TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
165
(20,01%) và huyện Càng Long (19,99%). Bởi vì
BVSNTV đóng trên địa bàn thành phố Trà Vinh
và gần huyện Càng Long nên số lượng bệnh
nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện nhiều.
Điều này cho thấy người dân ở hai khu vực này
ý thức được vai trò quan trọng của việc phòng
bệnh cho trẻ, công tác truyền thông giáo dục
sức khỏe cho trẻ được các bậc phụ huynh quan
tâm sâu sắc.
V. KẾT LUẬN
- Ba nhóm bệnh chủ yếu thường gặp ở trẻ
dưới 5 tuổi tại BVSNTV là: bệnh hệ hô hấp
(56,61%), bệnh hệ tiêu hóa (9,97%), bệnh
nhiễm khuẩn và ký sinh vật (9,95%).
- Nhóm bệnh hô hấp chủ yếu là: Viêm cấp
đường hô hấp trên khác (46,82%), viêm họng và
viêm amidan cấp 39,37%), viêm phế quản và viêm
tiểu phế quản cấp (9,40%) là ba bệnh chủ yếu.
- Nhóm bệnh đường tiêu hóa chủ yếu là: Viêm
dạ dày và tá tràng (5,62%), Bệnh khác của ruột
non và màng bụng (3,76%) là hai bệnh chủ yếu.
- Nhóm bệnh đường tiết niệu sinh dục chủ
yếu là: Tổn thương viêm khác của các cơ quan
khung chậu nữ (33,55%), rối loạn kinh nguyệt
(17,08%), tổn thương không viêm của buồng
trứng, vòi fallope và dây chằng rộng (13,20%) là
3 bệnh chủ yếu.
- Nhóm bệnh nhiễm khuẩn: Các bệnh nhiễm
khuẩn ruột khác (58,62%); Ỉa chảy, viêm dạ
dày, ruột non có nguồn gốc nhiễm khuẩn
(34,94%) là hai bệnh chủ yếu.
- Tỷ lệ trẻ nam nhập viện điều trị là 58,99%,
tỷ lệ trẻ nữ nhập viện điều trị là 41,01%.
- Tỷ lệ trẻ mắc bệnh theo nhóm tuổi chiếm
đa số từ 1 đến 5 tuổi là 41,79%.
- Tỷ lệ trẻ nhập viện điều trị chủ yếu tập
trung chủ yếu ở hai khu vực là: TP. Trà Vinh
(20,01%) và huyện Càng Long (19,99%).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế. Bảng phân loại Quốc tế bệnh tật Việt Anh
lần thứ 10 (ICD10), nhà xuất bản Y học, 2001.
2. Hunh Thuận và cộng sự (2014). Mô hình
bệnh tật tại Bệnh viện Nhi Qủang Nam trong 5
năm (2009 – 2013).
3. Trương Thị Mai Hồng, Lê Thanh Hải, Phạm
Ngọc Toàn, Đỗ Quang Vỹ, Lê Thị Dung.
(2012). Mô hình bệnh tật tại Khoa cấp cứu, bệnh
viện Nhi Trung ương 2011.
4. Nguyễn Đình Thoại, Lê Văn Dũng (2005).
Tình hình bệnh tật và tử vong tại Bệnh viện Nhi
Quảng Nam trong 9 tháng (1/2004 – 10/2004).
5. Nguyễn Thị Xuân Hương, Hoàng Thị Huế
(2011). Tình hình bệnh tật và tử vong so sinh tại
bệnh viện tại khoa Nhi bệnh viện đa khoa trung
ương Thái Nguyên trong 3 năm (2008-2010).
6. Võ Phương Khanh, Trịnh Hữu Tùng, Thái
Thanh Tùng. Mô hình bệnh tật tại Bệnh viện Nhi
Đồng 2 (2005 – 2007).
7. Lawn JE (2004) "Why are 4 million dying each
year", The lancet, vol 364.
PHÁT HIỆN hMAM mRNA TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR VÀ RT-REALTIME PCR
Nguyễn Minh Hiền*
TÓM TẮT43
Ung thư vú (UTV) là loại ung thư rất thường gặp ở
phụ nữ, việc chẩn đoán và điều trị sớm UTV sẽ góp
phần giảm tỷ lệ tái phát và tỷ lệ tử vong cho người
bệnh. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã
chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ
khối u xâm nhập và di chuyển rất sớm vào máu ngoại
vi gọi là tế bào ung thư di chuyển (CTC). Phát hiện
các gen đăc hiệu từ CTCs có thể hữu ích trong sàng
lọc, tiên lượng, theo dõi sau điều trị. Mục tiêu của
nghiên cứu này là: Phát hiện hMAM mRNA trong máu
bệnh nhân UTV, tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện
của hMAM mRN và một số yếu tố khác trong bệnh
*Bệnh viện Thanh nhàn
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Minh Hiền
Email: hienshbvtn@gmail.com
Ngày nhận bài: 8.01.2020
Ngày phản biện khoa học: 28.2.2020
Ngày duyệt bài: 10.3.2020
UTV. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu trên
mẫu máu của 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định
là ung thư vú, 10 người khỏe mạnh tự nguyên tham
gia vào nhóm nghiên cứu. Sử dụng kỹ thuật Real time
RT-PCR, giải trình tự gen, để phát hiện hMAM mRNA
từ dòng tế bào ung thư vú, mô ung thư vú và các tế
bào ung thư vú trong máu. Kết quả: Tỷ lệ phát hiện
hMAM trong máu là 19/33 (57,57%), ngưỡng phát
hiện được hMAM là 40 đến 2.105 bản copies/ml máu.
Không thấy biểu hiện của hMAM trong máu người
khỏe mạnh (0/10). Tỷ lệ biểu hiện của gene này có
liên quan đến kích thước u, di căn cũng như giai đoạn
bệnh với (p<0,05), Kết luận: Phát hiện được gene
hMAM từ các tế bào ung thư vú trong máu.
Từ khoá:
Real-time,RT- PCR, hMAM, ung thư vú
SUMMARY
FINDING hMAM mRNA FROM BREAST
CANCER TUMOR CELLS BY RT-PCR AND
RT- REALTIME PCR TECHNIQUE
Breast cancer is a very common cancer in women,
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020
166
the diagnosis and the therapy of early stage tumors
have the potential to decrease morbidity and mortality
rate of patients with breast cancer. In recent years,
scientist have demonstrated that the cancer cells
derived from tumor infiltrating and moving in peripheral
blood from a very early stage known as Circulating
Tumor Cell (CTC). The detection sensitive genes from
CTCs may prove useful for screening, prognostication,
monitoring of response to therapy. The goal of this
study: Detection hMAM mRNA in peripheral blood of
breast cancer patients, correlation between the
expression of hMAM mRN and some other factors in
that. Patients and methods: Blood sample obtained
from 33 breast cancer patients, 10 healthy volunteers.
Using Real-time RT-PCR, gene sequencing techniques
to discover hMAM gene in breast cancer cell lines,
cancer tissues and in CTCs. Results: Detection rates
hMAM mRNA are 19/33 (57,57%) in blood, the
investigated range from 40 to 2.105 copies/ml blood,
non expression of hMAM in healthy human blood
(0/10). The expression rate of two genes related to
tumor size, metastasis and stage of disease (p <0.05).
Conclusion: The findings were hMAM gene from
breast cancer cells in the peripheral blood.
Keywords:
Real-time, RT-PCR, hMAM, breast cancer
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú là loại ung thư phổ biến ở phụ nữ
nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước
đang phát triển. Hàng năm trên toàn thế giới có
khoảng 1.3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú
mới được chẩn đoán và có tới trên 450.000 ca tử
vong vì căn bệnh này[1]. Theo những lý thuyết về
ung thư học trước đây, sự di căn của các tế bào
ung thư chỉ xảy ra ở giai đoạn muộn. Tuy nhiên,
theo công trình mới nhất của các nhà khoa học
Mỹ, các tế bào ung thư di chuyển (circulating
tumor cells - CTCs) có thể thâm nhập vào máu
ngoại vi ngay từ giai đoạn rất sớm. Sự xuất hiện
và di chuyển của các CTC từ khối u vào máu
ngoại vi bao gồm nhiều giai đoạn. Ban đầu các tế
bào ung thư phát triển nhanh, cần nhiều oxy nên
phát triển xâm lấn. Các tế bào này có mật độ thụ
thể trên bề mặt thấp dẫn tới sự giảm liên kết với
nhau và chống lại quá trình chết theo chương
trình. Kết quả là các tế bào này có khả năng sống
sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào máu. Sau
khi vào máu, các CTC không còn khả năng biệt
hóa và di chuyển tới các cơ quan khác. Trên mô
hình nghiên cứu ung thư ở động vật, người ta có
thể phát hiện 1 tế bào di căn trong 106 TB máu
[7]. Kết quả này chỉ ra ý nghĩa của việc phát hiện
ra các CTC mang những gene chỉ thị đặc trưng
cho khối u trong máu, góp phần xác định sớm,
tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư vú. Trên
thế giới đã có một số gene chỉ thị UTV được phát
hiện và nghiên cứu, trong đó hMAM (Human
Mammaglobin) là gene có độ nhậy và độ đặc hiệu
cao. Đây là cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên
cứu với mục tiêu:
1.Phát hiện hMAM mRNA ở máu và mô bệnh
nhân UTV.
2.Tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện của
hMAM mRNA và một số yếu tố khác trong bệnh
UTV.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu:
+ Mẫu bệnh: 33 Mẫu máu và 30 mẫu mô của
bệnh nhân UTV ở giai đoạn I, II, III, IV đã được
chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học. Giai đoạn
I: 05 bệnh nhân. Giai đoạn II: 16 bệnh nhân.
Giai đoạn III và IV: 12 bệnh nhân. Các bệnh
nhân được làm các xét nghiệm hoá sinh, huyết
học, X- quang, giải phẫu bệnh… tại Bệnh viện K
trung ương. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một
khối u hay ung thư một cơ quan nào khác ngoài
ung thư vú. Đã được điều trị trước đó
+ Mẫu chứng: 10 mẫu máu của người bình
thường
2. Phương pháp nghiên cứu:
2.1 Quy trình nghiên cứu
- Tách bạch cầu từ 5ml máu toàn phần bằng
cách ly tâm 4000 vòng trong 20 phút
- Tách RNA từ phần tế bào có nhân thu được
và mô UT dựa vào quy trình tách Kit Rneasy Mini
Kit của Quiagen Germany.
- Kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng RNA
tổng số RNA bằng phổ hấp thụ trên máy đo
NanoDrope -1000. Độ tinh sạch phụ thuộc vào tỷ
số OD260nm/OD280nm. Một acid nucleic được gọi là
sạch khi tỷ số này là 1,8 – 2,0. Khi các mẫu
nghiên cứu đảm bảo độ tinh sạch mới tiến hành
các quy trình kỹ thuật tiếp theo.
- Tạo cDNA (RT-PCR): Sử dụng 4 – 5 µg RNA
tổng số, thêm nước sạch RNase cho vừa đủ 6 µl/
1ống. Thêm 1 µl Reaction mix và 1 µl Random
hexamers để ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút. Sau
đó đặt trong đá lạnh 1 phút. Thêm 10 µl buffer
và 2 µl Enzym mix cho đủ 20 µl.Tổng hợp cDNA
với chu trình nhiệt như sau: 25oC/ 10 phút; 50oC/
50 phút; 85oC/ 5 phút. Sau đó sản phẩm cDNA
được bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.
(Invitrogen, USA).
- PCR: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với
cặp mồi GADPH và hMAM tiến hành như sau:
Bước khởi đầu sử dụng nhiệt độ 95oC/ 5 phút;
Tiếp theo thực hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu
trình nhiệt: Biến tính 95oC/ 45 giây, bắt cặp
52oC/ 45 giây, kéo dài 72oC/ 45 giây; Bước kéo
dài kết thúc 72oC/ 7 phút để hoàn tất phản ứng.
Sau đó mẫu được bảo quản ở 4oC.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
167
Tên primer
Trình tự
Tm
KT (bp)
GAPDH F
5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’
65.3
307
GAPDH R
5’- AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’
67
hMAM F1
5’- GAA GTT GCT GAT GGT CCT CAT GCT GGC-3’
71.3
326
hMAM R1
5’- CTC ACC ATA CCC TGC AGT TCT GTG AGC-3’
71.3
hMAM F 2
5’- CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC-3’
72.1
203
hMAM R2
5’- CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG-3’
70.4
- Diện di sản phẩm PCR thu được trên agarose
0,8%.
- Giải trình tự một số mẫu dương tính so sánh
với trình tự hMAM ở ngân hàng gene.
- Real-time- PCR.
Xây dựng đường chuẩn
cho phản ứng real-time PCR bằng dòng tế bào
UTV BT474 Phản ứng real-time PCR với primer
hMAM xác định số bản sao các mẫu UTV (quy
trình kit real-time PCR sử dụng SYBR Green trên
máy Light Cycler® của hãng Roche).
*Quy trình được áp dụng cho dòng tế bào
UTV, sau khi xác định được độ nhậy sẽ áp dụng
trong đối tượng nghiên cứu.
- Dòng tế bào: Sử dụng 3 dòng tế bào: MCF-
7, BT474, KPL4, MDA-MB23-1.
2.2 Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang.
Kết quả thu được được xử lý trên hệ thống máy
tính bằng các thuật toán y sinh học: Sử dụng Chi-
Square, Fishers exact test để so sánh các tỷ lệ.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Phát hiện hMAM trong nhóm nghiên cứu:
Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA trong
nhóm nghiên cứu
Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
với mồi GAPDH
1,2,3: mẫu máu BN UTV; 4,5,6 mẫu mô BN
UTV; 7,8,9 mẫu máu khỏe mạnh; 10: nước cất,
11: dòng tế bào MCF7; M: Marker 1000bp
Nhận xét:
Sau khi tách RNA, sử dụng kỹ
thuật RT-PCR tạo cDNA chúng tôi tiến hành phản
ứng PCR nhân bản mồi GAPDH là gene nội
chuẩn. Các mẫu dương tính có các băng rõ nét
kích thước là 307bp. Tất cả các mẫu NC đều
dương tính khi kiểm tra bằng GAPDH điều này
chứng tỏ chất lượng mRNA và quá trình tạo
cDNA đáp ứng các điều kiện cần thiết cho thí
nghiệm xác định gene nghiên cứu, loại trừ các
trường hợp âm tính giả do chất lượng cDNA
không đạt. Sau khi kiểm tra chất lượng các mẫu
nghiên cứu bằng mồi GAPDH, chúng tôi tiến
hành PCR các mẫu với mồi hMAM.
- Kết quả hMAM trong nhóm nghiên cứu
Hình2: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
với mồi hMAM
Từ 1-6 mô UTV (BN mã số 2,3,4,5,7,8), từ 7-
12 máu UTV (BN mã 2,3,4,5,7,8); 13: dòng TB
MCF7; 14: dòng TB KPL4; 15: dòng TB BT474,
16 dòng TB MDA-MB 23-1, Marker 1000bp
Nhận xét:
Trên kết quả điện di những giếng
có băng rõ nét kích thước tương đương với kích
thước 203bp là những sản phẩm dương tính. Các
giếng vị trí từ 1đến 6 là sản phẩm RT-PCR của
mẫu mô ung thư có kết quả dương tính với gene
hMAM. Vị trí số 7 là hình ảnh RT-PCR mẫu máu
của bệnh nhân ung thư vú âm tính, không có
băng kích thước tương đương 203bp. Các giếng
từ số 8 đến số 12 là kết quả điện di sẩn phẩm
RT-PCR mẫu máu bệnh nhân UTV, thể hiện các
băng rõ nét kích thước giống các băng ở mẫu
mô UTV dương tính. Các giếng 13,14,15,16 là vị
trí của dòng tế bào UTV, chúng tôi nhận thấy
dòng tế bào MCF7, KPL4, BT474 có biểu hiện
hMAM mRNA dương tính các băng rõ nét kích
thước đồng nhất 203bp. Dòng TB MDA-MB có
biểu hiện âm tính.
- Kết quả Real-time PCR khuyếch đại hMAM
Hình 3: Kết quả Real-time PCR nhân bản
250 bp
203
bp
307
bp
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020
168
mồi hMAm trong máu BN UTV
+ Xây dựng đường chuẩn dựa vào trộn vào
5ml máu bình thường tế bào BT474 ở các tỷ lệ
2x101; 2x102; 2x103; 2x104; 2x105 Quy trình tách
bạch cầu, tách RNA, RT-PCR được thực hiện như
mục 2.1
+ Ngưỡng phát hiện hMAM từ 40 bản
copies/ml máu.
- Tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA
Mẫu bệnh phẩm
n
hMAMmRNA
Tỷ lệ (%)
Số bản sao (
±SD)
Máu UTV
33
19
57,57
50,7log4 ±11,6log5
Mô UTV
30
28
93,33
92,6log5±25,3log5
Máu khỏe mạnh
10
0
0
P=0,2
Tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA ở mô UTV cao
hơn trong máu. Điều này phù hợp vì tế bào ung
thư có nguồn gốc từ mô ung thư xâm nhập vào
máu. Các tế bào ung thư trong máu không có
khả năng biệt hóa di chuyển đến các cơ quan
khác. Biểu hiện của hMAM trong máu của bệnh
nhân UTV là 57,57% cao hơn so với nghiên cứu
của Shen Changxing 36,2%[5]. Biểu hiện hMAM
mRNA trong mô UTV là 93,33 thấp hơn so với
nghiên cứu của S.Roncella 95%[7]. Không thấy
bản sao của hMAM ở mẫu chứng bình thường.
Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu không
thấy biểu hiện của hMAM ở nhóm khỏe mạnh
tình nguyên tham gia nghiên cứu[5,7].
2.Tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện
của hMAM mRNA và một số yếu tố khác
trong bệnh UTV.
Các yếu tố liên
quan UTV
n
hMAM (%)
Kích thước u
<2cm
2 -5cm
>5cm
6
19
8
2/6 (33,3%)
9/19 (47,3%)
8/8 (100%)
P= 0,002
Di căn xa
M0
M1
28
5
14/28 (50%)
5/5 (100%)
P= 0,037
Hạch
không
có
10
23
3/10 (30%)
16/23 (69,6%)
P=0,03
Giai đoạn bệnh
1
2
3 và 4
5
16
12
2/5 (40%)
7/16 (43,7%)
10/12 (83,3%)
P<0,01
Thể mô bệnh học
Thể ống xâm nhập
Thể tiểu thùy
Thể nhầy
19
7
7
10/19 (52,6%)
5/7 (71,4%)
4/7 (57,1%)
P=0,69
Nhận xét:
Kích thước u càng lớn thì thì tỷ lệ
biểu hiện gene hMAM càng cao. Trường hợp kích
thước u lớn hơn 5cm thì tỷ lệ biểu hiện hMAM là
8/8 trường hợp chiếm tỷ lệ 100%. Sự biểu hiện
của hMAM liên quan đến kích thước u là có ý
nghĩa thống kê (p<0,05). Tỷ lệ biểu hiện của
hMAM mRNA còn liên quan đến di căn hạch và di
căn xa (p<0,05). Đặc biệt tỷ lậ biểu hiện của
hMAM mRNA liên quan đến giai đoạn bệnh
(p<0,01). Điều này cũng giả thích cho sự liên
quan của hMAM mRNA đến mức độ nặng nhẹ
của bệnh UTV. UTV có nhiều dạng mô bệnh học,
hay gặp là UTV thể ống xâm nhập có độ ác tính
cao chiếm 75%, thể nhày và thể tiểu thùy ít gặp
chiếm 2%. Không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ
biểu hiện của hMAM ở các thể mô bệnh học khác
nhau trong UTV (p=0,69).
IV. BÀN LUẬN
Ung thư vú là ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất
ở phụ nữ không những ở Việt Nam mà trên toàn
thế giới. UTV cũng mang các đặc điểm của UT
nói chung là các tế bào phát triển vô hạn độ,
ngoài tầm kiểm soát, kết hợp với sự xâm lấn, di
căn. Bản chất của sự phát triển bất thường này
là gì thì đến nay khoa học vẫn còn đang tiếp tục
giải mã. Mặc dù cơ chế sinh bệnh học ung thư
vẫn chưa rõ ràng nhưng rất nhiều nhà khoa học
đồng ý rằng sự phát sinh ung thư có nguồn gốc
từ bệnh học phân tử, nó liên quan đến quá trình
chết tế bào (apotosis ), liên quan đến các yếu tố
tham gia quá trình tái bản (replication), quá trình
sao chép (trancription) và quá trình dịch mã
(translation). Đích đến của đề tài này nhằm phát
hiện mRNA của hMAM từ tế bào ung thư vú
trong máu, bước đầu làm sáng tỏ sự phiên mã
bất thường của gene hMAM trong bệnh UTV từ
đó trả lời câu hỏi có thể dùng việc phát hiện
gene bất thường để xác định tế bào ung thư
trong máu. Cho dù còn nhiều điều chưa biết rõ
về bản chất cũng như vai trò cụ thể của hMAM
trong quá trình bệnh học phức tạp của UTV,
song việc phát hiện mức độ biểu hiện của gene
hMAM trong nghiên cứu sẽ giúp các nhà UT một
phương tiện, một kỹ thuật mới trong chẩn đoán
UTV. Để đánh giá mức độ sao chép của gene
hMAM trong máu ngoại vi ta phải tiến hành tách
chiết được RNA tổng số và tổng hợp cDNA.
Trong nghiên cứu này chúng tôi phải tiến hành
tách chiết RNA tổng số từ mô tươi và từ máu của
bệnh nhân UTV để có đối chứng chặt chẽ. Máu
được lấy trước khi mổ, sau khi lấy máu, cần tiến
hành tách chiết RNA tổng số càng nhanh càng
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
169
tốt, thông thường phải tách RNA trong vòng 4
giờ sau khi lấy máu. Mô UTV sau khi lấy được
bảo quản ở - 80oC cho đến khi tiến hành tách
chiết. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân
hủy bởi các enzyme là các ribonuclease (RNase).
Tách chiết RNA tổng số theo Rneasy Mini Kit của
hãng QIAGEN là phương pháp có hiệu quả, tách
được phân tử RNA có chất lượng cao. Sau khi
tách RNA tổng số thu được 30 µl, độ tinh sạch
của phân tử RNA được xác định bằng các chỉ số
hấp thụ quang phổ, dựa trên tỷ lệ OD260/ OD280.
Tỷ lệ OD260/ OD280 biểu thị mức độ protein còn
sót lại trong dịch chiết. RNA được coi là tinh sạch
khi giá trị OD260/ OD280 từ 1,8 đến 2,0. Tất cả các
mẫu tách RNA của chúng tôi phải đảm bảo sự
tinh sạch mới tiến hành bước kỹ thuật tổng hợp
cDNA tiếp theo. Quá trình tổng hợp cDNA dựa
trên mẫu khuôn là RNA được thực hiện bởi
enzym sao mã ngược thu được 20 µl cDNA. Sau
mỗi lần tổng hợp cDNA, chất lượng sản phẩm
cDNA được kiểm tra bằng phản ứng khuếch đại
gene GAPDH với cặp mồi đặc hiệu. Gene GAPDH
hiện diện ở mọi tế bào của cơ thể và được xem
là gene nội chuẩn và được sử dụng để kiểm tra
chất lượng của DNA hay cDNA. Sau phản ứng
khuếch đại, nếu chất lượng cDNA không tốt, bị
đứt gãy hay tạp nhiễm thì băng điện di trên
agarose sẽ mờ, bờ không đều, xuất hiện các
băng phụ. Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy
sản phẩm RT-PCR với mồi GADPH F/R thu được
1 băng sáng đậm có kích khoảng 307 bp phù
hợp kích thước theo tính toán thiết kế. Điều này
chứng tỏ chất lượng RNA và quá trình tạo cDNA
của chúng tôi đã thành công, cDNA được tạo ra
đáp ứng các điều kiện cần thiết cho phản ứng
PCR tiếp theo.
Trong nghiên cứu này mẫu đối chứng dương
là dòng tế bào UTV. Trong hình 2: Có ba trong
bốn dòng tế bào UTV biểu hiện hMAM dương
tính. Điều này chứng tỏ hMAM là gene có tỷ lệ
biểu hiện cao trong dòng UTV. Tế bào MDA-MB
231 không biểu hiện hMAM. Trong nghiên cứu
của S. Rocella thì hMAM biểu hiện ở ba trong số
năm dòng UTV [5]. Điều này chứng tỏ gene
hMAM có thể biểu hiện ở các dòng TB ung thư
khác nhau. Mẫu đối chứng âm là 10 mẫu máu
của người tình nguyện khỏe mạnh, kết quả là
không có mẫu nào có biểu hiện của hMAM. Điều
này phù hợp với nghiên cứu của Chen, Shen,
Rocella, không thấy biểu hiện của hMAM trong
máu người khỏe mạnh. Từ năm 1996, Watson và
Fleming đã coi hMAM là chỉ giới để phân biệt
người lành và UTV. Trong số 30 mẫu mô UTV thì
có 28 mẫu có biểu hiện của hMAM chiếm tỷ lệ
93,33%. Kết quả này cũng gần tương đương với
kết quả nghiên cứu hMAM trên mô UTV khác. Tỷ
lệ biểu hiện gene UT trên mô cao là phù hợp vì
mô chứa rất nhiều tế bào UT. Nếu kỹ thuật tốt
lấy đúng được tổ chức UT thì việc phát hiện
gene UT ở mô UT là điều kiện lý tưởng. Việc
phát hiện hMAM trên mô UTV là một chứng
dương quan trọng để chúng tôi tìm sự biểu hiện
hMAM trong các CTC. Việc phát hiện gene trên
mô có nhiều hạn chế vì là thủ thuật không phải
lúc nào cũng thực hiện được nhất là trường hợp
khối u quá nhỏ hoặc không có biểu hiện bên
ngoài, những trường hợp sau phẫu thuật, tổ
chức u không còn giữ nguyên mốc giải phẫu
nữa, việc phát hiện gene trên mô UT rất khó
thực hiện được. VÌ vậy việc phát hiện gene UT
trong máu là hướng mới cho phát hiện UTV.
Trong số 33 mẫu máu của bệnh nhân UTV có 19
mẫu phát hiện có sự sao chép hMAM mRNA
chiếm 57,57%. Tỷ lệ này cao hơn nghiên cứu
của Chen và Roceella. Chúng tôi cho rằng có thể
do cỡ mẫu chưa đủ lớn, mặt khác số lượng bệnh
nhân UTV của Chen và Rocella rất nhiều ở giai
đoạn 0 và1 trong khi các bệnh nhân trong
nghiên cứu này chủ yếu ở giai đoạn 2,3 và 4 vì
thế mà tỷ lệ biểu hiện hMam trong máu bệnh
nhân UTV ở nghiên cứu này cao hơn. Trong hình
2 giếng 1 là kết quả điện di sản phẩm mô UTV
của BN mã số 2, BN này ở giai đoạn I kích thước
băng mờ, giếng 7 là kết quả máu tương ứng,
biểu hiện âm tính. Ở giếng 2 là kết quả mô UTV
của BN có kích thước u nhỏ hơn 2cm kết quả
băng điện di mờ, nhưng đây là bệnh nhân có di
căn hạch nên kết quả máu tương ứng lại là băng
điện di đậm. RT-PCR thường chỉ đánh giá sơ bộ
BN có biểu hiện dương tính với hMAM nhưng
chưa đánh giá mức độ biểu hiện của nó, vì vậy
phải làm kỹ thuật Real-time PCR để đánh giá số
bản sao hMAM trong máu. Ngưỡng phát hiện
hMAM mRNA trong máu là 40 bản copies/ ml
máu. Không có sự khác biệt về số bản sao hMAM
ở máu và mô bệnh nhân UTV (p=0,02). Đây là
sự khẳng định chúng tôi đã nhân bản thành
công hMAM mRNA từ các tế bào UTV lưu hành
trong máu. Điều này mở ra triển vọng có thể
ứng dụng phát hiện hMAM là một marker mới
trong chẩn đoán UTV. Để tìm hiểu mối quan hệ
của hMAM trong UTV chúng tôi tìm sự biểu hiện
của hMAM gene với các yếu tố sinh học khác liên
quan đến UTV.
Trong bệnh UTV kích thước u có ý nghĩa rất
quan trọng dó là cơ sở để chẩn đoán, tiên lượng
bệnh. Ở bệnh nhân có khối u dưới 2cm tỷ lệ
33,3%, khi kích thước u lớn hơn thì tỷ lệ biểu
hiện hMAM cũng cao hơn 100% ở trường hợp có
khối u lớn hơn 5cm. Khi khối u càng lớn dinh