NUÔI CẤY MÔ – T
Ế BÀO THỰC VẬT BẰNG
TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT
KHÁI NIỆM
Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho
phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật
hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trư
ờng
nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế
bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống
nghiệm.
CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI
CẤY MÔ- TẾ BÀO
TÍNH TOÀN NĂNG:
Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây
hòa chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp,
do trong tế bào có chứa bộ AND(NST) hoàn
chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1
chu kì sống hoàn chỉnh.
AND mARN Protêin tính trạng
Tùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì
sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp
hoạt động; các gen không cùng hoạt động nh
ư
nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể
(do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).
SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PHẢN PHÂN
HÓA CỦA TẾ BÀO:
Phân hóa: 1 t
ế bào 1khối tế bào(phân hóa) mô
cơ quan hệ cơ quan.
Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa
thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn
có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh
ban đầu ki gặp điều kiện thuận lợi.
Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ
sở là đặc điểm di truyền nhưng sự thay đổi
môi trường cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến
các đặc tính đó.
CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH CÔNG
TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ
BÀO THỰC VẬT:
Đảm bảo đi
ều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm
phải chuyên hóa cao.
Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trư
ờng
đúng cách.
Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và
sau khi cấy.
CÁC BƯỚC TRONG KĨ THẬY NUÔI CẤY
MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT
Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là bộ
phận nuôi cấy thích hợp nhất khử trùng cấy
trong môi trường khởi động để tái sinh
Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được
chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ
sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các
chồi cho vào môi trường tạo rể (bố sung
Auxin) mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đ
ủ tiêu
chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được
chuyển sang môi trường tự nhiên.
CÁC HÌNH THỨC NUÔI CẤY MÔ
Nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô bằng tế bào trần
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời:
VD: củ cà rốt cắt lát tách mảnh mạch rây xử
lí+ nuôi cấy mô phôi phôi nảy mầm cây non
trong ống nghiệm cây trưởng thành
Nuôi cấy từ mô hay cơ quan:
VD: từ 1 mô lá tách tế bào nuôi cấy trên đĩa
Pêtri điều kiện thuận lợi sẽ hình thành những
cây non trồng chậu phát triển cây trưởng
thành.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Từ 1 mô phân sinh của đỉnh sinh trưởng của
rễ hoặc thân nuôi cấy trong môi trường dinh
dưỡng sẽ tạo nên cây con
Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn( Auxin rất quan
trọng):
Nuôi cấy bao phấn có hạt phấn chín môi
trường thuận lợi bao phấn chín sẽ phân hóa
bằng cách: nhân sinh sản sẽ tiêu biến nhân
sinh dưỡng sẽ nguyên phân tạo mô sẹo nuôi
dưỡng cây đơn bội(n) xử lí cônxixin cây
trưởng thành(đơn bội kép).
NUÔI CẤY MÔ BẰNG TẾ BÀO TRẦN
Khái niệm tế bào trần:
Là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lí
enzim. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định
hướng( vì không còn chịu sự tương quan
trong hệ thống thực vật).
SỰ CÔ LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
Sự cô lập:
Trước hết phải xử lí vật liệu khởi đầu( lá, mô
sẹo, dịch treo tế bào…) với enzim phân hủy
vách( Xenlulaza, HemiXenlulaza,
Pectolyaza…).
Ví dụ: phương pháp tạo tế bào trần từ lá:
Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% rửa lại lá 3
lần bằng nước cất tiệt trùng tách lớp biểu bì
dưới của lá+ gây co nguyên sinh 1h bằng
Mannitol 10% enzim thu được tế bào trần.
Sức trương tế bào bình thường thì được cân
bằng với sức ép cơ học của vách vách mất,
để tế bào không bị vỡ thì cho vào những chất
gây co nguyên sinh (CaCl2,KCl,Mannitol…)
hòa tan trong Enzim khi xử lí
SỰ NUÔI CẤY
Thành phần của môi trư
ờng nuôi cấy lỏng hay
đặc tùy thuộc vào vaät liệu thực vật.Môi
trường này có thêm Auxin và Xitokinin đ
sự tái tạo vách và các lần phân cia đầu tiên
Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dư
ỡng: axit amin,
polyamin, Hydrolysat Cazein, nư
ớc dừa, mạch
nha…
Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp
suát thẩm thấu….
Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường
phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin
thích hợp, ánh sáng yếu.
Sau đó c
ần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách
pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng
trưởng tế bào.
Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển
chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở
nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn.
Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin,
tăng nồng độ Auxin.
Thông thường, tế bào trần cần 1-2 ngày cho
sự hình thành vách, 2-7 ngày cho các lần
nhân đôi đầu tiên, 3-4 tuần cho sự tăng
trưởng mô sẹo, sau đó 1-2 tháng để có phôi
hình cầu, 1tháng nữa để có cây nảy mầm.
ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN
Tế bào trần có khả năng tái tạo vách và cho
phôi thể hệ.
Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp
dẫn đ
ể theo dõi quá trình sinh phôi thể hệ từ 1
tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp
các sợi Xenluloz để xác định hư
ớng kéo dài tế
bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia.
Thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào:
tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa
tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực
vật…