Đề tài: Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat bằng phương pháp kết tủa đựợc tiến hành với các mục tiêu sau: Bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp kết tủa, đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nanoartesunat.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1. Đại cƣơng về hệ tiểu phân nano ......................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm ......................................................................................................... 2
1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 2
1.1.3. Một số phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano ................................................... 5
1.2. Đại cƣơng về Eudragit RS PO ............................................................................ 8
1.2.1. Giới thiệu về Eudragit RS PO .......................................................................... 8
1.2.2. Một số nghiên cứu về nano sử dụng Eudragit RS PO ...................................... 9
1.3. Đại cƣơng về Artesunat ...................................................................................... 9
1.3.1. Công thức hóa học ............................................................................................ 9
1.3.2. Tính chất lý hóa .............................................................................................. 10
1.3.3. Đặc điểm dƣợc động học ................................................................................ 10
1.3.4. Chỉ định .......................................................................................................... 10
1.3.5. Tác dụng chống ung thƣ ................................................................................. 11
1.3.6. Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa artesunat .................. 12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 14
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ......................................................................................... 14
2.1.1. Nguyên liệu. ................................................................................................... 14
2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................... 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 15
2.3.1. Phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano artesunat ............................................. 15
2.3.2. Các phƣơng pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân artesunat .............. 17
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 23
3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của quy trình bào chế tới đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................ 23
3.1.1. Khảo sát trình tự phối hợp hai pha ................................................................. 23
3.1.2. Khảo sát tốc độ phối hợp hai pha ................................................................... 23
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần trong công thức tới đặc tính lý hóa
của tiểu phân nano Artersunate. ................................................................................ 24
3.2.1. Khảo sát nồng độ chất diện hoạt. ................................................................... 24
3.2.2. Khảo sát nồng độ Eudragit RS PO ................................................................. 26
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu ................................................................ 27
3.2.4. Khảo sát nồng độ artesunat ............................................................................ 28
3.3. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano astesunat. .............................. 29
3.3.1. Về KTTP, PDI, Thế Zeta, hiệu suất mang thuốc, khả năng nạp thuốc ........... 30
3.3.2. Hình thái học của tiểu phân nanoartesunat ..................................................... 31
3.3.3. Đánh giá khả năng giải phóng dƣợc chất in vitro ........................................... 31
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................ 33
4.1. Về tiêu chuẩn lựa chọn công thức và quy trình bào chế .................................... 33
4.2. Về ảnh hƣởng của trình tự phối hợp và tốc độ phối hợp. .................................. 34
4.3. Về ảnh hƣởng của nồng độ chất diện hoạt. ........................................................ 35
4.4. Về ảnh hƣởng của nồng độ Eudragit RS PO ...................................................... 36
4.5. Về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu ..................................................... 36
4.6. Về ảnh hƣởng của nồng độ ART ....................................................................... 38
4.7. Về khả năng giải phóng dƣợc chất in vitro ........................................................ 38
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Atersunat ART
Acetonitril ACN
Dƣợc chất DC
HPLC High-performance liquid chromatography – sắc kí lỏng hiệu
năng cao
Edragit RS PO RS PO
PLGA Poly(lactic-co-glycolic) acid
DHA Dihydroartemisinin
DLS Dynamic Light Scattering
DĐVN Dƣợc điển Việt Nam
PDI Polydispersity index- Hệ số đa phân tán
KTTP Kích thƣớc tiểu phân
SEM Scanning Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử quét
EE Hiệu suất mang thuốc
MWCO Trọng lƣợng phân tử giới hạn
NIBS Non-Invasive Back-Scatter optics - Hiệu ứng quang học tán xạ
ngƣợc không xâm lấn
CS Chitosan
Bảng 1.1. So sánh hiệu suất bao gói của tiểu phân nano Cucurbitacin I của hai
phƣơng pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa .............................. 7 Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm ............. 14
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của trình tự phối hợp hai pha đến đặc tính cảm quan của
nhũ tƣơng artesunat ................................................................................................... 23
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tốc độ phối hợp hai pha đến đặc tính hóa lý của tiểu
phân nano artesunat ................................................................................................... 24
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................ 25
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu
phân nano artesunat ................................................................................................... 26
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của
tiểu phân nano artesunat ............................................................................................ 27
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
artesunat .................................................................................................................... 29
Bảng 3.7. Phần trăm giải phóng tích lũy của tiểu phân nano ART .................... 32
Bảng 4.1. Điều kiện của công thức tối ƣu. .......................................................... 34
Hình 1.1. Một số hạt nano thƣờng gặp.................................................................. 3
Hình 1.2. Cấu trúc hạt nano .................................................................................. 4
Hình 1.3. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phƣơng pháp kết tủa ..... 6
Hình 1.4. Công thức hóa học Eudragit RS PO ..................................................... 8
Hình 1.5. Công thức hóa học artesunat ................................................................. 9
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phƣơng pháp
kết tủa. ....................................................................................................................... 16
Hình 2.2. Bề mặt của một hạt nano mang điện tích và thế năng zeta ................. 19
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................ 25
Hình 3.2. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu
phân nano artesunat ................................................................................................... 26
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của
tiểu phân nano artesunat ............................................................................................ 28
Hình 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa và hiệu suất bao gói
của tiểu phân nano artesunat ..................................................................................... 29
Hình 3.5. Hình ảnh phân bố kích thƣớc tiểu phân của CT M15 ......................... 30
Hình 3.6. Hình ảnh thế Zeta của CT M15 ........................................................... 30
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của tiểu phân nanoartesunat ....................................... 31
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích luỹ của ART theo thời gian
từ tiểu phân nano trong môi trƣờng đệm phosphate pH 7,4 ..................................... 32
1
Artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ
artemisinin- một dẫn chất đƣợc phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng Artemsia
annua L., có tác dụng chính thƣờng đƣợc biết đến là điều trị sốt rét [48]. Gần đây
ART đƣợc chứng minh là có tác dụng chống tăng sinh tế bào khá mạnh và tiêu diệt
đƣợc các tế bào ung thƣ. Do đó, một số công trình đang mở ra nhiều hƣớng nghiên
cứu nhằm đƣa ART đến đích tác động - các tế bào ung thƣ [20], [22]. Tuy nhiên,
khi sử dụng đƣờng uống, sinh khả dụng của ART tƣơng đối thấp do đặc tính phân
tử nhạy cảm với môi trƣờng đƣờng tiêu hóa, khả năng hấp thu qua niêm mạc hoặc
các kênh riêng trong đƣờng tiêu hóa không tốt. Hơn nữa, ART có thời gian bán thải
ngắn và bị chuyển hóa qua gan lần đầu khá nhiều.
Để cải thiện dƣợc động học của ART, cần thiết phải đƣa ART vào một hệ chất
mang, tạo ra các tiểu phân có kích thƣớc nano nhằm đảm bảo sự ổn định, cải thiện
sinh khả dụng và khả năng giải phóng dƣợc chất so với các dạng bào chế thông
thƣờng [13], [14]. Hệ vi tiểu phân nano polyme hiện nay đƣợc đánh giá là giải pháp
tiềm năng cho việc đƣa thuốc đến đích là các khối u hay tế bào bệnh đồng thời giải
phóng kiểm soát dƣợc chất khó tan và thấm tốt nhƣ ART. Trong các phƣơng pháp
bào chế hệ tiểu phân nano polyme, phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ
thuật đơn giản nhất không phải sử dụng thiết bị máy móc hiện đại, có thể áp dụng
để nâng cấp quy mô sản xuất [42].
Vì các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat
bằng phƣơng pháp kết tủa” đƣợc tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp kết tủa.
2. Đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat.
2
1.1. Đại cƣơng về hệ tiểu phân nano
1.1.1. Khái niệm
Hệ vận chuyển thuốc kích thƣớc nano là hệ đƣợc cấu tạo nhƣ các hạt nano có
kích thƣớc từ 1-1000 nm, với thiết kế thích hợp có vai trò nhƣ một phƣơng tiện vận
chuyển chuyên biệt, đảm bảo vận chuyển các hoạt chất đến đích tác dụng. Công
nghệ nano ứng dụng trong y dƣợc học bao gồm các tiểu phân nano đƣợc sử dụng để
vận chuyển dƣợc chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể với liều lƣợng thích
hợp và theo đúng thời gian mong muốn, đảm bảo đƣợc 3 yếu tố góp phần tạo nên
tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều [18]. Các hệ vận
chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polyme-micelle, dendrimers, các hạt nano có
nguồn gốc kim loại polyme, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome.
Tiểu phân nano polyme thƣờng gồm 2 loại là siêu vi cầu (nanospheres) và siêu
vi nang (nanocapsules). Siêu vi cầu là tiểu phân nano có cấu trúc hình thành từ
polyme tạo nên nang bao lấy dƣợc chất. Siêu vi nang là tiểu phân nano có cấu trúc
hình thành từ polyme tạo nên lõi cầu, và dƣợc chất đƣợc tóm giữ trên bề mặt hoặc
phân tán đều với chất mang. Dƣợc chất (DC) có thể đƣợc hòa tan, nang hoá
(encapsulated), bẫy (entrapped), tạo liên kết hóa học hoặc đƣợc hấp phụ lên bề mặt
tiểu phân nano polyme [23], [38].
1.1.2. Phân loại
Hiện nay các hạt nano vận chuyển thuốc thƣờng đƣợc phân loại theo thành phần
cấu tạo, cấu trúc và đặc tính bề mặt của hạt nano. Thành phần cấu tạo của các hạt
nano chủ yếu là polyme, lipid và các hợp chất vô cơ, do vậy có thể phân thành 3 lớp
lớn [4]:
• Hạt nano polyme (polymeic nanoparticles)
• Hạt nano lipid (lipid nanoparticles)
3
• Hạt nano vô cơ(inorganic nanoparticles)
Hình 1.1. Một số hạt nano thƣờng gặp
Ngoài ra, còn có những hạt nano có cấu trúc hỗn hợp giữa polyme, lipid và hợp
chất vô cơ. Các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tƣơng thích sinh học
thƣờng đƣợc sử dụng là polylactid, polyglycolid, poly(lactid-co-glycolid), poly(ε-
caprolactone), poly(alkyl-cyanoacrylat), gelatin, chitosan… Các lipid thƣờng đƣợc
sử dụng là các lipid không độc với cơ thể, có cấu tạo khá tƣơng đồng với lipid sinh
học nhƣ phospholipid, cholesterol, glycerid… và dẫn xuất của các lipid này. Các hạt
nano vô cơ thƣờng đƣợc sử dụng trong chẩn đoán và điều trị nhƣ: hạt nano từ tính
(magnetic nanoparticle), chấm lƣợng tử (quantum dots).
Phân loại theo cấu trúc, các hạt nano có thể chia thành 3 dạng :
• Hạt nano dạng màng bao: cấu tạo giống nhƣ túi (vesicle) hoặc nang (capsule),
gồm một thành phần polyme hoặc một màng đơn hay màng kép lipid bao quanh
một lõi có thể ở trạng thái rắn, rắn-lỏng hoặc lỏng ƣa nƣớc hoặc ƣa dầu.
• Hạt nano cấu trúc dạng khung xốp (matrix): khung xốp polyme, lipid hoặc các
hợp chất vô cơ phân bố đều bên trong hạt nano thƣờng có dạng hình cầu.
Hạt nano cấu trúc dạng phức hợp (complex): thƣờng là một phức hợp đa thành
phần giữa polyme hoặc lipid tích điện dƣơng và hoạt chất tích điện âm (protein,
peptide và acid nucleic) kết hợp với nhau nhờ tƣơng tác điện tích.
4
Phân loại theo tính chất bề mặt của hạt nano, dựa trên các thay đổi bề mặt hạt
nano nhƣ: tính ƣa dầu, hiệu ứng cản trở không gian và thành phần cấu tạo bề mặt
nhằm hƣớng hạt nano đến đích tác dụng. Các hạt nano này có thể đƣợc chia làm 3
loại [3]:
• Hạt nano thụ động (pasive nanoparticles): bề mặt không có sự cản trở về mặt
không gian và thƣờng ƣa dầu. Các hạt nano này dễ dàng bị opsonin hóa bởi các
protein huyết tƣơng trong tuần hoàn và sau đó bị bắt giữ bởi tế bào thực bào đơn
nhân có các receptor bề mặt nhận biết đặc hiệu protein huyết tƣơng, rồi di chuyển
chủ yếu đến vùng gan, lách, vì vậy các hạt nano này thƣờng đƣợc gọi là hạt nano
hƣớng gan lách.
• Hạt nano Stealth ® (Stealth ® nanoparticles): bề mặt hạt nano đƣợc bao phủ
bởi lớp polyme ƣa nƣớc và linh động nhƣ polyethylenglycol (PEG), polysaccharid,
poloxame, poloxamin. Các hạt nano này thƣờng liên kết cộng hóa trị với PEG trên
bề mặt lên có thể gọi là hạt nano ghép PEG. Nhờ thay đổi cấu trúc bề mặt, các hạt
nano này hầu nhƣ không bị opsonin và bắt giữ thực bào. Do vậy thƣờng đƣợc áp
dụng để điều trị bệnh ngoài vùng gan lách.
• Hạt nano chủ động (active nanoparticles): Các hạt nano đƣợc gắn kết với các
ligand trên bề mặt nhằm nhận biết đặc hiệu các receptor ở mô và tế bào đích. Các
hạt nano này còn đƣợc gọi là hạt nano hƣớng đích.
Hình 1.2. Cấu trúc hạt nano
5
1.1.3. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano
Dựa theo quy trình bào chế, có thể chia các phƣơng pháp bào chế nano polyme
làm 2 loại: 1 giai đoạn và 2 giai đoạn. Các phƣơng pháp 1 giai đoạn dựa trên sự kết
tủa của polyme từ một dung dịch hoặc dựa trên sự kết tập tự phát của các đại phân
tử để hình thành các nanogel hoặc các phức hợp của các chất “đa điện tích”
(polyelectrolyte).
Các phƣơng pháp 2 giai đoạn bao gồm giai đoạn đầu chung cho các phƣơng
pháp là bào chế một nhũ tƣơng và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân
nano. Giai đoạn 2 có thể đƣợc thực hiện dựa trên phản ứng polyme hoá các
monome hoặc các quá trình kết tủa, gel hoá của các polyme. Các polyme đƣợc sử
dụng có thể là polyme tự nhiên, các polyme tổng hợp, có sẵn hoặc tạo thành từ các
monome. Tuy vậy, do các polyme tạo thành từ phản ứng polyme hoá thƣờng ít phân
huỷ sinh học, các monome tồn dƣ và chất diện hoạt đƣợc dùng với lƣợng lớn có thể
gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [47]. Do vậy, hiện các nghiên cứu sử
dụng chủ yếu phƣơng pháp đi từ các polyme có sẵn (các eudragit, các polyme phân
huỷ sinh học nhƣ PLGA, PLA, PCL,….).
Dƣới đây là một số phƣơng pháp thông dụng trong điều chế tiểu phân nano
polyme từ các polyme tổng hợp có sẵn:
- Phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa/bốc hơi dung môi
Polyme đƣợc hòa tan vào dung môi không đồng tan với nƣớc, sau đó dung
dịch này sẽ đƣợc nhũ tƣơng hóa vào nƣớc bằng lực khuấy từ hay lực siêu âm. Tiếp
theo dung môi hữu cơ sẽ đƣợc bốc hơi hết để các hạt tiểu phân đƣợc hình thành do
sự rắn hóa polyme.
- Phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa/ khuếch tán dung môi
Polyme đƣợc hòa tan vào dung môi tan một phần trong nƣớc và sau đó cho
bão hòa với nƣớc để đảm bảo cân bằng nhiệt động. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc phân
tán vào nƣớc có chứa chất ổn định để tạo các tiểu phân nano. Cuối cùng dung môi
đƣợc loại bỏ theo cách bốc hơi hoặc lọc, tùy theo nhiệt độ sôi của dung môi.
6
- Phƣơng pháp tạo muối kết lắng với polyme
Polyme cùng dƣợc chất đƣợc hòa tan trong dung môi tan trong nƣớc, sau đó
dung dịch này đƣợc phân tán vào gel nƣớc có các tác nhân tạo muối (ví dụ: magnesi
clorid, calci clorid hay sucrose) và các chất ổn định tao gel. Sau đó, hỗn hợp này
đƣợc hòa loãng với một lƣợng nƣớc vừa đủ để tăng sự khuếch tán của tiểu phân vào
nƣớc, từ đó hình thành tiểu phân nano. Cuối cùng, tác nhân tạo muối cũng nhƣ dung
môi đƣợc loại đi sau khi lọc.
- Phƣơng pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mặt
Các polyme đƣợc hòa tan trong một dung môi có thể trộn lẫn với nƣớc dẫn
đến sự kết tủa của các tiểu phân nano. Polyme lắng đọng trên bề mặt phân cách pha
giữa các pha nƣớc và pha dầu hữu cơ, gây ra bởi sự khuếch tán nhanh chóng của
dung môi, dẫn đến sự hình thành hệ keo.
Phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ thuật kết tủa đơn giản nhất,
trong đó polyme và dƣợc chất đƣợc hoà tan vào một dung môi đồng tan với nƣớc
(nhƣ aceton, ethanol,…) sau đó đƣợc chia thành từng giọt và phối với hợp pha
ngoại có thể chứa hoặc không chứa chất ổn định, sử dụng thiết bị khuấy trộn phù
hợp. Dung môi có thể đƣợc loại đi bằng nhiều cách nhƣ khuấy từ, nâng nhiệt độ pha
nƣớc khi phối hợp hoặc bay hơi trong chân không.
Hình 1.3. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phƣơng pháp kết tủa
7
Một số tác giả cho rằng tiểu phân nano đƣợc hình thành nhờ vào hiệu ứng
Gibbs-Marangoni, gây ra bởi chênh lệch sức căng bề mặt phân cách pha giữa các
dung môi khác nhau. Một số tác giả khác cho rằng tiểu phân nano hình thành thông
qua quá trình gồm 3 bƣớc: tạo mầm, tăng kích thƣớc và kết tụ giống nhƣ quá trình
kết tinh của nano tinh thể [39]. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ: đơn giản,
có thể triển khai quy mô lớn; thiết bị không phức tạp, kết tủa tạo thành có thể ở
dạng vô định hình, lƣợng chất diện hoạt sử dụng thấp hơn so với một số phƣơng
pháp khác, không cần thông qua bƣớc nhũ hoá tốn nhiều năng lƣợng,… [11], [24],
[38].
Aws Alshamsan và cộng sự (2014) đã tiến hành so sánh hiệu suất bao gói của
tiểu phân nano Cucurbitacin I sử dụng polyme là PLGA khi bào chế bằng phƣơng
pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi. Kết
quả đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 1.1. So sánh hiệu suất bao gói của tiểu phân nano Cucurbitacin I của hai phƣơng pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa
Công Thức Thành phần Phƣơng pháp EE
CI-NP1 1000 mcg Nhũ hóa một lần 1.29%
CI-NP2 250 mcg Nhũ hóa hai lần 4.8%
CI-NP3 500 mcg Nhũ hóa hai lần 7.96%
CI-NP4 1000 mcg Kết tủa do thay đổi dung môi 48.79%
Do đó, phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi làm tăng khả năng bẫy của
Cucurbitacin I trong tiểu phân nano sử dụng polyme PLGA cũng nhƣ các dƣợc chất
tiềm năng không hòa tan trong nƣớc khác [8].
8
1.2. Đại cƣơng về Eudragit RS PO
1.2.1. Giới thiệu về Eudragit RS PO
Công thức hóa học:
Hình 1.4. Công thức hóa học Eudragit RS PO
Eudragit (polymethacrylat) đƣợc sử dụng chủ yếu đối với viên nang dùng
đƣờng uống hay sử dụng nhƣ một chất tạo màng bao phim cho viên nén. Tùy thuốc
vào loại polyme sử dụng ngƣời ta chế tạo những màng bao phim với các đặc tính
hòa tan khác nhau. Eudragit RS chủ yếu đƣợc sử dụng để tạo mang bao phim không
tan trong nƣớc cho các chế phẩm tác dụng kéo dài. Khả năng thấm của Eudragit RL
tốt hơn khả năng thấm của Eudragit RS, và ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 loại này để
tạo ra các màng bao có khả năng thấm nhƣ mong muốn.
Eudragit RS PO là chất rắn ở dạng bột, có mùi nhẹ giống nhƣ amin ,hòa tan
tốt trong aceton hay alcohol. Đây là một polyme đồng trùng hợp từ ethyl acrylat,
methyl methacrylat và một lƣợng nhỏ liên kết ester của acid methacrylic và nhóm
amoni dạng tứ diện. Nhờ có sự hiện diện của nhóm amin trong cấu trúc phân tử nhƣ
một gốc muối nên Eudragit RS PO có khả năng giữ nƣớc do đó có khả năng thấm
nƣớc và trƣơng nở tốt [25]. Eudragit RS PO không hòa tan ở pH sinh lý và thể hiện
khả năng giải phóng thuốc không phụ thuộc vào pH [15].
9
1.2.2. Một số nghiên cứu về nano sử dụng Eudragit RS PO
Pandav S. và Naik J. (2014) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng giải
phóng kéo dài của tiểu phân nano Ramipril bao ngoài bằng các copolyme amoni
metylmetacrylat sử dụng phƣơng pháp đồng nhất hóa dƣới áp suất cao cho KTTP
khi sử dụng Eudragit RS PO vào khoảng 200-400 nm. Hiệu suất nạp thuốc khi sử
dụng RS PO là 76.67 ± 0.45%. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi sử dụng RS PO với
tỉ lệ DC/ polyme là 1:7 thì tác dụng giải phóng kéo dài tốt hơn 3 tỉ lệ 1:5 , 1:3 và
1:1, đạt 40,28 ± 0,147 sau 12 giờ. Tốc độ giải phóng dƣợc chất chậm hơn và ít dƣợc
chất giải phóng do vỡ màng bao khi sử dụng polyme RS PO so với polyme RL PO
[41].
Khalil R. và cộng sự (2014) tiến hành nghiên cứu đánh giá giải phóng in vitro
tiểu phân nano nhƣ một hệ mang thuốc tiềm năng làm tăng tác dụng tại đích của
colchichin. KTTP khi sử dụng polyme RS PO nằm trong khoảng 160- 480 nm, hiệu
suất bao gói khoảng 28,8 % , cao hơn so với tiểu phân nano colchichine bao ngoài
với polyme tự nhiên [31].
1.3. Đại cƣơng về Artesunat
1.3.1. Công thức hóa học
Hình 1.5. Công thức hóa học artesunat
Tên khoa học: (3R, 5aS,6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 -
trimethyl - 3,12 -epoxy - 12H - pyrano [39]- 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen
succinat.
10
Công thức phân tử: C19H28O8.
Khối lƣợng phân tử: 384,4 g/mol.
1.3.2. Tính chất lý hóa
ART là tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng, rất khó tan trong nƣớc (khoảng 56,2mg/L ở 25oC), tan tốt trong dicloromethan, ethanol, aceton, cloroform, dimethyl
sulfoxid và dung dịch kiềm. Do có nhóm chức ester và nhóm chức lacton nên rất dễ
bị thủy phân. Tuy nhiên tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức
độkiềm. Có tính acid yếu do có nhóm carboxylic trong phân tử với giá trị pKa ~ 4,6
[10].
1.3.3. Đặc điểm dược động học
Mặc dù artemisinin có các dạng bào chế đa dạng nhƣ viên uống, thuốc tiêm bắp,
tiêm tĩnh mạch dạng nƣớc, ART thƣờng chỉ dùng đƣờng tiêm dạng dung dịch trong
nƣớc. ART đƣợc hấp thu nhanh chóng, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng sau 0,5
giờ; 1,5 giờ và 2 giờ lần lƣợt ứng với tiêm bắp, đƣờng uống, trực tràng. Khi vào
máu ART chuyển hóa nhanh thành dihydroartemisinin (DHA), dẫn chất này vẫn
còn hoạt tính. Vì vậy nồng độ ART trong máu rất thấp. Nồng độ điều trị trong máu
của ART từ 197-397 ng/ml. Quá trình thải trừ ART cũng diễn ra rất nhanh chóng,
do đó hoạt tính chống sốt rét đƣợc xác định bằng cách gián tiếp thông qua
dihydroartemisinin. Thời gian bán thải của ART khi tiêm tĩnh mạch vào khoảng 2,7
phút, của DHA là 40 phút [28]. Thuốc phân bố rộng ra nhiều mô, màng não và rau
thai, lắng đọng ở gan, thận, mật. Hơn 80% lƣợng thuốc dùng sau 24 giờ đầu đƣợc
thấy trong nƣớc tiểu và phân. ART khi phát tác dụng nhanh và thải trừ nhanh (chỉ 6
giờ sau khi uống) [29]. Do đó ART cần đƣợc dùng lặp lại nhiều lần trong ngày, đặc
biệt trong điều trị ký sinh trùng sốt rét.
1.3.4. Chỉ định
Theo dƣợc thƣ quốc gia 2013, ART đƣợc sử dụng trong các trƣờng hợp sốt rét
ác tính, đặc biệt là đối với các trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán xác định nguyên nhân do
chủng P.falciparum đã kháng quinin [5].
11
1.3.5. Tác dụng chống ung thư
Mặc dù là thuốc điều trị đầu tay trong phác đồ điều trị sốt rét, tuy nhiên những
nghiên cứu in vitro gần đây cho rằng ART có hoạt tính chống tăng sinh tế bào khá
tốt ở khối u trên nhiều dòng tế bào nhƣ tế bào biểu mô, tế bào phổi nhỏ, thận, bạch
cầu,…[16]. Điều này mở ra hƣớng nghiên cứu mới vềt ác dụng chống ung thƣ của
ART.
Efferth T. và cộng sự (2001) đã chứng minh tác dụng chống ung thƣ của ART
trên 55 dòng tế bào ung thƣ ngƣời đƣợc thiết kế bởi chƣơng trình nghiên cứu các
liệu pháp điều trị của Viện ung thƣ quốc gia Hoa Kỳ. Kết quả cho thấy ART có tác
dụng mạnh nhất với dòng tế bào ung thƣ bạch cầu và đại tràng với giá trị GI50 là
1,11 ± 0,56µM và 2,13±0,74µM tƣơng ứng. Dòng tế bào ung thƣ phổi không tế bào
nhỏ cho giá trị GI50 cao nhất (25,62±14,95µM) cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với
ART. Giá trị GI50 trung bình có đƣợc ở các dòng tế bào ung thƣ hắc tố da
melamona, ung thƣ vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, hệ thần kinh trung ƣơng và
thận. So sánh với một số thuốc chuẩn khác đang dùng để điều trị ung thƣ cho thấy
ART có hiệu quả cao và độc tính thấp hơn [21].
Berger và cộng sự (2005) lần đầu tiên báo cáo về việc điều trị dài ngày với ART
kết hợp với hóa trị liệu thông thƣờng giúp kéo dài thời gian sống của 2 bệnh nhân
ung thƣ mắt di căn (metastatic uveal melanoma) [12].
Trong một báo cáo khác về điều trị ung thƣ thanh quản ngƣời, bệnh nhân đƣợc
tiêm và uống ART trong thời gian 9 tháng. Kết quả đã làm giảm tới 70% kích thƣớc
khối u sau 2 tháng điều trị [44].
Ngoài ra DHA - chất chuyển hóa của ART trong máu cũng có tác dụng kháng
lại các tế bào ung thƣ u thần kinh đệm, tế bào ung thƣ vú, ruột kết, phổi, buồng
trứng và tuyến tụy [27].
Cơ chế chống ung thƣ của ART hiện vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ nhƣng các nghiên
cứu gần đây trên các dòng tế bào ung thƣ đã đặt ra giả thuyết ART có tác dụng đến
các protein có vai trò quan trọng chu trình tế bào nhƣ: ức chế điểm R trong pha G1;
làm gián đoạn quá trình tự hủy của tế bào; chống tân tạo mạch và giảm tốc độ di căn
12
của các tế bào ung thƣ thông qua việc ức chế yếu tố nhân Kappa B (NF-kB - là một
yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokin,
chemokin) [34], [35].
1.3.6. Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa artesunat
Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano ART bằng phƣơng pháp tự nhũ hóa của
Đặng Tuấn Anh và cộng sự cho thấy những tín hiệu khả quan về khả năng hòa tan
cũng nhƣ KTTP và phân bố tiểu phân. KTTP đạt trong khoảng từ 150nm-350nm và
kích thƣớc phân bố hẹp. Việc sử dụng hệ chất mang làm tăng khả năng hòa tan của
dƣợc chất, làm tăng lƣợng dƣợc chất đƣa vào cơ thể mà không làm tăng quá lớn
lƣợng chất mang [2].
Tuan H.T và cộng sự (2014) tiến hành nghiên cứu bào chế vi nang nano lipid
ART, bao ngoài bằng chitosan và đánh giá hiệu quả của vi nang trong việc ức chế
sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ vú. Kết quả thu đƣợc rất khả quan với KTTP
đạt 160,9 3,5nm, vi nang có dạng hình cầu, hiệu quất mang thuốc cao, đạt
95.49±1.13% và có khả năng giải phóng kéo dài. Đặc biệt, vi nang nano lipid ART
bao ngoài bằng chitosan thể hiện khả năng chống ung thƣ cao hơn dạng ART tự do
trên tất cả các dòng tế bào ung thƣ vú (MCF-7, MDA-MB-231) [45].
Hanh T.N và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano
ART chứa polyme PLGA và ảnh hƣởng của hệ tiểu phân đến hiệu quả chống ung
thƣ in vitro trên một số dòng tế bào. Tiểu phân nano thu đƣợc có KT khoảng 170
nm, hệ số đa phân tán nhỏ, hiệu suất mang thuốc cao (khoảng 83,4%), kéo dài thời
gian giải phóng đến 48 giờ và cho thấy tác dụng ức chế tế bào ung thƣ trên 3 dòng
tế bào SCC7(tế bào ung thƣ biểu mô dạng vảy nến), A549 (tế bào ung thƣ biểu mô
tuyến ở phổi), và MCF-7 (tế bào ung thƣ vú). Tiểu phân nano polyme cho tác dụng
ức chế tế bào cao hơn dạng ART tự do ở tất cả các nồng độ khảo sát [40].
Trong phần lớn các nghiên cứu trên, phƣơng pháp nhũ hóa dƣới tác dụng của
siêu âm thƣờng đƣợc sử dụng. Do đó, trong nghiên cứu này, với những ƣu điểm đã
nêu ở phần 1.1.3 phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi đã đƣợc sử dụng để bào
13
chế tiểu phân nano chứa artesunat trên cơ sở đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố
thuộc công thức và quy trình bào chế đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano.
14
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu.
Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Artesunat Sao Kim pharma Nhà sản xuất 1
(Việt Nam)
Aceton Trung Quốc Tinh khiết phân tích 4
Acetonitril Merck (Đức) Dùng cho HPLC 5
Tween 80 Trung Quốc Tinh khiết hóa học 6
Acidphosphoric Merck (Đức) Dùng cho HPLC 7
Nƣớc cất 2 lần Việt Nam DĐVNIV 8
Acidacetic Trung Quốc Tinh khiết hóa học 13
Natrihydroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa học 14
Kalidihydrophosphat Merck (Đức) Dùng cho HPLC 15
2.1.2. Thiết bị
- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer .
- Máy khuấy từ MS7 (Hoa Kỳ)
- Hệ thống HPLC Shimadzu 20AD kết nối detector PDA (Nhật).
- Máy ly tâm lạnh HERMLE (Đức).
- Máy đo pH sensION PH3 HACH (Tây Ban Nha).
- Cân kỹ thuật và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
- Màng thẩm tích 10000 Dalton.
- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000 Dalton.
- Máy lắc điều nhiệt Shaking Water Bath Julabo (Đức).
15
- Máy cô quay chân không Stero Glass Strike 300 (Ý).
- Pipet Pasteur
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố thuộc công thức và quy trình bào
chế tiểu phân nano ART nhƣ nồng độ polyme, nồng độ chất diện hoạt, tỉ lệ pha
nƣớc: pha dầu, nồng độ ART, cách thức phối hợp hai pha đến đặc tính lý hóa của hệ
tiểu phân, từ đó lựa chọn công thức tối ƣu.
- Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano bào chế đƣợc từ công thức
tối ƣu.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat
Tiểu phân nano polyme đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp kết tủa do thay đổi
dung môi. Qua tham khảo các nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat trƣớc
đây, chúng tôi tiến hành cố định một số yếu tố trong công thức và quy trình bào chế
nhƣ sau:
- Chất diện hoạt sử dụng : Tween 80.
- Dung môi hữu cơ lựa chọn : aceton.
- Tốc độ máy khuấy từ : 1000 vòng/ phút. - Thông số máy cô quay: 34oC, 70 vòng/ phút.
Chúng tôi tiến hành đánh giá sự ảnh hƣởng của các yếu tố thuộc công thức và
quy trình bào chế nhƣ nồng độ polyme, nồng độ chất diện hoạt, tỉ lệ pha nƣớc : pha
dầu, nồng độ ART, cách thức phối hợp hai pha đến đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân.
Sơ đồ quy trình đƣợc trình bày ở hình 2.1.
Mô tả quy trình:
- Chuẩn bị pha hữu cơ: Hòa tan dƣợc chất ART và polyme Eudragit RS PO vào
aceton.
- Chuẩn bị pha nƣớc: Pha dung dịch Tween 80 trong nƣớc.
16
- Giai đoạn kết tủa: Phối hợp hai pha nƣớc và pha dầu với tốc độ 5 ml/phút.
Đồng thời, hỗn dịch đƣợc hình thành bằng lực phân tán. Thiết bị tạo lực phân tán sử
dụng máy khuấy từ. Thông số máy khuấy từ đƣợc cài đặt ở 1000 vòng/ phút.
- Giai đoạn bốc hơi dung môi: hỗn dịch thu đƣợc cô quay bằng máy cô quay
chân không ở 34oC trong vòng 30 phút để loại hết dung môi.
- Thu hồi sản phẩm: hỗn dịch nano thu đƣợc mang đi ly tâm bằng ống siêu ly
tâm – lọc với tốc độ 5000 vòng/phút trong 30 phút. Phần cắn thu đƣợc rửa với nƣớc
cất sau đó phân tán lại vào 20ml nƣớc cất.
Pha nƣớc
Tween 80 trong nƣớc
Pha hữu cơ Phối hợp Khuấy từ (ART, RS PO trong aceton)
Nhũ tƣơng
Cô Cô quay quay
chân không chân không
Hệ dị thể
Ly tâm
Hệ dị thể
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phƣơng pháp kết tủa.
17
2.3.2. Các phương pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân artesunat
2.3.2.1. Phương pháp định lượng artersunat
Artesunat trong các mẫu thử đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC với các
điều kiện sắc ký nhƣ sau:
- Pha động: ACN–đệm phosphat pH 3,0 (55:45, tt/tt) (hòa tan 1,36g KH2PO4vào
1000 ml nƣớc cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid pho phoric đặc). Lọc đệm qua
màng lọc kích thƣớc lỗ lọc 0,45 µm.
- Cột C18 (Sil C18HS3, 4,6mm x 25mm x 0,5µm)
- Thể tích tiêm mẫu 50 µL.
- Tốc độ dòng 1 mL/phút.
- Detector UV, bƣớc sóng 216 nm.
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg nguyên liệu ART, cho vào bình định
mức 100 mL. Thêm khoảng 10 ml ACN, lắc cho tan hết. Bổ sung ACN vừa đủ thể
tích, lắc đều. Từ dung dịch trên pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ
nằm trong khoảng 20 đến 100 µg/mL, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc kích thƣớc
lỗ lọc 0,45 µm.
- Xác định nồng độ ART trong mẫu thử: 1 ml dung dịchART đã đƣợc pha loãng
đến nồng độ thích hợp bằng ACN, lọc qua màng lọc kích thƣớc 0,45 µm. Tiêm sắc
ký mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Nồng độ ART trong mẫu thử tính theo công thức:
Trong đó
Ct, Cc là nồng độ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml)
St, Sc là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu)
D là hệ số pha loãng của mẫu thử
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân
Kích thƣớc hạt và phân bố kích thƣớc là những thông số quan trọng trong kiểm
tra độ ổn định của chế phẩm và sự phù hợp của kích cỡ hạt nano với đƣờng đƣa
18
thuốc vào cơ thể, đây là các thông số luôn đƣợc xem xét trong quá trình bào chế,
sản xuất và bảo quản.
- Đánh giá kích thƣớc tiểu phân
Nguyên tắc xác định KTTP: Đo kích thƣớc hạt theo phƣơng pháp tán xạ ánh
sáng động học (Dynamic Light Scattering – DLS): là phƣơng pháp có thể đo đƣợc
kích thƣớc của các hạt siêu nhỏ, thậm chí nhỏ hơn 1 nm, bằng cách quan sát sự
chuyển động nhiệt hoặc chuyển động Brown của các hạt trong môi trƣờng phân tán.
Kích thƣớc của các hạt đƣợc đo bằng cách quan sát sự tán xạ của ánh sáng laser từ
các hạt, xác định tốc độ khuếch tán và kích thƣớc của các hạt nano đƣợc tính toán
theo phƣơng trình Stockes-Einstein:
D: hệ số khuếch tán k: hằng sốBoltzmann
T: nhiệt độ η: độnhớt môi trƣờng phân tán
d: đƣờng kính trung bình các hạt nano trong mẫu khảo sát
Phƣơng pháp DLS là phƣơng pháp nhạy cảm với cƣờng độ của ánh sáng tán xạ
phát ra từ các hạt. Các hạt lớn thì phát tán ánh sáng lớn hơn là các hạt nhỏ, hạt kích
thƣớc 1 nm tán xạ một phần triệu lƣợng ánh sáng so với hạt kích thƣớc 10 nm.
Zetasier Nano sử dụng công nghệ NIBS (Non-Invasive Backscatter optics) đã đƣợc
cấp bằng sáng chế, với việc kết hợp độ nhạy cao và hiệu quả lƣợng tử lớn hơn 60%
(cao hơn so với 4% của các máy đo truyền thống).
- Phân bố kích thƣớc hạt (size distribution)
Phân bố kích thƣớc hạt biểu thị tỉ lệ hạt theo đƣờng kính hạt nano trong mẫu
khảo sát. Có 3 kiểu phân bố: phân bố liên tục, phân bố rời rạc và phân bố tích lũy.
Dãy phân bố kích cỡ có một đỉnh duy nhất hay nhiều đỉnh tùy theo tình trạng mẫu
đồng nhất hay không đồng nhất. Tính đồng nhất thƣờng đƣợc biểu thị ở chỉ số đa
phân tán (polydispersity index- PDI), chỉ số càng cao thì mức độ đồng nhất của mẫu
càng thấp.
- Cách tiến hành đo kích thƣớc và phân bố KTTP:
19
Tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nƣớc cất đƣợc phân tán vào một
lƣợng nƣớc cất vừa đủ(10ml) sao cho tốc độ đếm (count rate) nằm trong khoảng
200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer ZS 90, sử dụng cuvet nhựa.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá thế zeta của tiểu phân nano
Thế zeta thể hiện lực đẩy giữa các hạt nano, các hạt nano tích điện ở bề mặt
thƣờng đặc trƣng bởi thếzeta (ζ). Thế zeta đƣợc đo bởi tốc độ di chuyển của các hạt
nano trong vùng điện trƣờng. Thế zeta thƣờng đƣợc xácđịnh nhờ phép đo gió bởi
một Doppler laser. Nguyên tắc cơ bản dựa trên xácđịnh tần số chuyển động của hạt
nano trong vùng điện trƣờng quan sát đƣợc nhờ nhiễu xạ tia laser. Trong thực
nghiệm, hệ hạt nano phân tán có giá trị tuyệt đối của thế zeta giữa 30 và 60 mV sẽ
tạo sự ổn định tĩnh điện học nhờ lực đẩy giữa các hạt nano tích điện cùng dấu, nếu
giá trị này từ 5 đến 15 mV sẽ giới hạn độ bền vững của hệ phân tán, thế zeta từ 3
đến 5 mV thƣờng xuất hiện các hiện tƣợng không bền.
- Cách tiến hành: Tiến hành tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xác định kích thƣớc
tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.
Hình 2.2. Bề mặt của một hạt nano mang điện tích và thế năng zeta
20
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân
Nguyên tắc: Dùng kính hiển vi điện tử quét (SEM – Scanning Electron
Microscope) có chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Việc tạo ảnh đƣợc
thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tƣơng tác
của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano polyme 50 lần, nhỏ
trên giấy nhôm. Để khô bề mặt giấy nhôm ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát mẫu
bằng kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản).
2.3.2.5. Phương pháp xác định hiệu suất mang thuốc trong tiểu phân nano
-Hàm lƣợng dƣợc chất tự do trong mẫu nano đƣợc xác định nhƣ sau :
Lấy 2 ml hỗn dịch nano thu đƣợc sau giai đoạn cô quay loại dung môi cho vào
ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da (MWCO 10000Da, Millipore, USA). Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ10oC. Xác định nồng độ ART tự do trong
phần dịch trong dƣới màng lọc theo phƣơng pháp HPLC tại mục.
-Hàm lƣợng dƣợc chất toàn phần (dƣợc chất bao gói và dƣợc chất tự do) trong
mẫu nano đƣợc xác định nhƣsau:
Hút chính xác 1 ml hỗn dịch nano thu đƣợc sau giai đoạn cô quay loại dung môi
cho vào bình định mức 5ml. Thêm 3ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15
phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều. Nồng độ ART toàn phần trong mẫu
đƣợc xác định theo các bƣớc ghi tại mục 2.3.2.1.
-Công thức tính hiệu suất mang thuốc
EE(%)=
Trong đó :
EE: Hiệu suất mang thuốc (%)
Ctp: Nồng độ ART toàn phần trong hỗn dịch nano (µg/ml)
Ctd: Nồng độ ART tự do trong hỗn dịch nano (µg/ml)
21
2.3.2.6. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro
Qua tham khảo NC bào chế tiểu phân nano ART-PLGA của Nguyen H. T. và
cộng sự, NC của Yang R. và cộng sự, tiến hành đánh giá quá trình giải phóng in
vitro của ART từ hệ nano bằng cách sử dụng túi thẩm tích (kích thƣớc màng
10000Da–Membrane Cel, Chicago, IL, USA). Các điều kiện và các bƣớc tiến hành
cụ thể nhƣ sau :
-Thiết bị: Máy lắc điều nhiệt (Shaker Incubator, LSI-100B, Nhật Bản)
-Tốc độ lắc: 100 vòng/phút
Môi trƣờng giải phóng: 10 ml môi trƣờng đệm phosphat pH 7,4 -Nhiệt độ môi trƣờng giải phóng 37 ± 0,5oC
-Lấy mẫu vào các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 9 giờ, 14 giờ, 24
giờ và48 giờ. Hút chính xác 1 ml môi trƣờng thử bằng pipet, bổ sung 1 ml môi
trƣờng mới. Vì ART dễ bị phân hủy trong môi trƣờng nƣớc nên khoảng 3-4h tiến
hành thay mới toàn bộ môi trƣờng.
-Mẫu thử chứa tiểu phân nano: Dung dịch chứa tiểu phân nano ART sau khi cô
quay để loại dung môi aceton thu đƣợc hỗn dịch với nồng độ khoảng 15mg
ART/10ml. Hút chính xác 3 ml hỗn dịch đặc nói trên cho vào túi thẩm tích. Kẹp
chặt 2 đầu túi, đặt túi thẩm tích vào ống ly tâm có thể tích 50ml chứa 10mL môi
trƣờng đệm phosphat pH 7,4 sao cho túi thẩm tích ngập trong đệm.
-Mẫu chuẩn: chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1
-Cách tính kết quả:
Nồng độ ART tại thời điểm t đƣợc tính theo công thức ghi tại mục 2.3.2.1.
-Khối lƣợng ART đã giải phóng ra môi trƣờng tại thời điểm t đƣợc tính bằng
công thức:
Trong đó
mt là khối lƣợng ART đã giải phóng ra môi trƣờng hoà tan tại thời điểm t.
Ct là nồng độ ART trong môi trƣờng thử tại thời điểm t.
22
Ci là nồng độ ART trong môi trƣờng thử tại thời điểm i.
Phần trăm giải phóng tích luỹ tại thời điểm t đƣợc xác định bằng công thức
% ART giải phóng tại thời điểm t=
Trong đó mt là khối lƣợng dƣợc chất đã giải phóng tại thời điểm t
mo là khối lƣợng dƣợc chất ban đầu đƣa vào trong túi thẩm tích
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
23
3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của quy trình bào chế tới đặc tính lý hóa của tiểu
phân nano artesunat
3.1.1. Khảo sát trình tự phối hợp hai pha
Với mục đích khảo sát sự ảnh hƣởng của thứ tự phối hợp hai pha đến các đặc
tính của tiểu phân nano ART, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng
pháp trình bày ở mục 2.3.1,cố định nồng độ polyme là 5mg/ml, tỷ lệ Tween 80 là
2%, tỷ lệ pha nƣớc/pha dầu là 2:1, nồng độ ART là 3mg/ml, thay đổi thứ tự phối
hợp hai pha nhƣ sau:
+ Mẫu 1: Phối hợp pha dầu vào pha nƣớc.
+ Mẫu 2: Phối hợp pha nƣớc vào pha dầu.
Đặc tính cảm quan của nhũ tƣơng nano ART tạo thành đƣợc thể hiện trong bảng
3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của trình tự phối hợp hai pha đến đặc tính cảm quan của nhũ tƣơng artesunat
Mẫu Trình tự phối hợp Đặc tính cảm quan
M1 Pha dầu vào pha nƣớc Ban đầu dung dịch trong suốt, sau đó dung dịch
trở nên mờ đục và bắt đầu xuất hiện những kết
tủa lợn cợn nhỏ, một số có dạng sợi mảnh nhỏ.
M2 Pha nƣớc vào pha dầu Ban đầu dung dịch trong suốt sau đó trở nên mờ
đục, không xuất hiện kết tủa.
Nhận xét: Dựa vào đặc tính cảm quan ở bảng 3.1, cách phối hợp pha nƣớc vào
pha dầu đã đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát tốc độ phối hợp hai pha
Với mục đích khảo sát sự ảnh hƣởng của thứ tự phối hợp hai pha đến các đặc
tính của tiểu phân nano ART, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng
pháp trình bày ở mục 2.3.1, cố định nồng độ polyme là 5mg/ml, tỷ lệ Tween 80 là
24
2%, tỷ lệ pha nƣớc/pha dầu là 2 (10 ml pha nƣớc : 5 ml pha dầu), nồng độ ART là
3mg/ml, phối hợp pha nƣớc vào pha dầu, thay đổi thứ tự phối hợp nhƣ sau:
+ Mẫu M3: phối hợp nhanh (trong 2-3 giây).
+ Mẫu M4: phối hợp chậm (nhỏ giọt bằng micropipet với tốc độ khoảng 5ml/
phút).
Kết quả các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART đƣợc thể hiện trong bảng
3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tốc độ phối hợp hai pha đến đặc tính hóa lý của tiểu phân nano artesunat
Mẫu Tốc độ phối hợp KTTP (nm) PDI Thế Zeta(mV)
M3 272,9 0,271 4,19 Phối hợp nhanh
M4 265,6 0,245 7,28 Phối hợp chậm
Nhận xét: Dựa vào kết quả ở bảng 3.2, mẫu phối hợp nhanh cho kích thƣớc tiểu
phân và PDI lớn hơn so với mẫu phối hợp chậm nên cách phối hợp chậm: nhỏ giọt
bằng micropipet với tốc độ khoảng 5ml/ phút đã đƣợc lựa chọn cho các thử nghiệm
tiếp theo.
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần trong công thức tới đặc tính lý
hóa của tiểu phân nano Artersunate.
3.2.1. Khảo sát nồng độ chất diện hoạt.
Trong phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano polyme bằng kỹ thuật kết tủa do
thay đổi dung môi, chất diện hoạt đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình hình
thành tiểu phân. Qua tham khảo nghiên cứ của Zhiqing và cộng sự [49], chúng tôi
lựa chọn chất diện hoạt trong pha nƣớc là Tween 80 và tiến hành đáng giá sự ảnh
hƣởng của tỷ lệ Tween 80 đến một số đặc tính lý hóa cơ bản của tiểu phân.
Với mục đích khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ chất diện hoạtđến các đặc
tính của tiểu phân nano ART, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng
pháp trình bày ở mục 2.3.1, cố định nồng độ polyme là 5mg/ml, tỷ lệ pha nƣớc/pha
25
dầu là 2, nồng độ ART là 3mg/ml, phối hợp chậm pha nƣớc vào pha dầu, thay đổi
nồng độ Tween 80 từ 1% đến 2%.
Kết quả các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART đƣợc thể hiện trong bảng
3.3 và hình 3.1.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân nano artesunat
Mẫu Tween 80 (%) KTTP (nm) Zeta (mV) PDI
284,1 0,287 32,6 M5 1,0
265,6 0,245 7,28 M6 1,5
257,0 0,102 17,2 M7 2,0
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân nano artesunat
Nhận xét: KTTP giảm dần khi tăng nồng độ Tween 80. PDI giảm mạnh khi tăng
nồng độ Tween lên 2%. Dựa trên kết quả thu đƣợc, nồng độ Tween 80 là 2% đƣợc
lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo.
26
3.2.2. Khảo sát nồng độ Eudragit RS PO
Nồng độ polyme cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình bào chế ảnh
hƣởng đến các đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano polyme. Với mục đích khảo sát
sự ảnh hƣởng của nồng độ polyme đến các đặc tính của tiểu phân nano ART, tiến
hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng pháp trình bày ở mục 2.3.1, cố định
nồng độ Tween là 2%, tỷ lệ pha nƣớc/pha dầu là 2, nồng độ ART là 3mg/ml, phối
hợp chậm pha nƣớc vào pha dầu, thay đổi nồng độ polyme RS PO từ 5mg đến
10mg.
Kết quả các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART đƣợc thể hiện trong bảng
3.4 và hình 3.2.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Mẫu Nồng độ RS PO (%) KTTP (nm) PDI Thế Zeta (mV)
257 0,102 17,2 M9 0,5
188,7 0,174 25 M10 0,75
347,8 0,163 23,6 M11 1,0
Hình 3.2. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
27
Nhận xét: KTTP và PDI thay đổi không theo quy luật khi tăng nồng độ RS PO
từ 0,5% lên 0,75%. Dựa trên kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4. và hình 3.2. , nồng độ
polyme là 0,75% đã đƣợc lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ pha nước và pha dầu
Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự [1]
cũng nhƣ nhiều nghiên cứu về hệ tiểu phân nano polyme khác, sự thay đổi tỉ lệ giữa
pha nƣớc và pha dầu sẽ ảnh hƣởng đến đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân.Với mục
đích khảo sát sự ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc: pha dầu đến các đặc tính của tiểu
phân nano ART, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng pháp trình bày
ở mục 2.3.1, cố định nồng độ Eudragit RS PO là 0,75% (7,5mg/ml), nồng độ Tween
là 2%, nồng độ ART là 3mg/ml, phối hợp chậm pha nƣớc vào pha dầu, thay đổi tỉ lệ
pha nƣớc : pha dầu từ 10:1đến 1:1.
Kết quả các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART đƣợc thể hiện trong bảng
3.5 và hình 3.3.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Mẫu Tỉ lệ pha nƣớc: pha dầu KTTP (nm) PDI Thế Zeta (mV)
M12 293,8 0,127 22,5 10:1
M13 228,5 0,130 24,9 5:1
M14 188,7 0,174 25 2:1
M15 303,4 0,190 30,3 1:1
28
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Nhận xét: KTTP thay đổi không theo quy luật khi giảm tỉ lệ pha nƣớc/ pha dầu,
trong khi đó, PDI lại có xu hƣớng tăng. Dựa vào kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 và
hình 3.3. tỉ lệ pha nƣớc/ pha dầu là 2:1 đƣợc chọn các các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.4. Khảo sát nồng độ artesunat
Theo nghiên cứu của Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự [40], cũng nhƣ nhiều
nghiên cứu về hệ tiểu phân nano polyme, sự có mặt của dƣợc chất sẽ làm thay đổi
kích thƣớc tiểu phân của hệ. Do vậy, tỉ lệ ART trong công thức đƣợc thay đổi để
xác định ảnh hƣởng của dƣợc chất đến các đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân. Với
mục đích khảo sát sự ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc: pha dầu đến các đặc tính của
tiểu phân nano ART, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phƣơng pháp trình
bày ở mục 2.3.1, cố định nồng độ Eudragit RS PO là 0,75% (7,5mg/ml), nồng độ
Tween là 2%, phối hợp chậm pha nƣớc vào pha dầu, tỉ lệ pha nƣớc : pha dầu là 2:1,
thay đổi nồng độ ART từ 0,3% (3mg/ml) đến 0,5% (5mg/ml).
Kết quả của sự ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano artesunat đƣợc trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.4
29
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Mẫu Nồng độ ART KTTP PDI Thế Zeta Hiệu suất bao
(%) (nm) (mV) gói (%)
188,7 0,174 25 75,39 M15 0,3
218,8 0,185 24,2 81,93 M16 0,4
262,5 0,154 29,0 78,25 M17 0,5
Hình 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa và hiệu suất bao gói của tiểu phân nano artesunat
Nhận xét: Khi tăng nồng độ ART, KTTP tăng dần trong khi PDI không thay đổi
qua nhiều. Hiệu suất mang thuốc thay đổi không theo tỉ lệ với nồng độ artesunat.
30
3.3. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano astesunat.
3.3.1. Về KTTP, PDI, Thế Zeta, hiệu suất mang thuốc, khả năng nạp thuốc
CT tối ƣu M15 có KTTP đạt 188,7nm, phân bố kích thƣớc tiểu phân hẹp (0,174)
và có thế Zeta là 25mV. Tiến hành đánh giá hiệu suất mang thuốc, CT M15 có EE%
đạt 75,39%.
Hình 3.5. Hình ảnh phân bố kích thƣớc tiểu phân của CT M15
Hình 3.6. Hình ảnh thế Zeta của CT M15
31
3.3.2. Hình thái học của tiểu phân nanoartesunat
Hình thái học của tiểu phân nano từ công thức M15 đƣợc xác định bằng kính
hiển vi điện tử quét (SEM) theo phƣơng pháp ở mục 2.3.2.4. Kết quả đƣợc thể hiện
nhƣ ở hình 3.8.
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của tiểu phân nano artesunat
Dựa vào hình ảnh thu đƣợc bằng kính hiển vi điện tử quét, có thể thấy rằng tiểu
phân nano có hình cầu, KTTP nhỏ, phân bố kích thƣớc trong 1 khoảng hẹp, phù hợp
với kết quả về kích thƣớc tiểu phân trung bình và PDI đo đƣợc bằng phƣơng pháp
phổ tán xạ ánh sáng.
3.3.3. Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro
Phép thử tốc độ giải phóng của artesunat từ hệ tiểu phân nano bào chế theo
công thức tối ƣu đƣợc thực hiện theo mục 2.3.2.4. qua màng thẩm tích kích thƣớc
10000Da trong môi trƣờng đệm phosphat pH 7,4. Phần trăm giải phóng tích luỹ của
ART đƣợc thể hiện qua bảng và đồ thị giải phóng thuốc.
32
Bảng 3.7. Phần trăm giải phóng tích lũy của tiểu phân nano ART
Thời gian Phần trăm giải phóng của hỗn dịch
(giờ) tích lũy chứa tiểu phân nano ART (%)
20,43 ± 2,47 1h
25,17 ± 3,12 2h
32,60 ± 4,19 4h
38,70 ± 1,96 6h
43,03 ± 2,23 8h
49,13 ± 1,83 14h
62,07 ± 2,57 24h
72,89 ± 3,01 48h
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích luỹ của ART theo thời gian từ tiểu phân nano trong môi trƣờng đệm phosphate pH 7,4
Nhận xét: Quá trình giải phóng của dƣợc chất trải qua hai giai đoạn khá rõ rệt,
giai đoạn đầu đặc trƣng bởi quá trình giải phóng nhanh chóng của dƣợc chất
(khoảng 50% trong 14h đầu).Tiếp sau đó là quá trình giải phóng chậm, lƣợng dƣợc
chất đƣợc giải phóng từ từ đến 48h, đạt khoảng 72,89%.
33
4.1. Về tiêu chuẩn lựa chọn công thức và quy trình bào chế
Edel sah và Hongkee Sah (2015) qua nghiên cứu của mình cho thấy tiểu phân
nano PLGA bào chế bằng phƣơng pháp kết tủa đƣợc hình thành do sự khuếch tán
giữa pha nƣớc và pha dung môi, do đó thƣờng có KTTP nhỏ hơn so với các phƣơng
pháp khác nhƣ nhũ hóa bốc hơi dung môi hay nhũ hóa chiết dung môi. Bên cạnh đó,
dung môi sử dụng trong phƣơng pháp này thƣờng sử dụng là aceton, acetonitril,
polyethylen glycol, dimethylacetamid, dimethylformamid, dimethylsulfoxid,... Các
dung môi đều là những dung môi không chứa gốc halogen do đó độc tính ít hơn,
thân thiện với môi trƣờng hơn so với các dung môi sử dụng trong phƣơng pháp nhũ
hóa [19].
Tween 80 là chất diện hoạt không ion hóa đƣợc sử dụng rộng rãi trong bào chế
nhũ tƣơng, hỗn dịch cũng nhƣ bào chế nano bằng phƣơng pháp kết tủa do thay đổi
dung môi. Zhiqing và cộng sự với nghiên cứu của mình cho thấy, với cùng nồng độ
chất diện hoạt 0,5% thì Tween 80 cho KTTP nhỏ nhất và hiệu suất mang thuốc lớn
nhất khi so sánh với PVA và Poloxamer 188 [49]. Do đó, chúng tôi tiến hành chọn
Tween 80 làm chất diện hoạt cho các thử nghiệm tiếp theo.
Aisha A. F.A. và cộng sự (2015) bào chế tiểu phân nano xanthone chiết xuất từ
cây măng cụt (Garcinia mangostana) với polyme RL100 và RS100 tiến hành sử
dụng dung môi aceton trong quá trình bào chế, kết quả cho tiểu phân có kích thƣớc
khoảng 130nm, hiệu quất mang thuốc đạt tới 95% [7] . Bên cạnh đó, phƣơng pháp
kết tủa do thay đổi dung môi đòi hỏi dung môi hữu cơ phải tan một phần trong
nƣớc. So với một số dung môi khác, aceton tan một phần trong nƣớc và có khả năng
hoà tan rất tốt cả 2 thành phần là Eudragit RS PO và ART, từ đó dễ dàng điều chỉnh
tỷ lệ polyme và dƣợc chất. Ngoài ra, nhiệt độ bay hơi của acteton ở áp suất thƣờng là 56-57oC. Do vậy aceton đƣợc lựa chọn làm dung môi pha dầu.
Qua nghiên cứu một số tài liệu tham khảo bào chế tiểu phân nano ART, chúng
tôi tiến hành thí nghiệm với một số thành phần và thông số cố định nhƣ sau:
34
- Chất diện hoạt sử dụng là Tween 80.
- Dung môi sử dụng là aceton.
- Tốc độ khuấy trộn của máy khuấy từ là 1000 vòng/ phút.
- Tốc độ nhỏ giọt là 5ml/phút.
Chúng tôi hƣớng đến công thức có các đặc tính của hệ tiểu phân phù hợp với
mục đích làm tăng độ hòa tan, cải thiện sinh khả dụng, đặc biệt là tăng tính hƣớng
đích của ART đối với tế bào ung thƣ. Sự phân bố của tiểu phân nano trong cơ thể
phụ thuộc chủ yếu vào 2 đặc tính lý hóa quan trọng là kích thƣớc tiểu phân và đặc
tính bề mặt tiểu phân [23]. Nhiều tài liệu cho rằng tiểu phân nano kích thƣớc từ
100-200 nm và đồng nhất về phân bố kích thƣớc là thích hợp sử dụng theo đƣờng
tĩnh mạch để tránh nguy cơ tắc mạch và cho thời gian tuần hoàn kéo dài [6], [33].
Ngoài ra, KTTP nhỏ hơn 200nm là cần thiết để tránh hiệu ứng thuốc bị lọc ở lách
[36] và tăng tích lũy thuốc vào các khối u rắn thông qua hiệu ứng EPR [40].
Ngoài ra, 1 hệ đƣa thuốc tốt cần có hiệu suất mang thuốc cao để giúp bảo vệ tối
đa DC khỏi các điều kiện bất lợi và tăng hiệu quả điều trị.
Do đó, công thức tối ƣu đảm bảo cân bằng các điều kiện kể trên có các đặc tính
đƣợc thể hiện nhƣ bảng sau:
Bảng 4.1. Điều kiện của công thức tối ƣu.
Đặc tính Kí hiệu Đơn vị Yêu cầu
KTTP trung bình KTTP nm <200
Chỉ số đa phân tán PDI _ <0,3
Hiệu suất mang thuốc EE % Cao nhất
4.2. Về ảnh hƣởng của trình tự phối hợp và tốc độ phối hợp.
Qua khảo sát, chúng tôi lựa chọn thứ tự phối hợp là pha nƣớc vào pha dầu để
cho KTTP nhỏ hơn khi làm ngƣợc lại. KTTP đƣợc so sánh bằng cảm quan khi khảo
sát sự ảnh hƣởng của trình tự phối hợp hai pha, kết quả là KTTP ở CT M1 (phối
hợp pha dầu vào pha nƣớc) nhỏ hơn CT M2 (phối hợp pha nƣớc và pha dầu). Với
35
tốc độ phối hợp nhanh ở CT M3, tiểu phân nano ART có KTTP là 272,9nm lớn hơn
kết tủa thu đƣợc ở CT M4 với KTTP là 265,6nm.
Điều này có thể do ART tan tốt trong aceton nhƣng ít tan trong nƣớc, do đó,
khi chopha dầu vào pha nƣớc, sự giảm độ hòa tan xảy ra quá nhanh khiến ART kết
tủa nhanh thành các sợi mảnh nhỏ. Ngƣợc lại, khi cho pha nƣớc và pha dầu, quá
trình thay thế dung môi làm giảm độ hòa tan của ART diễn ra chậm hơn do đó
KTTP giảm đáng kể.
Về tốc độ phối hợp, chúng tôi lựa chọn cách phối hợp chậm (nhỏ giọt bằng
micropipet với tốc độ nhỏ giọt là 5ml/phút). Khi phối hợp nhanh pha nƣớc vào pha
dầu trong vòng 2-3 giây, lƣợng nƣớc tại thời điểm cho vào quá nhiều khiến độ hòa
tan của ART giảm đột ngột làm cho KTTP lớn hơn khi phối hợp chậm. Tốc độ nhỏ
giọt khi phối hợp chậm là 5ml/phút là vừa đủ đảm bảo cho sự giảm độ hòa tan ART
không xảy ra quá đột ngột. Mặt khác, lƣợng pha nƣớc cho vào mỗi lần nhỏ giọt khi
sử dụng micropipet là hợp lý, không cần sử dụng kim tiêm insulin 1ml để phối hợp
2 pha, điều này giúp thuận lợi trong quá trình thao tác.
4.3. Về ảnh hƣởng của nồng độ chất diện hoạt.
Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ chất diện hoạt là một yếu tố quan
trọng ảnh hƣởng đến đặc tính của tiểu phân nano nhƣ KTTP, PDI [9], [40],
[49].Nồng độ chất diện hoạt ảnh hƣởng lớn đến kích thƣớc và PDI, tăng nồng độ
chất diện hoạt giúp giảm sức căng bề mặt, giảm kết tụ phân tử trong quá trình đồng
nhất, dẫn đến giảm kích thƣớc tiểu phân. Nghiên cứu cũng cho kết quả có xu hƣớng
phù hợp với nhận định (khi tăng tỷ lệ Tween 80 từ 1,0% đến 2,0% thì KTTP giảm
từ 284,1 nm đến 257 nm).Khi nồng độ chất diện hoạt nhỏ (1%) thì tiểu phân không
đƣợc phân tán đều, dẫn đến sự kết tụ tiểu phân nên KTTP lớn. Khi tăng nồng độ
chất diện hoạt thì tiểu phân đƣợc phân tán đều, tránh hiện tƣợng kết tụ do đó KTTP
giảm. Qua thực nghiệm khảo sát, KTTP tốt nhất khi nồng độ chất diện hoạt là 2%.
PDI cũng giảm dần khi tăng nồng độ chất diện hoạt, đặc biệt khi nồng độ chất diện
hoạt là 2% thì PDI giảm mạnh xuống còn 0,102. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng
độ chất diện hoạt thì dung dịch sẽ trở nên sánh nhớt, làm cho sự phân tán diễn ra
36
khó khăn do đó có thể làm tăng KTTP. Nghiên cứu của Nguyen H.T. cũng cho thấy
khi tăng Tween lên 2% thì KTTP và cả PDI đều có xu hƣớng tăng do ảnh hƣởng
của cân bằng giữa sức căng bề mặt và độ nhớt pha nƣớc [40].
Bên cạnh đó, Thế Zeta thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ chất diện hoạt.thế
zeta giảm mạnh khi tăng nồng độ chất diện hoạt từ 1% (32,6 mV) lên 1,5%
(7,28mV). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ chất diện hoạt lên 2% thì thế Zeta
tăng lên đến 17,2mV.
4.4. Về ảnh hƣởng của nồng độ Eudragit RS PO
Nồng độ polyme ảnh hƣởng đến KTTP và hệ số đa phân tán. Tuy nhiên sự tăng
giảm KTTP và PDI không tuân theo quy luật. Khi nồng độ polyme nhỏ, KTTP thu
đƣợc lớn đồng thời PDI khá cao. Điều này có thể là do nồng độ polyme nhỏ không
đủ để bao gói toàn bộ dƣợc chất do đó có một phần dƣợc chất bị kết tinh lại trong
nƣớc sau khi bay hơi dung môi hữu cơ liên quan đến độ tan kém của dƣợc chất.
KTTP khi nồng độ polyme là 0,5% (5mg/ml) là 257nm.Tiếp tục tăng nồng độ thì
KTTP giảm do DC đƣợc bao tốt hơn nhƣng PDI tăng cao do ảnh hƣởng của lực gây
phân tán cũng nhƣ tốc độ nhỏ giọt không đồng đều nhau. Nồng độ polyme phải đảm
bảo đủ lớn để có thể bao ngoài toàn bộ dƣợc chất để đạt đƣợc hiệu suất bao gói
cao.Tuy nhiên, việc đƣa một lƣợng thừa polyme vào sẽ kết tụ lại, làm ảnh hƣởng
đến độ đồng đều của kích thƣớc tiểu phân cũng nhƣ sự phân tán các tiểu phân trong
hệ. Mặt khác, có thể do khi tăng tỷ lệ Eudragit RS PO thì độ nhớt pha hữu cơ tăng,
dẫn đến các giọt hình thành lớn hơn, do đó KTTP lớn hơn. Bên cạnh đó sự tăng độ
nhớt pha hữu cơ cản trở quá trình phá vỡ giọt bởi siêu âm và cản trở quá trình bay
hơi của dung môi ra khỏi pha nƣớc [17]. Do đó khi tăng nồng độpolyme lên
10mg/ml thì KTTP tăng cao đạt 347,8nm. Qua khảo sát, nồng độ polyme cho KTTP
nhỏ cũng nhƣ PDI tốt là 7,5mg/ml với KTTP đạt 188,7nm và PDI là 0,174.
4.5. Về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu
Khi thay đổi tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu thì KTTP cũng nhƣ PDI thay đổi đáng
kể. Với phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi, chúng tôi có thể điều chỉnh tỉ lệ
giữa 2 pha cao hơn so với phƣơng pháp nhũ hóa. Tuy nhiên KTTP và PDI thay đổi
37
không theo quy luật có thể do ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn. Với các tỉ lệ
giữa 2 pha khác nhau, sự khuấy trộn của thiệt bị khuấy từ cũng diễn ra khác nhau,
đặc biệt khi tăng dần thể tích các pha dầu để điều chỉnh tỉ lệ. Khi giảm tỉ lệ pha
nƣớc/ pha dầu từ 10:1 xuống 2 :1, KTTP có xu hƣớng giảm mạnh từ 293,8 nm
xuống 188,7 nm. Khi giảm tỉ lệ này xuống 1:1 thì KTTP tăng lại đồng thời PDI
tăng.
Khi tỉ lệ giữa pha nƣớc và pha dầu lớn, trong quá trình khuấy trộn với một
lƣợng dung môi nhỏ và tốc độ khuấy trộn lớn sẽ dễ tạo ra bọt, cản trở sự phân tán
của tiểu phân đồng thời làm thay đổi nhanh trạng thái bão hòa của dƣợc chất trong
hỗn hợp dung môi do đó KTTP có xu hƣớng tăng. Khi tăng thể tích pha dầu, sự
khuấy trộn diễn ra dễ dàng hơn, bọt ít tạo ra nên KTTP giảm. Tuy nhiên, khi giảm tỉ
lệ này xuống 1:1 thì KTTP lại tăng. Điều này có thể do với thể tích pha dầu lớn, thể
tích nƣớc tƣơng ứng không thể kết tủa hết lƣợng polyme cũng nhƣ dƣợc chất có
trong pha dầu. Lƣợng polyme và dƣợc chất thừa có xu hƣớng kết tụ với nhau, do đó
KTTP tăng.Với cùng năng lƣợng sử dụng để đồng nhất, cùng thể tích pha hữu cơ,
thể tích pha nƣớc thay đổi thì mức độ phân tán năng lƣợng cũng thay đổi nên KTTP
và phân bố KTTP cũng thay đổi [43]. Kết quả nghiên cứu của Sharma M. và cộng
sự cho thấy, khi tăng thể tích pha nƣớc/pha hữu cơ từ 1:1 đến 4:1 thì KTTP giảm,
tuy nhiên nếu tăng từ 4:1 lên 12:1 thì KTTP lại tăng lên [43]. Kết quả nghiên cứu
của Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự chỉ thể hiện một xu hƣớng, KTTP giảm khi tăng
thể tích pha nƣớc. Điều này có thể là do sự khác nhau về KLPT của PLGA 5050,
loại và nồng độ chất diện hoạt sử dụng trong nghiên cứu [40].
PDI lại có xu hƣớng ngƣợc với KTTP của hệ. PDI có giá trị nhỏ khi tỉ lệ pha
nƣớc : pha dầu lớn, và giảm dần khi tỉ lệ này đạt 2:1 và 1:1. Tuy nhiên tất cả hệ số
PDI đều có giá trị < 0,3. Hệ số PDI còn phụ thuộc vào nồng độ chất diện hoạt sử
dụng trong dung dịch để tiểu phân đƣợc phân tán đều.
Thế zeta tăng dần khi giảm tỉ lệ giữa pha nƣớc và pha dầu. Khi giảm tỉ lệ này từ
10:1 xuống 5:1 thì thế zeta tăng không đáng kể: 22,5mV lên 23,6 mV. Tiếp tục
38
giảm tỉ lệ này thì thế zeta tăng lên 25mV và 30 mV tƣơng ứng với hai tỉ lệ 2:1 và
1:1.
4.6. Về ảnh hƣởng của nồng độ ART
Nồng độ ART ảnh hƣởng đến KTTP và hiệu suất bao gói của hệ tiểu phân nano
trong khi đó, PDI lại hầu nhƣ ít bị ảnh hƣởng. Khi tăng dần nồng độ ART, PDI của
hệ hầu nhƣ không thay đổi nhiều. Tromg khi đó, KTTP tỉ lệ thuận với tỉ lệ
DC/polyme, hiệu suất bao gói cũng tăng nhƣng khi tiếp tục tăng nồng độ ART thì
hiệu suất bao gói lại giảm. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự
[40], Trần Tuấn Hiệp và cộng sự [45] đều cho thấy khi tăng tỷ lệ dƣợc chất/polyme
thì hiệu suất mang thuốc giảm, khả năng nạp thuốc tăng lên. Tuy nhiên, ở kết quả
thí nghiệm, sự chênh lệch hiệu suất bao gói không nhiều, đồng thời mẫu M15 cho
KTTP nhỏ hơn 200nm nên chúng tôi tiến hành lựa chọn công thức M15 để tiến
hành đánh giá giải phóng in vitro.
4.7. Về khả năng giải phóng dƣợc chất in vitro
Sự giải phóng dƣợc chất chia làm 2 pha: giải phóng nhanh ở giai đoạn đầu và
giải phóng chậm hằng định ở giai đoạn sau. Sự giải phóng thuốc ồ ạt trong giai đoạn
đầu có thể do sự liên kết lỏng lẻo giữa phân tử DC và polyme bề mặt tiểu phân cũng
nhƣ do tỉ lệ DC khá cao so với polyme [37], [46].Tiếp sau đó là quá trình giải phóng
chậm theo cơ chế khuếch tán qua cốt polyme hoặc ăn mòn polyme [30], lƣợng dƣợc
chất đƣợc giải phóng trong quá trình này có thể là lƣợng dƣợc chất còn lại đƣợc lƣu
giữ bên trong cốt polyme của tiểu phân nano.Cơ chế giải phóng dƣợc chất phụ
thuộc vào độ tan, khả năng khuếch tán, sự phân hủy sinh học của polyme, khả năng
nạp thuốc, KTTP nano [32].
Sự giải phóng dƣợc chất gồm 2 pha phù hợp với rất nhiều nghiên cứu. Nguyễn
Hạnh Thủy và cộng sự (2014) đã chỉ ra sự giải phóng dƣợc chất ART từ tiểu phân
nano ART-PLGA gồm 2 pha: giải phóng nhanh trong khoảng 24 giờ đầu và giải
phóng chậm trong khoảng sau 24 giờ sau. Sự giải phóng nhanh hơn khi KTTP nhỏ
làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc [40]. Kết quả tiểu phân này sau khi bao CS, hạn
chế sự giải phóng dƣợc chất ồ ạt trong 24 giờ đầu, có thể do CS làm thay đổi vị trí
39
ART trên bề mặt tiểu phân nano, giảm sự rò rỉ ART, hoặc do tƣơng tác ion giữa
ART và CS [26].
40
Qua quá trình nghiên cứu, đề tài đã đạt một số kết quả sau:
1. Bào chế đƣợc tiểu phân nano chứa artesunat bằng phƣơng pháp kết tủa
- Bào chế đƣợc tiểu phân nano artesunat bằng phƣơng pháp kết tủa với KTTP
thỏa mãn yêu cầu.
- Kết quả của công thức tối ƣu bào chế tiểu phân nano artesunat nhƣ sau:
+Tỉ lệ poyme RS PO: 0,75%(7,5mg/ml)
+Tỉ lệ chất diện hoạt Tween 80: 2% (20mg/ml)
+Tỉ lệ pha nƣớc/ pha dầu : 2:1
+Tỉ lệ artesunat : 0,3% (3mg/ml)
2. Đánh giá đƣợc một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat.
- Tiểu phân có hình cầu, KTTP khoảng 188,7 nm, tƣơng đối đồng đều
(PDI=0,174), thế zeta bằng 25 mV, hiệu suất mang thuốc khá cao (78,25%).
- Hệ nano ART-RS PO có khả năng giải phóng dƣợc chất kéo dài (thời điểm
48h phần trăm giải phóng là 72,89 ± 3,01).
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Mai Anh (2014), Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng
hỗn dịch nano piroxicam dùng cho nhãn khoa, Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, Đại học
Dƣợc Hà Nội.
2. Đặng Tuấn Anh (2014), Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Artesunat bằng
phương pháp tự nhũ hóa, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Đại học y Dƣợc Hà Nội.
3. Nguyễn Minh Đức, Trƣơng Công Trí ( 2010), Hạt nano: kỹ thuật bào chế, phân
tích tính chất ứng dụng trong ngành dược, Nxb Y học HCM.
4. Đặng Thị Minh Lụa (2012), Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp curcumin,
Viện khoa học công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
5. Bộ Y tế (2013), Dược Thư Quốc Gia.
Tiếng Anh
6. Acharya S., Sahoo S. K. (2011), "PLGA nanoparticles containing various
anticancer agents and tumour delivery by EPR effect", Advanced Drug Delivery
Reviews, 63(3), pp. 170-183.
7. Aisha A. F. A. (2015), "Development of Polymeric Nanoparticles of Garcinia
mangostana Xanthones in Eudragit RL100/RS100 for Anti-Colon Cancer Drug
Delivery", Journal of Nanomaterials, 2015, pp. 3-5.
8. Alshamsan A. (2014), "Nanoprecipitation is more efficient than emulsion
solvent evaporation method to encapsulate cucurbitacin I in PLGA nanoparticles",
Saudi Pharmaceutical Journal, 22(3), pp. 219-222.
9. Arunkumar R. et al. (2015), "Biodegradable Poly (Lactic-co-Glycolic Acid)–
Polyethylen Glycol Nanocapsules: An Efficient Carrier for Improved Solubility,
Bioavailability, and Anticancer Property of Lutein", Journal of Pharmaceutical
Sciences, 104(6), pp. 2085-2093.
10. Augustijns P. et al (1996), "Transport of Artemisinin and Sodium Artesunate
in Caco-2 Intestinal Epithelial Cells", Journal of Pharmaceutical Sciences, 85(6),
pp. 577-579.
11. Bansal S., Bansal M., Kumria R. ( 2012), "Nanocrystals: Current strategies
and trends", International journal of research in pharmaceutical and
biomedical sciences, 3(1), pp. 406 - 419.
12. Berger T. G. et al (2005), "Artesunate in the treatment of metastatic uveal
melanoma-first experiences", Oncology Reports, 14(6), pp. 1599-1603.
13. Chadha R., Gupta, S., Pathak N. (2012), "Artesunate-loaded chitosan/lecithin
nanoparticles: preparation , characterization and in vivo studies", Drug
Development and Industrial Pharmacy, 38(12), pp. 1538-1546.
14. Chen Y. et al. (2009), "Study of artemisinin nanocapsules as anticancer drug
delivery systems", Nanomedicine : Nanotechnology, Biology and Medicine, 5(3),
pp. 316-322.
15. Chowdhary K. P. R., Girija G. (1997), "Eudragit microcapsules of nifedipine
and its dispersions in HPMC-MCC: Physicochemical characterization and drug
release studies", Drug development and Industrial Pharmacy , 23(3), pp. 325-330.
16. Crespo-Ortiz M. P., Wei M. Q. (2011), "Antitumor activity of artemisinin and
its derivatives: from a well-known antimalarial agent to a potential anticancer drug",
BioMed Research International, 2012, pp. 1-18.
17. Dao T. P. T. et al. ( 2014), "A new formulation of curcumin using poly(lactic-
co-glycolicacid)-polyethyleneglycoldiblock copolymer as carrier material",
Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 5(3), pp. 035013
(7pages).
18. Davis M. E., Shin D. M. (2008), "Nanoparticle therapeutics: an emerging
treatment modality for cancer", Nature Review Drug Discovery, 7(9), pp. 771-782.
19. Edel S., Hongkee S. (2015), "Recent Trends in Preparation of Poly(lactide-co-
glycolide) Nanoparticles by Mixing Polymeric Organic Solution with Antisolvent",
Journal of Nanomaterials, 2015, pp. 5-7.
20. Efferth T. (2007), "Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and
antitumor activity of artemisinin--from bench to bedside", Planta medica, 73(4), pp.
299-309.
21. Efferth T. et al (2001), "The anti-malarial artesunate is also active against
cancer", International Journal of Oncology, 18(4), pp. 767-773.
22. Efferth T., Olbrich A., Bauer R. (2002), "mRNA expression profiles for the
response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate, arteether,
and artemether", Biochemical Pharmacology, 64(4), pp. 617-623.
23. Gref R. et al. (2012), "The controlled intravenous delivery of drugs using PEG-
coated sterically stabilized nanospheres", Advanced Drug Delivery Reviews, 64, pp.
316-326.
24. Gülsün T., Gürsoy R. N., Öner L. (2009), "Nanocrystal technology for oral
delivery of poorly water-soluble drugs", FABAD journal of pharmceutical sciences,
34, pp. 55-65.
25. Haznedar S., Dortune B. (2004), "Preparation and in vitro evaluation of
eudragit microspheres containing acetazolamide", International Journal of
pharmacy, 269(1), pp. 131-140.
26. Ho H. N. et al. (2015), "Optimization and Characterization of Artesunate-
Loaded Chitosan-Decorated Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Acid Nanoparticles",
Journal of Nanomaterials, Article ID 674175, 12 pages.
27. Ho W. E. et al (2014), "Artemisinins: pharmacological actions beyond anti-
malarial", Pharmacology & Therapeutics, 142(1), pp. 126-139.
28. Ilett K. F. et al (2002), "The pharmacokinetic properties of intramuscular
artesunate and rectal dihydroartemisinin in uncomplicated falciparum malaria",
British Journal of Clinical Pharmacology, 53(1), pp. 23-30.
29. Karbwang J. et al (1998), "Pharmacokinetics of oral artesunate in Thai patients
with uncomplicated Falciparum malaria", Clinical Drug Investigation, 15(1), pp.
37-43.
30. Khalil N. M. et al. (2013), "Pharmacokinetics of curcumin-loaded PLGA and
PLGA-PEG blend nanoparticles after oral administration in rats", Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, 101, pp. 353-360.
31. Khalil R. et al. (2014), "Polymeric nanoparticals as potential carriers for topical
delivery of colchicine : Development and in vitro characterization", International
journal of Pharmaceutical sciences and research, 5(5), pp. 1746-1756.
32. Kumari A. et al (2010), "Biodegradable polymeric nanoparticles based drug
delivery systems", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75(1), pp. 1-18.
33. Langer K. et al (2003), "Optimization of the preparation process for human
serum albumin (HSA) nanoparticles", International Journal of Pharmaceutics,
257(1-2), pp. 169-180.
34. Lindstrom T. M., Bennett P. R. (2005), "The role of nuclear factor kappa B in
human labour", Reproduction, 130(5), pp. 569-581.
35. Liu W. M., Gravett A. M., Dalgleish A. G. (2011), "The antimalarial agent
artesunate possesses anticancer properties that can be enhanced by combination
strategies", International Journal of Cancer, 128(6), pp. 1471-1480.
36. Makadia H. K., Siegel S. J (2011), "Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as
Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier", Polymers, 3(3), pp. 1377-1397.
37. Mirakabad F. et al. (2014), "PLGA-Based Nanoparticles as Cancer Drug
Delivery Systems", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15(2), pp. 517-
535.
38. Mora-Huertas C. E. et al (2011), "Influence of process and formulation
parameters on the formation of submicron particles by solvent displacement and
emulsification-diffusion methods critical comparison", Advances in Colloid and
Interface Science, 163(2), pp. 90-122.
39. Mora-Huertas C. E., Fessi H., Elaissari A. (2010), "Polymer-based
nanocapsules for drug delivery", International Journal of Pharmaceutics, 385(1–2),
pp. 113-142.
40. Nguyen H. T. et al. (2014), "Enhancing the in vitro anti-cancer efficacy of
artesunate by loading into poly-D,L-lactide-co-glycolide (PLGA) nanoparticles",
Archives of pharmacal research, 38(5), pp. 716-724.
41. Pandav Satish, Naik Jitendra (2014), "Sustained release of ramipril from
ammonio methacrylate copolymer matrix prepared by high pressure homogenizer",
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences., 6(1), pp. 349-
353.
42. Pegi A. G., Julijana K. (2011), "The manufacturing techniques of drug-loaded
polymeric nanoparticles from preformed polymers", Journal of
Microencapsulation, 28(4), pp. 323–335.
43. Sharma N. et al. ( 2015), " Effect of process and formulation variables on the
preparation of parenteral paclitaxel-loaded biodegradable polymeric nanoparticles:
A co-surfactant study ", Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, pp. 404-414.
44. Singh N. P., Panwar V. K (2006), "Case report of a pituitary macroadenoma
treated with artemether", Integrative Cancer Therapies, 5(4), pp. 391–394.
45. Tran T. H. et al. (2015), "Development and Evaluation of Artesunate-Loaded
Chitosan-Coated Lipid Nanocapsule as a Potential Drug Delivery System Against
Breast Cancer," American Association of Pharmaceutical Scientists Technology,
16(6), pp. 1307-1316
46. Vasconcelos A. et al. (2015), "Conjugation of cell-penetrating peptides with
poly(lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol nanoparticles improves ocular
drug delivery", International Journal of Nanomedicine, 10, pp. 609-631.
47. Vauthier C., Bouchemal K. (2009), "Methods for the preparation and
manufacture of polymeric nanoparticles", Pharmaceutical research, 26(5), pp.
1025-1058.
48. Xiao X. C., Hong Z. G. (2010), "Firstborn microcrystallization method to
prepare nanocapsules containing artesunate", International journal of
nanomedicine, 5, pp. 483-486.
49. Zhiqing W. et al. (2007), "Preparation and in vitro Studies of Stealth PEGylated
PLGA Nanoparticles as Carriers for Arsenic Trioxide", Chinese Journal of
Chemical Engineering, 15(6), pp. 795-801.
THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ARTESUNAT
1. Phù hợp hệ thống
- Tiến hành pha mẫu chuẩn artesunat với nồng độ khoảng 200µg/mL , tiến hành
theo mục 2.3.2.1. Tiến hành đo mẫu 6 lần với kết quả đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 1. Kết quả phù hợp hệ thống
Nồng độ Diện tích pic Thời gian lƣu
(µg/mL) (mAu.s) (phút)
200 326896,5 13,158
200 327176 13,135
200 326469 13,159
200 326395 13,159
200 326281,5 13,163
200 327080,5 13,218
326716,4 13,165 Trung bình
0,106753 0,192 RSD(%)
Dựa vào kết quả ở bảng trên, độ lệch chuẩn qua 6 lần đo diện tích Pic và thời
gian lƣu trung bình của lần lƣợt là 0,106753 và 0,192 nên phƣơng pháp này có độ
phù hợp hệ thống cao.
2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính
- Pha dãy nồng độ chuẩn với các nồng độ 12,5µg/mL; 255µg/mL; 505µg/mL;
1005µg/mL; 2005µg/mL; 4005µg/mL; 8005µg/mL từ mẫu chuẩn gốc 2000 µg/mL
trong bình định mức 10mL.
- Tiến hành theo mục 2.3.2.1. Kết quả đo đƣợc thể hiện trong bảng sau:
) s .
u A m
( c i p
h c í t
n ệ i D
Hình 1. Đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ ART
Kết quả cho thấy: R2> 0,99, do vậy có mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ artesunat trong khoảng nồng độ nói trên.
3. Độ chính xác trong ngày
- Tính toán để pha 6 mẫu thử gốc trong bình định mức 10mL.
- Pha 6 mẫu thử (200µg/mL ) , tiến hành theo mục 2.3.2.1. để biết đƣợc độ chụm
kết quả.
Bảng 3. Kết quả độ chính xác cùng ngày
Nhận xét: Kết quả độ chính xác trong ngày ĐẠT với RSD(%)<2%.
4. Độ lặp lại khác ngày
- Tiến hành tƣơng tự mục 3 sau 1 ngày với kết quả ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả độ chính xác khác ngày
Nhận xét: Kết quả độ chính xác khác ngày ĐẠT với RSD(%)<2%.
5. Độ đúng
- Tiến hành phân tích các mẫu placebo có thêm chính xác một lƣợng chất
chuẩn (tính theo artesunat) ở 3 mức 100%, 110%, 120%, ở mỗi mức nồng độ tiến
hành phân tích 3 lần.
- Pha trong vial, cụ thể:
+ Nồng độ100% (tƣơng ứng 200µg/mL ): 100% thử, 3 mẫu
+ Nồng độ 110%: 100% thử + 10% chuẩn, 3 mẫu
+ Nồng độ 120%: 100% thử + 20% chuẩn, 3 mẫu
Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 5 và bảng 6 sau:
Bảng 5. Kết quả số liệu về độ đúng
Bảng 6. Kết quả phần trăm tìm lại của lƣợng Artesunat thêm vào
Trung bình
RSD(%)
Nhận xét: Các tỉ lệ thu hồi riêng phần nằm trong khoảng từ 89,5% đến 96,3%
và tỉ lệ thu hồi trung bình đạt 91,65%. RSD(%) đạt 0,027 <2 nên phƣơng pháp có
độ đúng cao.
Kết luận: Phƣơng pháp định lƣợng cho độ phù hợp hệ thống cao ,độ tuyến tính,
độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu. Do đó, phƣơng pháp này có thể áp dụng xác
định hàm lƣợng artesunat trong mẫu phân tích.
![Bộ Thí Nghiệm Vi Điều Khiển: Nghiên Cứu và Ứng Dụng [A-Z]](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250429/kexauxi8/135x160/10301767836127.jpg)
![Nghiên Cứu TikTok: Tác Động và Hành Vi Giới Trẻ [Mới Nhất]](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250429/kexauxi8/135x160/24371767836128.jpg)
