Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:97

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò được thực hiện với mục tiêu nhằm Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh và chính xác O. tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao; đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA được thiết lập. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------ Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS HỒ HỮU THỌ TS. MAI THỊ ĐÀM LINH Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hồ Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy đã tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Mai Thị Đàm Linh – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài. Xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học và Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này. Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019 Học viên Lê Thị Thúy
MỤC LỤC MỤC LỤC ...................................................................................................................4 DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................7 DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................9 DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..............................................................10 ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................3 1.1 Bệnh sốt mò ................................................................................................3 1.1.1 Dịch tễ học ...........................................................................................3 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng ..............................................................................7 1.1.3 Điều trị .................................................................................................9 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò ............................................................................10 1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi .............................10 1.2.1. Đặc điểm sinh học .............................................................................10 1.2.2. Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò ..........................................................14 1.2.3. Cơ chế gây bệnh sốt mò ....................................................................18 1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò ............................................22 1.3.1. Phương pháp huyết thanh học .................................................................22 1.3.2. Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR ................................24 1.3.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) ..........................................................................................24 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................34 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................34
2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA .....................................................34 2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo ...................................................................35 2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm nghiên cứu thiết kế ................................................................................................35 2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập ..................................................................37 2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng ......................................................................37 2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng ...................................................................38 2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) ......................................................39 2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện ............................................................................40 2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường ...............................................................................................................41 2.7.1. Đánh giá độ nhạy ....................................................................................41 2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu ...............................................................................41 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................43 3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ..........................................43 3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ...........44 3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA ........................................................................45 3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi ...................................................52 3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA ..................................................................55 3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (PrimerDesign) ......................................................................................................57 3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường ...............................................................................................................................59 KẾT LUẬN ...............................................................................................................64
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................66 PHỤ LỤC ..................................................................................................................84 Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi.........................84 Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò .................................................................................................................85 Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo ...................................................................................................................................86 Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo .......................................87
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] .........................................4 Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt ........................................................................8 Hình 1.3. Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh trong tế bào nội mô mạch máu ...............................................................................................11 Hình 1.4. Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense ..............................................16 Hình 1.5. Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O. tsutsugamushi [62] ............................................................................................................................21 Hình 1.6. Chu trình phản ứng RPA [53] ...................................................................29 Hình 1.7. Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53] ..................................................31 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................34 Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo ............................................35 Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu ............................37 Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của O. tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs [38] ...................................................................................................................................44 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu .................................................................................45 Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi ........47 Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi ...................................................................................................................................49 Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi ............................................................................................................50
Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi ............................................................................................................51 Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi ............................................................................................................55 Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát hiện O. tsutsugamushi .......................................................................................56 Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10) ...............................................59 Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò ..............................................................................................................................60 Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt ...........................................................................................................62
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] ........................4 Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng RPA ...........................................................................................................................26 Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ...............................32 Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA ...............36 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR ........................................................39 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt ..........................................................................................40 Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi ...................................................................................................................................43 Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA .......................................52 Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix .................................................................................52 Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O. tsutsugamushi ...............................................................................................57 Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình ....................................................62
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 1. bp : Base pair 2. DNA : Deoxyribonucleic acid 3. kb : Kilo base 4. LAMP : Loop-mediated isothermal amplification 5. NAT : Nucleic acid test 6. PCR : Polymerase chain reaction 7. RNA : Ribonucleic acid 8. RPA : Recombinase polymerase amplification
ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mò là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng ở khu vực châu Á- Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của của Cục Y tế dự phòng, bệnh sốt mò có mặt ở hầu hết 24 tỉnh phía Bắc chiếm 38,51% số bệnh nhân sốt nhập viện, không rõ căn nguyên. Bệnh do tác nhân Orientia tsutsugamushi gây nên; trung gian truyền bệnh là ấu trùng mò Leptotrombidium. Nếu không được điều trị sớm với loại kháng sinh phù hợp có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong cao. Trong khi đó, các triệu chứng của bệnh sốt mò thường không đặc hiệu và có thể lẫn với nhiều loại mầm bệnh khác với các phác đồ điều trị khác nhau (sốt xuyết huyết, sốt xoắn khuẩn vàng da …). Để có thể bắt đầu phác đồ điều trị phù hợp kịp thời, việc chẩn đoán sớm nhiễm O. tsutsugamushi đóng vai trò quyết định. Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử như PCR/realtime PCR phát hiện O. tsutsugamushi đã được nghiên cứu và phát triển nhằm cải thiện những hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể đặc hiệu hiện có trong chẩn đoán sốt mò. Tuy nhiên, để ứng dụng các phương pháp này vào chẩn đoán đòi hỏi phải đào tạo vận hành máy luân nhiệt PCR, và trong điều kiện với nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định là rất khó khăn. Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR/realtime PCR truyền thống trong kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng trong chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt. Recombinase polymerase amplification (RPA) là một trong những phương pháp khuếch đại acid nuclecic đẳng nhiệt với nhiều ưu điểm nổi bật. Khác với PCR truyền thống, công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân (Escherichia coli RecA recombinase hoặc T4 UvsX protein) giúp các mồi gắn đặc hiệu vào gen đích và enzyme DNA polymerase với hoạt tính thay thế sợi cho phép tổng hợp liên tục DNA mà không cần biến tính sợi kép DNA ở nhiệt độ cao, do vậy không cần đến thiết bị luân nhiệt được thiết kế tinh vi với giá thành cao. Phản ứng 1
RPA có thể được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C, so với các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác như NASBA, SDA hay LAMP thì điều kiện nhiệt độ của RPA khá dễ dàng thiết lập và đảm bảo. Bên cạnh đó, thời gian để có thể phát hiện được tín hiệu từ đơn phân tử đích ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp đẳng nhiệt khác và PCR. Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế về nguồn lực. Hiện nay, trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu thiết lập các quy trình RPA nhằm phát hiện nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh sốt mò -O. tsutsugamushi. Các quy trình được thiết lập vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, đặc biệt là khi đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thấp tại khu vực Đông Nam Á. Qua phân tích tính đa hình nhận thấy trình tự mồi xuôi và probe thiết kế trong nghiên cứu đã công bố có đến 03 vị trí chưa bổ sung hoàn toàn với trình tự gen đích 47-kDa của hầu hết các chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dẫn đến hiệu suất chẩn đoán bệnh sốt mò bị hạn chế khi áp dụng tại Việt Nam và các nước trong khu vực. Với những lý do thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò” với hai mục tiêu chính: 1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh và chính xác O. tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao 2) Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA được thiết lập 2
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sốt mò Bệnh sốt mò hay phát ban, còn được biết đến với tên gọi là bệnh tsutsugamushi, gây ra bởi trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội bào bắt buộc [112, 135]. Khoảng 5 đến 14 ngày sau khi bị cắn bởi tác nhân mang bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có những biểu hiện của nhiễm trùng như các triệu chứng giống cúm như sốt, phát ban, sẩn ở vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho, nổi hạch, buồn nôn, nôn và đau bụng [74, 75, 101]. Sốt và đau đầu là những đặc điểm phổ biến nhất ở bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% các trường hợp [74]. 1.1.1 Dịch tễ học  Dịch tễ học bệnh sốt mò trên thế giới Bệnh sốt mò lưu hành rộng trên thế giới, gặp ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, Đông Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới phía đông Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines... [98, 124, 141]. Trước đây, bệnh được xác định vùng dịch tễ là tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật Bản đến phía đông của Liên bang Nga, phía bắc của nước Úc và phía tây của Pakistan, Afghanistan [75, 99, 138]. Tuy nhiên, các báo cáo gần đây về bệnh sốt mò cho thấy bệnh đã vượt quá giới hạn của “Tam giác Tsutsugamushi” khi được phát hiện ở Chile, Peru, bán đảo Ả rập, một số khu vực Châu Phi [92, 139]. 3
Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] Bệnh là vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng và là một trong những bệnh truyền nhiễm bị lãng quên. Ước tính mỗi năm có khoảng một triệu ca nhiễm bệnh sốt mò và hơn một tỷ người trên thế giới có nguy cơ mắc bệnh hàng năm. Trong những năm vừa qua, bệnh sốt mò đã gây dịch ở nhiều nước với số mắc và tử vong cao ở nhiều khu vực [77, 99, 107]. Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] TT Số ca tử Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong 1 Thái Lan Chiang Mai 2007 65 0 2 Ấn Độ Bishnipur-Manipur 2007 38 2 3 Himachal Pradesh Ấn Độ 2008 5 1 (northern India) 4 Ấn Độ Pondicherry 2008 50 1 5 Ấn Độ Meghalaya 2010 24 0 6 Ấn Độ Sikkim 2011 63 0 4
TT Số ca tử Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong 7 Ấn Độ Chennai 2011 52 0 8 Northern Úc 2011 124 0 Queensland 9 Trung Quốc Guangdong 2012 29 4 10 Ấn Độ Meghalaya 2012 90 5 11 Ấn Độ Rajasthan 2012 42 7 12 Trung Quốc Jiangsu 2013 271 0 13 Ấn Độ Puducherry 2013 28 0 14 Ấn Độ Northern India 2013-2014 228 0 15 Quần đảo Western Province 2014 9 0 Solomon 16 Bu-tan Thimphu 2014 12 2 17 Ấn Độ Uttarakhand 2014 69 1 18 Ấn Độ Andhra-pradesh 2014 176 8 19 Ấn Độ Rajasthan 2014 66 14 20 Nepal Kathmandu 2015 23 0 21 Nepal Chaitwan 2016 264 8  Phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh sốt mò đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX. Một nghiên cứu thực hiện ở cả miền Nam và miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh đã được ghi nhận 5
lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh, thành. Tuy nhiên, trong một thời gian dài, bệnh ít được phát hiện do việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol và tetracycline trong thực hành y khoa và thiếu các xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25]. Sau năm 1990, hàng nghìn người mắc và hàng trăm người chết do bệnh sốt mò được ghi nhận tại các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước,... [11]. Sau thời gian dài bệnh tạm lắng, gần đây bệnh lẻ tẻ xuất hiện ở nhiều nơi và có xu hướng ngày càng tăng cao. Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò. Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò là 18 trường hợp từ các huyện: Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên và Lục Ngạn. Trong đó có 6 bệnh nhân nam (33,3%) và 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20]. Theo kết quả điều tra của Nguyễn Duy Quyền (2002), tại đảo Thanh Lân và Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò là 0,14/1.000 dân [24]. Năm 2000-2002, tại Bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt mò vào điều trị. Bệnh nhân sốt mò được phát hiện rải rác quanh năm, tập trung nhiều từ tháng 5-10. Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mò đốt (94,2%); có sốt (100%); có nổi hạch (98,7%) và phát ban (52,2%). Điều trị bằng chloramphenicol và tetracyclin sau 5-7 ngày hết sốt [18]. Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã thống kê được 251 ca bệnh sốt mò (trong đó nam chiếm 50,6% và nữ chiếm 49,4%) từ 225 xã thuộc 125 huyện của 24 tỉnh thuộc Bắc bộ và Bắc Trung bộ nhập viện điều trị, chiếm 35,3% số các trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25]. Từ năm 1998 đến năm 2005, tại Bệnh viện 110 đã điều trị 168 ca sốt mò. Từ năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành ở nhiều vùng trung du và rừng núi của Việt Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên,... với số ca bệnh lên đến hàng trăm ca mỗi năm [7, 13, 21]. 6
Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010), kết quả điều tra sơ bộ huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ phơi nhiễm Orientia tsutsugamushi trong cộng đồng dân cư tại các khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung bộ và Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi ở khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông 13,99% và huyện Krông Pa 7,14%), và Kon Tum 5,21% [11]. Từ 2008 đến 2010, tại miền Trung và Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mò, trong đó ở M’ Drăk (Đăk Lăk) chỉ có 2 bệnh nhân, còn lại 469 bệnh nhân ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung ở Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang (27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11]. Tại tỉnh Yên Bái, trong 2 năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mò tăng đột biến, đã có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp) đến điều trị sốt mò. Trong số đó có 7 ca tử vong. Các bệnh nhân đến từ các huyện: Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải 157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh nhân (7,6%); huyện Trấn Yên 1 bệnh nhân (0,4%). Bệnh nhân gặp ở nữ (61,25%) nhiều hơn nam (38,75%). Bệnh gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó bệnh nhân trong độ tuổi lao động nhiều nhất (51%). Bệnh nhân làm nhiều nghề khác nhau trong đó gặp nhiều nhất là làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22]. Các thông tin trên cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam có xu hướng ngày càng mở rộng, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều khu vực với số bệnh nhân ngày càng tăng lên. 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình 8 - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1]. Lúc đầu tại nơi ấu trùng mò đốt có một nốt phỏng nước kích thước khoảng 2 - 5mm, không đau, bệnh nhân thường không chú ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát ra với những triệu chứng sau: 7
Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày nếu không điều trị; Có khi rét run 1 - 2 ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu nặng, đau mỏi cơ. Nốt loét đặc trưng (điển hình của sốt mò): Thường ở vùng da mềm, ẩm, như bộ phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ…, đôi khi ở vị trí bất ngờ trong vành tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm của nốt loét: Không đau, không ngứa; người bệnh thường chỉ có một nốt, hiếm khi có nhiều hơn; nốt hình tròn hoặc bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt phỏng ban đầu phát triển dần thành dịch đục trên một nền sẩn đỏ, sau 4 - 5 ngày vỡ thành một nốt có vẩy nâu nhạt hoặc đen tùy vào vùng da mềm hay cứng và độ non hay già của nốt loét; sau một thời gian, vẩy bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng đỏ hoặc thâm tùy theo bệnh đang phát triển hay đã lui; từ khi hết sốt nốt loét liền dần; nốt loét gặp ở 65 - 80% các trường hợp [1, 15, 26]. Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt Hạch và ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng và đau, không đỏ, vẫn di động, xuất hiện cùng với sốt hoặc sau 2 - 3 ngày, là chỉ điểm tìm nốt loét; Hạch toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ những ca nặng. Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ nhất đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn tại vài giờ đến 1 tuần, thưa hơn so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất hiện 8
ban, tùy thời điểm bệnh nhân được khám; đôi khi có đốm xuất huyết (dưới 10%). Trong những ngày đầu, da và niêm mạc xung huyết ở đa số các trường hợp (khoảng 88%), khác với sốt rét và thương hàn [67, 113, 26]. Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi không điển hình [2, 143]. Ngoài ra, sốt mò còn có thể ẩn và thể không điển hình (không có nốt loét). Nếu được điều trị bằng kháng sinh thích hợp, sẽ cắt sốt nhanh. Nếu can thiệp muộn hoặc không hiệu quả, có thể có biến chứng như viêm cơ tim, sốc nhiễm khuẩn, viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não... dẫn đến tử vong [6, 102]. Tỷ lệ tử vong do Orientia tsutsugamushi khác nhau ở từng nước, từng vùng, phụ thuộc vào chủng lưu hành ở địa phương. Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%, Indonesia và Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26]. 1.1.3 Điều trị Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò là chloramphenicol, doxycycline và tetracycline. Các bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu sẽ hết sốt sau 1 - 2 ngày. Tuy nhiên, do các kháng sinh này không có tác dụng diệt vi khuẩn mà chỉ có tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn Orientia tsutsugamushi vẫn sống và tồn tại trong hạch bạch huyết, ở hệ võng nội mô trong nhiều ngày, nhiều tháng và dễ tái phát bệnh [12, 25, 26]. - Doxycycline là thuốc được lựa chọn hàng đầu. Liều thường dùng là viên 100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài 7 ngày. - Tetracycline được sử dụng ở liều 2g/24 giờ chia 4 lần, cách nhau 6 giờ. - Chloramphenicol được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều khuyến cáo là 2g một ngày chia 4 lần, đến khi hết sốt 2-3 ngày. - Các thuốc macrolide cũng có tác dụng với sốt mò, tốt nhất là azithromycin và 9
thuốc này có thể chỉ định cho trẻ dưới 8 tuổi và phụ nữ mang thai [40]. 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò Thực hiện các biện pháp tuyền truyền giáo dục sức khỏe kết hợp vệ sinh phòng bệnh. Điều tra cơ bản phát hiện ổ dịch ở địa bàn nghi ngờ và có người ở để xử lý (bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mò, phân loại, phân lập O. tsutsugamushi , tìm kháng thể, phát hiện bệnh nhân). Tại ổ dịch đã xác định hoặc nghi ngờ: - Biện pháp ngăn ngừa mò đốt: + Tránh ngồi nằm phơi quần áo đặt balô trên bãi cỏ, gần bờ bụi, gốc cây; khi đi phát nương làm rẫy, hành quân dã ngoại, trinh sát vào rừng cần mang giầy và tất, chít ống quần. + Tối ưu tẩm quần áo bằng thuốc diệt mò (permethrine và benzyl benzoat) hoặc xoa chân, tay, cổ bằng các thuốc xua mò (diethyltoluamid, DEET,...). - Diệt mò ở môi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cây cỏ cao dưới 20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin, chlordan. - Diệt chuột theo mùa, chú ý rắc thuốc diệt mò trước. - Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc các đám thực vật có nhiều ấu trùng mò (đảo mò). 1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi 1.2.1. Đặc điểm sinh học Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở Việt Nam. Orientia tsutsugamushi (còn có tên Rickettsia orientalis, hoặc Rickettsia tsutsugamushi) là một loài trong nhóm Rickettsia thuộc Giới Bacteria, Ngành Proteobacteria, Lớp Alphaproteobacteria, Bộ Rickettsiales, Họ Rickettsiaceae, Giống 10