HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PHAN TRUNG THẮNG
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG
CỦA MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT BẬC CAO ĐỐI VỚI CỎ DẠI
Ngành: Bảo vệ thực vật
Mã số: 9 62 01 12
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023
Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PGS.TS. Trần Đăng Khánh Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Văn Viên
PGS.TS. Ngô Bích Hảo Phản biện 1:
Hội Bảo vệ thực vật
PGS.TS. Đồng Huy Giới Phản biện 2:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
TS. Lại Tiến Dũng Phản biện 3:
Viện Bảo vệ thực vật
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại:
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2023
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
Việt Nam là đất nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới, được biết đến
là trung tâm đa dạng sinh học thực vật, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú với
hơn 16.000 loài cây khác nhau (Biodivn, 2017). Trong số đó, nhiều loài thuộc nhóm
cây xâm lược, nhóm họ đậu đỗ và cây dược liệu. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít nghiên
cứu về đánh giá tính đối kháng thực vật của các loài cây này cũng như tách chiết các
hoạt chất đối kháng phục vụ công tác phòng trừ cỏ dại trên đồng ruộng. Đây là nguồn
vật liệu vô cùng quý giá cần được khai thác và phát triển.
Cỏ dại là thực vật không mong muốn làm giảm năng suất cây trồng đáng kể. Để
kiểm soát cỏ dại, một số phương pháp truyền thống được áp dụng bao gồm làm cỏ
bằng tay, sử dụng nước, làm đất hay kỹ thuật thâm canh đã được áp dụng. Tuy nhiên,
những phương pháp này thường phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, tốn thời gian công
sức và không phù hợp với xu thế đô thị hóa như ở nước ta. Hiện nay, xu hướng tăng
cường sử dụng nông dược và thuốc diệt cỏ tổng hợp ngày càng trở nên phổ biến.
Thực tế, sử dụng thuốc diệt cỏ có thể giảm thiểu thời gian kiểm soát cỏ dại và ổn định
năng suất cây trồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng và phụ thuộc vào thuốc diệt cỏ để
phòng trừ cỏ dại hiện đang là một vấn đề nghiêm trọng tại nước ta, dẫn đến ô nhiễm
môi trường đặc biệt là môi trường đất (mất cân bằng hệ vi sinh vật đất, thay đổi tính
chất lý hóa cũng như làm giảm các chất dinh dưỡng trong đất), các sản phẩm nông
nghiệp không an toàn và ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Nông nghiệp thế giới đang phải đương đầu để kiểm soát sự xâm lấn cỏ dại và đã
xuất hiện cỏ dại kháng thuốc diệt cỏ, do vậy cần phải phát triển nhiều loại thuốc diệt
cỏ mới hoặc tăng nồng độ sử dụng. Hiện nay, theo thống kê trên thế giới có khoảng
30.000 loài cỏ dại gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng (Manisankar &
cs., 2022). Ở Hoa Kỳ, người ta ước tính rằng cỏ dại gây thiệt hại khoảng 33 tỉ USD
cho sản lượng cây trồng và hàng năm người dân phải chi khoảng 6,2 tỉ USD để phòng
trừ cỏ dại. Ở Australia, tổng chi phí cho phòng trừ cỏ dại là khoảng 3,3 tỉ đô la Úc
mỗi năm, với thiệt hại năng suất tương đương 2,7 triệu tấn ngũ cốc (Chauhan, 2021).
Ở nước ta, việc sử dụng thuốc diệt cỏ tổng hợp để quản lý cỏ dại tăng đáng kể từ đầu
những thập niên 90 và tăng mạnh lên 42,000 tấn/ năm vào năm 2013, tương đương
1
300 triệu USD và tăng gấp đôi trong những năm gần đây (Thanh & Tran, 2020).
Tính đối kháng thực vật (allelopathy) có thể được hiểu một cách đơn giản là khả
năng ức chế hoặc kích thích sinh trưởng của cây trồng này sang cây trồng khác thông
qua con đường hóa sinh. Trong tự nhiên, thực vật xanh sản xuất nhiều sinh chất thứ
cấp được gọi là chất đối kháng thực vật, nhiều chất trong số này có khả năng ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của những thực vật bên cạnh. Các thực vật ức
chế cỏ dại thông qua việc giải phóng các độc tố vào môi trường bằng cách tiết dịch
gốc hoặc từ sự phân hủy tàn dư thực vật đã được Kalisz & cs. (2021) chứng minh trên
khoảng 200 loài. Hoạt chất đối kháng (allelochemicals) là hoạt chất thứ cấp đóng vai
trò quan trong trong sự tương tác giữa cây trồng với cây trồng, giữa cây trồng với vi
sinh vật và côn trùng. Trong đó, nhiều chất liên quan đến hoạt tính đối kháng gây ảnh
hưởng đến quá trình trao đổi chất và hệ thống sinh trưởng của thực vật bằng acid
shikimic hoặc acid acetate (Rizvi & Rizvi, 1992; Kong & cs., 2019). Nhiều chất đối
kháng đã được tách chiết, tinh sạch và xác định từ các loài thực vật bậc cao thường
thuộc nhóm acid phenolics và nhóm dẫn xuất, terpenoids, sterols, fatty acids,
lactones, amino acids. Theo thông tin cập nhật nhất, cho tới nay có khoảng 100.000
chất thứ cấp liên quan đến tính đối kháng đã được xác định (Latif & cs., 2017). Một
số chất đối kháng đang được sử dụng để quản lý cỏ dại như nguồn thuốc diệt cỏ sinh
học bao gồm hoạt chất glucosinolate, sorgoleone, momilactones, artemisinin,
leptospermone được thanh lọc từ Brassica sp., Sorghum bicolor L., (Oryza sativa L,
Artemisia annual L., Callistemon citrinus (Latif & cs., 2017).
Để giảm thiểu sự lệ thuộc vào thuốc điệt cỏ tổng hợp, đồng thời phát triển và duy trì nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường là nhiệm vụ cấp bách của các nhà khoa học hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp. Phòng trừ cỏ dại bằng phương pháp sinh học vẫn là lĩnh vực mới và chưa được tập trung nghiên cứu nhiều ở nước ta. Xuất phát từ những lý do nêu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính đối kháng của một số cây thực vật bậc cao đối với cỏ dại”. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp nguồn thông tin hữu ích và nguồn vật liệu quý giá có hoạt tính và hoạt chất đối kháng cao phục vụ nghiên cứu sâu hơn để tổng hợp thành thuốc diệt cỏ sinh học (bioherbicide) trên quy mô công nghiệp để phòng trừ cỏ dại trong tương lai gần.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại (Arachis pintoi
2
Krapov. & W.C.Greg.), liêm hồ đằng (Cissus sicyoides L.), tơ hồng xanh (Cassytha
filiformis L.), lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich.), cỏ may (Chrysopogon
aciculatus (Retz.) Trin.) đối với cỏ dại.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Thu thập và đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại, cây liêm hồ
đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà
lưới và trên đồng ruộng.
- Xác định được hoạt tính đối kháng từ dịch chiết của các cây thử nghiệm đến khả
năng ức chế sự nảy mầm, sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực và các hạt chỉ thị.
- Phân tích và xác định một số hoạt chất đối kháng thực vật từ chiết xuất của các
cây thử nghiệm.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Cây lạc dại (Arachis pintoi Krapov. & W.C.Greg.), liêm hồ đằng (Cissus
sicyoides L.), tơ hồng xanh (Cassytha filiformis L.), lá gai (Boehmeria nivea (L.)
Gaudich.), cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin.).
- Cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.).
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
+ Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;
+ Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học
Nông nghiệp Việt Nam;
+ Phòng thí nghiệm sinh lý thực vật và hóa sinh (Laboratory of Plant
Physiology and Biochemistry), Trường Sau đại học về Hợp tác và Phát triển Quốc
tế (Graduate School for Internatinal Development and Cooperation), Đại học
Hiroshima, Nhật Bản.
1.3.3. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu sinh thực hiên nghiên cứu từ tháng 10/2016 đến tháng 05/2021.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đề tài nghiên cứu đánh giá và xác định về tính đối kháng thực vật của một số
thực vật bậc cao lần đầu tiên tại Việt Nam như cây lạc dại (A. pintoi), liêm hồ đằng
3
(C. sicyoides), tơ hồng xanh (C. filiformis), lá gai (B. nivea), cỏ may (C. aciculatus).
Các loài thực vật thu thập lần đầu tiên được đánh giá tính đối kháng thực vật trong
đủ cả ba điều kiện là trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Ba loại
cây thử nghiệm (có tổng số điểm phân hạng cao nhất) được lựa chọn để sử dụng là
nguồn vật liệu để thực hiện các thí nghiệm dịch chiết, xác định hoạt chất đối kháng
thực vật gồm cây lạc dại, thân gai và lá gai.
- Luận án này đã xác định được hàm lượng gây ức chế 50% (IC50) của dịch chiết bằng ethyl acetate của cây gai và dịch chiết bằng methanol, hexan, ethyl acetate
của cây lạc dại đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của thực vật chỉ thị (cỏ lồng vực
nước (E. crus-galli) và xà lách (lactuca sativa). Trên chỉ thị cỏ lồng vực nước (E.
crus-galli), cao chiết ethyl acetate từ lá gai có giá trị ức chế mạnh nhất, với giá trị
IC50 ở chỉ tiêu chiều dài rễ và thân lần lượt là 3,96 và 9,3 mg/ml.
- Luận án này đã phát hiện các hợp chất thứ cấp liên quan tới tính đối kháng thực vật bao gồm: 04 hợp chất từ cao chiết methanol của cây lạc dại thuộc các nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, pyrroles; 09 hợp chất từ cao chiết hexan của cây lạc dại thuộc các nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, triterpenoids; 05 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của cây lạc dại thuộc các nhóm pyranones, benzofurans, dialkyl ethers, fatty acids, fatty acids esters; 04 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của thân gai thuộc các nhóm phenols, phenolic acids, fatty acids; 04 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của lá gai nhóm phenolic acids, coumarins và fatty acids.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án đã cũng cấp dẫn liệu khoa học về các hợp chất đối kháng thực vật, hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số từ dịch chiết bằng ethyl acetate của cây gai và bằng methanol, hexan, ethyl acetate của cây lạc dại. Đây là nguồn tư liệu làm căn cứ giúp cho các nhà nghiên cứu lựa chọn vật liệu nhằm chiết xuất các hợp chất đối kháng ức chế sự phát triển của cỏ dại.
Luận án đã cung cấp dẫn liệu khoa học mới về tính đối kháng thực vật của các cây thử nghiệm (cây lạc dại, cây gai, liêm hồ đằng, tơ hồng xanh, cỏ may) đối với cỏ lồng vực trong điều kiện phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và trên đồng ruộng.
4
Kết quả của nghiên cứu này góp phần phát triển các thí nghiệm sàng lọc, xác định các cây trồng có tính đối kháng thực vật và có thể đáp ứng các tiêu chí là chi phí thấp, nhanh chóng, dễ thực hiện, ứng dụng rộng rãi cho nhiều loài mục tiêu, có thể tái sử dụng và dễ thực hiện thống kê, đồng thời không đòi hỏi quá cao về thời gian và không gian thực hiện.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án đóng góp cho việc tìm ra những nguồn vật liệu mới nhằm tạo ra các sản phẩm, chế phẩm sinh học phòng chống cỏ dại, giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc diệt cỏ hoá học, giảm thiểu tác nhân gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tạo ra các sản phẩm nông nghiệp an toàn, đồng thời hướng tới phát triển và duy trì một nền nông nghiệp bền vững.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH ĐỐI KHÁNG THỰC VẬT CỦA THỰC VẬT BẬC CAO
2.1.1. Nguồn gốc thuật ngữ “Đối kháng thực vật” (allelopathy)
Thuật ngữ “Đối kháng thực vật” (allelopathy) được giới thiệu bởi Molisch năm
1937. Năm 1996, Hiệp hội Allelopathy Quốc tế (International Allelopathy Society)
đã đưa ra định nghĩa về allelopathy như sau: Bất kỳ quá trình nào liên quan đến
các chất chuyển hóa thứ cấp được tạo ra bởi thực vật, vi sinh vật, virus và nấm có ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của hệ thống nông nghiệp và sinh học (trừ
động vật), kể cả tích cực và tác động tiêu cực (Torres & cs., 1996).
2.1.2. Các nghiên cứu về tính đối kháng thực vật của thực vật bậc cao trên thế giới
Theo Nghiêm Nhật Mai (2017), thực vật bậc cao là các nhóm thực vật chủ yếu
đã lên cạn, do đó các mô hóa gỗ để truyền dẫn nước, khoáng chất và các sản phẩm
quang hợp trong cơ thể, có sự xen kẽ thế hệ bào tử và giao tử trong sinh sản. Trong
văn liệu khoa học, thực vật bậc cao được đề cập dưới tên gọi khác nhau như
Telomophyta, Embryophyta, Cormophyta, Tracheophyta. Nét chung của thực vật bậc
cao hay thực vật có mạch là cấu trúc sinh thế có dạng đặc biệt gọi là cây, gồm ba bộ
phận cơ bản: rễ, thân và lá. Chúng có những đặc điểm cơ bản, phân biệt so với thực
vật bậc thấp: Có mạch và các mô mạch đảm nhiệm chức năng tuần hoàn dưỡng chất
trong cây. Đặc điểm này có được do quá trình lịch sử tiến hóa của giới thực vật, cho
phép thực vật bậc cao có kích thước to lớn hơn so với thực vật bậc thấp (tức thực vật
không mạch hay tân thực vật). Trong thực vật bậc cao, pha thế hệ chủ yếu là thể bào
tử, thông thường là dạng lưỡng bội với hai bộ nhiễm sắc thể trên mỗi tế bào. Điều
này khác biệt so với thực vật bậc thấp là loại có pha thế hệ chủ yếu là thể giao tử, tức
5
là dạng đơn bội với một bộ nhiễm sắc thể trên mỗi tế bào.
Chủ đề nghiên cứu tính đối kháng thực vật đã nhận được nhiều sự quan tâm từ
các nhà khoa học trên thế giới kể từ khi một số nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng
dụng tính đối kháng và hoạt chất đối kháng thực vật có thể thay thế thuốc diệt cỏ tổng
hợp trong công tác phòng trừ cỏ dại (Kato-Noguchi & Peter, 2013). Nhiều loài thực
vật bậc cao trong tự nhiên biểu hiện tiềm năng đối kháng đáng kể khi được kết hợp sử
dụng trong công tác phòng trừ cỏ dại trên đồng ruộng. Một số nghiên cứu trước đó
trên thế giới đã khai thác tiềm năng đối kháng thực vật để kiểm soát cỏ dại, trong đó,
Ndam & cs. (2014) đã sàng lọc tính đối kháng của hơn 300 loài thực vật bậc cao thu
thập ở Nhật Bản, Cameroon. Trong đó đã xác định được 26 loài thuộc nhóm cây họ
đậu, 19 loài cây xâm lược bao gồm cả cỏ dại có hoạt tính đối kháng cao, ức chế sinh
trưởng của cây chỉ thị.
Nghiên cứu về tính đối kháng của một số cây trồng chính cũng đã được thực
hiện ở nhiều nước trên thế giới, trong đó lúa được nghiên cứu nhiều nhất. Một số
nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng tính đối kháng và hoạt chất đối kháng thực
vật có thể thay thế thuốc diệt cỏ tổng hợp trong công tác phòng trừ cỏ dại (Kato-
Noguchi & Peter, 2013).
2.1.3. Các nghiên cứu về tính đối kháng thực vật của thực vật bậc cao tại
Việt Nam
Trong thực tế, ở nước ta những nghiên cứu về tính đối kháng của cây thực vật bậc cao vẫn chưa được thực hiện nhiều, một số nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả như Hong & cs. (2003, 2004), Xuan & cs. (2005), Khanh & cs. (2013), đã sàng lọc tính đối kháng của hơn 60 loài thực vật bậc cao dựa trên một số chỉ tiêu; (i) tính xâm lược và diện tích của thực vật trong hệ sinh thái; (ii) thực vật chọn lọc có ít cỏ dại sinh trưởng ở dưới tán lá; (iii) truyền thống được sử dụng làm phân xanh hay diệt cỏ hoặc côn trùng, hoặc sử dụng làm dược liệu (Hong & cs., 2003).
2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HỢP CHẤT ĐỐI KHÁNG CỦA THỰC VẬT BẬC CAO VÀ PHƯƠNG THỨC TÁC ĐỘNG
2.2.1. Các nghiên cứu về các hoạt chất đối kháng thực vật trên thế giới
6
Trong tự nhiên, thực vật xanh sản xuất nhiều sinh chất thứ cấp được gọi là hợp chất đối kháng thực vật (allelochemicals), nhiều chất trong số này có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của những thực vật bên cạnh. Cho tới nay, có khoảng 100.000 chất thứ cấp liên quan đến tính đối kháng đã được xác định (Latif &
cs., 2017). Một số chất đối kháng đang được sử dụng để quản lý cỏ dại như thuốc diệt cỏ sinh học bao gồm hoạt chất glucosinolate, sorgoleone, momilactones, artemisinin, leptospermone được chiết xuất từ chi cải (Brassica sp.), cao lương (Sorghum bicolor L.), lúa (Oryza sativa L.), ngải hoa vàng (Artemisia annual L.), tràm liễu (Callistemon citrinus) (Latif & cs., 2017).
2.2.2. Phương thức tác động của các hợp chất đối kháng
Thực vật mang tính đối kháng thường tiết ra các chất chuyển hóa thứ cấp đi vào hệ rễ, ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật trong vùng lân cận (Akemo & cs., 2000). Trong tự nhiên, thực vật được công nhận có tiềm năng đối kháng thuộc các nhóm sau: (a) khí gây độc tế bào (cytotoxic gases), (b) axit hữu cơ, (c) axit thơm, (d) lacton đơn không bão hòa (simple unsaturated lactones), (e) coumarin, (f) quinon, (g) flavonoid, (h) tannin, (i) alkaloid, và (j) terpenoit và steroid (Mushtaq & Siddiqui, 2018).
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Thu thập và đánh giá ảnh hưởng của các cây thử nghiệm gồm có cây lạc dại,
cây liêm hồ đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may đến sự sinh trưởng và này
mầm của hạt cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli L.), hạt thóc (Oryza sativa), hạt đỗ
xanh (Vigna radiate L.) trong điều kiện phòng thí nghiệm, điều kiện nhà lưới và trên
đồng ruộng; Đánh giá tính đối kháng thực vật của của các cây thử nghiệm từ dịch
chiết xuất.
- Xác định hàm lượng tổng Phenolic tổng số và hàm lượng tổng Flavonoid tổng
số trong chiết xuất của các cây thử nghiệm; So sánh giữa tính đối kháng thực vật với
hàm lượng phenolic tổng số và hàm lượng flavonoid tổng số.
- Phân tích và xác định các hoạt chất thứ cấp từ dịch chiết của các cây thử
nghiệm bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-
Mass Spectometry).
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phương pháp thu thập vật liệu
7
Tham khảo phương pháp được mô tả của Hoàng Chung (2009). Thu thập mẫu: Thu thập 10 kg/loại mẫu. Mỗi loại mẫu được thu tại 3 điểm trong khu vực diện tích 50 m2.
Nguyên tắc thu mẫu: Mỗi cây thu 03 mẫu. Khi thu mẫu ghi chép đặc điểm dễ
nhận biết ngoài thiên nhiên như đặc điểm, kích thước cây, màu sắc hoa, quả, có hay
không có nhựa mủ,… Mẫu được thu thập và dán nhãn ghi thông tin : loại mẫu, địa
điểm thu thập, thời điểm thu thập, tọa độ thu thập.
3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của
hạt chỉ thị trong điều kiện phòng thí nghiệm
Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010);
Akil (2017); Zaïri & cs. (2020).
Môi trường sử dụng: Môi trường thạch 5%. Thành phần: Thạch (agar), nước cất.
Phương pháp: Hấp khử trùng môi trường chứa bột cây thử nghiệm tại 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp, để nguội 45-50◦C đổ 250ml/cốc nhựa. 20 hạt của từng
loại cây chỉ thị được đặt trên mặt môi trường thạch. Công thức đối chứng chỉ sử dụng
agar và nước cất. Mỗi công thức được tiến hành với 3 lần nhắc lại. Các mẫu thí
nghiệm được để trong tủ điều tiết sinh trưởng ở nhiệt độ 25°C, 4000 lux, thời gian
chiếu sáng: 9:00–17:00 h, độ ẩm: 75%. Sau 7 ngày các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy mầm, chiều
dài thân, độ dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô của các cây chỉ thị được đo đếm
so với đối chứng.
3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của
hạt chỉ thị trong điều kiện nhà lưới
Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010).
Phương pháp: 03 kg đất được bổ sung vào chậu nhựa (đường kính 25cm, dung
tích 7 lít) và được làm ẩm với 1 lít nước. Hạt cỏ lồng vực được tráng nhiều lần bằng
nước cất. Mỗi chậu thí nghiệm được gieo đều 20 hạt cỏ lồng vực trên bề mặt đất
trong chậu. Hai mươi hạt cỏ lồng vực được đặt thành 5 x 4 (hạt x hàng) trên đất ẩm.
Bột cây thử nghiệm được bón đều trên bề mặt chậu thí nghiệm với các công thức có liều lượng: 200, 150, 100 và 50 g/m2. Chậu đối chứng chỉ sử dụng nước. Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần với liều lượng 50; 100; 150; 200 g/m2. Các chậu thí nghiệm được đặt trong điều kiện nhà lưới, nhiệt độ 25- 30oC. Sau 30 ngày đo đếm tỷ lệ nảy
mầm, cân khối lượng tươi, khối lượng khô, đo chiều dài thân của cỏ lồng vực ở từng
8
chậu thí nghiệm được đo đếm và so sánh với đối chứng.
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của
hạt cỏ lồng vực trong điều kiện trên đồng ruộng
Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010).
Phương pháp: Ruộng thí nghiệm được phân lô với kích thước 1m x 1m (Mỗi ô 1m2 là 1 công thức), lặp lại 3 lần, không sử dụng thuốc diệt cỏ. Mạ 15 ngày tuổi được
cấy vào mỗi lô thí nghiệm với mật độ: hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 10 cm
(20cm x 10cm). 50 hạt cỏ lồng vực được gieo đều vào các ô thí nghiệm, xen đều giữa
mỗi hàng mạ. Các công thức được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, với các liều lượng 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 t.ha-1. Lô thí nghiệm đối chứng không xử lý bất cứ thuốc
diệt cỏ hay xử lý bột cây thử nghiệm. 30 ngày sau khi xử lý, cân khối lượng tươi,
trọng lượng khô, đo chiều dài thân cỏ của cỏ được thu thập và xác định
3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến cỏ tự nhiên và năng
suất của lúa trong điều kiện trên đồng ruộng
Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010). Ruộng thí nghiệm được phân lô với kích thước 1m x 1m (Mỗi ô 1m2 là 1
công thức), lặp lại 3 lần. Mạ 15 ngày tuổi được cấy vào mỗi lô thí nghiệm với mật
độ: hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 10 cm (20cm x 10cm). Các công thức
được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên với các liều lượng 50; 100; 150; 200 g/m2. LCBT: Lô thí nghiệm chỉ làm cỏ bằng tay, thời gian làm cỏ vào ngày thứ 7 và
15 sau khi cấy mạ; TDC: Lô thí nghiệm sử dụng thuốc trừ cỏ, thuốc trừ cỏ sử dụng là
Butoxim 60EC (Butachlor 600 g/l) với nồng độ 01 lít/ha, thời gian phun thuốc vào
ngày thứ 05 sau khi cấy mạ; ĐC: Lô thí nghiệm đối chứng không xử lý bất cứ thuốc
diệt cỏ, làm cỏ hay xử lý bột cây thu thập. 30 ngày sau khi cấy, cân khối lượng khô
của cỏ được thu thập và xác định. Sau 110 ngày, lúa ở các lô thí nghiệm được thu
thập để tính toán năng suất.
3.2.6. Phương pháp chiết xuất các vật liệu có tiềm năng đối kháng thực vật
cao nhất
Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Dịch chiết được cô đặc trong
chân không bằng máy bay hơi chân không Rotavapor® R-300 (Nihon Buchi K.K., Tokyo, Japan) ở nhiệt độ 45 oC tạo ra cao chiết xuất tổng. Cao chiết xuất tổng tiếp tục
9
được pha với nước cất và lần lượt được phân tách pha lỏng bằng các dung môi
hexane và ethyl acetate (EtOAc). Sau khi lọc, các dịch chiết thu được đều được cô đặc bằng máy bay hơi chân không ở nhiệt độ 45oC. Cao chiết xuất bằng hexane, ethyl
acetate và methanol (cao chiết xuất tổng) được sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá
tính đối kháng thực vật (allelopathy), thí nghiệm xác định hàm lượng phenolic và
flavonoid tổng số.
3.2.7. Đánh giá tính đối kháng thực vật (allelopathy) của dịch chiết xuất từ các
loại vật liệu
Theo phương pháp được mô tả của Xuan & cs. (2006); Minh & cs. (2019). Dung
dịch thạch agar 0.5% được chuẩn bị với nước cất. Bơm 1 mL dung dịch thạch 0.5%
vào các giếng của đĩa nuôi cấy. Đĩa giấy (có đường kính phù hợp với các giếng) được
thấm đều bằng 300 µL dung dịch chiết xuất của các cây thử nghiệm với dải nồng độ
khác nhau. Mẫu đối chứng chỉ thấm đều bằng methanol. Mỗi công thức được lặp lại 3
lần. Sau đó đĩa giấy được để khô trong 2h ở nhiệt độ phòng (nhằm bốc hơi hết
methanol). Đặt đĩa giấy lên bề mặt thạch đã nguội trong các giếng. Gieo hạt chỉ thị
lên bề mặt các đĩa giấy với số lượng là 06 hạt/đĩa giấy. Sau đó, bơm 200 µL nước cất
lên bề mặt đĩa giấy. Sau đó đĩa nuôi cấy được cho vào buồng sinh trưởng thực vật Biotron (growth chamber), với cài đặt ngày/đêm lần lượt: nhiệt độ 28/25oC, thời gian
16/8h, ánh sáng 4000 lux. Hàng ngày bổ sung 100 µL nước cất vào mỗi giếng. Sau 05
ngày tiến hành đo đếm các chỉ số về chiều dài thân, chiều dài rễ của các hạt chỉ thị
trong các giếng.
3.2.8. Xác định hàm lượng Phenolic tổng số
Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Các mẫu dịch chiết được hoà
tan vào methanol để đạt nồng độ 1000ppm. Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% được pha
loãng bằng nước cất. Lần lượt cho 20μL dung dịch gallic acid (nồng độ 5, 10, 25, 50
và 100 μg/ml) vào 100 μL thuốc thử Folin 10% và để phản ứng trong 3 phút; sau đó,
thêm tiếp vào 80 μl dung dịch Na2CO3 7,5%. Sau 30 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được xác định bằng máy đo quang phổ (Thermo Scientific, Multiskan™
GO Microplate Spectrophotometer) ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3
lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng
xác định hàm lượng phenolic tổng số trong các mẫu cao chiết. Các mẫu dịch chiết
được hoà tan vào methanol để đạt nồng độ 1000ppm. Các mẫu cao chiết (1000
10
ppm) được tiến hành tương tự như đối với dung dịch gallic acid.
3.2.9. Xác định hàm lượng Flavonoid tổng số
Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Chất chuẩn rutin được chuẩn
bị trong methanol với các nồng độ 6,25; 12,5; 25; 50 và 100 μg/mL; dung dịch AlCl3
2% được pha trong nước cất. Lần lượt cho 100 μl mẫu/hoặc chất chuẩn đã chuẩn bị
vào 100 μl AlCl3 2% và để phản ứng trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong. Sau 15
phút, tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ (Thermo Scientific,
Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer) ở bước sóng 430 nm. Thí nghiệm
được lặp lại 3 lần. Kết quả OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu
chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid trong các mẫu cao chiết. Các mẫu
dịch chiết của cây thử nghiệm được tiến hành tương tự với rutin.
3.2.10. Phân tích các hoạt chất thứ cấp trong vật liệu bằng phương pháp sắc ký
khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
Theo phương pháp được mô tả của Xuan & cs. (2018). Hệ thống GC-MS (JMS-
T100 GCV, JEOL Ltd., Tokyo, Nhật Bản) được kết nối với bộ lấy mẫu tự động và
cột DB-5MS, chiều dài 30 m, id 0.25 mm, độ dày màng 0.25 µm (Agilent
Technologies, J &WScientific Products, Folsom, CA, USA).
3.2.11. Phương pháp phân hạng giá trị ức chế trung bình trong các thí nghiệm
Các giá trị ƯCTB (%) sẽ được phân hạng thành 3 mức độ ức chế: Giá trị ƯCTB
<20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50%: 03 điểm (tham khảo phương pháp
của Hong & cs., 2003). Cây có tổng số điểm phân hạng cao sẽ được lựa chọn để sử
dụng là nguồn vật liệu để thực hiện các thí nghiệm dịch chiết, xác định hoạt chất đối
kháng thực vật.
3.2.12. Phương pháp xử lý số liệu: Kỹ thuật phân tích số liệu thông kê qua các
chương trình phần mềm: Minitab 1.8, IRRISTAT ver 2010, Excel 2013.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA BỘT VẬT LIỆU THU THẬP ĐẾN SỰ
NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG CỦA HẠT CHỈ THỊ TRONG ĐIỀU KIỆN
PHÒNG THÍ NGHIỆM, NHÀ LƯỚI VÀ TRÊN ĐỒNG RUỘNG
4.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của bột vật liệu thu thập đến sự nảy mầm và sinh
11
trưởng của hạt chỉ thị trong điều kiện phòng thí nghiệm
4.1.1.1. Thí nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích thực hiện thí nghiệm này nhằm đánh giá sự ảnh hưởng từ bột vật liệu
tới sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt cây chỉ thị trong điều kiện kiểm soát nhiệt độ,
cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và độ ẩm. ƯCTB (%) sẽ được tính toán dựa
trên các nghiệm thức các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài thân, độ dài rễ, khối lượng
tươi, khối lượng khô của các cây chỉ thị so với đối chứng.
a. Chỉ thị hạt thóc (Oryza sativa)
Trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng, sự sinh trưởng của cây lúa luôn tồn
tại với sự cạnh tranh dinh dưỡng từ cỏ dại. Chính vì vậy, thí nghiệm trên hạt thóc
(Oryza sativa) cũng là một căn cứ để đánh giá sự ảnh hưởng của bột vật liệu tới cây
lúa, thể hiện mối tương quan giữa sự ức chế cỏ dại và sự sinh trưởng của lúa.
Đối với các thí nghiệm trên hạt thóc (Oryza sativa), các vật liệu biểu hiện ức chế
không đáng kể ở nồng độ 6,2 g/l, ngoại trừ lá liêm hồ đằng ức chế sự sinh trưởng của
hạt thóc (Oryza sativa) ngay cả ở nồng độ thấp với ƯCTB tới 25,66%.
Hình 4.1. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm
trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt thóc (Oryza sativa)
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 08 điểm, Rễ
liêm hồ đằng (RLHĐ): 06 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 06 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 10 điểm, Lạc dại (LD): 07 điểm, Thân gai (TG): 06 điểm, Lá gai (LG): 08 điểm, Tơ hồng xanh: 07 điểm.
12
b. Chỉ thị hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Hình so sánh 4.2 cho thấy tại nồng độ thấp 6,2 g/l, các vật liệu từ cây liêm hồ
đằng và tơ hồng xanh kích thích sự sinh trưởng của cỏ lồng vực (E. crus-galli), với
ƯCTB cao nhất tới 21,26% khi xử lý bột lá liêm hồ đằng. Tại nồng độ 12,5 g/l,
ƯCTB cao nhất lần lượt là: thân gai, lá gai, cỏ may, lạc dại, thân liêm hồ đằng. Tại
nồng độ 25 g/l, các vật liệu đều thể hiện tính ức chế với cỏ lồng vực (E. crus-galli),
với ƯCTB cao nhất của thân gai, lá gai, lạc dại, thân liêm hồ đằng, tơ hồng xanh. Còn
tại nồng độ cao nhất 50g/l, ƯCTB cao nhất lần lượt là thân gai, lá gai, cỏ may, lạc
dại, thân liêm hồ đằng. Như vậy có thể thấy tại các nồng độ trong điều kiện phòng thí
nghiệm thì bột thân gai, lá gai luôn ức chế cỏ lồng vực (E. crus-galli) với giá trị
ƯCTB cao.
Hình 4.2. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 07 điểm, Rễ
liêm hồ đằng (RLHĐ): 06 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 06 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 06 điểm, Lạc dại (LD): 08
điểm, Thân gai (TG): 09 điểm, Lá gai (LG): 08 điểm, Tơ hồng xanh: 06 điểm.
c. Chỉ thị hạt đỗ xanh (Vigna radiate)
Tại hình 4.3 cho thấy tại nồng độ thấp 6,2 g/l các vật liệu đều thể hiện ức chế sự
phát triển của hạt đỗ xanh (Vigna radiate), ngoại trừ rễ liêm hồ đằng cho thấy sự kích
thích nhẹ với ƯCTB là -6,26%. Tại nồng độ 12,5 g/l, ƯCTB của các vật liệu có giá
13
trị cao nhất lần lượt là: lá gai, lạc dại, thân gai, lá liêm hồ đằng, thân liêm hồ đằng.
Tại nồng độ 25 g/l, ƯCTB của các vật liệu có giá trị cao nhất lần lượt là: lá gai, thân
gai, lạc dại, lá liêm hồ đằng, thân liêm hồ đằng. Tương tự tại nồng độ 50 g/l, có thể dễ
dàng nhận thấy các vật liệu cho ƯCTB cao nhất lần lượt là: lá gai, thân gai, lạc dại, lá
liêm hồ đằng, thân liêm hồ đằng.
Hình 4.3. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm
trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt đỗ xanh (Vigna radiate)
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 06 điểm, Rễ
liêm hồ đằng (RLHĐ): 07 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 07 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 08 điểm, Lạc dại (LD): 08
điểm, Thân gai (TG): 08 điểm, Lá gai (LG): 10 điểm, Tơ hồng xanh: 06 điểm.
4.1.1.2. Thí nghiệm trong điều kiện nhà lưới
Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá sự ảnh hưởng khi xử lý bột vật
liệu tới sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực trong điều kiện nhà lưới với nhiệt độ từ 25 đến 30oC. ƯCTB (%) sẽ được tính toán dựa trên các nghiệm thức các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều dài thân của cỏ lồng
vực ở từng chậu thí nghiệm được so sánh với đối chứng. Thí nghiệm trong điều kiện
nhà lưới cho thấy tại các nồng độ từ 6,2 tới 50 g/l thì ƯCTB cao nhất đều là từ các
vật liệu: lá gai, lạc dại, thân gai. Điều đó cho thấy tính ức chế lên cỏ lồng vực (E.
crus-galli) của các vật liệu này rất rõ rệt trong điều kiện nhà lưới với nhiệt độ từ 25 đến 30oC. Ngoài ra, các vật liệu lá liêm hồ đằng, cỏ may, rễ liêm hồ đằng cũng thể hiện tính ức chế khá mạnh mẽ lên cỏ lồng vực (E. crus-galli) tại các nồng độ cao là
14
25, 50 g/l.
Hình 4.4. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm
trong điều kiện nhà lưới trên cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 06 điểm, Rễ
liêm hồ đằng (RLHĐ): 06 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 06 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 06 điểm, Lạc dại (LD): 09 điểm, Thân gai (TG): 08 điểm, Lá gai (LG): 10 điểm, Tơ hồng xanh: 06 điểm.
4.1.1.3. Thí nghiệm trong điều kiện đồng ruộng
a. Đánh giá ảnh hưởng của bột vật liệu đến cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Trong các thí nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, tại nồng độ
thấp mẫu thân liêm hồ đằng luôn biểu hiện sự kích thích nhẹ sự sinh trưởng của thực vật chỉ thị. Tuy nhiên tại thí nghiệm đồng ruộng, ở nồng độ 0,5t.ha-1 có thể nhận thấy bột thân liêm hồ đằng kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng của cỏ lồng vực (E. crus-
galli) với ƯCTB tới -49,4%. Ngoài ra, với nồng độ thấp thì bột từ rễ liêm hồ đằng, lá
liêm hồ đằng, cỏ may, tơ hồng xanh như một loại phân xanh, kích thích nhẹ sự phát triển cỏ lồng vực (E. crus-galli). Với liều lượng cao (1t.ha-1) thì các vật liệu bắt đầu biểu hiện ức chế lên cỏ lồng vực (E. crus-galli), ngoại trừ rễ liêm hồ đằng vẫn kích nhẹ với ƯCTB là -5,6%. Liều lượng 1,5t.ha-1 các mẫu cây thử nghiệm đều ức chế cỏ lồng vực (E. crus-galli), với ƯCTB cao nhất là: lá gai, thân gai, tơ hồng xanh, lạc dại. Tăng liều lượng tới 2t.ha-1 thì các vật liệu biểu hiện tính ức chế khá rõ rệt, với ƯCTB cao nhất thuộc về lá gai, thân gai, lạc dại, tơ hồng xanh, cỏ may. Như vậy, kể cả trong
điều kiện đồng ruộng thì lá gai, thân gai, lạc dại vẫn thể hiện tính ức chế mạnh mẽ
15
nhất tới cỏ lồng vực (E. crus-galli).
Hình 4.5. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các vật liệu trong
điều kiện đồng ruộng trên cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 06 điểm, Rễ liêm hồ đằng (RLHĐ): 05 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 06 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 05 điểm, Lạc dại (LD): 06
điểm, Thân gai (TG): 07 điểm, Lá gai (LG): 09 điểm, Tơ hồng xanh: 06 điểm.
Hình 4.6. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các vật liệu trong điều kiện đồng ruộng trên cỏ mọc tự nhiên
Chú thích: Giá trị ƯCTB <20%: 01 điểm; từ 20 đến <50%: 02 điểm ; ≥50: 03 điểm; Phân hạng: Cỏ may (CM): 06 điểm, Rễ liêm hồ đằng (RLHĐ): 06 điểm, Thân liêm hồ đằng (TLHĐ): 05 điểm, Lá liêm hồ đằng (LLHĐ): 05 điểm, Lạc dại (LD): 07
điểm, Thân gai (TG): 08 điểm, Lá gai (LG): 09 điểm, Tơ hồng xanh: 06 điểm.
16
b. Đánh giá ảnh hưởng của bột vật liệu đến cỏ tự nhiên
Trong thí nghiệm đồng ruộng xử lý bột vật liệu và để cỏ mọc tự nhiên cho thấy tại liều lượng 50 g/m2 thì các mẫu từ cây liêm hồ đằng, tơ hồng xanh và cỏ may vẫn
thể hiện sự kích thích sinh trưởng tới cỏ tự nhiên rõ rệt nhất, với ƯCTB của thân liêm hồ đằng tới -32,72%. Tại liều lượng 150 g/m2, các mẫu cây thử nghiệm đều ức chế tới
sự phát triển của cỏ tự nhiên, trong đó ƯCTB của lá gai tới 53,51%. Tại liều lượng
cao nhất, ƯCTB cao nhất của các vật liệu là: lá gai, thân gai, lạc dại, tơ hồng xanh.
4.1.1.4. Phân hạng giá trị ức chế trung bình của các mẫu cây thử nghiệm trong
các thí nghiệm
Bảng 4.1 cho thấy giá trị phân hạng ƯCTB của các mẫu cây thử nghiệm từ cao
tới thấp, lần lượt là: lá gai (54 điểm), thân gai (46 điểm), lạc dại (45 điểm), lá liêm hồ
đằng (40 điểm), cỏ may (39 điểm), tơ hồng xanh (37 điểm), thân liêm hồ đằng (36
điểm), rễ liêm hồ đằng (36 điểm). Giá trị phân hạng này sẽ là căn cứ để lựa chọn các
mẫy cây thử nghiệm có tiềm năng đối kháng thực vật cao nhất phục vụ cho các thí
nghiệm sử dụng dịch chiết từ vật liệu và các phân tích hóa sinh.
Bảng 4.1. Phân hạng giá trị ức chế trung bình của các mẫu cây thử nghiệm trong các thí
nghiệm
LAB ĐX 10 8 8 8 6 6 7 7
LAB THÓC 8 6 7 10 8 7 6 6
LAB CLV 8 9 8 6 7 6 6 6
NL CLV 10 8 9 6 6 6 6 6
ĐR CLV 9 7 6 5 6 6 6 5
ĐR Cỏ tự nhiên 9 8 7 5 6 6 5 6
Phân hạng (điểm) 54 46 45 40 39 37 36 36
LG TG LD LLHĐ CM THX TLHĐ RLHĐ
Chú thích : LAB : thí nghiệm trong điều kiện trong phòng, ĐR : Thí nghiệm trên đồng ruộng ; NL: Thí nghiệm trong
nhà lưới; LG: lá gai; TG: thân gai; LD: lạc dại; LLHĐ: lá liêm hồ đằng; TLHĐ: thân liêm hồ đằng; RLHĐ: rễ liêm hồ
đằng; CM: cỏ may; THX: tơ hồng xanh.
4.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG THỰC VẬT CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ
MẪU CÂY THỬ NGHIỆM
4.2.1. Chỉ thị hạt rau xà lách (Lactuca sativa)
Kết quả tại bảng 4.2 cho thấy trên chỉ thị hạt xà lách (Lactuca sativa), tại tất cả
17
các nghiệm thức thì cao chiết xuất từ lá gai đều cho IC50 thấp hơn so với thân gai. Qua đó cũng cho thấy tại chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều dài thân, cao chiết xuất ethyl
acetate từ lá gai cho IC50 rất thấp, lần lượt là 1,19 và 1,1 mg/ml. Điều đó cho thấy lá gai là nguồn vật liệu có tiềm năng rất lớn trong khai thai tính đối kháng thực vật.
Bảng 4.2. Nồng độ ức chế 50% (IC50) từ dịch chiết của cây gai và lạc dại đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt rau xà lách (Lactuca sativa)
IC50 (mg/ml)
Chiều dài rễ
Chiều dài thân
LG- ethyl acetate
LD- methanol
LD- hexan
LD- ethyl acetate
TG- ethyl acetate
1,19c ± 0,01 3,72a ± 0,22 1,7bc ± 0,02 2,01bc ± 0,13 2,64ab ± 0,99
1,1d ± 0,02 3,91a ± 0,29 1,54cd ± 0,04 2,03b ± 0,25 1,68bc ± 0,09
Chú thích: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Nghĩa là các giá trị có các chữ cái viết thường khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể trong cùng một cột (p <0,05) (n = 3). IC50 (nồng độ ức chế 50%); LG: lá gai; TG; thân gai; LD: lạc dại.
Đối với cây Lạc dại, chỉ tiêu trên rễ và thân cây chỉ thị cho thấy cao chiết từ
hexan thể hiện ức chế mạnh mẽ hơn so với ethyl acetate và methanol, với IC50 thấp lần lượt là 1,7 mg/ml và 1,54 mg/ml trên rễ và thân. Có thể thấy cao chiết của cây lạc
dại từ hexan và ethyl acetate gây ức chế rõ rệt tới sự phát triển thân rễ của hạt cỏ lồng
vực (E. crus-galli) và hạt rau xà lách (Lactuca sativa).
4.2.2. Chỉ thị hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli)
Kết quả tại bảng 4.3 cho thấy cao chiết xuất từ lá gai ức chế mạnh mẽ tới phần rễ của cỏ lồng vực (E. crus-galli), gần như gấp đôi so với cao chiết xuất từ thân gai (3.96 mg/ml và 7.34 mg/ml).
Bảng 4.3. Nồng độ ức chế 50% (IC50) từ dịch chiết của cây gai và lạc dại đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli)
IC50 (mg/ml)
LG- ethyl acetate
LD- methanol
LD- hexan
LD- ethyl acetate
Chiều dài rễ 3.9c ± 0.22 10.3a ± 0.26 4.08c ± 0.34 7.94b ± 0.51 7.34b ± 0.27
Chiều dài thân 9.3c ± 0.73 15a ± 0.11 8.4c ± 0.59 12.55b ± 0.43 9.02c ± 0.38
TG- ethyl acetate
Chú thích: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Nghĩa là các giá trị có các chữ cái viết thường khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể trong cùng một cột (p <0,05) (n = 3). IC50 (nồng độ ức chế 50%); LG: lá gai; TG; thân gai; LD: lạc dại.
18
Tuy nhiên ở chỉ tiêu chiều dài thân, cao chiết xuất từ thân gai cho IC50 thấp hơn
không đáng kể so với từ lá gai.
Đối với lạc dại, tại các chỉ tiêu chiều dài thân và rễ thì cao chiết xuất hexan có
IC50 thấp nhất, chỉ với lượng 4,08 mg/ml đối với rễ và 8,4 mg/ml đối với thân sẽ gây
ức chế 50% so với đối chứng.
4.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOLIC TỔNG SỐ VÀ FLAVONOID
TỔNG SỐ VÀ PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT THỨ CẤP TRONG VẬT
LIỆU
4.3.1. Xác định hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số
4.3.1.1. Xác định hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số từ cao chiết
ethyl acetate của cây gai
Kết quả tại bảng 4.4 có thể thấy hàm lượng phenolic tổng số được xác định từ
cao chiết xuất ethyl acetate từ mẫu thân gai có hàm lượng phenolic tổng cao nhất là
0,35 (mg GAE/g DW).
Bảng 4.4. Hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số của cao chiết ethyl acetate
từ lá gai, thân gai
Lá gai- ethyl acetate
TPC (mg GAE/g DW) 0,05b ± 0,012 0,35b ± 0,008
TFC (mg RE/g DW) 0,05c ± 0,0003 0,14b ± 0,0026
Thân gai- ethyl acetate
Chú thích: TPC: hàm lượng phenolic tổng số ; TFC: hàm lượng flavonoid tổng số. Dữ liệu được trình bày dưới dạng
trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Nghĩa là các giá trị có các chữ cái viết thường khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể
trong cùng một cột (p <0,05) (n = 3); LG: lá gai; TG; thân gai.
Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy, hàm lượng flavonoid tổng số được xác định từ cao
chiết ethyl acetate trong thân gai là 0,14 (mg RE/g DW) cao hơn so với lá gai (0,05 mg
RE/g DW).
4.3.1.2. Xác định hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số của các cao
chiết xuất từ cây lạc dại
Kết quả cho thấy hàm lượng phenolic tổng của cao chiết từ methanol là cao nhất
với 2,67 (mgGAE/g DW), tiếp đó là cao chiết từ ethyl acetate là 0,39 (mgGAE/g
19
DW) và hexan là 0,19 (mgGAE/g DW).
Trong thí nghiệm xác định hàm lượng flavonoid, kết quả ở bảng 4.5 cũng cho
thấy hàm lượng flavonoid tổng số được xác định từ cao chiết methanol là cao hơn so
với cao chiết từ hexan và ethyl acetate. Kết quả cũng cho thấy hàm lượng flavonoid
tổng trong cao chiết methanol của lạc dại là 1,01 (mg RE/g DW), khá cao so với 0,26
(mg RE/g DW) của ethyl acetate.
Bảng 4.5. Hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số
trong các cao chiết từ cây lạc dại
Methanol
Hexan
TPC (mg GAE/g DW) 2,67a ± 0,053 0,19c ± 0,009 0,39b ± 0,035
TFC (mg RE/g DW) 1,01a ± 0,004 0,49b ± 0,01 0,26c ± 0,003
Ethyl acetate
Chú thích: TPC: hàm lượng phenolic tổng số ; TFC: hàm lượng flavonoid tổng số. Dữ liệu được trình bày dưới dạng
trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Nghĩa là các giá trị có các chữ cái viết thường khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể
trong cùng một cột (p <0,05) (n = 3)
Kết quả cho thấy cao chiết methanol của lạc dại có hàm lượng phenolic tổng và
flavonoid tổng cao nhất, tuy nhiên để có thể xác định các hợp chất thứ cấp có tiềm
năng đối kháng thực vật cần phải tiếp tục phân tích các mẫu từ cao chiết từ methanol,
hexan và ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký để có thể xác các hợp chất đối kháng
thực vật trong đó.
4.3.2. Phân tích các hợp chất thứ cấp trong vật liệu bằng phương pháp sắc ký
khí ghép khối phổ (GC-MS)
4.3.2.1. Cây lạc dại
a. Mẫu lạc dại chiết xuất từ methanol
Trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS
(Gas Chromatography - Mass Spectometry) để xác định các thành phần hợp chất thứ
cấp trong cao chiết xuất methanol của lạc dại. Phương pháp xác định bằng cách so
sánh thời gian lưu (phút), khối lượng phân tử (Da) và các điểm tương đồng. Nồng độ
của hợp chất được biểu thị bằng diện tích đỉnh (% of total area).
Kết quả cho thấy (Hình 4.7) xác định được 12 hợp chất thứ cấp trong cao chiết
methanol của lạc dại. Một số trong các hợp chất thứ cấp đó đã được xác định có
20
thuộc tính đối kháng thực vật, tương đồng với các nghiên cứu trên thế giới.
Hình 4.7. Phân tích GC-MS mẫu cao chiết methanol của cây lạc dại bằng phần mềm JEOL’s
GC-MS Mass Center System
b. Mẫu lạc dại chiết xuất từ Hexan
Có 15 hợp chất đã được xác định trong cao chiết xuất hexan của cây lạc dại.
Trong đó các hợp chất đã xác định là hợp chất đối kháng thực vật theo các công bố
quốc tế như: Ethanol, 2-[2-(2-butoxyethoxy) ethoxy]-; Hexadecanoic acid, methyl
ester; n-Hexadecanoic acid hay palmitic acid; 9,12-Octadecadienoic acid, methyl
ester; Octadecanoic acid (Stearic acid); n-Decanoic acid; Stigmasterol; γ-Sitosterol;
Lupeol.
Hình 4.8. Phân tích GC-MS mẫu cao chiết từ hexan của cây lạc dại bằng phần mềm
JEOL’s GC-MS Mass Center System
c. Mẫu lạc dại chiết xuất từ Ethyl acetate
Kết quả phân tích GC-MS từ cao chiết ethyl acetate của cây lạc dại (Hình 4.9)
21
cho thấy đã xác định được 17 hợp chất thứ cấp. Có 05 hợp chất đối kháng thực vật đã
được xác định theo các công bố quốc tế.
Hình 4.9. Phân tích GC-MS mẫu cao chiết từ ethyl acetate của cây lạc dại bằng phần
mềm JEOL’s GC-MS Mass Center System
4.3.2.2. Cây gai
a. Mẫu thân gai chiết xuất từ ethyl acetate
Trong các hợp chất được xác định từ cao chiết xuất ethyl acetate của thân gai có 04 hợp chất đã được xác định theo các công bố quốc tế là hợp chất đối kháng thực vật, gồm: 2-methoxy-4-vinylphenol; 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid; p- Coumaric acid, trans; n-Decanoic acid (capric acid).
Hình 4.10. Phân tích GC-MS mẫu cao chiết ethyl acetate của thân gai bằng phần mềm
JEOL’s GC-MS Mass Center System
b Mẫu lá gai chiết xuất từ ethyl acetate
22
Có 04 hợp chất đã được xác định là hợp chất đối kháng thực vật
allelochemicals là scopoletin chiếm 0,75%, Benzeneacetic acid (axit phenylacetic)
chiếm 2,16%, Hexanoic acid chiếm 17,62%, Pentanoic acid (valeric acid) chiếm
17,62%.
Hình 4.11. Phân tích GC-MS mẫu cao chiết ethyl acetate của lá gai bằng
phần mềm JEOL’s GC-MS Mass Center System
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1. Thu thập 05 loài cây thử nghiệm bao gồm: cây lạc dại (Arachis pintoi),
liêm hồ đằng (Cissus sicyoides), tơ hồng xanh (Cassytha filiformis), cây gai
(Boehmeria nivea), cỏ may (Chrysopogon aciculatus). Đánh giá bột của mẫu cây
thử nghiệm ảnh hưởng đến sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực nước
(E. crus-galli), hạt thóc (Oryza sativa), hạt đỗ xanh (Vigna radiate) trong điều
kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng, trong đó mẫu lá gai đạt
điểm phân hạng giá trị ức chế trung bình cao nhất.
2. Đánh giá tính đối kháng thực vật bằng cao chiết của cây thử nghiệm cho
thấy cao chiết ethyl acetate của lá gai thể hiện ức chế thực vật mạnh nhất đối với
cả hai chỉ thị là hạt xà lách (Lactuca sativa) và cỏ lồng vực nước (E. crus-galli),
với giá trị IC50 ở chỉ tiêu chiều dài rễ và thân lần lượt là 1,19 và 1,1 mg/ml trên xà
23
lách và 3,96 và 9,3 mg/ml trên cỏ lồng vực nước.
3. Hàm lượng phenolic tổng số (TPC) và hàm lượng flavonoid tổng số (TFC)
có mối tương quan thuận với ức chế hạt chỉ thỉ là hạt xà lách (Lactuca sativa) và
hạt cỏ lồng vực nước (E. crus-galli), trong đó hàm lượng phenolic tổng số và
flavonoid tổng số cao nhất xác định được đều từ cao chiết methanol của cây lạc
dại lần lượt là 2,67 (mg RE/g DW) và 1,01 (mg RE/g DW).
Các mẫu cao chiết của cây lạc dại (methanol, hexan, ethyl acetate) xác định
được số lượng hợp chất thứ cấp liên quan tới tính đối kháng thực vật nhiều nhất
bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS, gồm: (i) 04 hợp chất đối
kháng thực vật từ cao chiết methanol: Hexadecanoic acid, methyl ester chiếm
15,23% (diện tích đỉnh); n-Hexadecanoic acid chiếm 10,2%; n-Decanoic acid
chiếm 10,2%; Pyrrole chiếm 8,13%; (ii) 09 hợp chất đối kháng thực vật từ cao
chiết hexan: Ethanol, 2-[2-(2-butoxyethoxy) ethoxy]- chiếm 0,75%; Hexadecanoic
acid, methyl ester chiếm 24,04%; n-Hexadecanoic acid hay palmitic acid chiếm
20,03%; 9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester chiếm 16,12%; Octadecanoic
acid (Stearic acid) chiếm 1,8%; n-Decanoic acid chiếm 1,8%; Stigmasterol chiếm
0,83%; γ-Sitosterol chiếm 1,89% và Lupeol chiếm 1,66%; (iii) 05 hợp chất đối
kháng thực vật từ cao chiết ethyl acetate: maltol chiếm 1,09%; n-hexadecanoic
acid hay palmitic acid chiếm 6,43%; benzofuran, 2,3-dihydro- chiếm 1,11%;
ethanol,2-[2-(2-butoxyethoxy) ethoxy]- (còn gọi là triethylene glycol monobutyl
ether) chiếm 1,52%; hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (còn gọi là
hexanedioic acid dioctyl ester hoặc bis(2-ethylhexyl) adipate) chiếm 0,65%.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Nghiên cứu tiếp tục thực hiện những thí nghiệm, phân tích định lượng, xác
định phần trăm khối lượng các hợp chất thứ cấp trong các cao chiết ethyl acetate của
cây gai, cao chiết methanol, hexan, ethyl acetate của cây lạc dại.
- Nghiên cứu tiếp tục đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cao chiết từ các
24
mẫu cây thử nghiệm khác như cây tơ hồng xanh, cây liêm hồ đằng, cây cỏ may.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Phan Trung Thắng, Nguyễn Văn Viên, Khuất Hữu Trung & Trần Đăng Khánh
(2019). Nghiên cứu hoạt tính đối kháng (Allelopathy) của thân, lá cây gai
(Boehmeria nivea (L.) Gaudich.) tới khả năng sinh trưởng của cỏ lồng vực
(Echinochloa crus-galli) trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới. Tạp chí
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. ISSN: 1859-0004. 17(11): 891-900.
2. Thang P. T., N. V. Vien & T. D. Khanh (2021). Allelopathic potential of an
invasive plant (Cassytha filiformis L.) Under different assessing conditions.
Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology. ISSN: 0972-2025. 22(17&18):
82-94.
3. Phan Trung Thắng, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Thanh Nhung, Nguyễn Hà Trang
Linh & Trần Đăng Khánh (2022). Đánh giá tiềm năng đối kháng thực vật
(allelopathy) của cây cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin.) trong các
điều kiện sàng lọc khác nhau. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. ISSN:
1859-0004. 20(10): 1361-1373.
4. Thang P. T., Vien N. V., Anh L. H., Xuan T. D., Duong V. X., Nhung N. T.,
Trung K. H., Quan N. T., Nguyen C. C., Loan L. T. K., Khanh T. D. & Ha T. T.
T. (2023). Assessment of allelopathic activity of Arachis pintoi Krapov. & W.C.
Greg as a potential source of natural herbicide for paddy rice. Applied
Sciences. ISSN: 2076-3417. 13(14): 8268.
