ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------
Lê Thị Thúy
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT
RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC
NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------
Lê Thị Thúy
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT
RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC
NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số : 8420101.07
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS HỒ HỮU THỌ
TS. MAI THỊ ĐÀM LINH
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hồ
Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy đã
tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Mai Thị Đàm Linh –
Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến
thức và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ gen và
Di truyền tế bào đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học và
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp
đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019
Học viên
Lê Thị Thúy
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... 4
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... 7
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 9
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT .............................................................. 10
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1 Bệnh sốt mò ................................................................................................ 3
1.1.1 Dịch tễ học ........................................................................................... 3
1.1.2 Đặc điểm lâm sàng .............................................................................. 7
1.1.3 Điều trị ................................................................................................. 9
1.1.4 Phòng bệnh sốt mò ............................................................................ 10
1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi ............................. 10
1.2.1. Đặc điểm sinh học ............................................................................. 10
1.2.2. Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò .......................................................... 14
1.2.3. Cơ chế gây bệnh sốt mò .................................................................... 18
1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò ............................................ 22
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học ................................................................. 22
1.3.2. Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR ................................ 24
1.3.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase
amplification (RPA) .......................................................................................... 24
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 34
2.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................ 34
2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA ..................................................... 34
2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo ................................................................... 35
2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm
nghiên cứu thiết kế ................................................................................................ 35
2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập .................................................................. 37
2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng ...................................................................... 37
2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng ................................................................... 38
2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) ...................................................... 39
2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện ............................................................................ 40
2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên
thị trường ............................................................................................................... 41
2.7.1. Đánh giá độ nhạy .................................................................................... 41
2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu ............................................................................... 41
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 43
3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa .......................................... 43
3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ........... 44
3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA ........................................................................ 45
3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi ................................................... 52
3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA .................................................................. 55
3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
(PrimerDesign) ...................................................................................................... 57
3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
............................................................................................................................... 59
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 64