Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------------------- NGUYỄN THỊ HIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Động vật học

Hà Nội - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, các

số liệu trong luận văn là trung thực và chính xác.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc

cảm ơn đầy đủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hiệp

LỜI CẢM ƠN!

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Linh,

chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Bùi Xuân

Nguyên, TS. Nguyễn Thị Ƣớc, những ngƣời thầy đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn

tôi trong công việc chuyên môn cũng nhƣ những kinh nghiệm trong cuộc sống.

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán bộ nghiên cứu

Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt là TS. Nguyễn Văn Hạnh, Ths. Nguyễn Thị

Hồng, Ths. Nguyễn Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn Lâm đã nhiệt tình giúp đỡ,

ủng hộ và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này.

Luận văn đƣợc hoàn thành với sự tài trợ của Quỹ Phát triển khoa học và

công nghệ quốc gia trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của giọt

noãn bào chất đơn tính lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi” mã số

106.12-2012.93 do TS. Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm.

Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện về

thủ tục hành chính để tôi bảo vệ luận văn này.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã

luôn sát cánh, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Học viên

Nguyễn Thị Hiệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................... iii

DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... .v

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ …vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... ..viii

PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1

1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................... 1

1.2 Mục đích ....................................................................................................... 2

1.3 Ý nghĩa ......................................................................................................... 3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4

2.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn ............................................ 4

2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng .................................................. 4

2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng ......................................... 6

2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng .............................................................. 9

2.2 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn ......................................................................... 10

2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh

....................................................................................................................... 10

2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn trong ống nghiệm ............................... 13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn ............. 20

2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) ở

Việt Nam .......................................................................................................... 26

PHẦN III. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 29

3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .............................................................. 29

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .............................................. 29

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi ............................................ 29

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 32

3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu và rửa buồng trứng ...................................... 32

3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng ..................... 33

3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng ............................................. 35

3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau khi nuôi ................................... 37

3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF).......... 38

3.4.7. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang ..................................... 42

3.4.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 43

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 43

4.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới sự thành thục của tế bào trứng lợn ... 44

4.2 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn. ... 48

4.3 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển của phôi lợn

thụ tinh ống nghiệm ......................................................................................... 50

4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn

54

4.5 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh sự phát triển và chất lƣợng của phôi lợn. ... 63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 70

5.1. Kết luận ..................................................................................................... 70

5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 71

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng 43 thành thục của tế bào trứng lợn

Bảng 4.2 . Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng 47 hình thành tiền nhân đực của tế bào trứng lợn.

Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát 49 triển tiếp theo của tế bào trứng lợn

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của 53 tinh trùng với trứng loại A

Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của 56 tinh trùng với trứng loại B1

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của 57 tinh trùng với trứng loại B2

Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo 61 của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo 62 của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo 63 của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2

DANH MỤC HÌNH

Tên hình Trang

Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn 5

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng 6

Hình 3. 1. Buồng trứng lợn lai kinh tế 33

Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2 35

Hình 4.1 Trứng lợn ở giai đoạn GV (a) và giai đoạn MI. 44

Hình 4.2 Trứng lợn ở giai đoạn thành thục 45

Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng 55

lợn đa thụ tinh

Hình 4.4 Phôi ở giai đoạn 4 tế bào (a) và giai đoạn phôi dâu (b) 65

Hình 4.4. Phôi nang (Blastocyst) 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 4.5 Số tế bào/phôi nang 67

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Tên biểu đồ Trang

Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập 58

của tinh trùng

Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành 59

tiền nhân

Biểu đồ 4. 3. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh 60

bình thƣờng của tế bào trứng lợn.

Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng phân chia 64

của tế bào trứng lợn

Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành 65

phôi nang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Biểu đồ 4.6. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang 66

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

DMSO Dimethyl Sulfoxide Chất bảo quản lạnh

Equine Chorionic ECG Gonadotropin nhau thai ngựa Gonadotropin

Yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng EGF Epidermal growth factor biểu mô

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bê

FM Fertilization medium Môi trƣờng thụ tinh

FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng

GSH Glutathione

GV Germinal vesicle Giai đoạn bóng mầm

GVBD Germinal Vesicle Break Down Giai đoạn tan bóng mầm

Human Chorionic HCG Gonadotropin nhau thai ngƣời Gonadotropin

IVC In vitro Culture Nuôi phôi

IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm

IVM In vitro muaturation Thành thục ống nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luteinsing Stimulating LH Hormone thể vàng hormone

MI Metaphase I Trung kỳ I

MII Metaphase II Trung kỳ II

MPN Male pronuclear Tiền nhân đực

North Carolina State NCSU 23 Môi trƣờng nuôi trứng, phôi University 23

North california state NCSU 37 Môi trƣờng nuôi trứng, phôi university 37

NST Nhiễm sắc thể

pFF Porcine follicle fluid Dịch nang trứng lợn

Pregnant mare’s serum PMSG Huyết thanh ngựa chửa gonadotropin

TCM Tissue Culture Medium Môi trƣờng nuôi cấy

TN Thí nghiệm

tt/ml Tinh trùng/ml

TTON Thụ tinh ống nghiệm

vcs Và cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ZP Zona pellucide Màng trong suốt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cuộc cách mạng khoa học công nghệ trong sinh học sinh sản mở đầu với

các công nghệ trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo và cấy chuyển phôi trong suốt thế

kỷ 20, đƣợc tiếp tục với nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM),

thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF), kích hoạt sinh sản vô tính

(trinh sản – parthenogenetic), nuôi phôi ống nghiệm và nhân bản các động vật

bản địa bằng cách chuyển nhân từ các tế bào sinh dƣỡng. Các công nghệ này

góp phần nâng cao năng suất sinh học vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học.

Lợn đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho con

ngƣời. Ngoài ra, lợn còn có sự tƣơng đồng với con ngƣời về giải phẫu, di truyền

học, sinh lý học (Meuren vcs., 2012) [40]. Do đó, việc tạo ra các sản phẩm phôi

ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc sử

dụng động vật biến đổi gene nhƣ là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học của

sản phẩm dƣợc, con cho trong ghép mô khác loài, các dòng tế bào gốc phôi hay

là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở ngƣời (Nguyễn Thị Ƣớc

vcs, 2008; Katska, 2006) [7, 25]. Hơn nữa, sự phát triển của các công nghệ in

vitro cho phép tạo ra các sản phẩm tế bào trứng thành thục và phôi với số lƣợng

lớn, giá thành thấp hơn so với các sản phẩm tạo ra trong cơ thể.

Kỹ thuật nuôi thành thục trứng lợn trong ống nghiệm (IVM) sử dụng

những tế bào trứng chƣa thành thục thu từ các nang trứng trên bề mặt buồng

trứng. Điều này cho phép khai thác tiềm năng noãn khổng lồ của buồng trứng

lợn. Hơn nữa, thời gian cho sự thành thục của tế bào trứng lợn và ngƣời là tƣơng

tự nhau. Vì vây, nghiên cứu IVM ở lợn là nền tảng ý tƣởng cho kỹ thuật IVM ở

ngƣời. Thành thục trứng bao gồm những thay đổi quan trọng trong nhân và tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào chất của trứng. Thành thục nhân xảy ra trong suốt quá trình nối lại giảm

phân. Thành thục tế bào chất cần thiết cho sự thành công của quá trình thụ tinh

và sự phát triển của phôi. Sự thành thục tế bào chất không hoàn toàn của tế bào

trứng xảy ra giải thích cho những vấn đề chính của sự thụ tinh và sự phát triển

của phôi (Melanie, 2007) [39]

Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization) là một trong những kỹ thuật

chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Con lợn đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này đƣợc

công bố bởi Cheng vcs, 1986. Tiếp theo đó, Matiolli vcs., 1989 công bố về khả

năng phát triển in vitro của trứng lợn thành thục, thụ tinh ống nghiệm. Thụ tinh

ống nghiệm ở lợn bị thách thức bởi hiện tƣợng đa tinh trùng. Hiện tƣợng này

xảy ra ở lợn nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay cả khi thụ tinh trong

cơ thể dƣới các điều kiện thực nghiệm đa dạng (Hunter, 1990) [23]. Mặc dù các

kỹ thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm ở lợn đã đƣợc cải thiện

dần dần trong những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở lợn vẫn là một trong

những vẫn đề chính trong hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera, 2001)

[9]

Nhƣ vậy, hai vấn đề chính cần khắc phục để đảm bảo sự thành công trong

thụ tinh ống nghiệm ở lợn là sự không thành thục tế bào chất của trứng lợn và

hiện tƣợng đa tinh trùng. Ở Việt Nam, đây cũng là một trở ngại lớn dẫn đến hiệu

suất thấp trong thụ tinh ống nghiệm. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục

và nồng độ tinh tối ƣu là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự thành công trong thụ

tinh ống nghiệm ở lợn. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hƣởng của môi

trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự

phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm”

1.2 Mục đích

Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thành thục, sự hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành tiền nhân và sự phát triển của tế bào trứng lợn thụ tinh ống nghiệm

Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân

và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

1.3 Ý nghĩa

Góp phần tạo nguồn nguyên liệu trứng lợn thành thục phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ Phôi trên động vật có vú, đặc biệt

là lợn.

Góp phần hoàn thiện hệ thống TTON trong điều kiện ở Việt Nam. Cung

cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi chất lƣợng tốt phục vụ cho các nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tiếp theo đặc biệt là theo hƣớng y sinh.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn

2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng

Sự hình thành và phát triển nang trứng ở động vật có vú đƣợc chia làm ba

giai đoạn: Từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và

cuối cùng là nang trứng thành thục (De Graff).

Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong

giai đoạn bào thai. Phân chia nguyên phân của tế bào mầm bắt đầu từ ngày thứ

13 của phôi cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Sau khi con vật đƣợc sinh ra thì các

nang nguyên thủy sẽ phát triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy thƣờng

bao gồm một tế bào trứng (ovocyt I) và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng,

dẹt. Số lƣợng nang nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang.

Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đƣờng kính khoảng 30 - 60 m,

nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp tế bào nang

mỏng. Hạt Balliani là thể noãn đặc biệt: có tính ƣa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai

trò quan trọng trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ

cấp là những nang trứng không có xoang nang.

Nang thứ cấp đƣợc hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một

ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I dầy

lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh.

Nang trứng thành thục (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành

gồm một ovocyt I có đƣờng kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn,

nhân to, tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là màng trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ. Xung quanh hai bên của

ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang

trứng thành thục có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày

hơn có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào

màng hạt). Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang chứa

dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai sinh sản

không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì vậy có nhiều

nang trứng thành thục cùng phát triển trong một chu kỳ.

Trong quá trình phát triển từ nang không có xoang thành nang có xoang

trứng đƣợc di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có

xoang phát triển thành nang trứng thành thục thì trứng lại ra bề mặt buồng trứng

để chuẩn bị cho sự rụng trứng.

Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản

(Hình 2.1) [59] cho ta thấy nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy

chúng tách rời và hình thành xoang. Khi xoang đƣợc hình thành tế bào trứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và rụng ra khỏi buồng trứng.

Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn

2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng

Cấu tạo buồng trứng

Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ

những noãn bào nguyên thủy đƣợc phân bố vùng ngoại biên. Ở lợn, noãn bào

nguyên thủy đƣợc hình thành từ những biểu mô phôi thai khi cơ thể vẫn còn

trong giai đoạn bào thai. Những nang nguyên thủy này đạt 5000 ở thời điểm sinh

(Black và Ericsion, 1968) [14] và giảm xuống 420.000 ở thời điểm thành thục về

tính (Gosden và Telfer, 1987) [20]. Một số nang nguyên thủy có thể phát triển

thành nang sơ cấp hoặc nang có xoang ở ngày 70 sau khi sinh.

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng [58]

Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có

dạng hình cầu (hình 2.2), ở lợn trứng có đƣờng kính từ 0,12 - 0,17 mm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao

 Nhân: bao gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân

 Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất

hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác.

 Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và

màng ngoài.

o Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn

đƣợc gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng

này có tác dụng nuôi dƣỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Trong màng có

chứa men Muraminidaza.

o Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra

từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dƣỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu

của màng này là đảm bảo dinh dƣỡng cho tế bào trứng trong buồng

trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong

quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho

từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng

trống. Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ pH 3 - 5,

chứa dịch có nồng độ ion cao.

o Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp.

Những tế bào này đƣợc phân bố xung quanh tế bào trứng nên đƣợc gọi

là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi

axít Hyaluronilic. Khi tinh trùng gặp trứng ở phần acrosom (phần đầu

tinh trùng) tiết ra men Hyaluronidaza để phân giải và thủy phân axít

Hyaluronilic làm cho màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện cho quá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình thụ tinh xảy ra.

Ngoài cùng là lớp tế bào hạt cùng với lớp màng phóng xạ, lớp tế bào hạt

tạo nên cho tế bào trứng lớp tế bào cumulus có vai trò rất quan trọng tới sự phát

triển và chất lƣợng của trứng thành thục

Quá trình phát triển từ noãn bào nguyên thủy đến hình thành trứng trải

qua ba giai đoạn.

Giai đoạn tăng số lƣợng noãn nguyên bào: Nhờ quá trình nguyên phân

liên tiếp nhiều lần mà số lƣợng noãn nguyên bào đƣợc tăng lên. Do cơ chế của

quá trình nguyên phân nên các noãn bào đƣợc hình thành đều mang bộ nhiễm

sắc thể là 2n và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô. Giai đoạn này diễn ra khi

cơ thể con cái chƣa thành thục về tính. Đến khi cơ thể thành thục thì các noãn

nguyên bào sẽ lần lƣợt đƣợc phát trình thành trứng thành thục.

Giai đoạn sinh trƣởng: Noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dƣỡng, tăng

kích thƣớc và khối lƣợng hình thành nên các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I,

tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n.

Giai đoạn hình thành trứng: Nhờ cơ chế giảm phân noãn bào cấp I giảm

phân thông qua hai lần phân bào liên tiếp.

- Lần phân bào I: Noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II

(Noãn bào thứ cấp) có khối lƣợng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàn của

noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thƣớc bé (cực cầu thứ nhất)

- Lần phân bào II: Noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng lớn

và cực cầu bé thứ hai. Trong lúc đó cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia

thành hai cực cầu bé.

Kết quả sau quá trình giảm phân từ một noãn bào cấp I cho một trứng lớn

và ba cực cầu bé. Trứng và cực cầu bé đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội n.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trứng có khối lƣợng và kích thƣớc lớn vì đã nhận toàn bộ khối noãn hoàng từ

noãn bào cấp I điều đó có ý nghĩa phát triển của trứng, kết thúc giai đoạn giảm

phân thì trứng thành thục.

2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng

Sau khi trải qua quá trình hình thành và đạt đƣợc kích thƣớc cực đại,

trứng sẽ chuyển sang giai đoạn thành thục. Sự thành thục của tế bào trứng bao

gồm thành thục nhân và thành thục tế bào chất.

Thành thục nhân: Là quá trình nối lại giảm phân và đạt tới giai đoạn trung

kỳ II. Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích thƣớc rất lớn và đƣợc

gọi là túi phôi (Germinal Vesicle - GV). Sau khi bị kích thích bởi các kích dục

tố hoặc điều kiện thích hợp của môi trƣờng nuôi thành thục in vitro, nhân lại

nhanh chóng tiếp tục các kỳ của quá trình giảm phân (Meiosis). Kết thúc quá

trình giảm phân I hình thành nên hai tế bào: Tế bào thứ nhất gồm có nhân và

một chút tế bào bào chất tách ra khỏi noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất

nhƣng bên trong màng trong suốt đƣợc gọi là thể cực thứ nhất. Tế bào thứ hai là

noãn bào II. Noãn bào này sẽ bị kìm hãm ở kỳ giữa của lần phân bào giảm

nhiễm thứ hai (giai đoạn Metaphase II) cho đến khi thụ tinh (Nguyễn Mộng

Hùng, 2000) [4]. Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng

(GVDB), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình là sự xuất hiện của thể cực thứ

nhất và nhiễm sắc thể ở trạng thái metaphase II.

Quá trình thành thục tế bào chất: Tế bào chất là nơi quan trọng trong việc

tổng hợp các protein thiết yếu, chuẩn bị các điều kiện cho noãn bào có thể thụ

tinh và phát triển phôi sớm. Biểu hiện của sự thành thục tế bào chất là việc tăng

sinh các thể hạt (Mitochondries), xuất hiện thể Golgi, có sự di chuyển các hạt vỏ

(Granules corticales) tới chu vi noãn bào ngay dƣới màng dịch tƣơng. Những hạt

này chứa Ovoperpxidase có tác dụng ngăn không cho nhiều tinh trùng có thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xâm nhập vào một trứng (ngăn chặn hiện tƣợng đa tinh trùng)

Quá trình thành thục màng noãn bào: Gồm toàn bộ các quá trình cho phép

tinh trùng chấp nhận riêng biệt noãn bào. Màng trong đƣợc tổng hợp ở giai đoạn

tăng trƣởng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh, màng có tác dụng

chỉ cho tinh trùng có khả năng thụ tinh mới đƣợc xâm nhập vào noãn bào, tạo

điều kiện thích hợp cho sự phối hợp giữa tinh trùng và trứng, bảo vệ noãn bào

không bị thụ tinh đa tinh trùng. Vùng trong (Zone pellucide) gồm 95% của ba

gycoprotein đƣợc cấu tạo thành các sợi dài hợp nhất: ZP1, ZP2, ZP3. Chỉ có

ZP3 đƣợc tinh trùng chấp nhận và có phản ứng thể đỉnh (Acrosomique). ZP2 có

tác dụng cố định tạm thời đầu tinh trùng trong quá trình thụ tinh (khi tinh trùng

đi qua vùng trong). ZP1 chiếm ít nhất khoảng 10% có tác dụng bảo đảm độ bền

vững của vùng trong cho đến giai đoạn phôi bào.

2.2 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn

2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh

Thụ tinh ống nghiệm cho động vật có vú lần đầu tiên đƣợc tiến hành trên

thỏ năm 1954 từ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh (trong tử cung)

với những noãn bao mới rụng. Đến năm 1959, M.C. Chang đã thành công trong

việc tạo ra những con thỏ thụ tinh ống nghiệm đầu tiên. Điều này thể hiện tính

chất bình thƣờng sinh học của kỹ thuật thụ tinh in vitro. Thụ tinh ống nghiệm đã

đƣợc tiến hành thành công trên nhiều loài động vật có vú thể hiện qua sự đánh

giá mô bào hoặc sự phân chia của trứng nhƣ trên thỏ (1954), chuột đồng (1964),

chuột nhắt (1968), ngƣời (1969), bò (1980), ngựa (1989). Trong đó, sự thành

công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ghi nhận bằng việc sinh ra con non đƣợc ghi

nhận ở các loài nhƣ thỏ (1959), ngƣời (1978), bò (1981), dê (1985), cừu, lợn

(1986) và ngựa (1990). Các giai đoạn chính của quá trình thụ tinh in vitro và in

vivo có những điểm tƣơng đồng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các giai đoạn của quá trình thụ tinh (Nguyễn Hữu Đức, 2005) [2]

 Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ

 Tƣơng tác tinh trùng với màng trong suốt

 Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt

 Phản ứng thể đỉnh

 Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt

 Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái

 Sự hoạt hóa tế bào trứng

Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ: Ở phần lớn các loài động

vật có vú, có nhau thai, trứng thành thục in vivo hoặc in vitro đƣợc bao xung

quanh bởi nhiều lớp tế bào cumulus. Những tế bào này tạo thành một đám “ma

trận” giàu axit hyaluronic. Chỉ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh

mới có thể đi qua đƣợc lớp tế bào cumulus này. Tất cả các tinh trùng khi tiếp

cận với vùng trong suốt đều còn acrosome nguyên vẹn. Hyaluronidaza với một

lƣợng ít ỏi liên kết với màng ngoài của tinh trùng có thể tạo cho chúng xuyên

qua lớp tế bào cumulus một cách thuận lợi.

Tƣơng tác tinh trùng với màng trong suốt: Trƣớc khi qua màng trong suốt,

tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosome.

Vùng trong suốt đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein mà trong họ có

nhiều dạng đồng phân. Chúng đƣợc xác định ở nhiều loài khác nhau. Ba

glycoprotein chủ yếu là ZP1, ZP2, ZP3. Trong đó, ZP3 là một polypeptide, trên

nó có ghép những chuỗi oligosaccharit đặc biệt có chứa fucose và N-acetyl

glusamin. ZP2 và ZP3 liên kết với nhau để tạo nên những sợi có cầu nối với

nhau bởi ZP1, nó tạo nên cấu trúc ba chiều của vùng trong suốt.

Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt: Vùng trong suốt nhận biết và cố định

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đặc hiệu các tinh trùng cùng loài khi chúng đã đƣợc kiện toàn năng lực thụ tinh.

Sự kết dính này đƣợc xảy ra bởi tƣơng tác qua lại giữa các phân tử trên một

phần bề mặt của tinh trùng và vùng trong suốt của trứng. Tinh trùng khi đƣợc

gắn vào vùng trong suốt sẽ thực hiện phản ứng thể đỉnh. Điều này giúp bộc lộ

màng trong của acrosome.

Phản ứng thể đỉnh: Phản ứng thể đỉnh đƣợc đặc trƣng bởi sự dung giải

dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosome của tinh trùng. Quá trình này

vừa hình thành những bọng của màng, mặt khác tạo ra những lỗ trống để cho

các chất chứa trong acrosome giải phóng ra ngoài. Phản ứng thể đỉnh xảy ra rất nhanh và phụ thuộc vào nồng độ của ion Ca2+. Phản ứng này luôn kèm theo việc tăng nồng độ Ca2+ nội bào và không thể thực hiện trong môi trƣờng thiếu Ca2+

Cảm ứng phản ứng thể đỉnh bởi màng trong suốt của trứng: Ở nhiều loài

giai súc, vùng trong suốt bị hòa tan có cả ứng in vitro với phản ứng thể đỉnh các

tinh trùng cùng loài. ZP3 có tính hai mặt chức năng, một mặt nó đảm bảo cho sự

gắn kết tinh trùng, mặt khác nó phát động phản ứng thể đỉnh của nó. Sự gắn kết

của phối tử ZP3 vào thể tiếp nhận của tinh trùng đã phát động những phân tử vào những tế bào dẫn đến phản ứng thể đỉnh và nhất là luồng Ca2+ vào là một

trong những chặng đầu của đợt phản ứng.

Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt: Khi thực hiện phản ứng thể đỉnh,

tinh trùng thải những bọng màng lên bề mặt vùng trong suốt, sau đó chui qua

lớp vỏ bọc này theo một đƣờng chéo. Dấu vết lƣu lại trong vùng trong suốt do

tinh trùng xuyên qua là có những bờ mép rõ nét chứng tỏ sự xâm nhập của tinh

trùng đã sử dụng quá trình cơ giới hơn là quá trình enzyme….

Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái: Sau khi vƣợt khỏi vùng trong

suốt, tinh trùng đi vào khoảng trống quanh noãn hoàng và đi vào tiếp xúc với

màng trong suốt noãn bào. Lúc này nó ngừng chuyển động và hai giao tử dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hợp. Sự dung hợp xảy ra giữa màng sinh chất bao quanh đai xích đạo của tinh

trùng và màng sinh chất của noãn bào. Màng sinh chất của tinh trùng hòa trộn

với màng sinh chất của noãn bào khi dung hợp. Còn màng trong acrosome thì

hòa trộn trong bào tƣơng noãn bào cùng với nhân tinh trùng.

Sự hoạt hóa tế bào trứng : Noãn bào đƣợc tinh trùng hoạt hóa kèm theo

những biến đổi về trao đổi chất cũng nhƣ những thay đổi quan trọng của tế bào.

Mặc dù những cơ chế ở mức độ phân tử xảy ra trong hoạt hóa còn chƣa đƣợc

hiểu cặn kẽ ở các loài động vật có vú nhƣng ngƣời ta biết rằng thế năng truyền qua màng và suy huy động hàng loạt Ca2+ nội bào tạo ra những bƣớc ban đầu

của quá trình hoạt hóa trứng. Các biểu hiện ở mức tế bào đi theo sự hoạt hóa: sự

xuất bào của những hạt lớp vỏ, hoàn thành phân chia giảm nhiễm lần hai và

những biểu hiện đặc điểm lớp vỏ của trứng đều đƣợc xác định khá rõ.

Khả năng phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm sau khi thành thục

in vitro đã đƣợc khẳng định ở lợn (Kikuchi vcs., 2002; Mattioli vcs., 1989;

Yoshida vcs., 2003) [28, 37,56] . Tuy nhiên, hiệu suất tạo phôi in vitro ở loài lợn

vẫn khá thấp so với hiệu suất in vivo (Kikuchi vcs., 1999) [29], cũng nhƣ hiệu

suất in vitro ở các loài động vật nuôi và động vật thí nghiệm khác nhƣ bò hay

chuột, mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu với mục đích cải tiến chất lƣợng phôi.

Trong những năm vừa qua, hệ thống nuôi phôi in vitro (IVC) đã đƣợc cải thiện

đáng kể. Tuy nhiên, hệ thống nuôi thành thục trứng (IVM) và TTON vẫn còn

những hạn chế chƣa giải quyết đƣợc. Đó là vấn đề thành thục noãn bào chất

chƣa đầy đủ và vấn đề đa thụ tinh.

2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn trong ống nghiệm

Quá trình thành thục in vitro là quá trình sử dụng các môi trƣờng và điều

kiện nhân tạo cần thiết cho các trứng ban đầu chƣa thành thục sau khi nuôi sẽ

thành thục, có khả năng thụ tinh và phát triển sau thụ tinh. Đây là bƣớc tiến căn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bản có ảnh hƣởng trực tiếp tới chất lƣợng trứng, khả năng thụ tinh và sự phát

triển của phôi. Cơ sở khoa học chính của quá trình thành thục in vitro là dựa vào

những hiểu biết quá trình thành thục tự nhiên (in vivo).

Sự thành thục ống nghiệm (in vitro) của tế bào trứng động vật có vú lần

đầu tiên đƣợc công bố bởi Pincus. Điều này đƣợc quan sát khi tế bào trứng

nguyên thủy của thỏ tiếp tục giảm phân một cách tự nhiên khi đƣợc giải phóng

từ nang của nó và chuyển vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp (Kay và Brian,

2003) [26]. Ở các loài động vật có vú, quá trình thành thục in vivo noãn bào

đƣợc đặt trong điều kiện tối ƣu, do đó loại trừ đƣợc các ảnh hƣởng bất lợi đến sự

phát triển và thành thục của trứng. Còn quá trình thành thục in vitro rất phức tạp

và chịu nhiều ảnh hƣởng rất nhiều của các yếu tố bên ngoài. Đã có rất nhiều các

nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về vấn đề này nhằm mục đích

giảm thiểu các yếu tố ảnh hƣởng, nâng cao chất lƣợng của trứng thành thục. Các

phƣơng pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn đã đạt đƣợc những kết quả tƣơng

đƣơng với các loài động vật có vú khác, 80-90% tế bào trứng lợn đạt tới giai

đoạn metaphase II sau khi nuôi thành thục ống nghiệm (IVM). Tƣơng tự nhƣ các

loài động có vú khác, một tỷ lệ lớn tế bào trứng lợn thành thục in vitro không đạt

đƣợc sự thành thục tế bào chất. Điều kiện in vitro có thể gây ra một số gián

đoạn. Sự gián đoạn này bao gồm sự di chuyển của ty thể tới lớp tế bào chất bên

trong, tổng hợp protein, dẫn truyền các tín hiệu, các ion (đặc biệt là canxi) và

các chất khác (Katska, 2006) [25]. Hậu quả của những sự gián đoạn này là sự

thành thục không hoàn toàn có thể xảy ra do sự thiết hụt của một số yếu tố cần

thiết cho sự thành thục đầy đủ của tế bào chất. Để nối lại giảm phân, điều kiện

nuôi thành thục ống nghiệm (IVM) đã đƣợc cải thiện trong những năm gần đây,

từ việc nhận ra tầm quan trọng của trạng thái oxi hóa khử và nồng độ

glutathione trong mối liên quan tới cystein trong môi trƣờng nuôi thành thục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Nagai, 2001) [43].

Đối với tế bào trứng lợn, một số môi trƣờng nuôi đã đƣợc sử dụng thành

công nhƣ là North Carolina State University (NCSU) có chứa taurine và

hypotaurine – NCSU-23 hoặc sorbitol - NCSU-37 (Kikuchi vcs., 2002; Yoshida

vcs., 2003) [28, 56]. Một số nhóm nghiên cứu sử dụng môi trƣờng Tissue

Culture Medium 199 - TCM 199 (Abeydeera và Day, 1997) [11] hoặc cải biên

Krebs - Ringer medium TALP. Môi trƣờng nuôi thành thục thƣờng đƣợc bổ

sung một lƣợng nhỏ các chất mà sự có mặt của chúng là có lợi cho sự thành thục

tế bào trứng và sự phát triển tiếp theo của phôi. Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng

lợn trong các môi trƣờng này cũng khác nhau. Môi trƣờng NCSU 23 cho tỷ lệ

thành thục từ 33-93,1% tùy theo chất lƣợng trứng (Suzuki vcs., 2003) [51],

87,7% (Long vcs., 1999) [34], 67,4-90,5% tùy theo kích thƣớc nang trứng

(Quian vcs., 2001) [47], môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ lệ thành thục lên tới 90,5%

(Spinacinaci vcs., 2008) [50].

Việc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cysteine, cysteamine, cycloheximide,

glutamine, hormones: FSH, LH, HCG, eCG, leptin, yếu tố tăng trƣởng biểu mô

(epidermal growth factor), β-mercaptoethanol, follicular fluid, serum hoặc

serum albumin vào môi trƣờng nuôi thành thục giúp cải thiện sự thành thục tế

bào chất đƣợc thể hiện ở khả năng phát triển của phôi (Abeydeera vcs., 1998;

Bing vcs., 2001; Marchal, 2001; Margot vcs., 2001; Mattioli vcs., 1989; Yoshida

vcs., 2003) [8, 13, 35,36, 37,56]. Tế bào cumulus đƣợc chứng minh là có vai trò

quan trọng trong quá trình thành thục tế bào chất của trứng lợn cũng nhƣ các

động vật nông trại (Nagai, 2001) [43].

Cystein là một amino axit quan trọng cấu tạo nên glutathione (GSH), một

chất quan trọng giúp bảo vệ tế bào chống lại tác động có hại của hiện tƣợng oxi

hóa. Hàm lƣợng GSH trong tế bào trứng thành thục cao hơn so với tế bào chƣa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành thục. Cystein khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi thành thục tuy không làm

tăng tỷ lệ thành thục của tế bào trứng nhƣng làm tăng tỷ lệ hình thành tiền nhân

đực của tế bào trứng sau thụ tinh (Yoshida vcs., 1992) [55].

Dịch nang trứng (Follicular fluid) đã đƣợc chứng minh là làm tăng sự mở

rộng của lớp tế bào cumulus giúp cải thiện sự thành thục cả tế bào chất cả nhân

trong cả điều kiện in vivo và in vitro (Kikuchi vcs., 2002; Marchal, 2001;

Yoshida vcs., 2003) [28, 35, 56]. Tỷ lệ thành thục tăng lên rõ rệt trong môi

trƣờng có bổ sung dịch nang trứng (61% sv 92%) trong môi trƣờng TCM 199,

(64% sv 94%) trong môi trƣờng Waymouth và (70% sv 88%) trong môi trƣờng

mTLP-PVA (Yoshida vcs., 1992) [55].

Một số loại hormone và yếu tố kích thích tăng trƣởng cũng góp phần nâng

cao tỷ lệ thành thục của tế bào trứng lợn. Đối với thành thục nhân, việc thêm các

loại hormone và yếu tố tăng trƣởng trong môi trƣờng IVM đƣợc xem là có tác

dụng dƣơng tính. Các loại hormone đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi nhƣ

hormone thể vàng (LH), hormone kích thích sự phát triển nang trứng (FSH)

(Mattioli vcs., 1989) [37], huyết thanh ngựa chửa (PMSG), hormone nhau thai

ngƣời (hCG). Việc nuôi trứng thành thục đến giai đoạn Metaphase II (MII) tăng

lên đáng kể khi có mặt của hormone LH (76%) và FSH (86%) so với môi trƣờng

nuôi không có bổ sung hai hormone này (35%). Việc bổ sung FSH vào môi

trƣờng nuôi thành thục ở giai đoạn 20h đầu cho kết quả trứng thành thục (MII)

cao hơn rất nhiều so với không bổ sung FSH (84% sv 58% với P < 0,05)

(Spinaci vcs., 2008) [50]

Yếu tố tăng trƣởng biểu mô (epidermal growth factor - EGF) và hormone

kích thích tăng trƣởng nang trứng (follicle-stimulating hormone - FSH) bổ sung

vào môi trƣờng nuôi thành thục ảnh hƣởng lên sự thành thục tế bào chất trứng

lợn. Việc bổ sung EGF, FSH, EGF+FSH tăng đáng kể tỷ lệ tế bào trứng đạt tới

giai đoạn MII. Việc bổ sung một mình EGF làm giảm tỷ lệ đa tinh và tăng tỷ lệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thụ tinh bình thƣờng. FSH làm tăng tỷ lệ đa tinh khi bổ sung vào môi trƣờng

nuôi một mình hoặc kết hợp với EGF. Ngoài ra, các phân tích protein trong tế

bào trứng và tế bào cumulus của tế bào trứng nuôi trong môi trƣờng có chứa các

kích tố trên, tác giả nhận định rằng EGF có thể có vai trò sinh lý nào đó trong sự

thành thục tế bào chất của trứng lợn (Singh vcs., 1997) [49]

Việc bổ sung dịch ống dẫn trứng và amino acid (mSOFaa) vào môi trƣờng

nuôi thành thục TCM 199 không làm tăng tỷ lệ thành thục của tế bào trứng nuôi

in vitro so với đối chứng (91% sv 89% ) P>0,05 (Mtango vcs., 2002) [41]

Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn. Trứng đƣợc nuôi ở 39oC có tỷ lệ thành thục cao hơn rất nhiều so với 35oC (79% và 12%) (Abeydeera, 2001) [9]. Nhiều thí nghiệm chỉ ra

rằng nhiệt độ thấp làm cản trở sự thành thục nhân và tế bào chất của tế bào

trứng. Hiện nay các nhà nghiên cứu đều tiến hành nuôi thành thục trứng ở nhiệt độ 38,5oC - 39oC với nồng độ CO2 là 5%. Trứng lợn hoàn toàn đạt đƣợc tới giai

đoạn Metaphase II sau khi đƣợc nuôi từ 44 - 48h. Abeydeera vcs. ,2001 [9] cho

rằng việc kéo dài thời gian nuôi có thể kích thích sự thành thục nhân và tế bào

chất của trứng lợn.

Hàm lƣợng oxy trong quá trình IVM cũng là một yếu tố quan trọng của sự

thành thục tế bào chất cho sự phát triển tiếp theo đến giai đoạn phôi nang trong

điều kiện in vitro (Kikuchi vcs., 2002) [28]

Chất lƣợng trứng đem nuôi ảnh hƣởng đến khả năng thành thục tế bào

trứng lợn (Karja, 2008; McGaughey vcs., 1979; Suzuki vcs., 2003) [24, 38, 51].

Suzuki vcs. (2003) tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả

năng thành thục trứng lợn. Tổ hợp trứng-tế bào cận noãn COCs đƣợc chia làm 4

nhóm theo mô tả của Leibfried và First, 1979 [31]. Nhóm 1 COCs đƣợc bao phủ

với nhiều hơn 3 lớp tế bào cumulus. Nhóm 2: COCs đợc bao phủ với 2-3 lớp tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào cumulus. Nhóm 3: COCs: Một phần tế bào trứng không có tế bào cumulus

bao quanh. Nhóm 4: Tế bào trứng trần, chỉ kèm theo màng trong suốt. Ở thời

điểm 0h, trạng thái nhân tế bào trứng ở các nhóm (1-4) chủ yếu ở giai đoạn bóng

mầm (GV) tƣơng ứng là (100%, 82,1 ± 3,5%, 71 ± 4,5%, 52,2 ± 1,4%, P<0,05).

Khi nuôi thành thục trứng trong môi trƣờng NCSU 23 thì tỷ lệ tế bào trứng đạt

tới giai đoạn trung kỳ II ở các nhóm tƣơng ứng là (93,1 ± 1,1%, 79,5 ± 6,2%,

58,0 ± 8,9% và 33,0 ± 6,9%. Trứng lợn ở nhóm 1 cho tỷ lệ thành thục cao nhất,

cao hơn nhóm 3 và 4 (P<0,05), nhóm 2 cao hơn nhóm 3 và 4, sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê với P<0,05. Nhƣ vậy, chất lƣợng trứng ảnh hƣởng đến khả năng

phát triển đến giai đoạn thành thục của tế bào trứng lợn. Tỷ lệ thành thục nhân

tăng lên theo chất lƣợng trứng. Tƣơng tự nghiên cứu của Suzuki vcs., 2003,

Karja, 2008 [24] cũng phân loại chất lƣợng trứng dựa vào hình thái, sự đặc chắc

của tế bào chất và lớp tế bào cận noãn (cumulus) bao quanh trứng. Trứng sau

thu đƣợc phân loại thành 3 nhóm (nhóm 1: có trên 5 lớp tế bào cận noãn, tế bào

chất dày, chắc, đồng nhất. Nhóm 2 : có ít hơn 5 lớp tế bào cận noãn, tế bào chất

dày, chắc. Nhóm 3: trứng bị mất một phần tế bào cumulus, tế bào chất có chỗ bị

tối màu). Tế bào trứng sau đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng NCSU 23. Tỷ lệ

thành thục của tế bào trứng ở thời điểm 44-46 giờ sau nuôi của trứng nhóm 1 và

nhóm 2 là tƣơng đƣơng (P>0,05) và cao hơn có ý nghĩa so với nhóm 3 (P<0,05)

tƣơng ứng là (87,9 ± 2,8%, 86,7 ± 2,8% sv 69,6 ± 3,1%). Qua các nghiên cứu

cho thấy, lựa chọn trứng có chất lƣợng tốt làm tăng tỷ lệ thành thục của tế bào

trứng lợn. Cumulus đƣợc chứng minh là cần thiết cho tế bào trứng cho sự thành

thục tế bào chất và phát triển bình thƣờng trong suốt quá trình IVM để tổng hợp

và vận chuyển GSH bên trong tế bào trứng. Do đó, vấn đề lựa chọn trứng và

môi trƣờng nuôi tối ƣu góp phần quan trọng giúp tế bào trứng lợn thành thục cả

nhân và tế bào chất.

Kích thƣớc nang trứng cũng đƣợc coi là một yếu tố có ảnh hƣởng lớn tới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

số lƣợng trứng thu đƣợc cũng nhƣ chất lƣợng và khả năng thành thục của tế bào

trứng. (Qian vcs., 2001) [47] đã đánh giá ảnh hƣởng của kích thƣớc nang đối với

sự bông tơi của tế bào cumulus, sự thụ tinh và sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống

nghiệm. Sau khi nuôi thành thục, tỷ lệ trứng lợn có tế bào cumulus bông tơi

đƣợc thu từ các nang xoang có đƣờng kính ≥5mm, 4-4,9mm, 3-3,9mm và 2-

2,9mm lần lƣợt là 90,5%, 89,7%, 85,4% and 67,4%, theo thứ tự. Sau khi thụ tinh

ống nghiệm, khả năng phát triển của trứng tăng sự phụ thuộc với kích thƣớc

nang trứng. Tỷ lệ chia cao hơn và sự cân xứng cao hơn của của phôi 3-4 tế bào

đƣợc quan sát ở nhóm nang có đƣờng kính ≥4mm so với nhóm nang 2-2,9mm.

Mặc dù sự cân xứng của các phôi 6-8 tế bào, 12-16 tế bào giữa các nhóm nang

không có sự khác biệt, phôi ở nhóm nang 2-2,9mm bị lỗi khi phát triển đến giai

đoạn 8 tế bào. Phôi nhóm 3-3,9mm lỗi khi phát triển đến giai đoạn 16 tế bào và

không có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi dâu

Mùa vụ cũng là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng tới sự thành thục

của trứng (bao gồm: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng…) trong đó nhiệt độ có

ảnh hƣởng trực tiếp tới tỷ lệ thành thục của trứng nuôi trong ống nghiệm. Nhiệt

độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hƣởng không tốt đến chất lƣợng cũng nhƣ khả

năng thành thục của trứng (có thể làm cho trứng bị chết, chất lƣợng giảm, khả

năng thành thục giảm hoặc không có khả năng thành thục. (Liu, 2003) [33] tiến hành nuôi trứng lợn sau khi làm lạnh ở 24oC và 4oC trong khoảng thời gian là 5,

30, 120 phút trong môi trƣờng có hoặc không bổ sung 1,5M dimethylsulfoxide

(DMSO), sau đó trứng đƣợc làm ấm trở lại và nuôi trong môi trƣờng nuôi thành

thục trong 44h. Kết quả cho thấy trứng làm lạnh trƣớc khi cho vào nuôi thành

thục sẽ bị hạn chế quá trình thành thục nhân và tế bào chất. Việc bổ sung DMSO

vào môi trƣờng khi làm lạnh cũng không có ý nghĩa bảo vệ trứng trƣớc tác động

của nhiệt độ thấp. Hầu hết các nhà nghiên cứu hiện nay đều tiến hành thí nghiệm với trứng đƣợc bảo quản ở 30 - 35oC trong tất cả các giai đoạn từ khâu lấy trứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

từ lò mổ đến các giai đoạn thu và nuôi trứng…

Ngoài ra khả năng thành thục của tế bào trứng lợn và một số loại động vật

khác còn phụ thuộc vào giống, độ tuổi của con vật, dinh dƣỡng, chế độ chăm

sóc…

2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn

Thụ tinh ống nghiệm là quá trình kết hợp trứng và tinh trùng trong điều

kiện ống nghiệm. Vì thế quá trình này chịu tác động của yếu tố trứng, yếu tố tinh

trùng cũng nhƣ điều kiện môi trƣờng, điều kiện thí nghiệm… Đã có nhiều

nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố này nhằm tìm ra giải pháp nâng

cao hiệu suất thụ tinh ống nghiệm ở lợn.

Nồng độ tinh trùng ảnh hƣởng tới khả năng thành công của kỹ thuật thụ

tinh ống nghiệm. Nếu nồng độ tinh trùng thấp quá sẽ làm giảm khả năng xâm

nhập của tinh trùng (Zăham vcs., 2006) [57]. Khi tăng nồng độ tinh lên, tỷ lệ

xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng cũng tăng lên. Tuy nhiên, nếu nồng độ

tinh cao quá sẽ gây ra hiện tƣợng đa tinh trùng, từ đó ảnh hƣởng đến hiệu quả

thụ tinh ống nghiệm (Abeydeera và Day, 1997; Zawham vcs., 2006) [11,57].

Thời gian thụ tinh cũng ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh và phát triển của tế bào

trứng lợn (Abeydeera và Day, 1997; Funahashi, 2005; Mtango vcs., 2002) [11,

17, 41]. Khi tăng thời gian ủ trứng với tinh trùng thì tỷ lệ tinh trùng xâm nhập

vào tế bào trứng tăng lên, nhƣng tỷ lệ đa tinh trùng cũng tăng lên (Abeydeera và

Day, 1997) [11]. Theo Abeydeera và Day (1997) nồng độ tinh, thời gian thụ tinh

tới khả năng thụ tinh và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiêm. Với

trứng đƣợc ủ với tinh trùng trong 12h ở 3 nồng độ 0,1 triệu, 0,5 triệu và 1 triệu

tinh trùng/ml. Ở nồng độ tinh trùng 0,1 triệu/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng là

40% với tỷ lệ đa tinh trùng là 16%. Khi tăng nồng độ tinh trùng lên 0,5 triệu và

1 triệu làm tăng tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng lên 84-87% (P<0,05).

Không có sự khác biệt về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở hai nồng độ tinh 0,5

triệu và 1 triệu/ml. Để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian thụ tinh, trứng đƣợc ủ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với tinh trùng ở nồng độ 0,5 triệu ở các mức thời gian là 3, 6, 9 và 12h. Ở thời

điểm 3h sau thụ tinh, 31,1 ± 2,1% tế bào trứng đƣợc tinh trùng xâm nhập, trong

đó tỷ lệ đa thụ tinh là 13,8 ± 4,2%. Tăng thời gian thụ tinh lên 6,9 và 12 h, tỷ lệ

tinh trùng xâm nhập tƣơng ứng là (80,5; 81,4; 87,6%) với tỷ lệ đa thụ tinh là

(38,8; 58,5 và 69,5%). Khi thời gian thụ tinh tăng từ 9h lên 12h, tỷ lệ tinh trùng

xâm nhập và đa tinh có tăng lên, nhƣng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

(P>0,05). Trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm phát triển tốt trong môi trƣờng

NCSU 23, có 19,0 ± 1,8% trứng phát triển đến giai đoạn phôi nang.

Môi trƣờng thụ tinh cũng ảnh hƣởng tới khả năng phát triển phôi lợn thụ

tinh ống nghiệm, Mtango vcs., 2002 [41] so sánh hiệu quả của hai môi trƣờng

thụ tinh: Môi trƣờng Tris-buffered cải biên (mTBM) và mSOFaa đối với khả

năng phát triển của tế bào trứng lợn. Kết quả chỉ ra rằng: ở 48 giờ sau khi thụ

tinh 51,1% tế bào trứng đƣợc thụ tinh trong môi trƣờng mSOFaa và 44,8% trong

môi trƣờng mTBM đã phân chia đến giai đoạn ít nhất là 2 tế bào. Tỷ lệ tế bào

trứng đạt đến giai đoạn phôi nang trong môi trƣờng mSOFaa cao hơn có ý nghĩa

so với trong môi trƣờng mTBM (12,7 % vs. 3,9 %; P <0,05). Môi trƣờng thụ

tinh không có tác động có ý nghĩa tới số lƣợng tế bào/phôi nang của lợn ở ngày

thứ 7 sau thụ tinh. Tuy nhiên môi trƣờng mTBM tạo ra phôi nang với số lƣợng

tế bào thấp hơn so với môi trƣờng mSOFaa.

Việc tăng sự hình thành tiền nhân gây ra bởi việc bổ sung cystein có liên

quan tới việc nồng độ glutathione nội bào tăng cao (Abeydeera, 2001) [9]. Sự

tổng hợp glutathione trong suốt quá trình thành thục trứng là điều kiện tiên quyết

cho sự duỗi xoắn của NST trong nhân ở tế bào tinh trùng của lợn và chuột đồng

và cho sự thành công của việc hình thành tiền nhân đực (Perreault vcs.,1988)

[46]. Khả năng của tế bào chất chuyển một nhân của tế bào tinh trùng thành tiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhân đực là hiệu quả của tế bào trứng thành thục và thụ tinh trong sự có mặt của

tế bào cận noãn (cumulus). Hàm lƣợng glutathione nội bào phụ thuộc vào sự có

mặt của tế bào cumulus trong suốt quá trình nuôi.

Funahashi, 2005 [17] chứng minh rằng sự bổ sung βME trong suốt quá

trình IVF, ngoại trừ trong quá trình ủ phôi với sự có mặt của caffeine, có lợi thế

trong việc duy trì chức năng giao tử, tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng và sự phát triển

tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm. Ông đã tiến hành thí nghiệm đánh

giá ảnh hƣởng của beta-mercaptoethanol (βME) trong quá trình ủ các giao tử

trong 10 phút và hoặc tiếp tục nuôi đến 6-9 giờ sau thụ tinh, đối với sự xâm nhập

của trứng lợn thành thục ống nghiệm và ở giai đoạn phát triển sớm in vitro. Khi

tinh tƣơi đƣợc đƣợc nuôi trong các nồng độ khác nhau của βME trong 2h, βME

neutralized kích thích tác động của caffeine-benzoate đối với khả năng hoạt hóa

của tinh và spontaneous phản ứng acrosome ở 50-250 µM/l. Khi nồng độ 50

µM/l đƣợc thêm vào trong quá trình ủ giao tử trong 10 phút, tỷ lệ xâm nhập của

tinh trùng giảm 9h sau thụ tinh (70,5-82% vs 90,5-94,0% khi không có mặt

βME) nhƣng tỷ lệ xâm nhập đơn tinh trùng thì không có tác dụng, nhƣng tỷ lệ

đơn tinh trùng của trứng tăng lên (43,9-45,8% vs 31,7-34,3%, trong sự có mặt

của βME). Sự có mặt của βME trong suốt quá trình ủ giao tử làm giảm ở mức

thấp nhất nồng độ glutathione trong trứng ở 6h sau thụ tinh (7,9 pmol/trứng

trƣớc khi thụ tinh và 6,7 pmol/trứng nếu có mặt βME vs 5,5 pmol/trứng nếu

không có mặt βME). Mặc dù sự có mặt của 50 µM/l βME trong suốt quá trình ủ

giao tử trong 10 phút và trong quá trình nuôi tiếp theo không làm tăng tỷ lệ hình

thành blasotyst (29,6-37,7%), 50 µM/L βME trong suốt quá trình nuôi phôi làm

tăng có ý nghĩa số tế bào trong mỗi phôi nang (73,3 – 76,4 vs 51,2 trông sự có

mặt và không có mặt của βME, theo thứ tự).

Hệ thống nuôi cũng ảnh hƣởng tới khả năng phát triển trứng lợn khi nuôi

trong môi trƣờng nuôi thành thục có bổ sung dịch nang trứng. Agung vcs, 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[12] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng bổ sung dịch nang trứng (pFF) sử

dụng các hệ thống nuôi in vitro và các giai đoạn thụ tinh khác nhau. Tế bào dịch

nang trứng (follicular cells, FCs) và dịch nang trứng (pFF) đƣợc thu từ nang

trứng của buồng trứng lợn, pFF đƣợc sử dụng nhƣ môi trƣờng nuôi thành thục

sau khi bổ sung hormone kích thích nang trứng (FSH) và kháng sinh. Tổ hợp

trứng – tế bào cận noãn (COCs) đƣợc nuôi thành thục trong ống 15ml có chứa

3,5 ml dịch nang trứng tế bào nang trứng (follicle cells – FCs), mật độ tế bào là

5,2 x 1 triệu tế bào/ml trong hệ thống tĩnh hoặc ống có chứa 2 ml dịch nang

trứng và không có tế bào đệm (hệ thống tĩnh) trong 44-48 giờ. Sau khi nuôi

thành thục, trứng đƣợc ủ với tinh trùng đông lạnh-giải đông trong 5h và sau đó

nuôi trong 7 ngày. Kết quả cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập,

tế bào trứng thụ tinh bình thƣờng và tế bào trứng có hình thành tiền nhân đực

trong hệ thống động cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với hệ thống tĩnh tƣơng ứng

là (71,1 ± 3,5% sv 56,0 ± 2,8%, 44,5 ± 2,4% sv 32,6 ± 5,2%, 70,9 ± 3,2% sv

58,2 ± 5,6%). Không có sự khác biệt giữa hai hệ thống lên kết quả của hiện

tƣợng đa tinh trùng, tƣơng ứng là 44,4 ± 3,9% sv 43,4 ± 2,2%. Tế bào trứng nuôi

trong hệ thống động cho tỷ lệ phân chia của phôi và tỷ lệ phát triển đến giai

đoạn phôi nang cao hơn hẳn so với hệ thống tĩnh (tƣơng ứng là 74,7 ± 3,4% sv

58,0 ± 2,4%, 11,6 ± 1,6 sv 4,4 ± 1,4%) P<0,05

Hiện tƣợng đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn

Vấn đề chính trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn là tỷ lệ thấp của sự xâm

nhập tinh trùng và hiện tƣợng đa tinh. Tỷ lệ thụ tinh và đơn tinh trùng trong thụ

tinh ống nghiệm ở lợn phụ thuộc vào nồng độ tinh trùng và khoảng thời gian

TTON (Nagai, 1996) [42]. Việc lựa chọn nồng độ tinh và thời gian thụ tinh phù

hợp giúp giảm hiện tƣợng đa tinh trùng, góp phần nâng cao hiệu suất thụ tinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ống nghiệm. Do đó, sự thành công của sản phẩm phôi ống nghiệm yêu cầu nồng

độ tinh và thời gian ủ tinh trùng với trứng phù hợp để làm giảm hiện tƣợng đa

tinh trùng.

Trong suốt quá trình thụ tinh ống nghiệm ở lợn, tinh trùng xâm nhập bắt

đầu từ thời điểm 3 giờ sau khi thụ tinh (Ding vcs., 1992) [16], ở thời điểm 4 giờ

sau thụ tinh, khả năng xâm nhập của tinh trùng là (20,5%), tăng lên đến 72,9% ở

thời điểm 8 giờ. Sự xâm nhập của tinh trùng nhanh chóng gây ra hiện tƣợng nối

lại phân bào giảm nhiễm và phản ứng miền vỏ ngăn cản hiện tƣợng đa tinh

trùng. Ở thời điểm 5 giờ sau thụ tinh, giải nén đầu tinh trùng và đĩa nhiễm sắc

thể ở trạng thái kỳ sau II đƣợc quan sát ở một nửa của tế bào trứng. Sự hình

thành tiền nhân đƣợc quan sát ở thời điểm 6 giờ sau thụ tinh (3,3%). Ở thời điểm

8 giờ sau thụ tinh, cả tiền nhân đực và tiền nhân cái đƣợc hình thành (Ding vcs.,

1992) [16]. Thời điểm 10 giờ sau thụ tinh, tỷ lệ hình thành tiền nhân tăng lên

46,8% (Kikuchi vcs., 1995) [27]. Nếu trong điều kiện in vitro thích hợp có thể

60-70% trứng thành thục đƣợc tinh trùng xâm nhập. Tuy nhiên, tỷ lệ trứng đƣợc

thụ tinh bình thƣờng (hiện tƣợng đơn tinh khá thấp trong khi tỷ lệ cao hiện

tƣợng đa tinh trùng). Đa tinh trùng đƣợc xem là một trong những vấn để khó và

dai dẳng nhất cần khắc phục trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.

Trong các hệ thống TTON lợn thông dụng, mặc dù tinh trùng chỉ có thể

xâm nhập vào trứng trong vòng 3 giờ, và kết thúc trƣớc 6 giờ, tỷ lệ đa thụ tinh

tăng dần lên tỷ lệ thuận với thời lƣợng thụ tinh. Vì lý do này, phần lớn các

phòng thí nghiệm nghiên cứu TTON lợn sử dụng thời gian thụ tinh khoảng 6 giờ

(Kikuchi vcs.,2002; Yoshida vcs., 2003) [28,56]. Tuy nhiên, Kikuchi vcs., 2006

phát hiện ra rằng nếu thời gian ủ trứng với tinh trùng tăng lên 6h thì số tinh

trùng trung bình xâm nhập vào tế bào trứng sẽ tăng lên gấp đôi so với thời gian

ủ tinh 3h, điều này sẽ dẫn đến hiện tƣợng đa tinh trùng, trong khi tỷ lệ hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành tiền nhân không tăng.

Để khắc phục hiện tƣợng đa tinh trùng đã đƣợc nhiều tác giả đƣa ra các

hƣớng giải quyết nhƣ: Thay đổi phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm: thụ tinh ống

nghiệm trong cọn rạ (Li vcs., 2003) [32], sử dụng các vi kênh mô phỏng sinh

học, tạo điều kiện thụ tinh nhƣ trong ống dẫn trứng (Clark vcs, 2005) [15] hay

bổ sung dịch nang trứng (pFF) vào môi trƣờng thành thục, môi trƣờng thụ tinh.

Sự thay đổi này giúp tăng tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng và giảm tỷ lệ đa tinh của tế

bào trứng lợn (Vatzias và Hagen, 1999) [52]

Trứng thụ tinh trong môi trƣờng mSOF cho tỷ lệ đa tinh trùng thấp hơn

10%. Tỷ lệ tinh trùng thấp có thể do số lƣợng tế bào tinh trùng đƣợc sử dụng

thấp và sự bổ sung đầy đủ của các amino acid cần thiết và không cần thiết trong

môi trƣờng mSOFaa. Môi trƣờng thụ tinh không có ảnh hƣởng tới tỷ lệ chia

nhƣng có ảnh hƣởng tới tỷ lệ trứng phát triển đến giai đoạn phôi nang và số

lƣợng tế bào của chúng. Việc bổ sung đầy đủ các amino acid nhƣ taurine,

hypotaurine trong môi trƣờng thụ tinh dƣờng nhƣ có hiệu quả dƣơng tính. Thành

phần môi trƣờng cũng ảnh hƣởng tới khả năng phát triển của phôi IVM/IVF. Rất

nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện để đƣa ra các thành phần cần thiết của môi

trƣờng cho sự phát triển của tế bào trứng đến giai đoạn phôi nang. Ý tƣởng về

việc thiết lập hệ thống IVF với tỷ lệ tinh trùng xâm nhập cao (>80%), với tỷ lệ

đa tinh trùng thấp (<10%) (Abeydeera, 2002) [10].

Có giải thiết cho rằng sự hiện diện của glucose và hàm lƣợng lactate cao

hơn trong môi trƣờng cải biên của Waymouth có thể chịu trách nhiệm cho sự

phát triển kém của phôi IVM/IVF. Phôi lợn đƣợc nuôi trong môi trƣờng không

cải biên NCSU 23 không bổ sung glucose nhƣng bổ sung ở mức thấp lactate (4,5

mM) and pyruvate (0.33 mM) cho 72 h đầu tiên sau đó nuôi trong môi trƣờng

NCSU 23 có glucose trong 72 h tiếp theo cải thiện sự phát triển đến giai đoạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phôi nang so với phôi nuôi 144 h trong NCSU 23 (Abeydeera, 2002) [10].

Trong những năm vừa qua, hệ thống nuôi phôi in vitro (IVC) đã đƣợc cải

thiện đáng kể. Tuy nhiên, hệ thống nuôi thành thục trứng (IVM) và TTON (IVF)

vẫn còn những hạn chế chƣa giải quyết đƣợc. Đó là vấn đề thành thục noãn bào

chất chƣa đầy đủ và vấn đề đa thụ tinh. Cả hai hiện tƣợng nay đều gây nên bất

thƣờng bội thể của các phôi TTON, làm các phôi này khó phát triển đƣợc tới

giai đoạn phôi nang cũng nhƣ không tạo đƣợc lợn con. Để kiểm soát hiện tƣợng

đa tinh trùng, việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh hợp lý

là một trong những hƣớng tiếp cận đã đƣợc nghiên cứu.

2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF)

ở Việt Nam

Các sản phẩm phôi ống nghiệm đã đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng trâu bò

từ những năm 1994. Bê sinh ra từ phôi thụ tinh ống nghiệm và phôi thụ tinh ống

nghiệm xác định giới tính ra đời năm 1994 [6,44]. Các sản phẩm phôi nuôi

thành thục, thụ tinh ống nghiệm đã đƣợc nghiên cứu trên trâu đầm lầy. Trứng

trâu đầm lầy thành thục rất thấp trong môi trƣờng nuôi thông thƣờng, chỉ đạt

30%, nhƣng khi bổ sung estradiol vào môi trƣờng nuôi thành thục thì tỷ lệ thành

thục của trứng tăng lên đến 60%. Tỷ lệ hình thành phôi dâu, phôi nang cũng

tăng lên (Nguyen vcs., 2006) [44]

Trên đối tƣợng lợn, năm 2003, chúng ta đã thành công trong việc tạo ra

phôi lợn bằng phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm [5]. Nguyễn Thị Phƣơng Hiền

vcs., 2007 [3] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục

trứng một số động vật nuôi; Nguyễn Thị Mến vcs., 2008 đã nghiên cứu ảnh

hƣởng của sự thay thế Pyruvate/lactate bởi Gluco và tỷ lệ Pyruvate/Lactate và

Gluco trong môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng phát triển phôi lợn thụ tinh ống

nghiệm. Trong những năm gần đây, thụ tinh ống nghiêm và nhân bản vô tính là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hai hƣớng đƣợc chú trọng phát triển mạnh của công nghệ phôi. Đã có rất nhiều

những nghiên cứu cũng nhƣ thành công quan trọng theo hai hƣớng này đƣợc ra

đời tại đây.

Các nghiên cứu cơ bản cũng đƣợc nghiên cứu giúp tạo nguồn nguyên liệu

tế bào trứng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong các lĩnh vực nhƣ thụ

tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính. Huỳnh Thị Lệ Duyên vcs., (2003) [1] để

đánh giá hiệu quả của môi trƣờng và mốc thời gian ảnh hƣởng tới sự thành thục

của trứng đã tiến hành nuôi tế bào trứng lợn có từ ba lớp tế bào cumulus trở lên

nuôi trong 3 loại môi trƣờng khác nhau gồm: OMM (Occytes Maturation

Medium) (M1); TCM - 199 (Tissue Culture Medium) (M2) và BSA - free

NCSU - 23 có bổ sung 10% dịch nang trứng lợn (M3). Trứng đƣợc nuôi trong

các môi trƣờng trên ở các mốc thời gian khác nhau là: 0, 24, 36, 60 giờ ở cùng một điều kiện 38,50C và 5% CO2. Tác giả đánh giá sự thành thục của trứng

thông qua sự xuất hiện của thể cực thứ nhất. Kết quả cho thấy trứng đƣợc nuôi ở

60 giờ cho tỷ lệ thành thục cao nhất trong cả ba loại môi trƣờng lần lƣợt là

(17,14 % ± 4,77; 18,3% ± 7,3; 14,75% ± 3,8).

Nguyễn Thị Ƣớc vcs., 2008 [7] đã nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội

địa bằng tổ hợp công nghệ ống nghiệm và sinh sản vô tính. Trong báo cáo này

đã trình bày kết quả nghiên cứu thiết lập tổ hợp công nghệ in vitro và nhân bản

vô tính (NBVT) để sản xuất phôi lợn mini nội địa. Kĩ thuật TTON đƣợc tiến

hành với tinh lợn Bản đông lạnh và trứng lợn đƣợc kích thích phát triển in vivo

bằng eCG và hCG và nuôi thành thục trong các môi trƣờng nuôi in vitro. Kết

quả thu đƣợc tỉ lệ phôi TTON phát triển thành phôi nang đạt trên 16% đối

với lợn Bản và 20% đối với lợn Landrace. Đối với phôi NBVT, tỉ lệ tế bào

đƣợc gắn sau xung điện đạt trên 90% và tỉ lệ phôi nang đạt trên 12%. Đối với

phôi đơn bội, tỉ lệ phôi nang đạt trên 12%, và số tế bào/phôi tăng rõ rệt trong

trƣờng hợp phôi ghép tử hai trứng trần không màng sáng. Tổ hợp công nghệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phôi in vitro và nhân bản vô tính đã đƣợc thiết lập trên mô hình lợn Bản và có

thể triển khai để bảo tồn các giống lợn nội địa khác và phục vụ nghiên cứu y

sinh trong tƣơng lai. Việc bổ sung tế bào đệm (tế bào màng lót ống dẫn trứng và

tế bào sợi thai chuột) trong quá trình nuôi phôi đã thu đƣợc kết quả khả quan. Tế

bào đệm giúp phôi vƣợt qua giai đoạn 2-16 tế bào và tăng tỷ lệ hình thành phôi

nang (27%).

Các kết quả nghiên cứu về công nghệ thụ tinh ống nghiệm của Phòng

Công nghệ Phôi nói riêng, Việt Nam nói chung góp phần tạo nguồn nguyên liệu

phôi nang phục vụ cho nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc, tạo các dòng tế bào gốc

có giá trị y sinh. Góp phần hoàn thiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, trong công

trình này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi

thành thục và nồng độ tinh tới sự hình thành tiền nhân và sự phát theo của tế bào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trứng lợn”

PHẦN III. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu:

+ Trứng lợn từ buồng trứng lấy tại các lò mổ trên địa bàn Thanh Oai - Hà Nội

+ Tinh trùng thu từ dịch hoàn của lợn Landrace đông lạnh dạng cọng rạ và bảo

quản trong nittơ lỏng.

Phạm vi nghiên cứu: Nuôi cấy và thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn tại

phòng thí nghiệm.

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng công nghệ Phôi -

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

18 Hoàng Quốc Việt quận Cầu Giấy - Hà Nội.

Thời gian nghiên cứu: Thời gian tiến hành thí nghiệm từ 1/2014 - 7/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi

Đánh giá và chọn lọc môi trƣờng nuôi phù hợp, cải thiện tỷ lệ thành thục,

sự hình thành tiền nhân và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn.

Đánh giá và chọn lọc nồng độ tinh tối ƣu đối với khả năng hình thành tiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhân và sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Thí nghiệm 1: Đánh giá và chọn lọc môi trƣờng nuôi có tác dụng cải thiện

tỷ lệ thành thục, sự hình thành tiền nhân và sự phát triển của tế bào trứng lợn.

Trong thí nghiệm này, lô tinh sử dụng là tinh của lợn Landrace đông lạnh dạng

cọng rạ đã đƣợc kiểm định.

Tế bào trứng lợn loại A, B sau khi thu xong đƣợc chia làm 3 nhóm với số lƣợng

và chất lƣợng tƣơng đƣơng nhau chia vào 3 loại môi trƣờng nuôi thành thục

NCSU 37 và TCM 199 bổ sung 10% FBS, TCM 199 bổ sung 10% pFF

Nhóm đối chứng: môi trƣờng NCSU-37 (MT1)

Nhóm thí nghiệm 1: TCM - 199 10% FBS (MT2)

Nhóm thí nghiệm 2: TCM - 199 10% pFF (MT3)

– Đánh giá tỷ lệ thành thục của trứng lợn sau khi nuôi thành thục trong

môi trƣờng NCSU 37 so với môi trƣờng có bổ sung 10% huyết thanh thai bò và

môi trƣờng bổ sung 10% dịch nang trứng lợn.

Trứng lợn sau khi nuôi thành thục trong ba loại môi trƣờng đƣợc đƣa vào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thụ tinh theo nhóm bằng tinh trùng đông lạnh - giải đông.

Thí nghiệm 2: Đánh giá và chọn lọc nồng độ tinh có ảnh hƣởng tối ƣu

tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống

nghiệm

Trứng lợn đƣợc phân loại chất lƣợng theo phƣơng pháp của Leibfried và First

(1979) [31], chia làm 3 nhóm là A, B1 và B2 nuôi trong môi trƣờng TCM 199

10% FBS. Trứng đƣợc thụ tinh với tinh trùng đông lạnh – giải đông của lợn

Landrace, thử nghiệm 3 nồng độ tinh là 0,05 triệu, 0,1 triệu, 1 triệu tinh trùng

/ml để tìm ra nồng độ phù hợp nhất.

Các chỉ tiêu theo dõi trong hai thí nghiệm là:

+ Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng, tỷ lệ hình thành tiền nhân, tỷ lệ thụ tinh bình

thƣờng đƣợc đánh giá ở thời điểm 10 h sau khi thụ tinh.

+ Tỷ lệ phân chia đƣợc đánh giá ở ngày thứ 2 (ngày thụ tinh đƣợc đánh giá là

ngày 0)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Tỷ lệ hình thành phôi nang, số tế bào/phôi nang đƣợc đánh giá ở ngày thứ 6.

Các chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng = số tế bào trứng đƣa vào thụ

tinh/tổng trứng thí nghiệm

Tỷ lệ hình thành tiền nhân đực = số phôi có hình thành tiền nhân đực/số tế bào

trứng có tinh xâm nhập

Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng = số tế bào trứng có một tinh trùng xâm nhập và đƣợc

hoạt hóa

Số phôi chia = Số phôi chia giả định/tổng số trứng thí nghiệm

Số phôi nang = Số phôi nang/tổng số trứng thí nghiệm

Số tế bào trung bình = Tổng số tế bào đếm đƣợc/số phôi nang.

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu và rửa buồng trứng

Môi trƣờng rửa buồng trứng là nƣớc muối sinh lý 9‰ có bổ sung thêm

chất kháng sinh Gentamicine 40mg/1ml với liều lƣợng là 3ml trên 1 lít dung dịch nƣớc muối và đƣợc làm ấm ở 37 – 38,5oC.

Môi trƣờng thu trứng (rửa trứng): Môi trƣờng TCM 199 có độ pH 7,4 với

thành phần trong 1 lít môi trƣờng: muối hank’s (1 lọ), hepes (4,766g), NaHCO3

(0,35g), FBS (50ml), bổ sung thêm kháng sinh. Môi trƣờng đƣợc lọc qua

milipore có đƣờng kính lỗ lọc là 2m đảm bảo vô trùng. Tất cả các thao tác tiến

hành pha đều đƣợc thực hiện trong tủ hút vô trùng. Đây là môi trƣờng thao tác

ngoài tủ nuôi.

Chuẩn bị môi trƣờng nuôi thành thục: Môi trƣờng NCSU-37 có chứa 10%

dịch nang trứng lợn, 0.6 mM cysteine, 0.5 µl β-mercaptoethanol, 1 mM

dibutyryl cAMP, 10 IU/ml eCG, 10 IU/ml hCG và estrogen (theo phƣơng pháp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của Nguyễn Thị Ƣớc vcs., 2008 [7].

Môi tƣờng: TCM - 199 bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS), 0.6 mM

cysteine, 0.5 µl β-mercaptoethanol, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml hCG.

Môi trƣờng: TCM - 199 bổ sung 10% dịch nang trứng lợn (pFF), 0.6 mM

cysteine, 0.5 µl β-mercaptoethanol, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml hCG.

3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng

Dụng cụ để thu buồng trứng lợn đƣợc chuẩn bị trƣớc từ phòng thí nghiệm

bao gồm: kéo, găng tay cao su, phích giữ nhiệt, túi nilon, và dung dịch bảo quản

buồng trứng. Dung dịch bảo quản buồng trứng là túi chứa nƣớc ấm đƣợc đƣa

vào trong phích giữ nhiệt, đảm bảo nhiệt độ trong phích giữ nhiệt khoảng từ 32oC - 35oC. Buồng trứng đƣợc thu ngay sau khi con vật bị giết mổ và đƣợc vận

chuyển ngay về phòng thí nghiệm, thời gian từ lúc con vật bị giết mổ đến khi

tiến hành xử lý trứng khoảng từ 1 - 2 giờ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.1. Buồng trứng lợn lai kinh tế với mũi tên chỉ các nang trứng.

3.4.3 Phƣơng pháp thu trứng

Buồng trứng sau khi thu về phòng thí nghiệm đƣợc rửa sạch bằng nƣớc muối sinh lý ở 37oC 3-5 lần. Sau đó tiến hành thu các nang trứng có kích thƣớc

từ 2-6mm nhƣng không thu những nang trứng có kích thƣớc quá to.

Hầu hết những tế bào noãn của những nang noãn này bắt đầu trƣởng

thành nhƣng dừng lại ở pha giữa I (metaphase I – MI) của sự phân bào giảm

nhiễm. Khả năng hoàn thành chuyển tiếp M 1 thành M 2 có thể đạt đƣợc ở

những tế bào noãn đã đạt tới kích thƣớc đầy đủ của chúng và đã nén chặt hạch

nhân (nucleolar compaction) (Yanagimachi, 1994) [54]. Nhiều nghiên cứu đã

chứng minh ảnh hƣởng của kích thƣớc nang trứng tới khả năng thành thục ống

nghiệm in vitro. Theo Quian vcs. 2001 [47], trứng lợn thu từ nang có kích thƣớc

từ 5mm trở lên cho tỷ lệ thành thục tới 90,5%. Trong khi trứng thu từ nang có

kích thƣớc 2-2,9mm cho tỷ lệ thành thục đạt 67,4%.

Có hai phƣơng pháp thu nhận trứng là hút trứng từ những nang noãn hoặc

chọn lọc nang noãn rồi rạch để lựa chọn trứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

sử dụng phƣơng pháp rạch nang.

Phƣơng pháp thu trứng đƣợc tiến hành là phƣơng pháp rạch nang trứng để thu

trứng. Dùng cán dao số 3, lƣỡi dao số 11 để thu trứng lợn. Dùng mũi dao chọc

vào nang trứng, nhẹ nhành xoay khắp trong nang để giải phóng tế bào trứng.

Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thu đƣợc nhiều trứng hơn, tế bào trứng hầu nhƣ

không bị ảnh hƣởng do tác động cơ học. Tuy nhiên trứng thu theo phƣơng pháp

này có nguy cơ bị nhiễm cao hơn so với phƣơng pháp hút nang.

Sau khi thu xong dung dịch bao gồm: dịch nang trứng, trứng và các tế bào

nang đƣợc đƣa vào ống 15 để vào trong tủ ấm khoảng 10 -15 phút cho trứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lắng xuống dƣới đáy ống. Dùng pipet hút bỏ đi phần nƣớc trong phía trên lấy

phần lắng phía dƣới cho vào đĩa nhựa petri vô trùng có chứa sẵn môi trƣờng thu

trứng (TCM 199).

Trứng đƣợc thu dƣới kính hiển vi với bộ dây hút và kim có đƣờng kính

thích hợp (đã đƣợc vô trùng). Trứng sau khi thu sẽ đƣợc rửa lại 3 - 4 lần trong

môi trƣờng thu trứng (TCM 199), sau đó mới tiến hành phân loại trứng và đƣa

vào môi trƣờng nuôi. Trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng nuôi, trứng sẽ đƣợc rửa lại

3 lần trong giọt môi trƣờng nuôi cho sạch dung dịch rửa trứng và làm quen dần

với môi trƣờng mới. Toàn bộ thao tác hút và thu trứng đều đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng ở 37oC.

3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng

Trứng phân loại chất lƣợng dựa vào hình thái và số lớp tế bào cận noãn

theo phƣơng pháp của Karja (2008) và Leibfried và First (1979) [24,30]. Thời

gian hút trứng ra khỏi buồng trứng đến khi phân loại trứng tiến hành càng nhanh

càng tốt để chất lƣợng của trứng không ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên ngoài nhƣ

nhiệt độ, ánh sáng.

Trứng loại A: có từ 4 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng, các lớp tế bào

cận noãn này dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ với nhau, nguyên sinh

chất của trứng đồng đều, toàn bộ trứng nhìn trong và đầy đặn.

Trứng loại B1: có từ 3-4 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng, các tế bào

này liên kết không chặt chẽ, nguyên sinh chất đồng đều nhƣng hơi tối màu ở

vùng ngoại vi trứng, toàn bộ trứng nhìn ít trong và ít đầy đặn hơn.

 Trứng B2: Có từ 2 lớp tế bào cận noãn (cumulus) bao quanh trứng, các

lớp tế bào này liên kết không chặt chẽ, có nơi bị mất 1 phần tế bào. Nguyên sinh

chất đồng đều nhƣng hơi tối màu ở vùng ngoại vi trứng. Toàn bộ trứng nhìn kém

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong và ít đày đặn hơn.

 Sau đó chúng tôi tiến hành lựa chọn những trứng loại A và B1, B2 để

tiến hành nuôi trong các môi trƣờng đối chứng và thí nghiệm.

Toàn bộ các thao tác sau này đều đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng

a

b

c

d

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và nhiệt độ 37oC.

e

f

Hình 3.2 Trứng lợn ở thời điểm 0h và 48 h nuôi in vitro (a, b) trứng lợn loại A;

(c, d) trứng lợn loại B1; (e, f) trứng lợn loại B2

3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau khi nuôi

Có hai phƣơng pháp đánh giá sự thành thục của tế bào trứng sau nuôi. Đó

là phƣơng pháp đánh giá sự xuất hiện của thể cực thứ nhất và phƣơng pháp bằng

nhuộm nhân.

*Phƣơng pháp đánh giá bằng sự xuất hiện thể cực thứ nhất.

Trứng sau khi nuôi trong môi trƣờng nuôi thành thục 44-46 giờ đƣợc tách

sạch cumulus bằng các dùng men Hyaluroindaz sục qua cho tế bào cumulus tan

một phần. Dùng kim thủy tinh có kích thƣớc phù hợp hút lên thổi xuống cho

cumulus bong ra hết. Đánh giá sự thành thục của tế bào trứng bằng sự xuất hiện

thể cực thứ nhất.

*Phƣơng pháp nhuộm nhân

Trứng lợn sau nuôi thành thục cũng đƣợc tách sạch lớp tế bào cận noãn

(cumulus), rửa 2-3 lần trong môi trƣờng nuôi để sạch hết lớp tế bào cận noãn.

Trứng sau đó đƣợc đƣợc cố định trên lam kính, đậy lamen và đƣa vào dung dịch

cố định ethanol : acid acetic theo tỷ lệ 3:1 về thể tích (v/v) tối thiểu 3 ngày. Sau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đó trứng đƣợc nhuộm bằng thuốc nhuộm orcein 1% trong 5-7 phút, rửa bằng

dung dịch Aceto glycerol (Acid acetic: glycerol: nƣớc = 1 : 1 : 3) tỷ lệ theo thể

tích. Tiêu bản đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100-400 lần. Dựa

vào hình thái của nhân để đánh giá các giai đoạn phát triển nhân của tế bào trứng

(Leibfried vcs., 1986) [30]. Có ba giai đoạn phát triển chính của nhân:

 Trứng chƣa thành thục (Germinal Vesicle -GV): Màng nhân chƣa tan,

thấy rõ nhân.

 Trứng bắt đầu thành thục ( Metaphase I - MI): Màng nhân tan, Nhiễm

sắc thể ở giai đoạn Metaphase I.

 Trứng thành thục (Metaphase II - MII): Trứng ở giai đoạn này đã có

thể thụ tinh, nhiễm sắc thể ở giai đoạn Metaphase II, có thể quan sát đƣợc thể

cực thứ nhất.

3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF)

Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện thụ tinh ống nghiệm với tinh

trùng đƣợc bảo quản lạnh -196oC trong cọng rạ.

Trứng sau khi nuôi 44-46h, có thể dùng để IVF

Các loại môi trƣờng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm (IVF)

FM: Môi trƣờng dùng để pha loãng và thụ tinh

TCM 199 pH 7,8 : Môi trƣờng hoạt hóa tinh, kiện toàn năng lực thụ tinh

IVC PyrLac: Môi trƣờng nuôi phôi trong 2 ngày đầu

IVC Glucose: Môi trƣờng nuôi phôi đến ngày thứ 6

Ngày thụ tinh đƣợc coi là ngày 0.

Môi trƣờng thụ tinh là môi trƣờng Pig-FM cải biên có bổ sung 2mM Caffein

anhydrous và 5mg/ bovine serum albumin (BSA; Fraction V, Sigma). Kỹ thuật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

IVF đƣợc làm theo phƣơng pháp của Kikuchi vcs., 2002 [28]

Các bƣớc thực hiện gồm

 Chuẩn bị các loại môi trƣờng

 Chuẩn bị trứng

 Chuẩn bị tinh

 Thụ tinh ống nghiệm

 Nuôi phôi

 Chuẩn bị môi trƣờng :

Các loại môi trƣờng dùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn:

Môi trƣờng thụ tinh (FM). Dùng để pha loãng tinh và ủ trứng với tinh

trùng.

Môi trƣờng hoạt hóa, kiện toàn năng lực thụ tinh : TCM 199 pH 7,8

Môi trƣờng nuôi phôi ở ngày thứ 0 đến ngày thứ 2 (IVC Pyrlac). Ngày thụ

tinh đƣợc tính là ngày 0.

Môi trƣờng nuôi phôi ở ngày thứ 2 đến thứ 6 (IVC Gluco)

Môi trƣờng thụ tinh: Đƣợc nạp vào đĩa tròn 7 giọt mỗi giọt 40l cách đều

nhau, sau đó phủ dầu lên bề mặt các giọt môi trƣờng thụ tinh cho kín rồi thêm

vào mỗi giọt 45l môi trƣờng thụ tinh rồi lại phủ dầu parafin (Paraffin lỏng,

Nakarai Tesque, Kyoto, Nhật Bản) lên tiếp cho kín các giọt.

Môi tƣờng hoạt hóa tinh: Môi trƣờng TCM 199 có pH 7,8

Môi trƣờng pha loãng tinh: Môi trƣờng FM đƣợc nạp trong đĩa 4 giếng

Môi trƣờng nuôi phôi: Môi trƣờng IVC pyrlac đƣợc nạp vào đĩa 4 giếng,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mỗi giếng 500l.

Các môi trƣờng đã chuẩn bị đƣợc đƣa vào tủ ấm ít nhất 2 giờ trƣớc khi

thụ tinh.

 Chuẩn bị trứng: Trứng lợn sau khi nuôi thành thục 44h đến 46h sẽ tách

tế bào cumulus bằng men hyalronidaz (một loại men của tinh trùng tiết ra để pha

vỡ tế bào cumulus) để cho trứng đỡ dính với nhau. Sau đó đƣợc rửa lại 2 - 3 lần

với môi trƣờng thụ tinh (FM) trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng thụ tinh chính thức

với mục đích làm cho sạch men hyaluroindaz và giúp cho trứng làm quen dần

với môi trƣờng mới. Sau đó trứng đƣợc đƣa vào các giọt thụ tinh với mật độ

không quá 20 tế bào trứng/giọt.

 Chuẩn bị tinh trùng: Tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng -196oC đƣợc giải đông trong nƣớc ấm 37oC dƣới 1 phút. Tinh trùng đƣợc đƣa vào môi trƣờng

hoạt hóa tinh trùng TCM - 199, pH 7,8 và lấy 1 giọt tinh trùng ra soi kính hiển

vi kiểm tra xem hoạt động của tinh trùng, nếu hoạt động thì đem ly tâm ở 2000

vòng/ phút trong 2 phút. Tiếp theo hút bỏ phần dung dịch trong phía trên lấy

phần cặn ở dƣới đáy chứa tinh trùng. Sau đó thêm môi trƣờng TCM-TCM 199,

pH 7,8 khoảng 60l đến 100µl vào để pha loãng, sục đều và lấy ra 10l tinh pha

với 2 ml NaCl 3% để đếm tinh bằng phƣơng pháp đếm dùng buồng đếm hồng

cầu. Phần tinh còn lại cho vào đĩa tròn, phủ dầu ấm đƣa ngay vào trong tủ ấm 38,5oC trong 15 phút.

 Tính toán nồng độ tinh

Dựa vào tổng số tinh trùng đếm đƣợc trong 4 ô vuông nhỏ trong buồng

đếm mà ta tính toán đƣợc nồng độ tinh phù hợp. Trong thí nghiệm, chúng tôi sử

dụng 3 nồng độ tinh là 0,05 triệu, 0,1 triệu hoặc 1 triệu tinh trùng/ml (tt/ml)

Sau khoảng 15 phút trong tủ ấm. Lúc này tinh trùng đã sẵn sàng cho thụ tinh.

Khi kiểm tra đánh giá chất lƣợng tinh trùng dựa trên các chỉ tiêu nhƣ: hoạt lực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tinh trùng, sức sống của tinh trùng, nồng độ tinh trùng

Tiến hành thụ tinh ống nghiệm:

Sau khi tinh trùng đƣợc hoạt hóa và đánh giá chất lƣợng, chúng tôi tiến hành cho

trứng tiếp xúc tinh trùng trong giọt thụ tinh (thụ tinh ống nghiệm)

Dùng pipet lấy lƣợng tinh đã tính toán theo nồng độ đƣa vào các giọt thụ tinh.

Dùng pipet sục nhẹ để trộn đều tinh trùng và trứng. Nhanh chóng đƣa đĩa chứa môi trƣờng thụ tinh vào tủ 38,5oC trong điều kiện không khí 5% O2, 5% CO2 và

N2 90%, độ ẩm bão hòa.

Toàn bộ quá trình đƣợc thực hiện trên bàn ấm, hạn chế ánh sáng và trong điều

kiện vô trùng.

Tinh trùng đƣợc ủ với trứng trong khoảng thời gian 3 giờ

Nuôi phôi

Sau thời gian trứng ủ với tinh trùng, Trứng đƣợc tách sạch lớp tế bào cận

noãn và các tinh trùng bám xung quanh. Trứng đƣợc rửa lại 2-3 lần và chuyển

vào nuôi trong đĩa 4 giếng chứa môi trƣờng nuôi phôi trong 2 ngày đầu là môi

trƣờng IVC pyrlac (NCSU-37 có chứa 4 mg/ BSA và 50μM β-mercaptoethanol).

Ở ngày thứ 2 (46-48 h sau thụ tinh), phôi giả định đƣợc đánh giá khả năng phân

chia và chuyển sang môi trƣờng IVC bổ sung thêm 5,55 mM D-glucose (Sigma)

hay còn gọi là môi trƣờng IVC glucose trong vòng bốn ngày sau. Toàn bộ quá trình nuôi phôi trong điều kiện 38,5oC, 5% O2, 5% CO2 và N2 90%, độ ẩm bão

hòa.

Để đánh giá tình trạng thụ tinh của tế bào trứng ở giai đoạn phân bào

giảm nhiễm, hợp tử và khả năng phát triển của phôi sau khi thụ tinh ống nghiệm

và sau đó tiến hành nuôi cấy trong ống nghiệm (IVC), tế bào trứng sau khi nuôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành thục trong khoảng 44 - 46giờ, hợp tử đƣợc hình thành sau 8-10 giờ cho

tinh vào môi trƣờng có trứng (dẫn tinh), phôi hình thành sau khi nuôi trong môi

trƣờng IVC 2 ngày và phôi nang (blastocysts) đƣợc hình thành sau khi nuôi

trong môi trƣờng IVC 6 ngày. Vì vậy, tình trạng thụ tinh của trứng đƣợc đánh

giá ở thời điểm 10 giờ sau thụ tinh và 6 ngày sau thụ tinh (tính từ lúc cho tinh

trùng gặp trứng). Bằng cách tiến hành ép trứng vào phiến kính và đậy lamen lên

sau đó tiêu bản đƣợc cố định trong một hỗn hợp của axit acetic và ethanol với

tỉ lệ 1:3 về thể tích, ít nhất trong 3 ngày. Sau đó đƣợc nhuộm màu với aceto-

orcein trong vòng 5-7 phút và rửa với dung dịch aceto-glycerol (acid acetic :

glycerol : cất nƣớc với tỉ lệ 1: 1: 3). Sau đó đƣợc kiểm tra trên kính hiển vi

tƣơng phản pha (Olympus, Tokyo, Nhật Bản) với độ phóng đại 40X và 100X.

Tế bào trứng đã đƣợc đánh giá về sự trƣởng thành đến gian kỳ phân chia phân

bào giảm nhiễm thứ hai (M-II), và giả định hợp tử đƣợc đánh giá cho các thông

số thụ tinh nhƣ: tỷ lệ hình thành tiền nhân đực (MPN), tỷ lệ đơn tinh trùng, thụ

tinh bình thƣờng, đối với phôi thai vào ngày 2 và ngày 6 (ngày thụ tinh định

nghĩa là ngày 0) đƣợc đánh giá về tỷ lệ trứng phân chia và tỷ lệ phôi nang hình

thành

3.4.7. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang

Chất lƣợng phôi nang đƣợc thể hiện qua số lƣợng tế bào/phôi nang. Phôi

sau thụ tinh ống nghiệm ở ngày thứ 6 đƣợc cố định trên tiêu bản, đƣa vào dung

dịch ethanol: acid acetic theo tỷ lệ 3:1 về thể tích (v/v) trong 3-4 ngày. Nhuộm

tiêu bản bằng thuốc nhuộm aceto-orcein 1% trong 5-7 phút nhƣ mục (3.4.4). Sau

đó tiến hành đếm số tế bào trong mỗi phôi nang. Nhân tế bào bắt màu đỏ với

thuốc nhuộm orcein. Đếm số tế bào dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 200-400

lần. Vì phôi nang có dạng hình cầu nên ta phải điều chỉnh kính lên xuống để

thấy hết đƣợc tế bào trong mỗi phôi nang. Số tế bào đƣợc đếm 3 lần sau đó lấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kết quả trung bình.

3.4.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu đƣợc xử lý phân tích bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft

Excel 2007, phân tích ANOVA one way analysis of Variance.

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong phần I của nghiên cứu này, ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành

thục tới khả năng thành thục, thụ tinh và phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn

đƣợc đánh giá. Từ đó lựa chọn đƣợc môi trƣờng nuôi phù hợp đối với hệ thống

nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF).

Phần hai: Sau khi đã chuẩn hóa đƣợc môi trƣờng nuôi thành thục, chúng

tôi đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh và chất lƣợng trứng tới sự hình thành

tiền nhân đực và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn.

Kết quả phần I: đánh giá về ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình bày từ mục 4.1-4.3

4.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới sự thành thục của tế bào trứng lợn

Nuôi thành thục trứng lợn là bƣớc khởi đầu cho các nghiên cứu tiếp theo

nhƣ thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính…Đây là bƣớc cung cấp nguồn

nguyên liệu tế bào trứng thành thục. Trứng lợn đƣợc thu từ các nang có kích

thƣớc từ 2-6mm trên bề mặt buồng trứng. Trứng sau thu đƣợc phân loại chất

lƣợng, chỉ có trứng có trên hai lớp tế bào cận noãn mới đƣợc đƣa vào sử dụng.

Môi trƣờng nuôi thành thục là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới khả năng thành

thục cũng nhƣ sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn sau thụ tinh ống

nghiệm [36, 53]. Đã có nhiều loại môi trƣờng đƣợc sử dụng thành công trong

nuôi thành thục tế bào trứng lợn. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục tối

ƣu giúp nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm.

Ba loại môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là NCSU-37 có

chứa 10% dịch nang trứng lợn, TCM 199 bổ sung 10% huyết thanh thai bò

(FBS) và TCM 199 bổ sung 10% dịch nang trứng lợn (pFF). Cả ba loại môi

trƣờng này đều đƣợc bổ sung các chất cần thiết cho sự thành thục tế bào trứng

lợn nhƣ cystein, β-mercaptoethanol, hormone.

Sau 44 giờ đến 46 giờ nuôi trong môi trƣờng nuôi thành thục, tế bào trứng lợn

đƣợc đánh giá khả năng thành thục theo phƣơng pháp nhuộm nhân (mục 3.4.4).

Kết quả đánh giá trạng thái nhân của tế bào trứng lợn đƣợc thể hiện trong bảng

4.1

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng thành thục

của tế bào trứng lợn

Số Giai đoạn Các trạng Giai đoạn Giai đoạn

trứng GV/GVBD thái khác Môi trƣờng gian kỳ 1 – gian kỳ 2 -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TN (%) (%) MI (%) MII (%)

6 14 129 9 NCSU-37 158 (đối chứng). (3,8 ± 0,6)b (8,9 ± 3,1)b (81,6 ± 3,4)a (5,7 ± 1,6)a

13 TCM 199 94 5 (5,3 ± 2,9)a 10% FBS (13,8 ± 5,1)a 19 (20,2 ± 3,0)a 57 (60,6 ± 3,9)c

54 TCM 199 78 10% pFF 15 (19,2 ± 5,1)a 2 (2,6 ± 1,4)b 7 (9,0 ± 2,3)a (69,2 ± 4,5)b

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Qua bảng ta thấy, trứng lợn khi nuôi thành thục trong ống nghiệm sẽ phát

triển qua các giai đoạn từ GV (bóng mầm), tan bóng mầm (GVBD), gian kỳ I

(metaphase I) rồi đến gian kỳ II (metaphase II, thành thục). Tỷ lệ trứng ở giai

đoạn GV/GVBD của môi trƣờng NCSU 37, TCM 199 10% FBS, TCM 199 10%

pFF lần lƣợt là (3,8 ± 0,6%, 13,8 ± 5,1% và 9,0 ± 2,3%). Nhƣ vậy, khi nuôi

trứng trong môi trƣờng TCM 199 10% FBS và TCM 199 10% pFF tỷ lệ trứng ở

giai đoạn GV/GVBD cao hơn so với khi nuôi trong môi trƣờng NCSU 37

(P<0,05). Tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV/GVBD khi nuôi trong môi trƣờng TCM

199 10% FBS cao hơn so với môi trƣờng TCM 199 10% pFF. Tuy nhiên sự

a

b

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05)

Hình 4.1 Trứng lợn ở giai đoạn GV (a) và giai đoạn MI. Mũi tên chỉ trạng thái nhân của tế bào trứng.

Kết quả tƣơng tự với giai đoạn MI, tỷ lệ trứng ở giai đoạn MI trong ba

loại môi trƣờng NCSU, TCM 199 10% FBS, TCM 199 10% pFF lần lƣợt là

(8,9 ± 3,1%, 20,2 ± 3,0%, 19,2 ± 5,1%). Tỷ lệ trứng ở giai đoạn MI trong hai

môi trƣờng TCM 199 là tƣơng đƣơng nhau và cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so

với khi nuôi trong môi trƣờng NCSU 37.

Trứng ở giai đoạn gian kỳ hai là chỉ tiêu chúng tôi quan tâm nghiên cứu.

Vì chỉ có trứng ở giai đoạn gian kỳ II (thành thục) mới có khả năng tham gia thụ

tinh và tạo phôi. Khi trứng phát triển chƣa tới, hoặc qua giai đoạn này thì không

có khả năng thụ tinh nữa.

Trứng nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ lệ phát triển đến giai đoạn

MII đạt 81,6 ± 3,4% cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với khi nuôi trong

môi trƣờng TCM 199 10% pFF và môi trƣờng TCM 199 10% FBS lần lƣợt là

69,2 ± 4,5% và 60,6 ± 3,9%. Trong đó, môi trƣờng có bổ sung dịch nang trứng

lợn (pFF) cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với môi trƣờng bổ sung huyết thanh

thai bò (FBS) (P<0,05). Tỷ lệ thành thục của môi trƣờng TCM 199 10% pFF cao

hơn so với môi trƣờng TCM 199 10% FBS có thể giải thích là do pFF đƣợc tạo

ra từ các chất tiết nang, những chất này hỗ trợ tế bào trứng thành thục trong cơ

thể. Dịch nang trứng (pFF) đƣợc chứng minh là tác dụng dƣơng tính đối với sự

thành thục nhân và tế bào chất (Yoshida vcs., 1992) [55].

Môi trƣờng NCSU 37, có bổ sung pFF nhƣng nuôi thành hai giai đoạn:

Giai đoạn 1 có bổ sung hormone và dbcAMP, giai đoạn 2 không bổ sung gì cả.

Môi trƣờng TCM 199 10% FBS và TCM 199 10% pFF không có bổ sung dbc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

AMP. Vì dbcAMP có tác dụng ức chế quá trình phân chia nhân trứng trong 24

giờ đầu của IVM, vậy nên tạo thêm thời gian cho noãn bào chất có thể thành

thục đầy đủ hơn. Có thể do nguyên nhân này mà tỷ lệ thành thục của tế bào

trứng ở nhóm thí nghiệm bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) và dịch nang trứng

(pFF) thấp hơn so với đối chứng. Nhƣng hai phƣơng pháp này lại có ƣu điểm là

không phải thay môi trƣờng nuôi sau 22-24 giờ nên tránh đƣợc hiện tƣợng

nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi trứng. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành

thục tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn đã đƣợc nhiều tác giả quan

tâm nghiên cứu. Các môi trƣờng nuôi thành thục nói chung đều đƣợc bổ sung

a

b

các chất cần thiết cho sự thành thục của tế bào trứng lợn [53, 56].

Hình 4.2 a-Trứng lợn ở giai đoạn thành thục (mũi tên đen – nhân của thể cực,

mũi tên trắng – nhân của tế bào trứng). 4.2 b – Trứng lợn thành thục với sự xuất

hiện của thể cực thứ nhất (mũi tên)

Wang vcs., 1997 [53] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của ba loại môi trƣờng

nuôi là TCM 199, NCSU 23 và mWM tới khả năng thành thục của tế bào trứng

lợn . Cả ba loại môi trƣờng này đều bổ sung 0,57mmol cystein/l và 10% dịch

nang trứng. Ngoài ra, môi trƣờng mWM có bổ sung thêm 25,2mmol/l natri

lactate, natri pyruvat (0,33 mmol/l, canxi lactate 1,71 mmol/l. Môi trƣờng NCSU

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

23 bổ sung taurine (7mmol/l), hypotaurine (5mmol/l), glutamine (1mmol/l). Môi

trƣờng TCM 199 chỉ bổ sung glutamine 0,68 mmol/l. Kết quả về tỷ lệ thành thục

cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ thành thục giữa các loại môi trƣờng

nuôi. Tỷ lệ thành thục ở các loại môi trƣờng tƣơng ứng là 87%, 93%, 89%. Kết

quả này cao hơn so với tỷ lệ thành thục khi nuôi trong các loại môi trƣờng của

chúng tôi. Điều này có thể giải thích là do nhiều nguyên nhân khác nhau ảnh

hƣởng đến chất lƣợng trứng in vitro: Nguồn mẫu, thời điểm thu mẫu, điều kiện

bảo quản, cơ sở vật chất phòng thí nghiệm. Nguồn mẫu thƣờng là giống lợn lai

nuôi để giết thịt, bổ sung thức ăn tăng trọng nhanh, tuổi giết thịt là 4-5 tháng khi

chƣa thành thục về tính. Bên cạnh đó chất lƣợng của các lô lợn từ các cơ sở chăn

nuôi khác nhau cũng rất khác nhau chứ không đồng đều nhƣ lợn đƣợc nuôi công

nghiệp bên các nƣớc phát triển.

Tuy nhiên, tỷ lệ thành thục theo tiêu chí đạt đến giai đoạn MII không phải

là tiêu chí duy nhất đánh giá một hệ thống nuôi thành thục, bởi bên cạnh đó khả

năng thụ tinh, hình thành các tiền nhân và phát triển của phôi sau IVF cũng là

những tiêu chí rất quan trọng. Kết quả về ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành

thục tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn đƣợc thể hiện ở mục 4.2

4.2 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn.

Những trứng lợn sau khi nuôi thành thục trong ba loại môi trƣờng đƣợc

dùng trong thụ tinh ống nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi là khả năng thụ tinh, khả

năng hình thành tiền nhân đực và tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng lợn.

Sau khi trứng đƣợc nuôi thành thục trong ba loại môi trƣờng: môi trƣờng

đối chứng, môi trƣờng TCM 199 10% FBS, môi trƣờng TCM 199 10% pFF.

Khả năng thụ tinh của tế bào trứng lợn đƣợc đánh giá ở thời điểm 10 h sau thụ

tinh thông qua các chỉ tiêu: Tỷ lệ thụ tinh, hình thành tiền nhân đực, và tỷ lệ thụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tinh bình thƣờng. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.2

Bảng 4.2 : Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng hình thành tiền

nhân đực của tế bào trứng lợn.

Số trứng Số trứng đƣợc thụ Tiền nhân đực Thụ tinh bình

Môi trƣờng tinh (%) _ MPN (%) thƣờng (%) TN

169 NCSU-37 (đối 43 (25,4 ± 2,6)b 30 (69,8 ± 8,0)b 16 (37,2 ± 6,2)c chứng).

TCM 199 10% 138 68 (49,3 ± 2,7)a 66 (97,1 ± 2,0)a 45 (66,2 ± 6,4)a FBS

TCM 199 10% 153 77 (50,3 ± 7,4)a 73 (94,8 ± 4,7)a 45 (58,4 ± 4,5)b pFF

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Qua bảng 4.2 ta thấy, tỷ lệ trứng đƣợc thụ tinh, tỷ lệ hình thành tiền nhân

đực của trứng đƣợc nuôi trong môi trƣờng TCM 199 10% pFF và TCM 199

10% FBS lần lƣợt là (50,3 ± 7,4% và 49,3 ± 2,7%) và (94,8 ± 4,7% và 97,1 ±

2,0%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tỷ lệ này khi trứng đƣợc nuôi trong

môi trƣờng NCSU 37 (25,4 ± 2,6% và 69,8 ± 8,0%) (P<0,05). Không có sự khác

biệt giữa hai loại môi trƣờng TCM 199 trong tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ hình thành

tiền nhân đực (P>0,05).

Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của trứng nuôi trong môi trƣờng TCM 199

10% FBS cao hơn so với tỷ lệ này của trứng nuôi trong môi trƣờng TCM 199 bổ

sung pFF (66,2 ± 6,4% sv 58,4 ± 4,5%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với P<0,05. Trong khi đó, trứng lợn nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ lệ

thụ tinh bình thƣờng chỉ đạt 37,2 ± 6,2%, thấp hơn so với tỷ lệ này trong các lô

thí nghiệm (P<0,05).

Tỷ lệ trứng đƣợc thụ tinh (tinh xâm nhập) trong môi trƣờng TCM 199

10% FBS và TCM 199 10% pFF thấp hơn so với công bố của Wang vcs., 1997

[53] tƣơng ứng là (25,4%, 49,3, 50,3% sv 71, 76 và 74%). Tuy nhiên, tỷ lệ hình

thành tiền nhân đực trong hai loại môi trƣờng TCM 199 của chúng tôi là tƣơng

đƣơng.

Cũng nghiên cứu về ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục, Wang

vcs., 1997 [53] đánh giá ảnh hƣởng của ba loại môi trƣờng là NCSU 23, TCM

199 và mWM thì tỷ lệ tinh trùng xâm nhập tƣơng ứng là 71, 76 và 74% với tỷ lệ

hình thành tiền nhân tƣơng ứng là (92, 83, 86%), tỷ lệ đa tinh trùng là 31, 30,

30%. Không có sự khác biệt (P>0,05) trong các tham số này giữa các loại môi

trƣờng trong công bố của tác giả. Các kết quả về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng,

khả năng hình thành tiền nhân đực cao hơn so với kết quả của chúng tôi. Trong

khi đó, môi trƣờng nuôi của chúng tôi cũng đƣợc bổ sung cystein, hormone,

pFF, β-mercaptoethanol… Điều này có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ

chất lƣợng trứng, nguồn cung cấp mẫu, yếu tố mùa vụ, thời tiết … Tiếp theo

chúng tôi đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển

phôi lợn thụ tinh ống nghiệm.

4.3 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển của phôi

lợn thụ tinh ống nghiệm

Để đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng phát

triển của trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm, trứng đƣợc nuôi thành thục, thụ tinh

sau đó chuyển vào môi trƣờng nuôi phôi.

Khả năng phát triển của phôi đƣợc đánh giá bằng tỷ lệ phân chia của phôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ở ngày thứ 2 (ngày thụ tinh đƣợc tính là ngày 0), và tỷ lệ hình thành phôi nang ở

ngày thứ 6. Phôi nang là những phôi to hơn bình thƣờng, căng phồng và có

khoang phôi. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.3

Bảng 4.3 : Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển tiếp theo

của tế bào trứng lợn

Số Số phôi phân Số phôi nang Số tế bào trứng Môi trƣờng chia (%) (%) trung bình TN

NCSU-37 (đối 158 79 (50,0 ± 3,5)b 10 (6,3 ± 1,0)c (18,5 ± 2,3)b chứng).

TCM 199 10% 253 187 (74,0 ± 3,2)a 34 (13,4 ± 1,9)b (28,5 ± 1,6)a

FBS

TCM 199 10% 266 186 (70,0 ± 6,8)a 52 (19,6 ± 1,2)a (31,7 ± 1,5)a pFF

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Qua bảng ta thấy, tỷ lệ phân chia của phôi trong ba loại môi trƣờng đối

chứng, thí nghiệm 1 (TCM 199 10% FBS), thí nghiệm 2 (TCM 199 10% pFF)

tƣơng ứng là (50,0 ± 3,5%, 74,0 ± 3,2%, 70,0 ± 6,8%). Trong đó, tỷ lệ chia của

trứng trong môi trƣờng bổ sung FBS cao hơn so với môi trƣờng bổ sung pFF (

P>0,05). Tỷ lệ chia của phôi trong hai loại môi trƣờng thí nghiệm đều cao hơn

đối chứng (74,0 ± 3,2%, 70,0 ± 6,8% sv 50,0 ± 3,5%). Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê với P<0,05.

Trong thí nghiệm của Wang vcs., 1997 [53], tác giả cũng đánh giá ảnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển tiếp theo của tế bào

trứng lợn sau thụ tinh in vitro. Trứng sau khi nuôi thành thục trong ba môi

trƣờng NCSU 23, TCM 199 và mWM đƣợc thụ tinh ống nghiệm. Ở 48 giờ sau

thụ tinh ống nghiệm, 61-70% trứng phân chia (NCSU 70%, TCM 199 và mWM

(61%). Kết quả này tƣơng đƣơng với kết về tỷ lệ chia trong các môi trƣờng

chúng tôi thực hiện.

Tỷ lệ phôi nang của tế bào trứng trong ba nhóm môi trƣờng trƣờng đối

chứng, thí nghiệm 1 (TCM 199 10% FBS), thí nghiệm 2 (TCM 199 10% pFF)

lần lƣợt là (6,3 ± 1,0%, 13,4 ± 1,9%, 19,6 ± 1,2%), trong đó, trứng nuôi trong

môi trƣờng bổ sung pFF thể hiện ƣu thế về tỷ lệ hình thành phôi nang là so với

môi trƣờng bổ sung FBS và môi trƣờng đối chứng (19,6 ± 1,2% sv 13,4 ± 1,9%,

6,3 ± 1,0%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Tỷ lệ hình thành

phôi nang của trứng nuôi trong môi trƣờng bổ sung FBS cũng cao hơn có ý

nghĩa so với môi trƣờng đối chứng (13,4 ± 1,9%, 6,3 ± 1,0%) P<0,05

Tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày thứ 6 trong môi trƣờng NCSU 23 sử

dụng trong nghiên cứu của Wang vcs., 1997 [53] cao hơn có ý nghĩa so với TCM 199 và mWM tƣơng ứng là (27a sv 15b, 4c %) với P<0,05. Số tế bào trung

bình ở ngày thứ 7 trong mỗi phôi nang của ba loại môi trƣờng tƣơng ứng là (36,8 ± 17a, 30,7 ± 13,3ab, 29,4 ± 12b). Nhƣ vậy trong nghiên cứu của Wang

vcs., 1997 [53] thì môi trƣờng NCSU 23 thể hiện ƣu thế cả về tỷ lệ hình thành

phôi nang và số tế bào trong mỗi phôi nang so với môi trƣờng TCM 199 và

mWM. Môi trƣờng NCSU 23 cũng là môi trƣờng thành công và đƣợc nhiều

phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng [11, 24, 51]

Kết quả về số tế bào trung bình/phôi nang. Số tế bào trung bình/phôi nang

của nhóm thí nghiệm bổ sung pFF cao nhất (31,7 ± 1,5), cao hơn so với nhóm bổ

sung FBS tƣơng ứng là (31,7 ± 1,5 sv 28,5 ± 1,6) , sự khác biệt này không có ý nghĩa

thống kê P>0,05. Cả hai nhóm này đều có số tế bào / phôi nang cao hơn so với nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đối chứng (31,7 ± 1,5, 28,5 ± 1,6 sv 18,5 ± 2,3) P<0,05. Số tế bào trong mỗi phôi

nang trong nghiên cứu này là tƣơng đƣơng và ổn định hơn so với nghiên cứu của

tác giả Wang vcs., 1997 [53]. Tỷ lệ hình thành phôi nang trong môi trƣờng

NCSU 23 (27%) cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này trong môi trƣờng TCM 199

(19%) P<0,05. Tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng nuôi trong môi trƣờng

mWM là thấp nhất và chỉ đạt (4%)

Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục trong hệ thống

IVM/IVF đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Các loại môi trƣờng đƣợc

bổ sung thêm một số chất nhƣ cystein, pFF, FBS…Những chất này đã đƣợc

chứng minh là giúp tăng tỷ lệ thành thục, tăng tỷ lệ hình thành tiền nhân của tế

bào trứng lợn (Singh vcs., 1997) [49] thành thục, thụ tinh ống nghiệm.n

Trong nghiên cứu này, trứng lợn nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ

lệ thành thục nhân cao hơn nhƣng khả năng thụ tinh và phát triển phôi lại kém

hơn so với môi trƣờng TCM 199. Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng xâm nhập (trứng

đƣợc thụ tinh), tỷ lệ hình thành tiền nhân, tỷ lệ trứng thụ tinh bình thƣờng, tỷ lệ

chia, hình thành phôi nang, số tế bào/phôi nang của môi trƣờng TCM 199 bổ

sung FBS và pFF cao hơn có ý nghĩa thống kê so với môi trƣờng NCSU 37

(P<0,05). Nhƣ vậy môi trƣờng TCM 199 10% pFF là môi trƣờng tốt nhất. Cả

pFF và FBS đều có vai trò cải thiện khả năng thành thục, thúc đẩy sự phát triển

tiếp theo của tế bào trứng lợn. Trong đó, pFF là nguồn nguyên liệu thu từ dịch

nang trứng của những nang trứng to (nang >3mm) trên bề mặt buồng trứng lợn,

đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm nhƣng lại là nguồn tiềm tàng lây nhiễm.

Trong khi đó, FBS có độ tinh sạch cao và rất sẵn trên thị trƣờng.

Mặc dù môi trƣờng TCM 199 10% pFF là môi trƣờng tốt nhất nhƣng do

tính chất thí nghiệm tiến hành vào mùa hè, khả năng nhiễm khuẩn cao nên

chúng tôi lựa chọn môi trƣờng tốt thứ hai là môi trƣờng TCM 100 10% FBS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dùng trong các nghiên cứu tiếp theo.

Phần II. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh, chất lƣợng trứng tới khả năng

hình thành tiền nhân và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn sau thụ

tinh ống nghiệm

Đa tinh trùng đƣợc xem là một trong những vấn để khó và dai dẳng nhất

cần khắc phục trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn [10, 16]. Đã có nhiều nghiên cứu

đánh giá nồng độ tinh trùng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn, từ đó tối

ƣu hóa nồng độ tinh, tạo hiệu quả cao trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Bên cạnh

yếu tố tinh trùng, chất lƣợng trứng cũng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng

đến khả năng thành thục (Karja, 2008) [24] và khả năng thụ tinh của tế bào

trứng lợn thụ tinh ống nghiệm (Suzuki vcs., 2003) [51]. Vì thế, trong nghiên cứu

này chúng tôi cũng đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh và chất lƣợng trứng tới

khả năng thụ tinh và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn.

4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm ở

lợn

Tế bào trứng lợn đƣợc nuôi thành thục trong môi trƣờng TCM 199 bổ

sung 10% FBS trong 44-46h, trứng đƣợc đƣợc thụ tinh với tinh trùng đông lạnh

– giải đông trong thời gian 3 giờ ở các mức nồng độ là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu

tt/ml và 1 triệu tt/ml. Sau thụ tinh 10 giờ, trứng đƣợc cố định trong dung dịch

ethanol:acid acetic (3:1) theo tỷ lệ về thể tích (v/v) để đánh giá kết quả thụ tinh.

Các chỉ tiêu nghiên cứu là tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng, tỷ lệ hình thành

tiền nhân đực và tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng với trứng thuộc các

nhóm phân theo chất lƣợng trứng là A, B1, B2. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng

4.4-4.6. Để đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng xâm nhập của

tinh trùng vào tế bào trứng, mỗi nhóm chất lƣợng trứng chúng tôi cho thụ tinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với tinh trùng ở ba mức nồng độ tăng dần là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml, 1

triệu tt/ml. Kết quả cho thấy, khi tăng mức nồng độ tinh thì tỷ lệ xâm nhập của

tinh trùng vào tế bào trứng tăng lên. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với

trứng loại A

Tỷ lệ xâm nhập Nồng độ tinh Số trứng Tỷ lệ hình thành Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng (tt/ml) TN tiền nhân (%) bình thƣờng (%) (%)

0,05 triệu 97 35 (36,2 ± 2,6)b 21 (60,6 ± 3,2)b 15 (43,1 ± 4,5)b

0,1 triệu 98 59 (60,3 ± 1,9)a 50 (85,1 ± 3,7)a 38 (64,3 ± 3,3)a

1 triệu 113 80 (70,8 ± 1,4)a 56(69,9 ±1,6)b 33 (41,4± 1,7)b

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Đối với trứng lợn loại A, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng ở mức

nồng độ 0,05 triệu tt/ml là thấp nhất 36,2 ± 2,6%. Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1

triệu tt/ml, tỷ lệ này đạt 60,3 ± 1,9%, sự khác biệt này có ý nghĩa với P<0,05.

Tiếp tục tăng nồng độ tinh lên mức 1 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng

tăng lên mức 70,8 ± 1,4%. Tỷ lệ hình thành tiền nhân là một chỉ tiêu quan trọng

để đánh giá khả năng thụ tinh của trứng và tinh trùng. Tỷ lệ hình thành tiền nhân

đạt cao nhất ở mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml là 85,1 ± 3,7% cao hơn so với mức

nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml lần lƣợt là (60,6 ± 3,17% và 69,9

±1,6%), sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng ở mức

nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml không có sự khác biệt, lần lƣợt là 43,1 ±

4,5% và 41,4 ± 1,7% với P>0,05 và thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nồng độ 0,1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 64,3± 3,3% (P<0,05).

Cũng nghiên cứu về ảnh hƣởng của nồng độ tinh, tác giả Zăhan vcs., 2006

(Zăham vcs., 2006) [57] đã chỉ ra rằng khi tăng nồng độ tinh từ 5 x 0,1 triệu lên 7,5 x 0,1 triệu - 1 triệu tinh trùng/ml thì tổng tỷ lệ thụ tinh tăng từ 37,93% lên

đến 41,94%. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng này là tƣơng đƣơng so với kết quả của

chúng tôi ở nồng độ 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml. Trong khi đó, nồng độ tinh 5 x

0,1 triệu, tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của chúng tôi đạt 64,3 ± 3,3%. Nhƣng nếu

tiếp tục tăng nồng độ tinh lên mức 2,5 x 1 triệu tinh trùng/ml thì tỷ lệ thụ tinh

giảm xuống còn 38,71%. Nếu tăng nồng độ tinh lên 5 x 1 triệu tinh trùng/ml thì

tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng giảm xuống còn 27,54%, đồng thời với việc tăng hiện

tƣợng đa tinh trùng (Zăham vcs., 2006) [57].

Qua đó ta thấy việc đánh giá nồng độ tinh là rất quan trọng trong thụ tinh

ống nghiệm ở lợn. Nếu nồng độ tinh thấp quá, khả năng xâm nhập, thụ tinh của

tinh trùng kém. Nhƣng nếu nồng độ tinh quá cao sẽ dẫn đến hiện tƣợng đa tinh

trùng. Vì vậy, việc đánh giá nồng độ tinh là cần thiết trong thụ tinh ống nghiệm

nói chung, thụ tinh ống nghiệm ở lợn nói riêng.

Việc giảm tỷ lệ tinh trùng:trứng trong quá trình thụ tinh cũng góp phần cải

thiện tỷ lệ thụ tinh và sự phát triển bình thƣờng của phôi thụ tinh ống nghiệm

(Sasithorn vcs., 2011) [48]. Ba tỷ lệ tinh trùng: trứng đƣợc sử dụng là (1000:1,

2000:1, 4000:1). Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng tăng khi trứng đƣợc thụ tinh ở

mức tỷ lệ 2000 (90.23±2,5%) và 4000 (93.46±3,7%) so với ở mức tỷ lệ 1000:1

là (74,08±1,2%). Trứng đƣợc thụ tinh ở mức tỷ lệ 1000:1 có tỷ lệ đơn tinh cao

hơn (81,79±2,9%) so với những trứng đƣợc thụ tinh ở mức 2000:1 và 4000:1

tƣơng ứng là (48,07±6,0 và 31,51±4.9%, theo thứ tự). Khả năng phát triển đến

giai đoạn phôi nang tăng có ý nghĩa trong nhóm 1000:1 (29,02±1.8%) so với tỷ

lệ này ở nhóm 4000:1 (14,00±3,0%). Tuy nhiên không có sự khác biệt về số

lƣợng tế bào trong mỗi phôi nang nhƣng phôi nang tạo ra từ nhóm tỷ lệ 1000:1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có số tế bào nội phôi nhiều nhất. Kết quả nghiên cứu của Sasithorn vcs., 2011

[48] chỉ ra rằng, tỷ lệ tinh trùng:trứng tối ƣu ở thời điểm thụ tinh cải thiện tỷ lệ

thụ tinh đặc biệt là tỷ lệ đơn tinh trùng và tỷ lệ hình thành phôi nang. Điều này

một lần nữa khẳng định vai trò của việc lựa chọn nồng độ tinh phù hợp trong thụ

b

a

tinh ống nghiệm ở lợn

Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng (mũi tên chỉ một tiền nhân đực

và một tiền nhân cái), 4.3-b Tế bào trứng lợn đa thụ tinh

Hình 4.3-a minh họa tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng với hình thành

một tiền nhân đực (mũi tên đen) và một tiền nhân cái (mũi tên đỏ). Trứng trứng

này có khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang và có thể phát triển đến giai

đoạn con non. Trong khi đó, tế bào trứng lợn đa thụ tinh (Hình 4.3-b) có ba tiền

nhân (trong đó có hai tiền nhân đực). Những trứng này ít có khả năng phát triển

đến giai đoạn phôi nang và gần nhƣ không có khả năng phát triển thành lợn con.

Chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh đối với trứng lợn loại B

tới khả năng thụ tinh của vào tế bào trứng lợn. Kết quả thể hiện ở bảng 4.5

Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trứng loại B1

Tỷ lệ xâm nhập Nồng độ Số trứng Tỷ lệ hình thành Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng tinh (tt/ml) TN tiền nhân (%) bình thƣờng (%) (%)

0,05 triệu 109 32 (29,4 ± 1,3)c 18 (56,2 ± 3,1)b 13(40,5 ± 3,2)b

0,1 triệu 99 50 (50,7 ± 4,1)b 39 (78,6 ± 2,5)a 29 (59,4 ± 5,4)a

1 triệu 111 74 (66,6 h 1,1)a 47(63,4 ± 2,1)b 28 (37,9 ± 1,7)b

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Tƣơng tự nhƣ đối với trứng A, trứng loại B1 cho tỷ lệ xâm nhập của tinh

trùng tăng khi tăng nồng độ tinh. Ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm

nhập của tinh trùng là 29,4 ± 1,3%. Khi tăng nồng độ tinh lên mức 0,1 triệu

tt/ml, 1 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng cũng tăng lên tƣơng ứng là

(50,7 ± 4,1%, 66,6 ± 1,1%), các sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Trong khi đó, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực ở nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml là

cao nhất, đạt 78,6 ± 2,5%, cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ hình thành tiền nhân

đực ở nhóm nồng độ 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là (56,2 ± 3,1% và

63,4 ± 2,1%) P<0,05. Không có sự khác biệt trong sự hình thành tiền nhân ở

mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của

nhóm nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 40,5 ± 3,2% và

37,9 ± 1,7% thấp hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ hình thành tiền nhân đực ở mức

nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, tƣơng ứng là 59,4 ± 5,4% (P<0,05).

Tƣơng quan giữa thời gian ủ tinh với tinh trùng và nồng độ tinh cũng là

yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera vcs., 1997).

Trứng đƣợc ủ với tinh trùng trong vòng 12 giờ. Với nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng đạt 39,9 ± 5,2%, kết quả này thấp hơn kết quả của

chúng tôi là 50,7 ± 4,1% với cùng nồng độ và thời gian ủ trứng với tinh trùng là

3 giờ. Tuy nhiên, khi tác giả tăng nồng độ tinh lên 5 x 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu

tt/ml làm tăng tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng lên 83,5 ± 4,3% và 86,9 ±

3,1% (P<0,05). Không có sự khác biệt về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở hai

nồng độ tinh 5 x 0,1 triệu và 1 triệutt/ml. Kết quả này cao hơn kết quả của chúng

tôi là 66,6 ± 1,1% với trứng loại B1 và 70,8 ± 1,4% với trứng loại A. Điều này

có thể lý giải do sự khác biệt về thời gian ủ tinh, nguồn gốc, chất lƣợng của các

lô tinh sử dụng.

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với

trứng loại B2

Tỷ lệ hình Tỷ lệ thụ tinh Nồng độ tinh Số trứng Tỷ lệ xâm nhập thành tiền nhân bình thƣờng (tt/ml) TN của tinh trùng (%) (%) (%)

0,05 triệu 115 26 (22,3 ± 1,7)c 10 (38,7 ± 5,6)b 5 (19,00 ± 5,5)

0,1 triệu 110 35 (31,6 ± 2,3)b 18 (51,9 ± 3,9)a 9 (25,5 ± 4,3)

1 triệu 120 52 (43,5 ± 2,0)a 30 (56,8 ± 5,2)a 8 (15,7 ± 2,8)

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Đối với trứng lợn loại B2, ở mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm

nhập của tinh trùng là 22,3 ± 1,7%. Tăng mức nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, 1

triệu tt/ml tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng là 31,6 ± 2,3%, 43,5 ± 2,0, sự khác biệt

có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở hai mức nồng độ 0,1

triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml cũng có sự khác biệt với P<0,05. Tỷ lệ hình thành tiền

nhân của trứng khi thụ tinh ở mức nồng độ 1 triệu tt/ml là cao nhất 56,8 ± 5,2%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở mức nồng độ

0,05 triệu tt/ml tƣơng ứng là (38,7 ± 5,6%). Không có sự khác biệt trong tỷ lệ

hình thành tiền nhân của hai nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml

(P>0,05). Sự khác biệt về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng của hai nhóm nồng độ

này cũng có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của mức nồng độ

tinh 0,1 triệu tt/ml, 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là (25,5 ± 4,3%,

19,00 ± 5,5% và 15,4 ± 2,8%). Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với

P>0,05.

Trứng đƣợc ủ với tinh trùng ở nồng độ 5 x 0,1 triệu tt/ml ở các mức thời

gian là 3, 6, 9 và 12h. Ở thời điểm 3h sau thụ tinh, 31,1 ± 2,1% tế bào trứng

đƣợc tinh trùng xâm nhập (Abeydeera và Day, 1997) [11]. Kết quả này tƣơng

đƣơng với kết quả của chúng tôi về tỷ lệ tinh trùng xâm nhập là 31,6 ± 2,3% với

trứng thuộc loại B2 và nồng độ tinh là 0,1 triệu tt/ml. Ảnh hƣởng của chất lƣợng

trứng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng đƣợc thể hiện ở biểu đồ 4.1.

)

Khả năng xâm nhập của tinh trùng

%

A

B1

B2

( g n ù r t h n i t a ủ c p ậ h n m â x ệ

l ỷ T

Nồng độ tinh trùng

Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng

Qua biểu đồ 4.1 ta thấy, ở các mức nồng độ tinh khác nhau, chất lƣợng

trứng cũng ảnh hƣởng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng sau thụ tinh. Với

cùng một mức nồng độ tinh, trứng loại A , B1 cho tỷ lệ tinh trùng xâm nhập

tƣơng đƣơng nhau và cao hơn so với trứng loại B2. Với mức nồng độ tinh 0,05

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

triệu tt/ml ,0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào

trứng loại A, B1 lần lƣợt là (36,2 ± 2,6%, 29,4 ± 1,3%) (60,3 ± 1,9% sv 50,7 ±

4,1%) và (70,8 ± 1,4%, 66,6 ± 1,1%) cao hơn so với trứng loại B2 (22,3 ± 1,7%,

31,6 ± 2,3% và 43,5 ± 2,0), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Tiếp theo, chúng tôi đánh giá ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả

năng hình thành tiền nhân của trứng lợn thụ tinh ống nghiệm. Kết quả thể hiện ở

biểu đồ 4.2

Khả năng hình thành tiền nhân của trứng sau thụ tinh

)

%

ì

( n â h n n ề i t h n à h t h n h ệ

l ỷ T

A

0,05 triệu tt/ml 60.60

0,1 triệu tt/ml 85.08

1 triệu tt/ml 69.86

B1

56.19

78.60

63.37

B2

38.67

51.96

56.80

Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành tiền nhân

Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng tới khả năng hình thành tiền nhân của trứng

lợn sau thụ tinh ống nghiệm. Ở mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, trứng A và B1

cho tỷ lệ hình thành tiền nhân là tƣơng đƣơng (60,6 ± 3,2%, 56,2 ± 3,1%) cao

hơn so với tỷ lệ hình thành tiền nhân của trứng B2 (38,7 ± 5,6%), sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Không có sự khác biệt trong tỷ lệ hình thành

tiền nhân giữa các nhóm chất lƣợng trứng ở mức nồng độ tinh 1 triệu tt/ml. Tuy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhiên, ở mức nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, trứng A cho tỷ lệ hình thành tiền nhân

cao nhất rồi đến trứng B1, B2 lần lƣợt là (85,1 ± 3,7% sv 78,6 ± 2,5% sv 51,9 ±

3,9%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào

Khả năng thụ tinh bình thường của tế bào trứng lợn sau thụ tinh

)

%

ì

( g n ờ ư h t h n b h n i t ụ h t ệ

l

ỷ T

A

0,05 triệu tt/ml 43.10

0,1 triệu tt/ml 64.28

1 triệu tt/ml 41.36

B1

40.48

59.42

37.88

B2

19.00

25.47

15.75

trứng lợn đƣợc thể hiện trong biểu đồ 4.3

Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng

của tế bào trứng lợn.

Chất lƣợng trứng cũng ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của

của tế bào trứng lợn. Trứng A, B1 cho tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng đƣơng nhau

(P>0,05) và cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này ở nhóm trứng B2 (P<0,05)

(43,1% và 40,48% sv 19%; 64,28% và 59,42% sv 25,47%; 41,36% và 37,88%

sv 15,75%) tƣơng ứng ở ba mức nồng độ tinh là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml

và 1 triệu tt/ml

Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trứng lợn đã đƣợc xác nhận. Theo Suzuki, 2003 (Suzuki vcs., 2003) [51], tỷ lệ

đa tinh trùng của nhóm chất lƣợng tốt (có trên 3 lớp tế bào cận noãn) đƣợc thụ

tinh từ tinh trùng của lợn Đại Bạch là 2,3%, thấp hơn có ý nghĩa so với các

nhóm chất lƣợng khác dao động từ 14,3 – 35,6% (P<0,05) đối với lợn Landrace

và 38,1% so với các nhóm khác dao động từ 48,6 – 58,5% (P<0,05) đối với lợn

Đại Bạch

4.5 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh sự phát triển và chất lƣợng của phôi lợn.

Để đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của tế

bào trứng lợn. Trứng sau thụ tinh đƣợc nuôi 48 giờ trong môi trƣờng IVC

pyrlac. Tỷ lệ chia đƣợc đánh giá ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang đƣợc đánh giá ở

ngày thứ 6 sau thụ tinh (ngày thụ tinh đƣợc tính là ngày 0). Ảnh hƣởng của nồng

độ tinh tới sự phát triển và chất lƣợng phôi lợn thể hiện qua bảng 4.7-4.9

Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn

thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A

Nồng độ tinh Số trứng Tỷ lệ phôi nang Số tế bào/phôi Tỷ lệ chia (%) (%) nang (tt/ml) TN

0,05 triệu 99 35 (35,4 ± 1,4)c 11 (11,1 ± 0,9)c 34,8± 2,3

0,1 triệu 103 67 (65,3 ± 2,0)a 22 (24,4 ± 1,11)a 35,6 ± 1,1

1 triệu 114 56(49,1 ± 0,9)b 18 (15,8 ± 1,1)b 31,0 ± 1,3

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05. Qua bảng 4.7 ta thấy, khi tăng nồng độ tinh, tỷ lệ chia của tế bào trứng

cũng tăng lên. Điều này là do nồng độ tinh ảnh hƣởng tới khả năng xâm nhập

của tinh trùng vào tế bào trứng và khả năng hình thành tiền nhân. Tế bào trứng

đƣợc thụ tinh và đƣợc hoạt hóa, phôi sẽ tiếp tục phân chia để phát triển đến giai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đoạn phôi nang.

Ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ chia chỉ đạt 35,4 ± 1,4%. Khi tăng

nồng độ tinh, tỷ lệ chia của phôi cũng tăng lên (P<0,05). Tỷ lệ chia của phôi ở

mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml cao hơn có ý nghĩa so với ở mức nồng độ tinh1 triệu

tt/ml tƣơng ứng là (65,3 ± 2,0% sv 49,1 ± 0,9%) với P<0,05. Tỷ lệ phôi nang, số

tế bào trong mỗi phôi nang của nhóm nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml thể hiện ƣu thế

hơn so với các nhóm nồng độ tinh khác. Tỷ lệ phôi nang của nhóm nồng độ 0,1

triệu tt/ml cao hơn so với nhóm nồng độ 1 triệu tt/ml, 0,05 triệu tt/ml tƣơng ứng

là (24,41 ± 1,11% sv 15,8 ± 1,1%, 11,1 ± 0,9%) P<0,05. Tỷ lệ phôi nang ở nồng

độ 1 triệu tt/ml cũng cao hơn so với tỷ lệ phôi nang ở mức nồng độ 0,05 triệu

tt/ml (P<0,05). Với trứng loại A, nồng độ tinh không ảnh hƣởng tới chất lƣợng

phôi nang. Số tế bào trung bình/phôi nang ở các mức nồng độ tinh 0,05 triệu

tt/ml, 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 34,8± 2,3; 35,6 ± 1,1; 31,0 ± 1,3.

Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05)

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn

thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1

Nồng độ tinh Số trứng Tỷ lệ chia (%) Tỷ lệ phôi nang Số tế bào/phôi

(tt/ml) TN (%) nang

0,05 triệu 1 triệu 33 (31,2 ± 1,1)b 8 (7,46 ± 1,0)b (25,0 ± 1)

0,1 triệu 101 62 (61,5 ± 2,8)a 15 (14,8 ± 1,5)a (23,4 ± 1,2)

1 triệu 109 59 (54,1 ± 3,2)a 13 (11,9 ± 1,1)ab (21,8 ± 0,8)

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Với trứng lợn loại B1, tỷ chia của phôi ở 48 giờ cũng tăng lên khi tăng

nồng độ tinh. Ở nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ chia của phôi là 31,2 ± 1,1%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml làm tăng tỷ lệ chia của

phôi lên 61,5 ± 2,8% và 54,1 ± 3,2%. Không có sự khác biệt về tỷ lệ chia của

hai nhóm nồng độ này (P>0,05). Tỷ lệ phôi nang ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml

chỉ đạt 7,46 ± 1,0%. Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, tỷ lệ hình thành

phôi nang tăng lên 14,8 ± 1,5% (P<0,05). Không có sự khác biệt về tỷ lệ hình

thành phôi nang của nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml (11,9 ± 1,1%)

với P>0,05 và giữa nhóm 1 triệu tt/ml với nhóm 0,05 triệu tt/ml (P>0,05).

Với trứng loại B1, nồng độ tinh không ảnh hƣởng tới chất lƣợng phôi

nang. Số tế bào trung bình/phôi nang ở các mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml,

0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 25,0 ± 1; 23,4 ± 1,2; 21,8 ± 0,8. Sự

khác biệt về số lƣợng tế bào/phôi nang không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).

Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn

thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2

Nồng độ tinh Số trứng Tỷ lệ phôi nang Số tế bào/phôi Tỷ lệ chia (%) (tt/ml) TN (%) nang

0,05 triệu 117 27 (23,0 ± 2,1)b 00,00 ± 0,00 -

0,1 triệu 113 49(43,2 ± 1,4)a 6 (5,25 ± 0,7) 16,4 ±0,5

1 triệu 122 52 (42,5 ± 1,3)a 3 (2,51 ± 1,0) 16,3 ± 0,7

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần., TN:thí nghiệm

Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê, P<0,05.

Với trứng thuộc nhóm B2, tỷ lệ chia của phôi ở mức nồng độ 0,05 triệu

tt/ml chỉ đạt 23,0 ± 2,1%. Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml

thì tỷ lệ chia cũng tăng lên tƣơng ứng là (43,2 ± 1,4% và 42,5 ± 1,3%). Sự khác

biệt có ý nghĩa với P<0,05. Không có sự khác nhau về tỷ lệ chia của hai nồng độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tinh 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml

Với mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, trứng loại B2 sau thụ tinh không

phát triển đến giai đoạn phôi nang. Khi tăng nồng độ tinh, phôi nang có hình

thành nhƣng tỷ lệ thấp, chỉ đạt 5,25 ± 0,7% ở mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml và

2,51 ± 1,0% ở mức nồng độ tinh 1 triệu tt/ml. Số tế bào trên mỗi phôi nang

không có sự khác biệt giữa hai nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng

ứng là 16,4 ±0,5 và 16,3 ± 0,7. Kết quả về ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới

sự phân chia và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn sau thụ tinh ống

Khả năng phân chia của tế bào trứng sau thụ tinh ống nghiệm

)

%

( i

a h ứ h t

A

y à g n ở

B1

i

B2

a h c n â h p ệ

l

ỷ T

Nồng độ tinh trùng

nghiệm đƣợc thể hiện ở biểu đồ 4.4 đến biểu đồ 4.6.

Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng phân chia của tế bào

trứng lợn

Qua bảng 4.7-4.9 và biểu đồ 4.4 chúng tôi thấy, mặc dù trứng loại A, cho tỷ lệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phân chia của phôi cao hơn so với trứng loại B1, B2 ở mức nồng độ tinh 0,05

triệu và 0,1 triệu tinh trùng/ml, nhƣng ở nồng độ 1 triệu tinh trùng/ml trứng loại

B1 cho tỷ lệ chia cao hơn trứng loại A. Không có sự khác biệt về tỷ lệ phân chia

a

b

sau thụ tinh ống nghiệm giữa các nhóm chất lƣợng trứng (P>0,05).

)

%

Khả năng hình thành phôi nang của tế bào trứng sau thụ tinh ống nghiệm

( g n a n

i

ì

ô h p h n à h t h n h ệ

l

ỷ T

A

0,05 triệu tt/ml 11.12

0,1 triệu tt/ml 21.41

1 triệu tt/ml 15.82

B1

7.46

14.82

11.92

B2

0.00

5.25

2.51

Hình 4.4 Phôi ở giai đoạn 4 tế bào (a) và giai đoạn phôi dâu (b)

Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành phôi nang

Ở nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, trứng loại B2 không có khả năng hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành phôi nang. Trứng loại A cho tỷ lệ hình thành phôi nang cao hơn so với

trứng loại B1 (11,1 ± 0,9% sv 7,46 ± 1,0%) sự khác biệt giữa hai nhóm trứng

này không có ý nghĩa thống kê với P>0,05.

Với nồng độ tinh 1 triệu tt/ml, trứng loại B2 có hình thành phôi nang

nhƣng tỷ lệ thấp, chỉ có 3 phôi nang hình thành trong tổng số 122 trứng thí

nghiệm chiếm tỷ lệ 2,51 ± 1,0%. Trong khi đó, trứng loại A, B1 cho tỷ lệ hình

thành phôi nang cao hơn (P<0,05) tƣơng ứng là (15,8 ± 1,1% và 11,9 ± 1,1%)

với P>0,05.

Ở nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, trứng loại A cho tỷ lệ hình thành phôi nang

cao nhất rồi đến trứng B1, B2 lầ lƣợt là (24,41 ± 1,1%, 14,8 ± 1,5%, 5,25 ±

0,7%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Hình 4.4. Phôi nang (Blastocyst) ngày thứ 6 sau thụ tinh ống nghiệm (độ

phóng đại 40X)

Chất lượng phôi nang

g n a n

i

ô h p / o à b ế t ố S

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

A

0,05 triệu tt/ml 34.80

0,1 triệu tt/ml 35.60

1 triệu tt/ml 31.00

B1

25

23.4

21.8

B2

16.6

16.3

Biểu đồ 4.6. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang

Qua biểu đồ ta thấy, chất lƣợng trứng ảnh hƣởng rõ rệt tới chất lƣợng phôi

nang. Ở nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, chỉ có trứng A, B1 có hình thành phôi

nang. Trứng A có chất lƣợng phôi nang tốt, đạt trung bình 34,8 tế bào/phôi

nang. Trong khi đó trứng loại B1 có số tế bào trung bình là 25. Sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê với P<0,05.

Ở nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, số tế bào trong mỗi phôi nang ở các nhóm

chất lƣợng trứng A, B1, B2 tƣơng ứng là (35,6 ± 1,1; 23,4 ± 1,2; 16,4 ± 0,5). Sự

Tế bào

Tế bào

khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Hình 4.5 Phôi nang nhuộm với thuốc nhuộm orcein (độ phóng đại 200X, 100X)

Với mức nồng độ tin 1 triệu tt/ml, số tế bào có trong mỗi phôi nang tƣơng

ứng là (31,0 ± 1,3; 21,8 ± 0,8; 16,3 ± 0,7). Số tế bào giữa các nhóm nồng độ tinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có sự khác biệt thống kê với P<0,05.

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Môi trƣờng nuôi thành thục có ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh và phát triển

tiếp theo của tế bào trứng lợn.

NCSU 37 cho tỷ lệ thành thục nhân là cao nhất. Trong khi đó, TCM 199

thì ngƣợc lại, khi nuôi trứng trong môi trƣờng này cho tỷ lệ thành thục thấp hơn

nhƣng sự phát triển sau thụ tinh lại tốt hơn.

TCM 199 10% pFF là môi trƣờng tốt nhất trong nuôi thành thục trứng

lợn. Tuy nhiên pFF là nguồn tiềm tàng lây nhiễm nên có thể sử dụng môi trƣờng

TCM 199 10% FBS để thay thế.

2. Nồng độ tinh ảnh hƣởng tới khả năng xâm nhập, khả năng hình thành tiền

nhân và khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng.

Nồng độ tinh quá thấp (0,05 triệu tt/ml) không đủ tiêu chuẩn sử dụng

trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn với lô tinh này.

Nồng độ tinh tối ƣu với lô tinh sử dụng trong nghiên cứu này là (0,1 triệu

tt/ml) đảm bảo khả năng xâm nhập, hình thành tiền nhân và tỷ lệ thụ tinh bình

thƣờng.

3. Chất lƣợng trứng lợn ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh và phát triển tiếp theo

của tế bào trứng lợn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trứng loại A, B1 đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.

Trứng B2 không nên sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.

5.2 Đề nghị

Nghiên cứu cải thiện môi trƣờng nuôi trứng, góp phần nâng cao tỷ lệ hình

thành phôi nang, chất lƣợng phôi nang. Từ đó cung cấp nguồn nguyên liệu tế

bào phôi nang đảm bảo chất lƣợng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, đặc

biệt là theo hƣớng y sinh.

Nghiên cứu cải tạo môi trƣờng để tận dụng đƣợc nguồn tế bào trứng B2

rất dồi dào. Đây cũng là cơ sở trong nghiên cứu bảo tồn các loài động vật quí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hiến, bảo tồn đa dạng sinh học ex situ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, Nguyễn

Quốc Đạt (2003), “Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên heo”, Báo

cáo khoa học; Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 639 -

642.

2. Nguyễn Hữu Đức (2005) “Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống

nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam”, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp. Trƣờng

Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội.

3. Nguyễn Thị Phƣơng Hiền, (2007), Nghiên cứu ảnh hƣởng của mùa vụ

lên kết quả nuôi thành thục một số động vật nuôi, Luận văn thạc

sỹ Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

4. Nguyễn Mộng Hùng (1993) “Bài giảng sinh học phát triển”, Nhà xuất bản

Khoa học Kỹ thuật, Hà nội.

5. Bùi Xuân Nguyên (2003), “Phát triển công nghệ phôi và tế bào phôi ở

Việt Nam”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật

Hà Nội, tr. 411 - 417.

6. Nguyễn Thị Ứơc, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn

Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu,

Nguyễn Thùy Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, Dƣơng Đình Long, Bùi Xuân

Nguyên, (2003), “Sản xuất bê sữa bằng thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xác định giới tính, Tài liệu hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Nxb

Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, Tr 717- 719.

7. Nguyễn Thị Ƣớc, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân

Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi

Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Khắc Tích,

Phan Ngọc Minh, Bùi Xuân Nguyên, (2008). “Nghiên cứu sản xuất phôi

lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ ống nghiệm và nhân bản vô tính”.

Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4A), tr. 625-635.

Tài liệu tiếng Anh

8. Abeydeera L.R., Wang W.H., Cantley T.C., Prather R.S., Day B.N.,

(1998). Presence of betamercaptoethanol can increase the glutathione

content of pig oocytes matured in vitro and the rate of blastocyst

development after in vitro fertilization. Theriogenology 50, 747-756

9. Abeydeera LR. (2001). In vitro fertilization and embryo development in

pigs. Reproduction (Suppl) 58:159–173.

10. Abeydeera LR. (2002) “In vitro production of embryos in swine”

Theriogenology. 57(1):256-73

11. Abeydeera, L.R., Day, B.N., 1997. Fertilization and subsequent

development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified tris-

buffered medium with frozen-thawed ejaculated spermatozoa. Biol.

Reprod. 57, 729–734.

12. Agung B., Otoi T., Fuchimoto D-I., Senbon S., Onishi A. and Nagai T.

(2013). In vitro Fertilization and Development of Porcine Oocytes

Matured in Follicular Fluid. Journal of Reproduction and Development 59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(2):103-1 triệu

13. Bing Y.Z., Rodriguez-Martinez H., Nagai T. (2001), Effects of

cysteamine, FSH, and estradiol-17β on in vitro maturation of porcine

oocytes. Theriogenology 55, 867-876

14. Black JL and Erickson BH (1968) Oogenesis and ovarian development in

the prenatal pig Anatomical Record 161 45–56

15. Clark, S.G., Haubert, K., Beebe, D.J., Ferguson, C.E., Wheeler, M.B.,

(2005). “Reduction of polyspermic penetration using biomimetic

microfluidic technology during in vitro fertilization” Lab. Chip 5, 1229–

1232

16. Ding J., Clarke N., Nagai T., Moor R.M., 1992. Protein and nuclear

changes in pigs at fertilization. Mol. Reprod. Dev. 31: 287-296

17. Funahashi H, 2005. Effect of beta-mercaptoethanol during in vitro

fertilization procedures on sperm penetration into porcine oocytes and the

early development in vitro. Reproduction 130, 889-898.

18. Funahashi H, Romar R, 2004. Reduction of the incidence of polyspermic

penetration into porcine oocytes by pretreatment of fresh spermatozoa

with adenosine and a transient co-incubation of the gametes with caffeine.

Reproduction 128, 789-800.

19. Funahashi H., Nagai T., 2001. Regulation of in vitro penetration of

frozen-thawed boar spermatozoa by caffeine and adenosine. Mol. Reprod.

Dev. 58, 424-431

20. Gosden RG and Telfer EE (1987) Numbers of follicles and oocytes in

mammalian ovaries and their allometric relationships Journal of Zoology

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

London 211 169–175

21. Grupen C.G., Nagashima H., Nottle M.B., 1995. Cysteamine enhances in

vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Biol.

Reprod. 53, 173-178

22. Hunter M G (2000). Oocyte maturation and ovum quality in pigs.

Journals of Reproduction and Fertility. 5, 122–130.

23. Hunter RHF, (1990). Fertilization of pig eggs in vivo and in vitro. J

Reprod Fertil (Suppl) 40:211–226

24. Karja NWK.. Nuclear Matureation of Porcine oocytes in vitro: Effect of

the Cumulus-Oocyte Complexes Quality. Indoneisan Journal of

Biotechnology. December, 2008. Vol.13, No.2, pp.1078-1084.

25. Kątska-Książkiewicz L. (2006) Pig embryo production by in

vitromaturation and fertilization of ovarian oocytes. A review. Journal of

Animal and Feed Sciences 15: 525–542

26. Kay E. and Brian D. (2003). In vitro fertilization, second edition,

Cambridge university press.

27. Kikuchi K, Naito K, Daen FP, Izaike Y and Toyoda Y (1995) Histone

H1kinase activity during in vitro fertilization of pig follicular oocytes

matured in vitro. Theriogenology 43523–532

28. Kikuchi K, Onishi A, Kashiwazaki N, Iwamoto M, Noguchi J, Kaneko

H, Akita T, Nagai T (2002) “Successful piglet production after transfer of

blastocysts produced by a modified in vitro system” Biol Reprod

66(4):1033-41.

29. Kikuchi K., Kashiwazaki N., Noguchi J., Shimada A., Takahashi R.,

Hirabayashi M., Shino M., Ueda M., and Kaneko H. (1999)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Developmental Competence, after Transfer to Recipients, of Porcine

Oocytes Matured, Fertilized, and Cultured In Vitro. Biology of

reproduction 60, 336–340

30. Leibfried – Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L.,

and First (1986), “Developmental potential of bovine oocytes matured in

vitro or in vivo” Theriogenology, 25 (1), 164.

31. Leibfried L and First NL (1979) Characterization of bovine follocular

oocytes and their ability invitro. J Anim Sci (48): 76-86.

32. Li YH., Ma W., Li M., Hou Y, Jiao LH., Wang WH., (2003) “Reduced

Polyspermic Penetration in Porcine Oocytes Inseminated in a New In

vitro Fertilization (IVF) System: Straw IVF”. Biology of reproduction 69,

pp 1580–1585

33. Liu R.H. et al, (2003). “Maturation of porcine oocytes after cooling at the

germinal vesicle stage”. Zygote, 11; 299-305

34. Long C. R., Dobrinsky J. R., Johnson L. A., 1999. “In vitro production of

pig embryo: Comparision of culture media and boars”. Theriogenology,

vol. 31; 1375 - 1388

35. Marchal R., Feugang J.M., Pereau C., Venturi E., Terqui M., Mermillod

P., 2001. Meiotic and developmental competence of prepubertal and adult

swine oocytes. Theriogenology 56, 17-29

36. Margot Alves Nunes Dode, Charles Graves (2001). Influence of

hormones and follicular fluid on maturation of pig oocytes. Ciênca Rural,

Santa Maria, 31 (1), p.99-104

37. Mattioli M., Bacci M.L., Galeati G., Seren E., 1989. Developmental

competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

31, 1201-1207

38. McGaughey RW, Montgomery DH and Richter JD (1979) Germinal

vesicle configuration and patterns of polypeptide synthesis of porcine

oocytes from antral follicles of different size as related to their

competence for spontaneous maturation, Journal of Experimental Zoology

209 239–252

39. Melanie Anna Bagg (2007). Factors affecting the developmental

competence of pig oocytes matured in vitro. Ph.D thesis in Medicine.

40. Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. (2012)

The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology

20 (1)

41. Mtango N.R., Varisanga M.D, Juan D.Y., Wongrisekeao P. and Suzuki T.

(2002). Development to Blastocyst Stage of Pig Oocytes Matured,

Fertilized and Electroactivated In vitro Arch. Tierz., Dummerstorf 45 6,

547-556

42. Nagai T, (1996). In vitro maturation and fertilization of pig oocytes.

Animal Reproduction Science 42, 153–163.

43. Nagai T. (2001). The improvement of in vitro maturation systems for

bovine and porcine oocytes. Theriogenology 55, 1291-1301

44. Nguyen B. X., et al. (2006). “Current status and Trends of animal

reproductive biotechnology in Viet Nam”. Embryo Transfer Newsletter,

V24, No2: 5-10.

45. Nguyen VIET LINH, Thanh Quang DANG-NGUYEN, Bui Xuan

NGUYEN, Noburu MANABE and Takashi NAGAI (2009), Effect of

Cystein During In vitro Maturation of Porcine Oocytes Under Low

Oxygen Tension On Their Subsequent In vitro Fertilization and

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Development. J.Reprod. Dev. 55 6 (2008) 594-598.

46. Perreault, S.D., Barbu, R.R. and Slott, V.L. (1988) Importance of

glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear

decondensing activity in maturing hamster oocytes. Dev. Biol., 125, 181-

186.

47. Qian Y.; Shi W.Q., Ding J.T., Fan B.Q. and Fuku Y.; “Effect of follicle

size on Cumulus - Expansion, In vitro fertilization and development of

porcine follicular oocytes”. Journal of Reproduction and Development.

Vol. 47, No. 3, 2001; 145 – 152

48. Sasithorn P., Theerawat T., Panida C., Mongkol T. (2011). Improvement

of Normal Fertilization Rate and Embryo Development by Reduction of

Sperm: Oocyte ratio during In vitroFertilization in Pig. Thai J Vet Med.

41(1): 71-77

49. Singh B., Meng L., Rutledge J.M., Armstrong D.T., 1997. Effects of

epidermal growth factor and follicle stimulating hormone during in vitro

maturation on cytoplasmic maturation of porcine oocytes. Mol. Reprod.

Dev. 46, 401-407

50. Spinaci M et al. (2008), “Effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on

in vitro maturation and fertilization of porcine oocytes”. Theriogenology

(69) 877-885

51. Suzuki H., Saito Y., Kagawa N., and Yang X. (2003). In vitro

Fertilization and Polyspermy in the Pig: Factors Affecting Fertilization

Rates and Cytoskeletal Reorganization of the Oocyte. Microscopy

Research and Technique 61:327–334.

52. Vatzias G., Hagen, D.R., (1999). “Effects of porcine follicular fluid and

oviduct-conditioned media on maturation and fertilization of porcine

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

oocytes in vitro”. Biol. Reprod. 60, pp 42–48

53. Wang W. H., L. Abeydeera R., Cantley T. C. and Day B. N.(1997).

Effects of Oocyte maturation media on development of pig embryos

produced by in vitro fertilization. Journal of Reproduction and Fertility

111, 101-108.

54. Yanagimachi R. 1994. “Mammalian fertilization”. In E. Knobil and J. D.

Neill (eds.), “The Physiology of Reproduction”, 2nd Ed. Raven Press,

New York

55. Yoshida, M., Ishigaki, K., Pursel, V.G., 1992. Effect of maturation media

on male pronucleus formation in pig oocytes matured in vitro. Mol.

Reprod. Dev. 31, 68–71

56. Yoshioka K., Suzuki C., Itoh S., Kikuchi K., Iwamura S., Rodriguez-

Martinez H., (2003). Production of piglets derived from in vitro-produced

blastocysts fertilized and cultured in chemically defined media: effects of

theophylline, adenosine, and cysteine during in vitro fertilization. Biol.

Reprod. 69, 2092-2099

57. Zăhan M., V. Miclea, C. Man, Ileana Miclea, I (2006). Roman The

Influence Of Sperm Concentration On Swine In vitro Fertilization

Buletinul USAMV-CN, 63, ISSN 1454-2382

58. http://ibbio.pbworks.com/f/1317538698/oocyte.jpg

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

59. http://www.repropedia.org/sites/repropedia/files/oocyte-final.jpg