TNU Journal of Science and Technology
230(05): 123 - 131
http://jst.tnu.edu.vn 123 Email: jst@tnu.edu.vn
IDENTIFICATION OF SOYBEAN SAMPLES BASED ON
MORPHOLOGICAL AND DNA BARCODING
Tran Trong Dai1, Tran Dinh Ha1, La Thi Thao2, Tran Anh Tuan2, La Van Hien1*
1TNU – University of Agriculture and Forestry, 2Vietnam National University of Agriculture
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
12/8/2024
The current soybean is faces the risk of degeneration and loss of
genetic resources. Soybean research mainly focuses on assessing
genetic diversity based on external morphological characteristics.
Genetic identification is one of the tools for soybean improvement.
This study aims to evaluate the morphological differences and genetic
identification of four soybean lines/varieties, including DT84 (control),
black soybean (135544), Cuc Vo Nhai, and DT2008DB, to provide a
scientific basis for the selection and development of new soybean
varieties. The seeds color of soybean cultivars is dark yellow (cuc Vo
Nhai), black (135544 and DT2008ĐB), and light yellow (DT84). In
addition, the matK gene and ITS2 sequences, were amplified,
sequenced, and identified. Comparison of the matK gene and ITS2
sequences of four soybean lines/cultivars with sequences in the NCBI
gene bank showed that the matK gene sequence had a similarity level
of 98.25-100.00% with Glycine max and 91.7% with Glycine soja. The
ITS2 gene sequence had a 98.88-99.45% similarity with Glycine max
species. These results provide a scientific basis for identifying and
classifying soybean lines/cultivars to conserve this gene source.
Revised:
21/01/2025
Published:
22/01/2025
KEYWORDS
Black soybean
Glycine max
Soybean cultivars
ITS1 and matK
DT84
NHẬN DẠNG CÁC MẪU ĐẬU TƯƠNG DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ MÃ VẠCH ADN
Trần Trọng Đại1, Trần Đình Hà1, Lã Thị Thảo2, Trần Anh Tuấn2, Lã Văn Hiền1*
1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên, 2Học viện Nông nghiệp Việt Nam
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
12/8/2024
Hiện nay, cây đậu tương đang phải đối mặt với nguy cơ thoái hóa giống
và mất dần nguồn gene. Hình thái bên ngoài là yếu tố chính được sử
dụng trong các nghiên cứu về cây đậu tương để đánh giá đa dạng di
truyền. Nhận dạng di truyền đang được sử dụng phổ biến như một công
cụ chính để cải thiện giống đậu tương. Mục đích của nghiên cứu này là
đánh giá sự khác biệt về hình thái và nhận dạng di truyền của bốn
dòng/giống đậu tương, bao gồm DT84 (đối chứng), đậu tương đen
(135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB, nhằm cung cấp cơ sở khoa học
cho việc chọn lọc và phát triển giống đậu tương mới. Hạt của các giống
đậu tương có màu vàng đậm (cúc Võ Nhai), đen (135544 và
DT2008DB), vàng nhạt (DT84). Bên cạnh đó, hai vùng gene matK và
ITS2 được khuếch đại, giải trình tự và xác định loài. So sánh trình tự gen
matK và ITS2 của bốn dòng/giống đậu tương với các trình tự trên ngân
hàng gene NCBI cho thấy trình tự gene matK có mức độ tương đồng
98,25-100,00% với loài Glycine max, 91,7% với loài Glycine soja. Trình
tự gene ITS2 có mức tương đồng 98,88-99,45% với loài Glycine max.
Những kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để nhận dạng và phân loại
dòng/giống đậu tương nhằm bảo tồn nguồn gene này.
Ngày hoàn thiện:
21/01/2025
Ngày đăng:
22/01/2025
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10925
* Corresponding author. Email: lavanhien@tuaf.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 123 - 131
http://jst.tnu.edu.vn 124 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Đậu tương (Glycine max) là cây trồng họ đậu Fabaceae, loài bản địa có nguồn gốc từ Đông Á.
Trong hệ thống phân loại chi đậu tương dại (Glycine Willd) bao gồm hai phân chi Glycine và
Soja. Phân chi Soja (Moench) F.J. Herm bao gồm cây đậu tương chọn tạo Glycine max (L.)
Merr., và cây đậu dại Glycine soja Sieb. & Zucc. Glycine soja là tổ tiên hoang dại của Glycine
max, phân bố chủ yếu tại khu vực Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan [1]. Phân chi
Glycine bao gồm ít nhất 25 loài cây dại, tiêu biểu như Glycine canescens F.J.Hem. và Glycine
tomentella Hayata. Đậu tương được thuần hóa trong thời gian lâu dài, dẫn đến sự phát sinh đa
dạng và phức tạp. Bởi vậy, các dấu vết về sự liên hệ giữa các loài đậu tương hiện đại và loài
hoang có thể không còn.
Việc nhận diện và phân loại đậu tương ở cấp độ loài sử dụng kết hợp dựa trên đặc điểm hình
thái và định danh phân tử bằng mã vạch DNA (DNA barcode). Mã vạch DNA sử dụng hỗ trợ
định danh loài dựa trên một vùng DNA đặc hiệu [2], [3]. Mã vạch DNA đã được chứng minh là
một phương pháp hữu hiệu để định danh loài mới [2]. Thông qua so sánh trình tự nucleotide của
đoạn DNA được khuếch đại bằng chỉ thị DNA từ các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên ngân
hàng gene (GenBank), sự khác biệt về trình tự nucleotide trên đoạn DNA đặc hiệu sẽ là cơ sở để
phân biệt các loài với nhau. Hầu hết các mã vạch DNA được sử dụng trong định danh thực vật
nằm trong hệ gene lục lạp điển hình là các trình tự mã hóa (như rbcL và matK), hoặc được lấy từ
các vùng liên gene (như trnH-psbA) [4], một số locus DNA nhân được sử dụng làm mã vạch
DNA (DNA ribosome (ITS)) [5], [6].
Hiện nay, các nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu tập trung đánh giá đa dạng di truyền của các
giống đậu tương [7], [8], mà chưa có nhiều nghiên cứu nhận dạng loài đậu tương. Tập đoàn giống
đậu tương của Việt Nam bao gồm nhiều giống khác nhau thể hiện sự đa dạng về kiểu hình và
kiểu gene. Thêm vào đó, sự phân tán giống do tập quán canh tác, cùng với quá trình lai tạo phát
triển các giống đậu tương mới góp phần tạo nên sự đa dạng của các giống đậu tương, tuy nhiên
cũng là nguyên nhân khiến các giống đậu tương bản địa dần biến mất. Từ thực tế trên cho thấy
quá trình phân loại và bảo tồn nguồn gene bản địa còn gặp nhiều khó khăn. Do vậy, việc nhận
dạng các giống đậu tương bằng các đặc điểm hình thái và kiểu gene là rất cần thiết và là nguồn
thông tin cơ sở để phân loại và lưu giữ nguồn gene hiệu quả. Nghiên cứu này trình bày kết quả
nhận dạng loài đậu tương dựa trên đặc điểm hình thái và sự hỗ trợ của mã vạch DNA từ bốn mẫu
đậu tương DT84, đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, DT2008ĐB.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Các mẫu dòng/giống đậu tương thu thập tại Thái Nguyên và cung cấp bởi Trung tâm tài nguyên
Thực vật [9]. Bốn dòng/giống đậu tương bao gồm: DT84, cúc Võ Nhai, đậu tương đen (135544), và
DT2008ĐB. Các mẫu giống được trồng tại vườn thực nghiệm Khoa Nông học
(21°34′46″B 105°47′18″Đ) ở cùng một điều kiện canh tác, theo QCVN 01- 58:2011/BNNPTNT
“Về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống đậu tương” [10].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân loại hình thái
Để phân loại các dòng/giống đậu tương nghiên cứu, các bộ phận gồm có hạt, quả, hoa, lá, rễ,
và cây được mô tả dựa trên quy trình phân loại hình thái cây đậu tương của Ngô Thế Dân [11].
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
Lá đậu tương được thu thập ở giai đoạn cây non (6 lá) và được bảo quản ở -80oC. Nghiền lá
tươi trong nitrogen lỏng thành bột mịn. Sử dụng 50 mg bột để tách chiết DNA tổng số bằng
phương pháp CTAB [12]. DNA tổng số được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp điện di trong gel
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 123 - 131
http://jst.tnu.edu.vn 125 Email: jst@tnu.edu.vn
agarose 1%, bổ sung thuốc nhuộm RedSafe. DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng
máy NanoDrop One (Thermo Scientific).
2.2.3. Định danh loài bằng mã vạch DNA
Chỉ thị khuếch đại đoạn DNA thuộc vùng ITS-rDNA (internal transcribed spacer-ribosome
DNA) và gene lục lạp matK (maturase K) nhằm xác định loài cho các giống đậu tương thu thập.
Trình tự mRNA của vùng ITS2 (U60551.1) và gene matK (NC_007942.1) từ ngân hàng gene
NCBI [13] Các cặp mồi đặc hiệu ITS2 và matK được thiết kế bằng phần mềm primer3 Plus [14]
và trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Thông tin mồi sử dụng để nhận diện loài
Tên mồi
Trình tự nucleotide (5’-3’)
Kích thước dự kiến (bp)
ITS2-F
ITS2-R
AATTGCAGAATCCCGTGAAC
ACCATTTTATCACGGCGAAG
216
matK-F
matK-R
TATTCGGCCCAATCTTTCAG
CGCAAAAACCGGTCAATAAT
213
Phản ứng PCR thực hiện trên máy Gradient Analytik Jena-Đức với tổng thể tích 15 µL (gồm 5
µL DiH2O; 7 µL đệm Dream Taq Mastermix 2X; 1 µL mồi xuôi và 1 µL mồi ngược 10 pmol/µL;
1 µL DNA 50 ng/µL và chu kỳ nhiệt như sau: 94oC trong 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ bao
gồm các bước: 94oC trong 30 giây, 52-53oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, giữ nhiệt độ ở 72oC
trong 5 phút. Sản phẩm PCR đạt yêu cầu được tinh sạch bằng bộ kit của Thermo Scientific-Mỹ
và giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Công ty 1st BASE
Singapore). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Sequence Scanner v1.0, BioEdit
và MEGA 11, công cụ BLAST trên NCBI.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Sự đa dạng về hình thái của bốn dòng/giống đậu tương
Bốn dòng/giống đậu tương DT84, đậu tương đen (DTD, 135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB
có sự khác biệt rõ ràng về hình thái, cũng như đặc điểm sinh trưởng (Hình 1 và Bảng 2).
3.1.1. Giống DT84
- Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ. Trên cả rễ chính và rễ phụ đều có nhiều nốt sần.
- Thân: thân thảo, có hình tròn, đặc, có màu xanh đậm, cứng cây. Thân có trung bình 7 – 8
lóng, mức độ phân cành thấp 2-3 cành/cây, cao trung bình 50 – 60 cm. Sinh trưởng hữu hạn.
- Lá: đơn nguyên, mọc cách. Lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Cuống mảnh. Lá có hình
bầu dục, hai mặt có lông (chiều dài biến động từ 8,0 – 10,0 cm và chiều rộng biến động từ 7,0 –
8,2 cm).
- Hoa: to, loại cánh bướm, có màu trắng. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân thành
từng chùm có từ 3-5 hoa. Hoa thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính, nhị và nhụy cùng tồn tại trên
một hoa. Mỗi hoa có 5 lá đài, 5 cánh hóa, 10 nhị và một nhụy.
- Quả: thuộc loại quả nang, hơi dẹp, dài 2 – 7 cm, có 1 – 3 ô, mang 1 – 3 hạt. Quả mọc ra từ
đốt cây, từ đốt thứ 5 – 6 trở lên tỷ lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều. Tỷ lệ quả chắc đạt 98%.
- Hạt: hạt có hình tròn, màu vàng. Rốn hạt có màu đen. Khối lượng 100 hạt là 18,3 g.
3.1.2. Dòng đậu tương đen (135544)
- Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ chính phát sinh nhiều rễ phụ. Các rễ phụ cấp 2 và cấp 3
tập trung chủ yếu tại tầng đất 9 – 10 cm.
- Thân: thân thảo, có hình tròn, đặc, có màu xanh hoặc tím, có lông thô ráp rặm. Thân khi còn
non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt. Thân có trung bình 8 – 10
lóng, ít phân cành, cao trung bình 40 – 60 cm.
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 123 - 131
http://jst.tnu.edu.vn 126 Email: jst@tnu.edu.vn
Hình 1. Hình thái bốn giống đậu tương.
(a)
cây trưởng thành; (b) lá cây; (c) hoa; (d)
cây đậu tương thu hoạch; (e) hạt đậu tương
khô. DTD: đậu tương đen.
Bảng 2. Đặc điểm sinh trưởng của 4 giống đậu tương
Chú thích: TGST: thời gian sinh trưởng
Giống
Đặc điểm
Hình ảnh
DT84
- TGST: 95 ngày
- Chiều cao cây: 75 cm
- Số cành quả/cây: 6,5
cành/cây
- Tổng số quả/cây: 66 quả
- Khối lượng 100 hạt: 16,5 g
DTD
(135544)
- TGST: 105 ngày
- Chiều cao cây: 51 cm
- Số cành quả/cây: 4,5
cành/cây
- Tổng số quả/cây: 41 quả
- Khối lượng 100 hạt: 7,5 g
Cúc Võ
Nhai
- TGST: 90 ngày
- Chiều cao cây: 50 cm
- Số cành quả/cây: 2,6
cành/cây
- Tổng số quả/cây: 39 quả
- Khối lượng 100 hạt: 8,4 g
DT2008ĐB
- TGST: 110 ngày
- Chiều cao cây: 80 cm
- Số cành quả/cây: 4,0
cành/cây
- Tổng số quả/cây: 80 quả
- Khối lượng 100 hạt: 20,8 g
- Lá: lá đơn, mọc cách. Lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Cuống mảnh, có lông giống
thân. Lá có hình bầu dục, xoan, hình mác; chót phiến nhọn, 2 mặt có lông rặm, kích thước: chiều
dài biến động từ 7 - 9,0 cm và chiều rộng biến động từ 6,3 – 8,1 cm.
- Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm, màu tím. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân.
Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 – 10 hoa và thường có 3 – 5 hoa. Hoa lưỡng tính
trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 8-10 nhị và 1 nhụy.
- Quả: Thuộc loại quả nang, hơi dẹp, dài 2 – 5 cm, chia 1 – 3 ô, mang 1 – 3 hạt. Mỗi quả trung
bình có từ 2 – 3 hạt. Số lượng quả dao động 35 – 42 quả/cây.
- Hạt: hạt có hình tròn dẹp; màu đen. Rốn hạt màu đen. Khối lượng 100 hạt 7,5 g.
3.1.3. Giống cúc Võ Nhai
- Rễ: có rễ chính và rễ phụ. Trên rễ chính có nhiều nốt sần.
- Thân: thân thảo, có hình tròn, có màu xanh nhạt. Trên thân thường có 14 – 15 lóng, các lóng
ở gần gốc thường ngắn, các lóng ở bên trên thường dài, ít phân cành, cao trung bình 40 – 55 cm.
- Lá: đơn nguyên, lá mầm mọc đối xứng. Các lá đơn sinh trưởng đối xứng. Lá kép có 3 lá
chét. Cuống mảnh, kích cỡ: (1,0 – 2,0) x 0,1 cm. Lá có hình bầu dục nhọn 2 mặt có lông (chiều
dài biến động từ 10 - 11,0 cm và chiều rộng biến động từ 7,7 – 8,6 cm).
- Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm, màu tím. Hoa mọc theo từng chùm, mỗi chùm bao gồm 3 –
5 hoa. Hoa đồng chu lưỡng tính, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy.
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 123 - 131
http://jst.tnu.edu.vn 127 Email: jst@tnu.edu.vn
- Quả: thuộc loại quả nang tròn, dài khoảng 5 cm. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Hạt có
màu sắc vàng sẫm. Rốn hạt màu hồng nhạt.
- Hạt: hạt có hình tròn, màu vàng đậm. Rốn hạt có màu vàng nhạt, phớt hồng.
3.1.4. Giống DT2008ĐB
- Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Rễ chính dài khoảng 20- 30 cm.
- Thân: thân thảo, hình tròn, có màu xanh đậm. Mức độ phân cành cao, cao trung bình 80 cm.
- Lá: đơn nguyên, lá mầm mọc đối xứng. Lá đơn mọc đối xứng. Lá có hình bầu dục nhọn 2
mặt có lông, (chiều dài 10 - 11,0 cm và chiều rộng từ 7,7 – 8,6 cm. Khối lượng 100 hạt 8,4 g.
- Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm. Hoa có màu tím nhạt, sinh trưởng tại nách lá, đầu cành và
đầu thân. Hoa mọc từng chùm, mỗi chùm từ 3 – 5 hoa. Hoa là loại hoa đồng chu lưỡng tính trong
hoa tồn tại cả nhị và nhụy, mỗi hoa có 5 lá đài, 5 cánh hoa, 10 nhị và 1 nhụy.
- Quả: Thuộc loại quả nang tròn, dài khoảng 5 cm. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Quả có
màu sắc biến động từ vàng đậm đến đen.
- Hạt: hạt có hình tròn, bầu dục, màu đen. Rốn hạt có màu đen. Khối lượng 100 hạt 20,8 g.
3.2. Xác định mối quan hệ di truyền và định danh loài các giống đậu tương
3.2.1. Kết quả khuếch đại gene
Hàm lượng và giá trị OD của DNA tổng số tách chiết từ bốn mẫu lá đậu tương được xác định
bằng máy NanoDrop One. Kết quả cho thấy, DNA tách chiết có độ tinh sạch OD260/OD280 nằm
trong khoảng 2,10-2,14, hàm lượng DNA nằm trong khoảng 708,2-1530,8 ng/µL (dữ liệu không
trình bày). Mẫu DNA tiếp tục được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1% (Hình 2.a) và pha loãng
đến nồng độ 50 ng/µL để sử dụng trong phản ứng PCR. Kết quả PCR cho thấy trình tự gene
matK và vùng ITS2 được khuếch đại với kích thước dự kiến 213 bp và 216 bp khi so với thang
chuẩn DNA (Hình 2.b và 2.c).
Hình 2. Kết quả khuếch đại gene chỉ thị matK và ITS2 ở bốn dòng/giống đậu tương. (a) DNA tổng số điện
di trên gel agarose 1%. (b) và (c) gene chỉ thị matK và ITS2 hiển thị trên gel agarose 2%. (d), (e), và (f)
phân tích Blast gene ITS2 ở ba giống đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB