Vietnam J. Agri. Sci. 2024, Vol. 22, No. 8: 1002-1010
Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2024, 22(8): 1002-1010 www.vnua.edu.vn
PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHÂ NĂNG LY GIÂI CỦA THỰC KHUẨN THỂ TRÊN VI KHUẨN Pectobacterium spp. GÂY BỆNH THỐI NHŨN RAU CÂI THÂO (Brassica rapa subsp. pekinensis)
Võ Thị Ngọc Hà*, Trương Thị Ngọc Hân
Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
*Tác giả liên hệ: ha.vothingoc@hcmuaf.edu.vn
Ngày nhận bài: 27.11.2023
Ngày chấp nhận đăng: 07.08.2024
TÓM TẮT
Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Pectobacterium spp. và Dickeya spp. (trước kia thuộc Erwinia spp.) gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng gây hại nhiều loại cây trồng trong quá trình sản xuất, thu hoạch và bảo quản. Nghiên cứu này thực hiện với mục tiêu phân lập và phân loại thực khuẩn thể kiểm soát vi khuẩn Pectobacterium spp. từ đất trồng rau cải thảo tại Lâm Đồng, đồng thời đánh giá khả năng ký sinh và khả năng ly giải của các dòng thực thể trên các dòng Pectobacterium spp. Kết quả cho thấy đã phân lập được 14 dòng thực khuẩn thể được chia làm 6 nhóm với đặc trưng hình thái vết tan có tâm trong hoặc tâm đục lớn hoặc nhỏ và được bao bởi quầng ngoài mờ với kích thước khác nhau. Tất cả 14 dòng thực khuẩn thể đều có phổ ký chủ hẹp và có khả năng ly giải vi khuẩn Pectobacterium sp. dòng DT2, trong đó hai dòng TKT ĐR05 và ĐR07 thuộc họ Podoviridae của bộ Caudovirales với phần đầu dạng khối đa diện và đuôi ngắn, không co rút, có khả năng ly giải vi khuẩn cao với đường kính vết tan tương ứng là 13,58mm và 9,37mm.
Từ khóa: Pectobacterium spp., khả năng ly giải, hình thái vết tan, đường kính vết tan.
Isolation and Evaluation of the Lytic Ability of Bacteriophages on Pectobacterium spp. Causing Soft rot Disease of Chinese Cabbage (Brassica rapa subsp. pekinensis)
ABSTRACT
Soft rot disease, caused by Pectobacterium spp., is one of the most dangerous pathogens causing damage to numerous crops during production, harvesting, and storage. This study aimed to isolate and classify bacteriophages from Chinese cabbage-growing soil in Lam Dong and evaluate the parasitic and lytic properties of bacteriophage isolates on Pectobacterium spp. The results revealed that 14 bacteriophage isolates were identified and assigned to six groups. The plaque morphology was characterized by a big or small inner or opaque center surrounded by a translucent outer halo of varying diameters. All 14 bacteriophage isolates had a narrow host range and were capable of lysing Pectobacterium sp. isolate DT2. Two bacteriophage isolates DR05 and DR07 belonging to the Podoviridae family of the Caudovirales order with a polyhedral head and a short, non-contractile tail showed high bacterial lysis ability and plaque diameters were 13.58mm and 9.37mm, respectively.
Keywords: Pectobacterium spp., lysis ability, plaque morphology, plaque diameters.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
thối Bệnh do vi
khoai tây (Xie & cs., 2017; Golkhandan & cs., 2013; Toth & cs., 2003) trong quá trình canh tác, vên chuyển và trong kho tồn trĂ (Bhat & cs., 2010; Glasner & cs., 2008). Vi khuèn Erwina đþợc liệt kê là một trong 10 mæm bệnh thăc vêt quan trọng nhçt trong nông nghiệp khuèn nhün Pectobacterium spp. và Dickeya spp. (trþĆc kia thuộc Erwinia spp.) gây häi trên nhiều loäi cây trồng có giá trð kinh tế nhþ câi thâo, cà chua,
1002
Võ Thị Ngọc Hà, Trương Thị Ngọc Hân
(Mansfield & cs., 2012). Đặc biệt, bệnh thối nhün tàn phá nghiêm trọng đến câi thâo (Kim & cs., 2014) và gây thiệt häi kinh tế cho ngþąi sân xuçt cüng nhþ sā dýng.
cây câi thâo. Do đò, việc phân lêp và khâo sát các dòng thăc khuèn thể có khâ nëng kiểm soát vi khuèn Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhün trên câi thâo trong nghiên cĀu này là tiền đề cho các nghiên cĀu tiếp theo về đðnh hþĆng phát triển chế phèm sinh học kiểm soát Pectobacterium tÿ thăc khuèn thể.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất và vật liệu
Nguồn vi khuèn: 6 dòng Pectobacterium spp. (TM01, TM02, ĐR01, ĐR02, DT1, DT2) đã đþợc xác đðnh là tác nhân gây bệnh trên cây câi thâo đþợc Bộ môn Bâo vệ thăc vêt, Khoa Nông học, Trþąng Đäi học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cçp.
Kiểm soát mæm bệnh bìng biện pháp hóa học nhþ sā dýng thuốc gốc đồng (Cu) hoặc thuốc trÿ bệnh dăa trên kháng sinh đã đþợc áp dýng phổ biến. Tuy nhiên, việc sā dýng kháng sinh không cñn đþợc khuyến khích do tác động tiêu căc đến môi trþąng bìng cách đèy nhanh să xuçt hiện cûa vi khuèn kháng kháng sinh. Theo Nguyen & cs. (2022) một số chûng Erwinia phân lêp trong đçt nông nghiệp ć Hàn Quốc có khâ nëng kháng đối vĆi streptomycin thþĄng mäi ć nồng độ 250 ìg/ml. Nồng độ Āc chế tối thiểu (MIC) cûa streptomycin và tetracycline ć các chûng Erwinia phân lêp vào nëm 2021 đã tëng gçp đôi so vĆi các chûng phân lêp vào nhĂng nëm 2000 (Kim & cs., 2021).
Hóa chçt: Pepton (Yeast Extract FP101, Trung Quốc), Glycerol (Cas 56-81-5, Xilong, Trung Quốc), K2HPO4.3H2O (Cas 16788-57-1, Xilong, Trung Quốc), MgSO4.7H2O (Cas 10034- 99-8, Xilong, Trung Quốc), agar (Robika Hâi Long, Việt Nam), NaCl (Cas 7647-14-5, Xilong, Trung Quốc), Tris-HCl (CAS 1185-53-1, Biobasic, Canada).
Môi trường King’s B (KBA) (Burgess & cs., 2009)
Các chiến lþợc kiểm soát sinh học bền vĂng, bao gồm liệu pháp thăc khuèn thể (TKT), đã đþợc đề xuçt nhþ là giâi pháp cho gen kháng kháng sinh. Thăc khuèn thể là loài phong phú nhçt trong sinh quyển, vĆi số lþợng þĆc tính là 1032 thăc khuèn thể trong tă nhiên và khoâng 109 virion trong mỗi gram đçt (Weinbauer, 2004; Wommack & Colwell, 2000). So vĆi kháng sinh hóa học, thăc khuèn thể có hiệu quâ cao và tiết kiệm chi phí do khâ nëng tă sao chép trong tế bào chû và tính đặc hiệu cao đối vĆi vi khuèn chû là þu điểm nổi an toàn vì không ânh hþćng đến nhĂng vi sinh vêt khác (Romero-Calle & cs., 2019).
Thành phæn: Peptone (20g), Glycerol (10g), K2HPO4 khan (1,5g), MgSO4.7H2O (1,5g), Agar (15g), nþĆc cçt (1.000ml). Trộn chung tçt câ các thành phæn ngoäi trÿ MgSO4. Điều chînh pH đến 7,2 bìng pH kế Hanna Edge HI2020 sā dýng NaOH 1M. Tÿ tÿ thêm MgSO4 và líc đều. Hçp khā trùng ć 121C trong 20 phút.
Đệm Saline - magnesium (SM) (Kropinski, 2009)
Thành phæn: NaCl (5,8g), MgSO4.7H2O (2g), 1M Tris-HCl (pH 7,5) 50ml, nþĆc cçt (1.000ml). Hçp khā trùng ć 121C trong 21 phút.
2.2. Thu mẫu đất và phân lập thực khuẩn thể
thăc khuèn Trên nhĂng ruộng bệnh thối nhün thþąng xuyên xuçt hiện theo ghi nhên cûa nông dân, täi thąi điểm thu méu câi thâo trên ruộng có triệu chĀng bệnh thối nhün lçy méu đçt ć 4 vð trí khác nhau (200 g/vð trí) vĆi bán kính 50cm Thăc khuèn thể đã đþợc chĀng minh có khâ nëng kiểm soát bệnh bệnh thối nhün trên khoai tây do Pectobacterium spp. và Dickeya spp. (Czajkowski & cs., 2015; Nguyen & cs., 2022), phòng trÿ bệnh cháy bìa lá lúa do Xanthomonas campestris pv. oryzae (LþĄng HĂu Tâm & Nguyễn Thð Thu Nga, 2014; Nguyễn Thð Trúc Giang & cs., 2014), kiểm soát bệnh thối hät lúa do vi khuèn Burkholderia glumae (Phan Quốc Huy & cs., 2016) và phòng trÿ bệnh héo xanh trên cây vän thọ do Ralstonia solanacearum (Nguyễn Thúy An & cs., 2017). Tuy nhiên, hiện nay chþa có nhiều nghiên cĀu thể đối vĆi vi khuèn về Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhün trên
1003
Phân lập và đánh giá khả năng ly giải của thực khuẩn thể trên vi khuẩn Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhũn rau cải thảo (Brassica rapa subsp. pekinensis)
nghiệm thĀc tþĄng Āng vĆi số dòng TKT phân lêp đþợc, và cho vào đïa 5ml môi trþąng KBA 0,8% agar đã nçu tan để nguội ć 45C chĀa 100µl tÿng dòng vi khuèn Pectobacterium spp. (OD600 = 0,3) và để khô đïa trong tû cçy 15-20 phút. Dùng micropipette rút 5µl huyền phù tÿng dñng TKT nhó vào ô kẻ tþĄng Āng và û đïa ć 28C trong 24 gią.
xung quanh cây bð bệnh ć độ sâu 0-20cm, sau đò trộn lén vào nhau thành 1 méu gộp đäi diện cho vþąn. Méu đçt thu đþợc bâo quân trong túi zip, viết tên nhãn cho tÿng méu và bâo quân trong tû länh cho đến khi sā dýng (Roger & Dean, 2005). TKT đþợc phân lêp bìng phþĄng pháp tëng sinh và khâo sát vết tan trên agar hai lĆp theo mô tâ cûa Kropinski (2009) gồm hai bþĆc nhþ sau: BþĆc 1: Thu dðch TKT thô: Cho 1 g đçt thu đþợc vào ống falcon chĀa 10ml môi trþąng King’s B lóng và 100µl huyền phù vi khuèn Pectobacterium sp. dòng DT2 (OD600 = 0,3), líc vĆi vên tốc 150rpm trong 24 gią. Sau đò dung dðch đþợc ly tâm vĆi vên tốc 6.000 rpm trong 10 phút để loäi bó chçt cặn líng bên dþĆi ống. Phæn dung dðch nổi đþợc chuyển qua ống falcon chĀa 100µl chloroform líc đều bìng vortex và ly tâm ć 6.000rpm trong 10 phút để loäi bó tế bào vi khuèn và chloroform, thu dðch nổi và ly tâm ć 6.000rpm trong 10 phút læn 2, dðch nổi thu đþợc là dðch TKT thô bâo quân trong tối ć 4C.
Khâ nëng ly giâi cûa các dñng TKT cüng đþợc đánh giá bìng phþĄng pháp khâo sát đþąng kính vết tan trên agar hai lĆp cûa Kropinski & cs. (2009). Chuèn bð sinh khối vi khuèn Pectobacterium sp. dòng DT2 nồng độ 108 CFU/ml (OD600 = 0,3) và tçt câ các dòng TKT nồng độ 103 PFU/ml. Lçy 100µl huyền phù tÿng dòng TKT mêt độ 108 PFU/ml và 100µl huyền phù vi khuèn Pectobacterium sp. nồng độ 108 CFU/ml (OD600 = 0,3) vào ống nghiệm chĀa 5ml môi trþąng KBA 0,8% agar đã nçu tan để nguội ć 45C, líc nhẹ và trâi trên môi trþąng KBA sau đò đặt đïa trong tû đðnh ôn 28C, quan sát và ghi nhên đþąng kính cûa 10 vết tan (không bao gồm quæng mą bao ngoài) ngéu nhiên và lçy trung bình cûa mỗi læn lặp läi ć các thąi điểm 24 gią, 48 gią và 72 gią.
Các thí nghiệm đþợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngéu nhiên đĄn yếu tố, mỗi dòng TKT là 1NT, 3 LLL, mỗi LLL là 3 đïa petri.
2.4. Phân loại TKT dựa trên đặc điểm hình thái
BþĆc 2: Tách đĄn dñng TKT: Cho 100µl dðch TKT thô và 100µl dðch huyền phù vi khuèn Pectobacterium sp. dòng DT2 (OD600 = 0,3) vào 5 ml môi trþąng KBA 0,8% agar ć 45C, líc đều và trâi trên đïa môi trþąng KBA, sau đò û đïa trong tû đðnh ôn ć 28C trong 24 gią và quan sát să hình thành vết tan. Ở các đïa cò xuçt hiện vết tan dùng tëm bông vô trùng chçm vào các vết tan đĄn lẻ väch truyền sang đïa petri mĆi chĀa vi khuèn ký chû và û ć 28C trong 24 gią. Sau đò cho 5ml đệm SM vào đïa petri và ngåm đïa trong 30 phút rồi thu phæn huyền phù vào ống falcon, bổ sung 50µl chloroform và ly tâm hai læn vĆi vên tốc 6.000rpm trong 10 phút, thu dðch nổi và ly tâm ć 6.000rpm trong 10 phút læn 2. Sau đò thu phæn dðch nổi chî chĀa TKT vào ống falcon mĆi và trĂ trong điều kiện che tối ć nhiệt độ 4C. Tên cûa dñng TKT đþợc đặt theo tên méu đçt thu đþợc täi các điểm thu méu.
2.3. Đánh giá khâ năng ký sinh và khâ Hai dòng TKT có khâ nëng ly giâi vi khuèn cao nhçt là TKT ĐR05 và ĐR07 đþợc nhân mêt số đät 1010 PFU/ml theo phþĄng pháp tëng sinh TKT (theo mô tâ ć bþĆc 1 mýc 2.2) và xác đðnh hình thái học bìng kính hiển vi điện tā truyền qua - Transmission electron microscopy (TEM), model máy JEOL JEM 1010 ć chế độ STEM, 120kV täi phòng cçu trúc siêu hiển vi, Viện Vệ sinh dðch tễ Trung þĄng (Hà Nội). Dăa trên đặc điểm hình thái, các dñng TKT đþợc phân loäi dăa trên khóa phân loäi cûa Ủy ban Quốc tế về phân loäi virus (ICTV) (Murphy & cs., 1995).
2.4. Phân tích số liệu năng ly giâi của các dòng TKT trên các dòng Pectobacterium spp.
Số liệu cûa các thí nghiệm đþợc xā lý bìng Excel 2016 và phån tích phþĄng sai (ANOVA) một nhân tố, tríc nghiệm phân häng Duncan ć mĀc ý nghïa alpha 0,01 bìng phæn mềm SAS 9.1. Khâ nëng ký sinh cûa các dñng TKT đþợc đánh giá thông qua phþĄng pháp nhó giọt trên agar hai lĆp (Kropinski & cs., 2009). Chuèn bð đïa môi trþąng KBA đã đþợc kẻ ô và đánh số
1004
Võ Thị Ngọc Hà, Trương Thị Ngọc Hân
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
dòng ĐR05 cò tåm trong nhó, quæng ngoài lĆn mą (Hình 1).
3.1. Kết quâ phân lập các dòng TKT từ đất trồng câi thâo
cûa enzyme
Các méu đçt tÿ vùng đçt trồng câi thâo ć ĐĄn DþĄng và thành phố Đà Lät tînh Låm Đồng đã phån lêp đþợc 14 dòng TKT (Bâng 1). Trong đò, 7 dñng TKT đþợc phân lêp ć xã Đä Ròn và 4 dòng TKT phân lêp ć xã Thänh Mỹ huyện ĐĄn DþĄng, 3 dñng TKT phån lêp ć xã Xuân Thành thành phố Đà Lät. Kết quâ cho thçy rìng ć các nĄi cò xuçt hiện vi khuèn gây bệnh đều phân lêp đþợc TKT.
Hình thái vết tan cûa các dòng TKT thể hiện să đa däng khá rõ ràng và xếp vào 6 nhóm vĆi đặc trþng nhþ sau: nhòm 1 gồm có các dòng XT02, XT03, TM02, ĐR01, ĐR03 cò tâm trong lĆn, quæng ngoài mą; nhóm 2 gồm các dòng XT01, TM03, TM04, ĐR04 cò tåm trong nhó, viền ngoài mą và có vòng màu tríng; nhóm 3 chî có dòng ĐR02 vĆi đặc trþng cò tåm đýc, quæng ngoài mą; nhóm 4 gồm các dòng TM01, ĐR06 cò tåm trong nhó, quæng ngoài nhó mą; nhóm 5 chî có 1 dòng ĐR07 cò tåm trong lĆn, quæng ngoài lĆn mą và nhóm 6 là Kiểu hình thái vết tan có tâm trong thþąng đþợc thể hiện ć các dñng TKT sinh tan, điều này có thể do khâ nëng ly giâi cûa vi khuèn giâm hoặc do să Āc chế ly giâi bći să khuếch tán và lipopolysacharide hoät động depolymerase đþợc sinh ra tÿ TKT, có tác dýng phân hûy màng lipopolysacharide cûa vi khuèn täo vết tan có quæng hoặc viền mą xung quanh (Jurczak-Kurek & cs., 2016; Lai & cs., 2016). Mặt khác, să hình thành các vết tan trong có thể điển hình cho các TKT độc (virulent phage), trong khi đò să hình thành các vết tan đýc có thể là các TKT ôn hoà (temperate phage) (Jurczak-Kurek & cs., 2016). Să khác nhau về hình thái vết tan giĂa các dòng TKT có thể là do să khác nhau về cách thĀc xâm nhiễm cüng nhþ về tốc độ sinh trþćng cûa TKT. Abbas & cs. (2015), khi phân lêp TKT kiểm soát bệnh thối nhün trên khoai tåy do Dickeya dadantii cüng thu đþợc TKT có hai loäi hình thái vết tan khác nhau gồm mâng lĆn cò đþąng kính 5mm, có quæng sáng mą ć rìa và mâng nhó cò đþąng kính 1-2mm vĆi quæng mą và đýc.
Dòng TKT
Địa điểm thu mẫu
Tọa độ
11°56'33,6"N 108°31'06,1"E
Xã Xuân Thành - TP Đà Lạt
XT01
11°56'36,3"N 108°31'05,5"E
XT02
11°56'39,5"N 108°31'00,6"E
XT03
11°45'22,9"N 108°28'32,2"E
Xã Thạnh Mỹ - Đơn Dương
TM01
11°45'16,5"N 108°28'21,0"E
TM02
11°45'19,2"N 108°28'16,4"E
TM03
11°45'58,4"N 108°28'57,8"E
TM04
11°44'57,8"N 108°27'26,7"E
Xã Đạ Ròn - Đơn Dương
ĐR01
11°45'13,4"N 108°27'25,0"E
ĐR02
11°45'11,5"N 108°27'37,5"E
ĐR03
11°45'18,8"N 108°27'46,6"E
ĐR04
11°45'07,9"N 108°27'36,2"E
ĐR05
11°45'07,9"N 108°27'36,2"E
ĐR06
11°45'07,9"N 108°27'36,2"E
ĐR07
Tổng
14
Ghi chú: Tên TKT được đặt theo thứ tự: - Xã lấy mẫu - số thứ tự. VD: XT01 (Mẫu TKT số 1 ở Xuân Thọ).
Bâng 1. Danh sách 14 dòng TKT phân lập ở Lâm Đồng (nëm 2023)
1005
Phân lập và đánh giá khả năng ly giải của thực khuẩn thể trên vi khuẩn Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhũn rau cải thảo (Brassica rapa subsp. pekinensis)
Ghi chú: a: Nhóm 1; b: Nhóm 2; c: Nhóm 3; d: Nhóm 4; e: Nhóm 5; f: Nhóm 6.
Hình 1. Các dạng vết tan của các dòng TKT
Đường kính vết tan (mm)
Dòng TKT
24 giờ
48 giờ
72 giờ
2,14e
3,76e
6,28ef
XT01
1,48g
3,49ef
6,26ef
XT02
1,52g
3,81e
5,73h
XT03
1,90ef
2,50g
6,09fg
TM01
1,83f
2,80g
6,66d
TM02
1,28g
3,28f
6,15fg
TM03
2,03of
3,79e
5,88gh
TM04
1,27e
4,83d
6,25ef
ĐR01
2,14e
4,93d
6,54de
ĐR02
2,70d
4,70d
6,03fgh
ĐR03
2,82d
4,62d
6,26ef
ĐR04
8,67a
11,55a
13,58a
ĐR05
6,68b
7,40b
8,43c
ĐR06
4,45c
6,85c
9,37b
ĐR07
CV (%)
3,90
3,30
1,90
Mức ý nghĩa
0,01
0,01
0,01
Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có cùng kí tự theo sau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo phân hạng Duncan ở mức α = 0,01.
Bâng 2. Đường kính vết tan của các dòng TKT với vi khuẩn Pectobacterium sp. dòng DT2 trong điều kiện phòng thí nghiệm
1006
Võ Thị Ngọc Hà, Trương Thị Ngọc Hân
13,58mm; 8,43mm và 9,37mm, khác biệt có ý nghïa thống kê so vĆi các dòng TKT còn läi. 3.2. Khâ năng ký sinh và ly giâi của TKT trên các dòng vi khuẩn Pectobacterium spp.
3.3. Phân loại TKT dựa trên đặc điểm hình thái
Hai dòng TKT ĐR05 và ĐR07 cò khâ nëng ly giâi mänh vi khuèn Pectobacterium spp. và täo ra các vết tan rõ ràng, có tâm trong lĆn hoặc nhó và quæng ngoài lĆn mą (Hình 1e và 1f) đþợc lăa chọn để chýp TEM và phân loäi.
Tçt câ 14 dñng TKT đều có phổ ký chû hẹp, chî ký sinh trên dòng vi khuèn ký chû Pectobacterium spp. dñng DT2 đþợc dùng để tëng sinh TKT ć giai đoän phân lêp. Kết quâ này tþĄng tă cûa Buttimer & cs. (2018), khi phân lêp dòng TKT vB_PatP_CB5 tÿ méu đçt täi nhà máy phân loäi cû khoai tây ghi nhên phäm vi ký sinh hẹp chî có khâ nëng hình thành các vết tan trên vi khuèn ký chû cûa TKT (DSM 30186) và hai chûng P. atrosepticum. Thăc khuèn thể CUB19 có phäm vi ký chû hẹp, ký sinh 4 trong số 40 chûng Stenotrophomonas maltophilia đþợc thā nghiệm và không ký sinh chûng Pseudomonas aeruginosa (Fanaei & cs., 2022). Thăc khuèn thể RpY1 đþợc phân lêp tÿ vùng rễ cûa cây cà chua chî có thể ký sinh 3 chûng trong số 20 chûng Ralstonia solanacearum (Lee & cs., 2021).
Khâ nëng ly giâi TKT đþợc thể hiện qua đþąng kính vết tan và đþąng kính vết tan càng lĆn khâ nëng ly giâi cûa TKT càng cao. Thăc khuèn thể có khâ nëng ly giâi cao là TKT có đþąng vết tan tÿ 6-17mm trong khoâng 24 đến 48 gią (Tan & cs., 2009). Đþąng kính vết tan cûa 14 dñng TKT đối vĆi vi khuèn Pectobacterium spp. dòng DT2 qua 3 thąi điểm 24 gią, 48 gią và 72 đþợc ghi nhên täi bâng 2. Khi quan sát 2 dñng TKT này dþĆi kính hiển vi điện tā truyền qua cho thçy câ 2 TKT đều có phæn đæu däng khối đa diện cò kích thþĆc tÿ 40-50nm và cò đuôi ngín không có sợi đuôi (Hình 2). Theo thang phân loäi Ủy ban Quốc tế về phân loäi virus (ICTV) câ 2 TKT thuộc họ Podoviridae cûa bộ Caudovirales. Lim & cs. (2013); Buttimer & cs. (2018) và Kabanova & cs. (2018) đã phån lêp đþợc các TKT thuộc họ Podoviridae có tiềm nëng Āng dýng kiểm soát vi khuèn Pectobacterium spp. vĆi kích thþĆc phæn đæu khoâng 60nm vĆi đuôi ngín và không co rút tÿ đçt trồng câi thâo, hoặc khoai tây nhiễm bệnh thối nhün. Bên cänh đò, các TKT đặc trþng cho Pectobacterium cñn đþợc phân lêp tÿ méu bệnh, đçt, dung dðch phân bón hoặc hồ chĀa nþĆc (Ravensdale & cs., 2007; Eayre & cs., 1995; Gross & cs., 1991), hæu hết nhĂng nĄi cò vi khuèn tồn täi bao gồm câ méu thăc vêt nhiễm bệnh (Wommack & Colwell, 2000).
Tçt câ các dòng TKT phân lêp đþợc đều có khâ nëng ly giâi vi khuèn ký chû bít đæu tÿ 24 gią sau cçy (GSC) và tëng dæn lên ć các thąi điểm tiếp theo. Ba dòng TKT ĐR05, ĐR06 và ĐR07 cò khâ nëng ly giâi vi khuèn cao, các dòng còn läi có khâ nëng ly giâi thçp và duy trì khâ nëng ly giâi ć tçt câ các thąi điểm theo dõi.
Ở thąi điểm 24 GSC đþąng kính vết tan dao động tÿ 1,28-8,67mm. Trong đò, 3 dñng TKT ĐR05, ĐR06 và ĐR07 cò đþąng kính vết tan cao nhçt (læn lþợt là 8,67mm, 6,68mm và 4,45mm) khác biệt cò ý nghïa thống kê đối vĆi các dòng TKT còn läi.
TþĄng tă, ć thąi điểm 48 GSC và 72 GSC, đþąng kính vết tan cûa các dñng TKT đều tëng so vĆi thąi điểm 24 gią, đät tÿ 2,8-11,55mm (48 gią) và 5,73-13,58mm (72 gią), ba dòng TKT ĐR05, ĐR06 và ĐR07 vén thể hiện khâ nëng ly giâi cao cò đþąng kính vết tan sau 72 gią læn lþợt là Theo Ackermann (2007) các loài thuộc họ Podoviridae cüng chĀa sợi đôi AND däng thîng cò đuôi ngín chiếm khoâng 14% trọng bộ Caudovirales. Đæu là khối đa diện cùng kích thþĆc khoâng 60nm, chĀa 72 protein (T = 7). Đuôi cò kích thþĆc 17 × 8nm và có 6 sợi đuôi ngín và không thể co läi, trọng lþợng bộ gen khoâng trên 40kb. CĄ chế xâm nhiễm cûa họ Podoviridae vào vi khuèn kí chû chþa biết đến một cách rõ ràng. Tuy nhiên, các loài thuộc họ Podoviridae sā dýng các sợi đuôi ngín này để bám vào bề mặt cûa tế bào kí chû, sau đò bĄm ADN vào tế bào kí chû. Trong nghiên cĀu này hai TKT ĐR05 và ĐR07 cò phổ ký chû hẹp, chî ký sinh trên vi khuèn ký chû cûa chúng, kết quâ này cüng phù hợp vĆi công bố cûa Sabour & Griffiths (2010) rìng các TKT cò đuôi thuộc họ Podoviridae và Siphoviridae thþąng có phổ ký chû hẹp hĄn so họ Myoviridae.
1007
Phân lập và đánh giá khả năng ly giải của thực khuẩn thể trên vi khuẩn Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhũn rau cải thảo (Brassica rapa subsp. pekinensis)
Hình 2. Hình chụp TEM của 2 dòng TKT ĐR05 (a) và ĐR07 (b)
4. KẾT LUẬN
Ackermann H.W. (2007). 5500 Phages examined in the electron microscope. Archives of virology. 152(2): 227-243.
Bhat K.A., Masood S.D., Bhat N.A., Bhat M.A., Razvi S.M., Mir M.R., Sabina A., Wani N. & Habib M. (2010). Current status of post harvest soft rot in vegetables: A review. Asian Journal of Plant Sciences. 9(4): 200-208.
Burgess L.W., Timothy E.K., Len T. & Phan Thúy Hiền (2009). Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Nhà xuất bản Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR). tr. 195.
atrosepticum
Buttimer C., Lucid A., Neve H., Franz C., O’mahony J., Turner D.J., Lavigne R. & Coffey A. (2018). Pectobacterium phage vB_PatP_CB5: a member of the proposed genus ‘Phimunavirus.’ Viruses. 26(10): 394. Czajkowski R., Pérombelon M.C.M., Tÿ 12 méu đçt thu thêp đþợc ć các vùng trồng câi thâo täi Låm Đồng đã phån lêp đþợc 14 dòng thăc khuèn thể vĆi đặc trþng hình thái vết tan có tâm trong hoặc tåm đýc lĆn hoặc nhó và đþợc bao bći quæng ngoài mą vĆi kích thþĆc khác nhau, chia làm 6 nhóm. Tçt câ 14 dòng TKT đều có phổ ký chû hẹp và có khâ nëng ly giâi vi khuèn Pectobacterium sp. dòng DT2, trong đò hai dñng TKT ĐR05 và ĐR07 cò khâ nëng ly giâi vi khuèn cao vĆi đþąng kính vết tan tþĄng Āng là 13,58mm và 9,37mm. Hai thuộc họ dòng TKT ĐR05 và ĐR07 Podoviridae cûa bộ Caudovirales vĆi phæn đæu däng khối đa diện và đuôi ngín.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abbas S.D., Zahra E., Giti E. & Majid B. (2015). Isolation of Dickeya dadantii strains from potato disease and biocontrol by their bacteriophages. Brazilian Journal of Microbiology. 46(3): 791-797. Jafra S., Lojkowska E., Potrykus M., van der Wolf J.M. & Sledz W. (2015). Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review. Annals of Applied Biology. 166(1) : 18-38. Eayre C.G., Bartz J.A. & Concelmo D.E. (1995). The Bacteriophages of Erwinia carotovora and Erwinia
1008
Võ Thị Ngọc Hà, Trương Thị Ngọc Hân
isolated from freshwater lakes. Plant ananas Disease. 79: 801-804.
Kropinski A.M., Mazzocco A., Waddell T.E., Lingohr E. & Johnson R.P. (2009). Enumeration of Bacteriophages by Double Agar Overlay Plaque Assay. In: Clokie M.R., Kropinski A.M. (eds) Bacteriophages. Methods in Molecular Biology™. Humana Press. Vol. 501. therapeutic agent. Fanaei P.R., Wagemans J., Kunisch F., Lavigne R., Trampuz A. & Gonzalez M. M. (2022). Novel Stenotrophomonas maltophilia bacteriophage as potential Pharmaceutics. 14(10): 2216.
exopolysaccharide Lai M.J., Chang K.C., Huang S.W., Luo C.H., Chiou P.Y., Wu C.C. & Lin N.T. (2016). The tail associated protein of Acinetobacter baumannii phage ÖAB6 is the host specificity determinant possessing depolymerase activity. PloS One. 11(4): e0153361.
Glasner J.D., Marquez-Villavicencio M., Kim H.S., Jahn C.E., Ma B., Biehl B.S., Rissman A.I., Mole B., Yi X., Yang C.H., Dang J.L., Grant S.R., Perna N.T. & Charkowski A.O. (2008). Niche-specificity and the variable fraction of the Pectobacterium pan-genome. Plant-Microbe Molecular Interacttion. 21:1549-1560. infecting RpY1
Lee S.Y., Magar R.T., Kim H.J., Choi K. & Lee S.W. (2021). Complete genome sequence of a novel bacteriophage Ralstonia solanacearum strains. Current Microbiology. 78: 2044-2050.
carotovorum subsp. Golkhandan E., Kamaruzaman S., Sariah M., Abidin M. A., Nazerian E. & Yassoralipour A. (2013). First Report of Soft Rot Disease Caused by Pectobacterium wasabiae on Sweet Potato, Tomato, and Eggplant in Malaysia. Plant Disease. 97(5): 685 Journal Lim J.A., Jee S., Lee D.H., Roh E., Jung K., Oh C. & Heu S. (2013). Biocontrol of Pectobacterium carotovorum using of Microbiol bacteriophage PP1. Biotechnology. 23(8): 1147-1153.
Gross D.C., Powelson M.L., Regner K.M., & Radamaker G.K. (1991). A bacteriophage-typing system for surveying the diversity and distribution of strains of Erwinia carotovora in potato fields. Phytopathology. 81: 220-226.
Lương Hữu Tâm & Nguyễn Thị Thu Nga (2014). Bước đầu phân lập và đánh giá khả năng ký sinh, tính đặc hiệu của một số chủng thực khuẩn thể của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật. 13: 76-84.
Biodiversity (2016). A.
Mansfield J., Genin S., Magori S., Citovsky V., Sriariyanum M., Ronald P., Dow M., Verdier V., Beer S.V., Machado M.A., Toth I., Salmond G. & Foster D.R. (2012). Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13(6): 614-629. Jurczak-Kurek A., Gąsior T., Nejman-Faleńczyk B., Bloch S., Dydecka A., Topka G., Necel A., Jakubowska-Deredas M., Narajczyk M., Richert M., Mieszkowska A., Wróbel B., Węgrzyn G. & Węgrzyn of bacteriophages: morphological and biological properties of a large group of phages isolated from urban sewage. Scientific Reports. 6: 34338.
characteristics Genomic the
proposed species Kabanova A., Shneider M. M., Bugaeva E., Ha V.T.N., Miroshnikov K.A., Korzhenkov A., Kulikov E.E., Toschakov S., Ignatov A. & Miroshnikov K.A. of (2018). vB_PpaP_PP74, a T7-like Autographivirinae bacteriophage infecting a potato pathogen of the newly Pectobacterium parmentieri. Advanced Virology. 163:1691-1694.
Murphy A. Frederick, Claude M. Fauquet, Bishop D.H., Ghabrial S.A., Jarvis A.W., Martelli G.P., Mayo M.A. & Summers M.D. (1995). Virus Taxonomy : Classification and Nomenclature of Viruses, Sixth Report of International Committee on Taxonomy of Viruses. Springer. Nguyen T.V., Roh E., Nguyen T.T. & Oh C.S. (2022). Antibiotic Resistance of Pectobacterium Korean Strains Susceptible to the Bacteriophage phiPccP- 1. Res. Plant Disease. 28(3): 166-171.
Kim D., Kim N., Kim C., Jeong M.I., Oh K.K., Kim B.E., Ryu J.G., Jung J., Jee S., Ryu K.Y. (2021). Investigation of antimicrobial minimum inhibitory concentration of Pectobacterium spp. isolated from agricultural produce. The Korean Journal of Pesticide Science. 25: 333-342.
Nguyễn Thị Trúc Giang, Nguyễn Thị Thu Nga & Đoàn Thị Kiều Tiên (2014). Phân lập thực khuẩn thể và đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ. (Chuyên đề Nông nghiệp): 194-203.
reduced soft rot
Kim H.S., Park Y.H., Nam H.; Lee Y.M., Song K., Choi C., Ahn I., Park S.R., Lee Y.H., Hwang D.J. & Van Wees S. (2014). Overexpression of the Brassica rapa transcription factor WRKY12 results in symptoms caused by Pectobacterium carotovorum in Arabidopsis and Chinese cabbage. Plant Biology. 16(5): 973-981. Nguyễn Thúy An, Nguyễn Thị Thu Nga, Phạm Văn Kim và Nguyễn Văn Minh Phụng (2017). Phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây hoa vạn thọ (Tagetes papula L.) do vi khuẩn Ralstonia
1009
Phân lập và đánh giá khả năng ly giải của thực khuẩn thể trên vi khuẩn Pectobacterium spp. gây bệnh thối nhũn rau cải thảo (Brassica rapa subsp. pekinensis)
to antibiotics in clinical care. alternatives Antibiotic (Basel). 8 : 138. solanacearum Smith. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 49b: 44-52
Sabour P.M. & Griffiths M.W. (2010). Bacteriophages in the control of foodand waterborne pathogens. American Society for Microbiology Press.
Phan Quốc Huy, Hồ Cãnh Thịnh, Nguyễn Thị Thu Nga & Phạm Nguyễn Minh Trung (2016). Đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 45b: 70-78. Pathology. Plant 4(1): Toth I.K., Bell K.S., Holeva M.C. & Birch P.R.J. (2003). Soft rot erwiniae: from genes to genomes. 17-30. Molecular doi:10.1046/j.1364-3703.2003.00149.
Ravensdale M., Blom T.J., Gracia-Garza J.A., Svircev A.M. & Smith R.J. (2007). Bacteriophages and the control of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Canadian Journal of Plant Pathology. 29: 121-130.
pathogen Weinbauer M.G. (2004). Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiology Reviews. 28: 127-81. Wommack K.E. & Colwell R.R. (2000). Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology. Review. 64: 69-114. Roger Shivas & Dean Beasley (2005). Management of of Australia collections. Diparment Forestry Fisheries plant Agriculture Government.
Xie H., Li X.Y., Ma Y.L. & Tian Y. (2017). First report of Pectobacterium aroidearum causing soft rot of Chinese cabbage in China. Plant Disease, PDIS-07- 17-1059-PDN. doi:10.1094/PDIS-07-17-1059-PDN. Romero-Calle D., Guimarães B.R., Góes-Neto A. & as (2019). Bacteriophages Billington C.
