Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.)

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG<br /> TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)<br /> <br /> Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên,<br /> Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo<br /> nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời<br /> gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường<br /> MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy,<br /> chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn<br /> Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả<br /> bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen.<br /> Từ khóa: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, in vitro, nuôi cấy.<br /> <br /> MỞ ĐẦU vậy, việc khai thác rễ tự nhiên dùng làm nguồn<br /> Cây bạch hoa xà, có tên khoa học là dược liệu chế biến sản phẩm tiêu tốn nhiều thời<br /> Plumbago zeylanica L., thuộc họ gian, làm cạn kiệt lượng cây phân bố ngoài tự<br /> Plumbaginaceae, là một cây dược liệu có nguồn nhiên.<br /> gốc từ vùng Tây Bắc châu Á [2], được phân bố Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết<br /> ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và<br /> Úc, châu Á và châu Phi [19]. bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch<br /> Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà được hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn<br /> sử dụng điều trị một số bệnh về da như bị vết Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô<br /> thương, chàm, bệnh ghẻ, bệnh phong [1]. Nhiều nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích<br /> nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ<br /> cành của cây được sử dụng như nguồn dược liệu. bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần<br /> Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản<br /> plumbagin, một naphtoquinone màu vàng được phẩm sử sụng trong lĩnh vực y dược.<br /> sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> năm trước công nguyên dùng kháng ký sinh, bổ<br /> tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra,<br /> Vật liệu<br /> nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ<br /> cây này, bao gồm phenolic acids, tannins, Cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) sinh<br /> anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn [13]. trưởng trong điều kiện tự nhiên ở tỉnh Phú Yên<br /> Nhiều nghiên cứu cho thấy, plumbagin được được lấy mẫu đọan thân để khử trùng; sử dụng 2<br /> chiết tách từ cây có khả năng kháng ung thư chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes<br /> [12], kháng khuẩn [4, 5], kháng sốt rét [8], ức ATCC (American Type Culture Collection)<br /> chế hoạt động phân chia tế bào [3], kháng đột 15934 và ATCC 11325 [dạng hoang dại (wild<br /> biến, kháng côn trùng [8] và làm giảm type), đều chứa plasmid pRi mang các gen rol<br /> cholesterol tổng số [12]. (root loci) như rolB và rolC trên vùng T-DNA]<br /> được cung cấp bởi Phòng Công nghệ gen, Viện<br /> Cây bạch hoa xà sinh trưởng chậm trong điều Sinh học nhiệt đới.<br /> kiện tự nhiên, các rễ của cây dùng để thu nhận<br /> plumbagin cần nhiều năm mới cho hàm lượng Phương pháp<br /> hoạt chất cao [7]. Ở Việt Nam, do chưa có qui Khử trùng mẫu cấy<br /> hoạch tổng thể vùng trồng thu nguyên liệu, vì<br /> <br /> 161<br />  Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) chứa chồi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nói trên<br /> ngủ được rửa dưới vòi nước máy trong 10-15 (hai lô thí nghiệm khác nhau). Thấm khô nhẹ<br /> phút, sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt bằng dịch vi khuẩn thừa ở mẫu lá và nuôi chung (co-<br /> nước xà phòng loãng và rửa lại bằng nước cất cultivation) mô với vi khuẩn trong 3 ngày. Sau<br /> vô trùng. Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng nuôi chung, tiến hành rửa loại bỏ vi khuẩn<br /> dung dịch javel thương mại nồng độ 10% (v/v) bằng kháng sinh cefotaxime (500 g/ml). Mẫu<br /> trong thời gian 20 phút. Mẫu được rửa lại bằng sau khi rửa được nuôi trên môi trường MS<br /> nước khử ion vô trùng, loại bỏ phần mô chết đặc có bổ sung cefotaxime (nồng độ như trên).<br /> trắng và cấy mẫu lên môi trường MS Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2-4 tuần nuôi ở<br /> (Murashige và Skoog, 1962) [10] đặc. 25oC và điều kiện tối, ghi nhận hình thái mẫu rễ<br /> Khảo sát sự tăng sinh chồi nách tơ và tách dòng nuôi cấy rễ tơ trong môi trường<br /> MS lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh<br /> Các đoạn thân mang chồi nách 4 tuần tuổi trưởng sau khi rễ phát triển đạt chiều dài khoảng<br /> (chồi cao khoảng 0,5 cm) được nuôi cấy trên<br /> 1 cm.<br /> môi trường MS có bổ sung BA 1,0-2,5 mg/L và<br /> IBA 0,1-0,5 mg/L. pH môi trường được điều Xử lý thống kê<br /> chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ Các thí nghiệm được thiết kế theo thể thức<br /> 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 30 phút. hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lặp<br /> Các mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm<br /> 10 h/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2oC. Statgraphics Centurion XV theo phương pháp<br /> Khảo sát phát triển cây Duncan multiple Range Test (Duncan, 1995) ở<br /> Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm là những mức ý nghĩa 5%.<br /> chồi in vitro có chiều cao khoảng 1,5 cm,<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ<br /> sung IBA nồng độ 0,1-0,35 mg/L, pH 5,8; Khảo sát sự tăng sinh chồi nách<br /> điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện Cytokinin là nhóm các chất điều hòa sinh<br /> nuôi như trên. trưởng thực vật, có một trong các hoạt tính sinh<br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định lý là kích thích sự phát triển chồi nách. Đặc biệt,<br /> Nghiên cứu này nhằm mục đích tạo nguồn khi tương tác với auxin ở nồng độ thích hợp,<br /> nguyên liệu rễ bất định dùng nuôi cấy so sánh cytokinin sẽ thúc đẩy phân chia tế bào ở mô<br /> với rễ tơ. phân sinh đỉnh, nâng cao tỷ lệ tạo chồi, tạo số<br /> lượng chồi hình thành nhiều hơn so với không<br /> Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) và lá cây in<br /> bổ sung hai nhóm chất này.<br /> vitro (có cuống) được nuôi cấy trên môi trường<br /> MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Khi không bổ sung/bổ sung ít cytokinin,<br /> NAA (0,1-1,5 mg/L) và IBA (0,1-1,5 mg/L). pH chồi tăng trưởng chủ yếu theo chiều cao, không<br /> 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều được kích thích tạo nhiều chồi bên. Không phải<br /> kiện nuôi như trên. nồng độ cytokinin và auxin cao quyết định sự<br /> tạo chồi mà chính tỷ lệ thích hợp giữa cytokinin<br /> Khảo sát khả năng tạo rễ tơ và auxin đã làm tăng khả năng tạo chồi (hình 1;<br /> Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC bảng 1). Nồng độ BA 1,5 mg/L kết hợp IBA 0,1<br /> 15834 và ATCC 11325 bảo quản ở -80oC được mg/L là tổ hợp tạo chồi tốt nhất trong các<br /> hoạt hoá bởi quá trình nuôi trải trên môi trường nghiệm thức (4,76 chồi/mẫu) và kết quả nhận<br /> LB (đặc) trong 2 ngày ở 25o C và điều kiện tối. được ở nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp<br /> Vi khuẩn, qua cấy chuyển vào môi trường lỏng với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002)<br /> LB và nuôi lắc 280 vòng/phút ở 25oC trong 24 [18], qua nghiên cứu khả năng tạo chồi trực tiếp<br /> giờ, được dùng để xử lý chuyển gen tạo rễ tơ. từ chồi bên cây bạch hoa xà với số chồi trung<br /> Mẫu lá (có cuống) của cây in vitro được gây bình là 3,5 trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L<br /> nhiễm (infection) trong 15 phút với từng chủng BA và 0,1 mg/L IBA.<br /> <br /> <br /> <br /> 162<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A. Nghiệm thức đối chứng B. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA<br /> sau 4 tuần nuôi cấy sau 4 tuần nuôi cấy<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> h<br /> b c d g i<br /> <br /> a e f j<br /> <br /> C. MS +1,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA D. MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> m<br /> l n r<br /> q s<br /> k o<br /> p t<br /> <br /> E. MS + 2,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA F. MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> Hình 1. Tạo chồi bạch hoa xà từ chồi bên trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy<br /> A. Đối chứng; B. Môi trường MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA; C. Môi trường MS +1,0 mg/L BA + (0,1-<br /> 0,5) mg/L IBA; D. Môi trường MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA; E. Môi trường MS + 2,0 mg/L BA +<br /> (0,1-0,5) mg/L IBA; F. Môi trường MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA. Các chữ cái a, b, c, d,... trên hình 1<br /> tương ứng môi trường A1, A2, A3,... ở bảng 1.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 163<br />  Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA và IBA đến khả<br /> năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây bạch hoa xà<br /> Chiều cao trung<br /> Môi Ký BA IBA Tỷ lệ tạo chồi Số chồi trung<br /> bình của chồi<br /> trường hiệu (mg/L) (mg/L) (%) bình/mẫu<br /> (cm)<br /> O 0 0 100 1,00 5,33 a<br /> A1 a 1,0 0,1 88,89 4,45 1,56 b<br /> A2 b 1,0 0,2 77,78 4,00 1,47 bc<br /> A3 c 1,0 0,3 83,33 2,67 1,59 b<br /> A4 d 1,0 0,4 77,78 3,56 1,31 bcd<br /> A5 e 1,0 0,5 55,56 3,78 1,12 bcde<br /> B1 f 1,5 0,1 100 4,67 1,40 bcd<br /> B2 g 1,5 0,2 88,89 4,33 1,45 bcd<br /> B3 h 1,5 0,3 88,89 1,89 0,69 de<br /> B4 i 1,5 0,4 100 2,44 0,73 cde<br /> B5 j 1,5 0,5 77,78 3,78 0,88 bcde<br /> C1 k 2,0 0,1 100 2,44 1,33 bcd<br /> C2 l 2,0 0,2 88,89 1,89 1,07 bcde<br /> C3 m 2,0 0,3 77,78 1,33 0,84 bcde<br /> C4 n 2,0 0,4 100 2,78 1,11 bcde<br /> C5 o 2,0 0,5 77,78 3,56 1,27 bcde<br /> D1 p 2,5 0,1 88,89 1,44 1,05 bcde<br /> D2 q 2,5 0,2 88,89 1,22 0,69 de<br /> D3 r 2,5 0,3 88,89 2,44 1,28 bcde<br /> D4 s 2,5 0,4 66,67 1,78 0,52 e<br /> D5 t 2,5 0,5 66,67 2,11 0,71 cde<br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c, ...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức thống kê, α = 0,05.<br /> <br /> Khảo sát sự phát triển cây hợp cho sự phát triển cây với số rễ trung bình<br /> Các chồi phát triển tốt được cắt ngang và 11,33; chiều dài rễ trung bình 2,27 và số lá<br /> cấy thẳng đứng trên môi trường MS có bổ sung trung bình 6,67 (bảng 2). Kết quả này cũng phù<br /> IBA với các nồng độ khác nhau (bảng 2) để hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al.<br /> đánh giá khả năng tạo rễ. Kết quả cho thấy, ở tất (2002), Wei et al. (2006) [18, 20] qua nghiên<br /> cả các chồi rễ đều phát triển trên môi trường cứu khả năng tạo rễ từ chồi cây Bạch hoa xà<br /> MS có bổ sung IBA sau 2 tuần nuôi cấy. Môi trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA - tốt<br /> trường E1 (0,1 mg/L IBA) là môi trường thích nhất cho sự tạo rễ và tăng trưởng cây.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> c d<br /> b e<br /> f<br /> <br /> a g<br /> <br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển cây sau 2 tuần nuôi cấy<br /> Các chữ cái a, b, c,... trên hình 2 tương ứng với các môi trường E0, E1, E3 ở bảng 2.<br /> <br /> <br /> 164<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên sự phát triển cây bạch hoa xà từ<br /> chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy<br /> Môi Ký Nồng độ Tỷ lệ tạo Số rễ trung Chiều dài Số lá trung<br /> trường hiệu IBA(mg/L) rễ (%) bình/mẫu rễ (cm) bình/mẫu<br /> E0 a 0,00 100 4,33 d 2,93 a 4,00<br /> E1 b 0,10 100 11,33 ab 2,27 a 6,67<br /> E2 c 0,15 100 13,00 a(*) 1,30 b 6,33<br /> E3 d 0,20 100 9,00 bc 1,13 b 5,33<br /> E4 e 0,25 100 10,33 ab 1,07 b 5,00<br /> E5 f 0,30 100 12,67 a 0,97 b 5,67<br /> E6 g 0,35 100 5,67 cd 0,67 b 4,67<br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.<br /> <br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định sung nồng độ khác nhau của các chất điều hòa<br /> Kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo rễ bất định sinh trưởng IBA và NAA được trình bày ở<br /> từ lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ bảng 3.<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng IBA và NAA đến khả năng tạo rễ bất định từ lá<br /> và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy<br /> Hàm lượng (mg/L) Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (g TLT)<br /> IBA NAA Lá Đoạn thân<br /> 0 0,0 1,210 j 0,4300i<br /> b<br /> 0 0,1 2,610 0,6800 h<br /> bc<br /> 0 0,5 2,500 0,8200 gh<br /> gh<br /> 0 1,0 1,810 1,130f<br /> 0 1,5 1,700hi 1,220ef<br /> i<br /> 0,1 0,0 1,600 1,25 ef<br /> ef<br /> 0,1 0,1 2,000 1,780a(*)<br /> de<br /> 0,1 0,5 2,110 1,550bc<br /> d<br /> 0,1 1,0 2,190 0,8500g<br /> c<br /> 0,1 1,5 2,400 1,670ab<br /> hi<br /> 0,5 0,0 1,720 1,450cd<br /> 0,5 0,1 3,020 a(*)<br /> 1,230ef<br /> hi<br /> 0,5 0,5 1,710 0,7700gh<br /> gh<br /> 0,5 1,0 1,830 1,120f<br /> gh<br /> 0,5 1,5 1,830 1,250ef<br /> 1,0 0,0 1,830gh 0,8800g<br /> de<br /> 1,0 0,1 2,120 0,7700gh<br /> d<br /> 1,0 0,5 2,200 1,500c<br /> c<br /> 1,0 1,0 2,400 1,170ef<br /> b<br /> 1,0 1,5 2,580 0,8500g<br /> fg<br /> 1,5 0,0 1,870 0,7700gh<br /> c<br /> 1,5 0,1 2,380 1,300de<br /> gh<br /> 1,5 0,5 1,750 1,220ef<br /> j<br /> 1,5 1,0 1,310 1,120f<br /> j<br /> 1,5 1,5 1,240 1,180ef<br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.<br /> <br /> <br /> 165<br />  Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả các sung 1,0 mg/L IBA và 0,5 mg/L NAA. Lá là bộ<br /> công thức đều kích thích tạo rễ bất định sau 4 phận cho kết quả tạo rễ bất định tốt hơn so với<br /> tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, tổ hợp nồng độ IBA đoạn thân.<br /> 0,5 mg/L và NAA 0,1 mg/L có tác động tối ưu<br /> Khảo sát tạo rễ tơ<br /> đến sự hình thành rễ bất định ở lá với trọng<br /> lượng tươi rễ trung bình đạt 3,02 g; IBA 0,1 Hai tuần sau nuôi chung, chúng tôi nhận thấy<br /> mg/L phối hợp NAA 0,1 mg/L có tác động tối có sự hình thành rễ tơ ở một số mẫu lá (hình 4).<br /> ưu cho sự tạo rễ từ đoạn thân với trọng lượng Tuy chưa thực hiện phản ứng PCR các gen rol để<br /> tươi rễ trung bình đạt 1,78 g (bảng 3 và hình 8). khẳng định là rễ chuyển gen nhưng dựa vào tần<br /> Như vậy, kết quả nhận được cho thấy sự hình số tạo rễ cao (công bố ở bài báo khác), dựa vào<br /> thành rễ được kích thích mạnh khi có sự kết hợp quan sát hình thái rễ qua kính hiển vi (rễ có rất<br /> của IBA và NAA trong môi trường nuôi cấy; nhiều lông hút) và sự tăng sinh rất nhanh với tính<br /> kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu ổn định cao của chúng trong môi trường MS lỏng<br /> của Sivanesan & Jeong (2009) [16] khi cho rằng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng so với<br /> rễ được tạo ra tốt nhất trong môi trường có bổ mẫu rễ đối chứng, chúng tôi cơ bản cho rằng 5<br /> <br /> <br /> 166<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> dòng rễ tạo được là các dòng rễ tơ (2 dòng qua nghiên cứu của Verma et al. (2002) [18] khi kết<br /> dùng chủng vi khuẩn ATCC 11325 và 3 dòng luận sinh khối tươi của rễ tơ/rễ chuyển gen cao<br /> qua dùng chủng vi khuẩn ATCC 15834) (hình 5, gấp 2,5 lần so với rễ đối chứng.<br /> 6, 7). Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả<br /> <br /> <br /> a b<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Sự hình thành rễ tơ từ mảnh lá Hình 5. Rễ tơ từ mảnh lá chụp dưới kính hiển vi<br /> a. Rễ tơ từ mảnh lá ở giai đoạn 14 ngày sau nuôi (vị trí mũi tên) qua nuôi chung với<br /> chung với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325<br /> (vị trí mũi tên), b. Đối chứng (ĐC).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Đoạn rễ tơ (chụp qua kính hiển vi, do Hình 7. Rễ tơ (do Agrobacterium rhizogenes<br /> Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834) nuôi ATCC 15834) nuôi trong môi trường MS lỏng<br /> trên môi trường MS không bổ sung chất điều lắc không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sau<br /> hòa sinh trưởng 30 ngày<br /> <br /> KẾT LUẬN nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở giai<br /> đoạn tiếp theo.<br /> Trên đối tượng cây dược liệu bạch hoa xà<br /> (Plumbago zeylanica L.), qua thực hiện một số Đã tạo được 5 dòng rễ tơ qua xử lý gây<br /> nghiên cứu về nuôi cấy mô in vitro bao gồm nuôi nhiễm và nuôi chung mẫu lá với 2 chủng vi<br /> cấy đoạn thân mang chồi ngủ, nuôi cấy tăng sinh khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325<br /> chồi, tăng trưởng cây và nuôi cấy tạo rễ bất định và ATCC 15834. Các dòng rễ tơ này mang nhiều<br /> dùng môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung lông hút, có khả năng tăng sinh khối nhanh và ổn<br /> một số loại chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA, định khi được nuôi lắc (ở điều kiện tối) trong môi<br /> NAA) thích hợp với nồng độ thích hợp ở từng trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh<br /> giai đoạn nuôi cấy khác nhau; nghiên cứu đã xây trưởng.<br /> dựng được nguồn nguyên liệu cây in vitro có Lời cảm ơn: Các tác giả chân thành cảm ơn<br /> sinh trưởng tốt dùng cho nghiên cứu tạo rễ tơ Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về công<br /> <br /> 167<br />  Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> nghệ tế bào thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi 11. Parimala R., Sachdanandam P., 1983. Effect<br /> về trang thiết bị để thực hiện nghiên cứu này. of plumbagin on some glucose metabolizing.<br /> J. Ethnopharmacol., 37: 85-91.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 12. Ram A., 1996. Effect of Plumbago<br /> 1. Abebe D., Ayehu A., 1993. Medicinal plants Zeylanica in hyperlipidaemic rabbits and its<br /> and enigmatic health practices of northern modification by vitamin E. Indian J.<br /> Ethiopia. BSPE, Addis Ababa. Pharmacol., 28:161-166.<br /> 2. Aditi G., Anjali G., Singh J., 1999. New 13. Rang D. D., Dung N. X., 1996. Chemical<br /> naphtoquinones from Plumbago zeylanica. constituents of Plumbago zeylanica. J. of<br /> Pharm. Biol., 37: 321-323. Chemicals (Vietnam), 34: 67-70.<br /> 3. Bhargava S. K., 1994. Effects of plumbagin 14. Satheeshkumar K., Jose B., Soniya E. V. and<br /> on reproductive function of male dog. Seeni S., 2009. Isolation of morphovariants<br /> Indian J. Exp. Biol., 22: 153-156. through plant regeneration in Agrobacterium<br /> rhizogenes induced hairy root cultures of<br /> 4. Didery N., Dubrevil L., Pinkas M., 1994. Plumbago rosea L. Indian J. Biotechnol., 8:<br /> Activity of anthraquinonic and 435-441.<br /> naphtoquinonic compounds on oral bacteria.<br /> Die Pharm., 49: 681-683. 15. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009. Induction<br /> and establishment of adventitious and hairy<br /> 5. Duraga R., Sridhar P., Polasa H., 1990. root cultures of Plumbago zeylanica L. Afr.<br /> Effect of plumbagin on antibiotic resistance J. Biotechnol., 8(20): 5294-5300.<br /> in bacteria. Indian J. Med. Res., 91: 18-20.<br /> 16. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009.<br /> 6. Idayat T., Gbadamosi, Egunyomi A., 2010. Micropropagation of Plumbago zeylanica L..<br /> Micropropagation of Plumbago zeylanica L. Afr J. Biotechnol., 8(16): 3761-3768.<br /> (Plumbaginaceae) in Ibadan, Southwestern, 17. Sivanesan, 2007. Shoot regeneration and<br /> Nigeria. J. Med. Plant Res., 4(4): 293-297. somaclonal variation from leaf callus cultures<br /> 7. Kitanow G. M., Pashankov P. P., 1994. of Plumbago zeylanica Linn. Asian J. Plant<br /> Quantitative investigation on the dynamics of Sci., 6(1): 83-86.<br /> plumbagin in Plumbago europea L. roots and 18. Verma P. C., Singh D., Rahman L. U.,<br /> herb by HPLC. Pharmazie, 49: 462. Gupta M. M. and Banerjee S., 2002. In<br /> 8. Kubo I., Uchida M., Klocke J. K., 1983. An vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid<br /> insect ecolysis inhibitor from the African micropropagation and establishment of<br /> medicinal plant, Plumbago capsensis higher plumbagin yielding hairy root<br /> (Plumbaginaceae). Agric. Biol. Chem., 47: cultures. J. Plant Physiol., 159: 547-552.<br /> 911-913. 19. Vijver L. M, Looter A. P., 1971. The<br /> 9. Mohana K., Purushothoman K. K., 1980. constituents of the roots of Plumbago<br /> Plumbagin: a study of its anticancer, auriculata and P. zeylanica responsible for<br /> antimicrobial and antifungal properties. antimicrobial activity. Plant Med., 20: 8-13.<br /> Indian J. Exp. Biol., 18: 876-888. 20. Wei X., Gou X., Yuan T. and Russell S. D.,<br /> 10. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised 2006. A highly efficient in vitro plant<br /> medium for rapid growth and bioassays with regeneration system and Agrobacterium-<br /> tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: mediated transformation in Plumbago<br /> 473-479. zeylanica. Plant Cell Rep., 25: 513-521.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 168<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> CREATION OF IN VITRO MATERIALS AND INITIAL STUDY<br /> OF CREATING HAIRY ROOT FROM Plumbago zeylanica L.<br /> <br /> <br /> Bui Dinh Thach, Nguyen Minh Hieu, Pham Thi Phuong Uyen,<br /> Ngo Ke Suong, Nguyen Huu Ho<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> <br /> Plumbago zeylanica L. is a medicinal plant that contains high levels of the active ingredient plumbgin.<br /> With the goal of creating raw materials in vitro, 20-minute disinfection time, 10% solution is the optimum<br /> level to create templates in vitro (41.29%), MS medium supplemented with 1.5 mg/L BA and 0.1 mg L IBA<br /> create optimal shoots (4.67 shoots/sample) after 4 weeks of culture. In vitro shoots developed into the best<br /> tree in each MS supplemented with 0.1 mg / L IBA. Two strains of Agrobacterium rhizogen ATCC-15834<br /> and ATCC-11325 used for transgenic stimulation ofhairy roots from in vitro leaves. The initial results have<br /> been selected for hairy root 5 lines.<br /> Keywords: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, hairy root, in vitro.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 169<br />