ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN PHI CƯỜNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Khoa: CNSH-CNTP
Khóa học: 2016-2020
Thái Nguyên – năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN PHI CƯỜNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Lớp: 48-CNSH
Khoa: CNSH-CNTP
Khóa học: 2016-2020
Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường
2. ThS. Vũ Hoài Nam
Thái Nguyên – năm 2020
i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo,
hướng dẫn và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành
luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn
Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công
Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Hoài Nam cùng các cán bộ, các anh
chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ,
tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và
bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 06 năm 2020
Sinh Viên
Nguyễn Phi Cường
ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài .................................. 15
Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài ........................... 16
Bảng 4.1: Kết quả nồng độ DNA sau khi đo quang phổ ................................ 28
iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 5
Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 6
Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 7
Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo
độ tuổi ................................................................................................................ 9
Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA ............................................................. 10
Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và
cộng sự ............................................................................................................ 23
Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT ........... 23
Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N ................... 24
Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer .................. 25
Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1 .......................................................... 31
Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1 ......................... 32
Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN ......................................................... 32
Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN ...................... 33
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DNA : Deoxirybonucleic Acid
PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic Axit
CRC : Colorectal Cancer (Ung thư đại trực tràng)
SNP : Sequence Number PDU
Kb : Kilo base – Kilo bazo nito
Ng : Nanogam
v
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ ii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 3
1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1.Ung thư đại trực tràng ................................................................................. 4
2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng ............................................................ 4
2.1.2.Cơ chế gây ung thư .................................................................................. 4
2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới .......................................... 5
2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam ........................................ 8
2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng ......................................................... 9
2.2.1. Methyl hóa DNA là gì ............................................................................. 9
2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng ................... 11
2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi
bisulfite ............................................................................................................ 11
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina
Infinium 450K ................................................................................................. 12
2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế ........................................................... 13
2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN
......................................................................................................................... 13
vi
2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1 ......................... 13
2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN ....................................................... 14
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 15
3.1.Vật liệu ...................................................................................................... 15
3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm......................................................................... 15
3.1.2.Mẫu bệnh phẩm ...................................................................................... 16
3.1.3.Trang thiết bị .......................................................................................... 16
3.2.Phương pháp .............................................................................................. 16
3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde .................. 17
3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết ..................................................... 23
3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion ...................... 25
3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa ................................................. 26
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4. Kết quả ........................................................................................................ 28
4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA ..................................................................... 28
4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự .................................................... 28
4.1.2.Sử dụng bộ KIT ...................................................................................... 28
4.1.3.Phương pháp NaOH 2N ......................................................................... 29
4.1.4.Phương pháp Lysis buffer ...................................................................... 29
4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi ............................................................. 31
4.4.1 Gene FLI 1 ............................................................................................. 31
4.4.2. Gene AGRN .......................................................................................... 32
4.4.3. Kết quả thiết kế mồi .............................................................................. 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 35
1. Kết luận ....................................................................................................... 35
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36
1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư hàng đầu trên thế
giới cũng như tại Việt Nam. Trong các cơ chế phân tử liên quan đến ung thư
đại trực tràng, sự methyl hóa DNA là một trong những cơ chế có ảnh hưởng
lớn. Các nghiên cứu về methyl hóa ở DNA đa phần được thực hiện trên quần
thể người Châu Âu và người Châu Mỹ, hay nói cách khác là người da trắng là
chính và một phần là người da đen. Các nghiên cứu trên quần thể người da vàng
còn hạn chế về mặt số lượng.
DNA methylation là một cơ chế epigenetics và cơ chế này không giống
như cơ chế di truyền, cơ chế epigenetics có sự khác biệt bởi yếu tố môi trường.
Yếu tố môi trường ở đây rất rộng, nó bao gồm các yếu tố như chủng tộc, chế
độ ăn uống, chế độ sinh hoạt,…
Trong những năm đầu của cuộc cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu
ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm cả ung thư đại trực
tràng. Cơ chế epigenetics là cơ chế rất cần thiết cho sự phát triển bình thường
và duy trì các mẫu biểu hiện gen đặc hiệu của mô ở động vật có vú. Sự gián
đoạn của quá trình biểu sinh có thể dẫn đến thay đổi chức năng gen và biến đổi
tế bào ác tính.[1]
Ở người, methyl hóa DNA là một trong những vấn đề được quan tâm
và nghiên cứu chuyên sâu. Trong các tế bào bình thường, nó đảm bảo sự điều
hòa biểu hiện gen và làm gen ổn định. Quá trình methyl hóa DNA có liên quan
đến thay đổi histone và sự tương tác của các thay đổi biểu sinh, các thay đổi
này rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động của bộ gen bằng cách thay đổi cấu
trúc chromatin. Quá trình methyl hóa bị hạn chế ở dư lượng cytosine và
chủ yếu gặp trong dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường được viết
tắt là CpGine). Dinucleotide này không được thể hiện trong toàn bộ bộ
2
gen, nhưng nó xuất hiện với độ dài tăng dần trong khoảng 0,3 kb và khoảng
40% gen người có chứa một đảo CpG trong vùng promoter. Việc bổ sung
cộng hóa trị của một nhóm methyl thường xảy ra ở cytosine trong các
dinucleotide CpG và tập trung thành các cụm lớn gọi là đảo CpG [2].
Việc phát hiện ra ung thư đại trực tràng hiện nay được xem là điều cần
thiết, nhưng để phát hiện sớm không hề dễ dàng. Đặc điểm của khối u khi mới
phát sinh là kích thước còn rất nhỏ, sau đó khối u tăng kích thước và bám vào
thành ruột nhưng chưa đâm thủng thành ruột. Khi ở dai đoạn này, tỷ lệ sống sót
của người mắc bệnh là 90%. Khối u sẽ tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng
thành ruột nhưng chưa di căn, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh lúc này giảm
đi còn 70%. Bản thân những người mắc ung thư đại trực tràng họ thường không
thể biết được những triệu chứng ban đầu của bệnh, tỷ lệ phát hiện bệnh là 39%.
Khi tế bào ung thư đã di căn đến các vùng khác của cơ thể thì tỷ lệ phát hiện
bệnh là 61%, lúc này tỉ lệ sống sót của người bênh chỉ còn 12% vì phát hiện
quá muộn.
Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh và tầm quan trọng của sự thay đổi methyl
hóa DNA trong khối u có một ý nghĩa rất lớn đối với con người, trong tương
lai methyl hóa có thể được phát triển thành một chỉ số theo dõi phác đồ điều trị
ung thư.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU
TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH
NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với
tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực
tràng Việt Nam.
3
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Tách chiết được DNA đạt được tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư
đại trực tràng từ mẫu cố định formaldehyde để vụ cho các nội dung thí nghiệm
của đề tài.
- Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung
thư đại trực tràng.
- Phần tích được các đặc điểm, cấu trúc của gene trên máy tính.
- Thiết kế được cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.
4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Ung thư đại trực tràng
2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng
Vài thập kỷ trước, do điều kiện khoa học và cơ sở vật chất trang thiết bị
chưa phát triển, bệnh ung thư đại trực tràng được chẩn là một bệnh rất
mới. Ngày nay, ung thư đại trực tràng được xem là căn bệnh nguy hiểm đứng
thứ tư trên thế giới với gần 900 000 ca tử vong hàng năm [3].
Ung thư ruột hay ung thư đại trực tràng là tên gọi chung của ung thư đại
tràng và và ung thư trực tràng, tức là ung thư phát triển từ đại tràng hay trực
tràng (là những phần của ruột già), nó được tạo nên bởi sự phát triển bất thường
của các tế bào và có khả năng lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể. Dấu hiệu
và triệu chứng bao gồm xuất hiện máu trong phân, tụt cân, đau bụng giữ dội, có sự
thay đổi trong nhu động ruột và cơ thể luôn luôn cảm thấy mệt mỏi.
Hầu hết các nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng là do các yếu tố
về lối sống không lành mạnh và độ tuổi, với chỉ một số ít trường hợp là do rối
loạn gen di truyền. Bên cạnh vấn đề về tỷ lệ dân số già và thói quen ăn uống
của các nước có thu nhập bình quân đầu người cao thì các yếu tố nguy cơ gây
nên bệnh có thể kể đến ở đây bao gồm chế độ ăn không tốt, bệnh béo phì, hút
nhiều thuốc lá, và ít hoạt động thể chất, lười tập thể dục. Những yếu tố về chế
độ ăn làm tăng nguy cơ hình thành bệnh là nhiều người ăn thịt đỏ, thịt sống, sử
dụng những sản phẩm thịt để lâu quá hạn, không đảm bảo về ăn chín uống sôi.
Không chỉ thế mà vấn đề về sử dụng rượu cũng rất đáng nói, vì uống rượu nhiều
cũng là yếu tố nguy cơ gây nên các bệnh về đường ruột như viêm đường ruột,
trong đó bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [4].
2.1.2.Cơ chế gây ung thư
Sự hình thành ung thư đại trực tràng bắt đầu với sự biến đổi của niêm
mạc biểu mô bình thường thành biểu mô tăng sinh. Những tế bào biểu mô ruột
5
tăng sinh mất tổ chức và cấu trúc của chúng và có khả năng hình thành
adenomas. Adenomas sau đó có thể phát triển và xâm lấn vào vùng dưới niêm
mạc và trở thành ung thư với khả năng phổ biến vào đại tràng. Chuỗi hoạt động
này được gọi là chuỗi adenoma-carcinoma, từ đó có thể dẫn đến CRC. Ba cơ
chế chính của sự mất ổn định di truyền: mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định
kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Các cơ chế này có tác động đến
các đường dẫn tín hiệu chính và dẫn đến mất kiểm soát sự tăng sinh tế bào, tăng
trưởng tế bào không giới hạn và phát triển khối u [5].
2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới
Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2018, ung thư đại trực tràng (CRC) là bệnh
ung thư đứng thứ tư trên thế giới và là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến
thứ ba trên toàn cầu, bao gồm 11% trong số tất cả các chẩn đoán ung thư khác
nhau.
Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính
năm 2018 http://globocan.iarc.fr/
Khoảng 1.096.000 trường hợp ung thư ruột kết mới ước tính sẽ được chẩn
đoán vào năm 2018, trong khi khoảng 704.000 trường hợp ung thư trực tràng
mới được phát hiện. CRC là bệnh ung thư được chẩn đoán có tỷ lệ mắc nhiều
6
nhất ở nam giới với 10 trong số 191 quốc gia trên toàn thế giới. Còn chẩn đoán
trên phụ nữ thì không có quốc gia nào có tỉ lệ cao cả [6].
Tỷ lệ mắc bệnh CRC không chỉ xảy ra nhiều ở nam giới hơn là nữ giới mà
tỷ lệ đó còn gấp 3 đến 4 lần đối với các quốc gia đang phát triển. Tỷ lệ mắc
bệnh chuẩn theo tuổi trên thế giới là 100.000 ca, ở cả hai giới là 19,7%, ở nam
là 23,6% và ở nữ là 16,3%. Mặc dù tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở nam giới là
30,1%/100.000 ở các quốc gia có chỉ số HDI (chỉ số phát triển con người) cao,
nhưng ở các quốc gia có HDI thấp thì tỷ lệ này giảm xuống (thống kê tương tự
ở nữ là 20,9% và 5,9%). Năm 2018, khoảng 576.000 đàn ông và 521.000 phụ
nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng [6].
Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018
http://globocan.iarc.fr/
Các nước phát triển là các nước có nguy cơ mắc ung thư đại tràng và trực
tràng cao nhất. Đối với ung thư ruột kết, Nam Âu, Úc / New Zealand và Bắc
7
Âu là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Đối với ung thư trực tràng,
các khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là Đông Âu, Úc / New Zealand và Đông
Á. Bắc Mỹ cũng là một trong những nơi có tỷ lệ mắc cao nhất đối với cả hai
bệnh ung thư. Quốc gia có tỷ lệ mắc CRC cao nhất trên 100,000 dân là Hungary
(70,6%) ở nam và Na Uy (29,3%) ở nữ. Tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Ả Rập Saudi,
Ô-man, Yemen, Bahrain, Qatar, Kuwait và Slovakia CRC cũng là bệnh ung thư
được chẩn đoán nhiều nhất ở nam giới. Trong khi đó, tất cả các khu vực của
[6].
Châu Phi, cũng như Nam Á thì CRC có tỷ lệ mắc thấp nhất đối với cả hai giới
Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm
2018 http://globocan.iarc.fr/
Ung thư trực tràng là một trong những bệnh gây tử vong nhiều nhất, với
310.000 ca tử vong, chiếm 3,2% tổng số ca tử vong do ung thư, ở độ tuổi từ 0
đến 74 tuổi, tử vong do ung thư đại tràng là 0,66% ở nam giới và 0,44% ở phụ
8
nữ. Nguy cơ tương tự ung thư trực tràng là 0,46% ở nam và 0,26% ở nữ. Tỷ lệ
tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) ở cả hai giới là 8.9% trên 100.000 ca
CRC. Dự kiến đến năm 2030 gánh nặng toàn cầu về ung thư đại trực tràng
sẽ tăng lên 60%, thêm hơn 2,2 triệu trường hợp mới và 1,1 triệu ca tử vong
hàng năm [7].
2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam
Tổng tỷ lệ mắc ung thư của tất cả các bệnh ung thư là trên 100.000 người,
được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IACR) đưa ra vào năm 2012, trong
đó có 173 trường hợp đối với nam và 114,3 trường hợp đối với nữ. Những số
liệu thống kê mới cho thấy tỷ lệ mắc ung thư cả hai giới ở các quốc gia là
125.000 trường hợp mới mỗi năm. Ước tính của IARC cho thấy tỷ lệ tử vong
do ung thư là 148 trên 100.000 trường hợp đối với nam giới, 76.3 trên 100.000
trường hợp đối với nữ và 94.700 người chết vì ung thư mỗi năm. Năm bệnh
ung thư thường gặp nhất tại Việt Nam ở cả nam và nữ là ung thư gan (17,6%
trường hợp mới), ung thư phổi (17,5% trường hợp mới), ung thư dạ dày (11,4%
trường hợp mới), ung thư vú (8,9% trường hợp mới) và đại trực tràng (7% tất
cả các trường hợp mới).
Từ những số liệu thống kê trên, sự thay đổi về tỷ lệ mắc các bệnh ung thư
tại Việt Nam như sau. Chúng ta có tỷ lệ tương đối cao đối với ung thư gan và
ung thư phổi, xếp sau đó là ung thư dạ dày, cuối cùng là ung thư vú và ung thư
đại trực tràng. Tỷ lệ mắc bênh ung thư đại trực tràng tại Việt Nam là thấp nhất
đối với các loại ung thư khác. Nguyên nhân ở đây là vì người dân Việt Nam
đặc biệt là nam giới sử dụng rất nhiều thuốc lá gây ảnh hưởng rất lớn đến phổi,
không những thế nhiều người dân điển hình như công nhân tiếp xúc rất nhiều
với chất gây ung thư từ công việc, nghề nghiệp. Sự lão hóa của người cao tuổi,
rượu bia và béo phì do lối sống không lành mạnh [8].
9
Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ
tuổi (Thế giới) năm 2018, Việt Nam, cả hai giới, độ tuổi 0-74
http://globocan.iarc.fr/
2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng
2.2.1. Methyl hóa DNA là gì
Di truyền học là một lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất
hiện trong hoạt các động hoặc chức năng của gen do sự thay đổi trực tiếp của
chuỗi DNA. Những thay đổi này gồm đột biến, xóa, chèn và dịch. Ngược lại,
biểu sinh học là lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong
hoạt động hoặc có trong chức năng gen mà không liên quan đến bất kỳ thay đổi
nào của trình tự DNA. Mặc dù hầu hết tất cả các tế bào trong một sinh vật sống
đều chứa cùng một thông tin di truyền, nhưng không phải tất cả các gen đều
được biểu hiện đồng thời bởi tất cả các loại tế bào. Xét về ý nghĩa rông hơn, thì
các cơ chế biểu sinh là cầu trung gian cho các sự biểu hiện gen đa dạng trong
nhiều loại tế bào và mô của các sinh vật đa bào. Trong bộ gen của động vật có
vú, quá trình methyl hóa DNA là một cơ chế biểu sinh liên quan đến việc
10
chuyển một nhóm methyl vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5-
methylcytosine. Quá trình methyl hóa DNA này có vai trò điều chỉnh biểu hiện
gen bằng cách thu thập các protein liên quan đến ức chế gen hoặc ức chế sự
gắn kết của các yếu tố phiên mã với DNA.
Trong lịch sử, quá trình methyl hóa DNA được phát hiện ở động vật có
vú ngay khi DNA được xác định là vật liệu di truyền ( Avery et al ,
1944 ; McCarty và Avery, 1946 ). Năm 1948, Rollin Hotchkiss lần đầu tiên
phát hiện ra cytosine đã biến đổi trong một chế phẩm của tuyến ức ở loài bò,
mà cụ thể là con bê non bằng phương pháp sắc ký giấy. Quá trình methyl hóa
DNA được xúc tác bởi một họ methyltransferase DNA (Dnmts) chuyển một
nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) sang carbon thứ năm của
cytosine để tạo thành 5mC. Dnmt3a và Dnmt3b có thể xây dựng lên một bản
sao methyl hóa mới để DNA chưa được sửa đổi thực hiện sửa đổi, do đó nó
được gọi là de novo Dnmt (Hình a). Mặt khác, Dnmt1 hoạt động trong quá trình
sao chép DNA, mục đích là sao chép mẫu methyl hóa DNA từ chuỗi DNA mẹ
lên chuỗi DNA con mới được tổng hợp.
Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA
11
Tất cả ba Dnmts đều tham gia sâu rộng vào sự phát triển của phôi. Khi
đạt thời điểm ngừng, các tế bào biểu hiện Dnmt sẽ giảm đi nhiều. Điều này cho
thấy rằng mô hình methyl hóa DNA trong các tế bào postmitotic là ổn định. Tuy
nhiên, các tế bào thần kinh postmitotic trong não động vật có vú trưởng thành
vẫn có sự xuất hiện đáng kể của tế bào biểu hiện Dnmts, điều này làm tăng khả
năng methyl hóa Dnmts và DNA có thể nó đóng một vai trò mới trong não
( Goto et al , 1994 ; Feng et al , 2005 ) [1].
2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng
Methyl hóa DNA là một trong những biểu sinh học có thể điều chỉnh biểu
hiện của gen. Ở người, quá trình methyl hóa DNA xảy ra ở cytosine, nó được
gọi là dinucleotide CpG (liên kết C-phosphodiester-G). Phần lớn các
dinucleotide CpG trong bộ gen của con người đều bị methyl hóa, tuy nhiên ở
trên gen có các khu vực tập chung nhiều CpG, những khu vực đó được gọi là
đảo CpG và thường không được methyl hóa trong các tế bào khỏe mạnh bình
thường. Các đảo CpG được tìm thấy ở các vùng promoter của ~ 40 406060%
gen ức chế khối u. Chúng thường dài khoảng 200 B20002000 bps, có hàm
lượng CG>50% và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen. Dinucleotide
methyl hóa CpG thường được tìm thấy trong gen, trong centromeres, trong các
yếu tố retrotransCPon và trong các trình tự LINE-1, SINE / Alu, v.v. Theo một
nghĩa nào đó, quá trình methyl hóa bình thường này về cơ bản được đảo ngược
như quá trình của các tế bào ung thư [9].
2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến
đổi bisulfite
Trong những năm qua, biến đổi bisulfite đã trở thành phương pháp được
sử dụng rộng rãi nhất để phân tích methyl hóa DNA. Đó là cách thuận tiện và
hiệu quả nhất để xây dựng lên một tấm bản đồ methyl hóa DNA cho từng cá
nhân người bệnh. Là bước đầu tiên trong kỹ thuật phân tích của nhiều lĩnh vực
nghiên cứu khác, điều cực kỳ quan trọng là quá trình biến đổi bisulfite được
12
hiểu và áp dụng rất tốt trong thực tế. Chuyển đổi bisulfite là một quá trình tương
đối khắc nghiệt, nó sẽ thay đổi đáng kể tính chất hóa học và tính chất vật lý của
mẫu DNA. Trong quá trình biến đổi, DNA của chúng ta sẽ chuyển từ các phân
tử sợi kép lớn và ổn định sang một loạt các phân tử sợi đơn bị phân mảnh ngẫu
nhiên. Ngoài ra, hầu hết các cytosine đã được chuyển đổi thành uracil. Về cơ
bản, sau khi trải qua sự biến đổi lớn như vậy thì DNA của chúng ta không còn
giống DNA gốc nữa, nên ta sẽ phải lưu ý thực hiện một số điều chỉnh sao cho
phù hợp với mục đích tiếp theo [10].
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao
Illumina Infinium 450K
Có hơn 28 triệu vị trí CpG (còn gọi là các điểm dinucleotide CpG) trong
bộ gen của con người. Do sự ảnh hưởng ngày càng tăng trong nghiên cứu biểu
sinh, quá trình methyl hóa DNA nói riêng, các nhà nghiên cứu khoa học họ cần
một cơ sở dữ liệu tham khảo nơi có thể tìm thấy thông tin về các vị trí CpG.
Thay vì sử dụng các cơ sở dữ liệu công cộng đang phát triển để cung cấp
chính xác. Illumina đã phát triển một phương pháp nhất quán chỉ định vị trí
CpG dựa trên thực tế hoặc trình tự tóm lược của từng vị trí CpG riêng lẻ.
Phương pháp Illumina tận dụng các chuỗi bên cạnh một vị trí CpG để tạo ra
một cụm vị trí CpG đặc biệt. Các số liệu này dựa trên những thông tin trình tự
duy nhất và không bị ảnh hưởng bởi các phiên bản bộ gen khác. Illumina được
chuẩn hóa thành thuật ngữ cũng tương đương với thuật ngữ chuỗi TOP / BOT
thường được sử dụng để chỉ định chuỗi SNP.
Ưu điểm của phương pháp này là nó sẽ luôn chỉ biểu thị định danh và định
hướng cùng một số vị trí CpG giống nhau ngay cả khi cơ sở dữ liệu công cộng
và bộ genome thay đổi. Điều này sẽ cho phép tất cả các nhà nghiên cứu khoa
học dễ dàng nghiên cứu các điều tương quan đến vị trí CpG được xác định với
nghiên cứu [10].
13
2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế
2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN
- Tuy nhiên chưa có nghiên cứu cụ thể nào xác định tính trạng methyl hóa
về gene FLI 1 và gene AGRN, dưới đây là một số nghiên cứu trong nước có
liên quan đến methyl hóa DNA tại Việt Nam.
- Tháng 7 năm 2018, các nhà nghiên cứu Tràng Lan Vũ, Nguyễn Thu
Trang, Văn Thị Hồng Đoàn và Lan Thị Thượng Võ đã nghiên cứu về methyl
hóa BRCA1, RASSF1A và GSTP1 ở phụ nữ Việt Nam bị ung thư vú 11
- Tháng 3 năm 2018, các nhà nghiên cứu Phương Kim Trường, Thuận Đức
Lão, Thủy Ái Huyền đã nghiên cứu Hypermethylation của Biomarker dựa trên
gen DcR1 trong sàng lọc ung thư không xâm lấn của bệnh nhân ung thư cổ tử
cung Việt Nam [12].
- Tháng 1 năm 2016, Thị Thượng Lan Võ, Bích Thuận Ta, Văn To
Ta, Diệu Linh Vương, Quỳnh Uyên Nguyễn đã nghiên cứu về methyl hóa
Promoter của GSTP1 và RASSF1A trong ung thư tuyến tiền liệt và tăng sản
lành tính ở nam giới Việt Nam [13].
2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1
- Tháng 11 năm 2015, David J. Elzi, Meihua Song, Peter J. Houghton,
Yidong Chen và Yuzuru Shiio đã nghiên cứu vai trò của gene FLI 1 đối với
bênh ung thư xương và mô mềm ở trẻ em [14].
- Ngày 26 tháng 5 năm 2014, Nicolò Riggi, Birgit Knoechel, Shawn M.
Gillespie và những người cộng sự đã nghiên cứu EWS-FLI1 sử dụng các cơ
chế tái cấu trúc chromatin khác nhau để trực tiếp kích hoạt hoặc kìm nén các
yếu tố tăng cường trong Ewing sarcoma [15].
- Tháng 2 năm 2015, Mara L. Lennard Richard , Danielle Brandon ,
Tamara K. Nowling , Dennis K. Watson , và Xian K. Zhang đã cho ra bài báo
nghiên cứu Fli-1 kiểm soát phiên mã từ chất kích thích gen MCP-1, có thể cung
cấp một cơ chế mới để kích hoạt chemokine và cytokine [16].
14
2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN
- Tháng 12 năm 2016, Celine Lefebvre, Thomas Bachelot, Thomas
Filleron, Marion Pedrero, Mario Campone, Jean-Charles Soria đã nghiên cứu
về đột biến của ung thư vú di căn, và gene AGRN là một gen có liên quan đến
căn bệnh này [17].
- Tháng 8 năm 2018, Xin Li, Xianteng Wang, Wanlu Song, Hui
Xu, Rongyao Huang, Yuting Wang, Wenwei Zhao, Zhengtao Xiao, Xuerui
Yang đã nghiên cứu đặc tính gây ung thư của NEAT1 trong các tế bào ung thư
tuyến tiền liệt phụ thuộc vào mạch điều hòa phiên mã CDC5L-AGRN 18.
- Tháng 12 năm 2019, Lei Zhang, Zhe Zhang, Zhenglun Yu đã nghiên cứu
Xác định một dấu hiệu gen liên quan đến glycolysis mới để dự đoán di căn và
sống sót ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi [19].
15
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.Vật liệu
3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm
Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất
Hãng sản xuất Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Thermo scientific Thermo scientific Thermo scientific
ĐVT Gam Gam Gam Gam Ml Gam Gam Pk Ml Bộ Ml Ml Ml
Agarose NaOH NaCl EDTA Ethanol Tris – HCL Tris Base, for Molecular Biology PCR Mastermix Loading dye Kit tách DNA Nước cất, nước khử ion Proteinase K Rnase Ethidium Bronide PBS Ml
TAE 1X Ml
TE CIAA Ml Ml
Alkali Ml
10X DreamTaq Buffer DreamTaq DNA Polymerase 10mM dNTP Mix Ml Ml Ml
Dung dịch 25:24:1 Ml
Lysis Buffer Ml Thermo scientific Thermo scientific Merck (Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.H2O, NaCl) (Tris base, Acid Acetic, EDTA) (100nM Tris/1mM EDTA) (chloroform, isoamylakihol) (0,1M NaOH, SDS 1%, pH=12) Thermo scientific Thermo scientific Thermo scientific (Phenol, Chloroform, Isoamylakihol) (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, SDS 10%)
Bộ FavorPrep
Bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit Bộ EZ DNA Methylation - Gold Bộ Zymo Research
16
3.1.2.Mẫu bệnh phẩm
Mẫu khối u và mô lành liền kề cố định formaldehyde của bệnh nhân ung
thư đại trực tràng, được lấy ở Bệnh Viện K Trung ương Việt Nam năm 2019.
3.1.3.Trang thiết bị
Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
Máy lọc nước Pall Co – UK
Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech – korea
Techne - OSI Bể ổn nhiệt
Eppendorf – CHLB Đức Máy li tâm
Máy ảnh chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USA
Tủ lạnh -20ºC; -80ºC Super freezer Eco130 – Ficchtti – Italy
TE 214S – Startorius Germany Cân điện tử
MS – 2347AR – LG VN Lò vi sóng
Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan
Genius 3 – IKA Genmany/China Máy vortex
Scie – plas Ltd – UK Bộ điện di
Amplied Biosytems USA/Singapore Máy PCR
Máy đo quang phổ Nadrop One Thermo scientific
3.2.Phương pháp
Với mục đích tách chiết được DNA cố định formaldehyde để phục vụ
cho các quá trình nghiên cứu về sau, và bởi vì DNA cố định formal nên DNA
trong quá trình ngâm đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, vì vậy cần phải sử dụng
các phương pháp khác nhau để thực hiện tách chiết.
Sự ảnh hưởng của formaldehyde đến DNA
Thông thường formaldehyde được dùng để làm chất bảo quản các mẫu
sinh phẩm trong phòng thí nghiệm, nó giúp kéo dài thời gian bảo quản các mẫu
17
sinh phẩm rất tốt. Nhưng mặt khác nó lại gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng
DNA. Cụ thể, formaldehyd sẽ phản ứng với DNA và protein, các phân tử DNA-
protein được liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, gây ra quá trình oxy
hóa và phản ứng khử amin, làm biến tính DNA, ảnh hưởng nghiêm trọng đến
enzyme [20].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã thực hiện tách chiết DNA cố định
formaldehyde và họ cũng chỉ tách chiết ra ở một mức độ nhất định. Vì DNA từ
các mô lưu trữ cố định không phải lúc nào cũng phù hợp để phân tích do chất
lượng không đủ và rất khó để tách chiết.
3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde
Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại
trực tràng cố định formal bằng phương pháp của Campos và cộng sự.
Phương pháp này chúng em tham khảo từ phương pháp chiết xuất gan
bằng Phenol-chloroform của tác giả SM Hykin, Adapted from Campos and
Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004). Chúng em đã thay đổi một số bước
trong phương pháp để phù hợp với điều kiện làm việc của phòng thí nghiệm sinh
học phân tử Viện Khoa Học Sự Sống Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Protocol for Extraction of hDNA from Formalin-fixed Museum
Specimens: Liver Extraction by Phenol-chloroform SM Hykin, Adapted from
Campos and Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004)
Bước 1. Dùng dao thái nhỏ khoảng 30-40 mg mẫu cho vào ống eppendorf
1,5 ml.
Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine, 10mM
Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ.
+ Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.
18
+ Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất.
Bước 2. Bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm alkali. Đun 100ºC trong 40 phút
(đưa vào bể ổn nhiệt)
Bước 3. Thêm 500 µl dung dịch 25.24.1, đảo đều rồi để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút
Bước 4. Ly tâm 10000v/p trong 5 phút, sau đó thu dịch
Bước 5. Thêm 500 µl dung dịch 24:1, đảo đều và để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút.
Bước 6. Ly tâm 10000v/p trong 5 phút sau đó thu dịch.
Bước 7. Thêm 1ml cồn 100%, đảo đều và ủ ở tủ -20ºC ít nhất trong 1 giờ.
Bước 8. Ly tâm 12000v/p trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ
dịch rồi để khô.
Bước 9. Bổ sung 50µl TE để bảo quản trong -20ºC.
Phương pháp tách DNA từ mẫu mô cố định formal bằng bộ KIT
Phương pháp này được làm theo hướng dẫn có sẵn trong bộ KIT, đây là
phương pháp chuẩn được thiết kế với mẫu mô cố định formaldehyde.
Hóa chất:
Chất tẩy rửa PBS
RNase ( phải chuẩn bị vì bộ KIT không có)
Bước 1. Cắt lấy mẫu mô khoảng 25mg, rửa mẫu mô 2 lần bằng PBS
trong 10 phút (mỗi lần lấy 1ml) để loại bỏ bẩn, sau đó nghiền mẫu bằng
micropestle (nghiền nát mẫu).
Bước 2. Thêm 200µl bộ đệm FATG1 và trộn đều trong lúc nghiền.
Bước 3. Thêm 20µl proteinase K ( 10mg/ml ) vào hỗn hợp, lắc đều.
Bước 4. Ủ trong bể ổn nhiệt ở 60ºC từ 1-3 giờ cho đến khi mô được tan
hoàn toàn, mix nhẹ bằng tay trong quá trình ủ (10 phút 1 lần).
Bước 5. Thêm 4µl (100mg/ml) Rnase A, lắc đều bằng tay và để ở nhiệt
độ phòng trong 2 phút.
19
Bước 6. Thêm 200µl bộ đệm FATG 2 vào hỗn hợp mẫu, sau đó ủ trong
bể ổn nhiệt ở 70ºC trong 10 phút
Bước 7. Thêm 200µl cồn 100% vào hỗn hợp mẫu, lắc đều bằng tay.
Bước 8. Sử dụng máy spindown để những giọt dụng dịch còn dính bên
thành ống dồn hết xuống đáy.
Bước 9. Đặt cột mini FATG vào trong ống eppendorf mới, chuyển hỗn
hợp ở ống cũ ( bao gồm cả tủa) sang cột mini FATG. Sau đó ly tâm ở tốc độ
12000v/p trong 3 phút, ly tâm xong loại bỏ hết phần dịch.
Bước 10. Thêm 400µl W1 Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ
tối đa trong 2 phút, sau đó loại bỏ dịch.
Bước 11. Thêm 750µl Wash Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ
tối đa trong 1 phút. Sau đó loại bỏ dịch.
Bước 12. Ly tâm ở tốc độ tối đa thêm 3 phút, sau đó để khô cột.
Bước 13. Thêm 100µl Elution buffer hoặc nước có PH ( 7,5-9 ) vào
màng của cột mini FATG ( đặt sang ống eppendorf mới) . Để đứng cột trong
3p, DNA từ màng sẽ rơi xuống ống ( lưu ý khi nhỏ elution buffer cần nhỏ chính
xác vào màng).
Bước 14. Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 2 phút để rửa phân giải DNA.
Tách chiết DNA ngâm formaldehyl bằng phương pháp NaOH2N
Phương pháp này được tham khảo theo phương pháp tách chiết DNA từ
móng tay của phòng nuôi cấy mô tế bào động vật thuộc Viện Công Nghệ Sinh
Học – Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam
Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine,
10mM Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ.
+ Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.
20
+ Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất.
Bước 1: Bổ sung 200µl NAOH 2N vào mẫu, ủ ở tº phòng qua đêm.
Bước 2: Votex nhẹ bằng máy vortex cho đến khi tan hoàn toàn.
Bước 3: Trung hòa dịch dến pH=6,8 kiểm tra bằng cách nhỏ 1µl dịch
mẫu lên giấy pH. Sử dụng HCl 12N để điều chỉnh PH (mỗi lần nhỏ khoảng 1-
3ul) sau đó vortex ngay lập tức. Nếu pH quá thấp thì tủa sẽ hình thành, chỉnh
pH với NaOH nếu cần thiết để làm tan tủa.
Bước 4: Bổ sung 1V phenol/choloroform (25:24:1) vào dịch trung hòa, votex
và li tâm 12000v/p trong 5 phút, chuyển dịch lớp trên sang ống dorf mới.
Bước 5: Tủa AND bằng cách bổ sung 2V EtoH 95%, đảo đều và ủ ở -
20ºC trong ít nhất 1 giờ.
Bước 6: Ly tâm 12000v/p trong 15-30 phút, loại dịch và để khô.
Bước 7: Bổ sung 50µl TE (100mM Tris/1mM EDTA).
Tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formal bằng phương pháp sử
dụng Lysis buffer
Phương pháp này được tham khảo từ phương pháp phân lập DNA nhanh
chóng, hiệu quả từ Osmanthus thông qua phương pháp ly giải kiềm được điều
chỉnh của tác giả Lisa Alexander (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, Dịch vụ Nghiên
cứu Nông nghiệp, Vườn ươm Quốc gia Hoa, Cây và Vườn ươm. Đơn vị nghiên
cứu, Trung tâm nghiên cứu vườn ươm Otis L. Floyd, McMinnville, Tennessee,
Hoa Kỳ)
Protocol Rapid, Effective DNA Isolation from Osmanthus via Modified
Alkaline Lysis Lisa Alexander U.S. Department of Agriculture, Agricultural
Research Service, U.S. National Arboretum, Floral and Nursery Plants
Research Unit, Otis L. Floyd Nursery Research Center, McMinnville,
Tennessee, USA
Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine,
10mM Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ.
21
+ Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.
+ Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất.
Bước 1. Bổ sung 500μl Lysis buffer, vortex nhẹ.
Bước 2. Bổ sung 2,5μl proteinase K, đảo đều, Ủ qua đêm trong bể ổn
nhiệt ở 56ºC.
Bước 3. Thêm 2μl Rnase vào hỗn hợp và ủ trong 60 phút ở 37ºC.
Bước 4. Thêm dung dịch CIAA tỷ lệ 1:1 với mẫu, lắc đều cho dung dịch
chuyển sang màu trắng đục, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Ly
tâm xong ta thu dịch ở pha trên cùng.
Bước 5. Bổ sung Isopropanol hoặc ethanol 100% vào mẫu với tỷ lệ 1:1,
lắc đều và ủ ở -20ºC qua đêm.
Bước 6. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó loại bỏ dịch và
thu cặn.
Bước 8. Bổ sung 1000μl ethanol 70%, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5
phút, sau đó loại bỏ dịch và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
Bước 9. Bổ sung 50μl TE 1x.
Điện di
Các bước của phương pháp điện di thực hiện như sau:
- Chuẩn bị gel
Cân 1 gam agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò
vi sóng khoảng 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Để gel nguội khoảng 50ºC -
60ºC, đổ gel vào khuân gel đã cài lược và để cho đến khi gel đông lại (khoảng
30-40 phút). Đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di
sao cho ngập bản gel, sau đó rút lược ra khỏi bản gel.
- Tra mẫu điện di
22
Tỷ lệ tra: Giếng đối chứng 1μl loading buffer trộn với 5μl DNA lader,
còn các giếng khác thì tra 1μl loading buffer với 5μl mẫu vào giếng.
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V, khi vị trí của vạch màu chạy đến
2/3 bản gel thì dừng quá trình điện di.
- Nhuộm gel
Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và nhuộm với ethidium bromide
(nồng độ 30μl/l) trong 3 - 5 phút.
Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.
Đo quang phổ kế
Quang phổ kế (Spectrophotometer) là các thiết bị hoạt động dựa
trên phân tích quang phổ của ánh sáng, nhằm thu được các thông tin về thành
phần, tính chất hay trạng thái của những khối vật chất liên quan đến chùm ánh
sáng đó. Phân tích quang phổ là phương pháp hàng đầu trong hóa phân tích.
Thông thường thì quang phổ kế xác định phân bố cường độ ánh
sáng theo bước sóng của ánh sáng do khối vật chất nào đó tự phát ra, hoặc phản
xạ hay truyền qua ánh sáng nó. Những khối vật chất khác nhau có đặc tính phát
quang hoặc hấp thụ ánh sáng với các bước sóng, hay mức năng lượng của
photon, chúng thường được gọi là các vạch quang phổ. Đo cường độ ánh sáng ở
các bước sóng đặc trưng cho phép xác định tỷ lệ (hay hàm lượng) của chất
tương ứng trong mẫu vật cần nghiên cứu.
23
3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết
M L U L U L U
3.2.2.1.Kết quả tách chiết DNA sử dụng phương pháp của campos và cộng sự
Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và cộng sự
Phương pháp này được tham khảo từ một phương pháp tách chiết DNA
từ phenol, trong đó có sử dụng đệm alkali. Kết của phương pháp này đạt yêu
cầu về nồng độ DNA, nhưng chất lượng diện di lại kém, DNA còn nhiễm tạp
chất phenol cao do phương pháp có sử dụng phenol. Phương pháp này cần được
tối ưu hơn để đảm bảo về độ tinh sạch.
3.2.2.2.Kết quả phương pháp sử dụng bộ KIT
M L U L U
Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT
24
Đây là một phương pháp chuẩn, được thiết kế phù hợp với mẫu mô cố
định formal. Nồng độ DNA tách chiết thấp nhất so với 4 phương pháp còn lại,
một số ít đạt yêu cầu. Ảnh điện di cho ra kém do DNA đứt gãy nhiều, nhưng
phương pháp này lại đạt yêu cầu cao nhất về độ tinh sạch.
3.2.2.3.Kết quả phương pháp sử dụng NaOH 2N
M L U L U
Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N
Kết quả tách chiết của phương pháp này cho ra nồng độ DNA cao bất
thường, hình ảnh điện di và độ tinh sạch đều không đạt yêu cầu. Vì đang tách
chiết DNA của mẫu mô cố định formal nên chúng tôi muốn sử dụng thử nghiệm
một phương pháp khó khác, đó là phương pháp tách chiết DNA mòng tay. Kết
quả cho thấy phương pháp này không phù hợp để áp dụng.
25
3.2.2.4.Kết quả phương pháp 4: phương pháp lysis buffer
M L U L U
Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer
Phương pháp này được tham khảo và thử nghiệm từ một phương pháp
tách chiết DNA thực vật, mặc dù không liên quan nhưng kết quả thực tế cho
thấy nồng độ DNA đạt yêu cầu, hình ảnh điện di cũng tốt hơn những phương
pháp còn lại, nhưng về độ tinh sạch chưa đạt yêu cầu.
3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion
Phương pháp này được lấy ngay trong bộ biến đổi bisulfite, phương pháp
gồm các bước sau:
Bước 1. Thêm 130μl CT conversion Reagent vào 20μl mẫu DNA (đã có)
vào trong ống PCR.
Bước 2. Đặt ống mẫu vào máy PCR và thực hiện các bước:
1. 98°C trong 10 phút
2. 64°C trong 2,5 giờ
3. 4°C trong tối đa 20 giờ
Bước 3. Thêm 600μl M – Binding Buffer vào cột IC Zymo – SpinTM và
đặt cột vào ống thu thập được cấp sẵn.
Bước 4. Lấy mẫu (từ bước 2) cho vào cột IC Zymo - SpinTM có chứa M –
binding Buffer. Đóng nắp và chộn bằng cách đảo ngược nhẹ bằng tay nhiều lần.
26
Bước 5. Ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây, sau đó loại bỏ dịch chảy qua màng.
Bước 6. Thêm 100μl M – Wash Buffer vào cột, sau đó ly tâm 10.000 vòng
trong 30 giây.
Bước 7. Thêm 200μl đệm M – Desulphonation Bufer vào cột và để ở nhiệt
độ phòng (20 - 30°C) trong 15 – 20 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 30
giây, xong ta thêm 200μl M – Wash Buffer và ly tâm tiếp 10.000 vòng trong
30 giây nữa.
Bước 8. Đặt cột sang ống 1,5ml mới, thêm 10μl M – Elifying Buffer vào
cột. Sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây để rửa giải DNA.
3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa
Truy xuất trình tự gene từ cơ sở dữ liệu Ensembl
Cơ sở dữ liệu Ensembl là một trình duyệt quốc tế về gene mới, nhẹ và rất
dễ dàng tuy cập. Trang web này được thiết kế cho phép chúng ta tìm kiếm
những thông tin về gene mới nhất cho một số lượng lớn các loài, nhằm mục
đích cung cấp các thông tin về các bộ gen. Ngoài việc truy cập trực tiếp vào tất
cả các tệp trên trang web, chúng ta có thể duyệt các tệp có sẵn và tìm các liên
kết nhanh để tải xuống các tệp chú thích gen và trình tự bộ gen.
Xác định trình tự promoter của gene và khoảng cách tới vị trí CpG đích
Việc dò tìm đầu 5´ là một trong những thách thức lớn nhất trong việc dò
tìm gene do rất khó xác định chính xác promoter và điểm khởi sự phiên mã
(transcriptional start site TSS). Hiện nay, xấp xỉ 17.000 gene người xuất hiện
trên Genbank chỉ có khỏang 3000 gene là được ghi chú TSS. Hầu hết các cDNA
lấy từ mRNA đều bị cắt ngắn đầu 5´ do quá trình phiên mã ngược không thể
tạo được đầu 5´. Hoạt động của promoter và quá trình khởi sự phiên mã thực
sự khá phức tạp. Sau khi chromatin trong khu vực chứa promoter được tái cấu
trúc theo hướng duỗi thẳng và siêu acetyl hóa, phức hợp tiền khởi sự sẽ gắn lên
vùng promoter lõi (nằm xấp xỉ 100 bp ở hai phía TSS). Quá trình phiên mã sau
đó sẽ được điều khiển chủ yếu bởi các yếu tố phiên mã gắn lên vùng lân cận
27
promoter (khoảng1 kb theo hướng thượng nguồn của TSS) và vùng intron đầu
tiên. Trong trường hợp người ta có một vùng không gian DNA khá rộng lớn
như genome người và việc lập bản đồ trình tự TSS chỉ cần độ phân giải thấp
(khoảng xấp xỉ 2kb) đồng thời các TSS này có liên hệ với CpG thì ta có thể kết
hợp hai thuộc tính CpG và promoter cho quá trình dò tìm [21].
Thiết kế mồi
- Methyl Primer Express v1.0
MethPrimer là một chương trình thiết kế bisulfit chuyển đổi dựa
trên Methylation PCR mồi . Hiện tại, nó có thể thiết kế mồi cho hai loại PCR
bisulfite: PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) và PCR Bisulfite-Sequences PCR
(BSP) hoặc PCR Bisulfite-Restriction. MethPrimer cũng có thể dự đoán các
đảo CpG trong chuỗi DNA.
Để xác định mức độ methyl hóa, ta sẽ thiết kế 2 cặp mồi cho mỗi promoter.
Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa và một cặp mồi dùng để xác
định ADN không bị methyl hóa.
28
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4. Kết quả
4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA
Bảng 4.1: Kết quả hàm lượng DNA sau khi đo quang phổ
Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Số DNA Tên phương pháp DNA trên DNA trên DNA trên mẫu dưới 1000ng/μl 500ng/μl 100ng/μl 100ng/μl
Phương pháp của campos 4 0 6 10 0 và cộng sự
Sử dụng bộ KIT 0 0 6 43 37
4 3 0 8 0 Phương pháp NaOH 2N
Phương pháp Lysis buffer 32 18 31 84 12
4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự
- Nồng độ DNA không ổn định với 40% trên 1000mg/ul và 60% từ 120
– 366
- Khối lượng các mẫu là 125mg
- Tỷ lệ OD 260/280 có mức ổn định từ 1.6 - 1.7 chiếm 60%.
- Tỷ lệ OD 260/230 hầu hết đều < 1.8, còn lẫn nhiều tạp chất
- Có một mẫu sát với chỉ tiêu về nồng độ, tỷ lệ OD chiếm 10%
- 6 mẫu nhiễm phenol chiếm 60%.
- Có một mẫu có chỉ số gần đạt tiêu chuẩn chiếm 10% tất cả thí nghiệm.
4.1.2.Sử dụng bộ KIT
- Tổng có 43 mẫu DNA (không tính mẫu mô lợn)
- Khối lượng các mẫu được cân toàn bộ trong khoảng từ 25-30 mg
29
- Có 6 thí nghiệm có nồng độ DNA trên 100ng/ul chiếm 13.95% tất cả
thí nghiệm bằng bộ KIT.
- Có 13 thí nghiệm có tỷ lệ OD 260/280 từ 1,6-1,7 chiếm 30% , có một
mẫu đạt 1,8 là mẫu lợn tươi.
- Kết quả OD 260/230 không ổn định > 1.8 có 10 mẫu chiếm 23,25 %.
- Hầu hết các thí nghiệm khi sử dụng bằng KIT không còn phenol trong
mẫu chiếm 83%.
4.1.3.Phương pháp NaOH 2N
- Tổng số mẫu : 8 mẫu (không tính mẫu mô lợn)
- Khối lượng của các mẫu đều được cân 125 mg
- Số mẫu có nồng độ DNA trên 1000ng/ul: 4 mẫu chiếm 50%
- Số mẫu có nồng độ DNA trên 500ng/ul : 3 mẫu chiếm 37.5%
- Không có nồng độ dưới 100ng/ul.
- Nồng độ OD 260/280: 3 mẫu có nồng độ từ 1.76-1.78 chiếm 37.5%
- Nồng độ OD 260/230 có một mẫu trên 2.0 còn lại hầu hết đều thấp hơn
1.5
- Số mẫu nhiễm tạp chất: 6 mẫu chiếm 75%.
4.1.4.Phương pháp Lysis buffer
- Tổng số mẫu: 84
- Khối lượng: 4 mẫu chưa rõ khối lượng
- 12 mẫu có khối lượng : 25 mg
- 6 mẫu có khối lượng : từ 50 - 80mg
- 71 mẫu có khối lượng 125 mg
- Số mẫu có nồng độ DNA trên 1000ng/ul: 32 mẫu – chiếm 34.40%
- Số mẫu có nồng độ DNA trên 500ng/ul: 18 mẫu – chiếm 19.35%
- Số mẫu có nồng độ DNA trên 100ng/ul: 31 mẫu – chiếm 33.33%
- Các mẫu vẫn còn tồn dư phenol : 54 mẫu - chiếm 58.06 %
30
- Tỷ lệ OD 260/280 : từ 1.8 - 2.0 : 1 mẫu nhưng khi đo lại lần 2 cho kết
quả khác.
- Tỷ lệ OD 260/230: không có mẫu nào từ 1.8 - 2.0
TỔNG KẾT: Trong 4 phương pháp, phương pháp sử dụng bộ KIT là
tối ưu nhất bởi vì phương pháp này được thiết kế phù hợp với mẫu mô cố định
formaldehyde.
Phương pháp sử dụng bộ KIT cho độ tinh sạch rất cao, nồng độ DNA
phần lớn là kém nhưng một số mẫu cũng đạt yêu cầu. Sử dụng bộ KIT là
phương pháp chuẩn để tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formal, kết quả tách
chiết chưa đạt yêu cầu là do thao tác tách chiết của chiết và thao tác điện di của
chúng tôi chưa được tốt.
Phương pháp Lysis buffer là một phương pháp chúng tôi chọn để thử
nghiệm, nhưng trên thực tế nó cho ra nồng độ DNA đạt yêu cầu và hình ảnh
điện di tốt nhất, nhưng DNA còn bị tạp nhiễm, phương pháp này cần phải được
tối ưu hơn.
Phương pháp NAOH 2N là phương pháp thử nghiệm từ một phương
pháp khó khác đó là phương pháp tách chiết DNA móng tay. Phương pháp này
cho ra kết quả về nồng độ DNA đạt yêu cầu, nhưng còn DNA còn bị nhiễm tạp
chất và điện di không hiển thị band DNA nên đây sẽ là phương pháp không phù
hợp và bị loại bỏ.
Phương pháp campos và cộng sự là phương pháp tách chiết DNA có sử
dụng phenol, phương pháp này cho ra kết quả DNA đạt yêu cầu, nhưng DNA
còn tồn dư tạp nhiễm phenol nhiều vì trong quá trình tách chiết thì phương pháp
này có sử dụng phenol, hình ảnh điện di của phương pháp này còn kém. Phương
pháp này cần được tối ưu tốt hơn.
31
4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi
Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa để phân biệt một cách tối ưu giữa
DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa. Các mồi không được methyl
hóa sẽ khuếch đại DNA chuyển đổi natri bisulfite có trong DNA không được
methyl hóa, trong khi đó mồi được methyl hóa sẽ khuếch đại DNA methyl hóa
natri bisulphite [22].
4.4.1 Gene FLI 1
Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1
Chromosome số 1 trên hệ gene, chiều dài từ 65,058,434-65,058,508 bp
- Dữ liệu này được trích xuất từ cơ sở dữ liệu Ensembl geneome
- Để xác định mức độ methyl hóa, ta sẽ thiết kế 2 cặp mồi cho mỗi
promoter. Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa và một cặp mồi
dùng để xác định ADN không bị methyl hóa. Sử dụng phần mềm chuyên dụng
Methyl Primer Express Software v1.0. (Applied Biosystem, Hoa kỳ). Trình
tự mồi được sử dụng dựa vào trình tự nucleotid của các promoter thuộc tế
bào dòng chuẩn trên ngân hàng gen.
- Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1
32
Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1
4.4.2. Gene AGRN
Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN
Chromosome số 1 trên hệ gene, chiều dài từ 1,047,475-1,047,838 bp
- Dữ liệu này được lấy từ cơ sở dữ liệu Ensembl geneome
- Sử dụng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0.
- Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN
33
Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN
4.4.3. Kết quả thiết kế mồi
1. AGRN CpG M-F TTTTATTTATTTTTTTAGTTTCGCG
2. AGRN CpG M-R CGAAAATCTACTATCCCCGTC
3. AGRN CpG U-F TTTATTTATTTTTTTAGTTTTGTGG
4. AGRN CpG U-R CCAAAAATCTACTATCCCCATC
5. AGRN Promoter M-F TTTTTCGTTTGCGTTATGGTC
6. AGRN Promoter M-R GTATACTACACCGAATCCACGTT
7. AGRN Promoter U-F GTTTTTTGTTTGTGTTATGGTTGG
8. AGRN Promoter U-R ACATATACTACACCAAATCCACATT
9. FLI1 Promoter M-F AATGTGTTTGGGTATTTTCGC
10. FLI1 Promoter M-R AAATAACTTCACTTTACGAATCGAA
11. FLI1 Promoter U-F TATGAATGTGTTTGGGTATTTTTGT
12. FLI1 Promoter U-R AAATAACTTCACTTTACAAATCAAA
34
13. FLI1 CpG M-F CGTTCGTATAGATTTTTAGCGTTTC
14. FLI1 CpG M-R TTACAACCTAAACCCAAACTTAACG
15. FLI1 CpG U-F TTTGTTTGTATAGATTTTTAGTGTTTT
16. FLI1 CpG U-R CAACCTAAACCCAAACTTAACA
35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Qua quá trình thí nghiệm, đã tách chiết thành công DNA cố định
formaldehyde bằng bốn phương pháp trên.
- Thiết kế được mồi PCR đặc hiệu methyl hóa bằng phần mềm chuyên
dụng Methyl Primer Express Software v1.0.
2. Kiến nghị
- Tối ưu hóa phương pháp tách chiết DNA của campos và phương pháp
lysis buffer để DNA đạt được độ tinh sạch cao.
- Sử dụng mồi PCR đặc hiệu methyl hóa đã được thiết kế cho các mục
đích thí nghiệm tiếp theo.
36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Moore, L. D., Le, T. & Fan, G. DNA methylation and its basic function.
Neuropsychopharmacology vol. 38 23–38 (2013).
2. Von Känel, T. & Huber, A. R. DNA methylation analysis. Swiss Med. Wkly.
143, (2013).
3. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M. & Wallace, M. B.
Colorectal cancer. The Lancet vol. 394 1467–1480 (2019).
4. Colon Cancer Treatment (PDQ®)–Patient Version - National Cancer
Institute. https://www.cancer.gov/types/colorectal/patient/colon-
treatment-pdq.
5. Lucas, C., Barnich, N. & Nguyen, H. T. T. Microbiota, inflammation and
colorectal cancer. International Journal of Molecular Sciences vol. 18
(2017).
6. Bray, F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of
incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA.
Cancer J. Clin. 68, 394–424 (2018).
7. Rawla, P., Sunkara, T. & Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer:
Incidence, mortality, survival, and risk factors. Przeglad
Gastroenterologiczny vol. 14 89–103 (2019).
8. Noi, H., Phong, H., Nguyen, T., Minh, H. C. & Tho, C. CANCER
CONTROL IN VIETNAM: WHERE ARE WE NOW?
9. Okugawa, Y., Grady, W. M. & Goel, A. Epigenetic Alterations in
Colorectal Cancer: Emerging Biomarkers. Gastroenterology 149, 1204-
1225.e12 (2015).
10. Illumina. CpG Loci Identification. www.illumina.com/literature. (2010).
11. Vu, T. L., Nguyen, T. T., Doan, V. T. H. & Vo, L. T. T. Methylation profiles
of BRCA1, RASSF1A and GSTP1 in Vietnamese women with breast
cancer. Asian Pacific J. Cancer Prev. 19, 1887–1893 (2018).
37
12. Truong, P. K., Lao, T. D. & LE, T. A. H. Hypermethylation of DcR1 Gene-
based Biomarker in Non-invasive Cancer Screening of Vietnamese
Cervical Cancer Patients. Iran. J. Public Health 47, 350–356 (2018).
13. Vo, T. T. L., Ta, B. T., Ta, V. T., Vuong, D. L. & Nguyen, Q. U. Promoter
methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancer and
benign hyperplasia in Vietnamese men. Turkish J. Med. Sci. 46, 228–235
(2016).
14. Elzi, D. J., Song, M., Houghton, P. J., Chen, Y. & Shiio, Y. The role of FLI-
1-EWS, a fusion gene reciprocal to EWS-FLI-1, in Ewing sarcoma.
Genes Cancer 6, 452 (2015).
15. Riggi, N. et al. EWS-FLI1Utilizes Divergent Chromatin Remodeling
Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing
Sarcoma. Cancer Cell 26, 668–681 (2014).
16. Lennard Richard, M. L., Nowling, T. K., Brandon, D., Watson, D. K. &
Zhang, X. K. Fli-1 controls transcription from the MCP-1 gene promoter,
which may provide a novel mechanism for chemokine and cytokine
activation. Mol. Immunol. 63, 566–573 (2015).
17. Lefebvre, C. et al. Mutational Profile of Metastatic Breast Cancers: A
Retrospective Analysis. PLoS Med. 13, (2016).
18. Li, X. et al. Oncogenic properties of NEAT1 in prostate cancer cells depend
on the CDC5L–AGRN transcriptional regulation circuit. Cancer Res. 78,
4138–4149 (2018).
19. Zhang, L., Zhang, Z. & Yu, Z. Identification of a novel glycolysis-related
gene signature for predicting metastasis and survival in patients with lung
adenocarcinoma. J. Transl. Med. 17, (2019).
20. Gilbert, M. T. P. et al. The Isolation of Nucleic Acids from Fixed, Paraffin-
Embedded Tissues-Which Methods Are Useful When? PLoS One 2,
(2007).
38
21. Zhang, M. Q. Computational prediction of eukaryotic protein-coding
genes. Nature Reviews Genetics vol. 3 698–709 (2002).
22. Huang, Z., Bassil, C. F. & Murphy, S. K. Methylation-specific PCR.
Methods Mol. Biol. 1049, 75–82 (2013).
39
XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG
Thái Nguyên ngày….. tháng…...năm……
Người nhận xét phản biện
Người hướng dẫn
(chữ ký và ghi rõ họ tên)
chữ ký và ghi rõ họ tên)
