TNU Journal of Science and Technology
230(01): 243 - 250
http://jst.tnu.edu.vn 243 Email: jst@tnu.edu.vn
STUDY ON CHANGES IN SOME GROWTH, PHYSIOLOGIAL AND
BIOCHEMICAL INDICATORS OF THE KING MANDARIN (Citrus nobilis Lour.)
IN SALINITY STRESS IN VITRO
Luong Thi Le Tho1*, Do Thi Tuyet Hoa1, Luu Tang Phuc Khang2
1Ho Chi Minh city University of Education, 2Chiang Mai University, Thailand
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
31/7/2024
Citrus nobilis Lour is a fruit tree known for its high nutritional and
economic value. Many nutrients and biologically active natural
compounds in King mandarin help improve the body's resistance against
diseases. Currently, cultivation in the Southwest provinces, including the
cultivation of King mandarin, is suffering great damage due to
increasingly complex drought and salinity. In vitro tests were peformed
with different NaCl concentrations (0, 1, 3, 5, 7, and 9 g/L) to the effects
of salt stress on the King mandarin growth performance. The results
show that the presence of NaCl in the culture medium inhibit King
Mandarin's growth process. In particular, the culture medium
supplemented with NaCl at a concentration of 9 g/L did not produce in
vitro seedlings. At NaCl concentrations from 1 g/L to 7 g/L, the
physiological indicators (plant height, number of roots, root length, fresh
biomass, dry biomass) and photosynthetic intensity of in vitro King
mandarin decreased with increasing salt concentration, lower than the
control. Contrastly, the higher the salt concentration, the higher the
proline content. In additon, ligninization and granular deposits appeared
more in the root anatomical structure.
Revised:
17/11/2024
Published:
18/11/2024
KEYWORDS
King Mandarin
in vitro
Physiological
Biochemical
Salinity stress
NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG, SINH LÝ,
SINH HÓA CỦA GIỐNG CAM SÀNH (Citrus nobilis Lour.) TRONG MÔI
TRƯỜNG NHIỄM MẶN IN VITRO
Lương Thị Lệ Thơ1*, Đỗ Thị Tuyết Hoa1, Lưu Tăng Phúc Khang2
1Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, 2Đại học Chiang Mai, Thái Lan
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
31/7/2024
Cam sành (Citrus nobilis Lour.) là một trong các loại cây ăn quả đem
lại giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Nhiều chất dinh dưỡng và các hợp
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học trong quả Cam sành giúp cải thiện
sức đề kháng của cơ thể chống lại bệnh tật. Hiện nay, việc trồng trọt ở
các tỉnh miền Tây Nam Bộ, trong đó có việc trồng cây Cam sành bị thiệt
hại lớn do hạn mặn diễn ra ngày càng phức tạp. Nghiên cứu này khảo
sát ảnh hưởng của stress mặn lên khả năng sinh trưởng của Cam sành
trong điều kiện in vitro các nồng độ NaCl khác nhau (0, 1, 3, 5, 7 và 9
g/L). Kết quả cho thấy, sự có mặt của NaCl trong môi trường nuôi cấy
làm chậm quá trình sinh trưởng của Cam sành. Đặc biệt, môi trường
nuôi cấy có bổ sung NaCl với nồng độ 9 g/L hạt Cam không phát triển
thành cây con in vitro. Ở nồng độ NaCl từ 1 g/L đến 7 g/L các chỉ tiêu
sinh lý (chiều cao cây, số rễ, chiều dài rễ, sinh khối tươi, sinh khối khô)
và cường độ quang hợp của cây Cam in vitro giảm theo chiều tăng nồng
độ muối, thấp hơn nghiệm thức đối chứng. Ngược lại, nồng độ muối
càng cao, hàm lượng proline càng tăng, đồng thời sự lignin hóa và các
hạt lắng đọng xuất hiện ở cấu trúc rễ càng nhiều.
Ngày hoàn thiện:
17/11/2024
Ngày đăng:
18/11/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10841
* Corresponding author. Email: tholtl@hcmue.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 243 - 250
http://jst.tnu.edu.vn 244 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Ngành trồng trọt là ngành sản xuất chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta, chiếm khoảng
75% giá trị sản lượng nông nghiệp hằng năm [1]. Những năm qua, diện tích trồng cây ăn quả có
xu hướng tăng lên và đây là nhóm cây trồng đã có bước phát triển nhảy vọt [2], trong đó, Cam sành
(Citrus nobilis Lour.) là cây ăn quả đem lại giá trị kinh tế cao [3] với hàm lượng các chất dinh
dưỡng, vitamin C, các chất chống oxy hóa dồi dào,… giúp tăng sức đề kháng cho cơ thể chống lại
các loại bệnh tật [4].
Do biến đổi khí hậu như nước biển dâng, tăng nhiệt độ, khai thác nước ngầm quá mức để đáp
ứng nhu cầu nước cho phát triển [5], vùng sản xuất cây có múi lớn nhất nước ta là Đồng bằng Sông
Cửu Long [3] đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi xâm nhập mặn và tình trạng này được dự báo
sẽ diễn biến xấu hơn trong những năm tiếp theo [6]. Trong thành phần các ion khoáng gây mặn
cho đất, muối NaCl là nguyên nhân gây mặn chủ yếu [7]. Xâm nhập mặn gây thiệt hại nặng nề đến
năng suất cam quýt vì ion Cl- đặc biệt độc đối với cây có múi [8]. Mặn gây hạn sinh lý, stress thẩm
thấu, stress ion và tạo ra các loại oxy phản ứng (Reactive Oxygen Species - ROS), từ đó làm rối
loạn các quá trình sinh lý của cây, tổn thương các sắc tố quang hợp, giảm tỉ lệ trao đổi khí, hoạt
động của enzyme [9], ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của thực vật, kéo theo đó là sự suy giảm về
năng suất và sinh khối của thực vật.
Thực tiễn trên cho thấy, việc tìm ra giống Cam chịu mặn đáp ứng cho việc trồng trọt ở các vùng
đất bị nhiễm mặn là cần thiết. Để đáp ứng với stress của môi trường, cây trồng có những biến đổi
về sinh lý, sinh hóa, hình thái, giải phẫu [7]. Trong quá trình đánh giá khả năng chống chịu với
stress mặn của cây trồng, việc quan sát các thay đổi về hình thái, sinh lý, sinh hóa của cây là rất
quan trọng, qua đó giúp đánh giá mức độ thiệt hại do stress mặn gây ra cho cây trồng [10].
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về khả năng chịu mặn của các cây thuộc chi Citrus. Tuy
nhiên, phần lớn các nghiên cứu đều tiến hành trong điều kiện thực địa [11], [12] hoặc thực hiện
trên gốc ghép của cây thuộc chi Citrus [9], [13]-[15]; trong khi các nghiên cứu về cây Cam sành
trong điều kiện nhiễm mặn in vitro còn hạn chế. Chính vì vậy, nghiên cứu sự biến đổi một số chỉ
tiêu sinh trưởng, sinh lí, sinh hóa của Cam sành (Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện stress mặn
in vitro được thực hiện nhằm khảo sát khả năng chịu mặn của Cam sành dưới tác động của NaCl ở
các nồng độ khác nhau, qua đó cung cấp cơ sở khoa học để áp dụng giải pháp phù hợp có thể hạn
chế tác hại của mặn cho quy trình trồng cây Cam sành ở những vùng đất bị xâm nhập mặn.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Hạt giống cây Cam sành Citrus nobilis Lour. được cung cấp từ vườn ươm thuộc xã Đông Thành,
thị xã Bình Minh, thành phố Vĩnh Long.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thử tính sống của hạt
Hạt được đánh thức phôi bằng cách ngâm trong nước 24 giờ. Sau đó, bóc vỏ hạt và ngâm hạt
trong dung dịch carmin indigo. Sau 2 giờ cắt dọc hạt ngang qua phần phôi, quan sát sự bắt màu của
phôi hạt. Kết quả tất cả phôi hạt không bắt màu, tỉ lệ sống đạt 100%.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Hạt Cam sành được khử trùng bên ngoài tủ cấy bằng cách lắc mẫu trong xà phòng loãng 1% và
rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng.
Tiếp tục đưa hạt Cam đã rửa vào tủ cấy để khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút
[16]; tiếp tục rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng; sau đó, cấy mẫu vào ống nghiệm có đường
kính 22 mm, dài 20 cm, chứa 10 mL môi trường nuôi cấy Murashige and Skoog (MS) [17] bổ sung
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 243 - 250
http://jst.tnu.edu.vn 245 Email: jst@tnu.edu.vn
thêm saccharose 20 g/L, agar 7 g/L và NaCl ở các nồng độ khác nhau: 0 (đối chứng), 1, 3, 5, 7 và
9 g/L [18]. Môi trường được chỉnh pH = 5,8 (bằng NaOH 1N và HCl 1N), được hấp khử trùng
bằng autoclave ở nhiệt độ 121oC và áp suất 1 atm trong thời gian 17 phút.
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy
Tất cả các nghiệm thức nuôi cấy đều được thực hiện ở điều kiện chiếu sáng 2500 ± 500 lux, độ
ẩm 60% ± 5% và nhiệt độ 28oC ± 2oC trong 12 giờ mỗi ngày.
2.2.4. Thu thập số liệu
Trong thời gian 60 ngày theo dõi các chỉ tiêu (không tiến hành cấy chuyền mẫu). Các chỉ tiêu
được theo dõi sau 60 ngày nuôi cấy ở những cây con còn sống và không bị nhiễm của các nghiệm
thức thí nghiệm:
- Chiều cao cây (cm): Đo từ bề mặt thạch đến đỉnh ngọn của cây.
- Số rễ (rễ): Thống kê số lượng ở ngày 20, 40 và 60 sau khi cấy.
- Chiều dài rễ (cm): Đo từ gốc đến đỉnh rễ của rễ dài nhất bằng đơn vị cm.
- Sinh khối tươi, sinh khối khô (g): Sinh khối tươi được xác định bằng cách cân mẫu trong điều
kiện in vitro ở các nghiệm thức ngay sau khi lấy ra khỏi ống nghiệm. Sau đó, xác định sinh khối
khô bằng cách sấy mẫu trong 2 giờ ở 90oC, sau đó tiếp tục sấy đến khi khối lượng không thay đổi
và cân để xác định sinh khối khô [19].
- Cường độ quang hợp (µmolO2/dm2/giờ) của lá được xác định bằng điện cực oxygen dựa trên
hàm lượng oxygen tăng lên ở mức 2000 lux trong buồng đo (LeafLab2, Hansatech) theo thời gian,
ở nhiệt độ 25oC [19].
- Hàm lượng proline (mM.l-1/g khối lượng tươi): Proline có trong cây và lá được li trích, thực
hiện phản ứng màu, tiếp đó đo mật độ quang ở λ = 520 nm và xác định hàm lượng nhờ so sánh với
đường chuẩn proline theo phương pháp của Paquin và Lechasseur [20].
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức tiến hành 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy
1 hạt Cam.
2.2.5. Phương pháp khảo sát cấu tạo giải phẫu
Vi phẫu sau khi cắt được ngâm và tẩy sạch mẫu bằng dung dịch Javel 50% từ 15 - 30 phút để
loại hết chất nguyên sinh của tế bào. Rửa sạch Javel bằng nước cất. Tiếp đó, sử dụng acid acetic
1% trong vòng 5 phút để loại bỏ hết Javel còn sót lại trong mẫu. Tiếp tục rửa sạch hết mùi acid
acetic loãng bằng nước cất. Nhuộm đỏ trong dung dịch carmine - phèn (1 g carmine + 10 g phèn
chua + 200 mL nước cất) khoảng 25-30 phút. Rửa trong nước cất và nhuộm mẫu bằng dung dịch
xanh metylen 1% trong khoảng 1 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất. Quan sát mẫu trong giọt
glycerin [21].
2.2.6. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lí thống kê bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)
phiên bản 26 dùng cho Windows. Kiểm định One-way Anova được áp dụng với sự khác biệt có ý
nghĩa ở mức xác suất P ≤ 0,05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NaCl lên các chỉ tiêu sinh trưởng của Cam sành
(Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện nuôi cấy in vitro
Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, ở các nghiệm thức có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác
nhau cho chiều cao cây dao động từ 0,22-1,46 cm, thấp hơn nghiệm thức đối chứng đạt 2,15 cm.
Ở nghiệm thức được bổ sung NaCl với nồng độ 9 g/L, hạt Cam không phát triển thành cây con in
vitro. Chiều cao cây thấp nhất ở nghiệm thức có nồng độ NaCl 7g/L, đạt 0,22 cm (Bảng 1).
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 243 - 250
http://jst.tnu.edu.vn 246 Email: jst@tnu.edu.vn
Đối với các chỉ tiêu về rễ, kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ NaCl càng cao, số lượng và
chiều dài rễ của cây Cam sành in vitro càng giảm (Hình 2). Các nghiệm thức được bổ sung NaCl
có số lượng rễ dao động từ 0,00 – 3,03 rễ và chiều dài rễ dao động từ 0,00 – 3,33 cm, thấp hơn
nghiệm thức đối chứng với số rễ đạt 3,73 rễ và chiều dài rễ là 5,24 cm (Bảng 1).
Bảng 1. Ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau đến các chỉ tiêu sinh trưởng của
cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện nuôi cấy in vitro sau 60 ngày nuôi cấy
Nồng độ
NaCL
(g/L)
Chỉ tiêu
Chiều cao cây
(cm)
Số rễ
(rễ)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g)
Sinh khối khô
(g)
0
2,15 0,35e
3,73 1,53e
5,24 0,59f
0,44 0,02f
0,14 0,01e
1
1,46 0,30d
3,03 1,47d
3,33 0,17e
0,39 0,03e
0,12 0,01d
3
0,81 0,08c
1,50 0,51c
2,17 0,15d
0,35 0,02d
0,10 0,01c
5
0,72 0,11c
1,00 0,00b
1,32 0,18c
0,25 0,01c
0,09 0,01b
7
0,22 0,07b
1,00 0,00b
0,40 0,04b
0,22 0,01b
0,08 0,01a
9
0,00 0,00a
0,00 0,00a
0,00 0,00a
0,21 0,17a
0,07 0,01a
Ghi chú: Số liệu trnh bày dưi dạng Mean ± SD: trung bnh ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái a, b, c, d, e, f chỉ sự
khác biệt về chiều cao cây ở các nghiệm thức bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau ở mức ý nghĩa thống kê (p
< 0,05).
Trong môi trường nuôi cấy in vitro được bổ sung NaCl, các chỉ tiêu sinh trưởng có xu hướng
giảm, dẫn đến sinh khối tươi và sinh khối khô ở các nghiệm thức tương ứng cũng giảm và các kết
quả đều có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 1). Sinh khối tươi và sinh khối khô của cây đều
giảm ở các nghiệm thức stress mặn, trong đó, sinh khối tươi và sinh khối khô ở nghiệm thức có bổ
sung NaCl nồng độ 9 g/L là thấp nhất, lần lượt đạt 0,21 g và 0,07 g so với nghiệm thức đối chứng
có sinh khối tươi là 0,44 g và sinh khối khô là 0,14 g, cao nhất trong tất cả các nghiệm thức. Sự
sinh trưởng của cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) in vitro trong điều kiện nhiễm mặn bởi NaCl
ở các nồng độ khác nhau ở giai đoạn 60 ngày tuổi được thể hiện qua Hình 1.
Hình 1. Cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) in vitro trong điều kiện nhiễm mặn bởi NaCl ở các nồng độ
(A) 0 g/L (đối chứng); (B) 1 g/L; (C) 3 g/L; (D) 5 g/L; (E) 7 g/L; (F) 9 g/L ở giai đoạn 60 ngày tuổi
3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau đến chỉ tiêu sinh hóa của
cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện nuôi cấy in vitro
Bảng 2. Ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau đến chỉ tiêu sinh hóa của
cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện nuôi cấy in vitro sau 60 ngày nuôi cấy
Nồng độ NaCl (g/L)
Cường độ quang hợp
(µmolO2/dm2/giờ)
Hàm lượng proline
(mM.l-1/g khối lượng tươi)
0
83,48 2,61c
103,90 0,70b
1
35,02 2,78b
122,24 2,97c
3
7,02 0,52a
180,30 2,20d
5
-
187,20 1,15e
7
-
196,35 1,68f
9
-
0,00 0,00a
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 243 - 250
http://jst.tnu.edu.vn 247 Email: jst@tnu.edu.vn
Ghi chú: “-”: không ghi nhận được. Các chữ cái a, b, c, d, e, f chỉ sự khác biệt về cường độ quang hợp ở các nghiệm
thức bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau ở mức ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Kết quả đo cường độ quang hợp của cây Cam sành in vitro sau 60 ngày nuôi cấy cho thấy, đối
với các nghiệm thức được bổ sung NaCl nồng độ 5 g/L - 9 g/L, cây Cam sành in vitro không ra lá
nên không đo được cường độ quang hợp. Các nghiệm thức bổ sung NaCl nồng độ 1 g/L và 3 g/L
có cường độ quang hợp đạt lần lượt là 35,02 µmolO2/dm2/giờ và 7,02 µmolO2/dm2/giờ thấp hơn so
với nghiệm thức đối chứng (83,48 µmolO2/dm2/giờ) (Bảng 2).
Cùng với sự giảm mạnh cường độ quang hợp thì kết quả đo hàm lượng proline ở các nghiệm
thức bổ sung NaCl cũng bị ảnh hưởng. Với nghiệm thức bổ sung NaCl nồng độ 1 g/L, sự sinh
trưởng của cây Cam sành bị ảnh hưởng nhẹ nên hàm lượng proline tăng nhẹ so với đối chứng, đạt
122,24 mM.l-1/g khối lượng tươi, ngược lại hàm lượng proline tăng mạnh nhất ở nghiệm thức được
bổ sung NaCl nồng độ 7 g/L, đạt 196,35 mM.l-1/g khối lượng tươi (Bảng 2).
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau đến hình thái giải phẫu rễ
cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) trong điều kiện nuôi cấy in vitro
Hình thái giải phẫu rễ cây Cam sành trong điều kiện nhiễm mặn in vitro thể hiện qua Hình 2.
Hình 2. Ảnh hưởng của NaCl ở nồng độ (A) 0 g/L (đối chứng); (B) 1 g/L; (C) 3 g/L; (D) 5 g/L; (E) 7 g/L;
đến hnh thái giải phẫu của rễ cây Cam sành (Citrus nobilis Lour.) nhiễm mặn in vitro tại giai đoạn
60 ngày tuổi(1: ngoại b; 2: nội b;
→
: các hạt lắng đọng; x: tế bào nhu mô vỏ có sự tẩm lignin)
Phẫu thức cắt ngang của rễ Cam sành in vitro có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau cho
thấy, sự lignin hóa ở nội bì và ngoại bì tăng theo chiều tăng nồng độ NaCl. Nồng độ NaCl càng
tăng sự hóa lignin ở rễ càng nhiều, thể hiện ở nồng độ NaCl 1 g/L và 3 g/L nội bì của rễ cây Cam
sành in vitro đã xuất hiện một số tế bào bị lignin hóa, tỉ lệ các tế bào nội bì bị lignin hóa ở các nồng
độ 5 g/L và 7 g/L nhiều hơn rõ rệt và xuất hiện phần nhu mô vỏ bị hóa gỗ. Bên cạnh đó, khi nồng
độ muối tăng dần, những hạt lắng đọng xuất hiện trong nhu mô rễ cũng nhiều hơn (Hình 2B, 2C,
2D, 2E).
3.4. Thảo luận
Các loài thuộc chi Citrus là nhóm cây nhạy cảm với mặn [22], khi bị stress mặn, cây bị hạn sinh
lý do áp suất thẩm thấu của môi trường đất lớn hơn tế bào, khiến cho cây khó hút nước [7]. Trong
điều kiện mặn, NaCl làm tăng hàm lượng Na+ nhưng làm giảm hàm lượng Ca2+ của cây [23]. Trong
cây, Na+ được vận chuyển chủ động nhờ ATP [7], hàm lượng cao của ion này trong tế bào làm tăng