Tóm tắt luận án: Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II)

24 1

(c). Các sensor huỳnh quang Hg2L2 và AMC đều có thể phát hiện Cys trong dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian của phản ứng xảy ra nhanh, có thể phát hiện được Cys với nồng độ thấp hơn trong nội bào và thấp hơn so với các sensor đã công bố.

MỞ ĐẦU Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) và Homocysteine (Hcy) là là những hợp chất thiol, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh học. Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh. Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người. Vì vậy, việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước.

5. Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính huỳnh quang của các chất dựa trên hình học tối ưu tại trạng thái cơ bản và các trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp phân tích NBO để xem xét sự biến đổi đặc tính huỳnh quang của các chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên kết. Kết quả tính toán cho thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang trong phức Hg2L2. Sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC- Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích thích electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc Kasha. Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp huỳnh quang. Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể phân tích các chất trong tế bào sống.

Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W. Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992. Với những ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại, anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007 bởi tác giả Dương Tuấn Quang.

Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…). Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, -S trong vòng hoặc ở mạch hở.

2 23

NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

Tuy nhiên, đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II).

1. Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai sensor huỳnh quang mới là L và AMC. Sự kết hợp linh hoạt này đã giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và thực nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả năng thành công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hiện nay, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh quang nói riêng. Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại. Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố. 2. Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được nghiên cứu dự đoán từ tính toán và khẳng định từ kết quả tổng hợp thực nghiệm sau đó.

Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) ".

3. Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu và khẳng định từ các kết quả thực nghiệm.

Những đóng góp mới của luận án: - Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất của Hg(II) với L (Hg2L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys bằng Hg2L2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.

4. (a). Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự có mặt các ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang là 0,076 μM và 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM. Phức Hg2L2 có thể phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. Sensor L phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys.

- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. - L và AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (b). Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys, GSH, Hcy) trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. Sensor AMC phản ứng với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo cơ chế phản ứng AMC cộng Michael. 1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang 1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang

22 3

Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0 tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm. Trong khi đó, các quá tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 trình chuyển electron từ S2 về S0 của AMC-Cys là xảy ra. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171; điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC-Cys quan sát được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3 nm là mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm. Ngoài ra, do quá trình chuyển electron từ S2 về S1 tại cấu hình REES1, với cấu hình S2 tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá trình (6) ở Hình 3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình 3.48b. Đó có thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (340,3 nm) mạnh hơn rất nhiều so với ở bước sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong thực nghiệm.

1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang 1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang 1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang 1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và phương pháp phát hiện 1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng 1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol 1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II) 1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II) 1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II) 1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol 1.4.1. Dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde 1.4.2. Dựa trên phản ứng cộng Michael 1.4.3. Dựa trên phản ứng ghép nối peptide 1.4.4. Dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm 1.4.5. Dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester bởi thiol 1.4.6. Dựa trên phản ứng phân tách disulfides bởi thiol 1.4.7. Dựa trên phản ứng hình thành và phân hủy phức 1.4.8. Dựa trên các cơ chế khác 1.5. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) 1.5.1. Dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II) 1.5.2. Dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) 1.6. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên fluorophore là cyanine và coumarin 1.7. Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu các sensor huỳnh quang CHƯƠNG 2 Đối với AMC-Hcy và AMC-GSH (tương tự AMC-Cys). Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các trạng thái kích thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC- GSH cho thấy, đối với sensor AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu hình REES1 và REES2, điều này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa hai tiểu phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy bị phân tách mạnh. Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa các MO trong các bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích của sensor AMC. Ngược lại, tại REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy nằm trong cùng một mặt phẳng. Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen phủ giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu 2.2. Nội dung nghiên cứu

Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của sensor AMC và các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt nguồn từ trạng thái S1. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc của Kasha. - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc các biothiol và ion Hg(II):

4 21

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của sensor L. + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L. + Nghiên cứu lý thuyết về ứng dụng của sensor L phát hiện ion Hg(II).

quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực nghiệm. Ngoài ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ S0→S2 (quá trình (2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0 (quá trình (4) ở Hình 3.48a). Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn cường độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong thực nghiệm. + Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L) phát hiện các biothiol. Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo.

(a)

(b)

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc các biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng của sensor AMC với các biothiol. + Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor AMC. + Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của

sensor AMC. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết

(d)

(c)

- Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn được thực hiện bằng phương pháp DFT tại B3LYP/LanL2DZ, sử dụng phần mềm Gaussian 03.

- Các thông số năng lượng tương tác được hiệu chỉnh ZPE gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng của các sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia.

- Tính toán trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời gian được thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết. - Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý

Hình 3.48. Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái kích thích electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC;

(b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

thuyết B3LYP/LanL2DZ. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

20 5

- Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi các phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS. 3.2.3.2. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang a. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích - Đặc tính, ứng dụng của các sensor được thực hiện bởi phương pháp quang phổ huỳnh quang và UV-Vis.

- Các điều kiện tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa trên kết quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm công bố trước đây về các phản ứng tương tự [2], [3], [29]. Quy trình tổng hợp các sensor được tóm tắt như sau:

Từ kết quả tính toán cho thấy, trong sensor AMC, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích S1 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn nhất là 0,5348, tại bước sóng 320,9 nm. Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO, với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21%. Bên cạnh đó, sự xen phủ giữa HOMO và LUMO là rất lớn, điều này cho thấy việc chuyển electron từ HOMO sang LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.

a. Tổng hợp sensor L * Tổng hợp CBZT 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic (4,18 g, 0,03 mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 8 giờ. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa nhiều lần với ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất rắn CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%).

* Tổng hợp sensor L CBTZ và (290mg,1mmol)

Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số liệu tính toán cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lần lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất nhiều so với các bước chuyển khác), tại các bước sóng tương ứng là 300,6; 300,4 và 300,7 nm. Trong các bước chuyển trạng thái này, bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển chính, với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17; 89,05 và 89,24%. Mặt khác, sự xen phủ giữa HOMO-1 và LUMO là rất lớn, nên việc chuyển electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.

Kết quả phân tích các MO biên cũng cho thấy, không có sự xen phủ giữa HOMO và HOMO-1. Do đó, trong AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến HOMO-1. Kết quả, các chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC- GSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở thực nghiệm. b. Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang

4-diethylamino-2- hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL ethanol tuyệt đối. Thêm 1 giọt piperidine, dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10 giờ, sau đó làm nguôi đến nhiệt độ phòng. Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều lần bởi diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng 3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%). b. Tổng hợp AMC Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu được dung dịch. Làm lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 0 oC. Thêm từ từ (trong khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng từng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL). Sau đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm nước vào dung dịch thu được để hòa tan các muối amine. Tiếp tục rửa sạch pha hữu cơ thu được bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình là bị cấm. Tại cấu hình REES2, các chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là xảy ra. Thêm vào đó, quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều này dẫn đến cường độ huỳnh

6 19

huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol + các amino acids với các dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b).

muối MgSO4 khan. Làm bay hơi dung môi hữu cơ trên máy cô quay chân không. Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng cách kết tinh lại trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.38. (a) Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH

=7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) trong sự hiện diện của hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr và Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH

3.1. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất của cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức 3.1.1. Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp, đặc trưng của sensor L 3.1.1.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ đã được áp dụng cho hệ nghiên cứu.

d. Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys

Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các dạng này đều có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor. Trong đó, donor (nhóm đẩy electron) là một nhóm amino; aceptor (nhóm rút electron) là ion amoni. Chúng được biết đến là những hợp chất màu, phát huỳnh quang mạnh [40].

Fluorophore

OHC

BrCH2COOH

Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau:

(II)

(I)

-O2C

L

BZT

CBZT

Receptor

Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], với R = 0,982. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys đã được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. 3.2.3. Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của AMC 3.2.3.1. Hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH ở trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích electron Đối với sensor AMC, ở trạng thái cơ bản S0, tiểu phần coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng. Trong khi đó, ở trạng thái kích thích electron S1(REES1) và S2(REES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau.

Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là nhóm có ái lực mạnh với ion Hg(II); các phản ứng tổng hợp L thực hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) và giai đoạn (II).

Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, trong các cấu hình S0(RGS) và S1(REES1), có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và acryloxy. Trong khi đó, ở cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng.

18 7

Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I) dựa trên phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic [29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa trên phản ứng phản ứng cộng andol và ngưng tụ croton [3]. a. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I)

S

CH3CH2OH

(1)

Br-

BrCH2COOH

(6)

+ CH3CH2OH2

N+

N

N+

BZT

CBZT-1

COOH

COOH...Br-

COO-

S

CBZT-3

CBZT

(2)

HBr

BrCH2COOH

N+

N

S

H2O

COO-

BZT

CBZT-2

(7)

Br-

H3O+

S

N+

(3)

BrCH2COOH

COOH...Br-

COO-

N+

N

CBZT-3

CBZT

COOH...Br-

BZT

CBZT-3

Trong khi đó, dung dịch sensor AMC tự do hiển thị một dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375 nm và 450 nm (Hình 3.33b). Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ) của sensor AMC đã được xác định là 0,05. Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần ở cả hai đỉnh phát xạ. Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước sóng dài tăng mạnh hơn cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước sóng ngắn. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng 375 và 450 nm như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng để xác định Cys. b. Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys

S

OH-

(4)

Br-

(8)

BrCH2COOH

H2O

N+

N

Br-

N+

COOH

BZT

CBZT-4

COOH...Br-

COO-

Br

S

CBZT-3

CBZT

(5)

BrCH2COOH

N

COOH

BZT

CBZT-5

Hình 3.3. Các phản ứng hình thành CBZT từ CBZT-3

Hình 3.2. Các sản phẩm có thể có từ phản

ứng giữa BZT với acid bromoacetic

Khi thêm Cys từ 0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys. Sau đó, tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys. Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ mol 1:1 (tương tự Hcy và GSH). Kết quả này phù hợp với kết quả thu được khi xác định hệ số tỷ lượng của phản ứng giữa AMC với Cys bằng phương pháp đồng phân tử gam và phân tích phổ khối lượng của sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys. c. Khảo sát ảnh hưởng của các amino axit cạnh tranh

(9)

H2O

N+

Phản ứng hình thành CBZT từ BZT và acid bromoacetic được trình bày ở Hình 3.2 và 3.3. Kết quả tính toán cho thấy, phản ứng giữa BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm để hình thành CBZT là thuận lợi về mặt nhiệt động. b. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (II)

L-1

COO-

(10)

H2O

N+

Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung các amino acids có chứa thiol, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng 450 nm và tăng vừa phải ở bước sóng phát xạ 375 nm. Tuy nhiên, mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys> GSH> Hcy (Hình 3.38a).

Hình 3.5. Các sản phẩm phản ứng có thể hình thành giữa CBZT với DHB

8 17

3.1.1.2. Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của L a. Cấu trúc phân tử của L

ester tạo bởi acid acrylic và các ancol (thường là các fluorophore), ban đầu tạo ra các thioether, tiếp theo là hình thành các hợp chất dị vòng đối với trường hợp của Cys và Hcy. Trong khi đó, các thioether của GSH thường bền, không xảy ra quá trình tạo các hợp chất vòng sau đó.

Hình 3.6. Hình học bền của L ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

Khác với nghiên cứu trên, kết quả tính toán về mặt nhiệt động cho thấy, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol (bao gồm Cys, Hcy và GSH) để hình thành các thioether theo tỉ lệ mol 1:1 là thuận lợi về mặt nhiệt động. 3.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của AMC 3.2.2.1. Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm AMC đã được Chiều dài các liên kết, số đo các góc liên kết, góc nhị diện trong L đã được tính toán. Trong đó, các acid phần BZT, tiểu bromacetic và DHB ít thay đổi so với ban đầu. Trong L có sự hình thành liên kết mới giữa N7 và C11 và liên kết đôi giữa nguyên tử C10 và nguyên tử C12. b. Phân tích phổ UV-Vis của sensor

khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS. 3.2.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC a. Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC

Phổ UV-Vis của sensor L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm. Trong một công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự như sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại ở 405 nm, là một chất phát xạ huỳnh quang mạnh ở bước sóng 495 nm. Kết quả này dẫn đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của L tương tự BZTVPA. c. Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L

Bảng 3.5. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên

quan đến quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển S0→S1

Năng lượng (eV) 2,53

Bước sóng (nm) 489,8

0,2566

Tỷ lệ % đóng góp 56,44

95→97

96→97

35,80

S0→S2

93→97

2,74

452,6

0,5626

29,22

Hình 3.33. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM)

95→97

28,63

trong C2H5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) tại 25C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang,

96→97

28,66

AMC (10 μM) khi thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys

5,90

S0→S3

92→97

2,86

432,9

0,0097

trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25C, bước sóng kích thích 320 nm

93→97

8,83

94→97

77,56

5,42

S0→S4

92→97

3,00

413,2

0,5815

93→97

49,94

Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ của dung dịch sensor AMC tự do đạt cực đại tại bước sóng 275 và 320 nm. Khi thêm Cys vào dung dịch của sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không đáng kể.

Bước chuyển

Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

94→97

Tỷ lệ % đóng góp 10,62

95→97

9,35

96→97

11,07

S0→S5

92→97

3,05

406,0

0,0060

86,61

93→97

7,68

S0→S6

90→97

3,92

316,7

0,0051

44,35

91→97

41,32

16 9

96→97

8,40

0,998. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã được xác định tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. 3.2. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael 3.2.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol 3.2.1.1. Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại ở bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159].

Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4- metylcouramin) từ dẫn xuất của coumarin dùng để phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7- hydroxylcoumarin được chọn làm fluorophore, còn receptor là acryloyl chloride, vì phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với dẫn xuất axit [2] và receptor này có thể gây ra phản ứng cộng với các biothiol.

Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: Kết quả tính toán (Bảng 3.5) cho thấy, các trạng thái kích thích có cường độ dao động lớn là S0→S1, S0→S2 tại các bước sóng tương ứng lần lượt là 489,8 nm và 452,6 nm đều có sự đóng góp khá lớn (tương ứng là 35,80% và 28,66%) của bước chuyển electron từ MO-96 lên MO-97. Do đây là các MO liên tiếp, nên không có quá trình PET nào can thiệp đến bước chuyển này. Kết quả này dẫn đến một kỳ vọng rằng L là hợp chất phát huỳnh quang. 3.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L 3.1.2.1. Thực nghiệm tổng hợp L

Fluorophore

Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm CBZT và L đã

+

(B)

HCl

+

(A)

được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ FAB-MS. 3.1.2.2. Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II) a. Khảo sát phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L

AMC

Receptor

Hình 3.29. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM)

trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) trong C2H5OH/H2O

(1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

Kết quả tính toán cho thấy, ΔG298 của phản ứng tổng hợp sensor AMC là âm, theo đó phản ứng tổng hợp sensor AMC là thuận lợi về mặt nhiệt động. 3.2.1.2. Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây, phản ứng cộng Michael giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các

10 15

Như dự đoán từ tính toán, L phát huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175; bước sóng huỳnh quang cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm. b. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.24 cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2: ở phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần dần biến mất, đồng thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước sóng 540 nm; ở phổ huỳnh quang, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại. b. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản ứng của Hg2L2 với các biothiol

Hình 3.11. Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0

μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM)

Hình 3.25. (a) Phổ huỳnh quang của Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v)

trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm

tại 25 oC khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly,

Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His (Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên

ngoại trừ Cys, Hcy và GSH). (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch

Hg2L2 (2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác

Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng và làm thay đổi phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L. Cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm dần khi tăng nồng độ Hg(II). c. Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II)

Kết quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ các amino acids có chứa nhóm thiol mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang của dung dịch. Các amino acids khác không chứa nhóm thiol hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch phức Hg2L2. Điều này cho thấy, phức Hg2L2 như một sensor huỳnh quang để phát hiện chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các amino acids không chứa nhóm thiol. Kết quả thí nghiệm ở Hình 3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp đến là GSH, Hcy. c. Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát hiện định lượng Cys

Hình 3.12. Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản

Hình 3.12 cho thấy, cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm mạnh khi nồng độ ion Hg(II) tăng từ 0 đến 5,0 M; và sau đó giảm không đáng kể khi tiếp tục tăng nồng độ ion Hg(II). Điều này cho thấy L phản ứng với Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1.

ứng giữa ion Hg(II) với L (L (5,0 M) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH ~7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm

Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5 μM, biến thiên cường độ huỳnh quang (F585) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể hiện bởi phương trình F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R =

14 11

d. Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại cạnh tranh 3.1.4. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát hiện các biothiol 3.1.4.1. Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ các phản ứng tạo phức

Hằng số bền của phức đã được xác định bằng phương pháp chuẩn độ huỳnh quang. Kết quả tính toán đã xác định được hằng số bền của phức Hg2L2 bằng 1017,45 (M-3). Trong khi đó, hằng số cân bằng tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với các biothiol RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) đối với Cys, GSH, Hcy tương ứng là 1020,1; 1020,2 và 1019,7. Vì vậy, phản ứng giữa Hg2L2 với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với các biothiol và giải phóng L tự do có thể xảy ra.

Hình 3.13. Phổ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của L (1,5 μM) với sự hiện diện của các ion

kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho mỗi ion kim loại) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14) Sự biến thiên của năng lượng tự do của phản ứng tạo Hg2L2

Kết quả nghiên cứu về mặt nhiệt động của sự tương tác giữa ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy ra vì có ΔG298 là âm nhất (ΔG298 = -821,6 kcal.mol-1)

+ 80H-

Hg(Cys)2

Hg2L2 + 4 H2Cys

+ 8 H20 + 2L

từ ion Hg(II) và sensor L là -410,2 kcal.mol‾1. Do đó, phản ứng sau xảy ra (vì có ΔG298 là -1232 kcal.mol-1):

Hình 3.13 cho thấy, không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào trong phổ UV-Vis cũng như phổ huỳnh quang khi thêm các ion kim loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) với nồng độ gấp 5 lần so với L. Như vậy, L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự hiện diện các ion này. e. Khảo sát sử dụng sensor L phát hiện định lượng ion Hg(II) 3.1.4.2. Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol a. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của Hg2L2

Hình 3.24. Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch

Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, ở 25C khi thêm 0-10

μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm

Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L: biến thiên mật độ quang (ΔA540) và biến thiên cường độ huỳnh quang (∆I585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) bởi các phương trình tương ứng: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng phương pháp trắc quang tương ứng là 15,3 μg/L và 51,2 μg/L hay 0,076 μM và 0,25 μM và phương pháp huỳnh quang tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM. 3.1.3. Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.16. Hình học bền của phức Hg2L2

tại mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

12 13

a. Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2

Bảng 3.8. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến quá trình kích thích chính của Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

Tỷ lệ % đóng góp

S0→S1

201→203

1,29

961,2

0,0838

4,63

202→203

30,06

202→204

59,58

S0→S2

201→203

1,37

903,4

0,5913

2,41

201→204

3,99

202→203

53,12

202→204

24,77

S0→S3

201→203

1,57

788,7

0,1063

38,83

201→204

39,46

Kết quả tính toán sự hình thành phức giữa ion Hg(II) và L theo tỷ lệ mol 1:1 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có một cấu trúc hình học bền được tìm thấy là Hg2L2 và được thể hiện ở Hình 3.16. Sự hình thành phức Hg2L2 là thuận lợi về mặt nhiệt động, với giá trị ∆G298 là -410,2 kcal mol-1. Các liên kết tạo phức gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, và O26O71. Các liên kết này hình thành được cho là dựa trên kết quả tính toán khoảng cách giữa các nguyên tử nhỏ hơn đáng kể so với tổng bán kính Van der Waals của nguyên tử tham gia liên kết.

S0→S4

201→203

1,59

778,5

0,0647

32,24

201→204

43,20

202→204

3,52

S0→S5

197→203

1,93

642,3

0,0183

2,66

199→203

50,52

199→204

10,31

Để khẳng định cấu trúc của phức Hg2L2, phân tích AIM đã được tiến hành. Kết quả phân tích cho thấy: có sự tồn tại các điểm tới hạn liên kết (BCPs) giữa các điểm tiếp xúc giữa các phối tử O, S với Hg(II), các liên kết này là liên kết cộng hóa trị và có sự tồn tại các điểm tới hạn vòng RCPs giữa các tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu trúc vòng)

200→203

25,64

S0→S5

201→205

2,29

S0→S6

198→204

1,95

636,4

0,0121

2,30

199→203

19,80

199→204

2,57

200→204

27,67

Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào bản chất electron của các liên kết, phân tích NBO cũng được tiến hành. Kết quả cho thấy, L tự do có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát huỳnh quang); L trong phức: cặp electron của N7 không còn liên hợp vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có sự chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang của phức. b. Phân tích đặc tính huỳnh quang của phức Hg2L2

Kết quả tính toán ở Bảng 3.8 cho thấy, sự hình thành phức Hg2L2 đã dẫn đến sự chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ các phối tử L đến các ion kim loại Hg(II) trung tâm và thu hẹp khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO. Kết quả, ở trạng thái kích thích chính (cường độ dao động lớn nhất và bằng 0,5913) từ S0→S2, với sự đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có năng lượng kích thích rất nhỏ là 1,37 eV. Điều này dẫn đến bước sóng phát xạ huỳnh quang của phức sẽ chuyển về vùng bước sóng dài, lớn hơn 900 nm. Vì vậy, trong thực tế không phát hiện được huỳnh quang từ phức Hg2L2.

24 1

(c). Sensors Hg2L2 and AMC is for the detection of Cys in a small amount of organic solvent, the reaction time occurs fast can detect Cys with lower concentration than that in the intracellular and lower than that in the similar sensors of previous studies.

INTRODUCTION Cysteine (Cys), glutathione (GSH), and homocysteine (Hcy) are thiol compounds play vital roles in many biological processes. Mercury is one of popular dangerous pollutants which can cause serious effects to human’s health. Therefore, that the determination of biothiol in living cells and water sources helps diagnose related diseases and protect habitats and has caught much attention from local and oversea scientists.

ions and Hg(II) high-performance

Many methods have been used for the detection of different biothiols liquid like chromatography, mass spectrometry,…,and fluorescent method. Among them, fluorescent method has outstanding benefits than other optical methods in term of investment of less expensive equipments and its simplicity. Furthermore, it can be applied to analyze many diffrent substances especially those in living cells.

5. TD-DFT method is used to study the fluorescent properties of substances based on the optimized geometry at the ground state and the excited one in the combination with NBO analysis to consider the the change of the fluorescent properties of substances, based on the nature of bondings. The results of calcuations shows that ion Hg(II) creates complexion reactions with L, leading to the decrease in the energy distance between HOMO and LUMO in the meantime change the conjugated π-electron system, which is the cause for the fluorescence quenching in the complextion of Hg2L2. All the fluorescent emission of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH comes from the higher-lying electron excited states (S2, S4) to the ground state S0. This is an exceptional case of Kasha rule.

to detect metal

Professor Czarnik at Ohio University studied Fluorescent method and proposed a new approach to the field of sphere optical sensor in 1992. With advantages of fluorescent method, studies of fluorescent sensors ions, anion, especially biomolecules is paid much attention by many local and oversea scientists, that have announced more and more Fluorescent sensors all over the world. In Vietnam, the study of the fluorescent sensors has been conducted by Duong Tuan Quang since 2007.

limited detection concentration, for high just

To detect biothiols, the studies have designed fluorescent sensors based on the characterized reaction of biothiol, complex reactions (complex between fluorescence and ion Cu(II)..). The studies of fluorescent sensors detect Hg(II) based on the characterized reaction of ion Hg(II) and complex reactions between ion Hg(II) and legands - O,-N,-S in closed and opened circuit. However, most of these sensors have shortcomings like the use of a large amount of organic solvents, short the excitation/emission wavelengths causing bad effects to living cells and slow reaction between sensors and analytes. Now, scientists are

2 23

continuing to study and design fluorescent sensors with high sensitivity and selectivity to detect biothiols and ions Hg(II).

At present, quantum chemical calculations have been become an important tool in chemical studies in general and fluorescent sensors in particular. The combination between quantum chemical calculations and experimental studies is a modern trend in which, however, the numbers of studies announced in fluorescent sensors is still limited. CONCLUSIONS 1. Flexible combination between quantum chemical calculations and experimental studies has been successfully applied for research and development of two new fluorescent sensors including L and AMC. This decreases the calculations of the theory and experiment, saving the time and expense for the chemicals, increase the possibility of success, clarify the nature of the proccesses and set ground for the further study.

2. Synthesis reactions sensor L and sensor AMC are studied, anticipated from calculations and afterwards verified from the synthesis results.

through contrastive 3. The structures, characteristics of sensor L and sensor AMC are determined at theoretical levels of B3LYP/LanL2DZ bringing about reliable results tests and verification from experiment results.

From demand and situation of studies in the fluorescent sensors in the world and Vietnam, we have conducted the project “Design, synthesis of fluorescent sensors from cyanine and coumarin derivatives to detect biothiol and Hg(II)” New findings of the thesis: - A new fluorescent sensor L designed from derivatives of cyanine which has been reported, selective detection of Hg(II) ions, based on complexation reaction, ON-OFF mechanism; the complex of Hg(II) with L (Hg2L2) selective detection of Cys, based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by L is 11,8 μg/L and 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively; limit of detection and limit of quantification Cys by Hg2L2 is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively.

- A new fluorescent sensor AMC designed from derivatives of coumarin which has been reported, selective detection of Cys based on Michael addition reaction, based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two different wavelengths. The limit of detection and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. 4. (a). Sensor L is for selective detection of Hg(II) ions, in the presence of ther metal ions, based on fluorescent ON-OFF mechanism. The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by colorimetric method is 0,076 μM and 0,25 μM; and by fluorescent method is 0,059 μM and 0,19 μM. Complextion of Hg2L2 is for selective detection of Cys in the presence amino acids without thiol groups based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The limit of detection and the limit of quantification Cys is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively. Sensor L for the detection of ion Hg(II) and complextion Hg2L2 for the detection of Cys, based on complexation reaction between core ions Hg(II) with two ligands of L and Cys. - L and AMC studyed by flexible combination quantum chemical calculations and experimental studies. Chapter 1. OVERVIEW

(b). Sensor AMC is for the selective detection of biothiols (Cys, GSH, Hcy) in the presence of amino acids without thiol groups, based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two different wavelengths. The limit of detection and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. Sensor AMC reacts with biothiols (Cys, GSH, Hcy) based on Michael addition reaction.

1.1. Overview of fluorescent sensors 1.1.1. Current situation of fluorescent sensors 1.1.2. Operating principles of fluorescent sensors 1.1.3. Structure of fluorescent sensors 1.1.4. Design principles of fluorescent sensors

22 3

For AMC-Cys, electron transitions from S1 to S0 at REES1 and REES2 are forbid. Meanwhile, electron transitions from S2 to S0 at REES1 and REES2 occur. In addition, because the oscillator intensity (f) of both processes are very large, while the oscillator intensity (f) at the wavelength of 340,3 nm is 0,5122, and obviously 0,3171 larger than that at the wavelength of 324,5 nm. This leads to the fact that fluorescence intensity of AMC-Cys observed in experiment is very strong, and that at the long wavelengths of 340,3 nm is stronger than short wavelengths of 324,5 nm. Besides, because the transitions processes of electron from S2 to S1 at REES1, with the S2 respectively do not have minimum energy, so processes (6) at Fig.3.48b is less dominant than processes (4) at Fig.3.48b. That may be another cause leading to fluorescence intensity at long wavelengths (340,3 nm) which is very stronger than the fluorescence intensity at short wavelengths (324,5 nm) as observed in experiment. This may be another cause to make fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm), as observed in the experiment.

1.2. Roles of biothiols in cells and methods for detection 1.2.1. Biothiol và and roles of them 1.2.2. Method for detection of biothiols 1.3. The sources of pollution, toxicities and methods for detection of Hg(II) ions 1.3.1. The sources of pollution, toxicities of Hg(II) ions 1.3.2. Method for detection of Hg(II) ions 1.4. Fluorescent sensors for detection of biothiols 1.4.1. Based on the cyclization reactions with aldehydes 1.4.2. Based on the Michael addition reactions 1.4.3. Based on the native chemical ligation of peptide reactions 1.4.4. Based on the aromatic substitution-rearrangement reactions 1.4.5. Based on the cleavage of sulfonamide or sulfonate ester reactions by thiols. 1.4.6. Based on the cleavage of disulfides reactions by thiols 1.4.7. Based on the reactions complexation and decomplexation 1.4.8. Based on the mechanisms 1.5. Fluorescent sensors for detection of Hg(II) ions 1.5.1. Based on the reactions complexation with Hg(II) 1.5.2. Based on the characteristic reactions of Hg(II) ions. 1.6. Fluorescent sensors for detection of biothiol and Hg(II) ions based on the fluorophore are cyanine and coumarin 1.7. Overview of application of computational chemistry in the study on fluorescent sensors Chapter 2. RESEARCH CONTENTS AND METHODS

2.1. Research objectives 2.2. Research contents For AMC-Hcy and AMC-GSH (similarly, AMC-Cys). As presented, the research results on optimum geometry with excited states of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH show that for AMC, there are twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties at REES1 and REES2, causing the breakdown of the π- electron conjugate system between two moieties, which in turn leads to the fact that the electron density between the coumarin moieties and acryloxy moieties is strongly fragmented. As a result, there is very little overlap between the MOs in electron transfer at the excitation state of the sensor AMC. In contrast, at REES2 of AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane. This is a favorable factor for the overlap between MOs in the state transitions.

- Study on the design, synthesis, characteristics, and applications of cyanine derivatives based on sensor L for selective detection of biothiols and Hg(II) ions: The above analysis shows that the fluorescence of the sensor AMC and its additive products with the biothiolis are not derived from the S1 state. This is an exceptional case of Kasha rule. + Theoretical study on design, synthesis and characteristics of sensor L.

4 21

+ Experimental research on characteristics and application of sensor L. + Theoretical research on the application of the sensor L detects Hg (II).

+ Study the use of complex (form by Hg(II) ions with sensor L) detection of biothiol. In particular, theoretical research is conducted first to guide the study of the application of the next complex

processes (3) and (4) above is not large enough (0,0137 and 0,0152), this results leads to the fact that fluorescence intensity of AMC is as small as observed in experiment. Moreover, because the excitation process from S0→S1 (process (1) in Figure 3.48a) has much greater oscillator intensity than that from from S0→S1 (2) in Fig 3.48a), so the transfer process of electrons from S1→S0 (process (3) in Fig. 3.48a) will be more dominant than that from S2→S0 (process (4) in Fig.3.48a). This may mainly cause the fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm) as observed in the experiment.

- Study on the design, synthesis, characteristics, and application of coumarin derivatives based on sensor AMC for selective detection of biothiols:

(a)

(b)

+ Study of design theory, synthesis of sensor AMC and reaction of sensor AMC with biothiols. + Experimental research on the synthesis, characteristics and applications of sensor AMC. + Theoretical study on characteristics and applications of sensor AMC.

2.3. Research methods 2.3.1. Theoretical calculation methods - The determination of

the structure of geometry optimizations and single point energy was carried out by the density functional theory (DFT) method with the software of Gaussian 03.

(d)

(c)

(d)

- The interaction energies adjusted for ZPE includesthe variation of enthalpy and variation of Gibbs free energy were derived as the differences between the total energy of the reaction products and the energy of the reactant substances.

- The calculation of the excited state and the time-dependent factors was carried out using time-dependent density functional theory (TD-DFT) at the same theory level as the geometry optimisation procedure. - The analysis of AIM and NBO was executed at the

B3LYP/LanL2DZ level of theory. 2.3.2. The experimental investigation methods - The structures of compounds were confirmed by 1H -NMR

Fig.3.48. Energy diagrams of excitation processes and excitation energy release at geometry in ground state (RGS) and electron excitation states (REES1, REES2,...) at theoretical level B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

and 13C- NMR spectrum, mass spectrometry.

20 5

- The characteristics and applications of the sensors were state S1 (REES1), S2 (REES2), the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in two planes perpendicular to each other. performed by fluorescence spectroscopy and UV-Vis spectroscopy.

- The conditions of sensors synthesis have been studied based on the predicted results from theoretical calculations and previous experimental results [2], [3], [29] on similar reactions. The synthesis process is summarized as follows:

For AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH have twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties in the RGS and REES1. In REES2 and the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane. 3.2.3.2. Research theories of spectral excitation and fluorescence spectrum a. Theoretical study on excitation and fluorescents pectra

a. Sensor L synthesis: * The synthesis of CBTZ 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) and bromoacetic acid (4,18 g, 0,03 mol) were dissolved in 50 mL absolute ethanol. The mixture was boiled for 8 hours to, then cooled to room temperature until the precipitation was formed. This precipitation was washed with ethanol in alkali solution for several times, then dried to get the solid CBTZ (4,0 g, 75% yield).

The calculated results show that in the sensor AMC, the singlet electronic transition from S0 ground state to S1 excited state is the main transition with the greatest oscillator strength (f) of 0,5348 at 320,9 nm wavelength. The S0→S1 transition is the main contribution to transition from HOMO→LUMO, with a percentage contribution up to 96,21%. Besides, the overlap between HOMO and LUMO is very large, which shows that the transfer of electrons from HOMO to LUMO is favorable. The transition of other states have a small unnoticeable oscillator intensity (f). * The synthesis of L CBTZ

Meanwhile, with AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH, calculated data show that the singlet electronic transition from S0 to S2 is the main transition with oscillator intensity (f) of 0,3723; 0,3694 and 0,3801, respectively (much larger than other transfers) at the wavelength of 300,6; 300,4 and 300,7 nm, respectively. In the transition of the states, the transfer of electrons from HOMO-1→ LUMO is the main transition with a percentage contribution of 89,17; 89,05 and 89,24%, respectively. On the other hand, the overlap between HOMO-1 and LUMO is very large so the transfer of electrons from HOMO-1 to LUMO is very favorable. Other transitions of states have small, unnoticiable oscillator strength (f).

The analyzed results of the MO frontier also show that there is no overlap between HOMO and HOMO-1. Thus in AMC-Cys, AMC- Hcy and AMC-GSH do not occur in the PET process from HOMO to HOMO-1. As a result, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH are fluorescents as presented in the experiment. b. Theoretical study on fluorescent spectra

(290 mg, 1 mmol) and 4-diethylamino-2- hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) were dissolved in 30 mL of absolute ethanol. With the addition of one drop of piperidine, the reaction solution turns red immediately. The reaction was kept boiling for 10 hours to cool to room temperature. The precipitation was formed and filtered, washed for several times with diethyl ether and then dried for the desired product L (3,0 g, 38% yield). b. Sensor AMC synthesis: 4-Methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) and Et3N (7.9 mL, 56,4 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (20 mL) with small addition of a catalyst amount of 4-dimethylaminopyridine to get a solution. The solution is made cool and keep at 0 oC. Each drop of acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) is gradually added to the reaction solution in an hour. Then, the solution was stirred for 2 hours at room temperature and water was added to dissolve the amine salt. The organic phase was washed with aqueous solution and then dried over MgSO4. After the solvent was For sensor AMC, at REES1, the electron transition from S1 and S2 to S0 are forbidden. At REES1, the lectron transition from S1 and S2 to S0 occur. In addition, because the oscillator intensity (f) of both

6 19

evaporated, the product was purified by recrystallization from ethanol to form a white crystalline solid (1,0 g, 45%, yield). Chapter 3. RESULTS AND DISCUSSION

) u

For other amino acids without thiol groups do not change distinct fluorescence variations of sensor AMC solution (Fig.3.38a). The presence of this miscellaneous amino acids also do not have effect on the reation between AMC and biothiols (Cys, GSH and Hcy) with the clue that there is no significant difference between the fluorescence spectrum of solutions (AMC + biothiol + amino acids) with solutions (AMC + biothiol) (shown in Fig.3.38b).

. a (

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Wavelength/nm

3.1. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor L from cyanine derivatives for detection of biothiols and Hg(II) ions based on the reactions complexation 3.1.1. Theoretical study on design, synthesis, characteristics of sensor L 3.1.1.1. Theoretical study on design, synthesis of sensor L B3LYP/LanL2DZ levels of theory was applied for of research. Cyanine including derivatives

R2N+=CH[CH=CH]n- NR2,Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, which all have the same structure, donor - π conjugated system - acceptor. Here, donor (the electron of push group) is an amino group; aceptor (the electron of withdrawal group) is amoni ions. They are known as color compounds with strong fluorescence [40]. Sensor L the design is planned as shown in the following

Fig.3.38. (a) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7,4, 1/4, v/v, at 25 oC) upon addition of Cys, Hcy, GSH, others amino acids (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val). (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7.4, 1/4, v/v, at 25 oC) in the presence of others amino acids mixture (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val) when upon addition of Cys, Hcy, and GSH

synthesis diagram:

OHC

BrCH2COOH

d. The survey on the use of sensor AMC to detect Cys

(II)

(I)

-O2C

L

BZT

CBZT

Fluorophore

Receptor

Fig. 3.1. Schematic design and synthesis sensor L

Here, the fluorophore is cyanine, receptor is -COO- group, a strong affinity group with Hg(II) ion; The sensor L synthesis reaction occurs in two phases: phase (I) and phase (II).

In the concentration range of Cys from 0 to 10 μM, The ratiometric fluorescent intensity at two different wavelengths sóng 450 và 375 nm (F450/375) has a good linear relationship with Cys concentration in the equation: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], R = 0,982. The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. 3.2.3. Theoretical study on characteristics and application of sensor AMC 3.2.3.1. Optimized geometries (RGS, REES1, REES2) of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH at electronically ground state and excited state In the ground state (S0) of sensor AMC, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane, but at the excited Reaction pairing the receptor to the fluorophore, the reaction (I) is based on the reaction between 4-methyl quinoline and carboxylic acid

18 7

derivative [29] while reaction pairing to form fluorophore, the reaction (II) is based on the adol addition reaction ethanol and croton condensate [3]. a. Survey of the reactions of the phase (I)

S

CH3CH2OH

(1)

Br-

BrCH2COOH

(6)

+ CH3CH2OH2

N+

N

N+

increases more strongly than that of fluorescent emission at short wavelength. The fluorescence intensity change at both 375 and 450 nm wavelengths above leads to an ability to use AMC as a fluorescence sensor based on rate variation in fluorescence intensity at two wavelengths to detect Cys.

BZT

CBZT-1

COOH

COOH...Br-

COO-

S

CBZT-3

CBZT

(2)

HBr

BrCH2COOH

N+

N

S

H2O

COO-

) u

BZT

CBZT-2

(7)

Br-

H3O+

. a (

S

N+

(3)

BrCH2COOH

COOH...Br-

COO-

N+

N

CBZT-3

CBZT

COOH...Br-

BZT

CBZT-3

S

OH-

(4)

Br-

(8)

BrCH2COOH

H2O

N+

N

Br-

N+

e c n a b r o s b A

COOH

BZT

CBZT-4

COOH...Br-

COO-

Br

S

y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

CBZT-3

CBZT

(5)

BrCH2COOH

N

COOH

BZT

CBZT-5

Wavelength/nm

Fig 3.3. The reactions formed CBZT from CBZT-3

Fig. 3.6. The optimized geometry of L at the B3LYP/LanL2DZ level of theory

According to the previously published works, the Michael addition reactions beween biothiols (Cys, Hcy and GSH) and esters created by acrylic acid and alcols (usually the fluorophore) initially generates thioethers, then followed by the formation of heterocycles compounds in the case of Cys and Hcy. Meanwhile, the thioether of GSH is usually stable with no subsequent ring formation. Different from the above study, the calculated results in term of the thermodynamics show that reactions between the sensor AMC and biothiols (including Cys, Hcy and GSH) to form thioether with the 1: 1 molar ratio is thermodynamically advantageous. 3.2.2. Experimental study on synthesis, characterization and application of sensor AMC 3.2.2.1. Experimental synthesis of sensor AMC After synthesis, the structure of AMC products was obtained The bond lengths, bond angles, and dihedral angles of L were calculated. In particular, these values of BZT, bromacetic acid and DHB have little change compared with that from the beginning. In L, there is the formation of new bond between N7 and C11 and double one of bond C10 and C12. b. UV-Vis spectral analysis of sensor L The UV-Vis spectra of L at gains the maximum value at a previous In 452,6 nm. announcement, BZTVPA had the same structure as the sensor L with a maximum absorption wavelength of 405 nm, which is a strong fluorescent emission at 495 nm. This result led to an expectation that the fluorescent properties of L would be similar to BZTVPA fluorescence. c. The analysis of Fluorescent properties of sensor L

Table 3.5. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for

State

low-laying singlet state of L at B3LYP/LanL2DZ f

E (eV) 2,53

λ (nm) 489,8

Percentage contribution(%) 56,44

0,2566

S0→S1

95→97

96→97

35,80

S0→S2

93→97

2,74

452,6

0,5626

29,22

95→97

28,63

96→97

28,66

5,90

S0→S3

92→97

2,86

432,9

0,0097

93→97

8,83

94→97

77,56

with 1H- NMR and FAB-MS spectra. 3.2.2.2. Experimental study on the characteristics and application of sensor AMC a. Absorption and the fluorescence spectrum of the AMC sensor As shown in Fig.3.33a, the free sensor AMC shows a characteristic absorption band peaked at 275 and 320 nm. When Cys were added to the solution of sensor AMC, the absorption spectrum was negligibly changed. Meanwhile, the free sensor AMC displays fluorescence emission band peaked at 375 nm and 450 nm (Fig.3.33b). Fluorescence quantum yield (Φ) of sensor AMC was determined to be 0,05. When Cys were added to the solution of sensor AMC fluorescence tensity increases gradually at both emission bands. In particular, the intensity of fluorescent emission at long wavelength

State

S0→S4

92→97

E (eV) 3,00

λ (nm) 413,2

0,5815

Percentage contribution(%) 5,42

93→97

49,94

94→97

10,62

95→97

9,35

96→97

11,07

86,61

S0→S5

92→97

3,05

406,0

0,0060

93→97

7,68

44,35

S0→S6

90→97

3,92

316,7

0,0051

91→97

41,32

96→97

8,40

16 9

not change the signals of the Hg2L2 solution’s fluorescence. This proves that the ensemble Hg2L2 complex is like a fluorescent sensor for the selective detection in the presence of amino acids without the thiol group. As shown in Fig.3.25b, fluorescence intensity gain strongest increase is Cys, then GSH and Hcy. c. Survey on the use of Hg2L2 for quantitative detection of Cys In the concentration range of Cys from 0 to 5 μM, there is a good linear relationship between the variation of fluorescence intensity (F585) of Hg2L2 and Cys concentration, shown in the following equation: F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], R = 0,998. The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,2 μM and 0,66 μM, respectively. 3.2. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor AMC from coumarin derivatives for the detection of biothiols based on the Michael addition reactions 3.2.1. Theoretical design, synthesis sensor AMC and reaction between AMC sensor with biothiols 3.2.1.1. Study on design, synthesis of sensor AMC

4-methyl-7-hydroxycoumarin compound gains maximum absorbance at 359 nm wavelength and maximum emission at 449 nm wavelength [159].

Calculated results (Table 3.5) showed that, excited states have great oscillator strength namely S0→S1, S0→S2 at wavelengths 489,8 nm and 452,6 nm, respectively to make a significant contribution (35,80% and 28,66%, respectively) to transition from MO-96 to MO- 97. Because of continuous MOs, there is no PET to intervene this transition. This result led to an expectation that the L is fluorescence emission compound. 3.1.2. Experimental study on synthesis, characteristics and application of sensor L 3.1.2.1. Experimental study on synthesis of L After synthesis, the structure of CBZT and L products was

To design AMC fluorescence sensor (7- acryloyl -4- metylcouramin) from coumarin-based derivatives to detect biothiols based on the Michael addition reactions, 4-methyl-7-hydroxylcoumarin compounds are chosen as fluorophore and receptor as acryloyl chloride, because reaction of receptor to fluorophore is conducted easily with ester reation among phenol groups with the acid derivative [2] and this receptor can cause an addition reaction with the biothiols. The sensor AMC is designed in the following synthesis scheme: obtained with 1H- NMR, 13C-NMR and FAB-MS spectra. 3.1.2.2. The experiamental survey of application of L for the detection of Hg(II) ions a. The survey of UV-Vis and fluorescence spectra of

Fluorophore

+

(B)

HCl

+

(A)

AMC

Receptor As expected from calculations, L performs red fluorescence with a quantum yield of 0,175. The maximum fluorescence wavelength is 585 nm and the maximum absorption wavelength is 540 nm (Fig.3.10).

Fig. 3.29. Schematic design and synthesis sensor AMC

10 15

e c n a b r o s b A

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Wavelength/nm

e c n a b r o s b A

Wavelength/nm

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

540 nm wavelength appears; in the fluorescence spectrum, the intensity of the fluorescence increases gradually again

Fig.3.10. UV-Vis and fluorescence spectra of L: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH /H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4; (b) fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4, excitation wavelength at 540 nm.

Wavelength/nm

b. They survey of UV-Vis and fluorescence titration spectra of L for the detection Hg(II) ions

Fig.3.24. Absorbance spectra (a) and emission spectra (b) of Hg2L2 (2,5 μM) in C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, at 25C upon addition of 0-10 equiv of Cys, excitation wavelength at 540 nm, emission wavelength at 585 nm

e c n a b r o s b A

) u

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Wavelength/nm

b. Survey on effects of competitive amino acids and reation between of Hg2L2 and biothiols

Fig.3.11. The UV-Vis and fluorescence spectra of L with Hg(II) ions: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM); (b) Fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM)), excitation wavelength at 540 nm

. a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Concentration (μM)

Wavelength/nm

Fig.3.11 showed that Hg (II) ions reacted and changed the UV- Vis, and fluorescence spectra of L. The fluorescence intensity of L was decreased gradually while the concentration of Hg(II) ions is increased. c. The survey on the reaction between L and Hg(II) ions

Fig.3.25. (a) Emission spectra of Hg2L2 (2,5 μM) C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) at 25 oC upon addition of different amino acids (10 equiv each) including Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, and Val, respectively (Others: a mixture of miscellaneous amino acids without mercapto group). (b) Emission intensity at 585 nm of Hg2L2 (2,5 μM) vs different concentions of Cys, GSH, Hcy, and other amino acids.

The results presented in Fig.3.25a show that only the thiol- containing amino acids make strong change to fluorescence intensity of solution. In contrast, other amino acids without the thiol group do Fig 3.12 shows that, the fluorescence intensity of solution L decreases noticeably when the concentration of Hg (II) ions increases from 0 to 5.0 μM; and then decrease unsignificantly when we continue to decrease concentration of Hg (II) ions. This shows that L reacts with Hg (II) ions in a molar ratio of 1:1

14 11

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Calculated results in Table 3.8 show that the formation of Hg2L2 complex leads to the significant transfer of the electron density from L ligands to metal core Hg(II) ions and shorten the energy gap between HOMO and LUMO. As the results, at main excited states (maximum oscillator intensity is 0,5913) from S0→S2, with the main contribution of transition from HOMO to LUMO (53,12%), with a small amount of excitation energy of 1,37 eV. This leads to the fact that fluorescence emission wavelength of complex shifts to the long wavelength, greater than 900 nm. Therefore, in practice, there is no fluorescence from Hg2L2 complex to be detected. 3.1.4. Study on the use of Hg2L2 complex to detect biothiols 3.1.4.1. Study on theoretical calculations from complex reactions

Fig.3.12. The graph for determination of the molar ratio of the reaction between Hg(II) ions and L: L 5 µM in C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, emission wavelength at 585 nm, excitation wavelength at 540 nm.

times

the d. Survey on effects the competitive metal ions Fig.3.13 shows no is there that significant change in UV-Vis spectra as well as fluorescence spectra when adding Cd (II), Fe (II), Co (III), Cu (II) , Zn (II), Pb (II), Ca (II), Na (I), K (I) with a higher 5 concentration of L. Thus, L can detect selectively Hg (II) ions in the presence of these ions.

e c n a b r o s b A

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Constant association of complex was calculated by fluorescence titration method. The calculated results reveal that constant association of complex Hg2L2 is 1017,45 (M-3). Meanwhile, the association constant of Hg(RS)2 from Hg(II) ions with biothiols RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) for Cys, GSH, Hcy are 1020,1; 1020,2 and 1019,7, respectively. Hence, the reation between Hg2L2 with biothiols (Cys, GSH, Hcy) to format complex (Hg(II) with biothiols the freedom of L may be available.

) u . a ( y t i s n e t n i e c n e c s e r o u ﬂ

Wavelength/nm Wavelength/nm

Wavelength/nm

+ 80H-

Hg(Cys)2

Hg2L2 + 4 H2Cys

+ 8 H20 + 2L

The research results in term of thermodynamics of reation between Hg(II) ions and Cysteine (H2Cys) show that the reation (14) occurs beacause ΔG298 is negative (value ΔG298 of -821,6 kcal.mol-1). 2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14) The free energy (ΔG298) of reaction to form Hg2L2 from Hg(II) ions and L with a value ΔG298 of -410,2 kcal.mol‾1. Thus, the reation occurs (for the reason that the value ΔG298 is -1232 kcal.mol-1):

Fig.3.13. Absorbance (a) and ﬂuorescence (b) spectra of sensor L (1,5 μM) with different metal ions Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (5 equiv each) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, excitation wavelength at 540 nm

3.1.4.2. Experimental study on the use of Hg2L2 complex as fluorescence sensor to detect biothiol a. Survey on UV-Vis and fluorescence titration spectra of Hg2L2

Fig.3.24 indicates that when Cys is gradually added in Hg2L2 complex solution: in the UV-Vis spectra, the maximum absorption peak at 460 nm wavelength disappears constantly while a new maximum absorption peak with a very strong absorption intensity at e. The survey on the use of sensor L for quantitation detection of Hg(II) ions In the concentration range of Hg(II) ions from 0 to 400 μg/L: the variation of absorbance (ΔA540) and variation of fluorescence intensity (∆I585) maitain a good linear relationship with the ion concentration of Hg(II) with respective equations: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], R=0,999; ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) ×

12 13

b. The analysis of fluorescent properties of Hg2L2

Table 3.8. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for low-laying singlet state of Hg2L2 at B3LYP/LanL2DZ

State

λ (nm)

E (eV)

S0→S1

201→203

1,29

961,2

0,0838

Percentage contribution(%) 4,63

202→203

30,06

202→204

59,58

S0→S2

201→203

1,37

903,4

0,5913

2,41

201→204

3,99

202→203

53,12

202→204

24,77

[Hg(II)], R=0,999. The limit of detection and limit of quantitation for Hg(II) ions of colorimetric method are respectively 15,3 μg/L and 51,2 μg/L or 0,076 μM and 0,25 μM and the fluorescent method is 11,8 μg/L và 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively. 3.1.3. The theoretical study on the application of L for detection Hg(II) ions a. The study on the molecular structure of Hg2L2

S0→S3

201→203

1,57

788,7

0,1063

38,83

201→204

39,46

S0→S4

201→203

1,59

778,5

0,0647

32,24

201→204

43,20

202→204

3,52

S0→S5

197→203

1,93

642,3

0,0183

2,66

199→203

50,52

The calculated results of the complex formation between Hg(II) ions and L with the molar ratio of 1: 1 at the theoretical level of B3LYP/LanL2DZ show that there is a unchanged geometrical structure found as Hg2L2, which is and shown in Fig.3.16. The formation of Hg2L2 complex is thermodynamically favorable, with a ∆G298 value of 410,2 kcal mol-1. The bonds of complexes include O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, and O26O71. These bonds are known to be formed based on the calculated results of the distances among atoms, significantly smaller than the sum of van der Waals radii of relevant atoms.

199→204

10,31

200→203

25,64

S0→S5

201→205

2,29

S0→S6

198→204

1,95

636,4

0,0121

2,30

To confirm that the structure of the Hg2L2 complex, AIM analysis was conducted. The results of the analysis show that there are bond critical points (BCPs) between the contact points between O, S ligands and Hg (II), which are covalent bonds with the existence of the ring critical (RCPs) points between contacts O, S, N, Hg points (complex have ring structure). To

Fig.3.16. The optimized geometry of Hg2L2 at the B3LYP/LanL2DZ level of theory

199→203

19,80

199→204

2,57

200→204

27,67

explain fluorescence characteristics based on nature of the electrons of the bonds, NBO analysis was conducted. The results show that free L has the structure: D-π conjugated - A (Fluorescent); L in complex: the electron pair of N7 is no longer conjugated to the conjugate π (the structure of D - π conjugated - A was broken), therefore there is an electron transfer leading to fluorescence quenching of the complex.