Ch ng 7ươ . NUÔI C Y T BÀO VÀ CH N DÒNG T BÀOẤ Ế Ọ Ế
7.1. Nuôi c y t bào đ nấ ế ơ
B n thân m i t bào th c v t là m t đ n v đ c l p, nó ch a đ ng t t c nh ng thông tinả ỗ ế ự ậ ộ ơ ị ộ ậ ứ ự ấ ả ữ
di truy n đ c tr ng c a c th t đó nó sinh ra. Cho nên m i t bào có th xây d ng l i toàn bề ặ ư ủ ơ ể ừ ỗ ế ể ự ạ ộ
c th m i nh tính toàn th . Th c vât bâc cao la môt nguôn cung câp cac h p chât hoa hoc vaơ ể ớ ờ ế ư ơ
d c liêu rât quan trong. Tuy nhiên trong nh ng năm gân đây san l ng cac th c vât đo rât khoươ ư ươ ư
đam bao m c ôn đ nh do hâu qua cua môt sô yêu tô nh : ơ ư ị ư
- Điêu kiên t nhiên không thuân l i. ư ơ
- Chi phi lao đông ngay cang tăng.
- Kho khăn ky thuât va kinh tê trong trông trot.
Ph ng phap nuôi cây tê bao d ch huy n phù (d ch l ng) c a th c vât co kha năng gopươ ị ề ị ỏ ủ ư
phân giai quyêt nh ng kho khăn trên.Nh ng t bào tr i qua quá trình nuôi c y và sinh tr ng ư ữ ế ả ấ ưở
trong d ch huy n phù g i là dòng t bào. Dòng t bào có nh ng đ c đi m sau:ị ề ọ ế ế ữ ặ ể
- Kh năng tách t bào caoả ế
- Phát sinh hình thái đ ng nh tồ ấ
- nhân to và t bào ch t đ m đ cế ấ ậ ặ
- Nhi u h t tinh b tề ạ ộ
- Có nh ng d n li u t o c quanữ ẫ ệ ạ ơ
- Có kh năng nhân đôi trong 24-72 giả ờ
- M t tính toàn thấ ế
- Tăng m c đa b i thứ ộ ể
D ch huy n phù đ c t o ra do s nuôi c y m t m nh mô s o không có kh năng bi tị ề ượ ạ ự ấ ộ ả ẹ ả ệ
hóa, trong môi tr ng l ng và đ c chuy n đ ng trong su t th i gian nuôi c y.Có th nuôi c yườ ỏ ượ ể ộ ố ờ ấ ể ấ
m t m nh mô bi t hóa vào trong môi tr ng m c dù th i gian nuôi c y s kéo dài nh ng nh ngộ ả ệ ườ ặ ờ ấ ẽ ư ữ
t bào nuôi c y s tr ng thái t do. Tuy nhiên không có d ch huy n phù nào ch có nh ng tế ấ ẽ ở ạ ự ị ề ỉ ữ ế
bào đ n. Các t bào liên k t v i kích th c khác nhau, các t bào đang phân chia và nh ng t bàoơ ế ế ớ ướ ế ữ ế
ch t. Danh t x p (friability) dùng đ ch nh ng t bào tách r i nhau sau khi phân chia.ế ừ ố ể ỉ ữ ế ờ
M c đ tách r i t bào ph thu c kh năng t o nhi u t bào x p và đ c đi u khi n b iứ ộ ờ ế ụ ộ ả ạ ề ế ố ượ ề ể ở
môi tr ng. Tăng t l Cytokinin/ Auxin s s n xu t nhi u t bào x p.ườ ỉ ệ ẽ ả ấ ề ế ố
C n có m t l ng mô s o ban đ u thích h p là 2-3 g/cmầ ộ ượ ẹ ầ ợ 3. Khi mô s o đ c c y vào d chẹ ượ ấ ị
l ng ta có ngay giai đo n Lag-phase. Đây là giai đo n đ u tiên cho đ n khi có tín hi u phân chiaỏ ạ ạ ầ ế ệ
đ u tiên, sau đó là giai đo n Exponential-phase và Linear-phase; là giai đo n t bào phân chia, tầ ạ ạ ế ế
bào tăng s l ng và tăng qu n th nhanh. Sau cùng là giai đo n Stationary-phase là giai đo n tố ượ ầ ể ạ ạ ế
bào không phân chia, l ng t bào sinh ra và ch t đi b ng nhau. Sau cùng là giai đo n suy vong.ượ ế ế ằ ạ
Nh ng tiên bô cua ky thuât nay trong nh ng năm gân đây đa đ c nhi u ư ư ươ ề công trình tông
kêt. Nuôi c y t bào th c v t trong đi u ki n ấ ế ự ậ ề ệ in vitro đ s n xu t các ch t t nhiên có m t sể ả ấ ấ ự ộ ố
u đi m sau:ư ể
- Các t bào th c v t có th đ c nuôi c y trong các đi u ki n nhân t o mà không phế ự ậ ể ượ ấ ề ệ ạ ụ
thu c vào th i ti t và đ a lý. Không c n ph i v n chuy n và b o qu n m t s l ng l n cácộ ờ ế ị ầ ả ậ ể ả ả ộ ố ượ ớ
nguyên li u thô.ệ
- Có th ki m soát ch t l ng và hi u su t c a s n ph m b ng cách lo i b các tr ng iể ể ấ ượ ệ ấ ủ ả ẩ ằ ạ ỏ ở ạ
trong quá trình s n xu t th c v t, nh là ch t l ng c a nguyên li u thô và s đ ng nh t gi aả ấ ự ậ ư ấ ượ ủ ệ ự ồ ấ ữ
các lô s n xu t.ả ấ
- M t s s n ph m trao đ i ch t có th đ c s n xu t t nuôi c y d ch huy n phù cóộ ố ả ẩ ổ ấ ể ượ ả ấ ừ ấ ị ề
ch t l ng cao h n trong cây hoàn ch nh.ấ ượ ơ ỉ
- M t s s n ph m trao đ i ch t có th đ c s n xu t t nuôi c y d ch huy n phù cóộ ố ả ẩ ổ ấ ể ượ ả ấ ừ ấ ị ề
ch t l ng cao h n trong cây hoàn ch nh.ấ ượ ơ ỉ
Thách th c l n nh t đ i v i công ngh t bào th c v t là s n đ nh cho phép nuôi c yứ ớ ấ ố ớ ệ ế ự ậ ự ổ ị ấ
t bào th c v t trên quy mô l n và đ t hi u su t t i đa cho s tích lũy và s n xu t các h p ch tế ự ậ ớ ạ ệ ấ ố ự ả ấ ợ ấ
t nhiên (hay còn g i là các s n ph m th c p). Đi u này có th th c hi n b ng cách ch n l cự ọ ả ẩ ứ ấ ề ể ự ệ ằ ọ ọ
các ki u gen thích h p và các dòng t bào có s n l ng cao, xây d ng các công th c môi tr ngể ợ ế ả ượ ự ứ ườ
dinh d ng h p lý đ nuôi c y t bào, thi t k và v n hành các h th ng nuôi c y t bàoưỡ ợ ể ấ ế ế ế ậ ệ ố ấ ế
(bioreactor) hi u qu . Chúng ta cũng có th s d ng kinh nghi m và ki n th c có đ c t nuôiệ ả ể ử ụ ệ ế ứ ượ ừ
c y vi sinh v t đ áp d ng cho nuôi c y t bào th c v t. Tuy nhiên, t bào th c v t và vi sinhấ ậ ể ụ ấ ế ự ậ ế ự ậ
v t có m t s đ c đi m khác nhau, vì th c n ph i c i bi n và đi u ch nh các đi u ki n nuôiậ ộ ố ặ ể ế ầ ả ả ế ề ỉ ề ệ
c y cũng nh c u hình c a n i ph n ng (bioreactor) đ tìm đ c các yêu c u đ c thù c a nuôiấ ư ấ ủ ồ ả ứ ể ượ ầ ặ ủ
c y t bào th c v t.ấ ế ự ậ
Hình 7. 1 Thi t b nuôi c y t bào đ nế ị ấ ế ơ
7.2 Ch n dòng t bàoọ ế
Ky thuât chon dong tê bao đa ra đ i rât s m trong nghiên c u vi sinh vât. Nh ng th c vât ơ ơ ư ư ơ ư
bâc cao, ky thuât nay m i đ c ng dung cach đây khoang h n 20 năm. Ng i ta co thê tiên hanh ơ ươ ư ơ ươ
x ly va chon loc tê bao th c vât ba m c đô chính:ư ư ơ ư
- Mô seo (callus).
- Tê bao đ n (single cell). ơ
- Tê bao trân (protoplast).
Muc đich chon loc in vitro co thê khai quat nh ng điêm sau : ơ ư
- Chon dong tê bao chông chiu cac điêu kiên bât l i cua ngoai canh, vi du: ch ng chiu nong, ơ ố
lanh, phen, măn, khô han...
- Chon dong tê bao khang cac đôc tô: đôc tô do nâm bênh tiêt ra, cac loai khang sinh.
- Chon dong tê bao san xuât d th a (over production) cac loai san phâm chu yêu la amino ư ư
acid.
- Chon cac đăc điêm ch th đê nghiên c u di truyên (genetic markers)... ỉ ị ư
Hiên t ng biên di di truyên xuât hiên cac tê bao không phân hoa (undifferentiation), cac ươ ơ
protoplast phân lâp, cac callus va cac mô nuôi cây in vitro. Nguyên nhân cua biên di chu yêu la do
nh ng thay đôi vê sô l ng va câu truc cua nhiêm săc thê. Tinh không đông nhât cua tê bao trongư ươ
nuôi cây tăng lên do cac nhân tô sau:
(a) Nhiêm săc thê trang thai kham hoăc co rôi loan di truyên cac tê bao cua mâu vât cây ơ ơ
gây.
(b) Cac đăc tinh m i không theo quy luât do cac điêu kiên nuôi cây gây ra. Trong nuôi cây ơ
mô, cac kiêu thay đôi nh thê th ng bi loai bo khi muc đich chinh la tăng cac qua trinh nuôi cây ư ươ
ôn đinh di truyên.
Nh ng nghiên c u gân đây cho thây cac thi nghiêm nuôi cây mô hoăc tê bao th ng traiư ư ươ
qua nh ng thay đôi di truyên (đa bôi-polyploidy, lêch bôi-aneuploidy, đ t gay nhiêm săc thê-ư ư
chromosomal breakage, khuyêt đoan-deletion, chuyên đoan-translocation, khuêch đai gen-gene
amplifications, va đôt biên-mutations), va nh ng thay đôi nay biêu hiên m c đô sinh hoa hoăc ư ơ ư
phân t . Nh vây, nuôi cây mô va tê bao th c vât co kha năng tao biên di di truyên t ng đôiư ư ư ươ
nhanh va không cân phai ng dung cac ky thuât ph c tap khac. Biên di di truyên trong nuôi cây mô ư ư
biêu hiên s thay đôi tinh trang cua cac cây tai sinh va sau đo truyên sang thê hê sau băng ơ ư
ph ng th c nhân giông h u tinh (ví d : rau diêp, thuôc la) hoăc dinh d ng (ví d : mia, khoaiươ ư ư ụ ươ ụ
tây).
Cac biên di chon loc đ c trong nuôi cây mô co nhiêu cach goi khac nhau nh : dong callus ươ ư
(calliclones-t nuôi cây callus) hoăc dong protoplast (protoclones-t nuôi cây protoplast). Nămư ư
1981, Larkin va Scowcroft dung môt thuât ng chung la biên di dong vô tinh (somaclonal ư
variation), măc du Evans va cs (1984) lai dung thuât ng biên di dong giao t (gameclonal ư ư
variation) cho cac dong bi biên đôi di truyên phat triên t cac tê bao giao t hoăc thê giao t . S đa ư ư ư ư
dang cua biên di cac dong vô tinh lam nôi bât môt th c tê răng biên di dong vô tinh co thê la môt ơ ư
công cu rât h u hiêu cho viêc cai thiên di truyên cây trông. ư
7.2.1. Đ c tính c a t bào th c v t đ c nuôi c yặ ủ ế ự ậ ượ ấ
S n đ nh c a các dòng t bào đ c nuôi c y là s th hi n t c đ sinh tr ng và sinhự ổ ị ủ ế ượ ấ ự ể ệ ố ộ ưở
t ng h p các h p ch t th c p có giá tr kinh t , đ c bi t nh t là ng d ng k thu t nuôi c y tổ ợ ợ ấ ứ ấ ị ế ặ ệ ấ ứ ụ ỹ ậ ấ ế
bào trên qui mô công nghi p. Bi n d di truy n c a t bào nuôi c y là c s đ thu nh n nh ngệ ế ị ề ủ ế ấ ơ ở ể ậ ữ
th bi n d soma có nh ng đ c tính quí. S n đ nh là yêu c u c n thi t cho vi c vi nhân gi ngể ế ị ữ ặ ự ổ ị ầ ầ ế ệ ố
các dòng t bào và ch n l c n đ nh trong t o gi ng. Môt vân đê khac đ c đê câp t i trongế ọ ọ ổ ị ạ ố ươ ơ
thông bao vê nuôi cây tê bao Catharanthus la tinh không ôn đinh cua cac dong tê bao đôi v i viêc ơ
tao san phâm th câp. Môt vai dong mât kha năng tao alkaloid ngay ca khi tiên hanh bao quan ư
chung.
Vi thê, hiên t ng giam năng suât không thê hoan toan loai tr đ c. Kho khăn ngay cang ươ ư ươ
tr nên l n h n khi đ a qui mô san xuât lên dang công nghiêp. Nh vây tr c hêt la phai tiênơ ơ ơ ư ư ươ
hanh chon loc nh ng dong tê bao to ra t ng đôi ôn đinh va tiên hanh nghiên c u c chê va ư ươ ư ơ
nguyên nhân dân đên tinh bât ôn đinh. Hiên nay, ng i ta cân tuân theo qui trinh đ c ng dung ươ ươ ư
trong nganh vi sinh vât hoc nhăm thu đ c nh ng dong tê bao co năng suât ôn đinh trong tât ca cac ươ ư
giai đoan nuôi cây đông th i đê tranh mât hoan toan nh ng dong san xuât nay. Môt sô nghiên c u ơ ư ư
cho thây co nh ng dong tê bao chuyên tao ra săc tô co tinh ôn đinh đăc biêt la nh ng điêu rât quan ư ư
trong trong vân đê năng suât. Thê nh ng, xet vê nghiên c u di truyên cho đên nay thi chi m i co ư ư ơ
môt công trinh duy nhât phân tich sô l ng nhiêm săc thê cua dong tê bao tao nhiêu caroten va ươ
dong không tao caroten cua cây Daucus carota va tac gia không tim thây s sai khac gi a hai dong ư ư
nay. S ôn đinh năng suât đây co thê do qua trinh cây chuyên, ng i ta chi cây chuyên nh ng ư ơ ươ ư
khôi callus co mau săc đâm nhât, măc du viêc lam đo hoan toan vô y th c. Ngoai ra, ng i ta se ư ươ
con phat triên ky thuât bao quan đông lanh đat t i trinh đô cho phep tranh hoan toan s xuât hiên ơ ư
nh ng thay đôi do chinh ky thuât đông lanh gây ra. Ph ng phap bao quan băng cach giam phânư ươ
chia tê bao trong nuôi cây nhiêt đô 0 ơ oC la ph ng phap co hiêu qua. ươ
Viêc tai thiêt đ c năng suât cua dong tê bao ươ Catharanthus nêu trên co thê đ c giaiơ ươ
thich băng hiên t ng tai biên song toan bô vân đê mât đi va tai thiêt năng suât se đ c giai thich ươ ươ
nêu nh ng dong tê bao đ c nghiên c u la dong epigenetic ch không phai la nh ng dong genetic. ư ươ ư ư ư
S thât răng tê bao th c vât nuôi cây mang nhiêu đăc điêm không di truyên đa đ c biêt kha ky.ư ư ươ
Chi co môt sô it tr ng h p ng i ta ch ng minh đ c răng nh ng thay đôi cua dong tê bao la do ươ ơ ươ ư ươ ư
nh ng đôt biên cu thê trong genome va plastome hoăc ng i ta ch ng minh đ c co nh ng sanư ươ ư ươ ư
phâm gen thay đôi, vi du nh enzyme thay đôi đ c tao ra. Nh vây, viêc s dung nh ng dong tê ư ươ ư ư ư
bao epigenetic hoăc không di truyên lam ph c tap hoa muc tiêu san xuât cac h p chât th câp băng ư ơ ư
nuôi c y t bào. Thât không may măn vi rât kho chon đ c dong tê bao không mang nh ng thayấ ế ươ ư
đôi không di truyên vi răng muôn ch ng minh điêu đo phai tai sinh cây hoan chinh t nh ng dong ư ư ư
tê bao nay va sau đo tiên hanh kiêm tra nuôi cây mô t hat hoăc cây thu đ c t nh ng cây hoan ư ươ ư ư
chinh đo.
Lo i t bào chính dung trong nuôi c y là nh ng t bào mô s o là k t qu c a nh ng tạ ế ấ ữ ế ẹ ế ả ủ ữ ế
bào soma ph n bi t hóa và nh ng t bào lai h u tính. Tính đa d ng c a nh ng dòng t bào là sả ệ ữ ế ữ ạ ủ ữ ế ự
thu n l i cho các nghiên c u sinh h c. Nh ng mô s o đ u tiên, hình thành qua s phân chiaậ ợ ứ ọ ữ ẹ ầ ự
nh ng t bào mô th ng không đ ng nh t. Nh ng t bào mô nuôi c y khác nhau là nguyênữ ế ở ườ ồ ấ ữ ế ấ
nhân tính không đ ng nh t c a t bào mô s o ti n kh i.ồ ấ ủ ế ẹ ề ở
S phân bào nguyên nhi m b t th ng trong su t quá trình phát sinh và duy trì phát sinhự ễ ấ ườ ổ
d n đ n s hình thành nh ng t bào đa b i, l ch b i và tái x p x p l i nhi m s c th . Dùngẫ ế ự ữ ế ộ ệ ộ ắ ế ạ ễ ắ ể
t c đ sinh tr ng trong đi u ki n nuôi c y thích h p d n đ n vi c ch n l c nhanh chóngố ộ ưở ề ệ ấ ợ ẫ ế ệ ọ ọ
nh ng t bào không đi vào giai đo n bi t hóa; mô s o không đ ng nh t ti n kh i chuy n hóaữ ế ạ ệ ẹ ồ ấ ề ở ể
thành t bào mô s o ch t và sau đó chuy n hóa thành t bào mô s o x p, c hai lo i t bào nàyế ẹ ặ ể ế ẹ ố ả ạ ế
không có c u trúc mô h c.ấ ọ
Thành ph n dinh d ng c a môi tr ng nuôi c y và hormone xác đ nh đ c tính sinh lí vàầ ưỡ ủ ườ ấ ị ặ
phát sinh bi u sinh c a nh ng t bào ph thu c vào nh ng ph n khác nhau c a mô s o. Ki u diể ủ ữ ế ụ ộ ữ ầ ủ ẹ ể
truy n c a m t lo i th c v t ch u nh h ng b i các quá trình bi n đ i xác đ nh c u trúc và t cề ủ ộ ạ ự ậ ị ả ưở ở ế ổ ị ấ ố
đ sinh tr ng c a mô s o. ộ ưở ủ ẹ
Đ có s phân bào t bào đ n, c n ph i s d ng môi tr ng giàu dinh d ng hay môiể ự ở ế ơ ầ ả ử ụ ườ ưỡ
tr ng đi u ki n b ng cách nuôi c y chung v i mô dinh d ng hay m t l p mô cung c p dinhườ ề ệ ằ ấ ớ ưỡ ộ ớ ấ
d ng.ưỡ
M t đ t bào đ n cao và s gi m th tích môi tr ng thúc đ y t bào chuy n qua phânậ ộ ế ơ ự ả ể ườ ẩ ế ể
chia, đây là nh ng đi u ki n đ nh tr c đ phát sinh phân bào nh ng t bào không có kh năngữ ề ệ ị ướ ể ở ữ ế ả
phân chia.
Nuôi c y t bào th c v t b c cao có tính hai m t trong di truy n:ấ ế ự ậ ậ ặ ề
1- Nó mang tính s h u thong tin di truy n c n thi t th hi n m c đ t bào. Thông tinở ữ ề ầ ế ể ệ ở ứ ộ ế
di truy n này đ c th c hi n trên ch c năng c a t bào.ề ượ ự ệ ứ ủ ế
2- T bào nuôi c y v n duy trì thông tin b sung xác đ nh kh năng s n xu t các c ch t.ế ấ ẫ ổ ị ả ả ấ ơ ấ
Nguyên nhân gây ch t trong qu n th t bào ế ầ ể ế invitro có th đ c phân chia theo các ki uể ượ ể
sau đây:
- Có s ch t c a t bào t t c các phase trong chu kì t bàoự ế ủ ế ở ấ ả ế
- S ch t xu t hi n m t phase c a giai đo n gi m d n trong nuôi c y do gi i h nự ế ấ ệ ở ộ ủ ạ ả ầ ấ ớ ạ
d ng ch t hay s c ch c a các s n ph m đ c t trong quá trình trao đ i ch t.ưỡ ấ ự ứ ế ủ ả ẩ ộ ố ổ ấ
- S ch t th hi n tr c khi t bào phân chia.ự ế ể ệ ướ ế
7.2.2. Nguyên liêu va điêu kiên nuôi cây
7.2.2.1. Kiêu gen va mâu vât
Kiêu gen anh h ng lên tân sô tai sinh cây va tân sô biên di dong soma. Sun va cs (1983) ươ
khi nghiên c u kha năng tai sinh cac thê đa bôi cua 18 th (variety) khac nhau cua lua thi chi taiư ơ ư
sinh đ c nhiêu dang bôi thê khac nhau th indica ma không tai sinh đ c th japonica.ươ ơ ư ươ ơ ư
Mâu vât đ c s dung t nhiêu nguôn mô khac nhau nh la, rê, long (internodes), bâu qua ươ ư ư ư
(ovaries) va hoa t (inflorescenes). Nguôn mâu vât đ c xem la rât quan trong trong viêc xuât hiên ư ươ
biên di dong soma. Nghiên c u cây phong l (geranium) cho thây cac biên di soma co thê thu ư ơ ư