Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng mã vạch DNA của cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân tích được đặc điểm của trình tự gen lục lạp matK phân lập từ các giống giảo cổ lam phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng mã vạch DNA của cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ HOÀI SƠN XÂY DỰNG MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 4- 2016
i LỜI CAM ĐOAN ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016 Tác giả Vũ Hoài Sơn
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Tác giả Vũ Hoài Sơn
iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục từ và chữ viết tắt ............................................................................. iv Danh mục bảng.................................................................................................. v Danh mục hình ................................................................................................. vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 ...................................................................................................... 1 ...................................................................................... 2 ..................................................................................... 2 ...................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM ................................................................................................ 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm sinh thái học ............................................................................ 4 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................. 4 1.2.1. Thành phần hóa học ................................................................................ 4 ............................................................. 6 1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK ................................. 7 1.3.1. DNA lục lạp ............................................................................................ 7
iv 1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding) .......................................................... 10 1.3.3. Gen matK............................................................................................... 16 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 22 ........ 22 .................................................................................................. 22 ............................................................................... 22 ............................................................................. 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 22 .................. 22 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ....................................................... 23 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27 ...... 27 3.1.1. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Chợ Đồn, Bắc Kạn ........ 27 3.1.2. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Ngọc Đƣờng, Hà Giang 28 .............................................................................. 30 3.1.4. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Sapa, Lào Cai ........... 31 matK . 32 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây Giảo cổ lam..................................... 32 3.2.2. Kết quả nhân gen matK bằng phản ứng PCR ....................................... 33 matK .............................................................................. 34 matK .................................... 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 45
iv DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide Cs: Cộ DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediamine tetraacetate matK: PCR: Polymerase chain reaction ( RNA: Ribonucleic acid TAE: - –
v DANH MỤC BẢNG Trang ................... 25 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK ................................... 25 –SP. ........................................................... 37 .......................................... 39 ......................................................................... 40 Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của các mẫu Giảo cổ lam. ...................................................................................... 40 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn của các mẫu Giảo cổ lam. ............................................................................... 42
vi DANH MỤC HÌNH Trang Đồn, Bắc Kạn. ................................................................................................. 27 H .......................................................................... 29 ............................................................. 30 (A, D, F: ............................ 32 .......................... 33 – – – CD) ........ 33 ................ 34 – ........................................................................................................ 36 cổ lam .............................................................................................................. 38 Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu Giảo cổ lam ................................................................... 41 ................................................................. 42
1 MỞ ĐẦU Đối với nƣớc ta dƣợc liệu có một vị trí quan trọng. Nƣớc ta nằm trong vùng nhiệt đới, chịu ảnh hƣởng của gió mùa. Nhiệt độ trung bình hàng năm là 250C, độ ẩm khá cao tạo điều kiện thuận lợi cho cây cối phát triển. Diện tích rừng chiếm 2/3 diện tích đất. Hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, cả nƣớc có khoảng 20.000 loài trong đó có trên 1.000 loài cây thuốc. Về mặt kinh tế, nhà nƣớc đã xếp cây thuốc vào loại cây công nghiệp cao cấp cần đƣợc phát triển nhƣ những cây công nghiệp khác. Hàng năm công ty Dƣợc liệu cấp I và cấp II và gần đây các công ty tƣ nhân đã biết khai thác nhiều mặt hàng dƣợc liệu để xuất khẩu nhƣ giảo cổ lam, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu hồi, quế, tràm… cây , có thành phần hóa học chính là flavonoid và saponin thành phần giống nhƣ nhân sâm song hàm lƣợng saponin có trong giảo cổ lam lại nhiều gấp 3 – 4 lần so với nhân sâm. Saponin đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dƣợc phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là điều trị ung thƣ. Dù Giảo cổ lam không thể hoàn toàn thay thế nhân sâm, song xét về một số phƣơng diện, hiệu quả mà giảo cổ lam mang lại còn tốt hơn cả nhân sâm. Ở Việt Nam chủ yếu nghiên cứu, phân loại dựa trên hình thái và nghiên cứu tác dụng dƣợc liệu của cây Giảo cổ lam. Đến nay, các mẫu hƣớng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp, mẫu vật chƣa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hƣ hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên
2 khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trƣờng hợp này mã vạch DNA đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô “Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)”. matK (Gynostemma pentaphyllum). lam thu phân tích gen matK DNA nucleotide matK. matK matK ban đ
3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Ở Việt Nam, năm 1997, Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện cây thất diệp đảm trên núi Fansipan và đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định đúng là loại Gynostemma pentaphyllum [122]. Gynostemma pentaphyllum, : Giới (regnum) Plantae, Bộ (ordo) Cucurbitales, Họ (familia) Cucurbitaceae, Chi (genus) Gynostemma, Loài (species) G. pentaphyllum. Ở Việt Nam có ba loại giảo cổ lam là: (1) Giảo cổ lam ba lá (G. Laxum), (2) Giảo cổ lam năm lá (G. Pentaphyllum), (3) Giảo cổ lam bảy lá (G. Pubescens) [122]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Giảo cổ lam là một loài cây thảo có thân mảnh, cây thƣờng mọc leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá. Lá cây Giảo cổ lam là lá kép hình chân vịt, mỗi lá gồm 3 hoặc 5 hoặc 7 lá chét, mỗi lá chét có một cuống riêng, cuống chung dài 3 – 4 cm. Lá mọc cách trên thân, mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dƣới lá có màu xanh lá cây, mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn. Cây có hoa nhỏ, màu trắng, hình sao, ống bao hoa rất ngắn cánh hoa rời nhau, cao 2,5 mm bao phấn
4 dính thành đĩa, có 3 vòi nhuỵ, ra hoa từ tháng 7 – 9, có quả từ tháng 9 – 10. Quả khô, tròn, to 5 – 9 mm, có màu đen, mỗi quả có từ 2 – 3 hạt khi chín màu đỏ, kích thƣớc hạt khoảng 4 mm. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái học ự phân bố, Giảo cổ lam mọc tự nhiên ở độ cao 100 m – 3200 m tại các cánh rừng và thung lũng trên núi, những nơi ẩm thấp nhƣ bên bờ suối, trong các bụi cây, phân bố rộng rãi ở các quốc gia nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanka, Lào, Myanmar, Việt Nam. năm 1997, lần đầu tiên, Phạm Thanh Kỳ cùng các cộng sự đã phát hiện một quần thể Giảo cổ lam mọc tự nhiên trên núi Fansipan (Lào Cai) ở độ cao 1500m, sau đó đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học chính xác. Hiện nay, giảo cổ lam đã đƣợc tìm thấy ở các tỉnh phía Bắc nhƣ Cao Bằng, Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình, Lào Cai… 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.2.1. Thành phần hóa học Từ thân, lá của các loài thuộc chi Gynostemma đã phân lập đƣợc một số lớp chất nhƣ tecpenoit, tecpenoid – glycosit và flavonoid. Nghiên cứu hóa học thực vật tiến hành trên cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) tại Bắc Kạn đã thu đƣợc 3 hợp chất phytosterol, 2 hợp chất flavonoid và thu đƣợc 5 hợp chất sạch là: stigmasterol (GyH1); β-sitosterol (GyH2), 3,3’5-trihydroxy- 4’,7 dimethoxyflavon (GyE1); sigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glycopyranosis (GyE2) và 3,5-dihydroxy-4’,7- dimethoxyflavon-3’-O-[α-L rhamnopyranosyl (1- 6)]-O-β-D-glycopyranosit (GyM1) [28]. Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại Saponin cấu trúc triterpen kiểu dammaran, trong đó có nhiều loại có cấu trúc rất giống với Saponin có trong
5 Nhân sâm và Tam thất (vì vậy có tên Ngũ diệp sâm, Sâm nam). Nhóm dammaran trong Saponin triterpenoid tetracylic có phần aglycon gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh. Phần đƣờng nối vào OH ở đầu C-3 hoặc nối vào nhóm –OH của mạch nhánh. Hình 1.1. Cấu trúc của saponin trong Giảo cổ lam [10] Giảo cổ lam còn chứa nhiều flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và có tác dụng chống lão hóa mạnh. Ngoài ra còn trong Giảo cổ lam còn có các acid amin tan trong nƣớc, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Zn, Fe, Se. Đã có nhiều nghiên cứu thử độc tính cấp, trƣờng diễn, bán trƣờng diễn và xác định cây không có độc. Các hoạt chất chiết xuất từ giảo cổ lam đã đƣợc thử nghiệm trên cả động vật lẫn trên cơ thể ngƣời và các nhà khoa học đã có đƣợc các kết quả rất đáng kinh ngạc. Giảo cổ lam có tác dụng ức chế tăng cholesteron 71% theo phƣơng pháp ngoại sinh và 82,08% theo phƣơng pháp nội sinh, do đó, nó có tác dụng giảm mỡ máu rất mạnh [122]. Còn rất nhiều thành phần khác nữa mà các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc đã nghiên cứu, chiết xuất, ứng dụng.
6 Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn [5]. Các thử nghiệm Giảo cổ lam trên chuột và thỏ áu (Triglicerid và Cholesterol). Giảo cổ lam làm tăng lực 214,2%, Giảo cổ lam bảo vệ tế bào gan mạnh trƣớc sự tấn công của các chất độc và làm tăng tiết mật. Các nhà khoa học đã thử nghiệm trên chuột bơi và nhận thấy tác dụng tăng lực tới 214,2%. Với tác dụng tăng lực nhƣ trên, các vận động viên của Trung Quốc và Nhật Bản thƣờng sử dụng giảo cổ lam trƣớc các cuộc thi đấu và họ gọi loại cây này là Doping thiên nhiên [12]. Giảo cổ lam có tác dụng bảo vệ tế bào gan rất mạnh trƣớc sự tấn công của các chất gây độc, làm tăng tiết mật và làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào khi chiếu xạ hoặc gây độc tế bào bằng hóa chất… [12]. Giảo cổ lam làm tăng đáp ứng miễn dịch của tế bào khi chiếu xạ tế bào hay gây độc bằng hóa chất Cyclophosphamid. Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, tăng cƣờng khả năng miễn dịch và tính kháng [35]. Giảo cổ lam có tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng. Trên chuột đái tháo đƣờng di truyền, liều uống 500mg/kg làm hạ đƣờng huyết 22%, liều 1000mg/kg làm hạ tối đa 36%. Trong liệu pháp dung nạp glucose ở chuột nhắt trắng, liều uống 1000mg/kg đã ức chế sự tăng đƣờng huyết tới 55% (sau 30 phút) và 63% (sau 60 phút) so với nhóm đối chứng. Giảo cổ lam gây hạ đƣờng huyết yếu trên chuột bình thƣờng nhƣng lại có tác dụng khá mạnh trên chuột có đƣờng huyết cao. Nhƣ vậy ngoài cơ chế làm tiết insulin, Giảo cổ lam cũng có tác dụng làm tăng nhạy cảm của mô với insulin [30]. cân tƣơng đối mạnh do giảm lƣợng mỡ dƣ thừa tích lũy ở vùng bụng, đùi và nội tạng thông qua tăng cƣờng chuyển hóa mỡ. Tuy nhiên, Giảo cổ
7 lam lại có tác dụng tăng cơ bắp nên chỉ có tác dụng giảm cân ở những ngƣời béo. Giảo cổ lam có tác dụng tăng lực co cơ đến 11,112 kg, cao hơn hẳn Quercetin và Phylamin. Tác dụng này phù hợp với mục đích sử dụng Giảo cổ lam để tăng lực cho các vận động viên thi đấu để nâng cao thành tích. Sau 2 tháng sử dụng Giảo cổ lam, huyết áp của các bệnh nhân đã giảm từ 113,765 xuống 97,868. Giảo cổ lam có tác dụng giảm mỡ trong máu tới 20%. Đặc biệt, Giảo cổ lam còn có tác dụng hạ Cholesterol trong máu tới 22%, [4]. Thử nghiệm lâm sàng cho thấy 100 bệnh nhân sử dụng Giảo cổ lam sau 2 tháng đã cải thiện tình trạng bệnh. Đối với các triệu chứng cơ năng khác nhƣ đau đầu, thiếu máu não, đau tức ngực, choáng ngất đều đƣợc cải thiện rất tốt sau khi sử dụng Giảo cổ lam. Làm hạ mỡ máu, nhất là hạ Cholesterol toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não. Chống lão hóa, giảm căng thẳng, mệt mỏi, giúp tăng sức mạnh, tăng khả năng làm việc. Tăng cƣờng sự miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành khối u. Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cƣờng máu lên não, cải thiện tình trạng giảm trí nhớ ở ngƣời già. Tăng cƣờng chức năng giải độc gan. Từ những tác dụng lâm sàng và công dụng dƣợc liệu của Giảo cổ lam đã khẳng định rằng đây là cây thuốc quý. Sử dụng Giảo cổ lam không những nâng cao sức khỏe mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh cho con ngƣời. 1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK 1.3.1. DNA lục lạp Không giống nhƣ động vật, ngoài gen nhân và ty thể (mtDNA), thực vật còn có một gen bổ sung là gen lục lạp (cpDNA). DNA nhân, lục lạp và ty thể đều đƣợc sử dụng trong phân tích phát sinh loài.
8 Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen và mỗi phƣơng pháp đƣợc áp dụng phù hợp. Do tính phức tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc , nhƣ vùng 18S, 26S, vùng ITS...đƣợc sử dụng. Vùng 18s và vùng 5,8S thƣờng đƣợc sử dụng để xác định mức dƣới họ cho đến loài; vùng ITS và vùng 5S Spacer thƣờng đƣợc dùng để phân tích mức loài cho đến mức dƣới loài. gen ty thể phù hợp cho phân biệt ở mức loài vì chúng có đặc điểm là cấu trúc, kích thƣớc, và trật tự gen thay đổi nhanh chóng. Gen cytochrome B và vùng control thƣờng đƣợc sử dụng ở mức loài đến mức dƣới loài. DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA), DNA lục lạp đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1962 và đƣợc công bố trình tự đầu tiên vào năm 1986 khi nhóm nghiên cứu Nhật Bản giải trình tự DNA lục lạp của thuốc lá và cây địa tiền. Kể từ đó, hàng triệu DNA lục lạp đã đƣợc giải trình tự, nhƣng chủ yếu là đại diện thực vật trên cạn và các loài tảo. DNA lục lạp là DNA sợi đôi, có chiều dài khoảng 35 – 217 kb tùy từng loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài khoảng 115 – 165 kb. DNA lục lạp có dạng vòng, kép, chiều dài khoảng 30 – 60 µm, khối lƣợng khoảng 80 – 130 triệu dalton. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 – 10000 bản sao cpDNA. Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài thực vật trên cạn, trình tự gen gần nhƣ là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosome, 30 – 31 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 tiểu đơn vị RNA polymerase. Các gen thuộc cpDNA có tính bảo thủ cao và có thể đƣợc chia thành 3 nhóm nhƣ sau: Nhóm 1: là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp nhƣ phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB) cytochrome (petA, petB) ATP synthease (atpA, atpB), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenase (ndhA, ndhB)
9 Nhóm 2: là có gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5), trnA (trnH, trnK), RNA polymerase (rpoA, ropB) và các gen tiểu phần ribosome (rps2, rps3). Nhóm 3 là gồm các ORF khung đọc mở (chƣa rõ chức năng) và các gen mã hóa protein nhƣ matK, cemA. Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật nhƣ: 16S, rbcL, atpß, ndhF, intron trnL và matK...trải rộng từ bộ cho đến mức loài. Vùng 16S phù hợp ở mức độ bộ, trong khi rbcL, atpß, ndhF, phù hợp ở mức độ bộ đến mức loài. Vùng intron trnL và matK có thể áp dụng trong một biên độ rộng từ bộ cho đến dƣới loài. Trƣớc đây chúng thƣờng đƣợc sử dụng từ mức họ cho đến mức loài; hiện nay chúng thƣờng đƣợc sử dụng từ mức họ đến mức phụ loài. Vùng atpß – rbcL có thể đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức loài nhƣng chúng cũng đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức phụ loài. Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ đƣợc gọi là phần bảo thủ. Phần này chứa một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân vật lý, hóa học tác động gây đột biến, do đó đoạn nucleotide đổi trong quá trình tiến hóa. Vì vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng các đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA, qua đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong sinh giới hiện nay. Có 7 vùng DNA gồm atpF – atpH, gen matK, gen rbcL, gen ropB, ropC1, spacer psbK – psbI và spacer trnH – psbA đƣợc chọn ứng cử viên làm mã vạch DNA cho thực vật trên đất liền; trong đó, có 4 vùng là các phần gen mã hóa (gen matK, gen rbcL, gen rpoB và gen ropC1) và ba vùng đệm không mã hóa cho protein (atpF – atpH, trnH – psbA và psbK – psbI).
10 Qua khảo sát chọn ra đƣợc 3 vùng là rbcL (dễ sử dụng nhƣng khó khăn phân biệt); matK (khả năng phân biệt và mã hóa cao hơn, gần với CO1, nhƣng phổ quát thấp) và trnH – psbA (có tính phổ quát, có khả năng phân biệt nhƣng chiều dài hay thay đổi). 1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding) Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tƣơng đối đầy đủ và toàn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chƣa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trƣờng, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới loài. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phƣơng pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và đƣợc gọi là phƣơng pháp phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu, ngƣời ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [33]. Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) nhƣ là một cách để xác định loài. Mã vạch đƣợc sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;
11 (ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao; (iii) Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều loài [19], [21]. 1.3.2.2. Ứng dụng của mã vạch DNA thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu cũng đƣợc ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ v cả chó đã đƣợc các cơ quan pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công việc của họ [37]. mã vạch DNA trong kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp USD mỗi năm. Sử dụng loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chƣơng trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh. Kinh doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ đƣợc đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh [26].
12 mã vạch DNA trong xác định vật chủ trung gian gây bệnh Mã vạch DNA cũng đƣợc sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh. Các nhà khoa học những ngƣời mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa ngƣời và động vật. Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng nhƣ phƣơng pháp điều trị đạt đƣợc hiệu quả nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang đƣợc xây dựng và phổ biến. Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phƣơng pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng [38]. mã vạch DNA trong bảo vệ loài nguy cấp Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tiệt chủng. Không thể kiểm soát đƣợc săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trƣởng giảm 90% . Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang dã quý hiếm hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học [36]. mã vạch DNA trong duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn đƣợc ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải