ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________
CHU THANH BÌNH
NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU
Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC
DIỆT TUYẾN TRÙNG
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9420101.07
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2019
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
2. TS. Hồ Tuyên
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
vào hồi giờ ngày tháng năm 20...
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tuyến trùng ký sinh thực vật (Plant-parasitic nematodes -
PPN) gây bệnh trên hàng loạt các loại rau, cây nông nghiệp, cây
công nghiệp. Mỗi năm ƣớc tính gây thiệt hại trị giá hơn 157 tỷ USD
trên toàn thế giới. Trong nhiều thập kỷ, việc kiểm soát tuyến trùng
phụ thuộc rất nhiều vào các chất hóa học nhƣ Furadan, Marshal,
Oncol, Nokap, Vimoca… với hiệu quả làm giảm mật số tuyến trùng
nhƣng vƣờn cây vẫn bị bệnh và phải áp dụng thuốc trong thời gian
dài. Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chƣa mang lại hiệu quả cao
thƣờng dẫn tới khả năng kháng thuốc, mất cân bằng giữa hệ vi sinh
vật có lợi và vi sinh vật đất. Hiện nay, một số chất hóa học đang bị
rút khỏi danh mục thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng vì độc tính
của chúng đối với động vật và sức khỏe con ngƣời. Hiệu quả của
luân canh cây trồng bị hạn chế trong một số hệ thống cây trồng do
phạm vi vật chủ rộng hoặc tỷ lệ sống lâu dài của hầu hết các PPN.
Hơn nữa, sự đa dạng di truyền cao trong/giữa các quần thể tuyến
trùng làm hạn chế hiệu quả của các loại cây trồng kháng bệnh do
tuyến trùng gây nên. Do đó, sản xuất cây trồng toàn cầu vẫn đang bị
đe dọa nặng nề từ PPNs. Cùng với việc phát triển các biện pháp kiểm
soát sinh học, các vi sinh vật tiêu diệt tuyến trùng nói chung và nấm
sợi nói riêng đƣợc coi nhƣ một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để kiểm
soát các loài gây hại tuyến trùng.
Tại Việt Nam, theo quy hoạch lý thuyết, diện tích trồng cây
Hồ tiêu của tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020 đạt 15.000 ha, tuy nhiên
tháng 1 năm 2017 diện tích trồng Hồ tiêu đã tăng lên tới 38.616 ha.
3
Việc tăng nhanh diện tích trồng Hồ tiêu cũng kèm theo số diện tích
bị sâu, dịch hại tăng nhanh. Theo Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực
vật, từ đầu năm 2016 đến đầu năm 2017, tỉnh Đắk Lắk có hơn 2.776
ha trồng Hồ tiêu bị sâu bệnh gây hại, chiếm 10% tổng diện tích Hồ
tiêu toàn tỉnh: Trong đó, hơn 579 ha bị bệnh vàng lá chết nhanh,
1.113 ha bệnh vàng lá chết chậm, 1.083 ha bị các loại sâu bệnh khác
gây hại. Diện tích trồng Hồ tiêu bị bệnh tập trung tại các huyện Buôn
Đôn (515 ha), Ea H’leo (183 ha), Ea Kar (hơn 156 ha), Krông Năng
(45,5 ha), thị xã Buôn Hồ (216 ha)… Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan
và bùng phát, Chi cục đã hƣớng dẫn ngƣời dân thực hiện nhiều biện
pháp phòng trừ dịch bệnh nhƣ thƣờng xuyên thăm vƣờn để nắm bắt
tình hình sinh trƣởng của cây trồng, thực hiện bón phân hợp lý, quản
lý sâu bệnh hại tổng hợp IPM… Ngoài ra, một số chi nấm sợi có khả
năng sinh tổng hợp các enzym và độc tố nhằm ngăn cản sự sinh sản,
nở trứng và khả năng sống sót của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne
sp. . Những chi nấm này đƣợc sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh
học diệt tuyến trùng. Ví dụ nhƣ chế phẩm sinh học Biocon có thành
phần chính là nấm Paecilomyces lilacinus, đây là loài có khả năng ký
sinh, tiêu diệt tuyến trùng và trứng của chúng.
Nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết để tìm kiếm các chủng
nấm sợi đối kháng cao với nấm diệt tuyến trùng hại Hồ tiêu vừa thân
thiện với môi trƣờng vừa tăng hiệu quả để kiểm soát bệnh gây ra bởi
tuyến trùng, đề tài đƣợc tiến hành với tiêu đề nhƣ sau:
“Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh trên cây Hồ tiêu Piper
nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng”
4
2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn đƣợc một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến
trùng Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây Hồ tiêu Piper
nigrum L. và tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm
tăng năng suất cây Hồ tiêu tối thiểu là 15%.
Tạo đƣợc chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao
gấp 3 lần so với chủng tự nhiên.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Trong ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng phân
lập đƣợc trên đất trồng Hồ tiêu, Paecilomyces lilacinus P1 (hay còn
gọi là Purpureocillium lilacinum) là chủng đƣợc quan tâm nghiên
cứu bởi hoạt lực diệt tuyến trùng cao và tính an toàn của chủng.
Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô
hình tại tỉnh Đăk Lăk đã có tác dụng điều hòa tăng năng suất lên
20% đối với vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh; 48% đối với vƣờn
Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng nhất. Chế phẩm sinh học diệt tuyến
trùng sẽ góp phần bảo vệ môi trƣờng và phát triển bền vững ngành
sản xuất Hồ tiêu ở nƣớc ta.
Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so
với chủng tự nhiên trong vòng 48 giờ. Sử dụng phƣơng pháp chuyển
gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ mở ra những
triển vọng về nghiên cứu vai trò, chức năng của các gen liên quan
đến cơ chế diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces.
4. Những đóng góp mới của luận án
+) Tuyển chọn đƣợc 1 chủng vi nấm bản địa từ đất trồng Hồ tiêu tỉnh
Đăk Lăk có hoạt lực diệt tuyến trùng cao, an toàn với con ngƣời.
5
+) Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô hình,
đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm
tăng lên 20% đối với những vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh,
48% so với vƣờn Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng nhất.
+) Lần đầu tiên đã xây dựng quy trình chuyển gen bằng phƣơng pháp
sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dựa trên cơ chế trợ
dƣỡng uridine/uracil đạt hiệu quả cao gấp 10 lần so với nghiên cứu trƣớc đây. 5. Bố cục của luận án
Bố cục của luận án gồm 132 trang, 18 bảng và 32 hình. Cụ
thể: Mở đầu 3 trang; Chƣơng 1 Tổng quan tài liệu 39 trang; Chƣơng
2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 25 trang; Chƣơng 3 Kết quả
và thảo luận 48 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các
công trình 1 trang; Tài liệu tham khảo 19 trang.
Chƣơng 1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. KHÁI QUÁT VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ BỆNH GÂY RA BỞI
TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp.
1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng
Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, tính đến tháng 10
năm 2016, bệnh gây ra bởi tuyến trùng chủ yếu là bệnh chết chậm và
bệnh vàng lá. Diện tích cây bị bệnh tập trung ở một số địa phƣơng
nhƣ Quảng Trị, Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Bình Dƣơng, Bình
Phƣớc,...lên đến hàng ngàn ha. Theo báo cáo của 3 tỉnh trọng điểm
trồng cây Hồ tiêu của Tây Nguyên là Đăk Lăk, Gia Lai và Đắk
Nông, hàng năm, mỗi tỉnh đều có vài ngàn ha tiêu bị nhiễm bệnh
6
vàng lá, tuyến trùng sần rễ …Tỉnh Gia Lai năm 2016 đã có trên
6.155 ha Hồ tiêu bị nhiễm bệnh làm thiệt hại cho các gia đình trồng
Hồ tiêu cả ngàn tỷ đồng.
1.1.2. Giới thiệu về tuyến trùng Meloidogyne sp.
Tuyến trùng gây hại thực vật thuộc nhóm động vật không
xƣơng sống, có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở
thực vật. Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng
ký sinh thực vật gây hại nhiều nhất đối với nền nông nghiệp trên toàn
thế giới. Trên cây Hồ tiêu, tuyến trùng Meloidogyne gây ra bệnh sần
rễ, vàng lá, chết chậm. Tuyến trùng ký sinh trên tất cả các bộ phận
của cây, nhƣng vùng rễ là nơi tuyến trùng tập trung nhiều nhất. Rễ
cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn thƣơng, trên bề mặt có dạng
sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá và gây chết.
Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai
đoạn phát triển: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng
cảm nhiễm-J2); ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trƣởng thành
với con cái và con đực.
Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne sp.
Hiện nay, nông dân thƣờng xử lý khi cây đã chớm biểu hiện
bệnh khi đó tuyến trùng đã xâm nhập và mức độ bệnh đã nặng nên
rất khó chữa trị hoặc mất nhiều thời gian và cây phục hồi cho năng
suất thấp. Có một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng nhƣ: Tuyển
chọn ngay từ khâu chọn giống: chọn cây khỏe, có khả năng kháng bệnh (i) Vật lý: Đa số tuyến trùng không sống đƣợc ở nhiệt độ 60oC; vì vậy biện pháp xử lý nhiệt sẽ triệt để nhƣng chi phí cao và thời gian
dài (ii) Hóa học: Biện pháp này cho hiệu quả cao nhƣng gây ô nhiễm
7
môi trƣờng, độc hại đối với ngƣời và động vật; (iii) Sinh học: mang
lại hiệu quả lâu dài hƣớng tới môi trƣờng phát triển bền vững.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG
Nấm diệt tuyến trùng là loại vi sinh vật có thể bắt, tiêu diệt
và tiêu hóa tuyến trùng. Có hơn 200 loài nấm sợi đƣợc biết đến khác
nhau về khả năng hoại sinh/ký sinh tuyến trùng. Các chi nấm này đều
có khả năng diệt tuyến trùng từ dạng trƣởng thành, dạng ấu trùng và
trứng, đồng thời sử dụng tuyến trùng làm chất dinh dƣỡng. Nhiều
loại nấm diệt tuyến trùng hình thành bẫy và ký sinh trứng tuyến
trùng có thể tồn tại trong đất ở dạng hoại sinh nhƣng loại nội ký sinh
thì sử dụng tuyến trùng là chất dinh dƣỡng (ký sinh bắt buộc). Hình
1.1 biểu diễn sơ đồ khái quát hóa sự tƣơng tác giữa nấm sợi (vi
khuẩn) tiêu diệt tuyến trùng với tuyến trùng, các phƣơng thức dẫn dụ
và diệt tuyến trùng.
Hình 1.1. Sự tƣơng tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn
1.2.1. Vai trò kiểm soát sinh học của nấm diệt tuyến trùng
Kiểm soát sinh học theo Cook và cs., (1993) là việc con
ngƣời sử dụng các vi sinh vật đối kháng không gây bệnh để ức chế
mầm gây bệnh theo cách thân thiện với môi trƣờng. Dựa trên các cơ
chế và tác dụng, các sản phẩm từ chủng này có thể đƣợc sử dụng làm
phân bón sinh học, làm chất tăng cƣờng thực vật và làm thuốc trừ
sâu sinh học. Theo nghiên cứu của Wu và cs., (2015), thị trƣờng toàn
cầu về thuốc trừ sâu sinh học sẽ tăng lên tới 83,7 tỷ USD vào năm
2019.
1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng
Các nhà khoa học đã phân loại nhóm nấm diệt tuyến trùng
dựa trên kiểu tấn công con mồi và do đó chia thành năm nhóm: (1)
8
bẫy/bẫy động vật, (2) nấm diệt tuyến trùng “ăn thịt”, (3) nội ký sinh,
(4) nấm sản xuất độc tố, (5) nấm sử dụng các thiết bị tấn công đặc
biệt.
1.2.2.1. Nấm bẫy tuyến trùng
Hầu hết các loại nấm bẫy tuyến trùng đƣợc công bố đều
thuộc Ascomycota. Những loại nấm này có thể sống hoại sinh trong
đất. Tuy nhiên, với sự có mặt của tuyến trùng, những loài nấm này
trở thành kẻ săn mồi thông qua việc sản xuất các bẫy cụ thể, bao gồm
các vòng, núm dính, mạng dính, cột dính.
1.2.2.2. Nấm ký sinh tuyến trùng
Chính vì khả năng hoại sinh hạn chế của chúng trong đất làm
cho nấm nội ký sinh sử dụng tƣơng đối hẹp trong các ứng dụng kiểm
soát sinh học. Trong số các loại nấm nội ký sinh, Drechmeria
coniospora đƣợc nghiên cứu nhiều nhất.
1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng
Giới thiệu về Paecilomyces sp.:Các loài thuộc chi
Paecilomyces là nấm sợi xuất hiện trong môi trƣờng đất khá phổ
biến. Với cơ chế là ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng đồng thời sản
sinh ra các enzym nhƣ chitinase, protease có khả năng phân hủy lớp
kitin bên ngoài của ấu trùng và ức chế nở trứng. Các công bố cho
thấy chitinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình diệt tuyến
trùng, protease và các enzym khác có vai trò hỗ trợ chitinase nhằm
thúc đẩy nhanh quá trình diệt. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
truyền qua đã cho thấy sợi nấm xâm nhập trực tiếp vào lớp biểu bì
của trứng, ấu trùng của M. javanica.
9
Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng
Vào những năm 1980, lần đầu tiên các nghiên cứu nhằm
sàng lọc các chủng nấm diệt tuyến trùng trong đất đã chứng minh
đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt tính chitinase của nấm diệt tuyến
trùng nhƣ Pochonia sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp. Theo
Yang và cs., (2007), nhiều loài nấm diệt tuyến trùng nhƣ Pochonia
sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp. đƣợc coi nhƣ các tác nhân
sinh học diệt tuyến trùng. Dackman và cs., (1989) đã công bố hai loài
thuộc chi Verticillium có khả năng diệt Heterodera schachtii nhờ
hoạt tính chitinase và protease của chi nấm này.
Protease từ nấm diệt tuyến trùng
Cho đến nay, hơn 20 protease serine đã đƣợc tinh sạch hoặc
xác định trọng lƣợng phân tử từ các loại nấm diệt tuyến trùng khác
nhau. Các nghiên cứu cơ chế tiêu diệt tuyến trùng đã chỉ ra rằng các
protease này có thể làm suy giảm hiệu quả các lớp biểu bì tuyến
trùng. Do đó, chúng còn đƣợc gọi là protease phân hủy tuyến trùng.
Các cấu trúc tinh thể của hai protease phân hủy lớp biểu bì, Ver112
(tìm thấy từ Lecanicillium psalliotae) và PL646 (tìm thấy từ
Paecilomyces lilacinus), cho các cấu trúc khác nhau dẫn tới chức
năng của chúng khác nhau.
1.3. CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG
1.3.1. Các phƣơng pháp chuyển gen
Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học đang sử dụng các
phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi nhƣ chuyển gen bằng tế bào
trần, chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens… Mỗi phƣơng pháp chuyển gen đều có
10
những ƣu nhƣợc điểm riêng tuy nhiên tùy thuộc vào từng loài mà
hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phƣơng pháp.
1.3.2. Một số gen chỉ thị dùng cho chuyển gen ở nấm
Gen chỉ thị đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả chuyển gen
vào chủng đƣợc chuyển hoặc để sàng lọc các thể chuyển gen.
Chuyển các gen chỉ thị vào chủng cần nghiên cứu nhằm tạo ra các
chủng có kiểu hình khác với chủng tự nhiên (WT). Các gen chỉ thị
giúp các nghiên cứu dễ dàng hơn trong việc nhận biết thể chuyển gen
dƣới kính hiển vi điện tử mà không làm thay đổi hoạt tính sinh lý,
sinh hóa của chủng. Một số gen chỉ thị thƣờng dùng là DsRed, GFP,
GUS, lacZ…
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình chuyển gen
Quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua A.
tumefaciens là phƣơng pháp đƣợc áp dụng phổ biến bởi tính ổn định
và chi phí thấp. Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình chuyển gen phụ
thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: (1) Agrobacter tumefaciens; (2) Thời
gian, cấu trúc màng đồng nuôi cấy quyết định thành công hay thất
bại của quá trình chuyển gen (3) Vật liệu chuyển gen (4) Nồng độ
chất cảm ứng.
1.3.4. Một số nghiên cứu cải biến di truyền đối với nấm diệt
tuyến trùng
Một cách để cải thiện khả năng kiểm soát sinh học của nấm
diệt tuyến trùng là sử dụng kỹ thuật di truyền để tăng khả năng gây
bệnh và khả năng sống sót của loại nấm diệt tuyến trùng. Nhờ đột
biến gen xảy ra với nấm diệt tuyến trùng A. oligospora, gen PII - mã
hóa protease serine (phân hủy lớp biểu bì tuyến trùng) đã đƣợc biểu
hiện quá mức ở A. oligospora. Ahman và cs., (2002) đã nghiên cứu
11
gen PII của Arthrobotrys oligospora và nhận thấy nếu xóa gen PII do
tái tổ hợp tƣơng đồng có ảnh hƣởng đến khả năng diệt tuyến trùng
của nấm này. Đồng thời, nếu biểu hiện quá mức PII thì nhận thấy tốc
độ diệt tuyến trùng tăng hơn so với chủng dại.
1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT
TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
Hiện nay, có một số khó khăn liên quan đến các ứng dụng
kiểm soát sinh học, bao gồm hiệu quả tƣơng đối thấp và sự không
thống nhất trong môi trƣờng nông lâm nghiệp.
Một số biện pháp sử dụng nhằm kiểm soát bệnh tuyến trùng cây
Hồ tiêu tại Việt Nam
Một trong những vấn đề lớn thƣờng gặp đối với đa số hộ
trồng Hồ tiêu là sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và tự ý tăng
liều lƣợng. Mục đích của ngƣời trồng Hồ tiêu là mong muốn tăng
cao năng suất nhƣng họ lại không quan tâm đến chất lƣợng sản
phẩm. Đây cũng chính là nguyên nhân khiến cho tình trạng hồ tiêu
thành phẩm của nƣớc ta xuất khẩu ra thị trƣờng quốc tế có tồn dƣ
chất bảo vệ thực vật vƣợt quá giới hạn cho phép.
Mặc dù tiềm năng kiểm soát sinh học bệnh tuyến trùng của
chi Paecilomyces là rất lớn nhƣng việc nghiên cứu sử dụng chi này ở
Việt Nam còn nhiều hạn chế. Các nghiên cứu gần đây nhƣ đã đề cập
ở trên cho thấy hiệu quả diệt tuyến trùng ở cây Hồ tiêu của chế phẩm
chƣa cao, vì vậy việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm
sinh học nhằm tiêu diệt tuyến trùng là rất cần thiết.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
12
2.1.VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: 15 mẫu đất thu thập tại vùng trồng Hồ
tiêu khu vực tỉnh Đăk Lăk, E.coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens
AGL1; Tuyến trùng Meloidogyne sp; Cây Hồ tiêu: 3,5 tháng tuổi;
Vƣờn Hồ tiêu thời kỳ kinh doanh (từ 5 – 7 năm tuổi) thuộc xã Eabar,
huyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk.
2.1.2. Hóa chất
Hygromycin B; Phleomycin; Nourseothricin; Geneticin
(G418); Kanamycin; Ampilixilin; Cefotaxime; Acetosyringone AS
(Merck); kít tinh sạch DNA (Thermo, Pro MEGA, Intron); enzym Phusion®; pJET 1.2/blunt – Cat. Nos. K1231 (Thermo); Casein (Merck); chitin (Biobasic); CMA (Merck); PDA, 5 – fluoroorotic
acid (5-FOA), Uridine,Uracil (Merck).
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sinh học phân tử thuộc Phòng thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Phòng Công nghệ lên men,
Phòng Công nghệ sinh học enzyme/Viện Công nghệ sinh học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập và quan sát hình thái
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu enzyme/protein
Phƣơng pháp xác định hoạt tính chitinase bằng phản ứng màu với
DNSA theo Miller 1959; Xác định hoạt tính protease đƣợc xác định
theo phƣơng pháp Anson cải tiến.
2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên Gel polyacrylamid (SDS-PAGE)
theo Laemmli U.K., (1970); Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng
protein tổng số theo Bradford.
2.2.4. Tách chiết DNA hệ gen và PCR các đoạn DNA
13
2.2.5. Phản ứng nối ghép gen (Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR
(50-100 ng/µl)
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α
2.2.7. Tách DNA plasmid
2.2.8. Đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5 – FOA của
chủng Paecilomyces lilacinus P1
2.2.9. Phƣơng pháp thu bào tử và hệ sợi nấm P. lilacinus P1
2.2.10. Phƣơng pháp tạo chủng đột biến gen pyrG bằng UV sử dụng
môi trƣờng chọn lọc 5-fluoroorotic acid (5-FOA) từ chủng P1
2.2.11. Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi bằng Agrobacterium
tumefaciens AGL1
2.2.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng
hợp chitinase của P. lilacinus P1
2.2.4. Các phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG
DIỆT TUYẾN TRÙNG
3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi
Từ 15 mẫu đất và rễ quanh cây Hồ tiêu thu thập tại Đăk Lăk.
Mẫu đƣợc pha loãng và đƣợc cấy gạt trên môi trƣờng CDA. Qua
tổng quan tài liệu, dựa trên hình thái, màu sắc khuẩn lạc, cấu trúc
sinh bào tử…, các chủng nấm sợi phân lập đƣợc sàng lọc định hƣớng
tới chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng.
Bảng 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi Bảng 3.2. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp.
14
Tên chủng Tỉ lệ tuyến trùng chết (%) ST
T 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
- - - - 0 Đối chứng 1 -
(nƣớc cất)
- - ± ± 1 ĐC 2 (CD -
dịch thể)
10,81± 30,7 ± 58,5 ± 58,5 ± 2 P1 -
0,75 2,71 2,39 2,41
- 3 NV01 2,31 ± 15,6 ± 50,4 ± 50.4 ±
0,24 1,82 2,84 2,97
- 4 NV20 20,80 ± 40,17 ± 55,23 ± 55,23
2,51 3,28 4,12 ± 3,96
Ghi chú: ( ± ): chết rất ít, không đáng kể, (-): chết
Bảng 3.2 cho thấy, trong thời gian thử nghiệm đến 96 giờ,
tuyến trùng cho tỷ lệ chết cao nhất đến 58% đối với P1; 55,23% đối
với NV20; 50,4% đối với NV01. Trong khoảng thời gian 72 - 96
giờ lƣợng trứng nở và ấu trùng sống sót bắt đầu giảm nhiều, có thể là
tại thời điểm này các enzym phân hủy cùng với các độc tố bắt đầu
đƣợc sản sinh nhiều hơn nên đã có tác động đến khả năng tồn tại và
phát triển quần thể của tuyến trùng so với mẫu đối chứng. Sau 96 giờ
trở đi, lƣợng trứng và ấu trùng sống sót thay đổi không đáng kể, có
thể do lƣợng enzym ủ lâu đã mất đi một phần hoạt tính.
Nhƣ vậy, cả ba chủng nấm đƣa vào khảo sát đều có khả năng
diệt tuyến trùng. Ở Việt Nam hiện nay các công bố về sử dụng chế
phẩm bào tử nấm để diệt tuyến trùng còn hạn chế. Tuy nhiên, đây là
15
bƣớc đầu thử nghiệm và khẳng định tính hiệu quả trong các nghiên
cứu về chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng.
3.1.2. Định danh các chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 bằng trình
tự ITS1/ITS4
Các chủng P1, NV01, NV20 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng CD dịch thể trong thời gian từ 3 -5 ngày; nhiệt độ nuôi cấy 28oC ± 2oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Hệ sợi nấm đƣợc thu để phục vụ tách chiết DNA hệ gen.
Chủng NV20 có mức độ tƣơng đồng về trình tự ITS với chủng
Pleurotus giganteus (KT956125) là 99%, do vậy đƣợc gọi là
Plerotus giganteus NV20. P1 có mức độ tƣơng đồng về trình tự ITS
với chủng Paecilomyces lilacinus KY549673.1 là 99%. NV01 thuộc
loài P. variotii và đƣợc đặt tên là P. variotii NV01.
3.1.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại
bào của chủng P. variotii NV01 và P. lilacinus P1
Kết quả cho thấy, hoạt độ chitinase và protease của P1 đều
cao hơn so với NV01 trong cùng điều kiện nuôi cấy. Cụ thể hoạt độ
chitinase lần lƣợt là 61,7 U/ml và 37,7 U/ml. Hoạt độ chitinase của
chủng P1 gấp 3 lần so với nghiên cứu của Homthong và cs., (2016)
khi nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trƣờng cơ bản.
Bƣớc tinh sạch
3.2.1. Tinh sạch chitinase từ chủng P1
Độ sạch (lần)
HL pr.TS (ml) 0,76
Bảng 3.3. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng P. lilacinus P1 HT tổng số (U)
Hoạt độ riêng (U/ml) 62,63
Hiệu suất (%) 100
Enzym thô 47,6 1,0
0,065 5,53 85,08 11,6 1,35 (NH4)2SO4
DEAE- 0,006 0,8 133,3 1,68 2,1
16
Sephadex A-50
3.2.2. Tính an toàn của chủng P. lilacinus P1
Theo một số công trình nghiên cứu, P. lilacinus là chủng an
toàn đối với con ngƣời. P. lilacinus cho thấy không có độc tính hoặc
khả năng gây bệnh khi thử nghiệm trên động vật gặm nhấm và các
động vật không xƣơng sống khác nhau. P. lilacinus không tồn tại ở
nhiệt độ cơ thể con ngƣời.
3.4.1. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên men
Ở nồng độ cơ chất 0,75% hoạt tính chitinase cao hơn cả cụ
thể gấp 2,7 lần so với không bổ sung cơ chất (70,3 U/ml so với 25,8
U/ml); gấp 1,8 lần so với nồng độ chitin là 0,1%. Điều đó chứng tỏ
rằng, khi không có hoặc nồng độ chitin quá thấp thì lƣợng cơ chất
này không đủ để chủng P1 vừa sinh trƣởng vừa tổng hợp chitinase.
Khi tăng nồng độ cơ chất thì hoạt tính chitinase tăng lên rõ rệt, tuy
nhiên khi tăng đến 1,5% thì hoạt tính chitinase lại giảm, điều này cho
thấy khi tăng nồng độ cơ chất vào môi trƣờng quá cao, thì pha tăng
trƣởng của nấm sợi có thể kéo dài hơn, sản phẩm cuối và thứ cấp sẽ
tích tụ nhiều hơn gây ức chế sự tổng hợp chitinase, nồng độ
chitinase 0,75% là thích hợp cho chủng P1 sinh chitinase cao và sử
dụng nồng độ này cho nghiên cứu kế tiếp.
3.1.7.2. Ảnh hưởng của nguồn các bon
Glucose cho hoạt tính chitinase cao nhất trong các nguồn
khảo sát 58,2 đến 62,7 U/ml. Do đó, glucose đƣợc chọn nguồn
carbon trong quá trình sinh tổng hợp chitinase.
Giống nhƣ carbon, việc lựa chọn nguồn nitơ và nồng độ của
3.1.7.3. Ảnh hƣởng của nguồn ni tơ nó trong môi trƣờng cũng đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất
17
chất chuyển hóa. Bởi vì, chủng P1 này có thể sử dụng cả nguồn nitơ
vô cơ và / hoặc hữu cơ. Trong nghiên cứu này, ảnh hƣởng của một số
nguồn nitơ nhƣ pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3 ở nồng độ 0,5% đã đƣợc nghiên cứu. Kết quả nhận thấy pepton cho hoạt tính
chitinase cao nhất, nguồn nitơ vô cơ cho hoạt tính thấp hơn; kết quả
này cũng trùng với các công bố của Farag A., (2014), Dhar P.,
(2010), Jha S., (2016)
3.1.7.4. Phân tích ý nghĩa của mô hình với thí nghiệm
Sử dụng phƣơng án đáp ứng bề mặt – phƣơng pháp cấu trúc
có tâm nhằm tìm kiếm sự kết hợp tối ƣu của các thành phần này
trong môi trƣờng nuôi cấy. Giới hạn nồng độ phù hợp của các yếu tố
đã đƣợc xác định sơ bộ. Nhƣ vậy năm yếu tố với tổng số 63 thí
nghiệm đƣợc tiến hành. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Hình 3.19. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hƣởng
đến sinh tổng hợp chitinase của chủng P. lilacinus P1
3.1.7.5. Đánh giá tính thực tế của mô hình
Môi trƣờng CHY3 (chitin cơ chất: 0,75%, glucose 1,93%, pepton 0,33%, K2HPO4 0,1%, Ca2+/Mg2+: 3:4) đã đƣợc chọn làm môi
18
trƣờng thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp chitinase
chủng P1: cụ thể là hoạt tính chitinase tăng lên 17% so với khi chƣa
tối ƣu; đồng thời gấp 3,5 lần so với nghiên cứu của Homthong và cs.,
(2016).
3.2. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ
PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG
3.2.1. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng
Meloidogyne sp. gây bệnh cây Hồ tiêu
Chế phẩm dạng dịch thể của chủng P1 đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 20oC – 30oC và đƣợc kiểm tra mật độ sau các khoảng thời gian bảo quản: 10 ngày, 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng.
3.2.2. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne
sp. hại Hồ tiêu trong điều kiện nhà lƣới của chế phẩm sinh học
Tại các thời điểm kiểm tra sau xử lý, mật độ tuyến trùng
trong các chậu đối chứng có tăng thêm từ 4,7% đến 9,9%. Trong các
chậu thí nghiệm mật độ tuyến trùng còn sống giảm xuống còn 56-
82% do tác động của chế phẩm. Hiệu lực diệt tuyến trùng dao động
trong khoảng 20-53%. Xét về hiệu lực diệt tuyến trùng ở các mức
pha loãng 50 và 100 lần gần giống nhau, còn ở mức 150 và 200 lần
hiệu lực giảm hẳn, nên chọn mức pha loãng chế phẩm 100 lần.
3.2.3. Đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng
chế phẩm
Chế phẩm sinh học có tác dụng điều hòa tăng năng suất tới
trên 20%. Các vƣờn chớm bị bệnh vàng lá, năng suất cả bên đối
chứng và mô hình đều giảm nhiều so với vƣờn không bị vàng lá,
nhƣng do vƣờn mô hình có sử dụng chế phẩm nên hạn chế đƣợc
19
tuyến trùng và nấm gây bệnh do đó năng suất tăng hơn nhiều so với
đối chứng, tới trên 30%.
3.3. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG P. lilacinus
P1
Khả năng diệt tuyến trùng cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp
enzym hoặc các chất có hoạt tính sinh học ở chủng P. lilacinus tự
nhiên là có hạn. Việc tăng cƣờng khả năng diệt tuyến trùng hay sinh
enzym có thể thực hiện thông qua việc cải biến di truyền. Trong
nghiên cứu này, hệ thống chuyển gen vào chủng P1 bƣớc đầu đƣợc
xây dựng nhằm tạo ra một công cụ hữu hiệu hơn để thực hiện việc
cải biến di truyền.
Chủng P1 kháng với cả 4 loại kháng sinh là phleomycin;
nourseothricin; hygromycin; geneticin (G418) với nồng độ kháng
sinh từ 600 – 1000 µg/ml. Tuy nhiên, đối với 5-FOA chủng P1
không sinh trƣởng đƣợc trên tất cả các nồng độ thử nghiệm. Điều đó
đƣợc giải thích rằng gen PyrG mã hóa cho enzym decarboxylase
orotidine-5’-monophotphate (OMP) xúc tác cho quá trình tổng hợp
pyrimidin tác dụng với 5-FOA (khi có mặt 5 – FOA) không độc
thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil dẫn tới tế bào chết.
3.3.2. Tạo chủng nấm P. lilacinus đột biến kháng 5-FOA và
trợ dƣỡng uracil/uridine
3.3.2.1. Gây đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uracil/uridine
bằng phương pháp chiếu UV
Từ kết quả đánh giá khả năng kháng kháng sinh và 5-FOA
của chủng P1, môi trƣờng chứa 5-FOA, uracil, uridine đƣợc sử dụng
để chọn lọc thu nhận các thể đột biến kháng 5-FOA và trợ dƣỡng
uracil và uridine. Phƣơng pháp chiếu UV đã đƣợc áp dụng để tạo ra
20
một số đột biến trong phòng thí nghiệm. Tác nhân gây đột biến là
UV đƣợc tiến hành trên máy cố định gen Vilber Lourmat. Những
khuẩn lạc sống sót đƣợc chọn lọc qua 5 thế hệ cấy chuyền liên tiếp
trên môi trƣờng CDA + 5- FOA + uracil + uridine.
3.3.2.2. Xác nhận thể đột biến 424 bằng giải trình tự vùng ORF
gen PyrG
Từ những vị trí đột biến nucleotid, sự sai khác của 3
aminoaxit trong vùng ORF gen pyrG đƣợc phát hiện, kết quả đƣợc
trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino axit
Vị trí Nucleotide Amino axit biến đổi
205 (WT) T C L S (Leucine – Serine)
251 (WT) T G S R (Serine – Arginin)
795 (WT) T A Thêm R (Arginin)
3.3.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào thể đột
biến 424 pyrG(-)
Cải biến di truyền ở chủng P1 bằng phƣơng pháp chuyển gen
ATMT sử dụng marker trợ dƣỡng là một bƣớc tiến vƣợt trội đồng
thời thí nghiệm đã chuyển gen thành công gen DsRed vào thể đột
biến 424pyrG(-) chủng P1 với các thông số tối ƣu là nồng độ uridine
bổ sung cho môi trƣờng IM đồng nuôi cấy là 0,005%; nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml; nhiệt độ đồng nuôi cấy là 22oC; nồng độ AS cho giai đoạn cảm ứng là 200 µM AS; thời gian đồng
nuôi cấy là 60 giờ.
3.3.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen
Kết quả cho thấy gen huỳnh quang DsRed đã biểu hiện thành
công vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 và điều này sẽ mở ra
21
triển vọng mới cho nghiên cứu về cơ chế diệt tuyến trùng, biểu hiện
protein, enzym tái tổ hợp cũng nhƣ sản xuất các chất có hoạt tính
sinh học của chi nấm tiềm năng này.
3.3.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease
và khả năng diệt tuyến trùng cao
Hình 3.23. Tỷ lệ chết của tuyến trùng A. Hình ảnh tuyến trùng
sống B. Hình ảnh tuyến trùng chết C. Đồ thị tỷ lệ chết của tuyến
trùng. (Ghi chú: hình A, B đƣợc chụp trên KHV Olympus CX 41 độ
phóng đại 150x)
Kết quả thử nghiệm cho thấy trong vòng 48 giờ, dịch nuôi
cấy PE858 cho tỷ lệ tuyến trùng Meloidogyne sp. bị chết lên đến
72%, trong đó chủng tự nhiên (P1) cho tỷ lệ chết 11%. Điều đó
chứng tỏ hoạt tính chitinase cao ảnh hƣởng đáng kể đến tốc độ diệt
tuyến trùng.
Việc cải biến di truyền tạo các thể đột biến cho khả năng diệt
tuyến trùng cao ở chủng P1 mở ra hƣớng nghiên cứu mới nhằm điều
tra vai trò, chức năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến
trùng cũng nhƣ các gen tham gia vào quá trình trao đổi chất của
chủng nấm sợi tiềm năng này.
22
KẾT LUẬN
1. Đã tuyển chọn đƣợc ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến
trùng
- Từ 15 mẫu đất bản địa khu vực trồng Hồ tiêu tỉnh ĐăkLăk đã
phân lập đƣợc ba chủng nấm sợi và đƣợc định danh là Paecilomyces
lilacinus P1; Paecilomyces variotii NV01; Plerotus giganteus NV20.
- Hoạt tính protease của chủng P1 và NV01 tƣơng ứng đạt 91,2 và
82,3 U/ml
- Hoạt tính chitinase của chủng P1 và NV01 tƣơng ứng đạt 61,7
và 37,7 U/ml
- Sử dụng phƣơng án đáp ứng bề mặt – phƣơng pháp cấu trúc có
tâm, hoạt tính chitinase của chủng P1 cao hơn 17% so với hoạt tính
chitinase khi chƣa tối ƣu.
2. Tạo chế phẩm sinh học từ chủng P1 và thử nghiệm quy mô
nhà lƣới, quy mô đồng ruộng 3 ha/mô hình tại tỉnh Đăk Lăk
- Đã xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng dạng dịch thể, chế phẩm ổn định với mật độ 107 CFU/ml sau 6 tháng. - Chế phẩm sinh học từ chủng nấm sợi trên đƣợc thử nghiệm trên
cây Hồ tiêu 3,5 tháng tuổi quy mô trong nhà lƣới có hiệu lực diệt
52,48% sau 30 ngày.
- Năng suất của mô hình trình diễn 3 ha triển khai tại Đăk Lăk
sau khi sử dụng chế phẩm tăng 20,9% so với đối chứng ở cấp độ cây
khỏe mạnh; tăng 48,7% khi sử dụng chế phẩm ở cấp độ cây bị bệnh
nặng nhất.
3. Tạo chủng đột biến PE858 có hoạt lực diệt tuyến trùng cao
23
- Lần đầu tiên thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumerfaciens dựa trên cơ chế trợ dƣỡng
uracil/uridine ở nấm Paecilomyces lilacinus với hiệu quả chuyển gen đạt 2860 ± 26 thể chuyển gen/106 bào tử. - Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với
chủng tự nhiên trong vòng 48 giờ.
KIẾN NGHỊ
1. Cần tiếp tục những nghiên cứu về cải biến di truyền chủng
Paecilomyces lilacinus P1 nhằm điều tra vai trò chức năng của một
số gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng.
2. Triển khai thêm mô hình ứng dụng trên một số địa bàn trong tỉnh
và vùng Tây Nguyên, thu thập số liệu bổ sung cho quy trình sử dụng
chế phẩm sinh học dạng dịch thể trong quản lý tổng hợp bệnh tuyến
trùng và nấm hại rễ cây Hồ tiêu nhằm phát triển bền vững ở Tây
Nguyên.
24
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA
TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Chu Thanh Bình, Bùi Thị Việt Hà, Hồ Tuyên, Nguyễn Phƣơng
Nhuệ (2017), “Đặc điểm sinh học của chủng Paecilomyces
variotii NV01 phân lập từ đất trồng hồ tiêu khu vực ĐăkLăk”,
Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,
33 (1S), 42-48.
2. Chu Thanh Bình, Nguyễn Phƣơng Nhuệ, Hồ Tuyên, Bùi Thị
Việt Hà (2019), “Tinh sạch và xác định hoạt tính chitinase từ
nấm diệt tuyến trùng Paecilomyces sp. P1”, Tạp chí Khoa học
ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 35 (1), 90-96.
3. Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Bui Thi Viet Ha (2019),
“Optimization of medium composition for enhancing chitinase
production of Paecilomyces sp. P1 strain by using response
surface methodology”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 17 (2), 301-
308.
4. Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Tran Bao Tram, Bui Thi Viet
Ha (2019), “Determination of protease and chitinase activities
from Paecilomyces variotii NV01 isolated from Dak Lak pepper
soil”, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering,
61 (4), 33-38.
5. Chu Thanh Binh, Bui Thi Viet Ha, Van-Tuan Tran (2019), “A new and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation
system based on the uridine/uracil auxotrophic mutant in the
nematophagous fungus Paecilomyces lilacinus”, Journal of
Microbiological Method, Đã nộp bản thảo.
