Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định được sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn gia cầm tại Việt Nam; xác định được đặc điểm phân tử gen và độc lực của virus cúm A/H5 biến chủng mới; đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của một số vacxin cúm gia cầm hiện hành đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới.
NGUYỄN VĂN LÂM
HÀ NỘI - 2021
Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài độc lập cấp quốc gia "Nghiên cứu sự
phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", mã số ĐTĐL.CN-
10/15, giai đoạn 2015-2018, do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ trì đề tài.
Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do tôi và
nhóm nghiên cứu thực hiện, kết quả được công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án là
trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công bố trước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin
trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả luận án
i
Nguyễn Văn Lâm
Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi nhận được sự giúp
đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS. Tô Long Thành, Trung tâm
Chẩn đoán Thú y Trung ương; PGS.TS. Chu Đức Thắng, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn tập thể các thầy cô và kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn đoán Thú
y Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Nghiên cứu này có sử dụng kinh phí của đề tài độc lập cấp quốc gia mã số
ĐTĐL.CN-10/15 "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt
hiệu quả cao", do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ trì đề tài.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong cùng nhóm nghiên cứu, các đồng tác giả Nguyễn Thị Thúy Mận, Nguyễn Hoàng Đăng, Nguyễn Đăng Thọ và
Tô Long Thành đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án.
Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi luôn biết ơn gia đình, đặc biệt là vợ tôi, đã luôn
bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu và bản luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Nghiên cứu sinh
ii
Nguyễn Văn Lâm
Lời cam đoan .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... ii
Mục lục ......................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................. viii
Danh mục hình ................................................................................................................ ix
Trích yếu luận án ............................................................................................................ xi
Thesis abstract ............................................................................................................... xiii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2
1.3. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................... 3
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 3
1.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................... 3
1.4. Những đóng góp mới của luận án ...................................................................... 3
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ........................................................... 4
1.5.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 4
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 4
Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5
2.1. Đại cương về bệnh cúm gia cầm ........................................................................ 5
2.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm ................................................................................. 5
2.1.2. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới ................................................ 8
2.1.3. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam ............................................... 11
2.1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm ......................................................................... 14
2.1.5. Triệu chứng bệnh cúm gia cầm ........................................................................ 16
2.1.6. Bệnh tích bệnh cúm gia cầm ............................................................................ 17
2.1.7. Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm .......................................................................... 19
2.2. Virus học cúm gia cầm .................................................................................... 21
2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm type A ......................................... 21
2.2.2. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm type A ................................................. 23
iii
2.2.3. Thành phần hóa học của virus ......................................................................... 24
2.2.4. Sự nhân lên và tác động gây bệnh của virus .................................................... 24
2.2.5. Độc lực của virus ............................................................................................. 27
2.2.6. Đặc tính các protein và khả năng biến chủng của virus ................................... 27
2.2.7. Sức đề kháng của virus .................................................................................... 33
2.2.8. Nuôi cấy và lưu giữ virus ................................................................................. 33
2.2.9. Danh pháp ........................................................................................................ 33
2.3. Phòng chống bệnh cúm gia cầm ...................................................................... 33
2.3.1. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ..................................................................... 33
2.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ................ 35
Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .......................................................... 38
3.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 38
3.1.1. Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới ........................................... 38
3.1.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới ... 38
3.1.3. Nghiên cứu khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của
các loại vacxin ................................................................................................. 38
3.2. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................... 39
3.2.1. Dụng cụ lấy mẫu .............................................................................................. 39
3.2.2. Hóa chất lấy mẫu ............................................................................................. 39
3.2.3. Vacxin và động vật thí nghiệm ........................................................................ 40
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 40
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu ...................................................................................... 40
3.3.2. Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx ........ 42
3.3.3. Giám định virus phân lập bằng phương pháp HI ............................................. 45
3.3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus A/H5 biến chủng mới ............ 46
3.3.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus A/H5 biến chủng mới ........... 47
3.3.6. Phương pháp đánh giá triệu chứng lâm sàng ................................................... 48
3.3.7. Phương pháp mổ khám toàn diện .................................................................... 49
3.3.8. Chuẩn bị tiêu bản vi thể bằng phương pháp paraffin ....................................... 50
3.3.9. Phương pháp công cường độc kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin
với virus cúm A/H5 biến chủng mới ............................................................... 50
iv
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 52
Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 53
4.1. Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới ........................................... 53
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu và sàng lọc virus cúm A ............................................... 53
4.1.2. Kết quả xác định subtype H5 từ các mẫu dương tính với virus cúm A ........... 55
4.1.3. Kết quả xác định subtype H5N1 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5 ...... 57
4.1.4. Kết quả xác định subtype H5N6 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5 ...... 60
4.1.5. Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài ...................... 62
4.1.6. Nghiên cứu phân loại virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được từ
gà, vịt và chim cút ............................................................................................ 63
4.1.7. Kết quả nghiên cứu nguồn gốc phát sinh của virus cúm A/H5 biến chủng
mới qua phân tích phả hệ dựa trên gen HA ..................................................... 65
4.1.8. Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới theo thời gian và
không gian ....................................................................................................... 70
4.2. Một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới ....................... 74
4.2.1. Đặc tính sinh học phân tử tiểu phần HA1 của các biến chủng ........................ 74
4.2.2. Đặc tính gây bệnh của virus cúm A/H5 biến chủng mới ................................. 80
4.2.3. Triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên
gia cầm ............................................................................................................. 82
4.3. Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại
vacxin ............................................................................................................... 90
4.3.1. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.2.1c ...... 91
4.3.2. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4a ...... 96
4.3.3. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4b .... 101
4.3.4. Biến đổi bệnh lý ở gà có miễn dịch dị chủng sau công cường độc bằng
virus clade 2.3.4.4a và clade 2.3.4.4b ............................................................ 106
4.3.5. Thảo luận về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của biến thể
virus cúm A/H5Nx ......................................................................................... 106
Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 108
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 108
5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 109
Danh mục công trình đã công bố liên quan đến luận án ............................................... 110
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 111
v
Phụ lục ....................................................................................................................... 128
Chữ viết tắt Diễn giải
Axit deoxyribonucleic ADN
Avian influenza AI
Axit ribonucleic ARN
An toàn sinh học ATSH
Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
Base pair Bp
Chicken Embryo Fibroblast CEF
Cúm gia cầm CGC
Chicken CK
Cộng sự CS
Cycle of threshold CT
CTCPTTYTW1 Công ty Cổ phần thuốc Thú y Trung ương 1
Duck DK
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA
Food and Agriculture Organization FAO
Geometic Mean Titer GMT
Goose Gs
Hemagglutination HA
Hạn sử dụng HSD
Hiệu giá kháng thể HGKT
Hemagglutination Inhibition HI
Highly Pathgenic Avian Influenza HPAI
Intravenous Pathogenicity Index IVPI
Kilo base Kb
Low Pathogenic Avian Influenza LPAI
Matrix protein M
Madin-Darby-Canine-Kidney MDCK
Muscovy duck MDK
vi
Mediocris Downtime MDT
MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis
NA Neuraminidae
NCVD National Centre for Veterinary Diagnostics
NEP Nuclear export protein
NP Nucleoprotein
NS Non-strutural protein
NSX Ngày sản xuất
OIE Office International des Épizooties
PA Polymerase acidic
PB1 Polymerase basic protein 1
PB2 Polymerase basic protein 2
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
SPF Specific pathogen free
RT-PCR Reverse transcriptase- Polymerase Chain Reaction
RNP Ribonucleoprotein
TCID50 Tissue Culture Infective Dosage
TCN Tiêu chuẩn ngành
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TW Trung ương
VN Việt Nam
vii
WHO World Health Organization
TT Tên bảng Trang
2.1. Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới giai đoạn 2003-2014 ............. 7
2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017 ....................... 10
2.3. Bệnh tích điển hình của gà mắc cúm gia cầm ..................................................... 18
3.1. Cơ cấu thu thập mẫu của đề tài ........................................................................... 41
3.2. Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6 .................................... 43
3.3. Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2 ....................................... 44
3.4. Bố trí thí nghiệm công cường độc ...................................................................... 47
3.5. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus H5N1
clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b .............................. 51
viii
4.1. Bệnh tích đại thể trên gà ở các lô thí nghiệm sau công cường độc..................... 93
TT Tên hình Trang
2.1. Sơ đồ mô tả các cơ chế sinh bệnh chủ yếu, các gen và sản phẩm của gen
tham ra vào sự gây nhiễm của virus cúm A/H5N1 ............................................. 15
2.2. Sơ đồ quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm .................................................... 21
2.3. Cấu trúc virus cúm H5N1 ................................................................................... 22
2.4. Quá trình nhân lên của virus cúm ....................................................................... 25
2.5. Cấu trúc bậc 3 của HA virus cúm ....................................................................... 28
2.6. Vị trí của 5 epitope kháng nguyên chính ............................................................ 28
4.1. Kết quả sàng lọc virus cúm A tại các tỉnh giám sát ............................................ 53
4.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A theo giai đoạn và khu vực giám sát............................ 54
4.3. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5 tại các tỉnh giám sát ...................................... 55
4.4. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 theo giai đoạn và khu vực giám sát ..................... 56
4.5. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5N1 tại các tỉnh giám sát ................................. 58
4.6. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 theo giai đoạn và khu vực giám sát ................. 59
4.7. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5N6 tại các tỉnh giám sát ................................. 60
4.8. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N6 theo giai đoạn và khu vực giám sát ................. 61
4.9. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài ..................................... 62
4.10. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong nghiên cứu và các chủng virus
thuộc các clade khác nhau đã lưu hành ở Việt Nam ........................................... 66
4.11. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong clade 2.3.4.4 .................................... 67
4.12. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong clade 2.3.2.1 .................................... 68
4.13. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 1/2015 tới 6/2016 ..................... 71
4.14. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 7/2016 tới 6/2017 ..................... 72
4.15. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 7/2017 tới 3/2018 ..................... 73
4.16. Trình tự amino acid gần vị trí cắt của protein HA .............................................. 74
4.17. Trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ ......................................... 75
4.18. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.2.3.1c ....................... 76
4.19. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4b ...................... 77
4.20. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4a ....................... 78
ix
4.21. Đặc điểm hiện tượng glycosyl hóa ở tiểu phần HA1 .......................................... 79
4.22. Tỷ lệ gà chết theo thời gian khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới
qua tĩnh mạch ...................................................................................................... 80
4.23. Chỉ số độc lực của virus và thời gian chết trung bình của gà khi gây nhiễm
virus cúm A/H5 biến chủng mới ......................................................................... 82
4.24. Điểm lâm sàng của gà gây nhiểm với virus cúm A/H5 biến chủng mới ............ 82
4.25. Bệnh tích đại thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5
biến chủng mới ................................................................................................... 86
4.26. Bệnh tích vi thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5
biến chủng mới (HE 10x) ................................................................................... 88
4.27. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm công cường độc bằng
virus clade 2.3.2.1c ............................................................................................. 91
4.28. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.2.1c ở gà có đáp ứng miễn
dịch dị chủng ....................................................................................................... 92
4.29. Bệnh tích đại thể ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau khi công cường
độc bằng chủng virus clade 2.3.2.1c ................................................................... 94
4.30. Hiện tượng thải virus ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công cường
độc bằng chủng virus clade 2.3.2.1c ................................................................... 95
4.31. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm công cường
độc bằng virus clade 2.3.4.4a .............................................................................. 96
4.32. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4a ở gà và vịt có đáp ứng
miễn dịch dị chủng .............................................................................................. 97
4.33. Hiện tượng thải virus ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công
cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4a ........................................................ 99
4.34. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm công cường
độc bằng virus clade 2.3.4.4b ........................................................................... 101
4.35. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4b ở gà và vịt có đáp ứng
miễn dịch dị chủng ........................................................................................... 103
4.36. Hiện tượng thải virus ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công
x
cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4b ...................................................... 105
Tên tác giả: Nguyễn Văn Lâm
Tên luận án: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
ở đàn gia cầm làm cơ sở cho phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.
Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Xác định được có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở
đàn gia cầm tại Việt Nam; từ đó xác định một số đặc tính sinh học của biến chủng nhằm
khuyến cáo sử dụng vacxin phòng bệnh.
Phương pháp nghiên cứu
Ba nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) kỹ
thuật PCR dùng để phát hiện virus cúm A/H5 biến chủng mới trong mẫu bệnh
phẩm và giải trình tự gen virus; (ii) ứng dụng tin sinh học, với các phần mềm như
MEGA, Weblogo, S.A.S, v.v... để phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm
A/H5 biến chủng mới; (iii) bố trí thí nghiệm để đánh giá độc lực, triệu chứng bệnh tích
trên gia cầm và khả năng bảo hộ của vacxin với virus cúm A/H5 biến chủng mới.
Kết quả chính và kết luận
Có 3 nhóm kết quả đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:
1) Đã xác định được có sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở 11 tỉnh
(Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế,
Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) tại Việt Nam trong giai đoạn 2015-2018,
cụ thể:
Virus CGC lưu hành có tỷ lệ dương tính với virus: cúm A (gen M) 9,15%; A/H5
1,15 %; A/H5N1 0,23%; A/H5N6 0,65%;
Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được gồm: A/H5N6 subclade
2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và miền Trung; A/H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền
Nam; chưa phát hiện virus cúm A/H5N6 ở miền Nam;
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới cao nhất trên vịt (A/H5N1 0,42%,
A/H5N6 1,27%), tiếp đến là gà (A/H5N1 0,23%, A/H5N6 0,5%), chưa phát hiện biến
xi
chủng mới trên chim cút.
2) Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
Virus cúm A/H5 biến chủng mới thuộc H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a
và 2.3.4.4b có độc lực cao với chỉ số IVPI tương ứng 2,95, 2,78 và 2,87.
Virus cúm A/H5 biến chủng mới mang đặc điểm khác biệt về trình tự amino acid
trên gen HA so với các chủng virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện hành
ở Việt Nam;
Các virus cúm A/H5 biến chủng mới đặc hiệu với receptor của gia cầm, gây bệnh trên
gia cầm với các biểu hiện đặc trưng của bệnh CGC gồm: (1) triệu chứng lâm sàng như sốt
cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi, thở khò khè; (2) biến đổi bệnh tích gồm phù,
sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hầu hết các cơ quan phủ tạng.
3) Đánh giá được khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của
các loại vacxin hiện hành.
Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 đối với các biến
chủng virus mới (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) tạo được miễn dịch
trên ngưỡng bảo hộ (>4log2); (2) không tạo ra trạng thái miễn dịch vô trùng, (3) có khả
năng bảo hộ lâm sàng 50- 80% gà và 100% vịt thí nghiệm;
Gà được gây miễn dịch dị chủng từ Navet-vifluvac và Re-5 có xu hướng giảm bài
thải virus cường độc, giảm rõ rệt biến đổi bệnh tích đại thể (chỉ có bệnh tích: ở phổi với
Navet-vifluvac; ở phổi, gan, cơ và ruột với Re-5);
Virus H5N6 clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn virus
H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N1 clade 2.3.2.1c;
Vacxin Navet-vifluvac bảo hộ lâm sàng cho gà (70-80%) chống lại virus cúm
xii
A/H5 biến chủng mới tốt hơn vacxin Re-5 (50-70%).
PhD candidate: Nguyen Van Lam
Thesis title: Investigation into biological characteristics of novel avian influenza A/H5
variants circulating on poultry as a basis for disease prevention in Vietnam.
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 9.64.01.02
Educational organization Institution: Vietnam National University of Agriculture.
Research Objectives The goal of research
To identify if there were novel avian influenza A/H5 variants circulating on
poultry in Vietnam and their biological characteristics as fundamental guideline for
vaccines selection.
Materials and Methods
Three main methods groups were adopted in this study, including: (i) Polymerase
chain reaction (PCR) was used to detect and gene sequencing of avian influenza A/H5
virus. (ii) Bioinformatics programs including MEGA, Weblogo, S.A.S, etc. to analyze
molecular biological characteristics of influenza virus A/H5 new strains. (iii)
Experimentally infected chickens with the obtained virus strains to evaluate their
virulence and protection ability of some commercial vaccines against the new strains.
Main findings and conclusions
Three milestones were achieved in this study:
1) New strains of influenza A/H5 virus had been identified in 11 provinces
(Hanoi, Phu Tho, Thai Nguyen, Nghe An, Quang Nam, Quang Ngai, Thua Thien Hue,
Kon Tum, Dong Thap, Vinh. Long, Kien Giang) of Vietnam over the period from 2015
to 2018:
The isolated avian influenza virus were identified to be positive with (M gene),
A/H5, A/H5N1, A/H5N1 at the proportion of 9.15%; 1.15%; 0.23% and 0.65%,
respectively.
The isolated influenza A/H5 virus were A/H5N6 clade 2.3.4.4a/b circulated in the
North and Central, meanwhile the A/H5N1 clade 2.3.2.1c circulated mainly in the
xiii
South. However, the A/H5N6 influenza virus was not found in the South.
The prevalence of A/H5 influenza virus new strains was highest in ducks
(A/H5N1 0.42%, A/H5N6 1.27%), and lower rate in the chickens (A/H5N1 0.23%,
A/H5N6 0, 5%), meanwhile it was not detected in quail.
2) Findings on biological characteristics of influenza virus A/H5 new strain:
The isolated A/H5 virus influenza new strain belongs to H5N1 clade 2.3.2.1c,
H5N6 clade 2.3.4.4a, and 2.3.4.4b whose virulence with IVPI index of 2.95, 2.78, and
2.87 respectively.
The new variant influenza A/H5 virus has different characteristics in the amino
acid sequence of the HA gene compared with the vaccine strains (Navet-vifluvac, Re-5).
The new avian variant of influenza A/H5 viruses were specific pathogenesis on poultry,
experimentally infected chickens manifested with specific symptoms and lesions,
including: (1) high fever, moodiness, fatigue, eyes and nasal discharged, and wheezing;
(2) Gross lesions including edema, congestion, hemorrhage, degeneration, necrosis, and
inflammatory cell infiltrates in most of the internal organs.
3) Findings on the evaluation of effect of commercial vaccines against the
influenza virus A/H5 new strains:
Heterologous immunity responses from Navet-vifluvac and Re-5 vaccines with
variants new virus (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) yielded immunity
above the protective threshold (> 4log2); (2) does not create a sterile immune state; (3)
clinically protected experimental poultry against A / H5 virus (20-50% in chickens and
100% ducks).
Chickens vaccinated with Navet-vifluvac and Re-5 reduced excretion of virulent
virus and markedly decreased macroscopic lesions (only lung lesions were found in
chickens vaccinated with Navet-vifluvac; meanwhile lesion in liver, muscle, and
intestines were found in animals injected with Re-5);
H5N6 clade virus 2.3.4.4b was able to overcome the heterologous immune
response better the H5N6 clade 2.3.4.4a and the H5N1 clade 2.3.2.1c virus;
Navet-vifluvac vaccine protected 70 to 80% of experimental chickens against
xiv
influenza virus A/H5 new strain meanwhile Re-5 vaccine only obtained 50-70%.
Bệnh cúm gia cầm (CGC) là bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra trên gia cầm, do virus subtype A/H5 gây ra. Bệnh CGC xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2003 và được ghi nhận là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI) gây nên. Virus CGC HPAI A/H5N1 lần đầu tiên phân lập được từ ngỗng ở Guangdong Trung Quốc năm 1996 (Xu & cs., 1999), xâm nhập vào Việt Nam cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục và đang là vấn đề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới, là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008; Lê Thanh Hòa & cs., 2008).
Virus cúm A/H5N1 từ khi xuất hiện tại Việt Nam năm 2003 cho đến năm 2005, gây bệnh CGC ở tất cả các tỉnh thành trên cả nước chủ yếu do biến chủng virus clade 1 (Wan & cs., 2008; Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008), bên cạnh đó clade 2.3.2 cũng được phát hiện năm 2005. Năm 2006, tình hình dịch CGC tạm lắng do các biện pháp làm giảm nguồn bệnh được áp dụng như cấm ấp nở thủy cầm (loài mang trùng virus CGC) và tiêm phòng vacxin trên phạm vi cả nước cho gia cầm bằng vacxin Re-1 (clade 0). Từ năm 2007 đến giữa năm 2010, có sự khác biệt địa lý về lưu hành của các biến chủng virus CGC, các clade 2.3.4 dòng Phúc Kiến (sau đó phân chia thành các subclade 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3) chiếm ưu thế ở các tỉnh phía Bắc. Trong khi đó, các clade 1 và subclade 1.1 (tiến hóa từ clade 1) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, sau đó tiếp tục tiến hóa thành clade 1.1.1 và 1.1.2 (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008; Nguyen & cs., 2012). Trong thời gian này, vacxin Re-1 và Re-5 (clade 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc đã được sử dụng, đồng thời một vacxin trong nước dùng chủng NIBRG-14 (clade 1) được thử nghiệm. Năm 2008, clade 7 được phát hiện trên gia cầm nhập lậu ở Lạng Sơn và một số chợ ở Hà Nội. Năm 2010-2011, nhiều biến chủng mới đã nổi lên, clade 2.3.2.1 (xuất hiện cuối 2009) trở nên thịnh hành vào cuối năm 2010 và tiến hóa thành các clade 2.3.2.1a,b (Nguyen & cs., 2012) lưu hành ở các tỉnh phía Bắc, các clade 1.1.1 và 1.1.2 tiếp tục lưu hành ở các tỉnh phía Nam.
Giữa năm 2012 clade 2.3.2.1c xuất hiện ở miền Bắc, sau đó nhanh chóng lây lan vào miền Trung và miền Nam Việt Nam, đồng thời các clade 2.3.2.1a và b dần biến mất. Năm 2013, chỉ còn clade 2.3.2.1c lưu hành trên cả nước và clade 1.1.2 vẫn khu trú ở các tỉnh phía Nam. Đầu năm 2014, các clade 2.3.2.1c và 1.1.2 vẫn là những clade chính gây bệnh CGC ở Việt Nam, tuy nhiên sau tháng 2 năm 2014,
1
clade 1.1.2 không còn được phát hiện. Từ tháng 4 năm 2014, dịch CGC do subclade 2.3.4.4 gây ra bắt đầu xuất hiện ở miền Bắc như Lạng Sơn (tháng 4/2014), Lào Cai (8/2014), Phú Thọ (9/2014). Sau đó, virus đã nhanh chóng được phát hiện ở một số tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh (6/2014), Quảng Ngãi (8/2014), Quảng Trị (8/2014) (Nguyễn Đăng Thọ & cs., 2016).
Virus CGC không có hoạt động sửa lỗi trong quá trình tổng hợp ARN khi nhân lên, làm biến đổi gen hình thành những biến chủng mới. Khả năng biến đổi gen đã giúp virus cúm tiến hóa rất đa dạng, dẫn đến những đợt dịch CGC mới xuất hiện. Tuy nhiên, những thay đổi kháng nguyên còn xảy ra do sự tái tổ hợp gen giữa các virus cúm khác nhau để tạo ra một biến chủng virus mới có độc lực không thể lường trước và tiềm ẩn gây ra các đại dịch (Van den Berg & cs., 2008). Khả năng tái kết hợp gen của các virus cúm cùng subtype hay khác subtype đã tạo ra nhiều virus cúm tái tổ hợp mới có kiểu gen khác nhau. Các nghiên cứu trước đây đã xác định được virus cúm H5N1 dòng GS/GD/96 đã tiến hóa thành 10 clade khác biệt về di truyền (0-9) và rất nhiều các subclade khác (WHO/OIE/FAO, 2008).
Từ thực tế cho thấy, sự xuất hiện liên tục các biến chủng mới của virus
A/H5N1 qua các năm đã làm phức tạp thêm vấn đề sử dụng vacxin trong phòng
chống bệnh CGC, thậm chí làm cho vacxin mất hẳn tính hiệu quả. Vì vậy, việc
xác định có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở Việt
Nam, xác định một số đặc tính sinh học và thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh
của các loại vacxin hiện hành với biến chủng mới là rất cấp thiết, mang tính
khoa học và thực tiễn.
Kết quả nghiên cứu của luận án là một phần nội dung của đề tài độc lập
cấp quốc gia mã số ĐTĐL.CN-10/15 "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng
(clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho
việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", do Trung tâm Chẩn đoán Thú y
Trung ương làm đơn vị chủ trì, đề tài đã được nghiệm thu năm 2018.
Trả lời câu hỏi có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng
mới ở đàn gia cầm tại Việt Nam; từ đó xác định một số đặc tính sinh học của biến chủng nhằm khuyến cáo sử dụng vacxin phòng bệnh.
- Xác định được sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn gia
2
cầm tại Việt Nam;
- Xác định được đặc điểm phân tử gen và độc lực của virus cúm A/H5 biến
chủng mới;
- Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của một số vacxin cúm gia cầm hiện
hành đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn
gia cầm tại Việt Nam.
- Địa điểm nghiên cứu được thực hiện ở miền Bắc, miền Trung và miền
Nam, trong đó:
+ Mẫu dịch hầu họng được thu thập trên gia cầm từ các ổ dịch, chợ và trại
chăn nuôi gia cầm tại 11 tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An,
Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh
Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền trên cả nước.
+ Các xét nghiệm và phân tích chuyên sâu thực hiện tại Trung tâm Chẩn
đoán Thú y Trung ương.
+ Các thí nghiệm động vật được thực hiện tại khu nuôi động vật an toàn
sinh học của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
- Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 11/2015 đến tháng 8/2018.
- Đã xác định có sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở 11 tỉnh
(Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên
Huế, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền tại Việt Nam
trong giai đoạn 2015-2018 gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b và A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
- Đã xác định được đặc điểm phân tử gen, độc lực và khả năng gây bệnh của
virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được;
- Đánh giá được khả năng bảo hộ dị chủng của vacxin Navet-vifluvac và Re-5
đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được.
3
- Hiểu biết hơn về sự lưu hành của virus CGC tại các địa phương nghiên cứu.
Làm cơ sở tham khảo cho nghiên cứu tiếp theo về sự biến đổi của virus CGC.
- Làm rõ hơn về một số đặc tính sinh học của virus CGC như: đặc điểm
phân tử gene, độc lực và khả năng gây bệnh trên gia cầm.
- Khuyến cáo lựa chọn vacxin phù hợp với virus A/H5 biến chủng mới
xuất hiện trên đàn gia cầm tại Việt Nam.
- Xác định được sự lưu hành của virus CGC ở 11 tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Kon
Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền tại Việt Nam trong
giai đoạn 2015-2018 gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và
miền Trung; A/H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền Nam; chưa phát hiện virus
cúm A/H5N6 ở miền Nam.
- Xác định được đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
(H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 subclade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b), bao gồm: (1) là virus
thể độc lực cao; (2) mang đặc điểm khác biệt về trình tự gen so với các chủng
virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện hành ở Việt Nam; (3) đặc
hiệu với receptor của gia cầm, gây triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh tích
trên gia cầm mang đặc trưng của bệnh CGC.
- Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 với các
biến chủng (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) không tạo ra trạng
thái miễn dịch vô trùng; (2) làm giảm bài thải virus cường độc; (3) bảo hộ về lâm
sàng hoàn toàn ở vịt, 50 – 80% ở gà.
4
Bệnh cúm ở gia cầm AI (Avian Influenza) là bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtype khác nhau (Ito &
cs., 1998). Trước đây, bệnh CGC còn được gọi là bệnh dịch hạch gà nhưng từ
Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh CGC tại Beltsville - Mỹ năm 1981, tên
bệnh đã được thay thế với tên gọi là bệnh CGC thể độc lực cao (Highly
Pathogenic Avian Inluenza - HPAI) để chỉ các virus cúm type A có độc lực
mạnh, lây lan nhanh, tỷ lệ tử vong cao (Trần Hữu Cổn & Bùi Quang Anh, 2004).
Bệnh CGC HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc độ lây lan rất
nhanh với tỉ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Virus gây bệnh CGC chủ
yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các loại
chim. Virus còn gây bệnh cho cả người và có thể thành đại dịch, vì thế bệnh
CGC ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Lê Văn Năm, 2004; Cục Thú
y, 2005).
Dịch CGC do virus cúm A subtype H5N1 HPAI xuất hiện ở vùng Quảng
Đông, Trung Quốc năm 1996 và lan ra hơn 60 nước trên thế giới ở châu Á,
châu Âu, châu Phi gây nhiều thiệt hại kinh tế do gia cầm bị chết hoặc tiêu hủy để
kiểm soát dịch, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang
người. Bệnh CGC A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm
2003, sau gần hai thập kỷ xuất hiện, virus CGC vẫn là tác nhân nguy hiểm với
đàn gia cầm, các ổ dịch vẫn thường xuyên bùng phát hàng năm gây thiệt hại rất
lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam (Cục Thú y, 2017).
Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate đã mô tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ đại dịch cúm đã được mô tả kỹ và từ đó đến nay đã xảy ra 31 vụ đại dịch được ghi nhận. Trong hơn 100 năm qua đã xảy ra 4 vụ đại dịch cúm vào các năm
1889, 1918, 1957, 1968 (Cục Thú y, 2004).
Năm 1878, ở Italy đã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở đàn gia cầm và
được gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague). Năm1901, Centanni và Savunozzi đã đề cập đến ổ dịch này, xác định được căn nguyên siêu nhỏ qua lọc (Filterable agent) là yếu tố gây bệnh. Đến năm 1955, Achafer đã xác định được
5
căn nguyên gây bệnh thuộc nhóm virus cúm type A thông qua kháng nguyên bề mặt là H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam
Mỹ, châu Phi, Trung Cận Đông (Lê Văn Năm, 2004).
Từ sau khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học đã tăng cường nghiên cứu thấy virus cúm còn có ở nhiều loài chim hoang dã, gia cầm nuôi ở
những vùng khác nhau trên thế giới. Bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra đối với
gia cầm là những chủng gây bệnh độc lực cao thuộc subtype H5 và H7, như ở
Scotland năm 1959 là virus cúm A/H5N1 (Franklin & Wecker, 1950).
Năm 1963, virus cúm type A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ
cầm di trú xâm nhập vào đàn gà. Những nghiên cứu về subtype H1N1 đều cho
rằng virus cúm type A đã có ở lợn và truyền lây cho gà tây. Ngoài ra, virus cúm
subtype H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn (Trần Hữu Cổn & Bùi Quang Anh, 2004;
Trương Văn Dung & Nguyễn Viết Không, 2004; Trương Văn Dung, 2008). Đến
nay, dịch CGC đã xảy ra ở khắp các châu lục với mức độ ngày càng nguy hiểm
hơn đối với các loài gia cầm và sức khoẻ của cộng đồng. Virus CGC liên tục biến
đổi theo thời gian tạo ra các chủng virus mới có sự thay đổi về tính kháng nguyên.
Ở Việt Nam, bệnh CGC do virus cúm A/H5N1 được phát hiện năm 2003
(Trương Văn Dung & Nguyễn Viết Không, 2004). Từ khi xuất hiện lần đầu tiên
tại Việt Nam năm 2003 cho đến năm 2005, bệnh CGC ở tất cả các tỉnh thành trên
cả nước được gây ra chủ yếu do biến chủng virus clade 1 (Wan & cs., 2008;
Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008), bên cạnh đó clade 2.3.2 cũng được phát hiện
năm 2005. Năm 2006, tình hình dịch CGC tạm lắng do các biện pháp làm giảm
nguồn bệnh được áp dụng như cấm ấp nở thủy cầm (loài mang trùng virus CGC) và tiêm phòng vacxin trên phạm vi cả nước cho gia cầm bằng vacxin Re-1 (clade
0). Từ năm 2007 đến giữa năm 2010, có sự khác biệt địa lý về lưu hành của các
biến chủng virus CGC, các clade 2.3.4 dòng Phúc Kiến (sau đó phân chia thành
các subclade 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3) đã chiếm ưu thế ở các tỉnh phía Bắc, trong khi đó, các clade 1 và subclade 1.1 (tiến hóa từ clade 1) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam và sau đó tiếp tục tiến hóa thành clade 1.1.1 và 1.1.2 (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008; Nguyen & cs., 2012). Trong thời gian này, vacxin Re-1
và Re-5 (clade 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc đã được sử dụng, đồng thời một
vacxin trong nước dùng chủng NIBRG-14 (clade 1) được thử nghiệm.
Năm 2008, clade 7 được phát hiện trên gia cầm nhập lậu ở Lạng Sơn và một
6
số chợ ở Hà Nội. Năm 2010-2011, nhiều biến chủng mới đã nổi lên, clade 2.3.2.1 (xuất hiện cuối 2009) trở nên phổ biến vào cuối năm 2010 và tiến hóa thành các
clade 2.3.2.1a,b (Nguyen & cs., 2012) lưu hành ở các tỉnh phía Bắc, các clade
1.1.1 và 1.1.2 tiếp tục lưu hành ở các tỉnh phía Nam. Giữa năm 2012 clade
2.3.2.1c xuất hiện ở miền Bắc, sau đó nhanh chóng lây lan vào miền Trung và miền Nam Việt Nam, các clade 2.3.2.1a,b dần biến mất. Năm 2013, chỉ còn clade
2.3.2.1c lưu hành trên cả nước và clade 1.1.2 vẫn khu trú ở các tỉnh phía Nam.
Đầu năm 2014, các clade 2.3.2.1c và 1.1.2 vẫn là những clade chính gây bệnh
CGC ở Việt Nam, tuy nhiên sau tháng 2 năm 2014, clade 1.1.2 không còn được
phát hiện. Năm 2014, dịch cúm do virus subclade 2.3.4.4 bắt đầu xuất hiện ở
Lạng Sơn vào tháng 4 năm 2014, sau đó lan ra một số tỉnh miền Bắc như Lào Cai
(8/2014), Phú Thọ (9/2014). Virus đã nhanh chóng phát hiện ở một số tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh (6/2014), Quảng Ngãi (8/2014), Quảng Trị (8/2014) (Nguyễn
Đăng Thọ & cs., 2016) (bảng 2.1).
Clade 1, 5 Clade 1, 2.3.2 2005-2006 Clade 1, 2.3.2
Clade 1 Clade 1, 2.3.2 Clade 1, 2.3.4
2007
Clade 1 Clade 1, 2.3.2 Clade 2.3.4.3
2008
1.1b,
2.3.4.1,
Clade 1.1b, 2.3.4.2 Clade 2.3.4.1, 1.1a
2009
2.3.2.1a/b,
Clade 1.1.1, 1.1.2
2010
2.3.2.1a/b,
Clade 1.1.1, 1.1.2
2011
Clade 2.3.4.2, 2.3.4.3, 2.3.4 Clade 2.3.4.2, 2.3.4.3, 7 Clade 2.3.4.3 Clade 2.3.4.2 Clade 2.3.2.1a, 2.3.4.1, 1.1 Clade 2.3.2.1a/b, 1.1.2 Clade 2.3.2.1a/b/c
2.3.2.1a/b,
2012
Clade 1.1.1, 1.1.2, 2.3.2.1c
2013
Clade 2.3.2.1a/b/c Clade 2.3.4.4
2014
Clade 1.1b Clade 2.3.4.1, 1.1.1 Clade 2.3.4.1, 1.1.1 Clade 2.3.4.1, 1.1.2 Clade 2.3.2.1a/c, 1.1.2 Clade 2.3.4.4, 2.3.2.1c
7
Nguồn: Cục Thú y (2014)
Năm 2015-2016, virus cúm A/H5N6 subclade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tiếp tục được phát hiện ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung, virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c
vẫn được phân lập và phát hiện ở các tỉnh phía Nam (Cục Thú y, 2016).
Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể là biến chủng H5N1 đầu tiên trên thế giới (Wu & cs., 2008). Từ đó đến nay, cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch của H5 và N1 đã có nhiều thay đổi. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông năm 1996, Hồng Kông năm 1997 với những
biến đổi sâu sắc gây chết trên cả gia cầm và người bệnh. Toàn bộ đàn gia cầm
của lãnh thổ này đã bị tiêu diệt vì đã gây tử vong cho con người. Như vậy, đây là
lần đầu tiên virus CGC đã vượt “rào cản về loài” để lây cho người ở Hồng Kông làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong đó có 6 người chết (Nguyễn Hoài Tao &
Nguyễn Tuấn Anh, 2004).
Cuối năm 2003 đầu năm 2004, đã có 11 quốc gia ở châu Á đã thông báo
bùng phát dịch CGC thể độc lực cao ở gà và vịt. Sự lây lan nhanh chóng dịch
CGC xảy ra đồng thời ở một số nước đã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu
(Tô Long Thành, 2004). Virus cúm A/H5N1 giai đoạn 2003-2008 về cấu trúc
không thay đổi, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng
nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với
nhiều biến chủng H5N1 trước đây (Subbarao & Luke, 2007; Zhao & cs., 2008).
Từ đầu năm 1997 đến tháng 5 năm 2005, virus cúm A/H5N1 chỉ giới hạn ở vùng
Đông Nam Á (Chen & cs., 2006). Từ cuối 2005, cúm A/H5N1 sau khi lây nhiễm
cho chim hoang dã ở vùng hồ Thanh Hải của Trung Quốc bắt đầu lan sang phía
Tây và một số nước vùng Trung Á, Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng
Tiểu Á, bao gồm: Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc – Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và
Nigieria là các nước chịu thiệt hại nhất (Salzberg & cs., 2007).
Từ cuối năm 2003 đến 2012, dịch CGC A/H5N1 bùng phát tại nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và liên tục bùng phát hàng năm tại nhiều nước trên thế giới. Tính đến tháng 4 năm 2012 đã có tổng cộng 55
nước, vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm làm 250 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu
hủy bắt buộc (WHO, 2008).
Theo thống kê, số người nhiễm CGC H5N1 của các nước báo cáo với Tổ
8
chức Y tế thế giới (WHO) từ tháng 12/2003 đến 01/2014, đã có tới 650 trường hợp mắc cúm H5N1 HPAI, trong số đó 386 trường hợp đã tử vong chiếm tới
59%. Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người nhiễm và tử vong do
virus cúm H5N1 cao nhất trên thế giới. Tổ chức Y tế Thế giới xác định các quốc
gia trên là “điểm nóng” có thể xảy ra dịch cúm mới ở người trong tương lai do virus cúm H5N1 ở đây có được các điều kiện thuận lợi để tiến hoá thích nghi và
lây nhiễm trên người (WHO, 2018).
Dịch CGC do virus cúm A/H5N1 gây ra trên gia cầm đã ảnh hưởng rất lớn
đến đời sống kinh tế xã hội của nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là một số nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Tại những nước này, chăn nuôi gia cầm vẫn chủ
yếu là mô hình chăn nuôi gia đình, nhỏ lẻ và phân tán. Điều đó làm cho việc khống
chế và thanh toán bệnh gặp rất nhiều khó khăn (Tô Long Thành & cs., 2005).
Các nghiên cứu về bệnh CGC đã được công bố như: sự xuất hiện bệnh
CGC HPAI ở Trung Quốc vào năm 1992 (Subbarao & cs., 2003; Chen & cs.,
2006) và ở các nước châu Á từ năm 1997 (Chen & cs., 2007). Các tác giả Việt
Nam cũng đã có những đóng góp về nghiên cứu bệnh CGC trên gà và thủy cầm
(Nguyễn Thị Bích Nga & Lê Thanh Hòa, 2012).
Người có thể nhiễm bệnh từ gia cầm nhiễm virus CGC và có thể dẫn tới tử
vong nếu không được can thiệp kịp thời (Chen & cs., 2006). Từ tháng 12/2003
đến tháng 3/2004, bệnh CGC đã liên tiếp xảy ra với quy mô lớn ở 11 quốc gia và
vùng lãnh thổ châu Á: Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Indonesia, Pakistan, Trung Quốc, Đài Loan và Hồng Kông. Sự lây lan
nhanh chóng dịch CGC xảy ra đồng thời ở một số nước đã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu. Các chủng virus CGC HPAI đã được phân lập và định
type ở Đài Loan là chủng H5N1, H5N2 (Bùi Quang Anh, 2005; Cục Thú y,
2004; Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2004; Phạm Sỹ Lăng, 2004; Tô Long Thành,
2004). Từ đó đến nay, hàng năm dịch đều xảy ra tại nhiều nước trên thế giới với nhiều chủng virus khác nhau. Tính đến hết năm 2017, dịch CGC đã xảy ra tại 46 quốc gia và vùng lãnh thổ tại tất cả các châu lục trong đó chủ yếu tại các quốc gia châu Á. Tình hình dịch CGC trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017 được
nêu trên bảng 2.2.
9
Số quốc gia Chủng virus gây bệnh Năm có dịch
H5N1, H5N2 2004 10
H5N1, H7N7 H5N1, H5N2 2005 2006 17 57
H5N1, H7N3 H5N1, H7N7, H7N3 2007 2008 35 27
H5N1, H7N7 H5N1, H7N7 2009 2010 17 18
2011 2012 2013 16 15 14 H5N1, H5N2 H5N1, H5N2, H7N3 H5N1, H5N2, H7N3, H7N2, H7N7
2014 2015 19 35 H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N3, H7N2 H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N8, H5N9,H7N3, H7N7
2016 43
H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N8, H5N9,H7N3, H7N7, H7N8 H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N8, H5N9,H7N3, H7N7, H7N8
2017 46 H9N2
Như vậy, kể từ khi dịch CGC tái bùng phát trở lại cho tới nay, hàng năm vẫn có rất nhiều quốc gia trên thế giới thông báo đã xảy ra các ổ dịch cúm trên gia cầm. Số lượng quốc gia thông báo có các ổ dịch cúm cao nhất vào năm 2006 với 57 quốc gia sau đó giảm dần. Tuy nhiên kể từ năm 2014 dịch lại có xu hướng tái xuất hiện trở lại tại nhiều nước lần lượt là 19 nước năm 2014, 35 nước năm 2015, 43 nước năm 2016 và 46 nước năm 2017.
Trong số các quốc gia có ổ dịch CGC thì các nước thuộc châu Á đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á thường xuyên xảy ra dịch CGC với các quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Campuchia, Indonesia, Việt Nam… năm nào cũng có dịch CGC xảy ra. Đây được coi là khu vực tồn tại lâu dài các ổ dịch do có nhiều điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh lưu hành như tổng đàn gia cầm lớn, điều kiện thời tiết thuận lợi, phương thức chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lạc hậu (Cục Thú y, 2017).
Bên cạnh sự bùng phát kéo dài của dịch CGC A/H5N1, thì việc xuất hiện nhiều chủng virus gây bệnh mới, đã tạo ra sự phức tạp trong việc quản lý dịch bệnh. Từ đó, đòi hỏi cần có thêm nhiều nghiên cứu nhằm giám định tìm ra các chủng virus mới; nghiên cứu đặc điểm sinh học và thử nghiệm các biện pháp phòng chống dịch bệnh hiệu quả.
10
Nguồn: OIE (2017)
Bệnh CGC xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 (Bùi Quang Anh, 2005) do virus CGC H5N1 HPAI gây ra. Sau đó bệnh liên tục tái
phát và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là vụ Đông - Xuân trong thời điểm có
rất nhiều điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển và gây bệnh.
Kể từ khi dịch xuất hiện, tính đến năm 2015 đã có 5.611 ổ dịch CGC với
khoảng 60 triệu con gia cầm các loại mắc bệnh phải tiêu hủy bắt buộc. Nghiêm
trọng hơn, virus CGC đã lây sang người làm 127 người mắc bệnh, số bệnh nhân tử vong là 64 người (WHO, 2017; Cục Thú y, 2017). Thống kê qua các năm gần đây
thấy rằng dịch CGC do virus cúm A/H5N1 gây thiệt hại lớn đến ngành chăn nuôi
gia cầm, cụ thể:
Trong năm 2011, diễn biến dịch bệnh CGC phức tạp, tăng cả về số
xã/phường lẫn số gia cầm tiêu hủy và số gia cầm bị bệnh. Có 82 xã/phường của
43 huyện/quận thuộc 22 tỉnh/thành phố có dịch. Tổng số gia cầm mắc bệnh lên
đến 110.311 con, trong đó có 39.126 con gà, 70.020 con vịt và 1.165 con ngan.
Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 con, trong đó có 60.787 con gà,
89.204 con vịt và 1.365 con ngan (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013).
Năm 2012 dịch bệnh CGC diễn biến phức tạp hơn với những biến đổi nhiều
về cấu trúc gen và độc lực. Năm 2012 cũng là năm có sự tăng mạnh về số
tỉnh/thành phố có dịch xảy ra, với 32 tỉnh/thành phố mắc dịch. Tổng số 296
xã/phường của 112 huyện/quận có dịch. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu
hủy là 616.109 con trong đó có 117.946 con gà (chiếm 19,14%); 479.859 vịt
(chiếm 77,89%) và 18.304 ngan (chiếm 2,97%) (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013).
Trong năm này có 4 ca mắc bệnh và tử vong 2 người.
Năm 2013 đã xảy ra 104 ổ dịch CGC tại 64 huyện, 31 tỉnh thành trong cả
nước, số gia cầm ốm chết phải tiêu hủy bắt buộc là 141.687 con. Ngoài việc xảy
ra trên đàn gia cầm, trong năm 2013 còn phát hiện ổ dịch CGC A/H5N1 trên chim yến tại Ninh Thuận làm ốm chết và tiêu hủy hơn 4.000 con và trên chim cút tại Tiền Giang với số chim cút phải tiêu hủy hơn 30.000 con. Cùng năm, có 2 ca mắc
bệnh trên người, trong đó có 1 ca tử vong.
Trong năm 2014 đã xảy ra 181 ổ dịch tại 96 huyện, 33 tỉnh trong cả nước,
số gia cầm phải tiêu hủy là 212.780 con. Trong năm này, có 2 ca mắc bệnh ở
người và đều đã tử vong.
11
Tháng 4/2014, phát hiện ổ dịch CGC H5N6 đầu tiên ở nước ta trên đàn gà 80 con của 1 hộ chăn nuôi tại xã Chi Lăng, huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn.
Sau đó các ổ dịch cúm H5N6 tiếp tục được phát hiện tại các tỉnh khác. Đến cuối
tháng 12/2014, cả nước đã xảy ra 7 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 6 xã, 6 huyện của 6
tỉnh trong cả nước là Lạng Sơn, Hà Tĩnh, Lào Cai, Quảng Trị, Quảng Ngãi và Quảng Nam làm 17.188 con gia cầm mắc bệnh phải tiêu hủy bắt buộc. Ngoài ra
trong quá trình giám sát chủ động, virus cúm A/H5N6 cũng được phát hiện tại
các tỉnh Phú Thọ, Bắc Giang, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam (Cục
Thú y, 2014).
Năm 2015, dịch CGC H5N6 đã xảy ra tại 23 xã, 18 huyện của 12 tỉnh trong
cả nước là Đắk Nông, Hà Nam, Lai Châu, Lào Cai, Nam Định, Nghệ An, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Hải Phòng, Sơn La, Thái Bình và Tuyên Quang làm ốm chết
và phải tiêu hủy bắt buộc 34.624 con gia cầm các loại trong đó có 17.509 con gà,
7.052 thủy cầm và 10.063 con chim cút (Cục Thú y, 2015).
Trong năm 2016, dịch xảy ra tại 7 xã, của 6 huyện, thuộc 5 tỉnh (Tuyên
Quang, Lạng Sơn, Nghệ An, Quảng Ngãi, Kon Tum). Số gia cầm mắc bệnh là
5.189 con (gà 4.655 con, chiếm 89,70% tổng số mắc bệnh và vịt, ngan là 534 con, chiếm 10,30%); số gia cầm tiêu huỷ là 13.550 con, bao gồm cả gia cầm khỏe
mạnh trong cùng đàn mắc bệnh (gà chiếm 91,90% trong tổng số chết, vịt chiếm
8,10%). So với năm 2015, tình hình dịch bệnh CGC A/H5N6 đã giảm cả về diện
dịch và mức độ dịch, cụ thể: số xã có dịch giảm 3 lần, số huyện có dịch giảm 2,83
lần, số tỉnh có dịch giảm 2,2 lần và số gia cầm chết và tiêu huỷ giảm 2,13 lần.
Năm 2017, toàn quốc xảy ra 40 ổ dịch cúm A/H5 (34 ổ dịch gây ra do virus cúm A/H5N1 và 6 ổ dịch do virus cúm A/H5N6; trung bình mỗi ổ dịch có 1258
con gia cầm mắc bệnh) tại 83 hộ chăn nuôi gia cầm tại 31 huyện thuộc 21 tỉnh,
thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 50.316 con (gà 25.198 con, chiếm
50,08% tổng số gia cầm mắc bệnh; vịt 24.665 con, chiếm 49,02%; ngan 453 con chiếm 0,9%) và số gia cầm tiêu huỷ là 73.835 con (gà 36.965 con, chiếm 50.08% tổng số gia cầm tiêu huỷ; vịt 36.388 con, chiếm 49,28%; ngan 482 con, chiếm 1,30%). Ngoài ra, một số địa phương có một số ổ dịch và đã được các cơ quan
liên quan của địa phương phát hiện và xử lý kịp thời. So với năm 2016, diện dịch
và mức độ dịch đều tăng, cụ thể: số ổ dịch tăng 2.86 lần, số huyện có dịch tăng
2.58 lần, số tỉnh có dịch tăng 3 lần, số gia cầm mắc bệnh tăng gần 5.05 lần (Cục
Thú y, 2017).
12
Cúm A/H5N1:
Trong năm 2017, toàn quốc đã xảy ra 34 ổ dịch cúm A/H5N1 tại 27 huyện
thuộc 17 tỉnh, thành phố (Cao Bằng, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hà Nam, Nam
Định, Hà Tĩnh, Nghệ An, Đắk Lắk, Đắk Nông, Sóc Trăng, Cần Thơ, An Giang, Bạc Liêu, Vĩnh Long, Hậu Giang, Đồng Nai, Tây Ninh). Số gia cầm mắc bệnh là
39.636 con (gà 22.918 con, chiếm 57,82% tổng số gia cầm mắc bệnh; vịt 16.265
con, chiếm 41,04%; ngan 453 con, chiếm 1,14%) và số gia cầm tiêu hủy là
56.125 con (gà 34.465 con, chiếm 61,41% tổng số gia cầm tiêu hủy; vịt 21.178
con, chiếm 37,73%; ngan 482 con, chiếm 0,86%).
Trong năm 2018 - 2019, virus CGC A/H5N1 phân bố tập trung chủ yếu tại khu
vực Đồng bằng sông Cửu Long. Phân tích đặc tính di truyền của các chủng virus
CGC A/H5N1 cho thấy virus CGC A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1 bao gồm các nhánh
phụ 2.3.2.1c và 2.3.2.1e (Cục Thú y, 2020).
Trong năm 2019- 2020, virus CGC A/H5N1 clade 2.3.2.1c phân bố tập trung
chủ yếu tại các tỉnh phía Nam. Kết quả giải trình tự gen giám sát tại ổ dịch và chợ từ
01/2019 - 05/2020 cho thấy các nhánh virus không có biến đổi lớn về di truyền (Cục
Thú y, 2020).
Cúm A/H5N6:
Trong năm 2017, toàn quốc đã xảy ra 6 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 5 huyện
thuộc 5 tỉnh (Cao Bằng, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Ngãi và Kon Tum).
Số gia cầm mắc bệnh là 10.680 con (gà 2.280 con, chiếm 21,35% tổng số gia
cầm mắc bệnh; vịt 8.400 con, chiếm 78,65%) và số gia cầm tiêu hủy là 17.710
con, bao gồm cả gia cầm khỏe mạnh trong cùng đàn mắc bệnh (gà 2.500 con,
chiếm 14,12% tổng gia cầm tiêu hủy; vịt 15.210 con, chiếm 85,88%). Đầu năm
2018 phát hiện ổ dịch cúm H5N6 ở Hải Phòng.
Trong năm 2018 - 2019, virus CGC A/H5N6 phân bố rộng khắp trên phạm vi
cả nước. Virus CGC A/H5N6 clade 2.3.4.4 bao gồm các nhánh phụ: 2.3.4.4h,
2.3.4.4f và 2.3.4.4g (Cục Thú y, 2020).
Trong năm 2019 - 2020, chủng virus CGC A/H5N6 phân bố ở nhiều địa phương trên phạm vi cả nước. Kết quả giải trình tự gen của chủng virus cúm
A/H5N6 lấy từ các chợ và ổ dịch từ 01/2019 - 05/2020 cho thấy các nhánh virus CGC không có biến đổi lớn về di truyền: virus CGC A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4g và 2.3.4.4h. Trong đó, nhánh 2.3.4.4g lưu hành tại các tỉnh miền Trung
13
và miền Nam, nhánh 2.3.4.4h lưu hành tại các tỉnh miền Bắc và miền Trung (Cục
Thú y, 2020).
Như vậy, dịch CGC đã xảy ra ở nhiều tỉnh thành trên cả nước. Bệnh đã và
đang gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi gia cầm. Những luận giải nói trên cho thấy, việc nghiên cứu về sự lưu hành của virus CGC ở Việt Nam là vấn đề rất
cần thiết.
Virus cúm được phân lập ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời,
thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt đuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu. Tần suất và số lượng virus phân lập được ở thủy cầm, đặc biệt vịt trời đều
cao hơn các loài khác (Bùi Quang Anh & Văn Đăng Kỳ, 2004).
Kết quả điều tra thủy cầm ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm
virus do tập hợp đàn trước khi di trú. Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và
N của các phân type virus cúm A diễn ra ở chim hoang dã, virus không gây độc
đối với vật chủ, được nhân lên ở đường ruột của chim khiến cho các loài này mang virus và là nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm
(Alexander, 2000).
Đã có nghiên cứu phát hiện nhiều virus cúm từ những loài vịt đi đầu trong
mùa di trú, sau khi xuất hiện đã gây ra dịch ở gà tây. Vịt từ khi bị nhiễm đến khi
bắt đầu thải virus trong vòng 30 ngày. Dường như virus được duy trì trong số
đông vịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyền cho các con non theo đường tiêu hóa do virus bài thải theo phân, gây ô nhiễm ao, hồ (Bùi Quang Anh
& Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004).
Gà, ngan, vịt, chim cút mọi lứa tuổi đều mắc cúm nhưng bệnh thường mắc
ở 4- 6 tuần tuổi: gia cầm dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao nhất ở nơi bệnh phát ra
lần đầu và giai đoạn sắp đẻ hoặc thời kỳ đẻ cao nhất; gia cầm có khả năng sản
xuất càng cao thì càng mẫn cảm với virus; gia cầm mái dễ bị nhiễm hơn trống; gia
cầm non và già mẫn cảm với mầm bệnh hơn con trưởng thành (Suarez & Pantin-
Jackwood, 2008).
Không chỉ đối với loài chim, virus có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú khác như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi... và cả con người. Nhiều nghiên cứu
14
mới đây cho thấy loài mèo, vốn được coi là không cảm nhiễm với cúm, cũng mắc bệnh và chết (Beard & cs., 1991).
a. Cơ chế sinh bệnh
Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus cúm tiếp cận tế bào đích (chủ yếu là tế bào biểu mô đường hô hấp) và bắt đầu quá trình nhân lên. Kết quả là số lượng virus tăng nhanh, tải lượng virus cao làm cho tế bào nhiễm bị phá hủy hàng loạt do bị dung giải trực tiếp hoặc mất trạng thái cân bằng vốn có của chúng, gây tổn thương không chỉ đường hô hấp mà còn gây tổn thương sâu ở các phế nang và phế quản nhỏ dẫn đến suy giảm hô hấp khiến sức đề kháng của cơ thể giảm sút rõ rệt, làm kế phát các bệnh do vi khuẩn, virus khác, từ đó có thể gây tử vong nhanh (Cinatl & cs., 2007; Korteweg & Gu, 2008). Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở động vật được quyết định bởi khả năng nhân lên nhanh của virus và khả năng tác động đến nhiều loại mô bào của vật chủ (Maines & cs., 2005). Sinh bệnh học của virus ở người phụ thuộc chủ yếu vào các yếu tố như: sự tương tác giữa virus với các hàng rào sinh học, loại tế bào đích, quá trình viêm và sự rối loạn điều hòa miễn dịch (Cinatl & cs., 2007).
15
Nguồn: Korteweg & Gu (2008)
Có nhiều yếu tố liên quan đến sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 (Korteweg & Gu, 2008). Sự kết hợp giữa các yếu tố đó sẽ quyết định mức độ tổn
thương mô bào và sự trầm trọng của bệnh. Rối loạn điều hòa cytokine và
chemokine có thể là một trong những cơ chế chủ yếu trong sinh bệnh học của
virus cúm A/H5N1. Cơ chế sinh bệnh của virus cúm A/H5N1 được tóm lược và trình bày ở hình 2.1.
b. Sự truyền lây virus
Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và
đường tiêu hóa. Sự truyền lây của bệnh được thực hiện theo 2 phương thức:
- Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông
qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn, nước
uống bị nhiễm virus.
- Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần
hoặc những dụng cụ chăn nuôi, phân, thức ăn, nước uống, quần áo, giầy dép,
phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, côn trùng có mang mầm bệnh.
Như vậy, virus cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con người, phương tiện
vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi. Phần lớn các ổ dịch đều ghi nhận có sự tiếp xúc với thủy cầm tại thời điểm phát dịch đầu tiên. Từ người và các động vật có
vú khác, phần lớn các ổ dịch CGC gần đây đã có sự lây lan thứ cấp thông qua con
người (Bùi Quang Anh & Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004).
Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm A/H5N1, tùy thuộc vào độc lực của chủng virus cảm nhiễm mà chúng có thể không mắc bệnh, mắc ở mức độ nhẹ hoặc rất
trầm trọng. Triệu chứng lâm sàng của CGC thay đổi và bị chi phối bởi độc lực
của virus, loài vật cảm nhiễm, tuổi, thời gian tác động, kế phát do vi khuẩn và
điều kiện môi trường (Beard, 1998). Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 21 ngày, có trường hợp kéo dài đến 28 ngày. Gia cầm bệnh có biểu hiện: sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, phù đầu và mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy
nước ở mỏ.
Gia cầm khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô
hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ
thức ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu hiện hen, khó thở, ủ rũ, rối loạn thần
kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường.
16
Những triệu chứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ (Tô Long Thành, 2004). Trong trường hợp quá cấp tính, gây chết đột ngột, triệu chứng lâm
sàng không biểu hiện, gia cầm chết chỉ sau vài giờ khi có tác động của mầm bệnh.
Toàn các ca bệnh cấp tính hoặc quá cấp tính đều bị chết, có khi lên đến gần 100%.
Trường hợp quá cấp tính gia cầm chết xuất hiện chỉ 24 giờ sau khi có triệu chứng đầu tiên và thường kéo dài trong khoảng 48 giờ. Gia cầm đẻ nhiễm bệnh, trứng đẻ ra
thường không có vỏ trứng bên ngoài.
Đối với người, sau khi nhiễm virus cúm, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày. Lúc đầu bệnh nhân sốt cao 390C và kéo dài từ 1 đến 3 ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho sổ mũi, nhức đầu, có thể tiến tới khó thở rồi ngạt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác. Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỷ lệ tử vong rất cao cả ở người và gia cầm, người có thể nhiễm cả đường hô hấp trên và dưới (Hui, 2008). Trong trường hợp không xảy ra các biến chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong vòng một tuần. Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong, đó là trường hợp bị biến chứng đi kèm do virus hoặc vi khuẩn hoặc cả hai (Bauer & cs., 2006).
Bệnh tích đại thể ở các loài khác nhau có biểu hiện khác nhau. Đối với gà bệnh tích thường gặp bao gồm: mào, tích sưng to, mí mắt phù thũng. Ở thể nhẹ bệnh tích ở các xoang trong cơ thể đặc trưng bởi viêm cata, lắng đọng fibrin, có mủ hoặc hình thành casein. Có thể phù ở niêm mạc khí quản với dịch thẩm xuất khác nhau từ thanh dịch đến casein. Viêm xoang bụng cata hoặc fibrin, có thể viêm dính buồng trứng với xoang bụng. Ống dẫn trứng ở gà mái đẻ thường xuất huyết nặng, xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ, xuất huyết điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng, xuất huyết hầu hết đường tiêu hóa, đặc biệt thấy rõ ở manh tràng, dạ dày tuyến. Tụy thường sưng to, có những vạch vàng hoặc đỏ sẫm theo chiều dọc. Túi Fabricius ở gà sung huyết và xuất huyết, bệnh tích này giống với bệnh tích của bệnh Newcastle (Alexander, 1999; Lê Văn Năm, 2004). Các biến đổi bệnh lý của bệnh CGC trên ngan và vịt về cơ bản cũng giống như ở gà. Tuy nhiên tần suất biến đổi tập trung ở phổi, túi khí, tim, buồng trứng, xương lồng ngực, cơ quan sinh sản và đường ruột (Lê Văn Năm, 2004). Chi tiết bệnh tích đại thể được thể hiện qua bảng 2.3.
17
Bệnh tích TT Cơ quan Đại thể Vi thể
1 Mào, tích, Thâm tím, phù nề, xuất huyết
2 Lỗ huyệt Xuất huyết
3 Cơ đùi, cơ lườn, bề mặt Xuất huyết
niêm mạc, mỡ bụng Mạch quản
4 Chân Xuất huyết dưới da chân thành vệt đỏ giãn rộng và
5 Khi quản Xuất huyết, có dịch đờm thâm nhiễm
tế bào bạch 6 Xoang miệng, mũi Chứa nhiều dịch nhầy
cầu đơn Phù, sung huyết, xuất huyết, viêm fibrin 7 Phổi
nhân xung 8 Dạ dày tuyến, dạ dày cơ Xuất huyết
quanh mạch Xuất huyết tá tràng, manh tràng, màng 9 Ruột
quản, sung treo ruột
huyết, xuất 10 Buồng trứng, ống dẫn trứng Viêm, xuất huyết
huyết 11 Lách Biến màu lốm đốm vàng, rắn chắc hơn
bình thường
Bao tim tích nước vàng, xuất huyết 12 Tim
màng bao tim, mỡ vành tim, cơ tim
Khô ròn, xuất huyết 13 Tụy
14 Túi Fabricius Sưng, phù, xuất huyết
Sung huyết 15 Não
Các tổn thương đại thể bao gồm phù dưới da, thận lốm đốm, xuất huyết điểm
trên bề mặt thanh dịch, sung huyết toàn thân, sung huyết phổi, xuất huyết và phù
phổi, sung huyết kết mạc và xuất huyết đường tiêu hóa. Các tổn thương mô học
bao gồm mất tế bào lông rung ở đường hô hấp, viêm phổi kẽ, tạo vành quanh mạch
ở não, tăng thần kinh đệm, viêm màng não bạch huyết, viêm não và màng não, hư
thận, viêm thận, viêm cơ tim, viêm cơ, suy giảm và hoại tử tế bào bạch huyết ở túi
Fabricius, lách, tuyến ức và hạch ruột tịt. Hoại tử được quan sát thấy ở biểu mô
ruột, tuyến tụy, lách, tuyến thượng thận, ống thu, các ống gần và xa của thận, tim,
túi Fabricius và cơ xương (Bui & cs., 2014).
18
Nguồn: Lê Văn Năm (2004)
Ở người, virus xâm nhập niêm mạc phế quản phế nang, nhân lên gây hủy hoại
biểu mô túi khí, gây sung huyết, xuất huyết và tràn dịch phổi ở bệnh nhân nhiễm
cúm. Mặt khác virus có khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não, và có thể xuyên
qua nhau thai xâm nhập vào bào thai. Mất cân bằng điều hòa miễn dịch do hiện
tượng tăng cytokine không kiềm chế gọi là “bão cytokine” (cytokine storm) thường
xảy ra dẫn đến cơ thể bị suy sụp và tử vong (Korteweg & Gu, 2008).
Bệnh tích vi thể chủ yếu là sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu ở
não và một số cơ quan khác. Mạch quản các cơ quan như: mào, tích, lách, gan,
phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não và một số cơ quan khác bị giãn rộng và thâm
nhiễm tế bào xung quanh mạch quản (Beard, 1998). Chi tiết bệnh tích vi thể được
thể hiện qua bảng 2.3.
Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ như bệnh lây lan nhanh, gia cầm mắc ở mọi
lứa tuổi, nhiều loại gia cầm mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc
bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vacxin
cúm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng
nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp.
Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đoán. Căn cứ
những triệu chứng điển hỉnh như: sốt cao, bỏ ăn, ủ rũ, ỉa chảy phân trắng xanh,
có triệu chứng thần kinh, khó thở…
Căn cứ những bệnh tích điển hỉnh như: phổi, gan, thận, lách sưng to; chân
xuất huyết thành vệt; xuất huyết mỡ vành tim; phù đầu và mí mắt; ỉa chảy. Xuất
huyết dạ dày cơ và dạ dày tuyến giống với bệnh Newcastle, xuất huyết điểm ở
ruột, sưng hạch ruột. Túi Fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết. Xuất
huyết và hoại tử tuyến tụy, tuyến tụy chuyển màu vàng có các vệt sẫm màu. Phù
keo nhầy và xuất huyết cơ đùi. Chảy máu lỗ chân lông, máu không đông hoặc
khó đông (Beard, 1998; Alexander, 1999). Trong trường hợp gia cầm chết do
bệnh ở thể quá cấp tính thì biểu hiện bệnh tích thường không điển hình.
19
Bệnh CGC có triệu chứng bệnh tích rất đa dạng, nếu chỉ dựa trên các đặc
điểm lâm sàng thì kết quả chẩn đoán có độ chính xác không cao, trừ trường hợp
trong giai đoạn xảy ra dịch. Muốn chẩn đoán chính xác bệnh CGC và bệnh cúm ở
người, thì cần phải thực hiện chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. Các xét nghiệm
sẽ phát hiện sự hiện diện của virus cúm trong cơ thể bệnh như: phản ứng ngăn trở
ngưng kết hồng cầu (HI), test chẩn đoán nhanh, các chẩn đoán xác định dựa vào
các xét nghiệm huyết thanh học và phân lập virus (Nicholson & cs., 2003; OIE,
2005) (hình 2.2).
Có thể sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hay phản ứng
ELISA để tìm kháng thể trong máu gia cầm. Tuy nhiên, trong điều kiện thực tế
hiện nay, sử dụng các phản ứng này để chẩn đoán là không còn phù hợp. Vì khi
xác định được trong huyết thanh chẩn đoán có kháng thể virus CGC nhưng có thể
do gia cầm đã đáp ứng miễn dịch với vacxin hoặc đã có sự xâm nhập của mầm
bệnh vào cơ thể gây đáp ứng miễn dịch, nhưng mầm bệnh đã bị đào thải khỏi cơ
thể (FAO, 2004). Vì vậy, để xác định bệnh một cách chắc chắn cần phải xác định
sự có mặt của căn nguyên gây bệnh CGC. Phương pháp chẩn đoán bệnh CGC rất
hiệu quả và có độ chính xác cao là phương pháp phân lập virus. Nhưng trở ngại
đối với phương pháp này là đòi hỏi kỹ thuật tương đối nghiêm ngặt: phôi từ gà
mái chưa có miễn dịch, là gà nuôi ở trạng thái cô lập bệnh đặc hiệu (gà SPF)
(FAO, 2004) nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng thực hiện được.
Các phương pháp Real-time PCR và reverse transcription-PCR (RT-PCR),
kể cả PCR đa gen (multiplex-PCR), trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A
và cúm A/H5 từ mẫu bệnh phẩm, gần đây đã được đưa vào ứng dụng, cho phép
chẩn đoán xác định và phân biệt sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây
bệnh, có độ chính xác và tin cậy cao chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm (OIE,
2005; Wu & cs., 2008). Đây là những phương pháp phát hiện virus phổ biến nhất
hiện nay và rất nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam đã có khả năng thực hiện.
Chẩn đoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà có phôi ấp 9-10
ngày hoặc trên môi trường tế bào xơ phôi. Giám định virus trong dịch nuôi cấy
bằng các phản ứng HA, HI.
20
Đặc điểm dịch tễ học Kiểm tra lâm sàng
Lấy mẫu bệnh phẩm
(Huyết thanh, Phủ tạng, …)
Phát hiện kháng thể Phát hiện kháng nguyên
Phân lập virus
PCR, RT- PCR
(+) (-)
(-) (+)
Giám định (HI) Phân lập lần 2 Phân lập virus
Kết luận bệnh :
Nguồn: Bộ Khoa học và Công nghệ (2014)
Phân bố trên bề mặt của virus là loại protein gây ngưng kết hồng cầu có tên gọi
là Hemagglutinin (HA) và một loại protein có chức năng là enzim phá hủy thụ thể
của virus có tên gọi Neuraminidae (NA), chúng là các glycoptein riêng biệt
(Kawoaka, 1988).
Hạt virion có cấu trúc là axit ribonucleic sợi âm ở dạng đơn, độ dài
13.500 nucleotit chứa 8 phân đoạn kế tiếp nhau mã hóa cho 10 loại protein
khác nhau của virus là HA, NA, NP, M1, M2, BP1, BP2, PA, NS1, NS2. Tám
phân đoạn của sợi RNA có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp
điện di (hình 2.3).
21
- Phân đoạn 1 - 3: mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein có
chức năng là enzym polymerase tổng hợp axit Ribonucleic nguyên liệu cho hệ
gen và các ARN thông tin tổng hợp protein của virus (Biswas, 1996).
- Phân đoạn 4: mã hóa cho protein Hemagglutinin (HA) là một protein bề
mặt cắm gốc vào bên trong, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, gây
ngưng kết hồng cầu, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào
phản ứng trung hòa virus. HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với
nhau bằng đoạn oligopeptit ngắn, thuộc loại hình mô typ riêng đặc trưng cho các
subtyp H (H1 - H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng (Bosch, 1979; Vey &
cs., 1992). Mô typ của chuỗi oligopeptit này chứa một số axit cơ bản làm khung,
thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtype H. Sự thay đổi thành phần của
chuỗi nối quyết định độc lực của virus thuộc biến chủng mới (Bosch, 1979;
Holsinger, 1994).
- Phân đoạn 5: mã hóa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein
được phosphoryl hóa, có biểu hiện tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm
(Group - Specific), tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân đoạn
ARN nên loại NP còn gọi là Ribonucleo protein (Buckler & Muphy, 1998).
- Phân đoạn 6: mã hóa cho protein enzym Neuraminidae (NA), có chức
năng là một enzym phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào nhiễm. Phân
đoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein, giúp giải phóng ARN virus từ
endosome và tạo hạt virus mới (Castrucci & cs., 1993).
- Phân đoạn 7: mã hóa cho 2 tiểu phần protein đệm (Matrix protein) M1 và
22
Nguồn: Muphy (1996)
M2 là protein màng không được glycosyl hóa, có vai trò làm đệm bao bọc lấy ARN hệ gen. M2 là một tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau
khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 có chức năng tham gia vào quá trình
tổng hợp và nảy mầm của virus (Horimoto & Kawaoka, 1994).
- Phân đoạn 8: có độ dài ổn định (890 nucleotit) mã hóa cho 2 tiểu phần
protein không cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết
hợp với M1, kích thích phiên mã, chống interfron (Luong & Palese, 1992).
Kháng nguyên của virus cúm diễn biến hết sức phức tạp do hiện tượng tái
tổ hợp các thành phần cấu trúc của chủng này với chủng khác hoặc biến đổi từ
chủng vô độc thành chủng có độc lực cao hơn và gây bệnh. Sự đột biến của từng
thành phần và loại hình kháng nguyên trong từng chủng virus cúm cũng góp
phần tạo nên cấu trúc kháng nguyên mới, tạo các loại biến chủng với các đặc tính
gây bệnh mới.
Các loại protein kháng nguyên: protein nhân (NP), protein đệm (matrix
protein – M1), protein HA, protein enzyme cắt thụ thể (NA) là những protein
kháng nguyên được nghiên cứu nhiều nhất.
Một trong những đặc tính kháng nguyên quan trọng của virus cúm là khả
năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài động vật mà thực chất là sự kết hợp
giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus với thụ thể có trên bề mặt
hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo mạng lưới ngưng kết qua các
cầu nối virus. Từ đặc tính kháng nguyên này có thể sử dụng các phản ứng ngưng
kết hồng cầu HA và ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI trong chẩn đoán CGC.
Sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên mà virus cúm có được là do sự
biến đổi và trao đổi kháng nguyên trong nội bộ gen và giữa gen hemagglutinin
(HA) và gen neutraminidase (NA).
Sự biến đổi chính nội bộ gen hay biến dị ngẫu nhiên (drift) mà bản chất là sự
thay đổi nucleotid trong đoạn gen là biến dị xảy ra liên tục thường xuyên trong quá
trình tồn tại của virus cúm. Chính nhờ sự biến đổi này cho phép virus cúm A tạo
nên 18 biến thể gen HA (H1 đến H18) và 9 biến thể gen NA (N1 đến N9) (Cục
Thú y, 2013).
Cũng nhờ hiện tượng Drift của virus cúm có thể lý giải được không phải
23
mọi H1, H5 hay Hx hoặc N1, N2, hay Nx đều giống nhau. Sự khác nhau trong
chính các Hx hay Nx do biến dị ngẫu nhiên tạo nên tính thích ứng với từng loài
vật chủ khác nhau và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau ở chính mỗi loại hình
tái tổ hợp HA và NA.
Bên cạnh hiện tượng Drift, sự biến đổi hệ gen của virus cúm A còn được
diễn ra nhờ hiện tượng tái tổ hợp gen - hiện tượng thay ca (Shift) ít xảy ra hơn,
hiện tượng này chỉ xảy ra khi hai hay nhiều virus cúm cùng nhiễm vào tế bào.
Tuy nhiên chỉ xuất hiện với tần suất rất thấp nhưng khi hiện tượng tái tổ hợp gen
xảy ra sẽ gây ra dịch lớn cho người và động vật, với mức độ nguy hiểm không
thể lường trước được. Hiện tượng Shift ở virus cúm A cho thấy nguy cơ của sự
lưu hành đồng thời nhiều loại virus cúm với số lượng lớn trong cùng một không
gian và thời gian kéo dài.
Về mặt lý thuyết, khi xâm nhập vào cơ thể động vật, virus cúm A sẽ tạo nên
sự hình thành của các kháng thể đặc hiệu, trong đó quan trọng hơn cả là kháng
thể kháng HA, chỉ có loại kháng thể này mới có thể trung hòa virus cho bảo hộ
miễn dịch. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus:
kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản giải phóng virus, kháng thể kháng M2
có tác dụng ngăn cản chức năng protein M2 không cho quá trình bao gói virus
xảy ra.
ARN của virus chiếm 0,8 - 1,1%; protein chiếm 70 - 75%; lipit chiếm 20 -
24%; hydratcacbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt virus.
Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipit có gốc phospho, số còn lại là
cholesterol, glucolipit và một ít hydrocacbon gồm các loại men galactose, ribose,
fructose, glucosamin. Thành phần chính protein của virus chủ yếu là glycoprotein
(Lê Văn Năm, 2004).
Virus CGC bắt đầu sự gây nhiễm và nhân lên của chúng bằng sự bám gắn
vào các axit neuraminic (axit sialic, SA) trên bề mặt của các tế bào chủ (hình
2.6). Protein HA của virus bám gắn vào tế bào vật chủ thông qua các thụ thể axit
sialic đặc biệt. Phân tử axit sialic được đặt tên là α2-3 và α2-6 tùy thuộc vào
thành phẩn hóa học của chúng (N-acetylneuraminic acid hoặc N-glyconeraminic
24
acid) và mối liên kết đường galactose với α2-cabon. Nhìn chung, các virus CGC
chủ yếu bám gắn với thụ thể axit-sialic có liên kết α2-3 (SA α2-3 Gal), trong khi
đó virus cúm người ưa thích bám gắn vào thụ thể axit-sialic có α2-6 Gal. Trong
thực tế thụ thể axit sialic α2-3 Gal có mặt ở biểu mô ruột của vịt (Ito & cs.,
2000), còn α2-6 Gal có mặt chủ yếu ở biểu mô đường hô hấp trên của người. Tuy
nhiên, một điều nên nhớ rằng tính đặc hiệu virus không phải là tuyệt đối cũng
như tế bào người và gia cầm có thể mang cả 2 loại liên kết axit sialic (Knipe &
Howley, 2007). Các nghiên cứu về tế bào lông rung ở đường hô hấp dưới của
người cho thấy rằng mối liên kết α2-3 axit sialic có mặt ở những tế bào này và
chúng có thể bị nhiễm virus CGC (Shinya & cs., 2006). Ái lực khác nhau của các
phân tử HA đối với các thụ thể axit sialic là một yếu tố quan trọng đối với vật
chủ. Khi bám gắn vào bề mặt tế bào, virus được đưa vào trong tế bào vật chủ bởi
sự nhập bào qua trung gian thụ thể. Trong quá trình nhập bào, M2 cho phép các
proton tràn vào làm môi trường trở nên axit. Độ pH thấp trong nội bào khiến cho
hình thái của phân tử HA thay đổi, điều này gây ra sự dung hợp màng tế bào và
màng virus, giải phóng vRNP vào bào tương (Knipe & Howley, 2007). Cuối
cùng, các vRNP được vận chuyển vào trong nhân thông qua các lỗ nhân ở đây
chúng làm khuôn mẫu cho quá trình sao chép (Knipe & Howley, 2007). Bên
trong nhân, phức hợp polymerase bắt đầu quá trình sao chép sơ cấp bằng hiện
tượng tóm nắp. Đầu tiên, Phức hợp RNA phụ thuộc RNA của virus phiên mã
RNA của virus thành mRNA. Đầu 5’ của RNA virus gắn vào tiểu phần PB1 để
PB2 nhận diện và bám vào tiền mRNA đó (Fechter & Brownlee, 2005).
Sự thay đổi này ở polymerase dẫn đến sự gia tăng ái lực của PB1 đối với
25
Nguồn: Neumann & cs. (2009)
đầu 3’ của RNA virus hình thành lên một kép hợp. Sau đó PB1 sử dụng hoạt
động nội nhân của nó, bẻ gãy các mRNA, khởi động quá trính sao chép và kéo
dài chuỗi. Sự tổng hợp mRNA của virus được hoàn thành với sự polyadenylation
ở đầu 3’ của RNA mới tổng hợp. Các đoạn RNA của virus cúng được dùng làm
khuôn mẫu để sản xuất cRNA mà không cần primer gắn nắp. Trong trường hợp
này, một bản sao chính xác của bộ gen RNA virus được tạo ra. Khi cRNA dương
cực được tạo ra, nó được sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp các bản sao RNA
âm cực của virus. Sau đó protein NP được cần đến để chặn men tổng hợp RNA
của virus hình thành đuôi poly (A) giúp cho quá trình sao chép được hoàn chỉnh.
Các enzyme tế bào được sử dụng để ghép nối mRNA cho M1 và M2 cũng như
NS1 và NS2. Khi protein M1 tích tụ trong nhân, nó tương tác với RNA di truyền
của virus và ức chế sự sao chép thêm. Bộ máy tế bào vật chủ được sử dụng để
phiên mã protein từ mRNA trong bào tương. Khi sự nhân lên của virus xảy ra, các
phức hợp RNP được vận chuyển ra khỏi nhân với sự hỗ trợ của M1, NEP/NS2 và
một thụ thể xuất khẩu CRM1 cho sự lắp ráp của virus. Những cái đuôi của HA và
NA trong bào tương có chức năng tương tác với M1 trong việc lắp ghép của virus
và để đảm bảo hình dạng đúng và đóng gói nhân di truyền của virus. Các nghiên
cứu cho thấy rằng RNP của virus được hợp nhất vào hạt virus bằng một quá trình
có kiểm soát đòi hỏi những tín hiệu mã hóa cụ thể bên trong mỗi đoạn gen. Các
virus cúm lắp ghép tại màng tương bào ngoài cùng, tại đây các virus đâm chồi và
giải phóng (Knipe & Howley, 2007).
Theo nhiều tác giả sau khi vào cơ thể, virus cúm tiếp cận với các tế bào đích
xâm nhập và giải phóng vật chất di truyền. Virus sử dụng các cơ quan trong tế
bào và nguồn nguyên liệu của tế bào để tổng hợp nên protein và ARN đặc trưng.
Các protein kết hợp với ARN virus tạo thành hạt virus và được giải phóng ra
ngoài. Tế bào chủ không bị dung giải, nhưng sẽ chết đi do mất trạng thái cân
bằng vốn có, đồng thời bị đầu độc bởi các sản phẩm sinh ra. Số lượng virus tăng
lên ngày càng nhanh theo cấp số nhân. Tế bào đích bị phá huỷ hàng loạt. Sự suy
giảm hô hấp khiến sức đề kháng của cơ thể giảm sút, làm kế phát các bệnh vi
khuẩn, virus khác (Alexander, 1993).
26
Độc lực của các chủng virus CGC có sự dao động lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA. Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cho thấy khả
năng lây nhiễm của virus phụ thuộc vào tác động của enzym protease vật chủ đến sự phá vỡ của liên kết hóa học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất
là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Tính thụ cảm của ngưng
kết tố và sự phá vỡ liên kết của enzym protease lại phụ thuộc vào số lượng các
axit amin gốc bazơ tại điểm bắt đầu phá vỡ các liên kết. Các enzym giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử arginin, trong khi đó các enzym
protease khác lại cần nhiều axit amin gốc bazơ, vì thế đánh giá độc lực của virus
trên cơ sở gây nhiễm cho gia cầm và sau đó phân tích sự sắp xếp các axit amin của
các virus (Trần Hữu Cổn & Bùi Quang Anh, 2004).
Để đánh giá độc lực của virus cúm một cách khoa học, các nhà nghiên cứu
sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch
0,2 ml nước trứng đã được gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh
giá mức độ nhiễm bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI). Điểm tối đa là 3 điểm và
đó là virus có độc lực cao nhất. Theo quy định của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE),
virus nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại có độc lực cao (OIE, 1992;
Nguyễn Tiến Dũng, 2004).
Trong thực tế người ta chia virus CGC ra làm 2 loại:
+ Loại virus có độc lực thấp - LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza).
+ Loại virus có độc lực cao - HPAI (Highly Pathgenic Avian Influenza).
Cho đến nay người ta thừa nhận chỉ có 2 subtype virus có cấu trúc kháng
nguyên H5 và H7 được coi là loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng
không phải tất cả các chủng mang gen H5, H7 đều gây bệnh (Horimoto & Kawaka, 1994).
HA là 1 glycoprotein bề mặt được tổng hợp trong tế bào nhiễm bệnh thành chuỗi polypeptide đơn (HA0) với độ dài xấp xỉ là 560 gốc axit amin và sau đó được phân cắt thành các tiểu phần HA1 và HA2 (Knipe & Howley, 2007).
Những tiều phẩn này được liên kết với nhau bởi mối liên kết đồng hóa trị
disulphide. Sự phân cắt HA0 là điều cần thiết cho phân tử này có thể hỗ trợ dung
27
hợp màng giữa vỏ virus và màng tế bào chủ (Knipe & Howley, 2007). Sự phân cắt HA0 thành HA1 và HA2 cần thiết cho sự lây nhiễm của virus, vì vậy nó
quyết định đến độc lực và sự tấn công của virus sang các tế bào khác (Knipe &
Howley, 2007). HA1, miền hình cầu ở đầu mút gai HA, chịu trách nhiệm cho
việc gắn kết virus vào thụ thể axit sialic của tế bào, túi gắn thụ thể có vị trí gần với đầu mũi của phân tử HA (hình 2.5). HA1 cũng có những epitope kháng
nguyên chính (hình 2.6).
Nguồn: Skehel & Wiley (2000)
Virus xâm nhập vào bào tương tế bào thông qua việc dung hợp màng tế bào
và màng virus bằng việc thay đổi hình thái HA ở điều kiện pH thấp trong thể nội bào. Glycoprotein HA là thành phần của virus gắn với thụ thể tế bào axit sialic và tại đầu mút của mỗi monomer của glycoprotein HA có một túi gắn thụ thể mà
kháng thể không tiếp xúc được. Trình tự axit amin hình thành nên túi giữa các
28
Nguồn: Weis & cs. (1990)
subtype khác nhau có tính bền vững, do đó tạo nên tính đặc hiệu gắn kết với tế bào khác nhau (Knipe & Howley, 2007). Hầu hết các kháng thể trung hòa bắt vào
các epitopes gần với vị trí bám thụ thể, ví dụ đối với virus cúm H3 có 5 vị trí
kháng nguyên được xác định ở đầu chùy của HA (Knipe & Howley, 2007). Vị trí
phân cắt HA là yếu tố quyết định độc lực đầu tiên của virus CGC, cùng với type và số lượng axit amin gốc bazơ tại vị trí phân cắt (Capua & Alexander, 2004).
HA là kháng nguyên ban đầu mà đáp ứng kháng thể vật chủ hướng tới và chỉ có
kháng nguyên này gây ra đáp ứng kháng thể trung hòa.
Bên cạnh HA, NA cũng là một glycoprotein khác nằm ở bề mặt của hạt
virus cúm. NA là một tetramer được chèn vào vỏ virus và là một protein tích hợp
màng, nó bẻ gãy axit sialic tại mối liên kết alpha-ketosidic với các gốc đường bên
cạnh. Sự bẻ gãy axit sialic khiến cho NA đóng vai trò quan trọng trong cả việc
xâm nhập và thoát ra khỏi tế bào vật chủ (Matrosovich & cs., 2004). Các chất ức
chế NA như oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza) gắn vào NA ngăn cản
sự giải phóng virus khỏi tế bào vật chủ. NA cũng trải qua những sự biến đổi và
đóng vai trò lớn trong việc quyết định kháng nguyên. Cả 2 gen HA và NA đều vô cùng biến đổi về trình tự và chỉ dưới 30% các axit amin là có tính bền vững giữa
các subtype (Lee & Saif, 2009).
Protein M1 nằm dưới lớp vỏ lipid và tương tác với các ribonucleoprotein
của virus (vRNPs). M1 là protein nhiều nhất trong hạt virus và là protein chính
chịu trách nhiệm cho việc hình thành và mọc chồi của hạt virus (Gomez-Puertas
&., 2000). Nó cũng hoạt động như là một tín hiệu nội địa hóa nhân (NLS) dựa
vào một trình tự tín hiệu đặc biệt và thúc đẩy sự xuất khẩu các vRNP từ nhân ra
bào tương cũng như căn cản chúng xâm nhập trở lại nhân.
M2 là một protein tích hợp màng khác, nó kéo giãn toàn bộ màng lipid và
nhô ra khỏi bề mặt của hạt virus. M2 hình thành một đường dãn ion cho phép các proton (Proton axit hóa bên trong hạt virus gây ra sự thay đổi hình thái ở M1 cho phép giải phóng các vRNP vào tế bào chất) chảy vào trong hạt virus trong nội
bào trong quá trình xâm nhập của virus vào tế bào (Shimbo & cs., 1996). M2
mục tiêu của các thuốc kháng virus như amantadine và rimantadine, có tác dụng
ngăn chặn sự axit hóa hạt virus và sự giải phóng các vRNP sau đó.
29
Nucleoprotein (NP) là kháng nguyên cấu trúc chính bao bọc RNA virus
bằng cách gắn vào cột trụ đường phốt phát của RNA virus. NP tham gia vào tổng
hợp RNA và tương tác với các men tổng hợp RNA virus cho phép khởi động quá trình sao chép RNA để hình thành nên cRNA và RNA virus (Newcomb & cs.,
2009). Bên cạnh việc gắn kết vào, NP còn cho thấy gắn kết với M1 và nhiều
protein vật chủ.
PB2, PB1 và PA là 3 protein của phức hợp men tổng hợp RNA virus, được mã hóa bởi những đoạn gen riêng rẽ. PB2 và PB1 là những protein cơ bản trong
khi PA là protein có tính axit và có liên quan chặt chẽ để tạo thành một cấu trúc đặc (Area & cs., 2004). Men tổng hợp RNA virus phiên mã các RNA thông tin
(mRNA), RNA bổ sung (cRNA) và RNA di truyền của virus.
PB1 bắt đầu quá trình phiên mã của các đoạn gen RNA. PB1 gắn kết cả vào
đầu 5' và 3' của RNA virus trước khi khởi động quá trình phiên mã. PB1 cũng chịu trách nhiệm cho việc kéo dài các chuỗi RNA đang tổng hợp bằng việc thêm
vào các nucleotide.
Protein PB2 cũng đóng vai trò rất quan trọng trong việc bắt đầu quá trình
phiên mã vì nó chịu trách nhiệm cho việc gắn kết vào mũ của RNA vật chủ.
Ngoài việc tham gia vào phiên mã, PB2 cũng tham gia vào việc nhân lên vì một
số đột biến ở PB2 đã cho thấy có ảnh hưởng đến sự nhân lên chứ không phải sự
sao chép RNA (Gastaminza & cs., 2003).
Protein PA chưa có chức năng cụ thể nào được mô tả, nhưng các đột biến
của chúng đã được chứng minh có ảnh hưởng cả sự phiên mã và sự nhân lên
(Huarte & cs., 2003). Hơn nữa, các đột biến ở PA ảnh hưởng đến sự đóng gói của tất cả các đoạn gen RNA virus cũng đã được mô tả. Các tiểu phần PA có hoạt động nội nhân chịu trách nhiệm cho việc bẻ gãy nắp đầu 5' của mRNA tế bào (Yuan & cs., 2009). Thêm vào đó, PA đóng vai trò trong việc ổn định phức hợp polymerase, hoạt động gắn nắp cũng như gắn phức hợp polymerase vào vùng
khởi động.
Gen PB1 cũng mã hóa một protein thứ 2 là PB1-F2 lần đầu tiên được mô tả
năm 2001. PB1 được thấy cục bộ hóa ở ti thể, nhưng cũng được thấy ở bào tương
30
và nhân của tế bào vật chủ điều chỉnh sự chết tự nhiên của tế bào bằng cách nhắm vào ti thể, góp phần vào các hoạt động RNP của virus và hỗ trợ RNA virus
nhân lên (Chen & cs., 2010). PB1-F2 góp phần vào sự gây bệnh của một số virus
cúm trong mô hình động vật cũng như những thay đổi hay đột biến axit amin của
virus cúm HPAI H5N1 có thể ảnh hưởng tới độc lực và tăng cường độc lực. PB1- F2 cũng được chứng minh là có thể gắn kết với PB1 và tăng cường hoạt động
tổng hợp RNA phụ thuộc RNA của virus tùy theo chủng virus và mô nhiễm
(Chen & cs., 2010). Hầu hết các virus CGC đều có gen PB1-F2, 96% trong số
861 chủng kiểm tra có gen này (Zell & cs., 2007).
N40 lần đầu tiên được mô tả năm 2009 là một protein được phiên mã từ một
AUG riêng rẽ tại codon 40 của đoạn gen PB1 (Wise & cs., 2009). Đến nay, những hiểu biết về protein này còn rất ít. Nó dường như có vai trò trong sự nhân lên ở
một số chủng virus, nhưng nó cũng không phải là cần thiết cho sự nhân lên của
virus và cũng khổng phải được biểu hiện bởi tất cả các virus. PAX là protein thứ
13 ẩn bên trong bộ gen nhỏ bé của virus cúm được mã hóa bởi đoạn PA. Lần đầu
tiên gen này được mô tả năm 2012 là một vùng chồng lấn mã hóa protein điều
chỉnh độc lực của virus CGC trong thí nghiệm với chuột, hoạt động của nó làm
giảm độc lực của virus (Jagger & cs., 2012).
NS1 và NS2 là những protein cuối cùng được mã hóa bởi đoạn gen thứ 8
của bộ gen virus cúm A. NS1 là protein đa chức năng và rất quan trọng trong
việc át chế đáp ứng kháng virus của vật chủ. NS1 đã cho thấy khả năng ức chế
đáp ứng cytokine đối với sự nhiễm virus trong môi trường tế bào (Li & cs., 2006). NS1 gắn vào RNA chuỗi kép ngăn chặn sự hoạt hóa của men protein kinase phụ
thuộc RNA chuỗi kép, một loại men gây ra đáp ứng interferon. Ngoài việc ức chế
đáp ứng kháng virus của vật chủ, NS1 còn điều chỉnh sinh lý học của tế bào chủ
và sự tổng hợp RNA của virus và nó cũng được chứng minh là tham gia vào kích hoạt sự chết lập trình của các tế bào nhiễm bệnh. NS1 có thể chia làm 2 phần là miền gắn với RNA và miến tác động đầu C, miền này điều chỉnh các tương tác
với protein vật chủ và ổn định chức năng của miền gắn RNA.
NS2 được đặt tên lại là nuclear export protein (NEP) khi được chứng minh
là có trong hạt virus và tham gia vào xuất khẩu các RNP virus ra khỏi nhân. Sự
tích tụ các RNP sẽ khởi phát sự thay đổi từ sản xuất các sản phẩm mRNA sang
31
phiên mã các RNA di truyền của virus (Robb & cs., 2009). NS2 gắn kết với M1
thông qua sự tương tác ion ở miền cuối C và chịu trách nhiệm cho việc xuất khẩu
và ngăn chặn sự xâm nhập trở lại của các RNP của virus vào nhân tế bào cũng
như phát tín hiệu cho các protein CRM1 đóng vai trò trong việc vận chuyển
(Shimizu & cs., 2011).
- Đột biến điểm (đột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trôi trượt, lệch lạc về
kháng nguyên-Antigenic drift). Đây là kiểu đột biến xảy ra liên tục thường xuyên
trong quá trình tồn tại của virus mà bản chất là do có sự thay đổi nhỏ về trình tự
nucleotit của gen mã hóa, đặc biệt đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N.
Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng với loài vật
chủ khác nhau và có mức độ độc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến đổi
này mà virus cúm A tạo nên 18 biến thể gen HA (H1- H18) và 9 kháng nguyên N
(N1 - N9).
- Đột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca - Antigenic Shift). Hiện
tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm. Hiện tượng
này chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế
bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus. Điều này tạo nên sự sai khác cơ bản về
bộ gen của virus cúm đời con so với virus bố mẹ. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen
xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và động vật với mức độ
nguy hiểm không thể lường trước được (Phạm Sỹ Lăng, 2004).
Do hạt virus cúm A có cấu trúc là 8 đoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus có
thể xuất hiện 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau (Cục Thú y, 2004).
Theo Suarez & Pantin-Jackwood (2008), tất cả các virus cúm phân lập được
của Việt Nam trong năm 2005 - 2007 không chỉ có độc lực cao với gà, mà còn
gia tăng đáng kể độc lực trên vịt so với các virus phân lập trước đó. Sự tăng độc
tính này là hệ quả của virus nhân lên trong các cơ quan nội tạng và sự thích nghi
ở diện rộng hơn của virus đối với các cơ quan nội tạng. Sự thay đổi độc tính của
các virus đang lưu hành có ảnh hưởng lớn tới dịch tễ học của virus và công tác
khống chế.
32
Virus không bền vững với nhiệt độ, ở 56 - 600C chỉ vài phút virus mất độc lực. Tuy nhiên virus tồn tại khá lâu trong các vật chất hữu cơ như trong phân gia cầm ít nhất 3 tháng, 30 - 35 ngày ở nhiệt độ 40C, 7 ngày ở nhiệt độ 200C. Trong thức ăn, nước uống bị ô nhiễm virus có khả năng tồn tại hàng tuần. Đây chính là nguồn mang mầm bệnh nguy hiểm và tiềm tàng để làm lây lan dịch bệnh (Lê Văn Năm, 2004).
Do cấu trúc vỏ ngoài của virus là lipid nên chúng mẫn cảm với các chất dung môi và chất tẩy rửa như formalin, axit, ete, β – propiolacton. Sau khi tẩy vỏ, các hóa chất như phenolic, NH4+, axit loãng, natrihypochlorit và hydroxylanine có thể phá hủy virus CGC. Người ta thường dùng các hóa chất này như các chất sát trùng hữu hiệu để tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi (Capua & cs., 2000).
Có thể nuôi cấy virus CGC trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi; trên tế bào xơ phôi gà CEF (Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào thận chó MDCK (Madin-Darby- Canine-Kidney) với điều kiện môi trường nuôi cấy không chứa Trypsin. Virus được bảo quản ở -70oC hoặc đông khô giữ đặc tính gây bệnh rất lâu (Lê Văn Năm, 2004).
Để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ các chủng virus cúm phân lập được, năm 1980 Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra hệ thống phân loại mới, được quy định ký hiệu theo trình tự: serotype/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtype HA (H) và NA (N).
Đối với bệnh truyền nhiễm, sử dụng vacxin để phòng bệnh được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao & Luke, 2007). Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vacxin không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của các loại virus nguy hiểm này sang người (OIE, 2005; Subbarao & Luke, 2007). Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vacxin, đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào (Lê Thanh Hòa & cs, 2008; Nayak & cs., 2010). Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết
33
chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính là vacxin truyền thống và vacxin thế hệ mới (Subbarao & Luke, 2007; Capua & Alexander, 2008).
Vacxin truyền thống: bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng:
- Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vacxin) là các loại vacxin được
sản xuất chứa cùng những chủng virus CGC giống chủng gây bệnh trên thực địa
(Swayne & Suarez, 2000).
- Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous vacxin) là vacxin sử dụng các
chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus thực địa, nhưng có kháng
nguyên NA dị chủng.
Vacxin thế hệ mới (vacxin công nghệ gen): là loại vacxin được sản xuất nhờ
sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ các vùng “gen độc”. Các loại vacxin này hoặc
đang được nghiên cứu hoặc đã đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
- Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: loại vacxin này sử
dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp hai gen H5 và N1 phòng chống
virus subtype H5N1 và H7N1 (Qiao & cs., 2006). Ví dụ, hãng Merial của Pháp
sản xuất vacxin TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83
(H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.
- Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách
chiết làm vacxin (Peyre & cs., 2008).
- Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle
virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5
vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxin phòng chống virus
cúm A/H5N1 (Gao & cs., 2006; Romer-Oberdorfer & cs., 2008; Hu & cs., 2011).
- Vacxin DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP,
M2 đơn lẻ hoặc đa gen (Keawcharoen & cs., 2005; Patel & cs., 2009).
- Vacxin virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, virus cúm nhân tạo được lắp ghép chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có “vùng độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Tian & cs., 2005;
Suguitan & cs., 2009). Có 3 loại vacxin đã được tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vacxin trên thế giới
hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-
34
PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Việt Nam/1194/2004(H5N1) hoặc A/Việt Nam/1203/2004(H5N1). Trung Quốc
cũng là nước sản xuất nhiều giống virus vacxin chống cúm. Ví dụ: Viện nghiên cứu
Thú y Cáp-Nhĩ-Tân đã thành công trong việc tạo giống vacxin vô hoạt đơn chủng
lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtybe H5N2 có độc lực yếu; hay giống vacxin vô hoạt đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1
từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu (Tian & cs., 2005;
Qiao & cs., 2006). Các loại vacxin này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ
năm 2006 cho đến nay.
Vacxin thế hệ mới chủng NIBRG-14: chủng NIBRG-14 là giống virus
vacxin thế hệ mới, thuộc loại hình vacxin được xóa gen bằng công nghệ gen, được lắp ráp nhân tạo bằng công nghệ di truyền ngược (reverse genetics-based
technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà (Marsh & Tannock,
2005). Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân
tạo nhược độc làm vacxin. Cụ thể, hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 được
tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount
Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, M, NS làm nền, còn
các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm cường độc
gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/VietNam/1194/2004(H5N1)) (Tian
& cs., 2005). Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị đột biến gen làm mất hẳn
4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm các bộ mã ở hai đầu của
“vùng độc”, làm thay đổi 3 amino acid ở vùng gây độc. Mặc dù virus được xử lý
làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng
nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu. Do vậy, nó
có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây
bệnh trong tự nhiên (Doherty & cs., 2006; Peyre & cs., 2008).
Nghiên cứu vấn đề gen kháng nguyên liên quan đến vacxin và miễn dịch đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Thú y Trung ương tiến hành nhờ việc thu thập
gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt
Nam qua các năm 2004 - 2008, và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1
của các chủng cường độc đương nhiễm và vacxin của Việt Nam và thế giới (Lê
Thanh Hòa & cs., 2004; Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2004; Lê Thanh Hòa & cs.,
35
2006; Lê Trần Bình & cs., 2006; Lê Trần Bình, 2007; Le & cs., 2008). Năm 2007, sự xuất hiện thêm chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) tại Việt
Nam, đã làm thay đổi hiệu quả của vacxin hiện dùng trong phòng chống bệnh, do
tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) của các chủng phân lập tại Nghệ An
(Việt Nam), A/Dk/Vietnam/NA114/2007(H5N1) và A/Dk/Vietnam/NA72/2007 (H5N1), thuộc dòng Phúc Kiến) với các chủng H5N1 thuộc phân dòng Quảng
Đông bao gồm một số chủng được sử dụng làm vacxin. Hiệu quả vacxin chỉ đạt
94% trong thực nghiệm (Lê Thanh Hòa & cs., 2008; Nguyễn Mạnh Kiên & cs.,
2008). Nhận định hỗn hợp virus gây bệnh và phân hóa kháng nguyên của virus cúm
A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã được xác nhận qua phân tích hàng chục chủng virus
được thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước (Nguyễn Tiến Dũng & cs.,
2008; Le & cs., 2008). Điều này ảnh hưởng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên (Smith & cs., 2006; Alexander, 2007), cũng như
vai trò miễn dịch của các chủng cổ điển đang làm vacxin tại Việt Nam và thế giới
(vacxin H5N1, chủng gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1); vacxin H5N2, chủng gốc: A-
Turkey-ENGN28(73)(H5N2); vacxin TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-IRE-
1378(83)(H5N8)); vacxin H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo232(94)(H5N2))
và vacxin H5N1
thế hệ mới chủng NIBRG-14, sử dụng chủng gốc:
A/Vietnam/1194/2004(H5N1) (Lê Trần Bình & cs., 2006; Lê Trần Bình, 2007;
Nguyễn Thị Lan Phương & Lê Văn Hiệp, 2006).
Xuất phát từ thực tế virus CGC liên tục biến đổi và tiến hóa xuất hiện những biến chủng mới, nhiều công trình nghiên cứu về vacxin CGC đã được thực hiện ở Việt Nam. Gần đây chủng virus CDC-RG30 đã được nhập khẩu từ Trung tâm phòng chống Dịch bệnh Quốc gia Hoa Kỳ. Chủng virus CDC-RG30 mang gen HA và NA của chủng A/Hubei/1/2010 và các gen PB2, PB1, PA, NP, M và NS của chủng virus cúm A/PuertoRico/8/1934(H1N1). Kết quả phân tích kháng nguyên cho thấy chủng CDC-RG30 có sự tương đồng kháng nguyên với các chủng virus clade 2.3.2.1c và không tương đồng với các chủng virus clade 1.1 và 2.3.4 (Trần Xuân Hạnh & cs., 2016). Tuy nhiên kết quả thử nghiệm công cường độc cho thấy vacxin CDC-RG30 có thể bảo hộ gà, vịt chống lại các virus clade 1.1 và 2.3.2.1c (Trần Xuân Hạnh & cs., 2016). Chủng virus NIBRG-14 là chủng virus vacxin đã được Tổ chức Y tế thế giới cho phép sử dụng để làm vacxin. Chủng virus này do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học (NIBSC) - Anh tái tổ hợp từ 2 chủng virus cúm A/Vietnam/1194/2004(H5N1) và A/PR8/34, trong đó gen mã hóa H5 (được cắt bỏ 4 axit amin mang tính kiềm) và
36
N1 lấy từ chủng virus của Việt Nam, 6 gen còn lại lấy từ chủng A/PR/8/34. Với chủng virus vacxin này, Công ty Navetco đã thực hiện nghiên cứu từ năm 2006- 2012 để xây dựng qui trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 nhũ dầu để phòng chống bệnh CGC. Kết quả nghiên cứu cho thấy vacxin dùng chủng NIBRG-14 của công ty Navetco tạo được hiệu giá kháng thể trung bình từ 3,5-3,8 log2 ở gà tiêm 1 mũi lúc 3 tuần tuổi và 6,3-6,7 log2 ở gà tiêm 1 mũi lúc 4 tuần tuổi (Trần Xuân Hạnh, 2012). Vacxin NIBRG-14 đã được nghiên cứu và đánh giá thử nghiệm trên gia cầm để chống lại các virus cúm A/H5N1 clade 1, 2.3.2.1a và 2.3.2.1b. Kết quả thử nghiệm cho thấy vacxin NIBRG-14 bảo hộ được gia cầm chống lại clade 1 và 2.3.2.1a nhưng không bảo hộ được chống lại 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng & cs., 2012). Vacxin sử dụng chủng NIBRG-14 đã được công ty Navetco thương mại hóa gọi là vacxin Navet-vifluvac. Vacxin này được đánh giá thử nghiệm trên gà để chống lại các biến chủng virus cúm A/H5N1 mới thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1c và cho kết quả khả quan. Gà tiêm vacxin Navet-vifluvac có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log2 và được bảo hộ 100% chống lại các virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c (Trần Xuân Hạnh & cs., 2013). Bên cạnh các vacxin nghiên cứu sản xuất trong nước, nhiều vacxin CGC đã được nhập khẩu và đưa vào sử dụng phòng bệnh CGC. Vacxin Re-6 nhập khẩu từ Trung quốc được khảo nghiệm trên gà có kết quả bảo hộ 70% chống lại clade 1.1, 100% chống lại 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c (CTCPTTYTW1, 2013). Cả 2 loại vacxin Navet- vifluvac và Re-6 cũng được khảo khiệm trên vịt và cho kết quả trên 90% vịt có kháng thể HI ≥ 4 log2 sau khi tiêm 2 mũi (mũi 1 lúc 14 ngày tuổi và mũi 2 trong khoảng từ 42-118 ngày tuổi) (Phan Chí Tạo & Trần Ngọc Bích, 2016). Ngoài ra 1 số vacxin khác cũng được nhập về Việt Nam và sử dụng rộng rãi trên cả nước. Giai đoạn 2007-2010, vacxin Re-5 (clade 2.3.4) được nhập khẩu để phòng bệnh đối với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.4. Thử nghiệm trên gà cho thấy với liệu tình tiêm 1 mũi, tỉ lệ có kháng thể bảo hộ (> 4 log2) thấp nhưng với liệu trình tiêm 2 mũi tỉ lệ có kháng thể bảo hộ trên 80% (Trần Ngọc Bích & Nguyễn Phúc Khánh, 2013). Nhìn chung tất cả các vacxin thương mại trên đều có hiệu quả bảo hộ tốt cho gia cầm trong từng thời gian nhất định. Năm 2011, một số vacxin thương mại được đánh giá lại bằng thí nghiệm thử thách cường độc đối với các chủng virus cúm đang lưu hành. Vacxin Re-5 có thể bảo hộ 90-100% gà và 100% ngan, vịt chống lại virus clade 2.3.4, 70% gà chống lại virus clade 2.3.2.1a và 0% với clade 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm & cs., 2011).
37
- Sàng lọc virus cúm A từ các mẫu thu thập được trên gà, ngan/vịt và chim cút;
- Xác định subtybe H5 từ các mẫu dương tính với cúm A;
- Xác định subtybe H5N1 và H5N6 từ các mẫu dương tính với cúm A/H5;
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài (gà,
ngan/vịt và chim cút);
- Phân loại virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được trên gà, ngan/vịt và
chim cút;
- Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh của virus cúm A/H5 biến chủng mới thu
thập được trên gà, ngan/vịt và chim cút;
- Nghiên cứu sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới theo thời
gian và không gian.
- Xác định đặc điểm phân tử gen HA của virus cúm A/H5 biến chủng mới;
- Xác định chỉ số độc lực của virus cúm A/H5 biến chủng mới;
- Xác định các triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây
ra trên gà.
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N1 clade
2.3.2.1c trên gà;
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N6 clade
2.3.4.4a trên gà và vịt;
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N6 clade
2.3.4.4b trên gà và vịt.
38
Bảo hộ lao động, bông cồn sát trùng, tăm bông vô trùng, ống đựng dung
dịch bảo quản mẫu, khay inok, thùng bảo quản mẫu, đá khô, nhãn dán mẫu, phiếu
ghi thông tin mẫu, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
a. Môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu
- Môi trường PBS - Glycerol - Dung dịch đệm phốt phát (PBS)
NaCl
8,00 g
KCl
0,20 g
1,44 g
Na2HPO4
0,24 g
KH2PO4
Nước cất
1 lít
- Hấp vô trùng PBS sau đó trộn với một lượng tương đương PBS và
glycerol vô trùng. Bổ sung kháng sinh vào 1 lít dung môi PBS/Glycerol.
Benzylpenicillin
2 x 106 IU/lit
Streptomycin
200 mg/lit
Gentamicin
250 /lit
- Điều chỉnh pH = 7,4 rồi lấy 4ml vào 1 ống nghiệm 15ml, bảo quản ở 40C.
b. Dụng cụ, hóa chất cho xét nghiệm mẫu bệnh phẩm
- Cabinet Class 2, tủ lạnh, máy Real time PCR: Biorad IQ5; máy spin, máy
vortex, máy ly tâm lạnh;
- Micropipettes (1 kênh và 8 kênh) và đầu típ phù hợp;
- Ống Eppendoff 0,5 ml; 1,5 ml không chứa ARNse. Máy đọc kết quả RT-
PCR Cerpheid, Biorad IQ5, ABI 7500;
- Nước tinh khiết (Distilled Water);
- Bộ kít chiết tách RNeasy Mini kit - Cat Qiagen. No. 74106 do hãng
Qiagen của Đức sản xuất;
39
- Bộ kít One-Step RT-PCR Qiagen® (Cat No.210210) hoặc Invitrogen
One-step RT-PCR (Cat No.11732-020);
- MgCl2 (Promega) 25nM;
- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) để phát hiện virus.
- Vacxin CGC H5N1:
+ Vacxin Navet-vifluvac (clade 1) do Công ty NAVETCO sản xuất và cung
cấp: số lô 27, NSX 03/01/2018, HSD 02/01/2019.
+ Vacxin Re-5 (clade 2.3.4) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung
cấp: số lô 2015009, NSX 09/02/2018, HSD 08/02/2019.
- Động vật thí nghiệm: gà Lương Phượng và vịt bầu cánh trắng được chọn
từ đàn khỏe mạnh, không có virus cúm type A (kiểm tra mẫu dịch hầu họng bằng
phương pháp Real time RT-PCR), chưa tiêm phòng vacxin CGC và không có
kháng thể cúm H5 (kiểm tra mẫu huyết thanh bằng phương pháp HI).
Đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau, từ kinh điển (phân
lập virus, nuôi cấy virus trên trứng, công cường độc cho gia cầm…) đến các kỹ thuật
sinh học phân tử (Realtime RT-PCR, sequencing…) và miễn dịch học (ELISA, HI)
để thực hiện các nội dung nghiên cứu đã được xác định trước, cụ thể:
Thu thập mẫu dịch hầu họng (sau đây gọi là mẫu) của gia cầm gồm gà, ngan/vịt tại các chợ buôn bán gia cầm sống và chim cút nuôi tại hộ gia đình tại 11
tỉnh giám sát. Tỉnh lấy mẫu cần có diện tích rộng, có số lượng gia cầm nuôi và
buôn bán lớn, có dịch CGC trong 3 năm gần thời điểm nghiên cứu và không nằm trong địa bàn của chương trình giám sát quốc gia, bao gồm 9/11 tỉnh (Đồng Tháp, Vĩnh Long, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Hà Nội, Thái Nguyên, Phú Thọ): tại mỗi tỉnh, lấy mẫu tại 3 chợ, các chợ lấy mẫu thuộc các huyện khác nhau, có số lượng gia cầm buôn bán lớn được thu gom từ các xã trong địa bàn, mỗi chợ lấy mẫu 30 gia cầm/tháng trong 24 tháng; tiến hành lấy
mẫu hàng tháng tại 5 hộ chăn nuôi chim cút, mỗi hộ lấy 10 mẫu/tháng trong vòng 24 tháng. Ngoài ra, để có cái nhìn toàn diện hơn, chúng tôi cũng tiến hành thu
thập mẫu trên đàn gia cầm (gà, ngan/vịt và chim cút) tại 2/11 tỉnh (Kiên Giang,
40
Nghệ An) thông qua công tác chẩn đoán xét nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán
Thú y Trung ương và các Cơ quan Thú y vùng giai đoạn 2015- 2018 (bảng 3.1).
Đối tượng Số mẫu Số Số tháng/ Số Số mẫu TT lấy mẫu chợ/hộ giai đoạn tỉnh thu thập lấy
1 Gà, vịt tại chợ 30 3 24 9 19.440
Chim cút tại các hộ 2 10 5 24 9 10.800 chăn nuôi
3 Gà, ngan/vịt, chim cút 150 2015-2018 2 300
Các mẫu sau khi thu thập sẽ được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2-8oC và
vận chuyển đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để xét nghiệm sàng lọc
virus cúm type A bằng phương pháp rRT-PCR theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN
8400-26:2014.
+ Phương pháp lấy mẫu dịch hầu họng
Dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt, chim cút
và ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc; lấy tăm bông ra sau đó cho vào ống
nghiệm có chứa dung dịch bảo quản, đưa vào thùng bảo quản lạnh gửi về phòng
thí nghiệm trong vòng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu;
Mẫu bảo quản ở 40C từ 1 - 2 ngày, nếu mẫu chưa được kiểm tra cần bảo quản ở tủ âm -200C, và chuyển tới phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt. Mẫu có
phiếu ghi bệnh phẩm kèm theo.
+ Phương pháp lấy mẫu máu
Sử dụng kim tiêm vô trùng lấy 3 - 5 ml máu tĩnh mạch cánh của gà, vịt và chim cút, chuyển vào ống chứa, để đông, giữ tại 40C trong vòng 24 giờ. Huyết
thanh được tách chiết như sau:
- Đóng chặt ống chứa máu, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Huyết
thanh và tế bào máu sẽ được phân tách trong ống;
- Dùng pipet vô trùng, nhẹ nhàng hút huyết thanh ở phần trên của ống
chuyển sang ống sạch, bảo quản ở 40C.
+ Phương pháp mổ khám, lấy mẫu nội tạng gia cầm
41
Tổng 30.540
Mổ khám gia cầm nhằm xác định các biến đổi đại thể trong các cơ quan, tổ
chức của gia cầm mắc CGC. Gia cầm được cắt tiết, bộc lộ và tách các cơ quan nội
tạng khỏi cơ thể. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách,
thận… theo các mục đích nghiên cứu khác nhau.
Phản ứng Realtime RT-PCR được sử dụng để phát hiện virus cúm type A, mẫu
dương tính với virus cúm type A tiếp tục được kiểm tra subtype H5. Mẫu dương tính
với H5 tiếp tục được kiểm tra với N1 và N6 bằng các cặp mồi tương ứng.
Các mẫu dịch hầu họng trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và tách
chiết ARN bằng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #
74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất (phụ lục 1).
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và
probe (bảng 3.2) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 và hỗn
hợp phản ứng theo quy trình chẩn đoán – TCVN 8400-26:2014 (phụ lục 2).
Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ FAM 3’ BHQ1
TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA M
FAM BHQ1
H5
FAM BHQ1
N1
FAM BHQ1
N6
Trong đó:
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G
Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T
Nucleotide K = nucleotide G hoặc T
Nucleotide N = nucleotide bất kì
42
Probe Xuôi Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA Probe ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G Xuôi Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC Probe TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Xuôi TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C Ngược CCA ATA ACA GGA GGG AGCCCAGACCC Probe CCC CAC CAA TGG GAA CTG Xuôi TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC Ngược
Phương pháp RT-PCR được sử dụng để định type H5N1 hoặc H5N6 trong
trường hợp phương pháp rRT-PCR không xác định được. Các huyễn dịch bệnh phẩm hoặc dịch hầu họng được tách chiết ARN bằng Rneasy Mini Kit (250)
QIAGEN Cat. 74106 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp RT-PCR
định type cúm A (gen M), subtype H5 và xác định subtype NA được thực hiện
với kít SuperScript III Platinum One-Step RT-PCR, Invitrogen 12574-026 và các
cặp mồi đặc hiệu gen M, H5, N1 (Fouchier & cs., 2000; Tsukamoto & cs., 2008) và N6 (Tsukamoto & cs., 2009). Các cặp mồi phát hiện được gen M, H5, N1 và
N6 liệt kê trong bảng 3.3.
Gen Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Vị trí sequence Gen HA chuẩn Kích thước
H5-918F 244 CTTCTAACCGAGGTCGAAACG
Không công bố M H5-1166 AGGGCATTTTGGACAAAG/TCGTCTA
H5-918F U69277 249 CCARTRGGKGCKATAAAYTC
H5 H5-1166 KGTCTGCWGCRTAYCCRCTY
N1-54F 245 TCARTCTGYATGRYAAYTGG CY003931 N1 N1-298R GGRCARAGAGAKGAATTGCC
Mã ký hiệu những bazơ nitric hỗn hợp: B, C/G/T; D, A/G/T; K, G/T; M, A/C; R, A/G; V, A/C/G; W, A/T; Y, C/T.
N6-57F 264 AGGAATGACACTATCSGTAGTAAG CY005464 N6 N6-307R GAYAGRATRTGCCATGAGTTYAC
Giải trình tự gen được thực hiện với các mẫu virus dương tính H5. Giải trình
tự gen HA, các đoạn gen HA1 và HA2 của virus được khuyếch đại bằng kit Platium PCR Supermix, Invitrogen 11306-016 với 2 cặp mồi đặc hiệu gen HA1 và HA2 (bảng 3.3) (Hoffmann & cs., 2001). Tất cả các mồi xuôi và ngược được gắn với đoạn trình tự M13 (bảng 3.4, chữ đậm) tương ứng để làm thuận lợi cho việc giải
trình tự gen:
43
Cặp mồi Tên Trình tự mồi
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA
Cặp 1 AGC AGG GGT YTA AT
S18_H5-1111R CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC
AAC CAT CTA YCA TTC C
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT
Cặp 2 AYA ARA TTG TCA AG
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA
Các phản ứng giải trình tự theo 2 chiều (xuôi, ngược) được thực hiện tại Macrogen, Inc (Seoul, Hàn Quốc). Các trình tự gen HA1 và HA2 được ráp nối trong Bioedit version 7.2.5 thành các trình tự gen HA đầy đủ, khoảng 1700 bp.
Cây phả hệ gen H5 của các virus trong nghiên cứu này và các virus tham chiếu trong ngân hàng gen (GenBank), GISAID, dữ liệu của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (NCVD) xây dựng để phân tích bằng phần mềm MEGA 7, phương pháp Neighbor - Joining, mô hình Kimura 2-parameter, độ tin cậy của phân tích phả hệ được kiểm tra bằng phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại. Các nhánh phả hệ có giá trị boostrap ≥ 95 là đáng tin cậy. Mức độ tương đồng nucleotide giữa các gen được tính toán bằng công cụ Sequence identity matrix trong phần mềm Bioedit.
S20_H5-R1773 ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
Các virus cúm H5 được phân loại theo tiêu chí định nghĩa clade của nhóm Nghiên cứu tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO. Một clade/subclade mới được xác định dựa trên đặc điểm phân nhánh của cây phả hệ gen H5 (tree topology) và một số tiêu chí sau: (1) phải có ít nhất 4 chủng virus cùng chung một nút (node), (2) khoảng cách trung bình nucleotide (Kimura 2-parameter) bên trong nhóm < 1,5% và giữa các nhóm > 1,5%, (3) giá trị bootstrap (1000 lần neigbour- joining bootstrap) tại điểm nút xác định clade ≥ 60 (Smith & Donis, 2015).
Sự xuất hiện của các virus được phân tích gắn với thời gian xuất hiện ổ dịch tương ứng. Bản đồ phân bố theo không gian của các virus xuất hiện được vẽ bằng phần mềm Quantum Gis (Hugentobler, 2008).
44
* Giám định bằng phương pháp HA để xác định các mẫu có chứa virus gây ngưng kết hồng cầu (đặc trưng gây bệnh của virus cúm A), các mẫu cho phản
ứng HA âm tính không chứa virus CGC.
- Chuẩn bị: hồng cầu gà 1%, dịch môi trường sau khi phân lập trên tế bào
hoặc dịch niệu mô sau khi phân lập trên trứng; kháng nguyên chuẩn CGC H5N1;
- Phương pháp tiến hành:
+ Cho 25 µl PBS pH ~7,2 vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Cho 25 µl dịch môi trường sau khi phân lập trên tế bào, dung dịch niệu mô sau khi phân lập
trên trứng hoặc kháng nguyên chuẩn vào giếng 1;
+ Trộn đều huyễn dịch hoặc kháng nguyên với PBS ở giếng 1, hút 25 µl từ
giếng 1 chuyển sang giếng 2 và trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng 3 và trộn
đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11. Giếng 12 chỉ có
PBS để làm đối chứng hồng cầu;
+ Cho 25 µl hồng cầu gà 1 % vào mỗi giếng, lắc nhẹ trên máy lắc trong 1
phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 30 phút.
- Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng HA dương tính khi có hạt ngưng kết lấm chấm ở độ pha loãng
(hiệu giá) ≥ 1/4;
+ Phản ứng HA âm tính khi không có ngưng kết hồng cầu hoặc có ngưng
kết nhưng ở độ pha loãng < 1/4;
+ Những mẫu dương tính với phản ứng HA là những mẫu có chứa virus gây
ngưng kết hồng cầu;
+ Hiệu giá HA của một mẫu được xác định tại nồng độ pha loãng cao nhất có ngưng kết hồng cầu. Ví dụ mẫu có phản ứng HA dương tính ở độ pha loãng
1/1024 thì hiệu giá HA của mẫu được xác định là 1/1024 hoặc 10 log2 (phụ lục 3).
* Phân tích kháng nguyên của virus cúm A/H5 biến chủng mới được thực hiện thông qua phản ứng HI chéo sử dụng kháng huyết thanh gà đồng chủng và
dị chủng thuộc các clade; 2.3.2.1c, 2.3.4.4a và 2.3.4.4b.
- Chuẩn bị: để loại bỏ yếu tố ngưng kết không đặc hiệu, các kháng huyết thanh được bất hoạt ở 560C trong 30 phút, rồi hấp phụ với hồng cầu gà theo tỉ lệ 0,5 ml huyết thanh/0,025 ml hồng cầu, trộn đều và để trong 30 phút, Phản ứng HI
45
được thực hiện theo hướng dẫn của OIE (phụ lục 4).
- Phương pháp tiến hành:
+ Cho 25 µl PBS pH ~7,2 vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Cho 25 µl
huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1;
+ Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 2, chuyển 25 µl sang giếng 3 và trộn
đều, chuyển 25 µl sang giếng 4, tiếp tục đến giếng 11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11;
+ Cho 25 µl kháng nguyên 4 HA/25 µl vào các giếng từ 1 đến 11. Cho thêm
25 µl PBS vào giếng 12 làm đối chứng hồng cầu;
+ Lắc nhẹ trên máy lắc sau đó để đĩa ở nhiệt độ phòng 30 phút;
+ Cho 25 µl hồng cầu gà 1 % vào mỗi giếng, lắc nhẹ trong 1 phút. Để đĩa
phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả sau 30 phút
- Đánh giá kết quả: hiệu giá HI được xác định bằng đảo nghịch độ pha loãng
cuối cùng của huyết thanh cho kết quả ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu.
Đặc tính sinh học phân tử của tiểu phần protein HA1 được phân tích, so
sánh trong nghiên cứu này, bao gồm:
* Phân tích đặc trưng trình tự amino acid ở gần vị trí cắt HA1-HA2 dựa vào
so sánh với motif đã biết trước đây (Senne & cs., 1996). Biểu diễn trình tự amino
acid ở gần vị trí cắt bằng phần mềm WebLogo (Crooks & cs., 2004).
* Xác định các vùng kháng nguyên quan trọng ở tiểu phần protein HA1
được thực hiện trên cơ sở (i) so sánh với 5 vùng kháng nguyên đã biết của virus cúm A subtype H15 (Wiley & cs., 1981; Sivay & cs., 2013) và (ii) so sánh với
trình tự amino acid tiểu phần tương ứng của virus cúm A clade 1 (GenBank:
EF541402) và clade 2.3.4 (GenBank: HM172115). Hai trình tự tham chiếu kể trên được chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (Connie Leung & cs., 2013). Phần mềm COBALT (Papadopoulos & Agarwala, 2007) được dùng để dóng
hàng (alignment) trong so sánh trình tự amino acid giữa các clade. Xác định vị trí 5 vùng kháng nguyên A- E của virus cúm A/H5Nx được dựa theo công bố trước
đây (Liu & cs., 2016).
* Phân tích hiện tượng glycosyl hóa: sử dụng phần mềm NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) để dự đoán trình tự đặc hiệu N-X-
S/T (N = Asparagin; X = amino acid bất kỳ, trừ Prolin; S/T = Serin hoặc
46
Threonin), ở đó xảy ra hiện tượng gắn gốc đường vào amino acid Asparagin.
Nội dung đánh giá chỉ số độc lực IVPI của virus CGC trong khuôn khổ đề tài được thực hiện đối với các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, biến chủng H5N6
clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tương ứng lần lượt là: H5N1 clade 2.3.2.1c
(A/Ck/VN/KienGiang/NCVD-15A7/2015(H5N1)), virus H5N6 clade 2.3.4.4a
(A/ck/VN/QuangNgai/NCVD-16A37/2016(H5N6)) và virus H5N6 clade 2.3.4.4b
(A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)). Virus được nhân giống, chuẩn độ và gây nhiễm vào gà 6 tuần tuổi qua đường tiêm tĩnh mạch với liều 106TCID50/100 µl/con.
a. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm trên gà được thực hiện như sau:
Số gà được sử dụng gồm 45 con chia làm 3 nhóm. Mỗi nhóm gồm lô gây
nhiễm 10 con và lô đối chứng không gây nhiễm 5 con (bảng 3.5). Gà được nuôi
từ lúc 1 ngày tuổi đến khi được 6 tuần tuổi. Trước khi tiến hành thí nghiệm, tất cả
gà được lấy mẫu huyết thanh để kiểm tra kháng thể kháng cúm H5 và mẫu dịch
hầu họng để kiểm tra virus cúm type A, đảm bảo gà không có kháng thể kháng
virus cúm H5. Sau đó, tiến hành tiêm virus vào tĩnh mạch của gà ở các lô gây
nhiễm (OIE,2012). Các lô đối chứng nuôi cách ly với lô gây nhiễm. Liều gây nhiễm là 106 TCID50/100 µl/con, theo đường tĩnh mạch.
Chủng virus H5N1 clade H5N6 clade H5N6 clade
Gà thí nghiệm (con) 2.3.2.1c 2.3.4.4a 2.3.4.4b
Lô gây nhiễm 10 10 10
Lô đối chứng 5 5 5
Theo dõi gà trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, chấm điểm lâm sàng hằng
ngày theo tiêu chí đánh giá của OIE về thử nghiệm độc lực virus CGC (OIE, 2012).
Khi gà chết, tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng để xét nghiệm virus nhằm xác
nhận nguyên nhân chết bằng phương pháp rRT-PCR. Giá trị Ct ≥ 35 được coi là âm tính virus.
Tính toán chỉ số độc lực IVPI theo kết quả theo dõi lâm sàng thu được.
47
Tổng 15 15 15
b. Công thức tính chỉ số độc lực IVPI
- Cách tính điểm lâm sàng theo hướng dẫn của OIE:
Điểm Tiêu chí
0 Gà khỏe mạnh bình thường, không có triệu chứng của cúm gia cầm.
1
Gà biểu hiện 1 trong các triệu chứng của cúm gia cầm như: ủ rũ, mệt mỏi, xù lông; triệu chứng hô hấp; ỉa chảy; tím tái; phù đầu, mặt; triệu chứng thần kinh.
2 Gà có từ 2 triệu chứng đặc trưng của cúm gia cầm.
- Chỉ số độc lực IVPI là giá trị trung bình điểm lâm sàng hằng ngày của các
cá thể trong lô thí nghiệm trong 10 ngày theo dõi. Chỉ số IVPI = 3 có nghĩa là tất
cả động vật thí nghiệm chết trong vòng 24 giờ; chỉ số IVPI = 0 có nghĩa là không
có triệu chứng lâm sàng xuất hiện ở tất cả động vật trong thời gian theo dõi 10
ngày.
- Theo quy định của OIE, chủng virus cúm nào cho chỉ số IVPI > 1,2 thì
được xếp vào nhóm độc lực cao.
c. Công thức tính thời gian chết trung bình
Động vật thí nghiệm được theo dõi sau mỗi 12 giờ đến khi chết. Thời gian
chết trung bình (MDT) là khoảng thời gian trung bình từ khi gây nhiễm đến khi
chết của những động vật chết trong lô thí nghiệm.
Số con chết x thời gian chết
MDT (h) =
Tổng số con chết
3 Gà chết. Những ngày sau khi chết được tính 3 điểm đến hết thời gian theo dõi
- Gà 6 tuần tuổi, không có kháng thể kháng virus cúm H5 được chia thành 3
lô, mỗi lô 10 con gây bệnh thực nghiệm với virus CGC và một lô 15 con làm đối
chứng được nuôi cách ly với lô gây bệnh (bảng 3.4).
- Ba chủng virus CGC phân lập năm 2015-2016 gồm H5N1 clade 2.3.2.1c,
H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tương ứng lần lượt.là: H5N1 clade 2.3.2.1c
(A/Ck/VN/KienGiang/NCVD-15A7/2015(H5N1)), virus H5N6 clade 2.3.4.4a
(A/ck/VN/QuangNgai/NCVD-16A37/2016(H5N6)) và virus H5N6 clade 2.3.4.4b
(A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)), được sử dụng để gây bệnh
48
thực nghiệm cho 3 lô gà trên qua đường nhỏ mũi với liều gây nhiễm là 106
TCID50 /100 µl/con.
- Quan sát gà trong thời gian theo dõi để đánh giá cho điểm triệu chứng lâm
sàng theo hướng dẫn của OIE (OIE, 2012).
- Chỉ số điểm lâm sàng trung bình là giá trị trung bình điểm lâm sàng của
tất cả các cá thể trong lô thí nghiệm trong 10 ngày theo dõi.
- Chỉ số điểm lâm sàng theo ngày là giá trị trung bình điểm lâm sàng hằng
ngày của tất cả gà trong lô thí nghiệm.
Gà ở các lô sẽ được mổ khám sau khi chết hoặc vào ngày thứ 10 khi kết
thúc thí nghiệm để đánh giá mức độ tổn thương đại thể.
Đặt gà nằm ngửa trên bàn mổ, dùng dao cắt da giữa vùng bụng và bẹn ở hai
bên chân, lật chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi; cắt da vùng
giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, kéo ngược phần da trên lên tận vùng diều bộc lộ
cơ ngực; dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dưới mỏ bộc lộ
diều, thực quản, khí quản, tuyến thymus để kiểm tra, quan sát các túi khí và phía
ngoài các cơ quan nội tạng:
- Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang;
- Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong;
- Dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong;
- Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, các xoang và
van tim;
- Tách phổi khỏi các xương sườn kiểm tra về màu sắc, độ xốp;
- Tách gan, lách ra khỏi cơ thể để kiểm tra: màu sắc, kích thước, hình dạng,
độ đàn hồi và mặt cắt;
- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau; kiểm
tra bên trong và bên ngoài từ dạ dày tuyến xuống đến hậu môn;
- Tách thận, túi fabricius ra khỏi cơ thể để kiểm tra;
- Cắt đầu gia cầm ở đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xương cắt sang hai
bên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não, kiểm tra não.
49
Các cơ quan phủ tạng được thu thập và bảo quản trong formalin 10% để
tiếp tục đánh giá biến đổi mô học qua mẫu bệnh phẩm.
- Mẫu bệnh phẩm được cố định bằng dung dịch formalin 10% trong 24 giờ.
- Chuẩn bị tiêu bản vi thể bằng phương pháp paraffin: mẫu bệnh phẩm được
cắt thành những miếng nhỏ ngâm trong dung dịch formalin 10% trong 24 giờ; cắt
thành các lát với độ dày 5mm; thực hiện các bước rút nước qua cồn, xylen, ngâm
tẩm paraffin, đúc paraffin và cắt tiêu bản với độ dày 3-5 µm. Sau đó thực hiện
các bước nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE (Hematoxylin & Eosin). Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang học từ độ phóng đại 4X tăng dần đến 60X
để quan sát bệnh tích.
a. Nguyên liệu
- Gà Lương Phượng lai và vịt bầu cánh trắng được chọn từ đàn sạch bệnh,
chưa tiêm phòng vacxin CGC, không có kháng thể cúm H5, do Công ty Cổ Phần Tập Đoàn RTD cung cấp. Gà, vịt được lấy máu trước khi tiêm vacxin để kiểm tra
kháng thể kháng CGC bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1.
- Vacxin Navet-vifluvac do Công ty NAVETCO sản xuất.
- Vacxin Re-5 do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp
- Kháng nguyên dùng cho phản ứng HI là các kháng nguyên đồng clade với
chủng vacxin: A/duck/Anhui/1/06 (clade 2.3.4) (nhóm thử nghiệm vacxin Re5);
A/Vietnam/1194/2004 (clade 1) (nhóm thử nghiệm vacxin Navet-vifluvac) và các
virus dùng để công cường độc.
tương ứng
lần
- Virus cường độc là các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, biến chủng H5N6 lượt.là: H5N1 clade 2.3.2.1c clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b (A/Ck/VN/KienGiang/NCVD-15A7/2015(H5N1)), virus H5N6 clade 2.3.4.4a (A/ck/VN/QuangNgai/NCVD-16A37/2016(H5N6)) và virus H5N6 clade 2.3.4.4b
(A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)).
b. Thiết kế thí nghiệm trên gà/vịt
Thí nghiệm được thể hiện cụ thể qua bảng 3.6:
50
Chủng virus
Gà thí nghiệm (con) H5N1 2.3.2.1c H5N6 2.3.4.4a H5N6 2.3.4.4b
Lô tiêm vacxin Re-5 Navet-vifluvac 12 12 12 12 12 12
Lô đối chứng không tiêm vacxin Re5 Navet-vifluvac 12 12 12 12 12 12
Số gà/vịt sử dụng gồm 48 con chia làm 2 lô. Lô 1 gồm 12 gà/vịt tiêm vacxin Navet-vifluvac và 12 gà/vịt đối chứng không tiêm. Lô 2 gồm 12 gà/vịt tiêm vacxin Re-5 và 12 gà/vịt đối chứng không tiêm. Gà/vịt được nuôi từ lúc 01 ngày
tuổi đến tuổi tiêm vacxin như khuyến cáo của nhà sản xuất.
Tiêm vacxin cho gà/vịt vào lúc 3 tuần tuổi. Tiếp tục tiêm nhắc lại với vịt
vào lúc 6 tuần tuổi. Liều tiêm, đường tiêm theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Cụ
thể: vacxin Navet-vifluvac tiêm dưới da cổ tại vị trí 1/3 phía dưới với liều 0,5
ml/con; vacxin Re-5 tiêm dưới da cổ tại vị trí 1/3 phía dưới với liều 0,3 ml/con;
các lô gà/vịt đối chứng không tiêm, nuôi cùng với gà/vịt tiêm vacxin.
Sau 3 tuần kể từ khi tiêm xong vacxin, lấy máu kiểm tra kháng thể kháng
virus cúm H5 bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu – HI với loại
kháng nguyên đồng chủng với kháng nguyên trong vacxin.
Gà/vịt tiêm vacxin Navet-vifluvac được kiểm tra bằng kháng nguyên H5N1
clade 1; gà/vịt tiêm vacxin Re-5 được kiểm tra bằng kháng nguyên H5N6 clade
2.3.4.
Sử dụng 10/12 gà/vịt tiêm vacxin và 10/12 gà/vịt đối chứng không tiêm vacxin để công cường độc vào cùng thời điểm 3 tuần kể từ khi tiêm xong vacxin. Còn lại 2 gà/vịt tiêm vacxin và 2 gà/vịt đối chứng không tiêm vacxin được nuôi
cách ly, không công cường độc nhằm so sánh các chỉ tiêu của thí nghiệm.
Gà/vịt công cường độc được gây nhiễm bằng biến chủng mới của virus cúm
A/H5N1 là virus H5N1 clade 2.3.2.1c, vỉrus H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b đã được phân lập, nhân giống và chuẩn độ. Liều gây nhiễm là 106 TCID50/100 µl/con, theo đường nhỏ mũi.
51
Tổng 48 48 48
Theo dõi gà/vịt trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, chấm điểm lâm sàng
hằng ngày theo tiêu chí đánh giá của OIE về thử nghiệm virus CGC.
Vào ngày thứ 3, thứ 10 sau công, hoặc khi gà/vịt chết, tiến hành lấy mẫu
swab hầu họng để xác định lượng virus bài thải. Giá trị Ct ≥ 35 được coi là âm
tính virus.
Những gà chết hoặc sống sót sau 10 ngày theo dõi được mổ khám để đánh
giá bệnh tích đại thể. Các cơ quan phủ tạng được thu thập và bảo quản trong
formalin 10% để tiếp tục đánh giá biến đổi mô học:
+ Gà không có miễn dịch với virus CGC sẽ xuất hiện các bệnh tích đặc
trưng của CGC (bảng 2.3).
+ Gà có miễn dịch với virus CGC sẽ giảm biểu hiện các bệnh tích (phụ thuộc vào chỉ số hiệu giá kháng thể đạt được sau tiêm vacxin và sự tương đồng
kháng nguyên giữa chủng virus gây bệnh và chủng virus chế tạo vacxin).
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.0 (2002). Các giá trị được xác
định bao gồm dung lượng mẫu (n), tỷ lệ nhiễm (tỷ lệ dương tính). Số liệu về tỷ lệ
nhiễm (tỷ lệ dương tính) được phân tích bằng phép thử Khi bình phương (với
dung lượng mẫu lớn) và phép thử chính xác của Fisher (với dung lượng mẫu bé)
bằng thủ tục FREQ của phần mềm SAS. So sánh cặp đôi giữa các tỷ lệ nhiễm
dựa vào chênh lệch tỷ lệ với sai số chuẩn của sự khác biệt.
Số liệu về điểm lâm sàng, giá trị Ct được phân tích theo phương pháp phân
tích phương sai một nhân tố với phép thử Kruskal – Wallis (Kruskal – Wallis
test) bằng thủ tục NPAR1WAY của phần mềm SAS.
52
Sau khi hoàn thành lấy mẫu xét nghiệm trên 6649 gà, 12991 ngan/vịt và
10900 chim cút. Mẫu được thu thập và sàng lọc virus cúm A. Kết quả xét nghiệm
được thể hiện ở phụ lục 5, biểu diễn qua hình 4.1 và hình 4.2.
Virus cúm A được phát hiện ở tất cả 11 tỉnh nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm virus cúm
A tại Nghệ An cao nhất (34,67%), tiếp đến là Kiên Giang (32,67%), Kon Tum
27,17%, Vĩnh Long với 10,68%, Quảng Ngãi với 9,11%, Đồng Tháp 8,15%, Hà Nội
7,26%, Quảng Nam 7,23%, Thừa Thiên Huế 4,64%, Phú Thọ 4,55% và thấp nhất là
Thái Nguyên với 1,34% (hình 4.1).
Trong tổng số 30540 mẫu thu được tại 11 tỉnh có 2794 mẫu dương tính với
virus cúm A, chiếm tỷ lệ 9,15% (hình 4.2A). Kết quả này thấp hơn so với kết quả
giám sát tại 14 tỉnh của Cục Thú y các năm từ 2011 đến 2013 với tỷ lệ gia cầm
dương tính với virus cúm A là 22,1% (tổng số 2162/9790 mẫu dương tính)
(Nguyen & cs., 2014).
So sánh tỷ lệ phát hiện virus cúm A theo miền, chúng tôi thấy: tỷ lệ nhiễm
virus cúm A ở miền Trung là cao nhất với 1670 mẫu dương tính trong 13590
53
mẫu xét nghiệm, chiếm tỷ lệ 12,29%. Tiếp theo là miền Nam với 682/6870 mẫu
dương tính, chiếm tỷ lệ 9,93%. Thấp nhất là 3 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình
là 4,38% (hình 4.2A).
Trong thời gian nghiên cứu, mẫu được lấy thành 3 giai đoạn: giai đoạn 1
từ tháng 1/2015 đến tháng 6/2016, giai đoạn 2 từ tháng 7/2016 đến 6/2017 và
giai đoạn 3 từ tháng 7/2017 đến tháng 3/2018. So sánh kết quả xét nghiệm theo
giai đoạn chúng tôi thấy rằng: tỷ lệ nhiễm virus cúm A trong giai đoạn 1 là cao
nhất với 12,78% (786 mẫu dương tính virus cúm A trong 6148 mẫu kiểm tra),
tiếp theo là ở giai đoạn 3 với tỷ lệ nhiễm virus cúm A là 9,94%. Thấp nhất là tỷ
lệ nhiễm virus cúm A trong giai đoạn 2 với 7,16% (hình 4.2B).
Kết quả xét nghiệm cũng cho thấy, gia cầm khỏe mạnh tại các chợ buôn
bán gia cầm sống mặc dù không có biểu hiện lâm sàng của bệnh CGC nhưng
vẫn mang virus này ở đường hô hấp (9,15%). Kết quả này cũng phù hợp với các
nghiên cứu trước đây cho rằng vịt là vật mang virus CGC. Thủy cầm và đặc biệt
là vịt, mặc dù mang mầm mà không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nhưng
thường xuyên bài thải mầm bệnh ra môi trường tạo nguồn lây nhiễm cho các
động vật cảm thụ khác. Thủy cầm, bao gồm cả vịt, là những bể chứa tự nhiên
của virus CGC type A và đóng vai trò là vật chủ lan truyền virus. Từ thủy cầm,
54
virus có thể truyền cho gia cầm và động vật có vú khác bao gồm cả con người
gây các đợt bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng (Sturm-Ramirez & cs., 2005).
Kết quả này cũng cho thấy chợ buôn bán gia cầm có thể là một nguồn lây
lan bệnh CGC. Chợ buôn bán gia cầm sống được xác định là đường lây truyền
virus cúm quan trọng. Với đặc điểm là tập trung nhiều loại gia cầm khác nhau,
được cung cấp bởi nhiều nguồn khác nhau khiến chợ buôn bán gia cầm sống có
vai trò trong quá trình nhân lên, duy trì, tuần hoàn và lan truyền virus CGC (Chu
& cs., 2016). Do đó, việc tiếp tục giám sát virus CGC tại các chợ buôn bán gia
cầm sống sẽ giúp hiểu rõ hơn sự phân bố của virus CGC và có biện pháp phù hợp
để giảm thiểu nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng.
Nhiều biện pháp đã được sử dụng để giảm thiểu nguy cơ lây lan bệnh cúm
từ các chợ buôn bán gia cầm như đóng cửa chợ tạm thời, tăng cường vệ sinh, khử
trùng tại các chợ, giảm số lượng gia cầm buôn bán theo quý, cấm lưu giữ gia cầm
qua đêm ở chợ,… Các biện pháp này đã chứng minh là có hiệu quả trong việc
giảm sự lưu hành virus cúm tại các chợ buôn bán.
Các mẫu dương tính với virus cúm A tiếp tục được xét nghiệm xác định
subtype H5 bằng phương pháp rRT-PCR. Kết quả được thể hiện ở phụ lục 6, biểu
diễn ở hình 4.3 và hình 4.4.
55
Trong số 11 tỉnh được lấy mẫu, chỉ có 8 tỉnh có mẫu dương tính với virus
cúm A/H5 bao gồm: Hà Nội, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum,
Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang. Trong đó cao nhất là Kon Tum chiếm tỷ lệ
4,32%, tiếp theo là Vĩnh Long chiếm tỷ lệ 3,33%, Nghệ An 2,67%, Kiên Giang
2 %, Quảng Nam 1,73%, Quảng Ngãi 0,42%, Đồng Tháp 0,39%. Có 3/11 tỉnh
không có mẫu dương tính với virus cúm A/H5 là Thừa Thiên Huế, Thái Nguyên
và Phú Thọ (hình 4.3).
Trong tổng số 30540 mẫu được xét nghiệm có 350 mẫu dương tính với
virus cúm A/H5, chiếm tỷ lệ 1,15%. Tỷ lệ mẫu nhiễm virus cúm A/H5 ở ở các
tỉnh miền Trung và miền Nam là gần tương đương nhau với tỷ lệ lần lượt là
1,63% và 1,86%. Các tỉnh miền Bắc có tỷ lệ mẫu dương tính với virus cúm A/H5
là rất thấp, chỉ có 0,01% (hình 4.4A).
Giai đoạn 1 của đề tài (từ 1/2015 đến 6/2016) có kết quả tỷ lệ mẫu dương
tính với virus cúm A là 2,11% cao hơn giai đoạn 3 (từ 7/2017 đến 3/2018) với tỷ
lệ mẫu dương tính virus cúm A/H5 là 1%. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 thấp nhất
là ở giai đoạn 2 (từ 7/2016 đến 6/2017) với 0,87% (hình 4.4B).
56
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 trong nghiên cứu của đề tài thấp hơn các kết
quả giám sát của Cục Thú y thực hiện hàng năm trước đây. Các đợt giám sát
virus CGC trên đàn vịt đã được thực hiện từ năm 2007 đến năm 2009, trong 5 đợt
giám sát virus với tổng số 2571 mẫu được thu thập từ thủy cầm, có 151 mẫu
dương tính với virus cúm A/H5, chiếm tỷ lệ 5,87% (Phan & cs., 2013).
Chương trình giám sát bệnh CGC giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2013 tại
14/63 tỉnh thành phố trong cả nước cho thấy: trong tổng số 9790 mẫu được kiểm tra,
có tổng cộng 531 mẫu dương tính với virus cúm A/H5 (chiếm tỷ lệ 5,4%) (Nguyen
& cs., 2014).
Kết quả nghiên cứu xác định subtype H5 cho thấy có 350 mẫu dương tính
với virus cúm A/H5 trong tổng số 2794 mẫu dương tính cúm A (phụ lục 5),
chiếm tỷ lệ 12,53%. Như vậy, bên cạnh virus cúm A/H5 còn có nhiều subtype
Hx khác cũng đang lưu hành trong đàn gia cầm.
Theo Chu & cs. (2016), khi nghiên cứu bệnh CGC tại tỉnh Thừa Thiên
Huế thấy rằng có nhiều các subtype khác nhau lưu hành trong đàn gia cầm và
môi trường tại các chợ buôn bán gia cầm sống. Trong số 178 mẫu virus cúm A
phân lập được, có các subtype H3 (19 virus), H4 (2), H5 (8), H6 (30), H9 (114)
và H11 (5). Cụ thể hơn là H3N2 (18 virus), H3N6 (1), H4N6 (2), H6N2 (14),
H6N6 (16), H9N2 (109), H9N6 (5), H11N6 (1) và H11N7 (4). Do đó, cần tăng
cường công tác tiêu độc khử trùng, đồng thời nghiên cứu xác định rõ các chủng
virus cúm A/H5 này để có biện pháp phòng chống bệnh phù hợp, đồng thời tạo
cơ sở để điều chế sản xuất vacxin và tiếp tục giám sát virus.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành xét nghiệm virus cúm A/H5N1.
Mẫu được xác định là dương tính với virus cúm A/H5N1 khi dương tính cúm A,
dương tính gen H5 và dương tính gen N1. Do đó, các mẫu dương tính với virus
cúm A/H5 tiếp tục được xác định gen N1 bằng phương pháp rRT-PCR để xác
định virus cúm A/ H5N1. Kết quả được trình bày ở phụ lục 7, biểu diễn qua hình
hình 4.5 và hình 4.6.
Kết quả xét nghiệm cho thấy, chỉ có 5/11 tỉnh có mẫu dương tính với virus
cúm A/H5N1: cao nhất là tỉnh Vĩnh Long chiếm tỷ lệ 1,79%, tiếp đến Kiên Giang
1,33%, Nghệ An 0,67%, thấp nhất Quảng Nam và Kon Tum với cùng tỷ lệ nhiễm
57
0,09%. Còn lại 6/11 tỉnh gồm: Quảng Ngãi, Đồng Tháp, Thừa Thiên Huế, Hà Nội,
Thái Nguyên và Phú Thọ không phát hiện được virus cúm A/H5N1 (hình 4.5).
Tỷ lệ phát hiện virus cúm A/H5N1 của 11 tỉnh giám sát rất thấp. Trong
30540 mẫu xét nghiệm chỉ có 69 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1, chiếm
tỷ lệ 0,23%. Tỷ lệ mẫu nhiễm virus cúm A/H5N1 ở miền Nam là cao nhất
(0.9%), tiếp đến là miền Trung (0.05%) (hình 4.6A).
Trong đó, tỷ lệ dương tính ở giai đoạn 1 cao nhất (0,24%), tiếp đến giai
đoạn 2 (0,23%), thấp nhất giai đoạn 3 với tỷ lệ 0,18% (hình 4.6B). Tỷ lệ này thấp
hơn các nghiên cứu giám sát của Nguyen & cs. (2014), với tỷ lệ nhiễm virus cúm
A/H5N1 là 3,9% trong các năm 2011-2013. Kết quả nghiên cứu lưu hành virus
cúm A/H5N1 từ 2007 đến 2009 tại các chợ ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông
Cửu Long cũng cho kết quả cao hơn với tỷ lệ dương tính virus cúm A/H5N1 là
6,6% (Phan & cs., 2013).
Virus cúm A/H5N1 là virus có độc lực cao, lưu hành tại Việt Nam từ cuối
năm 2003 đã gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Việc phát hiện virus cúm A/H5N1
tại các chợ buôn bán gia cầm sống tại các tỉnh cho thấy nguy cơ bùng phát dịch
bệnh tại địa phương.
Tại các chợ buôn bán gia cầm sống, các gia cầm mang virus cúm A/H5N1 có
thể bài thải virus ra ngoài môi trường, tích trữ qua nhiều ngày tại các chợ, từ đó có
58
thể lây truyền cho người và nhiều động vật khác, thậm chí còn có thể lây nhiễm ra
các trang trại thông qua sự di chuyển của người buôn bán gia cầm. Bởi phần lớn
người buôn bán đi vào những trang trại bằng phương tiện của họ và tự bắt gia cầm
mà không có bất kỳ biện pháp an toàn sinh học nào có thể dẫn đến tự lây lan từ đàn
gia cầm này sang đàn gia cầm khác (Phan & cs., 2013).
Do đó, các địa phương có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 cần tăng
cường công tác phòng bệnh tại chợ, thông báo kết quả xét nghiệm cho Ban quản
lý chợ để cảnh báo nguy cơ lây nhiễm virus cúm A/H5N1 đối với những người
kinh doanh, giết mổ, tiêu thụ gia cầm. Đồng thời tăng cường công tác vệ sinh tiêu
độc, khử trùng, công tác kiểm dịch,… nhằm giảm thiểu sự tồn tại, phát tán của
virus cúm A/H5N1 ngoài môi trường.
Kết quả nghiên cứu xác định subtype A/H5N1 cho thấy có 69 mẫu dương
tính với virus cúm A/H5N1 trong tổng số 350 mẫu dương tính cúm A/H5 (phụ
lục 7), chiếm tỷ lệ 19,71%. Như vậy, bên cạnh virus cúm A/H5N1 còn có nhiều
subtype A/H5Nx khác cũng đang lưu hành trong đàn gia cầm. Vì vậy, cần tiếp
tục nghiên cứu xác định các chủng A/H5Nx này cũng như độc lực của chúng để
có biện pháp phòng chống thích hợp.
59
Bên cạnh virus cúm A/H5N1 đã và đang lưu hành tại Việt Nam từ năm
2003 đến nay, từ tháng 4/2014 virus cúm A/H5N6 bắt đầu xuất hiện trên gia cầm
bệnh ở tỉnh Lạng Sơn, sau đó xuất hiện ở các tỉnh khác thuộc miền Bắc và miền
Trung như Lào Cai, Hà Tĩnh, Quảng Trị và Quảng Ngãi. Như đã tóm tắt trong
phần mở đầu, thực chất virus H5N6 là một biến chủng của virus H5N1 (Nguyễn
Đăng Thọ & cs., 2017); vì thế trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi cũng tiến hành
xét nghiệm xác định virus subtype H5N6. Các mẫu dương tính với virus cúm
A/H5 sẽ được xét nghiệm tiếp gen N6 bằng phương pháp rRT-PCR. Kết quả
được thể hiện ở phụ lục 8, biểu diễn ở hình 4.7 và hình 4.8.
Khác với kết quả xét nghiệm A/H5N1 chỉ xuất hiện chủ yếu là ở các tỉnh
miền Nam (Kiên Giang), kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N6 cho thấy, virus
này chủ yếu được phát hiện được ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An, Kon Tum,
Quảng Nam và Quảng Ngãi), cụ thể: Kon Tum chiếm tỷ lệ nhiễm cao nhất trong
các tỉnh được lấy mẫu (4,11%), tiếp theo là Quảng Nam với 46/3360 mẫu dương
tính, chiếm 1,37%, Nghệ An có 2/150 mẫu dương tính chiếm 1,33%, Quảng Ngãi
có 11/3360 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ 0,33%; Hà Nội có 1/3360 mẫu dương
tính với virus cúm A/H5N6, chiếm tỷ lệ 0,03%; các tỉnh Thừa Thiên Huế, Đổng
Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang, Phú Thọ và Thái Nguyên không phát hiện được
virus cúm A/H5N6 (hình 4.7).
60
Kết quả nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ phát hiện virus cúm A/H5N6 trên gia
cầm tại các tỉnh miền Bắc là rất thấp, chỉ 0,01%. Kết quả này thấp hơn rất nhiều
so với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan & cs. (2016), khi nghiên cứu về
sự lưu hành của virus cúm A tại một số chợ giáp biên giới với Trung Quốc ở tỉnh
Lạng Sơn với tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N6 là 4,52% (hình 4.8A).
A B
Trong tổng số 30540 mẫu được xét nghiệm, có 198 mẫu dương tính với virus
cúm A/H5N6, chiếm tỷ lệ 0,65% (phụ lục 8; hình 4.8A). Kết quả này thấp hơn kết
quả của một số nghiên cứu giám sát virus cúm A/H5N6 tại Việt Nam, cụ thể: theo
báo cáo của Cục Thú y về giám sát CGC do FAO tài trợ thực hiện tại 68 chợ buôn
bán gia cầm sống trên địa bàn 32 tỉnh, thành phố trong cả nước từ tháng 12/2015 đến
tháng 02/2016 phát hiện 91% số tỉnh có virus cúm A, 53% số tỉnh có virus H5N6.
Tỷ lệ dương tính trên gia cầm bán tại chợ đối với virus H5N6 là 5,32%.
Kết quả tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N6 ở giai đoạn 1 là 1,4% cao gấp
khoảng 3 lần so với giai đoạn 2 (0,47%) và giai đoạn 3 (0,44%) (hình 4.8B).
Trong giai đoạn 1 của nghiên cứu có 4/8 tỉnh là Nghệ An, Kon Tum, Quảng Nam
và Quảng Ngãi có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6. Đến giai đoạn 2, số
tỉnh có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 là 5/11 tỉnh. Ngoài 4 tỉnh cũ là
Nghệ An, Kon Tum, Quảng Nam và Quảng Ngãi có thêm Hà Nội. Giai đoạn 3 có
3/11 tỉnh có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 bao gồm: Kon Tum, Quảng
61
Nam và Quảng Ngãi (phụ lục 8).
Kết quả trên thấp hơn nhiều so với nghiên cứu giám sát chủ động trên 1280
mẫu thu thập từ gia cầm sống tại các chợ buôn bán, giết mổ gia cầm ở 3 khu vực
miền Bắc (Hà Nội, Quảng Ninh), miền Trung (Nha Trang) và miền Nam (Long An)
từ 2012 đến 2015 của Nguyễn Lê Khánh Hằng & Lê Thị Quỳnh Mai (2016), cụ thể:
tỷ lệ dương tính với subtype virus cúm A/H5 là 7,1% (91/1280 mẫu), trong đó virus
cúm A/H5N1 là 4,4 % (56/1280 mẫu), virus cúm A/H5N6 là 2,6% (33/1280 mẫu).
Từ kết quả xét nghiệm (phụ lục 6, 7, 8) cho thấy, tổng số mẫu dương tính với
virus cúm A/H5N1 (69 mẫu) và A/H5N6 (198 mẫu) là 267 mẫu trong tổng số 350
mẫu dương tính với virus cúm A/H5, chiếm tỷ lệ 76,29%. Như vậy, ngoài virus
A/H5N1 và A/H5N6 đang lưu hành phổ biến còn khoảng 23,71% virus cúm
A/H5Nx khác cũng đang lưu hành tại chợ buôn bán gia cầm sống. Vì vậy, cần có
thêm các nghiên cứu giám sát về các subtype H5Nx và các subtype HA khác.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng của
gia cầm gồm: 6649 gà, 12991 ngan/vịt và 10900 chim cút. Kết quả xác định tỷ lệ
nhiễm virus cúm theo loài được trình bày ở phụ lục 9 và biểu diễn hình 4.9.
Kết quả xét nghiệm mẫu cho thấy: tỷ lệ nhiễm virus cúm A trên gà là 15,7%
62
(1044 mẫu dương tính trong 6649 mẫu dịch hầu họng được kiểm tra), trên
ngan/vịt là 11,91% (1547/12991 mẫu dương tính với virus cúm A), và trên chim
cút nuôi tại các hộ chăn nuôi là 1,86% (203/10900 mẫu dương tính).
Mặc dù tỷ lệ ngan/vịt mang virus cúm A (11,91%) thấp hơn ở gà (15,7%),
nhưng chúng lại có tỷ lệ mang virus cúm A/H5 và virus cúm A/H5N1 cao gấp 2
– 2,5 lần so với gà. Cụ thể, tỷ lệ gà mang virus cúm A/H5 là 0,96% (64/6649
mẫu), mang virus cúm A/H5N1 là 0,23% (15/6649 mẫu) và mang virus cúm
A/H5N6 là 0,5% (33/6649 mẫu). Còn tỷ lệ ngan/vịt mang virus cúm A/H5 là
2,16% (280/12991 mẫu), mang virus cúm A/H5N1 là 0,42% (54/12991mẫu) và
mang virus cúm A/H5N6 là 1,27% (165/12991%).
Sự lưu hành của virus CGC A/H5N1 và A/H5N6 trên đàn gà và đặc biệt ở
trên đàn vịt có thể làm phát sinh các ổ dịch khiến cho việc phòng chống bệnh tại
địa phương khó khăn hơn bởi khả năng mang trùng và lan truyền mầm bệnh cho
đàn vịt tại địa phương (Sturm-Ramirez & cs., 2005).
Mặc dù trong những năm qua, dịch CGC A/H5N1 và A/H5N6 cũng xảy ra
lẻ tẻ trên chim cút ở một số tỉnh như Kiên Giang, Trà Vinh, Quảng Ngãi, Tiền
Giang. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, tỷ lệ phát hiện virus cúm A và A/H5
trên chim cút rất thấp lần lượt là 1,86% (203/10900 mẫu dương tính) và 0,06%
(6/10900 mẫu dương tính). Đồng thời không phát hiện được virus cúm A/
H5N1và A/H5N6 trên chim cút.
Trong số các mẫu dương tính với virus cúm A/H5, có 84 mẫu được lựa
chọn để tiến hành giải trình từ gen HA và tiến hành phân tích dựa trên cây phả hệ
(phụ lục 10). Các mẫu này được lựa chọn dựa theo không gian và thời gian để
đảm bảo các mẫu được đại diện cho các tỉnh trong thời gian nghiên cứu. Cây phả
hệ được xây dựng dựa trên gen HA của 84 chủng trong nghiên cứu được phân lập
từ các tỉnh Hà Nội, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Vĩnh Long,
Đồng Tháp và Kiên Giang từ tháng 1/2015 tới hết 3/2018 với các chủng tham
chiếu trong ngân hàng gen (GenBank), GISAID, và dữ liệu của Trung tâm Chẩn
đoán Thú y Trung ương (NCVD) gồm các chủng phân lập được ở Việt Nam từ
các năm trước đến các mẫu trong năm 2017.
63
Theo kết quả phân tích phả hệ gen HA, các chủng trong nghiên cứu được chia
thành 2 clade 2.3.4.4 và 2.3.2.1c. 34 chủng virus cúm A/H5N1 được phân lập từ
Vĩnh Long, Đồng Tháp, Kiên Giang, Kon Tum, và Quảng Nam thuộc subclade
2.3.2.1c cùng với các chủng tham chiếu A/Hongkong/6841/2010 (H5N1) và
A/Mongolia/X53/2009. Mức độ tương đồng về nucleotide với các chủng trong
nhóm (subclade 2.3.2.1c) là 89,7% -100%.
Tỷ lệ tương đồng về nucleotide của các chủng này với chủng A/Hongkong
/6841/2010 phân lập từ người ở Hồng Kông năm 2010 chỉ có 90,7%-93.7%. Còn lại
50 chủng dương tính với virus cúm A/H5N6 phân lập được từ Nghệ An, Quảng
Ngãi, Quảng Nam, Kon Tum và Hà Nội thuộc thuộc về clade 2.3.4.4 và chia thành 2
subclade là 2.3.4.4a và 2.3.4.4b giống như các kết quả nghiên cứu trước đây
(Nguyễn Đăng Thọ & cs., 2016). Giá trị boostrap tại gốc của các subclade này đều
cao và đạt mức 99 - 100 cho thấy sự hình thành 2 subclade này có độ tin cậy cao. So
sánh trình tự gen HA cho thấy, sự tương đồng gen HA (ở mức độ nucleotide) của
các virus H5N6 Việt Nam trong từng subclade là rất cao từ 98,6% - 99,7% (subclade
2.3.4.4a) và 96,9% - 99,7% (subclade 2.3.4.4b). Trong khi đó, sự tương đồng về gen
HA giữa 2 sublade này là 94,3%- 94,8%.
Các chủng virus H5N6 Việt Nam thuộc subclade 2.3.4.4a có sự tương đồng
gen HA với chủng virus tham chiếu A/chicken-/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6) (Bi
& cs., 2015) (98,4%- 99,6%) và A/Sichuan/26221/2014 (H5N6), chủng gây ca tử
vong đầu tiên ở người (WHO/Feb/2015) (98,3%- 99,5%) cao hơn so với chủng
A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6) (Bi & cs., 2015) (93,8%-95,0%).
Ngược lại các chủng virus H5N6 Việt Nam thuộc clade 2.3.4.4b có sự tương
đồng gen HA so với A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6) (90,2% -
98,1%) cao hơn là A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6) (89,6%- 94,3%) và
A/Sichuan/26221/2014 (H5N6) (89,7%- 94,4%).
Kể từ năm 2008, nhiều chủng virus cúm HPAI/H5 với subtype NA không
phải N1 như H5N2, H5N5, H5N6, H5N8 đã xuất hiện ở Trung Quốc (Zhao &
cs., 2012; Liu & cs., 2013; Wu & cs., 2014). Trong hai năm 2013-2014, các
chủng virus HPAI H5Nx cũng đã được phát hiện ở nhiều vùng lãnh thổ khác
ngoài Trung Quốc như Lào, Nhật Bản, Hàn Quốc, châu Âu, Mỹ, Canada (Lee &
cs., 2014; De Vries & cs., 2015; Wong & cs., 2015). Các báo cáo phân tích phả
64
hệ gen HA của những virus HPAI H5Nx cũng cho thấy chúng thuộc về clade
2.3.4 nhưng không nằm trong các subclade 2.3.4.1, 2.3.4.2 và 2.3.4.3 mà tạo
thành những nhánh virus mới trong clade 2.3.4. Theo định nghĩa clade của Nhóm
Nghiên cứu Tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO, phần lớn những virus
cúm HPAI H5Nx phát hiện trong năm 2013-2014 đều được các tác giả nghiên
cứu phân loại vào subclade 2.3.4.6. Ngày 12/01/2015, Tổ chức Y tế Thế giới đã
khuyến cáo sử dụng subclade 2.3.4.4 gọi thay cho subclade 2.3.4.6 sau khi Nhóm
Nghiên cứu Tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO tiến hành phân tích tất cả
những trình tự gen H5 gần đây (WHO, 2015).
Như vậy, trong thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2015 tới tháng 3/2018, virus
cúm A lưu hành ở Việt Nam thuộc 2 subclade: subclade 2.3.4.4 phân bố chủ yếu
ở miền Bắc và miền Trung; subclade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền Nam.
Tại thời điểm nghiên cứu, chưa phát hiện virus H5N6 ở miền Nam.
Trong 84 chủng dương tính với virus cúm A/H5 được lựa chọn giải trình tự
dựa trên gen HA (phụ lục 10), theo kết quả phân loại biến chủng đối với các
chủng virus cúm A/H5.
Trong thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2015 tới tháng 3/2018, virus cúm A
lưu hành ở Việt Nam thuộc 2 subclade (hình 4.10, hình 4.11, hình 4.12): subclade
2.3.4.4 phân bố ở miền Bắc và miền Trung và subclade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền
Nam; tại thời điểm nghiên cứu, virus H5N6 chưa phát hiện được ở miền Nam.
Virus CGC H5N6 lần đầu tiên được phát hiện gây bệnh trên gia cầm tại tỉnh
Lạng Sơn, Việt Nam vào tháng 4 năm 2014. Các virus H5N6, clade 2.3.4.4 Việt
Nam được chia thành 2 nhánh chính là nhánh virus giống với chủng
A/Sichuan/26221/2014 (H5N6) và A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2104 (H5N6)
của Trung Quốc. Trong nghiên cứu này, 2 nhánh virus đã được đặt tên lần lượt là
2.3.4.4a và 2.3.4.4b theo tiêu chí định nghĩa clade của Nhóm Nghiên cứu Tiến
hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO.
65
66
Chủng virus A/H5 từ 1/2015 - 6/2016; Chủng virus A/H5 từ 7/2016 - 6/2017; Chủng virus A/H5 từ 7/2017 - 3/2018; Chủng virus tham chiếu
67
68
Sự xuất hiện của chủng virus CGC độc lực cao subtype H5N6, clade 2.3.4.4
là một thách thức mới trong công tác phòng chống dịch CGC tại Việt Nam vì
chúng là chủng virus có protein H5 có thể kết hợp với nhiều subtype NA khác
nhau. Trong quá trình kết hợp đó, sự cân bằng giữa các hoạt động của HA và NA
có thể tạo ra những tổ hợp HA và NA mới có khả năng lây nhiễm vượt qua hàng
rào loài. Do vậy, H5N6 có thể coi là một biến chủng mới của virus cúm A/H5N1.
Vì vậy chứng minh nguồn gốc phát sinh của nhánh virus H5N6 là việc cần thiết
trong giai đoạn hiện nay.
84 chủng dương tính với virus cúm A/H5 được xây dựng cây phả hệ dựa
trên gên HA với các chủng tham chiếu trong ngân hàng gen (GenBank),
GISAID, và dữ liệu của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương gồm các
chủng phân lập được ở Việt Nam từ các năm trước đến năm 2017.
Theo kết quả phân tích phả hệ gen HA, các chủng trong nghiên cứu được
chia thành 2 clade 2.3.4.4 và 2.3.2.1c: 34 chủng virus cúm A/H5N1 được phân
lập từ Kiên Giang, Đồng Tháp, Kon Tum, và Quảng Nam thuộc subclade
2.3.2.1c cùng với các chủng tham chiếu A/Hongkong/6841/2010 (H5N1) và
A/Mongolia/X53/2009. Mức độ tương đồng về nucleotide với các chủng trong
nhóm (subclade 2.3.2.1c) là 92,2% - 100%.
Tỷ lệ tương đồng về nucleotide của các chủng này với chủng
A/Hongkong/6841/2010 phân lập từ linh trưởng ở Hồng Kông năm 2010 chỉ có
92,2% - 93.7%; còn lại 50 chủng dương tính với virus cúm A/H5N6 phân lập
được từ Quảng Ngãi, Quảng Nam, Kon Tum và Hà Nội thuộc về clade 2.3.4.4
và chia thành 2 subclade là 2.3.4.4 a và 2.3.4.4b giống như các kết quả nghiên
cứu trước đây (Nguyễn Đăng Thọ & cs., 2016). Giá trị boostrap tại gốc của các
subclade này đều cao và đạt mức 100 cho thấy sự hình thành 2 subclade này có
độ tin cậy cao.
Từ kết quả phân tích phả hệ và so sánh trình tự gen HA có thể nói các
virus H5N6 Việt Nam clade 2.3.4.4a thuộc dòng virus H5N6 Sichuan và các
virus 2.3.4.4b thuộc dòng virus H5N6 Jiangxi xuất hiện ở Trung Quốc năm
2014 (Bi & cs., 2015). Các subclade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b đều nằm trong clade
2.3.4 cũng gợi ý rằng gen HA của virus H5N6 có nguồn gốc từ các virus cúm
HPAI H5N1 lưu hành ở Trung Quốc và Việt Nam mà chủng H5N1 tổ tiên
69
chung gần nhất là chủng A/Duck/Yunan/6490/2006, clade 2.3.4.2. Tuy nhiên
gen HA của các virus H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b không bắt
nguồn trực tiếp từ các virus H5N1 mà dường như thông qua các virus như
A/Duck/Hebei/2/2011(H5N2) và A/Duck/Guangdong/wy19/2008 (H5N5), là
những virus hình thành do sự tái tổ hợp gen của virus cúm subtype H5N1 với
các virus cúm subtype khác khác như H5N2, H6N2, H6N5 (Liu & cs., 2013).
Virus cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2001 tại các chợ buôn bán
gia cầm sống trên địa bàn Hà Nội (clade 0) (Jabhao & cs., 2009) nhưng chỉ thực sự
gây ra dịch bệnh vào cuổi năm 2003 (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2004). Một số
công trình nghiên cứu về nguồn gốc của virus cúm A/H5N1 trong thời gian qua
cho thấy liên tục có sự xuất hiện các biến chủng mới của virus CGC tại Việt Nam.
Qua kết quả phân loại biến chủng đối với virus cúm A/H5N1, virus CGC
trong thời gian nghiên cứu thuộc về 2 subtype chính là H5N1 và H5N6. Tất cả các
virus cúm subtype H5N1 đều thuộc clade 2.3.2.1c và chủ yếu lưu hành ở các tỉnh
phía Nam. Tuy nhiên chúng vẫn xuất hiện rải rác ở các tỉnh phía Bắc và Miền
Trung. Các virus H5N6 thuộc về 2 clade là 2.3.4.4a (dòng Sichuan) và 2.3.4.4 b
(dòng Jiangxi) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh Phía Bắc và Miền Trung.
Dựa theo các thông tin về nơi thu thập mẫu kết hợp với các thông tin về
dịch tễ tại 11 tỉnh nghiên cứu cùng các thông tin ổ dịch phát hiện được trong thời
gian giám sát từ tháng 1/2015 tới tháng 3/2018 (Cục Thú y, 2016; Cục Thú y,
2017; Cục Thú y, 2018), chúng tôi phân tích sự xuất hiện của các biến chủng
cúm A/H5N1, vẽ bản đồ dịch tễ sử dụng phần mềm QuantumGIS. Sự phân bố
của virus cúm A/H5 ở Việt Nam năm 2015-2018 được thể hiện ở hình 4.13, hình
4.14, hình 4.15: virus CGC từ các ổ dịch trên cả nước thuộc về 2 subtype chính là
H5N1 và H5N6.
Tất cả các virus cúm subtype H5N1 đều thuộc clade 2.3.2.1c và không chỉ lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như năm đầu 2017 mà đã xuất hiện phổ biến hơn ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung như Bắc Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Cao Bằng, Quảng Ninh, Nghệ An, Kon Tum và Quảng Nam.
70
71
72
Các virus H5N6 thuộc về 2 clade là 2.3.4.4a (dòng Sichuan) và 2.3.4.4b (dòng Jiangxi) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung như Bắc Ninh, Hà Nội, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Lào Cai, Cao Bằng, Lai Châu, Vĩnh Phúc, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Trị, Kontum. Đặc biệt, clade
73
2.3.4.4b xuất hiện nhiều hơn từ năm 2015 cho tới nay. Các tỉnh phía Nam chưa phát hiện được virus H5N6 từ mẫu thu thập. Chủng virus cúm A/H5 được phân lập trong nghiên cứu này cũng thuộc 3 subclade là 2.3.4.4a,b và 2.3.2.1c. Các chủng phân lập ở các tỉnh Vĩnh Long, Đồng Tháp đều thuộc subclade 2.3.2.1, các chủng phân lập được từ Quảng Nam, Quảng Ngãi và Kon Tum đều thuộc subclade 2.3.4.4a,b (Đàm Thị Vui & cs., 2018).
Tóm lại, virus cúm A lưu hành ở Việt Nam thuộc 2 subclade: subclade 2.3.4.4 phân bố ở miền Bắc và miền Trung; subclade 2.3.2.1c phân bố phổ biến hơn ở cả 3 miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Tại thời điểm nghiên cứu, chưa phát hiện virus cúm A/H5N6 ở miền Nam.
HA là protein bề mặt của virus cúm có vai trò quan trọng trong việc bám
gắn vào màng tế bào để khởi đầu cho quá trình lây nhiễm. Kết quả phân tích trình
tự amino acid gần vị trí cắt được trình bày ở hình 4.16.
Ghi chú: đặc tính của mỗi amino acid được biểu diễn bằng màu sắc: kỵ nước (màu đen), có tính axit (màu đỏ), kiềm tính (màu xanh dương), trung tính (màu tím) và phân cực (màu xanh lá cây). Mũi tên biểu thị vị trí cắt giữa tiểu phần HA1 và HA2. Chữ số phía bên phải trình tự biểu thị số mẫu có trình tự tương ứng so với tổng số trình tự của mỗi clade.
74
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra liên hệ giữa trình tự amino acid ở gần vị trí cắt và độc lực của virus cúm (Senne & cs., 1996). Đối với virus cúm thể độc lực cao, ở tiểu phần HA1 và gần vị trí cắt tồn tại nhiều amino acid kiềm tính. Đối chiếu với motif B-X-B-R điển hình của các chủng virus cúm A có độc lực cao (với B là amino acid kiềm tính, X là amino acid không có tính kiềm và R là arginine) (Senne & cs., 1996). Trong 84 chủng được giải trình tự (đã dùng để xây dựng cây phả hệ), có 6 chủng [16H5-VL3-241, 16H5-VL3-254, 16H5-VL3-422, 16H5-VL3-535 (clade 2.3.2.1c) và 16H5-QNG3-153, 16H5-QNG3-301 (clade 2.3.4.4b)] bị khuyết thiếu nucleotit ở vị trí cắt giữa tiểu phần HA1 và HA2. Do đó, chỉ có 78 trình tự gen HA1 được dùng để phân tích đặc điểm biến đổi trình tự ở cấp độ nucleotit và amino acid. Có thể thấy, 77/78 chủng virus thuộc clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b mang đặc trưng này (hình 4.17). Motif cơ bản của các chủng virus cúm trong nghiên cứu này là PQRERRRKR|GLF (2.3.2.1c), PLREKRRKR|GLF (2.3.4.4a/b). Dựa vào trình tự amino acid ở gần vị trí cắt HA1-HA2 cho phép suy đoán các biến chủng virus cúm kể trên là thể độc lực cao.
Dựa vào nghiên cứu đã công bố của Sun & cs.(2013), trình tự 3 vùng cấu
thành nên hốc gắn thụ thể của tế bào vật chủ đã được xác định (hình 4.17).
Trong 78 trình tự gen HA1 lựa chọn phân tích đặc điểm trình tự amino acid
ở hốc gắn thụ thể, tiếp tục cắt bỏ những trình tự giống nhau (dùng công cụ
Duplicate finder) còn lại 56 trình tự gen HA1.
Ghi chú: trong 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất xuất hiện được thể hiện trong dấu [] ở trước tên chủng virus. Vị trí amino acid đặc hiệu cho thụ thể của gia cầm được đóng khung. Mũi tên chỉ các amino acid thay đổi khác biệt.
75
Trong 56 trình tự HA1 lựa chọn nghiên cứu, chỉ giữ lại các trình tự đại diện (13 trình tự), với tần suất xuất hiện (số virus cùng đặc điểm trình tự amino
acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ) được thể hiện ở trước tên chủng virus. Về
đột biến ở hốc gắn với thụ thể của vật chủ, 18/18 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 9/9
chủng thuộc clade 2.3.4.4a và 25/29 chủng thuộc clade 2.3.4.4b mang trình tự amino acid Q-222 và G-224 có ái lực cao, đặc hiệu với receptor ở gia cầm (Ha &
cs., 2001; Bui & cs., 2014; Tzarum & cs., 2015). Tuy nhiên, có 4/29 chủng virus
thuộc clade 2.3.4.4b mang đột biến G-224-E (hình 4.18). Đặc biệt, trong 4 chủng
kể trên có 1 chủng (16H5-KT2-242) đột biến ở cả 2 vùng đặc hiệu với thụ thể
của gia cầm là E-186-K và G-224-E (mũi tên hình 4.18). Ảnh hưởng của các đột
biến này chưa được làm rõ trong phạm vi nghiên cứu.
Tiểu phần HA1 của protein HA cấu tạo thành phần nhô lên trên bề mặt hạt
virus và bộc lộ vị trí kháng nguyên với hệ miễn dịch, do đó có tốc độ thay đột
biến cao (Kirkpatrick & cs., 2018). Trình tự amino acid ở 5 vùng kháng nguyên
nằm trên tiểu phần HA1 tiếp tục được phân tích để làm rõ đặc điểm đột biến giữa
các virus trong cùng clade hoặc giữa các clade (hình 4.18 - hình 4.20).
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống với trình tự ở trên cùng.
76
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống với trình tự ở trên cùng.
77
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống với trình tự ở trên cùng.
Về đột biến ở các vùng kháng nguyên (A- E), so với 2 chủng virus vacxin
được dùng trong nghiên cứu này (clade 1, clade 2.3.4), hầu hết các chủng virus
thuộc 3 clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b đều có thay đổi amino acid tại 5 vùng kháng
nguyên. Trong 5 vùng đó, vùng kháng nguyên A và D có nhiều đột biến nhất, đặc
biệt là ở các vị trí amino acid 123, 127, 134- 137 (vùng kháng nguyên A) và 192,
198-199 (vùng kháng nguyên D). Sự thay đổi amino acid ở các vùng kháng nguyên là tương đối phổ biến đối với virus cúm nói chung và subtype H5Nx nói riêng (Liu & cs., 2016). Ngược lại, có một số vị trí trong mỗi vùng kháng nguyên ít/ không có thay đổi, ví dụ như vị trí 112 (vùng kháng nguyên A); 177, 179-180 (vùng kháng nguyên B); 43-44 (vùng kháng nguyên C); 165, 196, 208, 211 (vùng kháng nguyên D); 63, 83 (vùng kháng nguyên E). Kết quả trình bày ở hình 4.19-
hình 4.21 còn cho biết đột biến điểm ở tiểu phần HA1 còn xuất hiện ở các vị trí kề bên những vùng kháng nguyên. Đặc điểm này cũng đã được mô tả trong nhiều
78
nghiên cứu về virus cúm gia cầm (Bui & cs., 2014; Nguyen & cs., 2017;
Ohkawara & cs., 2017).
Kết quả dự đoán khả năng gắn kết một gốc đường (oligosaccharide) vào
amino acid asparagin (N) ở tiểu phần HA1 được trình bày ở hình 4.22.
Ghi chú: Phần mềm NetNGlyc 1.0 dự đoán có 10 vị trí có hiện tượng glycosyl hóa (số thứ tự ở trên trình tự). Dấu “.” biểu thị amino acid giống với trình tự ở trên cùng. Dấu “-“ biểu thị không có amino acid ở vị trí tương ứng. Trong 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất xuất hiện được thể hiện trong dấu [] ở trước tên chủng virus.
Trình tự ở các vị trí glycosyl hóa của 56 chủng virus cúm H5Nx đại diện
trong nghiên cứu này khá đa dạng, với 12 kiểu đại diện. Ở mỗi vị trí glycosyl hóa
cũng có biến đổi, dẫn tới hiện tượng thêm/ mất khả năng glycosyl hóa. Phần lớn
79
(34/58) chủng virus có 6 vị trí được glycosyl hóa là 10-NNS, 11-NST, 23-NVT,
165-NNT, 193-NPT và 286-NSS (hình 4.21). Đáng chú ý, hầu hết các chủng
thuộc clade 2.3.2.1c có thêm 2 vị trí được glycosyl hóa (so với chủng vacxin
clade 1, clade 2.3.4) là 140-NSS và 236-NDT. Vai trò của hiện tượng glycosyl
hóa giúp virus lẩn tránh miễn dịch đã được biết ở virus cúm type A (Abe & cs.,
2004) và subtype H5 nói riêng (Hervé & cs., 2015). Do vậy, sự thay đổi vị trí/ số
lượng điểm được glycosyl hóa ở các chủng virus cúm A/H5Nx phát hiện trong
nghiên cứu này có thể dẫn tới khả năng mẫn cảm khác nhau với đáp ứng miễn
dịch chống lại virus cúm.
Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử tiêu phần protein HA1 của 56
chủng virus cúm A/H5Nx đại diện (hình 4.16 - hình 4.21) cho thấy đại đa số có tính
đặc hiệu với receptor của gia cầm và là các chủng virus có độc lực cao. Thêm vào
đó, sự biến đổi ở các vùng kháng nguyên và vị trí glycosyl hóa đã tạo ra tính đa dạng
kháng nguyên giữa các chủng virus trong cùng một clade và giữa các clade.
Kết quả thí nghiệm xác định chỉ số độc lực của virus được trình bày cụ thể
ở phụ lục 11, biểu diễn qua hình 4.22 và hình 4.23.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả gà đều dương tính với virus cúm
A/H5N1 (Ct<35). Những gà chết chậm hơn có xu hướng bài thải nhiều virus hơn
80
qua đường hầu họng, cụ thể: gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.2.1c có
7/10 gà chết trong ngày đầu sau gây nhiễm, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 2,
điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,95; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade
2.3.4.4a ngày đầu có 3/10 gà chết, ngày thứ 2 thêm 4 con chết, và toàn bộ gà chết
trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là
2,78; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.4.4b ngày đầu có 6/10 gà chết,
ngày thứ 2 thêm 3 con chết, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm
virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,87 (hình 4.23A) (phụ lục 11).
Virus H5N1 clade 2.3.2.1c và H5N6 clade 2.3.4.4b bắt đầu gây chết gà sau
12h gây nhiễm. Sau 24h đầu tiên, hai chủng virus này đã gây chết lần lượt cho
70% và 60% gà thí nghiệm. Trong khi đó virus H5N6 clade 2.3.4.4a bắt đầu gây
chết gà muộn hơn (sau 24h) và chỉ có 30% gà chết. Virus H5N1 clade 2.3.2.1c
gây chết 100% gà thí nghiệm trong thời gian 48h sau khi gây nhiễm. Hai chủng
virus H5N6 clade 2.3.4.4a & b cần thời gian lâu hơn (60h) để gây chết 100%
động vật thí nghiệm (hình 4.22).
Từ kết quả trên có thể nhận định, virus clade 2.3.2.1c gây chết nhanh gà thí
nghiệm với tỷ lệ cao, tiếp đến là virus clade 2.3.4.4b và clade 2.3.4.4a.
Kết quả thể hiện trên hình 4.22 cho thấy: hầu hết gà thí nghiệm chết đột
ngột trong vòng 24h đầu tiên sau gây nhiễm; chỉ số IVPI đều cho thấy cả 3 biến
chủng đều có độc lực cao theo tiêu chuẩn đánh giá của OIE. Với kết quả chỉ số
IVPI của các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6
clade 2.3.4.4b tương ứng là 2.95; 2,78 và 2,87 (phụ lục 11) phù hợp với nghiên
cứu của Nguyễn Đăng Thọ & cs. (2016). Để so sánh độc lực của các biến chủng,
chúng tôi đã tiến hành phân tích về số gà chết sau gây nhiễm với thời gian chết
trung bình ở các lô gà thí nghiệm, kết quả được biểu diễn ở hình 4.23.
Thời gian trung bình gây chết gà thí nghiệm khi sử dụng virus H5N1 clade
2.3.2.1c (27.6h) là nhanh nhất, tiếp đến là virus H5N6 clade 2.3.4.4b (31.2h) và
cuối cùng là virus H5N6 clade 2.3.4.4a (43.2h) (hình 4.23B).
Qua kết quả trên, ta thấy có sự liên hệ giữa độc lực của virus với thời gian gây
chết gà thí nghiệm. Những virus có độc lực cao hơn thì thời gian gây chết gà thí
nghiệm nhanh hơn, tỷ lệ chết cũng lớn hơn.
81
Sau khi công cường độc, kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng đánh giá
theo thang điểm của OIE của gà được gây nhiễm virus CGC H5N1 clade
2.3.2.1c, virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a, clade 2.3.4.4 b được tổng hợp chi tiết
ở phụ lục 12 và biểu diễn ở hình 4.24.
82
Qua theo dõi thí nghiệm cho thấy:
Gà đối chứng đều khỏe mạnh, tăng trọng tốt và không có bất cứ biểu hiện
bất thường nào. Trong khi tất cả gà gây bệnh thực nghiệm với virus CGC chết
với tỷ lệ 100% vào ngày thứ 5, cụ thể:
Gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c có điểm lâm sàng trung bình cao
nhất là 2.72, một nửa số gà gây nhiễm virus có biểu hiện triệu chứng bệnh vào
ngày đầu tiên sau CCĐ với triệu chứng: sốt cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt,
nước mũi, thở khò khè, vảy mỏ. Có 2/10 gà chết đột ngột không quan sát thấy
triệu chứng lâm sàng. 70% (7/10 con) số gà chết vào ngày thứ 2 và 30% (3/10
con) còn lại chết vào ngày thứ 3. Như vậy, gà có biểu hiện triệu chứng rất sớm và
chết nhanh, tỷ lệ chết 100% sau 3 ngày CCĐ.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a có điểm lâm sàng trung bình
thấp nhất là 2.29, diễn biến về biểu hiện lâm sàng chậm. Gà bắt đầu có biểu hiện
triệu chứng vào ngày thứ 2 sau gây bệnh với tỷ lệ 30% (3/10 con), 70% gà đến ngày
thứ 3 mới biểu hiện triệu chứng. Các triệu chứng gồm: ủ rũ, mệt mỏi, nước mắt,
nước mũi chảy, thở khò khè, vảy mỏ, gà phải rướn cao mỏ để thở, mắt bị viêm, mặt
phù nề, mào tích tím tái dày lên do thủy thũng, dưới da vùng chân có xuất huyết.
Ngoài ra, gia cầm còn có biểu hiện thần kinh như run rẩy, đi không vững, ủ rũ, nằm
li bì tụ đống với nhau, một số bãi phân và lẫn máu. Gà chết nhiều nhất vào ngày thứ
4 với tỷ lệ 60% (6/10 con) và đạt đến 100% vào ngày thứ 5.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4b có điểm lâm sàng trung bình
là 2.50, các biểu hiện lâm sàng biểu hiện tương tự nhưng xảy ra chậm hơn so với
gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c và nhanh hơn so với gà gây nhiễm virus
H5N1 clade 2.3.4.4a.
Qua kết quả trên cho thấy các virus H5N1 2.3.2.1c, H5N6 2.3.4.4a, 2.3.4.4b
gây triệu chứng trên gà khá tương đồng với các chủng virus H5N6 ở các nước
khác như Trung Quốc, Lào với các triệu chứng chủ yếu là: ủ rũ, lông dựng, sưng
mặt, sung huyết, xuất huyết mào tích và chân, xuất huyết dưới da, phù xung
quanh cẳng chân, khuỷu chân và triệu chứng thần kinh (Sun & cs., 2016; Xiang
& cs., 2017; Butler & cs., 2016). Nhiều triệu chứng do virus H5N6 cũng xảy ra
tương tự như do virus H5N6 clade 2.3.2.1 gây ra như phù mí mắt, ít vận động,
giảm ăn, khát nước, lông dựng, tím mào, ngoẹo cổ và các triệu chứng thần kinh
83
(Jiao & cs., 2016). Tuy nhiên ngoài các triệu chứng trên, các triệu chứng viêm
mắt, sưng phù mặt là các triệu chứng khá phổ biến ở gà nhiễm virus H5N6 của
Việt Nam. Điều đáng chú ý là với các virus H5N1 2.3.2.1c thường có triệu chứng
hô hấp nặng như chảy nhiều nước mắt, nước mũi, hen khẹc, vảy mỏ... thì các
virus H5N6 ít có hiện tượng này. Sự khác biệt về kiểu gây bệnh này cũng có thể
giải thích cho hiện tượng gà nhiễm virus H5N1 2.3.2.1c chết nhanh hơn gà nhiễm
virus H5N6 do các dịch tiết ở đường hô hấp quá nhiều làm tắc đường thở và gây
chết đột ngột gà. Hiện tượng này cũng được thấy ở trong các nghiên cứu gây
bệnh trên gà trước đây với các virus H5N1 (Suzuki & cs., 2009). Từ kết quả trên
cho thấy, điểm trung bình về triệu chứng giữa 3 nhóm gà thí nghiệm có sự khác
nhau nhưng các triệu chứng tương tự nhau. Những triệu chứng lâm sàng quan sát
được trong thí nghiệm đều phù hợp với đặc điểm của gà bị nhiễm CGC độc lực
cao đã được nêu ra (OIE, 2015; Nguyễn Bá Hiên, 2014). Như vậy trong chẩn
đoán bệnh CGC ở gà, những biểu hiện bệnh như gà xù lông, ít vận động, mào
tích tím tái, ngoẹo cổ, xuất huyết dưới da, chết ồ ạt, cho phép suy đoán nguyên
nhân của bệnh là do nhiễm virus CGC.
Sau khi kết thúc thí nghiệm công cường độc, tiến hành mổ khám gà thí
nghiệm để kiểm tra bệnh tích đại thể:
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.2.1c có bệnh tích chủ yếu xuất hiện ở đường
hô hấp (hình 4.25): niêm mạc xoang mũi, miệng bị sung huyết, chảy dịch (hình
4.25A); khí quản xuất huyết nặng (hình 4.25B); phổi phù, sung huyết, xuất huyết
(hình 4.25C). Ngoài ra, còn một số gà quan sát thấy: tuyến tụy xuất huyết (hình
4.25D); trực tràng xuất huyết (hình 4.25E); phù,xuất huyết dưới da vùng đầu
(hình 4.25F); não sung huyết (hình 4.25G); xuất huyết mỡ vành tim (hình 4.25H).
Tuy nhiên, một số con không biểu hiện bệnh tích rõ ràng có thể do chết quá cấp
tính nên không quan sát thấy tổn thương về đại thể.
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.4.4a, bệnh tích cũng tập trung ở đường hô
hấp tương tự như nhóm clade 2.3.2.1c nhưng diễn biến chậm hơn, số lượng gà có
biểu hiện bệnh tích nhiều hơn, cụ thể (hình 4.25): da chân xuất huyết (hình
4.25I); khí quản thấy chứa nhiều dịch, xuất huyết (hình 4.25J); phổi phù, sung
84
huyết và xuất huyết (hình 4.25K); kiểm tra niêm mạc ruột, 7/10 con có các đám
xuất huyết (hình 4.25L); 8/10 con có xuất huyết ở hậu môn (hình 4.25M); 4/10
con phù, xuất huyết dưới da vùng đầu (hình 4.25N); 5/10 con não xuất huyết
(hình 4.25O); 6/10 con có mỡ vành tim xuất huyết (hình 4.25P).
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.4.4b, bệnh tích cũng tập trung ở đường hô
hấp tương tự như 2 nhóm trên, với các bệnh tích cụ thể như: mào tích tím tái, xuất
huyết (hình 4.25Q); khí quản xuất huyết (hình 4.25R); phổi phù và xuất huyết
(hình 4.25S); tuyến tụy xuất huyết (hình 4.25T); túi Fabricius phù Tuyến (hình
4.25U); lách phù, xuất huyết (hình 4.25V); não xuất huyết (hình 4.25W); xuất
huyết mỡ vành tim (hình 4.25X).
Như vậy, qua kết quả thí nghiệm cho thấy bệnh tích chủ yếu của gà được
gây bệnh thực nghiệm với virus cúm H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a
và 2.3.4.4b xuất hiện ở nhiều cơ quan trong cơ thể với đặc trưng là phù, sung
huyết và xuất huyết.
Trong đó, bệnh tích trầm trọng nhất tập trung ở đường hô hấp, gồm xoang
mũi, xoang miệng, khí quản và phổi. Khí quản thấy chứa nhiều dịch, xuất huyết;
phổi phù, sung huyết và xuất huyết rất nặng. Điều này giải thích cho các triệu
chứng quan sát được khi theo dõi lâm sàng như: khó thở, chảy nước mũi, vẩy mỏ.
So sánh với gà được gây bệnh thực nghiệm với virus CGC H5N1 (Pfeiffer & cs.,
2009), bệnh tích đại thể ở phổi giống nhau, trong khi bệnh tích ở xoang mũi và
miệng không được đề cấp đến. So với kết quả khảo sát của Lê Văn Năm (2004),
về bệnh tích đại thể bệnh CGC ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc từ
phổi viêm cata, xuất huyết đến viêm thể fibrin. Trên gà tây gây bệnh thực nghiệm
với virus CGC FAV002/H5N1, cũng có bệnh tích chủ yếu là viêm màng phổi
dạng fibrin trong khi ở ngan còn thấy phù phổi và sung huyết ở khí quản
(Berhane & cs., 2016).
Tần số xuất hiện bệnh tích ở đường tiêu hóa cũng chiếm tỷ lệ cao với đặc
điểm thành ruột dầy, có các đám xuất huyết ở vùng niêm mạc và mảng Peyer
vùng ruột non. Lớp niêm mạc manh tràng, vùng hậu môn, điểm nối hồi manh
tràng cũng có biểu hiện sung huyết, xuất huyết.
85
Q
A
I
R
B
J
C
S
K
T
D
L
U
E
F
V
G
W
O
H
86
Điều này phù hợp với các triệu chứng ỉa chảy, phân lẫn máu đã quan sát được khi theo dõi lâm sàng. Những bệnh tích này giống với gà bị nhiễm virus CGC ở ngoài thực địa như với các đặc điểm viêm xuất huyết đường ruột, đặc biệt vùng lỗ huyệt, điểm nối hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng (Lê Văn Năm, 2004). Đối với gà gây bệnh thực nghiệm với virus cúm H5N1, bệnh tích chỉ được miêu tả xuất huyết mảng Peyer và điểm nối hồi manh tràng (Pfeiffer & cs., 2009).
Giải thích cho những bệnh tích xuất hiện nhiều ở đường hô hấp và ruột là quá trình xâm nhập và nhân lên của virus CGC ở các cơ quan này đầu tiên khi chúng hít phải virus. Trypsin giống những enzyme ở tế bào biểu mô của đường hô hấp và tiêu hóa cho phép phân tách hemagglutinin bề mặt, virus xâm nhập, nhân lên, giải phóng các virion trong đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sau đó các virion này xâm nhập vào lớp hạ niêm mạc rồi đi vào mao mạch. Virus nhân lên trong tế bào nội mạc, phát tán ra toàn bộ cơ thể thông qua hệ tuần hoàn và bạch huyết dẫn tới gây nhiễm, nhân lên ở nhiều loại tế bào trong các cơ quan nội tạng, não và da (Swayne & Halvorson, 2008).
Qua mổ khám thấy những tổn thương đại thể quan sát được đã lý giải các triệu chứng lâm sàng của gà theo dõi được sau khi gây bệnh. Bệnh tích đại thể biểu hiện ở gà cũng phản ánh sự tấn công của virus CGC H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b đã gây ra các biểu hiện có tính toàn thân. Do đó khi mắc bệnh CGC H5N1, H5N6 biểu hiện bệnh lý thường nặng nề dẫn đến tỷ lệ chết cao.
Kết quả quan sát thấy gà chết ở thể cấp tính không có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu trước đây, triệu chứng và bệnh tích bắt đầu xuất hiện từ 48h và rõ rệt lúc 72h sau gây nhiễm với những gà sống sót qua giai đoạn á cấp tính (Suzuki & cs., 2009; Wibawa & cs., 2013). Đối với gà có bệnh tích thì những bệnh tích của gà nhiễm H5N6 clade 2.3.4.4a và clade 2.3.4.4b rất khó phân biệt với nhau và rất khó phân biệt với bệnh tích của gà nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c. Tuy nhiên các bệnh tích thu thập được trong nghiên cứu này là khá đầy đủ so với những nghiên cứu trước đây khi chỉ có một số bệnh tích được mô tả như lách sưng to, lốm đốm, viêm phổi đặc, phù, sung huyết và xuất huyết, xuất huyết ở mảng Payer, hạch ruột tịt, xuất huyết điểm màng tim như ở gà nhiễm virus H5N1 clade 2.3.4 (Pfeiffer & cs., 2009), tổn thương hoại tử, xuất huyết ở các cơ quan nội tạng như màng thanh dịch, niêm mạc, lách và gan ở gà nhiễm virus H5N8 clade 2.3.4.4 (Bae & cs., 2015), xuất huyết đinh ghim nhẹ ở mỡ dưới da, sung huyết, xuất
87
huyết và hoại tử ở phổi, gan to màu hổ phách (Jiao & cs., 2016). Hơn nữa, nhiều nghiên cứu gần đây với virus H5N6 cũng không mô tả các biến đổi bệnh lý khi thực hiện thí nghiệm gây bệnh trên gà (Xiang & cs., 2017).
Đồng thời kết quả cũng phản ánh những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc
CGC H5N6 tương đối giống với những biến đổi bệnh lý của gà mắc cúm H5N1.
Gà sau khi mổ khám, lấy 15 mẫu ngẫu nhiên làm tiêu bản để kiểm tra bệnh tích vi thể gồm: khí quản, phổi, tuyến tụy, gan, thận, ruột và túi Fabricius. Kết quả tổng thể cho thấy gà thuộc 3 lô gây bệnh các cơ quan nội tạng đều quan sát phát hiện có tổn thương. Gà thuộc lô đối chứng cũng được lấy mẫu kiểm tra bệnh tích vi thể nhưng các cơ quan nội tạng đều bình thường, không có biến đổi bệnh lý.
D
A
G
B
E
H
C
F
I
Ghi chú: (A) phổi sung huyết, xuất huyết; (B) biểu mô khí quản bong tróc; (C; I) gan xuất huyết; (D) tuyến tụy viêm, xuất huyết; (E) ruột bong tróc niêm mạc; (F; H) fabricius phù, sung huyết; (G) thận xuất huyết; Mũi tên chỉ
các điểm xuất huyết ở tổ chức.
88
Ở cả 3 nhóm thí nghiệm công cường độc, gà đều có bệnh tích vi thể:
Nhóm gà thí nghiệm công cường độc clade 2.3.2.1c: phổi bị sung huyết,
xuất huyết tràn lan, biểu hiện bằng hình ảnh các hồng cầu tập trung lấp đầy mạch
quản và tràn lan ở trong lòng các phế quản và phế nang (hình 4.26A). Kể cả ở những con chết không biểu hiện bệnh tích đại thể đều thấy rõ hiện tượng phù.
Nguyên nhân là do virus nhân lên trong tế bào nội mạc, phá vỡ tế bào nội mạc
gây tổn thương thành mạch đến các thành phần trong lòng mạch thoát ra ngoài
trong đó hồng cầu là có thể quan sát rõ nhất. Đồng thời không duy trì được sự
cân bằng áp lực thủy tĩnh dẫn đến nước ra khỏi lòng mạch và vào gian bào (Swayne & Halvorson, 2008). Bệnh tích này cũng phù hợp với bệnh tích đại thể
khi mổ khám gà có thể thấy hiện tượng xuất huyết rất rõ. Qua đây cho thấy sự tổn thương ở phổi của gà mắc bệnh CGC do virus cúm H5N1 và H5N6 làm phổi
suy giảm chức năng vốn có của nó. Trong khi đó, lớp tế bào biểu mô khí quản
bong tróc, lông rung bị bong tróc và bào mòn (hình 4.26B). Gan sung huyết, hình
thành các điểm xuất huyết trên bề mặt (hình 4.26C).
Nhóm gà thí nghiệm công cường độc clade 2.3.4.4a: tuyến tụy viêm, có các
điểm xuất huyết (hình 4.26D). Tế bào hồng cầu tập trung thành từng đám, các tế bào tuyến tụy bị hoại tử. Khi quan sát trong vi trường thấy hình ảnh nhiều đám tế
bào bắt màu hồng đều một cách đồng nhất do hoại tử tế bào, nhân tế bào vỡ và
tan vào nguyên sinh chất nên không có vết tích của nhân. Ở ruột thấy hiện tượng
xuất huyết, các mạch quản bị sung huyết ở 50% số con thuộc 3 lô, đồng thời 1 số
con có cấu trúc lông nhung bị phá hủy ở vùng niêm mạc (hình 4.26E), đây cũng
là bệnh tích thường gặp của gà mắc CGC thể độc lực cao. Quan sát tiêu bản vi
thể ở túi Fabricius có nhiều dịch phù, sung huyết (hình 4.26F). Virus xâm nhập,
nhân lên và làm biến đối cấu trúc của túi Fabricius, cụ thể: các nang lympho bị
thoái hóa, cấu trúc của nang rời rạc; quan sát các nang lympho thấy cấu trúc đã bị phá hủy, lòng nang giãn rộng, các tế bào biểu mô của nang bị thoái hóa, bắt màu
mờ nhạt hơn so với những nang còn nguyên vẹn; gây xuất huyết túi Fabricius.
Nhóm gà thí nghiệm công cường độc clade 2.3.4.4b: quan sát thận thấy hiện tượng xuất huyết từng đám (hình 4.26G); ở túi Fabricius có nhiều dịch phù, sung
huyết và xuất huyết (hình 4.26H); gan xuất huyết hình thành nhiều điểm xuất
huyết trên bề mặt (hình 4.26I).
89
So sánh với thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên gà với virus Cúm H5N1 (VN/203) (Pfeiffer & cs., 2009), ở cơ quan miễn dịch như lách, túi Fabricius các
nang lympho cũng bị giảm. Thí nghiệm trên gà tây, ngỗng và ngan với virus
FAV002/H5N1 cũng cho thấy sự hoại tử ở lách dẫn đến giảm số lượng các tế bào
lympho (Berhane & cs., 2016). Tuy nhiên, ngoài những bệnh tích nêu trên gà nhiễm virus cúm H5N1 còn thấy ở cơ tim có nhiều điểm bị thoái hóa đến hoại tử
và sự xâm nhập của một số các tế bào viêm dạng lympho.
Do virus cúm H5N1 và H5N6 đều có độc lực cao, khi công cường độc virus
qua đường nhỏ mũi, tấn công mạnh vào hệ hô hấp rồi vào hệ tuần hoàn, gây bệnh cấp tính trên gà nên diễn biến bệnh nhanh, gây ra hiện tượng sung huyết, xuất
huyết tràn lan ở các cơ quan phủ tạng như gan, lách, thận, dạ dày tuyến, ruột. Không thấy có sự khác biệt đáng kể nào về bệnh tích đại thể và vi thể giữa 3
clade 2.3.2.1c (H5N1), 2.3.4.4a và 2.3.4.4b (H5N6).
Từ kết quả thu được của thực nghiệm cho thấy khi gà nhiễm virus CGC
H5N1 clade 2.3.2.1c, biến chủng H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b, bệnh tích
thường gặp là phù, sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hầu hết các cơ quan phủ
tạng của gà bệnh như: phổi, gan, lách, thận, não, tim, ruột, tụy, túi Fabricius, dạ dày tuyến, khí quản, tuyến ức. Trong đó, hiện tượng sung huyết, xuất huyết
chiếm tỷ lệ cao.
Kết quả trình bày ở mục 4.2 cho thấy 3 biến chủng virus cúm A/H5Nx
thuộc clade 2.3.2.1c, 2.3.4.4a và 2.3.4.4b có (1) độc lực cao và (2) mang đặc
điểm khác biệt về trình tự amino acid trên gen HA so với các chủng virus vacxin
được phép lưu hành ở Việt Nam. Trong sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia
cầm, mặc dù xảy ra đáp ứng miễn dịch chéo clade (cross-clade protection) nhưng
là đáp ứng có điều kiện, ví dụ như tùy thuộc vào liều kháng nguyên sẽ tạo được
đáp ứng miễn dịch vô trùng (sterilizing immunity) hay đáp ứng miễn dịch mang
trùng (non-sterilizing immunity) (Wood & cs., 1985; Swayne & cs., 1999). Nội
dung nghiên cứu ở mục 4.3 này được thực hiện nhằm kiểm tra khả năng và mức
độ vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của 3 biến chủng.
90
Để chuẩn bị nguyên liệu cho thí nghiệm, gà đã được gây miễn dịch bằng 2
loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm là Navet-vifluvac (clade 1) và Re-5 (clade
2.3.4). Ba tuần sau khi tiêm phòng vacxin, tiến hành kiểm tra đáp ứng miễn dịch
dịch thể (sử dụng kháng nguyên đồng chủng với kháng nguyên vacxin).
Kết quả xác định hiệu giá kháng thể (HGKT) (hình 4.27) cho thấy: gà được
tiêm vacxin Navet-vifluvac có HGKT trung bình đạt 5,0 log2 và gà được tiêm
vacxin Re-5 có hiệu giá kháng thể trung bình đạt 7,6 log2. Kết quả này phù hợp
với nghiên cứu của Phạm Thành Nhương & cs. (2016), nghiên cứu HGKT bảo
hộ khi sử dụng vacxin Navet-vifluvac đối với virus H5N1 cho kết quả 94% gà
thử nghiệm được bảo hộ về mặt huyết thanh (HGKT ≥ 4 log2), cũng như nghiên
cứu của Nguyễn Văn Cảm & cs. (2011) về mức độ bảo hộ kháng thể của vacxin
Re-5 đối với virus H5N1 trên gà đạt trung bình 4,1- 8,3 log2. Như vậy, gà có đáp
ứng miễn dịch ở trên ngưỡng bảo hộ (đường nét đứt màu đỏ hình 4.27) và đủ
điều kiện để thử thách công cường độc.
Hình 4.27. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm công cường độc bằng virus clade 2.3.2.1c
Kết quả theo dõi lâm sàng ở nhóm gà thí nghiệm và đối chứng sau công
cường độc được trình bày ở hình 4.28.
91
Nhóm gà đối chứng sau 1 ngày gây nhiễm virus, gà xuất hiện triệu chứng lâm sàng như: mệt mỏi, ủ rũ, chảy nước mũi, nước mắt. Sau đó gà chết rất đột ngột, chết 100% sau 3 ngày theo dõi. Những gà nuôi cách ly và không công cường độc, trong cùng thời gian theo dõi đều khỏe mạnh (không thể hiện).
Ở nhóm gà có đáp ứng miễn dịch trên ngưỡng bảo hộ chống lại virus cúm gia cầm clade 1 hoặc clade 2.3.4, chủng virus cúm clade 2.3.2.1c vẫn gây được bệnh ở mức ở mức độ nhất định, tóm tắt như sau. Gà tiêm vacxin Navet-vifluvac: sau 5 ngày đầu không có triệu chứng được ghi nhận, đến ngày thứ 6 và 7 có 20% gà (2/10 con) bị liệt chân, nằm bẹp, khó thở, dịch mũi chảy nhiều và chết sau đó. Những gà còn lại không có biểu hiện bệnh. Tỷ lệ sống sót sau 10 ngày theo dõi là 80%. Gà tiêm vacxin Re-5: tiến triển bệnh ở nhóm này nhanh hơn nhóm vacxin Navet-vifluvac. Gà biểu hiện triệu chứng và chết rải rác từ ngày thứ 2 đến ngày 7 sau công cường độc với tỷ lệ 50% (5/5 con). Còn lại 50% gà khác không có biểu hiện bệnh và đều sống sót sau 10 ngày theo dõi. Như vậy, về mặt lâm sàng, chủng virus cúm gia cầm clade 2.3.2.1c vẫn có khả năng gây bệnh ở gà đã được gây miễn dịch dị chủng, với tỷ lệ tương ứng 20% và 50% (hình 4.28).
Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể của toàn bộ số gà ở các lô thí nghiệm
được thể hiện ở bảng 4.1.
92
Số con biểu hiện/ số con thí nghiệm
TT Biến đổi bệnh lý Navet- Đối chứng Re - 5 vifluvac
1 Mào, tích thâm tím, phù nề 5/5 0/10 0/10
2 Xoang miệng, mũi nhiều dịch nhầy 3/5 0/10 0/10
3 Lỗ huyệt xuất huyết 5/5 0/10 0/10
4 Xuất huyết cơ đùi, cơ lườn 5/5 8/10 0/10
5 Xuất huyết mỡ vành tim 4/5 0/10 0/10
6 Phổi phù, sung huyết, xuất huyết 5/5 9/10 8/10
7 Dạ dày tuyến xuất huyết 3/5 0/10 0/10
8 Ruột xuất huyết 4/5 9/10 0/10
9 Tuyến ức sung huyết, xuất huyết 2/5 0/10 0/10
10 Túi Fabricius sưng, phù, xuất huyết 3/5 0/10 0/10
11 Não sung huyết 5/5 0/10 0/10
Ghi chú: bệnh tích quan sát được ở 2 nhóm thí nghiệm trở lên được đánh dấu
Ở nhóm gà đối chứng, có thể thấy chủng virus cúm thuộc clade 2.3.2.1c gây
bệnh tích điển hình của bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao, đó là hiện tượng sung
huyết, xuất huyết ở hầu hết các cơ quan nội tạng, với tỷ lệ xuất hiện mỗi loại
bệnh tích dao động từ 40%- 100% (cột 3, bảng 4.1). Những bệnh tích trên giống
với gà mắc bệnh cúm gia cầm được miêu tả ngoài tự nhiên (Lê Văn Năm, 2004)
hoặc trong điều kiện thí nghiệm (Nguyễn Thị Thúy Mận & cs., 2017), với sự
giống nhau là bệnh tích đại thể biểu hiện ở hầu hết các cơ quan, đặc biệt là ở
đường hô hấp và đường tiêu hóa.
Ngược lại, chủng virus thuộc clade này chỉ gây bệnh tích ở một số cơ quan
nội tạng của nhóm gà đã có miễn dịch bằng clade 2.3.4 (cột 4, bảng 4.1) hoặc
miễn dịch bằng clade 1 (cột 5, bảng 4.1). Đáng chú ý, bệnh tích phổi tích nhiều
dịch phù, sung huyết và xuất huyết lan tràn toàn bộ phổi (hàng 8, bảng 4.1) đều
quan sát được ở nhóm gà đối chứng và ở hai nhóm gà được gây miễn dịch dị
chủng. Tóm tắt biến đổi bệnh lý đại thể nêu trên được trình bày ở hình 4.29.
93
12 Gan xuất huyết 3/5 3/10 0/10
Ghi chú: (A) lỗ huyệt xuất huyết; (B) tuyến ức có các điểm xuất huyết; (C) mỡ vành tim có biểu hiện xuất huyết lấm chấm; (D) sung huyết ở lớp màng não; (E) phổi phù, xuất huyết tràn lan; (F; I) xuất huyết cơ đùi; (G; J) ruột xuất huyết; (H) phổi phù và sung huyết; (K) gan xuất huyết; (L) phổi phù, sung huyết và xuất huyết; Mũi tên chỉ các điểm xuất huyết ở tổ chức.
Ở nhóm đối chứng thấy biểu hiện bệnh tích ở nhiều nội quan, ví dụ như: lỗ huyệt xuất huyết (hình 4.29A), tuyến ức có các điểm xuất huyết (hình 4.29B), mỡ vành tim có biểu hiện xuất huyết lấm chấm (hình 4.29C), sung huyết ở lớp màng não (hình 4.29D), phổi phù, xuất huyết tràn lan (hình 4.29E), xuất huyết cơ đùi cũng gặp ở một số con (hình 4.29F), ruột xuất huyết (hình 4.29G). Ngoài ra, túi Fabricius sung huyết, dạ dày tuyến sung huyết, manh tràng xuất huyết, xoang mũi chứa nhiều dịch cũng quan sát được ở nhóm này (không thể hiện). Ở nhóm gà sử dụng vacxin Re-5 có một số bệnh tích của cúm gia cầm như: phổi phù và sung huyết (hình 4.29H), xuất huyết cơ đùi (hình 4.29I), ruột xuất huyết (hình 4.29J), gan xuất huyết ((hình 4.29K). Ở nhóm gà được gây miễn dịch bởi vacxin Navet-vifluvac chỉ thấy biểu hiện ở phổi (phù, sung huyết và xuất huyết; hình 4.29L), các cơ quan nội tạng như: khí quản, não, mỡ vành tim, dạ dày tuyến, ruột, tuyến tụy, v.v... không có bệnh tích.
94
Định lượng ARN của virus bài thải (sau đây gọi là định lượng virus) ở các nhóm gà được thực hiện vào ngày thứ 3, thứ 10 và khi gà chết sau công cường độc (hình 4.30).
Ghi chú: ngày 3 (D3), ngày 10 (D10), ngày gà chết (Dx) sau công cường độc. Đường nét đứt màu đỏ biểu
thị ngưỡng dương tính (Ct ≤ 35) và âm tính (Ct > 35) với virus cúm
Kết quả phân tích ở trên (hình 4.28, hình 4.29) cho thấy việc sử dụng vacxin đã bảo hộ về mặt lâm sàng ở ngưỡng 50%-80%, làm giảm mức độ tổn thương nội tạng của gà khi bị nhiễm virus cúm gia cầm thể độc lực cao clade 2.3.2.1c. Trong điều kiện thí nghiệm này, đáp ứng miễn dịch tạo ra không là tình trạng miễn dịch vô trùng (non-sterilizing immunity) khi công cường độc bằng virus clade 2.3.2.1c, với biểu hiện là hiện tượng thải virus (hình 4.30). Gà ở nhóm gây miễn dịch dị chủng (bằng virus vacxin clade 1 hoặc clade 2.3.4) thải mầm bệnh ít nhất đến ngày thứ 7 sau công cường độc (Ct ≤ 35, mũi tên, hình 4.30). Tuy nhiên ở ngày thứ 10, toàn bộ gà sống sót không còn thải virus (Ct trung bình là 40,00). Những gà chết trong vòng 10 ngày theo dõi, lượng virus bài thải với giá trị Ct trung bình dao động từ 29,71 đến 32,83. Ngược lại, gà ở nhóm đối chứng chết 100% và bài thải lượng lớn virus (Ct trung bình là 20,79).
Như vậy, đáp ứng miễn dịch dị chủng (đối với clade 2.3.2.1c) không bảo hộ hoàn toàn gà thí nghiệm về mặt lâm sàng và hiện tượng thải virus. Ở chiều ngược lại, có thể nói virus thuộc clade 2.3.2.1c đã vượt qua ở mức độ nhất định đáp ứng
95
miễn dịch dị chủng gây ra bởi virus thuộc clade 1 và clade 2.3.4. Nhận xét trên cho thấy sự cần thiết tiếp tục nghiên cứu về lưu hành biến chủng virus cúm để kịp thời có điều chỉnh công thức vacxin nhằm tạo ra đáp ứng miễn dịch vô trùng ở gia cầm được tiêm vacxin phòng bệnh.
Ở nội dung này, cả gà và vịt được dùng để tạo miễn dịch dị chủng (đối với
clade 2.3.4.4a). Kết quả được tóm tắt ở hình 4.31.
Gà được miễn dịch bởi virus thuộc clade 1 (vacxin Navet-vifluvac) và clade
2.3.4 (vacxin Re-5) có HGKT trung bình lần lượt là 5,2 log2 và 7,4 log2. Vịt sau khi được miễn dịch nhắc lại có HGKT trung bình rất cao (tương ứng là 9,0 log2 và 9,3 log2) với hai loại vacxin kể trên (hình 4.32). Như vậy, đã tạo được đáp ứng miễn dịch ở trên ngưỡng bảo hộ (đường nét đứt màu đỏ hình 4.31) cho cả gà
và vịt để thử thách công cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4a.
Kết quả theo dõi lâm sàng ở nhóm gà thí nghiệm và đối chứng sau công
cường độc được trình bày ở hình 4.32.
96
Sau công cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4a, quan sát được tiến triển bệnh khác nhau rõ rệt giữa nhóm đối chứng (không có miễn dịch) và nhóm thí nghiệm (có miễn dịch dị chủng với clade 2.3.4.4a). Ở nhóm đối chứng, sau gây nhiễm virus khoảng 2- 3 ngày gà và vịt bắt đầu xuất hiện những triệu chứng lâm sàng. Gà có tiến triển ở thể quá cấp, với hiện tượng chết rất đột ngột, có những con chết không quan sát được triệu chứng lâm sàng. Toàn bộ gà đối chứng
đều chết sau 4 ngày theo dõi (hình 4.32A). Ngược lại, vịt có tiến triển nhẹ hơn, với biểu hiện ủ rũ, có triệu chứng thần kinh, ngoẹo cổ, sau đó vịt chết rải rác từ
ngày thứ 4 sau công cường độc (hình 4.32B). Ngoài ra một số vịt có biểu hiện
97
nhiễm bệnh nhưng chỉ kéo dài 3- 4 ngày, con vật hồi phục và sống sót sau 10
ngày theo dõi. Tổng số vịt ở lô đối chứng chết sau công cường độc là 7/10 con.
Đối với nhóm gà có miễn dịch dị chủng bằng clade 1 (tiêm vacxin Navet-
vifluvac), sau 3 ngày đầu tiên không có triệu chứng được ghi nhận, đến ngày thứ 4 có 1/10 con bị liệt chân, nằm bẹp và có biểu hiện khó thở, dịch mũi chảy nhiều.
Gà nhiễm bệnh chết vào ngày thứ 5 sau công cường độc. Những ngày tiếp theo,
có thêm 1 gà khác ốm nhẹ và chết vào ngày thứ 9 với bệnh tích xuất huyết đặc
trưng của cúm thể độc lực cao ở vùng da bàn chân. Tỷ lệ sống sót sau 10 ngày
theo ngày theo dõi là 80% (đường nét đứt màu xanh, hình 4.33A). Nhóm gà được miễn dịch dị chủng bằng clade 2.3.4 (tiêm vacxin Re-5) có tiến triển chậm hơn 1-
2 ngày so với nhóm gà được miễn dịch bằng vacxin Navet-vifluvac. Gà đầu tiên chết vào ngày thứ 6 với biểu hiện ốm nhẹ trong ngày trước đó. Tiếp đến có thêm
2/10 gà bỏ ăn, chảy nước mắt, nước mũi, mào tím tái, phù vùng đầu, chết vào
ngày thứ 7 và thứ 8 sau công cường độc. Có 7/10 con không có biểu hiện bệnh và
đều sống sau 10 ngày theo dõi (đường nét đứt màu vàng cam, hình 4.32A).
Trái ngược với gà, nhóm vịt có miễn dịch dị chủng bằng clade 1 hoặc clade
2.3.4 đều sống 100% sau khi công cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4a (hình 4.32B). Trong thời gian theo dõi 10 ngày, ở cả 2 nhóm miễn dịch có tổng
4/10 vịt biểu hiện lâm sàng nhẹ (ủ rũ, chảy nước mũi ít, giảm ăn), kéo dài từ 2- 4
ngày rồi biến mất.
Phân tích kết quả công cường độc ở trên (hình 4.32) đã làm rõ sự tương
phản về tính gây bệnh của virus clade 2.3.4.4a giữa nhóm có miễn dịch và không
có miễn dịch. Đáng chú ý hơn là khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng để gây bệnh thể lâm sàng của virus clade 2.3.4.4a cao hơn ở gà (sống sót 70-
80%) so với ở vịt (sống sót 100%) (Nguyễn Hoàng Đăng & cs., 2017).
Độc lực của virus cúm gia cầm không chỉ thể hiện ở mặt lâm sàng, mà còn thể hiện thông qua tải lượng virus nhân lên ở cơ quan nội tạng và lượng virus bài thải. Kết quả trình bày ở hình 4.33 đánh giá mức bài thải virus clade 2.3.4.4a sau
công cường độc gà và vịt đã có miễn dịch dị chủng với clade này.
98
Ghi chú: ngày 3 (D3), ngày 10 (D10), ngày gà chết (Dx) sau công cường độc. Đường nét đứt màu đỏ biểu
thị ngưỡng dương tính (Ct ≤ 35) và âm tính (Ct > 35) với virus cúm
Xét về mặt lâm sàng, chủng virus clade 2.3.4.4a gây chết từ 20%- 30% gà
đã có miễn dịch dị chủng (hình 4.33A). Độc lực của virus thuộc clade này còn
được thể hiện thông qua hiện tượng thải virus kéo dài, đến ngày thứ 10 sau
công cường độc (hình 4.33A). Diễn biến cụ thể về hiện tượng thải virus được
tóm tắt như dưới đây. Đối với gà được miễn dịch bằng virus clade 1 (vacxin
99
Navet-vifluvac), mẫu swab lấy tại thời điểm 3 ngày sau công cường độc có thể
coi là không có virus cúm (Ct trung bình là 39,19 so với ngưỡng dương tính là
Ct ≤ 35).
Tuy nhiên lượng virus trong mẫu lấy vào ngày thứ 10 lại chứa lượng khá
lớn virus (Ct trung bình là 30,72). Gà chết ở các ngày 5- 9 sau công cường độc
bài thải lượng lớn virus (Ct trung bình là 17,57). Đối với gà được miễn dịch bằng
virus clade 2.3.4 (vacxin Re-5), mẫu swab hầu họng lấy tại thời điểm 3 ngày sau
công cường độc có chứa lượng virus khá lớn (Ct trung bình là 30,07). Đến thời
điểm 10 ngày sau công cường độc, lượng virus bài thải còn rất ít (Ct trung bình là
34,97). Nhóm gà được miễn dịch bởi vacxin Re-5 chết ở các ngày 6- 8 sau công
cường độc vẫn bài thải lượng lớn virus rất lớn (giá trị Ct trung bình là 20,98). Đối
với những gà đối chứng, sau khi được gây nhiễm bằng virus cường độc đã có
biểu hiện bệnh rất nhanh, đồng thời thải ra lượng lớn virus ngay tại thời điểm
ngày thứ 3 sau công cường độc (giá trị Ct trung bình là 21,52 tức là bải thải nhiều
hơn gà vacxin khoảng 29- 218 lần). Tất cả gà đối chứng đều chết 100% ở trong
tuần đầu sau công cường độc.
Ngược lại với gà, 100% vịt có miễn dịch dị chủng đều sống sót khi công
cường độc với virus thuộc clade 2.3.4.4a (hình 4.33B). Diễn biến hiện tượng thải
virus ở nhóm vịt cũng được tìm hiểu trong nghiên cứu này (hình 4.33B). Đối với
nhóm vịt tiêm vacxin Navet-vifluvac: tại cả 2 thời điểm lấy mẫu lúc 3 và 10 ngày
sau công cường độc, đều không phát hiện được virus bài thải (Ct trung bình
tương ứng là 38,34 và 39,42 so với ngưỡng dương tính có Ct ≤ 35). Nhóm vịt
tiêm vacxin Re-5, kết quả cũng không phát hiện được virus bài thải (Ct trung
bình tương ứng là 39,56 và 39,88 ở cả 2 thời điểm lấy mẫu lúc 3 và 10 ngày sau
công cường độc). Đối với nhóm vịt đối chứng: ở thời điểm lấy mẫu lúc 3 ngày, giá trị Ct trung bình của nhóm là 32,55. Lượng virus bài thải gấp khoảng 32 –
256 lần so với các nhóm vịt có miễn dịch. Ở thời điểm lấy mẫu lúc 10 ngày, một
số cá thể của nhóm vịt không có miễn dịch vẫn thải virus công cường độc với
lượng rất thấp (Ct trung bình của nhóm là 36,21 so với ngưỡng dương tính Ct ≤
35). Ngược lại, vịt chết ở nhóm đối chứng bài thải lượng lớn virus (Ct trung bình
là 20,15).
100
Từ việc phân tích, so sánh tỷ lệ bảo hộ về mặt lâm sàng và đặc điểm của
hiện tượng thải virus sau công cường độc, thấy rằng chủng virus clade 2.3.4.4a
có khả năng vượt qua (ở mức độ nhất định) đáp ứng miễn dịch dị chủng (clade 1,
clade 2.3.4) ở gà mà không vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng (clade 1, clade
2.3.4) ở vịt. Tuy nhiên, khác biệt trên còn có thể do sức đề kháng tự nhiên tương
đối cao của vịt đối với virus cúm gia cầm thể độc lực cao (nhóm vịt không có
miễn dịch sống sót 30% sau công cường độc). Do đó, cần tiếp tục làm rõ một số
khía cạnh khác như: ảnh hưởng của lượng kháng thể, lượng kháng nguyên gây
miễn dịch và loài động vật thí nghiệm (gà/ vịt), v.v...
Ba tuần sau khi gây miễn dịch, lấy mẫu máu để kiểm tra hàm lượng kháng
thể, kết quả được tóm tắt ở hình 4.34 dưới đây.
Tương đồng với kết quả đợt gây miễn dịch được thực hiện trước đó (mục
4.3.2 và 4.3.3), miễn dịch được tạo ra ở gà và vịt sử dụng virus clade 1 (vacxin
101
Navet-vifluvac) và clade 2.3.4 (vacxin Re-5) đều có hiệu giá kháng thể trung
bình ở trên ngưỡng bảo hộ (đường nét đứt màu đỏ, hình 4.35). Cụ thể: ở gà hiệu
giá kháng thể lần lượt là 4,7 log2 và 7,8 log2; và ở vịt (sau khi được miễn dịch
nhắc lại) là 8,3 log2 và 8,7 log2.
Kết quả thử nghiệm khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4b ở
nhóm gà, vịt có miễn dịch dị chủng (hình 4.34) được thể hiện trước hết thông
qua theo dõi tỷ lệ chết sau công cường độc (hình 4.35).
Nhóm gà đối chứng (không có miễn dịch) xuất hiện triệu chứng sớm (1
ngày sau công cường độc). Toàn bộ gà đối chứng công cường độc bằng virus
H5N6 clade 2.3.4.4b chết trong vòng 9 ngày. Trái lại, ở nhóm có miễn dịch dị
chủng (clade 1 hoặc clade 2.3.4), thời gian xuất hiện triệu chứng muộn hơn
(clade 1), diễn biến chậm hơn (clade 2.3.4) sau công cường độc, cụ thể: nhóm
gà tiêm vacxin Navet-vifluvac sau 4 ngày đầu tiên không có triệu chứng nào
được ghi nhận, đến ngày thứ 5 có 3/10 gà có biểu hiện ốm (liệt chân, khó thở,
nhiều dịch mũi). Gà nhiễm bệnh lần lượt chết vào ngày thứ 6, 7 và 8 sau công
cường độc với bệnh tích đặc trưng của bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao.
Những gà còn lại không có biểu hiện bệnh. Tỷ lệ sống sót của nhóm sau 10
ngày theo ngày theo dõi là 70% (hình 4.35A).
Đối với nhóm gà tiêm vacxin Re-5: tiến triển bệnh ở nhóm này nhanh hơn
nhóm vacxin Navet-vifluvac. Ngay ngày thứ nhất có 1 gà có biểu hiện ốm sau
đó gà chết vào ngày thứ 2. Cùng lúc đó có thêm 2 gà khác xuất hiện triệu chứng
ốm nhẹ, triệu chứng tăng dần trong những ngày tiếp theo như không thể đi lại,
chảy nhiều nước mắt, nước mũi, mào tím tái và bị phù vùng đầu, 2 gà này chết
vào ngày thứ 5 và 7 sau công cường độc. Còn lại 7/10 gà khác không có biểu
hiện bệnh và sống sót sau 10 ngày theo dõi (hình 4.35A). Kết quả so sánh về
tiến triển bệnh giữa nhóm gà không có miễn dịch và nhóm gà có miễn dịch
(trình bày ở hình 4.35A) cho thấy chủng virus clade 2.3.4.4b vẫn có khả năng
vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tạo ra bởi clade 1 và clade 2.3.4.
102
Nhóm vịt đối chứng sau 3- 4 ngày gây nhiễm virus H5N6 clade 2.3.4.4b, một số vịt bắt đầu có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, kém ăn. Thời gian bị bệnh của vịt kéo dài
103
hơn nhiều so với gà, cá biệt có những con ốm 6-7 ngày mới chết. Ngoài ra một số vịt cũng có biểu hiện nhiễm bệnh nhẹ, nhưng chỉ kéo dài 3- 4 ngày rồi triệu chứng
bệnh mất đi, con vật hồi phục và sống sót sau 10 ngày theo dõi. Tổng số vịt chết
sau công cường độc là 8/10 con, tỷ lệ chết là 80%. Nhóm vịt tiêm vacxin Navet-
vifluvac: trong thời gian theo dõi 10 ngày, có 3/10 vịt được gây nhiễm virus có biểu hiện lâm sàng nhẹ, chỉ thấy ủ rũ, chảy nước mũi nhẹ, giảm ăn. Triệu chứng
kéo dài từ 2- 5 ngày rồi hết, vịt vẫn sống sót đến khi kết thúc thí nghiệm. Nhóm vịt
tiêm vacxin Re-5: trong thời gian từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 9 sau công cường
độc, có 2/10 vịt xuất hiện triệu chứng lâm sàng nhẹ. Tuy nhiên vịt không có tiến
triển bệnh nặng hơn và vẫn sống sót sau 10 ngày theo dõi (hình 4.35B).
Như vậy, đáp ứng miễn dịch tạo ra bởi clade 1 (vacxin Navet-vifluvac) và clade 2.3.4 (vacxin Re-5) có khả năng bảo hộ lâm sàng chống lại virus H5N6
clade 2.3.4.4b với tỷ lệ 70% ở gà và bảo hộ 100% ở vịt. Ngược lại, có thể nhận
xét khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng để gây bệnh thể lâm sàng của
virus clade 2.3.4.4b cao hơn ở gà (sống sót 70%) so với ở vịt (sống sót 100%).
4.36 và phụ lục 15.
Kết quả định lượng virus bài thải sau công cường độc bằng virus clade
2.3.4.4b cũng phản ánh sự khác biệt rõ giữa nhóm gà và vịt có miễn dịch dị
chủng (hình 4.36). Đối với gà có miễn dịch chống lại clade 1 (tiêm vacxin Navet-
vifluvac), mẫu dịch hầu họng lấy tại thời điểm 3 ngày sau công cường độc có
virus cúm ở mức độ rất ít (giá trị Ct trung bình là 34,83 so với ngưỡng dương
tính là Ct ≤ 35). Kiểm tra ở ngày 10 sau công cường độc, nhóm gà gồm 7/10 gà
sống sót về cơ bản không còn bài thải virus (giá trị Ct trung bình nhóm là 36,62),
ngoại trừ 1 cá thể vẫn dương tính (Ct = 33,12, hình 4.36A). Đối với gà có miễn
dịch chống lại clade 2.3.4 (tiêm vacxin Re-5), mẫu swab hầu họng lấy tại thời
điểm 3 ngày sau công cường độc chứa lượng virus bài thải rất nhiều so với nhóm
gà được miễn dịch bằng vacxin Navet-vifluvac (Ct trung bình là 27,4). Vào ngày
thứ 10 sau công cường độc, có 4/7 gà sống sót của nhóm này tiếp tục bài thải
virus (giá trị Ct từ 30,41-32,52, ký hiệu ngôi sao, hình 4.36A). Gà chết sau công
cường độc (thuộc nhóm có miễn dịch dị chủng bằng clade 1 hoặc clade 2.3.4) bài
104
thải lượng rất lớn virus (Ct từ 19,81- 25,75; hình 4.36A), gần tương đương với
lượng virus bài thải ở nhóm gà đối chứng bị chết sau công cường độc (Ct =19,53).
105
Đối với nhóm vịt có miễn dịch chống lại clade 1 (vacxin Navet-vifluvac),
tại cả 2 thời điểm lấy mẫu lúc 3 và 10 ngày sau công cường độc, lượng virus
trong mẫu swab đều ở mức rất thấp với giá trị Ct trung bình tương ứng là 35,33
và 36,20 (ngưỡng dương tính có giá trị Ct ≤ 35). Mặc dù vậy, vẫn còn 4/10 vịt
thải virus ở nhóm này (ký hiệu ngôi sao, hình 4.37B). Ngược lại, đối với nhóm
vịt có miễn dịch chống lại clade 2.3.4 (vacxin Re-5), đều không phát hiện virus
bài thải tại thời điểm 3 và 10 ngày sau công cường độc (giá trị Ct trung bình lần
lượt là 39,56 và 39,88). Đối với nhóm gà, vịt đối chứng tại tất cả các thời điểm
lấy mẫu (3, 10 ngày sau công cường độc hoặc tại thời điểm động vật chết) đều
phát hiện virus bài thải với giá trị Ct trung bình từ 31,81- 33,34. Những cá thể
(vịt, gà) chết, lượng virus bài thải là rất lớn (giá trị Ct trung bình là 21,47). Nhóm
gà và vịt không công cường độc và được nuôi cách ly, đều không phát hiện virus
cúm bài thải ở cả 2 thời điểm lấy mẫu.
So sánh với kết quả của thí nghiệm công cường độc bằng clade 2.3.4.4a,
thấy rằng virus clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn (gây
ra hiện tượng mang trùng ở 5/14 gà sống sót và 4/20 vịt sống sót ở ngày thứ 10
sau công cường độc).
Về mặt biến đổi bệnh lý đại thể, kết quả mổ khám cho thấy gà có miễn dịch
dị chủng với clade 2.3.4.4a/b sau công cường độc đều giảm mức độ tổn thương
giống như ở nhóm gà công cường độc với virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c (mục
4.3.1.3). Thêm vào đó, biến đổi bệnh lý đại thể không là chỉ tiêu chính để kết luận
về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của các clade 2.3.4.4a/b. Nhằm
tránh trùng lặp, mô tả về biến đổi bệnh lý liên quan đã không được trình bày.
Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch đồng chủng hoặc dị chủng của các
chủng virus cúm gia cầm thể độc lực cao đã được biết tới trong một số nghiên
cứu trước đây (Fereidouni & cs., 2009; Costa & cs., 2011). Do vậy, kết quả thu
được về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của 3 biến chủng virus
cúm A/H5Nx (mục 4.3.4) là phù hợp. Đáng chú ý, khi đánh giá trên cùng nền
miễn dịch (clade 1 hoặc clade 2.3.4), ở cùng loài động vật (gà) thấy 3 biến chủng
106
gây ra tình trạng mang trùng khác nhau. Trong đó, chủng virus clade 2.3.4.4b gây
ra tình trạng mang trùng kéo dài (tới ngày thứ 10 sau công cường độc) ở 5/14 gà
sống sót (~36%). Không những thế, virus thuộc clade này cũng gây ra tình trạng
mang trùng ở vịt có miễn dịch dị chủng bởi clade 1 ở 4/10 con sống sót (40%).
Trong điều kiện thí nghiệm, đã có những kết quả nghiên cứu chứng minh
khả năng bảo hộ chéo clade (về mặt lâm sàng) của vacxin phòng bệnh cúm gia
cầm (Trần Xuân Hạnh, 2016; Hoang & cs., 2020). Mặc dù vậy, kết quả thu được
về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của 3 biến thể virus cúm
A/H5Nx lưu hành một lần nữa nhấn mạnh sự cần thiết trong việc tạo đáp ứng
miễn dịch vô trùng (bảo hộ đồng thời về mặt lâm sàng và hiện tượng mang và
thải virus). Để đạt tới trạng thái miễn dịch đó, ngoài các yếu tố về liều kháng
nguyên (Kim & cs., 2008), chất bổ trợ (Lu & cs., 2016) cần có chủng virus
vacxin phù hợp chủng hiện lưu hành (Connie & cs., 2013; Fallah & cs., 2020) và
tính đến đặc điểm đột biến ở protein HA, tại những vị trí quan trọng (Đậu Huy
Tùng, 2012).
107
1) Giám sát tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới tại 11 tỉnh tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế,
Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) giai đoạn 2015-2018:
Virus CGC lưu hành có tỷ lệ dương tính với virus: cúm A (gen M) 9,15 %;
A/H5 1,15 %; A/H5N1 0,23%; A/H5N6 0,65%;
Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và miền Trung; A/H5N1 subclade 2.3.2.1c chủ
yếu ở miền Nam; chưa phát hiện virus cúm A/H5N6 ở miền Nam;
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới: cao nhất trên vịt (A/H5N1
0,42%, A/H5N6 1,27% ), tiếp đến là gà (A/H5N1 0,23%, A/H5N6 0,5%), chưa
phát hiện biến chủng mới trên chim cút.
2) Đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
Virus cúm A/H5 biến chủng mới (H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a
và 2.3.4.4b) phân lập được đều thuộc thể độc lực cao (chỉ số IVPI tương ứng 2,95;
2,78 và 2,87).
Virus cúm A/H5 biến chủng mới mang đặc điểm khác biệt về trình tự amino
acid trên gen HA so với chủng virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện
hành ở Việt Nam;
Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được có tính đặc hiệu với receptor
của gia cầm, gây bệnh cúm trên gia cầm với các biểu hiện đặc trưng của bệnh CGC
gồm: (1) triệu chứng lâm sàng như sốt cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi,
thở khò khè; (2) biến đổi bệnh tích gồm phù, sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hầu hết các cơ quan phủ tạng.
3) Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại
vacxin hiện hành
Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 đối với các biến chủng (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) tạo được miễn
dịch trên ngưỡng bảo hộ (>4log2); (2) không tạo ra trạng thái miễn dịch vô trùng;
(3) có khả năng bảo hộ lâm sàng 50- 80% gà và 100% vịt thí nghiệm;
108
Gà được gây miễn dịch dị chủng từ Navet-vifluvac và Re-5 có xu hướng giảm bài thải virus cường độc và biến đổi bệnh tích đại thể (chỉ có bệnh tích: ở
phổi với Navet-vifluvac; ở phổi, gan, cơ và ruột với Re-5);
Virus H5N6 clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn (gây tình trạng mang trùng và tỷ lệ chết cao hơn cho động vật thí nghiệm) virus
H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N1 clade 2.3.2.1c;
Vacxin Navet-vifluvac bảo hộ lâm sàng cho gà (70-80%) chống lại virus
cúm A/H5 biến chủng mới tốt hơn vacxin Re-5 (50-70%).
1) Tìm hiểu thêm về các subtype H5Nx và các Subtype HA khác. Tiếp tục
các chương trình giám sát để theo dõi sự lây lan, tiến hóa của các virus H5, clade
2.3.4.4.
2) Tiếp tục nghiên cứu về độc lực của các virus cúm thuộc các nhánh khác
nhau đối với các loại gia cầm khác.
3) Nghiên cứu phát triển các vacxin sử dụng chủng H5N6 clade 2.3.4.4a/b và
H5N1 clade 2.3.2.1c. Tiếp tục nghiên cứu về lưu hành biến chủng virus cúm để kịp
thời có điều chỉnh công thức vacxin nhằm tạo ra đáp ứng miễn dịch vô trùng ở gia cầm được tiêm vacxin phòng bệnh.
4) Cần tiếp tục làm rõ một số khía cạnh khác như: ảnh hưởng của lượng kháng
thể, lượng kháng nguyên gây miễn dịch và loài động vật thí nghiệm (gà/ vịt),
v.v...trong các thí nghiệm đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin.
109
1. Nguyễn Văn Lâm, Tô Long Thành, Nguyễn Thị Thúy Mận, Nguyễn Đăng
Thọ & Vũ Đăng Đồng (2017). Bệnh lý đại thể và vi thể của gà được công cường độc với virus cúm gia cầm A/H5N1 sau khi sử dụng vacxin phòng
bệnh. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 12: 1621-1632.
2. Nguyễn Văn Lâm, Tô Long Thành, Nguyễn Hoàng Đăng & Nguyễn Đăng Thọ
(2018). Hiệu lực một số loại vacxin cúm gia cầm sử dụng trên gà chống lại virus
cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4b. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 25(5): 11-17.
110
Tiếng Việt:
1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2014). Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán – Phần
26: Bệnh cúm gia cầm H5N1. TCVN 8400-26:2014.
2. Bùi Quang Anh (2005). Báo cáo về dịch cúm gia cầm. Hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á do FAO, OIE tổ chức. Ngày 23-25/2/2005, thành
phố Hồ Chí Minh.
3. Bùi Quang Anh & Văn Đăng Kỳ (2004). Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 11(3): 69-75. Công ty thuốc thú y TW 1 (2013). Kết quả khảo nghiệm vacxin vô hoạt cúm gia cầm 4.
tái tổ hợp phân typ H5N1, chủng Re-6. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. (1): 16-21. 5. Cục Thú y (2004). Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống. NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
6. Cục Thú y (2005). Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm
trên người. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Cục Thú y (2013). Báo cáo công tác thú y năm 2013 và kế hoạch công tác năm 2014. 8. Cục Thú y (2014). Báo cáo công tác thú y năm 2014 và kế hoạch công tác năm 2015. 9. Cục Thú y (2015). Báo cáo công tác thú y năm 2015 và kế hoạch công tác năm 2016. 10. Cục Thú y (2016). Báo cáo công tác thú y năm 2016 và kế hoạch công tác năm 2017. 11. Cục Thú y (2017). Báo cáo công tác thú y năm 2017 và kế hoạch công tác năm 2018. 12. Cục Thú y (2018). Báo cáo công tác thú y năm 2018 và kế hoạch công tác năm 2019. 13. Cục Thú y (2020). Cập nhập thông tin về lưu hành virus cúm gia cầm, lở mồm long
móng, tai xanh và khuyến cáo sử dụng vacxin.
14. Đàm Thị Vui, Tô Long Thành, Nguyễn Đăng Thọ, Đỗ Thị Hoa, Nguyễn Hoàng Đăng, Mai Thùy Dương, Âu Xuân Khoa, Lường Văn Hảo & Trần Thị Hồng Nhung (2018). Phát hiện các biến chủng của virus cúm A/H5N1 theo thời gian. Tạp chí Khoa học Kỹ
thuật Thú y. 25(2): 5-17.
15. Đậu Huy Tùng, Đồng Văn Quyên, Nguyễn Tùng, Nguyễn Nam Thắng, Trần Xuân Hạnh, Kim Young Bong & Đinh Duy Kháng (2012). Đánh giá hiệu lực vacxin cúm gia cầm H5N1 (chủng Nibrg14) trên một số clade lưu hành ở Việt Nam năm
2011 và phân tích đặc tính di truyền của virut H5N1 clade 2.3.2.1b. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. 19(6): 5-16.
16. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải & Lê Trần Bình (2004). Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động
111
vật sang người. Tạp chí Công nghệ sinh học. 2(1): 1-18.
17. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng & Lê Trần Bình (2006). Sinh học phân tử vỉrus cúm A/H5N1 và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên, Y - Sinh học phân tử, quyển I.
NXB Y học, Hà Nội. 29-48.
18. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga & Lê Trần Bình (2008). Virus cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype và tương đồng kháng
nguyên - miễn dịch - vaccine. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 6(4A): 529-553. 19. Lê Trần Bình (2007). Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm (2006-2007). Trung tâm Thông tin và Tư liệu Quốc gia, Bộ Khoa học và Công nghệ.
20. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga & Trương Nam Hải (2006). Phân tích mối tương đồng
kháng nguyên và miễn dịch của virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vaccine cúm A/H5N1. Tạp chí Công nghệ sinh học 4(3): 291-296.
21. Lê Văn Năm (2004). Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía bắc. Tạp chí Khoa học
Kỹ thuật Thú y. 11(3): 86–90.
22. Nguyễn Bá Hiên (2014). Bệnh cúm ở người và động vật. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 23. Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Hoàng Đăng, Đàm Thị Vui, Đỗ Thị Hoa, Mai Thùy Dương, Nguyễn Thị Điệp, Nguyễn Viết Không & Tô Long Thành (2016). Virus cúm gia cầm độc lực cao H5N6 ở Việt Nam năm 2014. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 23(1): 18-28.
24. Nguyễn Đăng Thọ, Cấn Xuân Minh, Đào Thị Hoa, Nguyễn Hoàng Đăng, Đặng Thị Vui, Mai Thùy Dương, Nguyễn Viết Không & Tô Long Thành (2017). Sự phát sinh virus Cúm A/H5N6 ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 24(3): 14-23.
25. Nguyễn Hoài Tao & Nguyễn Tuấn Anh (2004). Một số thông tin về dịch cúm gia
cầm. Tạp chí Chăn nuôi. 3: 27.
26. Nguyễn Hoàng Đăng, Tô Long Thành, Nguyễn Đăng Thọ, Lường Văn Hảo, Âu Xuân Khoa, Nguyễn Văn Lâm & Mai Thùy Dương (2017). Hiệu lực một số loại vacxin cúm gia cầm sử dụng trên gà và vịt chống lại virus cúm A/H5N6 tại Việt Nam. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 24(6): 5-15.
27. Nguyễn Lê Khánh Hăng & Lê Thị Quỳnh Mai (2016). Đặc điểm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 trên gia cầm Việt Nam, 2012- 2015. Tạp chí Y tế Dự phòng. 16(10): 126-131.
28. Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn Thị Bích Nga & Lê Thanh Hòa (2008). Đặc điểm gen H5 của virus cúm A/H5N1 thuộc dưới dòng Phúc Kiến (Fujian) gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam phân lập năm 2007. Tạp chí Y Dược học Quân sự. 33(8): 36-41.
112
29. Nguyễn Ngọc Tiến (2013). Tình hình dịch cúm gia cầm gia đoạn 2009 - 2012 và
giải pháp phòng chống. Tạp chí Khoa học Kỹ thật Thú y. 20(1): 82-83.
30. Nguyễn Ngọc Tiến, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Tùng & Inui K. (2011). Lưu hành virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1 tại Việt Nam và vacxin phòng bệnh cúm gia cầm. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 18(6): 76-78. 31. Nguyễn Thị Bích Nga & Lê Thanh Hòa (2012). Xác định các nhóm kháng nguyên 1.1 và 2.3.2.1 của cúm A/H5N1 xuất hiện mới tại Việt Nam qua phân tích đặc
điểm di truyền và phả hệ gen hemagglutinin (H5) giai đoạn 2004 - 2011. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 19(2): 20-28.
32. Nguyễn Thị Lan, Phạm Ngọc Thạch, Trịnh Đình Thâu, Phạm Hồng Ngân & Đào Lê Anh (2016). Sự lưu hành virus cúm A/H5N6 trên đàn gia cầm tỉnh Lạng Sơn
và ứng dụng phương pháp Realtime – PCR trong chẩn đoán bệnh. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 24(2): 5-11.
33. Nguyễn Thị Lan Phương & Lê Văn Hiệp (2006). Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG-14 tại viện
vaccine và sinh phẩm y tế Nha Trang. Tạp chí Y học dự phòng. 5(84): 5-10. 34. Nguyễn Thị Thúy Mận, Tô Long Thành, Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Hoàng Đăng, Lường Văn Hảo, Đàm Thị Vui, Nguyễn Văn Lâm & Nguyễn Thị Thúy (2017). Biến đổi bệnh tích đại thể và vi thể của gà công cường độc với virus cúm
gia cầm A/H5N6. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 14(5): 33-39.
35. Nguyễn Tiến Dũng, Peiris M. J. S., Webster R. G., Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Inui K., Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không & Ngô
Thanh Long (2004). Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003- 2004. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 11(3): 6 - 14.
36. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thế Vinh, Vijaykrishna D., Webster R. G., Guan Y., Peiris M. J. S. & Smith G. J. D. (2008). Sự đa dạng của các dòng virus cúm A
(H5N1) tại Việt Nam từ 2005 - 2007. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 15(4): 9 - 15.
37. Nguyễn Văn Cảm, Tống Hữu Tiến, Nguyễn Tùng & Nguyễn Hoàng Đăng (2011). Kết quả công cường độc gà, vịt, ngan sau khi dùng vacxin cúm gia cầm tái tổ hợp
H5N1 chủng Re-5 của Trung Quốc. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 18(2): 12 - 16.
38. Pantin-Jackwood M. J., Pfeiffer J., Tô Long Thành, Nguyễn Tùng & Suarez D. L. (2008). Độc tính của virus cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 của Việt Nam trên
gà và vịt. Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch định chính sách phòng chống cúm gia cầm. Cục Thú y.
39. Phạm Sỹ Lăng (2004). Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở Châu Á và các hoạt động
113
phòng chống bệnh. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 11(3): 91- 94.
40. Phan Chí Tạo & Trần Ngọc Bích (2016). Khả năng đáp ứng miễn dịch đối với 2 loại vaccine cúm gia cầm H5N1 trên vịt tại Hậu Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. (44): 127-131.
41. Phạm Thành Nhương, Phạm Văn Lý, Hoàng Thị Miền, Nguyễn Bá Hưng, Trần Thị Huệ & Nguyễn Văn Đức (2016). Tình hình bệnh cúm gia cầm tại Thái Bình giai đoạn 2010 – 2015 và hiệu quả phòng chống. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 23(5): 5- 13.
42. Suarez D. L & Pantin-Jackwood M. J. (2008), Tiêm vacxin để khống chế bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao. Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch định chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/2008, Hà Nội.
43. Tô Long Thành (2004). Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các
nước châu Á. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 11(4): 87- 93.
44. Tô Long Thành (2005). Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm. Tạp chí Khoa
học Kỹ thuật Thú y. 12(1): 84-91.
45. Trần Hữu Cổn & Bùi Quang Anh (2004). Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng
chống. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
46. Trân Ngọc Bích & Nguyễn Phúc Khánh (2013). So sánh đáp ứng miễn dịch của 2 quy trình tiêm phòng vacxin cúm gia cầm H5N1-Re 5 trên giống gà Tàu và gà
Lương Phượng. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. (3): 18-21.
47. Trần Xuân Hạnh (2012). Sản xuất vacxin cúm gia cầm Navet-vifluvac, chủng
NIBGR-14 ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. (3): 89-92.
48. Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Đỗ Thanh Thủy, Phạm Sĩ Tú, Tô Long Thành, Tống Hữu Hiến, Nguyễn Hoàng Đăng & Đàm Thị Vui (2013). Thử hiệu lực của vacxin Navet-vifluvac phòng bệnh cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2. c bằng
phương pháp công cường độc và tiếp xúc trực tiếp. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 20(5): 22-29.
49. Trần Xuân Hạnh, Nguyễn Văn Dung, Tô Thị Huệ, Quách Vô Ngôn, Đặng Minh Hải, Đỗ Thanh Thủy & Huỳnh Tấn Phát (2016). Sự liên hệ kháng nguyên giữa chủng virus vacxin cúm CDC-RG30 với các chủng virus cúm A/H5N1 Clade 1.1, 2.3.2.1C. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 23(1): 11-17.
50. Trương Văn Dung & Nguyễn Viết Không (2004). Một số hoạt động nghiên cứu khoa học của Viện Thú y Quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học
công nghệ trong thời gian tới. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 11(3): 62-68. 51. Trương Văn Dung. (2008). Những Kết quả nghiên cứu đã đạt được về bệnh cúm
114
gia cầm ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 15 (4) 9-15.
Tiếng Anh:
52. Abe Y., Takashita E., Sugawara K., Matsuzaki Y., Muraki Y. & Hongo S. (2004). Effect of the addition of oligosaccharides on the biological activities and antigenicity of influenza A/H3N2 virus hemagglutinin, J Virol. 78(18): 9605-11.
53. Alexander D. .J. (1993). "Orthomyxovirus Infections”, In Viral Infections of Vertebrates. Viral Infections of Birds. McFerran J.B. & McNulty M. S., eds.
Horzinek M.C., Series editor. Elserviers, Amsterdam, the Netherlands. 3: 287- 316. 54. Alexander. D. J. (1999). Orthomyxoviridae (Avian Influenza). In Poultry
Diseases: 156-165.
55. Alexander. D. J. (2000). A review of avian in different bird species. Vet.
Microbiol. (74): 3-13.
56. Alexander D. J. (2007). An overview of the epidemiology of avian influenza.
Vaccine. 25: 5637–5644.
57. Area E., Martin-Benito J., Gastaminza P., Torreira E., Valpuesta J. M., Carrascosa J. L. & Ortin J. (2004) '3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains', Proc Natl Acad Sci U S A. 101(1): 308-313. 58. Bae Y. J., Lee S. B., Min K. C., Mo J. S., Jeon E. O., Koo B. S., Kwon H. I., Choi Y. K., Kim J. J., Kim J. N. & Mo I. P. (2015). Pathological Evaluation of Natural
Cases of a Highly Pathogenic Avian Influenza Virus, Subtype H5N8, in Broiler Breeders and Commercial Layers in South Korea. Avian Dis. 59(1): 175-82. 59. Bauer T. T., Ewig S., Rodloff A. C. & Muller E. E. (2006). Acute respiratory
distress syndrome and pneumonia: a comprehensive reviw of clinical data. Clin. Infect. Dis. 43(6): 748-756.
60. Beard C.W. (1998). Avian Influenza. In Foreign Animal Diseases. Richmond,
VA: United States Animal Health Association: 71-80.
61. Beard C.W, Schnitzlein W.M. & Tripathy D.N. (1991). Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowlpox
viruses. Avian Dis. 35: 356–359.
62. Berhane Y., Kobasa D., Embury-Hyatt C., Pickering B., Babiuk S., Joseph T., Bowes V., Suderman M., Leung A., Cottam-Birt C., Hisanaga T. & Pasick J. (2016). Pathobiological Characterization of a Novel Reassortant Highly
Pathogenic H5N1 Virus Isolated in British Columbia, Canada, 2015. Sci. Rep. 6, 23380. doi:10.1038/srep23380.
115
63. Bi Y., Mei K., Shi W., Liu D., Yu X., Gao Z., Zhao L., Gao G. F., Chen J. & Chen Q. (2015). Two novel reassortants of avian influenza A (H5N6) virus in China.J Gen Virol. 96: 975–981.
64. Biswas S. K. & Nayak D. P. (1996). Influenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites. J. Virol
70: 6716-6722.
65. Bosch F. X., Orlich M., Klenk H. D. & Root R. (1979). The structure of the hemagglutinin: a determinant for the pathgencity of Influenza virus. Virology. 95: 197-207.
66. Buckler W. & Muphy B. R. (1998). Nucleotide sequence analysis of the nucleoprotein gene of an avian and a human influenza virus strain identifies two
classes of nucleoproteins, Virology. 155: 345 - 355.
67. Bui V. N., Ogawa H., Trinh D. Q., Nguyen T. H., Pham N. T., Truong D. A., Bui A. N., Runstadler J., Imai K. & Nguyen K. V. (2014). Genetic characterization of an H5N1 avian influenza virus from a vaccinated duck flock in Vietnam, Virus
Genes. 49(2): 278-85.
68. Butler J., Stewart C. R., Layton D. S., Phommachanh P., Harper J., Payne J., Evans R. M., Valdeter S., Walker S., Harvey G., Shan S., Bruce M. P., Rootes C. L., Gough T. J., Rohringer A., Peck G. R., Fardy S. J., Karpala A. J., Johnson D., Wang J.,
Douangngeun B., Morrissy C., Wong F. Y., Bean A. G., Bingham J. & Williams D. T. (2016). Novel Reassortant H5N6 Influenza A Virus from the Lao People's
Democratic Republic Is Highly Pathogenic in Chickens, PLoS One. 11(9): e0162375. 69. Capua I. & Alexander D. J. (2004). Avian influenza: recent developments. Avian
Pathol. 33(4): 393-404.
70. Capua I. & Alexander D. J. (2008). Ecology, epidemiology and human health implications of avian influenza viruses: why do we need to share genetic data? Zoonoses Public Health. 55(1): 2-15.
71. Capua I., Marrangon S., Dalla Pozza M. & Santucci U. (2000). Vaccination for
Avian influenza in Italy. Vet. Rec: 147-751.
72. Castrucci M. R. & Kawaoka Y. (1993). Biologic importance of neuraminidase
stalk length in influenza A virus. J Virol67: 759-764.
73. Chen C. J., Chen G. W., Wang C. H., Huang C. H., Wang Y. C. & Shih S. R. (2010). Differential localization and function of PB1-F2 derived from different strains of influenza A virus. J Virol. 84(19): 10051-62.
74. Chen H., Bright R. A., Subbarao K., Smith C., Cox N. J., Katz J. M. & Matsuoka Y. (2007). Pyolygenic virulence factors involved in pathogenesis of 1997 Hong Kong H5N1 influenza viruses in mice. Virus Res. 128(1-2): 159-163.
116
75. Chen H., Smith G. J., Li K. S., Wang J., Fan X. H., Rayner J.M., Vijaykrishna D., Zhang J. X., Zhang L. J., Guo C. T., Cheung C. L., Xu K. M., Duan L., Huang K., Qin K., Leung Y. H. C., Wu W. L., Lu H. R., Chen Y., Xia S., Naipospos T. S. P., Yuen K. Y., Hassan S. S., Bahri S., Nguyen Tien Dung, Webster R. G., Peiris J. S.
M. & Guan Y. (2006). Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(8): 2845–2850.
76. Chu D. H., Okamatsu M., Matsuno K., Hiono T., OgasaWara K., Nguyen L. T., Van Nguyen L., Nguyen T. N., Nguyen T. T., Van Pham D., Nguyen D. H.,
Nguyen Tien Dung, To Long Thanh, Van Nguyen H., Kida H. & Sakoda Y. (2016). Genetic and antigenic characterization of H5, H6 and H9 avian influenza
viruses circulating in live bird markets with intervention in the center part of Vietnam. Vet Microbiol. 192: 472-477.
77. Cinatl J. Jr., Michaelis M. & Doerr H. W. (2007). “The threat of avian influenza A (H5N1)-part II: Clues to pathogenicity and pathology”, Med. Mícrobiol.
Immumol. 196: 191-201.
78. Connie Leung Y. H., Luk G., Sia S. F., Wu Y. O., Ho C. K., Chow K. C., Tang S. C., Guan Y. & Malik Peiris J. S. (2013). Experimental challenge of chicken vaccinated with commercially available H5 vaccines reveals loss of protection to
some highly pathogenic avian influenza H5N1 strains circulating in Hong Kong/China, Vaccine. 31(35): 3536-42.
79. Costa T. P., Brown J. D., Howerth E. W., Stallknecht D. E. & Swayne D. E. (2011). Homo- and Heterosubtypic Low Pathogenic Avian Influenza Exposure on
H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection in Wood Ducks (Aix sponsa), PLOS ONE. 6(1): e15987.
80. Crooks G. E., Hon G., Chandonia J. M. & Brenner S. E. (2004). WebLogo: a
sequence logo generator, Genome Res, 14(6): 1188-1190.
81. De Vries E., Guo H., Dai M., Rottier P. J., van Kuppeveld F. J. & de Haan C. A. (2015). Rapid Emergence of Highly Pathogenic Avian Influenza Subtypes from a
Subtype H5N1 Hemagglutinin Variant. Emerg Infect Dis. 21(5): 842-846.
82. Doherty P. C., Turner S. J., Webby R. G. & Thomas P. G. (2006). Influenza and
the challenge for immunology. Nat. Immunol. 7(5): 449-55.
83. Fallah Mehrabadi M. H., Ghalyanchilangeroudi A., Ghafouri S. A., Hosseini H., Zabihi Petroudi M. T., Modiri Hamadan A., Rezaee H., Motamed Chaboki P., Vatandour S. & Shayeganmehr A. (2020). Comparison of autogenous and
commercial H9N2 avian influenza vaccines in a challenge with recent dominant virus, Iran J Vet Res, 21(2): 109-114.
84. FAO (2004). FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian
Influenza, Animal health special report.
85. Fechter P. & Brownlee G. G. (2005). Recognition of mRNA cap structures by
117
viral and cellular proteins', J Gen Virol. 86(5): 1239-49.
86. Fereidouni S. R., Starick E., Beer M., Wilking H., Kalthoff D., Grund C., Häuslaigner R., Breithaupt A., Lange E. & Harder T. C. (2009). Highly
pathogenic avian influenza virus infection of mallards with homo- and heterosubtypic immunity induced by low pathogenic avian influenza viruses, PloS
one, 4(8): e6706-e6706.
87. Fouchier R. A., Bestebroer T. M., Herfst S., Van Der Kemp L., Rimmelzwaan G. F. & Osterhaus A. D. (2000) 'Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene'. J Clin
Microbiol. 38(11): 4096-101.
88. Franklin R. M. & Wecker E. (1950). Innactivation of some animal viruses by
hydroxylamine and the structur of ribonucleic acid. Nature. 84: 343-345.
89. Gao W., Soloff A. C., Lu X., Montecalvo A., Nguyen D. C., Matsuoka Y., Robbins P.D., Swayne D.E., Donis R.O., Katz J.M., Barratt-Boyes S.M., Gambotto A. (2006). Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus
through adenovirus-based immunization. J. Virol. 80(4): 1959-1964.
90. Gastaminza P., Perales B., Falcon A. M. & Ortin J. (2003). Mutations in the N- terminal region of influenza virus PB2 protein affect virus RNA replication but not transcription. J Virol. 77(9): 5098-108.
91. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A. & Portela A. (2000). Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. J Virol, 74(24): 11538-47.
92. Ha Y., Stevens D. J., Skehel J. J. & Wiley D. C. (2001). X-ray structures of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human
receptor analogs, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(20): 11181-11186.
93. Hervé P. L., Lorin V., Jouvion G., Da Costa B. & Escriou N. (2015). Addition of N-glycosylation sites on the globular head of the H5 hemagglutinin induces the
escape of highly pathogenic avian influenza A H5N1 viruses from vaccine- induced immunity, Virology. 486: 134-145.
94. Hoang H. T. T., Nguyen C. H., Nguyen N. T. T., Pham A. D., Nguyen H. T. T., Le T. H., Tran H. X., Chu H. H & Nguyen N. T. (2020). Immunization with the
H5N1 Recombinant Vaccine Candidate Induces High Protection in Chickens against Vietnamese Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Strains. Vaccines.
8(2): 159 -166.
118
95. Hoffmann E., Stech J., Guan Y., Webster R. G. & Perez D. R. (2001). Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol, 146(12): 2275-89.
96. Holsinger L. D., Nichani D., Pinto L. H. & Lamb R. A. (1994). Influenza A virus M2 ion chanel protein: a structurefunction anylasis. J. Viriol. 68: 1551-1563. 97. Horimoto T. & Kawaoka Y. (1994). Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza
A virus. J. Virol. 68: 3120-3128.
98. Horimoto T. & Kawaoka Y. (2001). Pandemic threat posed by avian
influenza viruses. Clind Microbiol Rev. 14(1): 129-149.
99. Hu X., Meng W., Dong Z., Pan W., Sun C. & Chen L. (2011). Comparative immunogenicity of recombinant adenovirus-vectored vaccines expressing different froms of hemagglutinin (HA) proteins from the H5 serotype of influenza
A viruses in mice. Virus Res. 155(1): 156-162.
100. Huarte M., Falcon A., Nakaya Y., Ortin J., Garcia-Sastre A. & Nieto A. (2003). Threonine 157 of influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious viruses. J Virol. 77(10): 6007-13.
101. Hugentobler M. (2008). Quantum gis. Encyclopedia of GIS. 935-939. 102. Hui D. S. (2008). “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with
influenza A/H5N1 infection”, Respirology. 13 Suppl 1: S10-3.
103. Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., Baum L.G., Krauss S., Castrucci M.R., Donatelli I., Kida H., Paulson J.C., Webster R.G. & Kawaoka Y. (1998). Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol. 72: 7367-7373.
104. Ito T., Suzuki Y., Suzuki T., Takada A., Horimoto T., Wells K., Kida H., Otsuki K., Kiso M., Ishida H. & Kawaoka Y. (2000). Recognition of N-glycolylneuraminic
acid linked to galactose by the alpha2,3 linkage is associated with intestinal replication of influenza A virus in ducks. J Virol. 74(19): 9300-5.
105. Jabhao S. J. (2009). Genetic analysis of avian influenza A viruses isolated from domesti waterfowl in live-bird markets of Hanoi, Vietnam, preeding fatal H5N1
human infetion in 2004, Arh Virol.10-009.
106. Jagger B. W., Wise H. M., Kash J. C., Walters K. A., Wills N. M., Xiao Y. L., Dunfee R. L., Schwartzman L. M., Ozinsky A., Bell G. L., Dalton R. M., Lo A., Efstathiou S., Atkins J. F., Firth A. E., Taubenberger J. K. & Digard P. (2012) 'An
overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response', Science. 337(6091): 199-204.
107. Jiao P., Song H., Liu X., Song Y., Cui J., Wu S., Ye J., Qu N., Zhang T. & Liao M. (2016). Pathogenicity, Transmission and Antigenic Variation of H5N1 Highly
Pathogenic Avian Influenza Viruses. Front Microbiol. 7: 635.
119
108. Kawaoka (1988). Is the gene pool of influenza viruses in shorebirds and gulls
different from that in wild ducks?. Virology. 179: 759-767.
109. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R. A., Osterhaus A. D., Payungporn S., Theamboonlers A. & Poovorawan Y. (2005). Characterization of the
hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta. Virol. 49(4): 277-280.
110. Kim J.-K., Seiler P., Forrest H. L., Khalenkov A. M., Franks J., Kumar M., Karesh W. B., Gilbert M., Sodnomdarjaa R., Douangngeun B., Govorkova E. A.
& Webster R. G. (2008). Pathogenicity and Vaccine Efficacy of Different Clades of Asian H5N1 Avian Influenza A Viruses in Domestic Ducks, Journal of
Virology. 82(22): 11374.
111. Kirkpatrick E., Qiu X., Wilson P. C., Bahl J. & Krammer F. (2018). The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain, Scientific reports, 8(1): 10432-10432.
112. Knipe D. M. & Howley P. M. (2007) 'Orthomyxoviridae: the viruses and their replication', Field’s Virology. 5 ed. Philadelphia, U.S.A. Lippincott Williams &
Williams. 1647-91.
113. Korteweg C. & Gu J. (2008). Pathology, Moleular Biology, and Pathogenesis of Avian Influenza A (H5N1) Infection in Humans. American Journal of Pathology. 172(5): 1155-1170.
114. Le Q. M. T., Wertheim H. F., Nguyen Hoang Dang, Taylor W., Hoang P. V., Vuong C. D. & Nguyen H. L. (2008). Influenza A H5N1 clade 2.3.4 virus with a different antiviral susceptibility profile replaced clade 1 virus in humans in
northem Vietnam, Plos. ONE, 3(10). e3339.
115. Lee C. W. & Saif Y. M. (2009). Avian influenza virus. Comp Immunol Microbiol
Infect Dis, 32(4): 301-10.
116. Lee Y. T., Kim K. H., Ko E. J., Lee Y. N., Kim M. C., Kwon Y. M., Tang Y., Cho M. K., Lee Y. J. & Kang S. M. (2014). New vaccines against influenza virus. Clin. Exp. Vaccine Res. 3: 12-28.
117. Li Z., Jiang Y., Jiao P., Wang A., Zhao F., Tian G., Wang X., Yu K., Bu Z. & Chen H. (2006). The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses, J Virol. 80(22): 11115-23.
118. Liu C. G., Liu M., Liu F., Lv R., Liu D. F., Qu L. D. & Zhang Y. (2013). Emerging multiple reassortant H5N5 avian influenza viruses in ducks, China, 2008, Vet Microbiol. 167(3-4): 296-306.
120
119. Liu L., Zeng X., Chen P., Deng G., Li Y., Shi J., Gu C., Kong H., Suzuki Y., Jiang Y., Tian G. & Chen H. (2016). Characterization of Clade 7.2 H5 Avian Influenza Viruses That Continue To Circulate in Chickens in China, J Virol. 90(21): 9797-
9805.
120. Lu J., Wu P., Zhang X., Feng L., Dong B., Chu X., Liu X., Peng D., Liu Y., Ma H., Hou J. & Tang Y. (2016). Immunopotentiators Improve the Efficacy of Oil- Emulsion-Inactivated Avian Influenza Vaccine in Chickens, Ducks and Geese,
PLOS ONE. 11(5): e0156573.
121. Luong G. & Palese P. (1992). Genetic analysis of influenza virus. Curr Opinion
Gen Develop. 2: 77-81.
122. Maines T. R., Lu X. H., Erb S. M., Edwards L., Guarner J., Greer P. W., Nguyen D. C., Szretter K. J., Chen L. M., Thawatsupha P., Chittaganpitch M., Waicharoen S., Nguyen Dang Tho, Nguyen Tung, Nguyen H. H., Kim J. H., Hoang L. T.,
Kang C., Phuong L. S., Lim W., Zaki S., Donis R. O., Cox N. J., Katz J. M. & Tumpey T. M. (2005). Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in
Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals. J. Virol. 79: 11788-11800.
123. Marsh G. A. & Tannock G. A. (2005). The role of reverse genetics in the development of vaccines against respiratory viruses. Expert Opin. Biol. Ther. 5(3): 369-380.
124. Matrosovich M. N., Matrosovich T. Y., Gray T., Roberts N. A. & Klenk H. D. (2004). 'Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection
in human airway epithelium', J Virol. 78(22): 12665-7.
125. Murphy B. R. & Webster R. G. (1996). Orthomyxoviruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: 1397-1445.
126. Nayak B., Kumar S., DiNapoli J. M., Paldurai A., Perez D. R., Collins P. L. & Samal S. K. (2010). Contributions of the avian influenza virus HA, NA, and M2
surface proteinsto the induction of neutralizing antibodies and protective immunity”, J. Virol. 84(5): 2408-2420.
127. Neumann G., Noda T. & Kawaoka Y. (2009). Emergence and pandemic potential
of swine-origin H1N1 influenza virus, Nature. 459(7249): 931-9.
128. Newcomb L. L., Kuo R. L., Ye Q., Jiang Y., Tao Y. J. & Krug R. M. (2009) 'Interaction of the influenza a virus nucleocapsid protein with the viral RNA
polymerase potentiates unprimed viral RNA replication', J Virol. 83(1): 29-36. 129. Nguyen Dang Tho, Bryant J. E., Davis C. T., Nguyen L. V., Pham L. T., Loth L., Inui K., Nguyen Tung, Jang Y., To Long Thanh, Nguyen Tien Dung, Hoang D. T., Do Thi Hoa, Nguyen T. T., Newman S., Siembieda Jennifer & Pham D. V.
(2014). Prevalence and distribution of avian influenza A(H5N1) virus clade variants in live bird markets of Vietnam, 2011-2013. Avian Dis. 58(4): 599-608.
121
130. Nguyen L. T., Nishi T., Shichinohe S., Chu D. H., Hiono T., Matsuno K.,
Okamatsu M., Kida H. & Sakoda Y. (2017). Selection of antigenic variants of an H5N1 highly pathogenic avian influenza virus in vaccinated chickens, Virology.
510: 252-261.
131. Nguyen Tung, Rivailler P., Davis C. T., Do Thi Hoa, Balish A., Nguyen Hoang Dang, Jones J., Dam Thi Vui, Simpson N., Nguyen Thi Huong, Shu B., Loughlin R., Ferdinand K., Lindstrom S. E., York I. A., Klimov A. & Donis R. O. (2012). Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus populations in Vietnam between 2007 and 2010. Virology. 432(2): 405-416.
132. Nicholson K. G., Wood J. M. & Zambon M. (2003). “Influenza”, Lancet.
362(9397): 1733-1745.
133. O.I.E. (2012). Avian Influenza Disease. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terresptrial Animals (Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012).
134. Ohkawara A., Okamatsu M., Ozawa M., Chu D.-H., Nguyen L. T., Hiono T., Matsuno K., Kida H. & Sakoda Y. (2017). Antigenic diversity of H5 highly pathogenic avian influenza viruses of clade 2.3.4.4 isolated in Asia, Microbiology and Immunology. 61(5): 149-158.
135. OIE, Council of European Communities (1992). Council Directive 92/40/Eec of 19 th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza, “Official Journal of European Communities”. 167: 1-15.
136. OIE – World organisation for animal health (2005). Avian influenza, manual of
diagnostic test and vaccines for terrestrial animals.
137. OIE (2017). Avian Influenza Portal: Update on avian influenza in animals (types
H5 and H7).
138. Papadopoulos J. S. & Agarwala R. (2007). COBALT: constraint-based alignment
tool for multiple protein sequences, Bioinformatics. 23(9): 1073-9.
139. Patel A., Tran K., Gray M., Li Y., Ao Z., Yao X., Kobasa D. & Kobinger G. P. (2009). Evaluation of conserved and variable influenza antigens for immunization against different isolates of H5N1 viruses. Vaccine. 27: 3083-3089.
140. Peyre M., Fusheng G., Desvaux S. & Roger F. (2008). Avian influenza vaccines: a practical review in relation to their application in the field with a focus on the Asian experience, Epidemiol. Infect. 14: 1-21.
141. Pfeiffer J., Pantin-Jackwood M., To Long Thanh, Nguyen Tung & Suarez D. L. (2009). Phylogenetic and biological characterization of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses (Vietnam 2005) in chickens and ducks, Virus Res. 142(1- 2): 108-20. Doi:10.1016/j.virusres.2009.01.019.
122
142. Phan M. Q., Henry W., Bui C. B., Do D. H., Hoang N. V., Thu N. T., Nguyen T. T., Le T. D., Diep T. Q., Inui K., Weaver J. & Carrique-Mas J. (2013). Detection of HPAI H5N1 viruses in ducks sampled from live bird markets in Vietnam.
Epidemiology and Infection. 141(3): 601-611.
143. Prel A., Le Gall-Recules G. & Jestin V. (2008). Achievement of avian influenza virus-like particles that could be used as a subunit vaccine against low-pathogenic avian influenza strains in ducks, Avian Pathol. 37(5): 513-520.
144. Qiao C., Tian G., Jiang Y., Li Y., Shi J., Yu K. & Chen H. (2006). Vaccines developed for H5 highly patthogenic avian influenza in China. Ann. N. Y. Acad.
Sci. 1081: 182-192.
145. Robb N. C., Smith M., Vreede F. T. & Fodor E. (2009). NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome, J Gen Virol. 90(6): 1398-407.
146. Romer-Oberdorfer A., Veits J., Helferich D. & Mettenleiter T. C. (2008). Level of protection of chickens against highly pathogenic H5 avian influenza virus with
Newcastle disease virus based live attenuated vector vaccine depends on homology of H5 sequence between vaccine and challenge virus, Vaccine. 26(19): 2307-2313. 147. Salzberg S. L., Kingsford C., Cattoli, G., Spiro D. J., Janies D. A., Aly M. M., Brown I. H., Couacy-Hymann E., De Mia G. M., Dung H., Guercio A., Joannis
T., Maken Ali A.S., Osmani A., Padalino I., Saad M. D., Savíc V., Sengamalay N. A., Yingst S., Zaborsky J., Zorman-Rojs O., Ghedin E. & Capua I. (2007).
“Genome Analysis Linking Recent European and African Influenza (H5N1) Vỉruses”, Emerg. Infect. Dis. 13: 713-718.
148. Senne D. A., Panigrahy B., Kawaoka Y., Pearson J. E., Süss J., Lipkind M., Kida H. & Webster R. G. (1996). Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential, Avian Dis. 40(2): 425-437.
149. Shimbo K., Brassard D. L., Lamb R. A. & Pinto L. H. (1996). Ion selectivity and activation of the M2 ion channel of influenza virus', Biophys. 70(3): 1335-46. 150. Shimizu T., Takizawa N., Watanabe K., Nagata K. & Kobayashi N. (2011). Crucial role of the influenza virus NS2 (NEP) C-terminal domain in M1 binding and nuclear export of vRNP, FEBS Lett. 585(1): 41-46.
151. Shinya K., Ebina M., Yamada S., Ono M., Kasai N. & Kawaoka Y. (2006). Avian flu: influenza virus receptors in the human airway', Nature. 440(7083): 435-6. 152. Sivay M. V., Baranovich T., Marchenko V. Y., Sharshov K. A., Govorkova E. A., Shestopalov A. M. & Webby R. J. (2013). Influenza A (H15N4) virus isolation in Western Siberia, Russia, J Virol. 87(6): 3578-82.
123
153. Skehel J. J. & Wiley D. C. (2000). Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin, Annu Rev Biochem. 69: 531-569. 154. Smith G. J. & Donis R. O. (2015). Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5) virus clades 2.1.3.2a, 2.2.1, and 2.3.4 during 2013-2014', Influenza Other Respir Viruses. 9(5): 271-6.
155. Smith G. J., Fan X. H., Wang J., Li K. S., Qin K., Zhang J. X., Vijaykrishna D., Cheung C. L., Huang K., Rayner J. M., Peiris J. S., Chen H., Webster R. G. &
Guan Y. (2006). Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China”, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103(45): 16936-16941.
156. Sturm-Ramirez K. M., Hulse-Post D. J., Govorkova E. A., Humberd J., Seiler P., Puthavathana P., Buranathai C., Nguyen Tien Dung, Chaisingh A., H. T. Long, T.
Naipospos S. P., Chen H., Ellis T. M., Guan Y., Peiris J. S. M. & Webster R. G. (2005). Are Ducks Contributing to the Endemicity of Highly Pathogenic H5N1
Influenza Virus in Asia?. Journal of Virology. 79(17): 11269-11279.
157. Subbarao E. K., Chen H., Swayne D., Mingay L., Fodor E., Brownlee G., Xu X., Lu X., Katz J., Cox N. & Matsuoka Y. (2003). Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by
plasmid-based reverse genetics. Virology. 305: 192-200.
158. Subbarao K. & Luke C. (2007). H5N1 Viruses and Vaccines. PLoS Pathog 3(3):
e40. doi:10.1371/journal.ppat.003004.
159. Suguitan Jr. A. L., Marino M. P., Desai P. D., Chen L. M, Matsuoka Y., Donis R. O., Jin H., Swayne D. E., Kemble G. & Subbarao K. (2009). The influence of the the attenuation, multi-basic cleavage site of the H5 hemagglutinin on
immunogenicity and effcacy of a live attenuated influenza A H5N1 cold-adapted vaccine virus. Virology. 395: 280-288.
160. Sun X., Shi, Y., Lu, X., He, J., Gao, F., Yan, J., Qi, J. và Gao, George f. (2013). Bat-Derived Influenza Hemagglutinin H17 Does Not Bind Canonical Avian or Human Receptors and Most Likely Uses a Unique Entry Mechanism, Cell
Reports, 3(3): 769-778.
161. Sun H., Pu J., Hu J., Liu L., Xu G., Gao G. F., Liu X. & Liu J. (2016). Characterization of clade 2.3.4.4 highly pathogenic H5 avian influenza viruses in ducks and chickens. Vet Microbiol. 182: 116-22.
162. Suzuki K., Okada H., Itoh T., Tada T., Mase M., Nakamura K., Kubo M. & Tsukamoto K. (2009). Association of increased pathogenicity of Asian H5N1
highly pathogenic avian influenza viruses in chickens with highly efficient viral replication accompanied by early destruction of innate immune responses. J Virol.
83(15): 7475-86.
163. Swayne D. E., Beck J. R., Garcia M. & Stone H. D. (1999). Influence of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines, Avian Pathology. 28(3): 245-255.
124
164. Swayne D. E. & Halvorson D. A. (2008). Diseases of poultry, 12th ed. Blackwell. 165. Swayne D. E. & Suarez D. L. (2000). Highly pathogenic avian influenza. Rev Sci
Tech Off Int Epiz. 20: 463-482.
166. Tian G., Zhang S., Li Y., Bu Z., Liu P., Zhou J., Li C., Shi J., Yu K. & Chen H (2005). Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics. Virology. 341(1): 153-162.
167. Tsukamoto K., Ashizawa H., Nakanishi K., Kaji N., Suzuki K., Okamatsu M., Yamaguchi S. & Mase M. (2008) 'Subtyping of avian influenza viruses H1 to H15
on the basis of hemagglutinin genes by PCR assay and molecular determination of pathogenic potential', J Clin Microbiol. 46(9): 3048-3055.
168. Tsukamoto K., Ashizawa T., Nakanishi K., Kaji N., Suzuki K., Shishido M., Okamatsu M. & Mase M. (2009) 'Use of reverse transcriptase PCR to subtype N1 to
N9 neuraminidase genes of avian influenza viruses', J Clin Microbiol. 47(7): 2301-3.
169. Tzarum N., De vries, Robert p., Zhu, X., Yu, W., Mcbride, R., Paulson, James c. và Wilson, Ian a. (2015). Structure and Receptor Binding of the Hemagglutinin from a Human H6N1 Influenza Virus, Cell Host & Microbe. 17(3): 369-376. 170. Van den Berg T., Lambrecht B., Marche S., Steensels M., Van Borm S. & Bublot M. (2008). Influenza vaccines and vaccination strategies in birds. Comparative
Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 31: 121-65.
171. Vey M., Orlich M., Adle S., Klenk H. D., Rott R. & Garten W. (1992). "Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R", Virology. 188: 408-413. 172. Wan X. F., Nguyen Tung, Davis C. T., Smith C. B., Zhao Z. M., Carrel M., Inui K., Do Thi Hoa, Mai Thuy Duong, Jadhao S., Balish A., Shu B., Luo F., Emch M., Matsuoka Y., Lindstrom S. E., Cox N. J., Nguyen Van Cam, Klimov A. &
Donis R. O. (2008). Evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in Vietnam between 2001 and 2007. PLoSOne3, e3462.
173. Weis W. I., Brünger A. T., Skehel J. J. & Wiley D. C. (1990). Refinement of the influenza virus hemagglutinin by simulated annealing', J Mol Biol. 212(4):
737-61.
174. WHO (2008). Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS).
Ritrieved at http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/en/
175. WHO (2015). "Evolution of the influenza A (H5) haemagglutinin:
WHO/OIE/FAO H5 Working Group reports a new clade designated 2.3.4.4. at Ritrieved
http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/h5_nomenclature_clade2344/en/. on 15 January 2015.
125
176. WHO (2017). Avian Influenza Weekly Update Number 573, 24 February 2017. 177. WHO (2018). Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza
reported 2003-2018. Available at: to
A(H5N1) WHO, http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/en/. on 2 March 2018. 178. WHO/OIE/FAO (2008). Toward a unified nomenclature system for highly
pathogenic avian influenza virus (H5N1). Emerg Infect Dis 14, e1.
179. Wibawa H., Bingham J., Nuradji H., Lowther S., Payne J., Harper J., Wong F., Lunt R., Junaidi A., Middleton D. & Meers J. (2013). The pathobiology of two Indonesian H5N1 avian influenza viruses representing different clade 2.1 sublineages in chickens
and ducks. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 36(2): 175-91.
180. Wiley D. C., Wilson I. A. & Skehel J. J. (1981). Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation, Nature. 289(5796): 373-378.
181. Wise H. M., Foeglein A., Sun J., Dalton R. M., Patel S., Howard W., Anderson E. C., Barclay W. S. & Digard P. (2009). 'A complicated message: Identification of a
novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA', J Virol. 83(16): 8021-31.
182. Wong F. Y., Phommachanh P., Kalpravidh W., Chanthavisouk C., Gilbert J.,
Bingham J., Davies K. R., Cooke J., Eagles D., Phiphakhavong S., Shan S., Stevens
V., Williams D. T., Bounma P., Khambounheuang B., Morrissy C., Douangngeun
B. & Morzaria S. (2015). Reassortant highly pathogenic influenza A(H5N6) virus
in Laos. Emerg Infect Dis. 21(3): 511-516.
183. Wood J. M., Kawaoka Y., Newberry L. A., Bordwell E. & Webster R. G. (1985). Standardization of Inactivated H5N2 Influenza Vaccine and Efficacy against Lethal
A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 Infection, Avian Diseases. 29(3): 867-872. 184. Wu C., Cheng X., He J., Lv X., Wang J., Deng R., Long Q. & Wang X. (2008). A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1, J. Virol. Methods. 148(1-2): 81-88. 185. Wu H., Peng X., Xu L., Jin C., Cheng L., Lu X., Xie T., Yao H. & Wu N. (2014). 'Novel reassortant influenza A(H5N8) viruses in domestic ducks, eastern China', Emerg Infect Dis. 20(8): 1315-1318.
186. Xiang B., Liang J., You R., Han L., Mei K., Chen L., Chen R., Zhang Y., Dai X., Gao P., Liao M., Xiao C. & Ren T. (2017). Pathogenicity and transmissibility of a highly pathogenic avian influenza virus H5N6 isolated from a domestic goose in
Southern China. Vet Microbiol. 212: 16-21.
187. Yuan P., Bartlam M., Lou Z., Chen S., Zhou J., He X., Lv Z., Ge R., Li X., Deng T., Fodor E., Rao Z. & Liu Y. (2009). Crystal structure of an avian influenza polymerase PA(N) reveals an endonuclease active site. Nature. 458(7240): 909-13.
126
188. Zell R., Krumbholz A., Eitner A., Krieg R., Halbhuber K. J. & Wutzler P. (2007).
Prevalence of PB1-F2 of influenza A viruses. J Gen Virol. 88(Pt 2): 536-46. 189. Zhao G., Gu X., Lu X., Pan J., Duan Z., Zhao K., Gu M., Liu Q., He L., Chen J., Ge S., Wang Y., Chen S., Wang X., Peng D., Wan H. & Liu X. (2012). Novel reassortant highly pathogenic H5N2 avian influenza viruses in poultry in China.
127
PLoS One. 2012. 7: e46183. doi: 10.1371/journal.pone.0046183 PMID: 23049973. 190. Zhao Z. M., Shortridge K. F., Garcia M., Guan Y. & Wan X. F. (2008). Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Gen Virol. 89(9): 2182-2193.
buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Nhỏ 200 µl mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 µl Qiagen®
ly tâm nhẹ.
- Thêm 500 µl etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi
10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm với tốc độ
tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.
- Bổ sung 700 µl dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy®Qiagen, ly tâm với
vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
- Nhỏ 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10000
trong 2 phút, bỏ ống thu.
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút
ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút,
bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µl nước sạch nuclease vào cột lọc,
RTPCR. Nếu để sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20 oC hoặc nhiệt độ thấp hơn.
128
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm
Đầu Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Primer /probe 5’ 3’
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT
Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGCCCAGACCC FAM BHQ1 FAM BHQ1 FAM BHQ1 FAM BHQ1
M Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA H5 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G N1 Xuôi N6 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC Trong đó:
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
Thành phần của phản ứng Realtime RT-PCR
Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) Hỗn hợp phản ứng
2x Reaction buffer 12,5
Mồi xuôi 20 µM 0,5
Mồi ngược 20 µM 0,5
Taqman probe 6 µM 0,5
Enzyme mix 0,5
Nước cất sạch nuclease 5,5
Mẫu ARN 5,0
129
- Chu trình nhiệt của phản ứng: + 1 vòng ở 50oC trong 15 phút + 1 vòng ở 95oC trong 2 phút + Chu trình 40 vòng: 95oC trong 10 giây + 58oC trong 50 giây
Giếng Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) Nguyên Các
bước liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Pha
loãng KN kiểm T rộn đề u, chuy ển 25 µ l lần lư ợt từ giế ng 1 đến giếng 11 25 0 KN tra, µl rồi hút bỏ 25 µl
HC gà 1
130
% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Cho Độ pha HC gà 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 loãng KN
Nguyên liệu 1 2 PBS (µl) 0 25 3 25 4 25 5 25 8 25 9 25 10 25 11 25 Giếng 7 25 6 25 12 50
50 0 Chuyển 25 µl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giến g 11 rồi hút bỏ 25 µl Huyết thanh kiểm tra
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 KN 4 HA (µl) Các bước Pha loãng huyết thanh Cho kháng nguyên Lắc nhẹ, để 30 phút ở nhiệt độ phòng
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
131
Cho hồng cầu gà 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Hồng cầu gà 1 % (µl) Độ pha loãng KT Mỗi đĩa phản ứng phải có mẫu đối chứng kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn.
Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Tổng 1/2015-6/2016 7/2016-6/2017 7/2017-3/2018 P- Tỉnh Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ value (+) (+) (+) (+) mẫu % mẫu % mẫu % mẫu %
Hà Nội 2688 172 6,40 672 72 10,71 3360 244 7,26a
Phú Thọ 2688 100 3,72 672 53 7,89 3360 153 4,55b Miền 0,0001 Thái Bắc 2688 33 1,23 672 12 1,79 3360 45 1,34c Nguyên
Tổng 8064 305 3,78 2016 137 6,80 10080 442 4,38C
Nghệ An 50 17 34 50 17 34 50 18 36 150 52 34,67a
Quảng Nam 1008 94 9,33 1680 122 7,26 672 27 4,02 3360 243 7,23b
Miền Quảng Ngãi 1008 143 14,19 1680 111 6,61 672 52 7,74 3360 306 9,11c 0,0001
Trung Huế 1008 86 8,53 1680 47 2,80 672 23 3,42 3360 156 4,64d
Kon Tum 1008 227 22,52 1680 466 27,74 672 220 32,74 3360 913 27,17e
Tổng 4082 567 13,89 6770 763 11,27 2738 340 12,42 13590 1670 12,29A
Đồng Tháp 1008 60 5,95 1680 151 8,99 672 63 9,38 3360 274 8,15a 0,0001 Miền Vĩnh Long 1008 143 14,19 1680 159 9,46 672 57 8,48 3360 359 10,68b
Nam Kiên Giang 50 16 32 50 19 38 50 14 28 150 49 32,67c
Tổng 2066 219 10,6 3410 329 9,65 1394 134 9,61 6870 682 9,93B
Trong cùng một miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c, d và giữa các miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái A, B, C
sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001)
132
Tổng 6148 786 12,78 18244 1307 7,16 6148 611 9,94 30540 2794 9,15
Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Tổng 1/2015-6/2016 7/2016-6/2017 7/2017-3/2018 P- Tỉnh Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ value (+) (+) (+) (+) mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%)
0,03a Hà Nội 2688 1 0,04 672 3360 1
0b Miền Phú Thọ 2688 0 0 672 3360 0 0,0001 0 0 0c Bắc Thái Nguyên 2688 0 0 672 3360 0 0 0 0,01C Tổng 8064 1 0,01 2016 10080 1
2,67e Nghệ An 50 1 2 50 2 4 50 150 4 2 1
58 1,73b Quảng Nam 1008 28 2,78 1680 23 1,37 672 7 1,04 3360 M 14 0,42c Quảng Ngãi 1008 1 0,1 1680 8 0,48 672 5 0,74 3360 0,0001 Miền 0d Huế 1008 0 0 1680 0 0 672 0 0 3360 0 Trung Kon Tum 1008 58 5,75 1680 69 4,11 672 18 2,68 3360 145 4,32e
Tổng 4082 88 2,16 6770 102 1,51 2738 31 1,13 13590 221 1,63B
Đồng Tháp 1008 12 1,19 1680 0 0 672 1 0,15 3360 13 0,39a
Vĩnh Long 1008 28 2,78 1680 54 3,21 672 30 4,46 3360 112 3,33b Miền
Kiên Giang 50
0,0001 Nam 2 4 50 1 2 50 0 0 150 3 2c
Tổng 2066 42 2,03 3410 55 1,61 1394 31 2,22 6870 128 1,86A
Ghi chú: (+): Mẫu dương tính; Trong cùng một miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c và giữa các miền, các
giá trị tỷ lệ mang chữ cái A, B, C sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001)
133
Tổng 6148 130 2,11 18244 158 0,87 6148 62 1 30540 350 1,15
Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Tổng 1/2015-6/2016 7/2016-6/2017 7/2017-3/2018 P- Tỉnh Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ value (+) (+) (+) (+) mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%)
Hà Nội 2688 672 3360
Miền Phú Thọ 2688 672 0 0 3360 0 0 0 - Bắc Thái Nguyên 2688 0 672 0 3360 0 0 0 0
Tổng 8064 2016 10080
Nghệ An 50 50 1 2 50 150 1 0,67e
Quảng Nam 1008 1680 3 0,18 672 3360 3 0,09a
Miền Quảng Ngãi 1008 1680 0 0 672 3360 0 0b 0 0 0,0001 Trung Huế 1008 0 0 672 0 0 3360 0 0b 0 Kon Tum 1008 1680 0 1680 3 0,18 672 3360 3 0,09a
Tổng 4082 6770 7 0,1 2738 13590 7 0,05B
0 ĐồngTháp 1008 0 0 1680 0 672 0 0 3360 0 0b
Miền Vĩnh Long 1008 13 1,29 1680 36 2,14 672 11 1,64 3360 60 1,79a 0,0001 Nam Kiên Giang 50 1 2 50 1 2 50 0 0 150 2 1,33c
Tổng 2066 14 0,68 3410 37 1,09 1394 11 0,79 6870 62 0,9A
Ghi chú: (+): Mẫu dương tính; Trong cùng một miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c và giữa các miền, các
giá trị tỷ lệ mang chữ cái A, B, C sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001)
134
Tổng 6148 14 0,23 18244 44 0,24 6148 11 0,18 30540 69 0,23
Số
Tỷ lệ
Số
Tỷ lệ
Số
Tỷ lệ
Số
Tỷ lệ
(+)
(+)
(+)
(+)
mẫu
(%)
mẫu
(%)
mẫu
(%)
mẫu
(%)
Hà Nội
2688
0,04 672
1
0,03
3360
1
Miền
Phú Thọ
2688
0
672
0
0
3360
0
0
0
0
0
0,368
Bắc
Thái Nguyên
2688
0
672
0
0
3360
0
Tổng
8064
0,01 2016
10080
1 0,01B
1
0
50
1
2
50
2
50
0
150
2 1.33a
1
5
Quảng Nam
1008 28 2,78 1680
13
0,77 672
0,74 3360
46 1,37b
Miền
4
Quảng Ngãi
1008
0,1
1680
0,36 672
0,6
3360
11 0,33c
1
6
0,005
Trung
0
Huế
1008
0
1680
0
672
0
3360
0
0d
0
0
Kon Tum
1008 56 5,56 1680
3,81 672
18 2,68 3360 138 4,11e
64
Tổng
4082 86 2,11 6770
1,24 2738 27 0,99 13590 197 1,45A
84
Đồng Tháp
1008
1680
672
3360
Miền
Vĩnh Long
1008
1680
672
3360
0
0
0
0
0
0
0
0
Nam
Kiên Giang
50
50
50
150
Tổng
2066
3410
1394
6870
Tổng
6148 86
1,4 18244 85
0,47 6148 27 0,44 30540 198 0,65
Ghi chú: (+): Mẫu dương tính; Trong cùng một miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c và giữa các miền, các
giá trị tỷ lệ mang chữ cái A, B, C sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001)
135
Nghệ An
Số (+) Tỷ lệ (+) Tỷ lệ (+) Tỷ lệ (+) Tỷ lệ Loài mẫu M (%) H5 (%) N1 (%) N6 (%)
6649 1044 15,7a 64 0,96b 15 0,23b 33 0,5b Gà
12991 1547 11,91b 280 2,16a 54 0,42a 165 1,27a Ngan/vịt
203 1,86c 6 0,06c 0 0,00c 0 0,00c Chim cút 10900
Ghi chú: (+): Mẫu dương tính; các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c sai khác có ý nghĩa thống kê
(P<0,0001)
136
<0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 P-value
STT Tỉnh
Subtype Clade 2.3.2.1c 2.3.4.4b
Chủng virus NCVD-15A7 NCVD-15A52 NCVD-16A34 NCVD-16A35 NCVD-16A36 NCVD-16A37 NCVD-16A38
2.3.4.4a
2.3.2.1c
2.3.4.4b
137
1 Kiên Giang 2 Nghệ An 3 Quảng Ngãi 4 Quảng Ngãi 5 Quảng Ngãi 6 Quảng Ngãi 7 Quảng Ngãi 8 Quảng Nam NCVD-16H5-QGN569 9 Quảng Nam 10 Quảng Nam 11 Quảng Nam 12 Quảng Nam 13 Quảng Nam 14 Kontum 15 Kontum 16 Kontum 17 Kontum 18 Vĩnh Long 19 Vĩnh Long 20 Vĩnh Long 21 Vĩnh Long 22 Vĩnh Long 23 Vĩnh Long 24 Đồng Tháp 25 Đồng Tháp 26 Đồng Tháp 27 Đồng Tháp 28 Đồng Tháp 29 Đồng Tháp 30 Kontum 31 Kontum 32 Kontum 33 Kontum 34 Kontum 35 Kontum 36 Kontum 37 Kontum 38 Kontum 39 Kontum NCVD-16H5-QN76 NCVD-16H5-QN121 NCVD-16H5-QN312 NCVD-16H5-QN352 NCVD-16H5-QN315 NCVD-16H5-KT53 NCVD-16H5-KT165 NCVD-16H5-KT344 NCVD-16H5-KT499 NCVD-16H5-VL157 NCVD-16H5-VL652 NCVD-16H5-VL657 NCVD-16H5-VL660 NCVD-16H5-VL817 NCVD-16H5-VL857 NCVD-16H5-DT406 NCVD-16H5-DT536 NCVD-16H5-DT831 NCVD-16H5-DT625 NCVD-16H5-DT992 NCVD-16H5-DT953 16H5-KT2-242 16H5-KT2-247 16H5-KT2-267 16H5-KT2-432 6H5-KT2-439 16H5-KT2-451 16H5-KT2-459 16H5-KT2-436 16H5-KT2-65 16H5-KT2-83 Thời gian 2015 2015 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 H5N1 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6
Subtype Clade
2.3.2.1c
2.3.4.4b
2.3.2.1c
138
STT Tỉnh 40 Kontum 41 Quảng Ngãi 42 Quảng Ngãi 43 Quảng Ngãi 44 Quảng Ngãi 45 Quảng Ngãi 46 Quảng Ngãi 47 Quảng Nam 48 Quảng Nam 49 Quảng Nam 50 Hà Nội 51 Vĩnh Long 52 Vĩnh Long 53 Vĩnh Long 54 Vĩnh Long 55 Vĩnh Long 56 Vĩnh Long 57 Vĩnh Long 58 Vĩnh Long 59 Vĩnh Long 60 Vĩnh Long 61 Kontum 62 Kontum 63 Quảng Nam 64 Quảng Nam 65 Vĩnh Long 66 Vĩnh Long 67 Quảng Nam 68 Quảng Nam 69 Quảng Nam 70 Quảng Ngãi 71 Quảng Ngãi 72 Quảng Ngãi 73 Kontum 74 Kontum 75 Kontum 76 Kontum 77 Kontum 78 Kontum 79 Kontum 80 Vĩnh Long 81 Vĩnh Long 82 Vĩnh Long 83 Vĩnh Long 84 Vĩnh Long Chủng virus 16H5-KT2-137 16H5-QNG2-12 16H5-QNG2-13 16H5-QNG2-475 16H5-QNG2-609 16H5-QNG2-1612 16H5-QNG2-1617 16H5-QN2-298 16H5-QN2-384 16H5-QN2-494 16H5-HN-72 16H5-VL2-164 16H5-VL2-157 16H5-VL2-857 16H5-VL2-817 16H5-VL2-652 16H5-VL2-657 16H5-VL2-112 16H5-VL2-302 16H5-VL2-309 16H5-VL2-447 16H5-KT2-1186 16H5-KT2-1200 16H5-QN2-1073 16H5-QN2-1071 16H5-VL2-1262 16H5-VL2-1656 16H5-QN3-152 16H5-QN3-162 16H5-QN3-291 16H5-QNG3-153 16H5-QNG3-291 16H5-QNG3-301 16H5-KT3-36 16H5-KT3-150 16H5-KT3-164 16H5-KT3-177 16H5-KT3-224 16H5-KT3-342 16H5-KT3-568 16H5-VL3-241 16H5-VL3-254 16H5-VL3-372 16H5-VL3-422 16H6-VL3-535 Thời gian 2016 2016 2016 2016 2016 2017 2017 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2016 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 2017 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N6 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1
Gà
Điểm
Điểm
Điểm
Điểm
thí
Ngày theo
lâm
Ngày
Ngày theo dõi
Ngày theo dõi
lâm
Giá trị
lâm
Giá trị
Giá trị
lâm
Giá
nghiệm
dõi
sàng
theo dõi
sàng
Ct
sàng
Ct
Ct
sàng
trị Ct
(n=10)
2
1
1
2
3
1
2
3
1-10
3
3
3
1
3
3
28,92
1
2,8
0
26,33
3
3
2.7
27.46
0
0
40
3
3
3
0
2
3
28,45
2
2,6
3
22,02
3
3
3
28.39
0
0
40
3
3
3
3
3
3
30,01
3
3
0
27,38
3
3
2.7
28.56
0
0
40
3
3
3
3
3
3
26,11
4
3
3
26,24
3
3
3
26.7
0
0
40
3
1
3
3
3
2,8
24,23
5
3
3
28,23
3
3
3
28.22
0
0
40
3
3
3
0
3
3
27,90
6
2,7
1
27,56
3
3
2.7
19.54
0
3
3
3
0
2
3
30,67
7
2,6
3
18,94
3
3
3
27.41
0
3
3
3
0
0
3
27,1
8
2,4
3
20,09
3
3
3
27.17
0
2,9
3
2
1
3
3
19,82
9
2,8
3
22,82
3
3
3
21.67
0
2,8
3
1
2
3
3
23,05
10
2,9
0
25,03
2
3
2.6
17.85
0
0
Mean
2,5 3,0 2,96a 26,63B 1,3 2,5 3,0 2,78a 24,46B 1,9 2,9
3,0
2,87a 25,3B
0b
40A
0
SD
0,8
0
0.1
3,4
1,0 0,4
0
0,2
3,3
0,8 0,3
0
0,2
4,0
0
0
Các giá trị điểm lâm sàng mang chữ cái a, b và các giá trị Ct mang chữ cái A, B sai khác có ý nghĩa thống
kê (P<0,001)
139
TT 1 2 7 5 3 9 10
1 2 1 1 1 3 3 3 2 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 1 1 2 1 2 1 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 1 2 3 3 3 2 3 Số ngày sau công cường độc 4 8 6 H5N1 clade 2.3.2.1c 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 H5N6 clade 2.3.4.4a 3 3 3 2 3 3 3 2 3 3 H5N6 clade 2.3.4.4b 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 3 3 3 3 2 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Điểm trung bình 2.72 2.80 2.70 2.90 2.60 2.80 2.70 2.80 2.80 2.50 2.80 2.29 2.30 2.50 2.20 2.10 2.40 2.20 2.40 2.10 2.40 2.30 2.50 2.60 2.10 2.20 2.70 2.80 2.80 2.60 2.30 2.20 2.70 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết) Ký hiệu gà Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) Ngày sau công cường độc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hiệu giá kháng thể (log2)
0.28 20 5
1 3 3 3 3 3 3 3 7 5 6 7 3 7 6 7 0 0 3 3 0 0 0 0.1 0 0 1.2 0 0 1.5
0 2.74 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.8 2.7 2.9 2.7 2.8 2.7 2.9 2.7 2.5 2.7
6 0 0
5 7 0 0
0 0 0
141
Navet- vifluvac 103 106 118 129 131 135 138 139 140 142 Đối chứng CCĐ 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 Vacxin không CCĐ 341 342 Đối chứng không CCĐ 343 344 0 0 0 0
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết) Ký hiệu gà Ngày sau công cường độc Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
50
Hiệu giá kháng thể (log2) 7.6 7 5 8 8 9 4 9 9 9 8 1 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1.13 1.9 1.3 2.4 0 0 2.7 0 0 0 1.8
0 2.3 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 2.3 2.4 2.1 2.5 2.3 2.4 2.1 2.5 2.2 2.2
8 0 0
8 8 0 0
0 0 0
142
0 0 Re-5 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 Đối chứng CCĐ 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 Vacxin không CCĐ 382 383 Đối chứng không CCĐ 384 385 0 0
Virus bài thải Virus bài thải
Ký hiệu gà Ký hiệu gà
Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết
33.68 33.62 40 40 32.83 Re-5 20.98
40 40 40 40
30.81 40 34.56 34.25 27.64 31.36 35.55 32.96 36.66 33.03 33.88 36.55 27.80 29.87 38.44 31.83 32.29 28.98 40 36.56 40 40 40 40 40 40 40 40 40 32.34 33.32 19.22 21.41 22.32
20.59 21
21.01 21.32 20.34 21.14 20.54 19.9 19.04 21.23 19.95 21.4 21.24 19.18 21.07 20.88 20.42 21.26 20.88 21.55 21.98 21.88
40 40 40 40
40 40 40 40 40 40 40 40
40 40 40 40
143
Navet- vifluvac 103 106 118 129 131 135 138 139 140 142 Đối chứng CCĐ 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 Vacxin không CCĐ 341 342 Đối chứng không CCĐ 343 344 40 40 40 40 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 Đối chứng CCĐ 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 Vacxin không CCĐ 382 383 Đối chứng không CCĐ 384 385 40 40 40 40
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết) Ký hiệu gà Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) Ngày sau công cường độc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hiệu giá kháng thể (log2)
5.2 0.28 20
2 3 3 3 3 3 1 1 3 3 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 4 3 9 8 7 3 5 6 4 3
2.29 100 0
1 1 3 3 3 3 3 3 1 1 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.3 2.3 2.1 2.4 2.5 2.2 2.5 2.1 2.1 2.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 6 0
0 0 5 7
0 0 0
144
Navet- vifluvac 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Đối chứng CCĐ 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 Vacxin không CCĐ 111 112 Đối chứng không CCĐ 321 322 0 0 0 0
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết)
Ký hiệu gà Ngày sau công cường độc
Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
30
1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 1 2 2 3 3 3 Hiệu giá kháng thể (log2) 7.4 9 8 9 8 9 3 6 9 7 6 0.44 0 0 0 0 0 1.6 1.4 0 1.4 0
0 2.3 100
1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.3 2.4 2.1 2.5 2.3 2.4 2.1 2.5 2.2 2.2
7.5 0 0
8 7 0 0
0 0 0
145
0 0 Re-5 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 Đối chứng CCĐ 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 Vacxin không CCĐ 211 212 Đối chứng không CCĐ 323 324 0 0
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết) Ký hiệu vịt
Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) Ngày sau công cường độc
Hiệu giá kháng thể (log2) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Navet-vifluvac 9 0.07 0
151 0 8
152 0 10
153 0 9
154 1 1 0.2 10
155 0 9
156 1 2 1 1 0.5 9
157 0 11
158 0 8
159 0 7
160 0 9
Đối chứng CCĐ 1.15 70
351 3 3 2.1 1 2 3 3 3 3 0
352 2 2 1.3 3 3 3 0
353 0 0
354 3 2 3 1.8 1 3 3 3 0
355 1 1 1 0.3 0
356 1 2 3 3 3 1.2 0
357 1 2 3 3 0.9 0
358 1 1 1 1 0.4 0
359 1 1 2 1 2 2 3 1.2 0
360 3 3 3 3 2 3 3 3 2.3 0
0 0 VX không công CCĐ 8.5
0 0
0 0
146
0 0 9 8 0 0 0 161 162 Đối chứng không CCĐ 371 372
Triệu chứng lâm sàng (1: ốm; 2: ốm nặng; 3: chết) Ký hiệu vịt Ngày sau công cường độc Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hiệu giá kháng thể (log2)
9.3 Re-5 0.06 0
1 1
251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 7 9 9 9 10 8 11 10 11 9 1 1 1 1 0.2 0 0.4 0 0 0 0 0 0 0
Đối chứng CCĐ 0 1.1 60
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 3 3 1 1 1 2 3 3 2 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 2 3 3 3 1 2 3 3 3 3 1 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1.7 0.2 1.2 2.3 0 0.3 1.6 1.8 1.9 0
8.5 0 0 Vacxin không CCĐ
261 262 10 7 0 0
0 0 0 Đối chứng không CCĐ
147
373 374 0 0 0 0
Virus bài thải Virus bài thải
Ký hiệu gà Ký hiệu gà
Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết
39.19 30.72 17.57 Re-5 30.07 34.97 20.98
34.02 37.43 33.47 35.09 30.91
40 38.45 40 40 36.48 40 40 37.10 39.82 40 31.21 29.18 32.91 31.31 32.68 32.15 25.13 31.18 16.95 18.18 31.49 31.00 36.12 28.45 24.13 25.54 26.93 32.76 35.78 30.62 33.64 38.11 19.22 21.41 22.32
21.58 18.02 21.65 17.98
23.22 20.23 23.09
21.37 22.13 21.10 16.71 17.92 20.16 19.78 18.13 16.42 19.03 16.08 17.77 18.18 21.20 20.45 21.74 18.41 16.54 17.24 18.35 16.48 21.51 18.48 19.11 16.02 17.64
40 40 40 40
40 40 40 40 40 40 40 40
40 40 40 40
148
Navet- vifluvac 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Đối chứng CCĐ 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 Vacxin không CCĐ 111 112 Đối chứng không CCĐ 321 322 40 40 40 40 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 Đối chứng CCĐ 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 Vacxin không CCĐ 211 212 Đối chứng không CCĐ 323 324 40 40 40 40
Virus bài thải Virus bài thải Ký hiệu vịt Ký hiệu vịt
Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết
38.34 39.42 Re-5 39.56 39.88 Navet- vifluvac
40 40 38.41 40 39.6 33.21 32.44 39.75 40 40 40 40 40 38.11 40 37.90 40 38.23 40 40 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 40 40 40 40 40 40 38.16 40 37.4 40 40 39.76 40 39.06 40 40 40 40 40 40
33.37 36.06 21.05 31.74 36.37 19.26 Đối chứng CCĐ Đối chứng CCĐ
31.42 35.44 34.27 28.43 32.66 36.77 39.5 35.12 34.98 25.08 40 35.03 33.14 20.33 21.5 18.41 19.06 22.22 24.15 21.67 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 25.44 33.16 30.48 23.41 29.51 38.09 34.64 35.05 31.45 36.13 37.33 34.42 33.72 40 18.37 20.08 17.12 21.46 18.94 19.56
40 40 40 40 Vacxin không CCĐ Vacxin không CCĐ
40 40 40 40 261 262 161 162 40 40 40 40
40 40 40 40 Đối chứng không CCĐ Đối chứng không CCĐ
149
40 40 38.48 40 373 374 371 372 40 40 40 40
Triệu chứng lâm sàng (1:ốm, 2:ốm nặng, 3:chết)
Ký hiệu gà Ngày sau công cường độc
Hiệu giá kháng thể (log2) Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Navet-vifluvac 4.7 30 0.47
100
1 2 3 3 3 3 3 1 1 1 3 3 3 3 1 2 2 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3
0%
3 5 6 5 6 6 6 3 3 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4.5 4 5 1.8 0 0 0 0 0 0 1.5 1.4 0 2.37 2.8 2.8 1.5 2.4 2.9 2.2 2.8 1.7 2.4 2.2 0 0 0
0 0 0%
150
0 0 0 0 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Đối chứng CCĐ 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 Vacxin không CCĐ 111 112 Đối chứng không CCĐ 321 322
Triệu chứng lâm sàng (1:ốm, 2:ốm nặng, 3:chết)
Ngày sau công cường độc Ký hiệu gà
Hiệu gía kháng thể (log2) Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Re-5 7.8 0.49 30%
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 1 1 1 2 2 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 8 9 8 7 6 5 8 9 9 9 0 0 0 1 1.9 2 0 0 0 0
Đối chứng CCĐ 2.36 100% 0
311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 2 2 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.8 2.8 1.5 2.8 2.5 2.3 1.4 2.9 2.4 2.2
0 0% Vacxin không CCĐ 7.5
211 212 8 7 0 0
0 0 0% Đối chứng không CCĐ
151
323 324 0 0 0 0
Triệu chứng lâm sàng (1:ốm, 2:ốm nặng, 3:chết)
Ký hiệu vịt Ngày sau công cường độc HGKT (log2)
Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Navetvifluvac 0
1 1 1 1 1 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 8.3 9 11 7 5 11 10 8 9 7 6 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 1 2 1 0.22 0 0 0.5 0.7 0 0 0 0 0 1
0 1.32 80
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3 3 1 1 1 1 2 3 3 3 3 1 1 1 2 3 1 2 3 3 1 2 3 1 1 1 2 2 1 1 1 3 3 3 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 2.2 1.6 0.3 1.8 1.1 1.2 0.9 0.8 1.2 2.1
8 0 0
7 9 0 0
0.0 0 0
152
Đối chứng CCĐ 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 Vacxin không CCĐ 161 162 Đối chứng không CCĐ 371 372 0 0 0 0
Triệu chứng lâm sàng (1:ốm, 2:ốm nặng, 3:chết)
Ngày sau công cường độc Ký hiệu vịt
Điểm lâm sàng Tỷ lệ chết (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
Hiệu giá kháng thể (log2) 8.7 8 8 10 7 9 8 10 11 9 7 1 1 1 1 1 0.11 0 0.4 0 0 0 0 0 0 0 0.7 1 2 1 1 1
0 1.35 70 Re-5 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 Đối chứng công cường độc
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 3 2 3 1 2 1 1 3 3 3 3 3 3 1 2 1 1 3 3 3 3 3 3 2 3 1 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 1.7 1.2 2 0.7 1.1 0.3 0.6 1.8 1.9 2.2 3 1 3 1 1 1 1 3 3 3 2 2 3 1 1 1 2 1 2 3 3
8 0 0 Vacxin không công cường độc
7 9 0 0
0 0 0
0 0
153
261 262 Đối chứng không công cường độc 373 374 0 0
Virus bài thải Virus bài thải
Ký hiệu gà Ký hiệu gà
Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết
Navetvifluvac 34.83 36.62 19,81 Re-5 27.4 33.21 25.75
37.12 37.45 36.23 39.05 33.12 37.59
31.68 36.51 35.66 34.67 38.78 32.33 37.22 34.54 28.23 38.68 35.78 18,32 19,13 21,98 23.76 30.46 28.89 28.55 29.48 30.51 29.04 22.35 26.76 24.20 35.81 32.52 31.59 35.12 35.59 31.43 30.41 25.29 25.8 26.16
28.13 18.76 24.62 20.30
29.35 33.51 29.10 40 35.44 34.32 34.98 27.93 17.45 20.23 17.57 18.96 19.76 18.65 19.09 17.74 20.78 17.37 32.34 24.48 32.08 35.78 36.32 28.78 29.43 27.03 21.57 20.55 19.23 19.67 18.46 19.03 21.88 22.34 20.35 19.94
38.78 40 39.67 39.60 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 Đối chứng CCĐ 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 Vacxin không CCĐ 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Đối chứng CCĐ 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 Vacxin không CCĐ
40 37.56 40 40 211 212 40 39.33 40 39.19 111 112
39.98 39.66 39.14 40 Đối chứng không CCĐ Đối chứng không CCĐ
154
40 39.95 39.32 40 323 324 40 38.27 40 40 321 322
Virus bài thải Virus bài thải
Ký hiệu vịt Ký hiệu vịt
Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết Ngày 3 Ngày 10 Ngày chết
Navetvifluvac 35.33 36.20 Re-5 39.56 39.88
35.68 39.51 31.66 40 40 32.33 31.22 34.54 40 28.39 35.35 40 34.45 31.23 40 29.94 40 38.23 40 32.78 40 40 40 40 40 40 38.16 40 37.4 40 40 39.76 40 39.06 40 40 40 40 40 40
33.61 32.09 21.27 33.06 31.64 22.08
29.35 33.51 31.46 29.10 40 35.44 34.32 40 34.98 27.93 31.82 32.35 23.45 22.23 20.96 18.65 19.09 21.78 22.75 27.86 33.97 29.55 36.9 40 35.29 32.72 34.35 30.58 29.4 33.61 30.23 31.07 19.74 21.11 20.36 24.70 24.93 21.62
38.78 40 39.2 40 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 Đối chứng CCĐ 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 Vacxin không CCĐ 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 Đối chứng CCĐ 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 Vacxin không CCĐ
161 162 40 37.56 40 40 261 262 38.42 40 40 40
39.98 39.66 39.19 40 Đối chứng không CCĐ Đối chứng không CCĐ
155
371 372 40 39.95 39.32 40 373 374 39.02 39.35 40 40
Phát hiện virus bằng PCR (trái) và phân lập virus trên nuôi tế bào (phải)
156
