150
THỰC HÀNH
NUÔI CẤY MÔ
VÀ TẾ BÀO
THỰC VẬT
151
MỤC LỤC
Bài 1 Mở đầu.............................................................. 153
I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào
thực vật.......................................................................... 153
II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế
bào thực vật ................................................................... 156
Bài 2 Môi trường dinh dưỡng ..................................... 172
I. Thành phần chính của môi trường .............................. 174
II. Vấn đề lựa chọn môi trường...................................... 182
III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc ............................. 184
Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ................................. 194
I. Mục đích và yêu cầu................................................... 194
II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất..................................... 195
III. Phương pháp tiến hành ............................................ 197
Bài 4 Nuôi cấy đơn bội in vitro .................................... 204
I. Mục đích và yêu cầu................................................... 204
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất......................................... 206
III. Phương pháp tiến hành ............................................ 207
152
Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù ........................ 213
I. Mục đích và yêu cầu................................................... 213
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất......................................... 215
III Phương pháp tiến hành ............................................. 217
Bài 6 Nuôi cấy protoplast ............................................ 222
I. Mục đích và yêu cầu................................................... 222
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất......................................... 223
III. Phương pháp tiến hành ............................................ 225
Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens................................................................... 231
I. Mục đích và yêu cầu................................................... 231
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất......................................... 232
III. Phương pháp tiến hành ............................................ 234
TÀI LIỆU ĐỌC THÊM .............................................. 242
153
Bài 1 Mở đầu
I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế
bào thực vật
(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)
1. Phòng rửa và cất nước
+ Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ)
+ Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ)
- Máy sản xuất nước khử ion
2. Phòng sấy hấp
+ Tủ sấy 60-300oC
+ Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)
- Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)
3. Phòng chuẩn bị môi trường
+ pHmeter
154
+ Máy khuấy từ
+ Cân phân tích 10-4g
+ Cân kỹ thuật 10-2g
+ Bếp điện
- Microwave
+ Tủ lạnh 100-200 L
- Tủ lạnh sâu (-20 -80oC)
4. Phòng cấy vô trùng
+ Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench)
+ Quạt thông gió
+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m)
- Thiết bị lọc không khí
5. Phòng ảnh
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
155
6. Phòng kính hiển vi
+ Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần).
+ Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có
gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số.
+ Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học.
- Kính hiển vi huỳnh quang
7. Phòng nuôi
+ Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu
sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
+ Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút)
+ Tủ ấm
- Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)
8. Phòng sinh hóa
+ Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...)
156
+ Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide)
+ Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của
DNA, RNA và protein (Gene documentation system)
+ Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm
- Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh
hóa của các tế bào và mô nuôi cấy.
II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-
tế bào thực vật
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng.
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng
cách.
- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau
khi cấy.
1. Bảo đảm điều kiện vô trùng
1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật
157
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có
chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các
loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của
nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực
vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào
tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn
bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc
nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong
điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào
thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy),
trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một
vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệm
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc,
điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào
đơn thực vật trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor),
điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công
được.
1.2. Nguồn nhiễm tạp
158
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không
được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các
sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn
theo bụi lên bề mặt môi trường.
1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thủy tinh
Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào
thực vật phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua
được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh
gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử
dụng. Thông thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng
sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ
cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy
nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo
nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích)
159
cần được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau
khi nguội được lấy ra cất vào chỗ ít bụi.
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông
không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi
không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị
bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không
thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược
điểm sau:
+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường
thì về sau sẽ bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi
cấy trong thời gian dài.
+ Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi
nuôi cấy trên quy mô lớn.
+ Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ.
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác
thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô
cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1
160
atm) mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm
dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho
việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy
nhôm để làm nắp đậy. Trong giáo trình này, chúng tôi sử
dụng giấy nhôm làm nút đậy.
c. Môi trường
Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong
điều kiện không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân
phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp. Thời gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC).
Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc
nút bông.
Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế
môi trường (dung dịch muối khoáng, vitamine, chất kích
thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung
dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ
và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một
lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường
chỉ nên dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL.
161
Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có
trong môi trường đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng
bào tử. Thời gian hấp thường từ 15 đến 20 phút ở 1 atm.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải dùng nước
cất hoặc nước khử ion, tốt nhất là dùng nước cất 2 lần từ
các máy cất hoàn toàn bằng thủy tinh.
Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế
phẩm mẫn cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng
các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường được khử
trùng.
d. Lọc vô trùng
Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc
Millipore (Hình 1.1) do hãng Millipore sản xuất hoặc dùng
các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.
162
Hình 1.1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng
Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đã được
khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần.
Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng
Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu
nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có
đường kính 25 mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa
chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt
màng lọc (có kích thước lỗ 0,25 µm) trên đế, đặt vòng cao
su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong
163
một tờ giấy nhôm và khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC
trong 15-20 phút. Đồng thời vô trùng một bình thủy tinh để
hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ
lọc.
1.4. Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau
của thực vật như: hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh
sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều
kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay
nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô
nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên
trong chứ không hạn chế ở bề mặt.
Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất
hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn.
Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng
vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả
năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy.
164
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của
chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy
trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong
dung dịch diệt khuẩn.
Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì
tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự
sinh trưởng của mô cấy.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn
trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật
có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng
dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa
nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần
trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải
cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh
hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên
chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch
diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi
trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành
công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được
165
nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử,
chắc chắn sẽ đạt kết quả.
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt
khuẩn để xử lý mô
cấy thực vật
Thời gian
Nồng Hiệu xử lý Stt Tác nhân vô trùng độ quả
(phút)
Calcium 9-10% 5-30 Rất tốt 1 hypochlorite
Sodium 2% 5-30 Rất tốt 2 hypochlorite
3 Nước Bromine 1-2% 2-10 Rất tốt
10-12% 5-15 Tốt 4 H2O2
0,1-1% 2-10 Khá 5 HgCl2
6 Kháng sinh 30-60 Khá 4-50
166
mg/L
1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là
bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi
mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng
nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp
này.
Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động
từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch
men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử
dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải
rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa
phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử
hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng
trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt
bàn bằng cồn 90%.
167
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước:
từ áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao,
kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy
thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng
trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng
cụ làm việc.
Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà
phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo
mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử
ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi
không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30
phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không
khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các
dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để
trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.
168
Hình 1.2. Tủ cấy vô trùng
2. Chọn môi trường dinh dưỡng
Xem bài 2
3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn
mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các
mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy.
Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển,
thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi
đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng
thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa (Bảng
169
1.2). Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây
nhất định, trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và
mô phân sinh ngọn.
Cần biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền
như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh
trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây
hoàn chỉnh rất khác nhau.
Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây
cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật,
trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng các bộ phận
khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh
trưởng khác nhau.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện
nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên
cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá
trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng
quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định từ 25 ± 2oC
bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng
từ 2000-3000 lux.
170
4. Một số điểm cần lưu ý
- Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau
khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau
mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90% rồi hơ lên
ngọn lửa đèn cồn.
- Trước khi cấy phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy
bằng cồn 90%.
- Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4-5 mẫu, tránh
trường hợp để nhiều không cấy kịp mẫu sẽ bị khô.
- Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi
đợt cấy.
Bảng 1.2. Các cơ quan của thực vật sử dụng trong nuôi
cấy mô và tế bào
Kích Nguồn gốc Stt Mẫu nuôi cấy thước mẫu vật nuôi
171
cấy
Mô phân sinh Đỉnh sinh trưởng
0,5-1 đỉnh 1 mm
(meristem)
Chồi đỉnh Chóp đỉnh có chứa một
0,5-1 cm 2 phần thân (shoot tip)
Chồi nách Chồi bên có chứa một
3 0,5-1 cm phần thân, lá và chồi (axillary bud)
nách
Cuống lá Cuống lá được cắt nhỏ, 0,2-0,3 4 phân nửa được cấy (leaf petiole) cm chìm vào môi trường
Phiến lá Phiến lá non đặt trên
5 0,2-1 cm môi trường, mặt dưới (leaf blade)
đặt trên mặt thạch
Rễ Mẫu rễ được đặt trên
6 0,5-1 cm mặt thạch (root)
172
Dạng hành Mẫu được đặt trên bề
1-2 cm 7 mặt hay cấy chìm phân (bulds, scale)
nửa vào môi trường
Chồi non Cây mầm
2-3 mm 8
(seedling)
Hạt phấn trong bao Hạt phấn
0,1-0,5 phấn 9 (pollen, mm
microspore)
Bài 2 Môi trường dinh dưỡng
Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô
và tế bào thực vật là tìm ra thành phần vật chất của môi
trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và
phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng
thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát
triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì
mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái
sinh cây hoàn chỉnh.
173
Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác
nhau cho các thí nghiệm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính
đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi
cấy những mô đặc biệt nào đó. Một số môi trường khác có
ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều
loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho
rằng môi trường nào trong chúng bảo đảm sinh trưởng tốt
hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường
thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường Murashige-
Skoog (1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các
môi trường khác.
Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ
cũng gồm năm thành phần chính:
- Đường cung cấp nguồn carbon.
- Các muối khoáng đa lượng.
- Các muối khoáng vi lượng.
- Các vitamin.
- Các chất điều khiển sinh trưởng.
Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số
chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (các amino
174
acid, EDTA...) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết
nấm men, dịch chiết cà chua ...).
I. Thành phần chính của môi trường
1. Đường
Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế
bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân
chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang
hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh
dưỡng.
Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose
và glucose. Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn,
tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi
từ 1-12%, thông dụng là 2-3%.
2. Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách
rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự
nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P,
K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).
175
Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi
cấy mô
Nguyên Nồng độ tố Stt Dạng sử dụng
(mM) đa lượng
-, [NO3 +]
N Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, 1 NaNO3, NH4NO3, NH4
-, +)
khoảng 20 (NO3 (NH4)2SO4
NH4
2 P khoảng 1 NaH2PO4.7H2O, KH2PO4
3 K khoảng 10 KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4
Ca khoảng 2 Ca(NO3)2.4H2O, 4 CaCl2.2H2O hoặc
CaCl2.6H2O
176
5 0,5-3 Mg MgSO4.7H2O
6 S khoảng 1 (NH4)2SO4
3. Các muối khoáng vi lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy
là lĩnh vực ít được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi
lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với
sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, nó đã
được sinh lý học thực vật chứng minh đối với cây hoàn
chỉnh do đó có thể sử dụng được hầu hết các nguyên tố vi
lượng cần thiết đối với cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong
môi trường nhân tạo. Vì vậy, sự cung cấp này có tính kinh
nghiệm trong những trường hợp cụ thể có thể là không cần
thiết (Bảng 2.2).
4. Các vitamin
Bảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng
trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu).
Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm
177
tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0oC (trong
ngăn đá tủ lạnh).
Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi
cấy mô
Nguyên
Nồng độ tố
Stt Dạng sử dụng
(mg/L) vi
lượng
1 15-100 Mn MnSO4.4H2O
2 B 6-100 H3BO3
3 Zn 15-30 ZnSO4.7H2O
0,01- 4 Cu CuSO4.5H2O 0,08
5 0,007-1 Mo Na2MoO4.2H2O
6 Co 0,1-0,4 CoCl2.6H2O
178
7 I KI 2,5-20
8 Fe 15-27,9 FeSO4.7H2O
Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy
mô
Nồng độ
Stt Tên vitamin
(mg/L)
100 1 myo-inositol
0,5-1 2 Nicotinic acid
Pyridoxine.HCl (Vit 0,05-0,5 3 B6)
4 10-50 Thiamine.HCl (Vit B1)
Panthotenate calcium 5 1-5 (Vit B5)
179
1-5 6 Riboflavin (Vit B2)
7 Biotin 0,1-1
8 Folic acid 0,1-1
5. Các chất điều khiển sinh trưởng
Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó
khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú ý:
- Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA3: cân một
lượng chất sinh trưởng đủ pha trong 50 mL dung dịch mẹ
vào một ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi lắc đến khi tan
hết, sau đó mới thêm nước cất đến 50 mL.
- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt
nước cất và vài giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước
cất đến thể tích cần pha.
- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi
pha đến thể tích cần thiết.
180
Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín
(riêng IAA bảo quản trong lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh.
2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong
một năm. BAP, IBA, KIN, và GA3 bảo quản được từ 2 đến
3 tháng. IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính.
Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh
trưởng
Chữ Chữ
Chất kích thích Chất kích thích sinh
viết viết sinh trưởng trưởng
tắt tắt
BA Benzyladenin KIN Kinetin
BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid
2hZ Dihydrozeatin GA3 Gibberellic acid
IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron
IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin
181
2-iP 2-Isopentenyl 2,4- 2,4-
adenin D Dichlorophenoxyacetic
acid
NOA Naphthoxyacetic Pic Picloram
acid
Chú ý
Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp (10-8). Cần dùng pipette riêng cho từng
loại chất sinh trưởng một. Và chú ý rửa cẩn thận các ly,
cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở
nồng độ cao. Ngoại trừ IAA và GA3, các chất sinh trưởng
còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng.
IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng
lọc millipore (xem bài trước) sau đó chứa trong các tube
eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh
sâu. Môi trường sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 50-60oC khi đó mới cho IAA đã lọc vào
(các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
182
6. Các chất hữu cơ khác
6.1. Nước dừa
Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng
minh là myo-inositol và một số amino acid khác. Lượng
nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao,
từ 10-20% thể tích môi trường. Lấy nước dừa già, lọc
trong, cho vào các túi nilon và bảo quản trong lạnh sâu cho
nđến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng.
Tốt nhất là nên sử dụng tươi.
6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein
Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi
sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và
bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ.
Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid,
lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường.
II. Vấn đề lựa chọn môi trường
183
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng
nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ
sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường
làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy
mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về
mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước đầu có thể
giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở
đó mà cải tiến cho phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề
nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy
khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là
môi trường White, Knop và Knudson C.
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5
của Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi
trường Murashige-Skoog và Linsmaier-Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số
đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so
sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu
184
-/NH4
thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần tìm tỷ + thích hợp. Việc sử dụng mang tính kinh lệ NO3
nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự
tiến bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực
vật.
Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như
là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và
cân bằng về chất dinh dưỡng. Vì vậy, những người mới tập
sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước
khi tìm ra được môi trường riêng của mình.
III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy
(môi trường làm việc), người ta không cân hóa chất cho
mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm
đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các
dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh
thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ
giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy.
185
1. Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962).
Chia làm 5 phần:
Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS
Nồng độ Dung tích Nồng trong dung dùng cho độ Dung dịch stock dịch mẹ 1 L môi (g/200 (mg/L) trường mL)
1900 19 MS1: KNO3
170 KH2PO4 ( 10) 20 mL 1,7
1650 NH4NO3
16,5
370 MgSO4.7H20
3,7
440 10 mL MS2: CaCl2.2H2O (20)
186
8,8
6,2 MS3: H3BO3
0,124
22,3 MnSO4.4H2O
0,446
0,025 CoCl2.6H2O
0,5 mg
0,025 CuSO4.5H2O ( 20) 10 mL 0,5 mg
8,6 ZnSO4.4H2O
0,172
0,25 5 Na2MoO4.2H2O
mg
KI 0,83
16,6 mg
27,8 MS4: FeSO4.7H2O ( 20) 10 mL 0,556
187
37,3 Na2-EDTA
0,746
100 2 MS5: myo-inositol
Thiamine.HCl 0,1 2 mg
Pyridoxine.HCl 0,5 ( 20) 10 mL 10 mg
Nicotinic acid 0,5 10 mg
Glycine 2 40 mg
2. Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5
phần:
Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch
Dung dịch stock Nồng Nồng độ Dung tích
188
độ trong dung dùng cho 1
dịch mẹ L môi (mg/L)
(g/200 mL) trường
950 9,5 Nt1: KNO3
68 B KH2PO4 ( 10) 20 mL 0,68
720 7,2 NH4NO3
185 1,85 MgSO4.7H20
166 Nt2: CaCl2.2H2O (20) 10 mL 1,66
10 0,2 Nt3: H3BO3
25 0,5 MnSO4.4H2O
0,0025 CuSO4.5H2O ( 20) 10 mL 0,05 mg
10 0,2 ZnSO4.4H2O
0,25 Na2MoO4.2H2O
189
0,5 mg
27,8 Nt4: FeSO4.7H2O ( 20) 10 mL 0,556
37,3 Na2-EDTA
0,746
100 2 Nt5: myo-inositol
Thiamine.HCl 0,5 10 mg
Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg
Nicotinic acid 5 ( 20) 10 mL 100 mg
Glycine 0,05 40 mg
Biotin 2 1 mg
Acid folic 0,5 10 mg
3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast (theo Trigiano
& Gray, 2000)
190
- Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –
PI)
Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI
Nồng độ
Stt Thành phần
(mg/L)
1480 1 CaCl2.H2O
27,2 2 KH2PO4
101 3 KNO3
246 4 MgSO4.7H2O
0,025 5 CuSO4.5H2O
6 KI 0,16
pH môi trường 5,8
- Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –
PC)
191
Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC
Nồng độ Dung
trong tích Nồng
dung dịch dùng độ Dung dịch stock mẹ cho 1 L
(mg/L) môi (g/200
trường mL)
( 20) 100 10 mL PC1: Ca(H2PO4)2.2H2O 2
450 9 CaCl2.2H2O
2500 50 PC2: KNO3
NaH2PO4.2H2O ( 20) 170 10 mL 3,4
134 1,68 (NH4)2SO4
250 5 MgSO4.7H20
192
60 H3BO3 3 PC3: mg
13,2 132 mg MnSO4.4H2O
0,025 0,5 mg CoCl2.6H2O
CuSO4.5H2O ( 20) 0,025 10 mL 0,5 mg
2 40 mg ZnSO4.7H2O
0,25 5 mg Na2MoO4.2H2O
KI 0,75 15 mg
myo-inositol ( 20) 100 10 mL PC4: 2
Nicotinic acid 1 20 mg
Lấy mỗi loại stock PC (PC1, PC2, PC3 và PC4) 10
mL. Bổ sung thêm:
+ Sequestrene 330 28 mg/L
193
+ Sucrose 10 g/L
+ Glucose 18 g/L
+ Mannitol 100 g/L
194
Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
I. Mục đích và yêu cầu
Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu
trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Môi
trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loại cây trồng được
đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ
chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung
chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh
195
trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định sẽ phát triển
thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục phát
triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh.
Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát
triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện
lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường, được
thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thông
qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý,
nếu dùng đỉnh sinh trưởng nhỏ quá thì nuôi cấy khó thành
công, nếu dùng đỉnh sinh trưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ
thành công nhưng cũng dễ bị nhiễm trùng. Kích thước của
đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiên
một đỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp
hơn cả.
Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành
cây có thể trực tiếp hoặc thông qua giai đoạn protocorm (dẽ
hành).
II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
196
1. Dụng cụ
- Bình tam giác (100 mL, 250 mL)
- Giấy nhôm
- Giấy thấm vô trùng
- Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette các loại
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ sấy
- Laminar
- Tủ lạnh
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
197
- Máy cất nước 2 lần
3. Hóa chất
- Dung dịch stock môi trường MS (MS1, MS2, MS3,
MS4 và MS5)
- Dung dịch HgCl2 0,1%
- Cồn 90%
- Agar
- Saccharose
- Nước cất vô trùng
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng:
BAP và NAA.
- Nước dừa
III. Phương pháp tiến hành
1. Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp
a. Nguyên liệu thực vật
198
- Đỉnh sinh trưởng của cây hông (Paulownia
fortunei)
- Đỉnh sinh trưởng cây keo lai (Acasia hybrid)
b. Môi trường nuôi cấy
- MS đầy đủ
- Saccharose 3%
- Agar 0,8%
- BAP 2 mg/L
- NAA 1 mg/L
- pHmôi trường 5,8
c. Tiến hành
Pha môi trường dinh dưỡng (1 L). Chia môi trường vào
trong 20 hoặc 40 bình tam giác loại 250 hoặc 100 mL,
tương ứng. Nút miệng bình bằng giấy nhôm, sau đó đem khử trùng ở 121oC (1 atm)/15-30 phút (môi trường chuẩn
bị trước từ 2 ngày trở lên).
199
Rửa sạch đỉnh sinh trưởng bằng xà phòng dưới dòng
nước chảy, cắt bỏ những lá chung quanh chỉ để lại một vài
lá, cho vào lọ thủy tinh vô trùng để chuẩn bị khử trùng mẫu
vật.
Trước khi cấy, laminar phải được bật đèn khử trùng 30
phút. Các dụng cụ cần thiết cho quá trình cấy (forceps, kéo,
dao, bình khử trùng, cồn, giấy thấm...) được đặt trong
laminar trước khi bật đèn.
Khử trùng sơ bộ bằng cồn 90% từ 30 giây đến 1 phút,
sau đó bằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút, cuối cùng rửa sạch
HgCl2 bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này
thực hiện trong laminar).
Lấy mẫu vật ra thấm khô trên giấy thấm vô trùng bóc bỏ
những lá chung quanh, chỉ giữ lại đỉnh sinh trưởng (những
phần mô thấm dung dịch khử trùng cũng cần phải cắt bỏ).
Sau đó, cấy mẫu vào các bình tam giác chứa môi trường
dinh dưỡng đã được chuẩn bị sẵn. Các bình môi trường đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 ± 2oC,
thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày với cường độ 2000-
3000 lux.
200
Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành cây
nhờ quá trình kéo dài chồi (shoot elongation).
2. Nuôi cấy phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm
a. Nguyên liệu thực vật
- Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi nách của hoa lan
Dendrobium
- Đỉnh sinh hoặc dứa (Ananas comusus)
b. Môi trường nuôi cấy
- Lan: MS đầy đủ
Saccharose 2%
Agar 0,8%
Nước dừa 15%
NAA 0,1 mg/L
BAP 1,0 mg/L
pHmôi trường 5,8
201
- Dứa: MS đầy đủ
Saccharose 2%
Agar 0,8%
NAA 0,5 mg/L
BAP 0,2 mg/L
pHmôi trường 5,8
c. Tiến hành
Các bước tiến hành tương tự như trường hợp nuôi cấy
phát triển thành cây trực tiếp. Nhưng lưu ý thêm:
- Đỉnh sinh trưởng của các loài lan hoặc dứa thường
rất bẩn nên phải rửa thật kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước
chảy.
- Lan và dứa là những cây có khả năng sinh trưởng
khá mạnh nên thời gian khử trùng đỉnh sinh trưởng của
chúng có thể lâu hơn các đối tượng khác (khoảng 7-10
phút) để đảm bảo tỷ lệ nhiễm bẩn thấp.
202
Các bình môi trường đã cấy mẫu được đặt trong
phòng nuôi với thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng 25 ± 2oC.
203
204
Bài 4 Nuôi cấy đơn bội in vitro
I. Mục đích và yêu cầu
Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật tạo dòng
thuần chủng luôn luôn giữ vai trò quan trọng. Có nhiều
phương pháp tạo dòng thuần chủng khác nhau, nhưng
thông thường nhất là tiến hành chọn lọc và kiểm tra qua
nhiều thế hệ tự phối. Cách làm này mang lại kết quả chắc
chắn, nhưng đòi hỏi chi phí lớn về trồng trọt và mất nhiều
thời gian.
Bằng con đường đơn bội, nghĩa là chọn ra những cá
thể 1n rồi sau đó lưỡng bội hóa chúng, trong một thời gian
ngắn sẽ thu được những cá thể đồng hợp tử tuyệt đối, đó là
những dòng thuần rất lý tưởng. Hai biện pháp truyền thống
để thu được cây đơn bội là:
- Chọn lọc đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên.
- Lai xa và chọn lọc sau khi bộ nhiễm sắc thể của một
trong hai giao tử mất đi (thoái biến) sẽ thu được thể đơn
bội, hiện tượng này chỉ mới phát hiện được ở một số cặp lai
khác loài của đại mạch.
205
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là làm sao để có được một
số lượng cây đơn bội lớn. Phương pháp này hầu như không
thể giải quyết vấn đề nói trên.
Năm 1964, Guha và Maheshawari đã đưa ra một
phương pháp tạo cây đơn bội mới, đó là tạo cây đơn bội từ
hạt phấn thông qua nuôi cấy in vitro. Trên nhiều đối tượng
cây trồng, phương pháp này đã tạo được hàng loạt cá thể
đơn bội trong một thời gian ngắn (chỉ một vài tháng).
Chính vì vậy, đã có nhiều chương trình tạo giống cây trồng
ra đời trên cơ sở áp dụng kỹ thuật đơn bội in vitro và đã thu
được kết quả tốt.
Có hai trường hợp tạo cây đơn bội từ hạt phấn: hạt
phấn tạo trực tiếp cây đơn bội (thường gặp ở thuốc lá) hay
hạt phấn tạo gián tiếp cây đơn bội thông qua giai đoạn phát
triển callus (ở lúa). Để tạo cây đơn bội kép có thể sử dụng
hai phương thức: cây đơn bội kép tạo từ cây đơn bội được
xử lý colchicine hay cây đơn bội kép tái sinh từ callus của
cây đơn bội (trường hợp này thường chỉ đạt hiệu suất
khoảng 60 %).
206
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
1. Dụng cụ
- Ống nghiệm (1,5 cm × 20 cm)
- Giấy thấm vô trùng
- Giấy nhôm
- Lọ khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ, kim nhọn
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ lạnh
- Laminar
- Tủ sấy
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
207
- Cân kỹ thuật 10-2g
- Máy cất nước 2 lần
- Kính hiển vi
3. Hóa chất
- Dung dịch stock môi trường Nt (Nt1, Nt2, Nt3, Nt4
và Nt5)
- Dung dịch HgCl2 0,1%
- Cồn 90%
- Agar
- Saccharose
- Nước cất vô trùng
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng:
IAA, BAP, KIN
và 2,4-D
III. Phương pháp tiến hành
1. Nguyên liệu thực vật
208
Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana
tabacum) đế nuôi cấy đơn bội.
2. Môi trường nuôi cấy
Bảng 4.1. Thành phần các môi trường nuôi cấy bao
phấn thuốc lá
Thành phần môi Tạo cây Tạo Tạo Tạo rễ
trường 1n callus 1n chồi 1n 1n
(1) (2) (3) (4) (5)
Nitsch đầy đủ
+ + + + (Nt1, Nt2, Nt3,
Nt4 và Nt5)
Saccharose (%) 2 2 2 2
0,8 Agar (%) 0,8 0,8 0,8
- - 0,1 IAA (mg/L) 0,1
209
2,4-D (mg/L) 0,1-0,5 - - -
KIN (mg/L) 0,1 0,1 0,1-1 -
BAP (mg/L) - 0,1-1 - -
Chú ý
Môi trường được chuẩn bị trong ống nghiệm (làm
thạch nghiêng).
3. Nuôi cấy bao phấn
Nụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá
đài (nụ dài khoảng 10-15 mm) được khử trùng theo thứ tự:
2 phút trong cồn 70%, 5 phút trong dung dịch HgCl2 0,05%
và rửa bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần. Trong điều kiện
vô trùng, dùng forceps và dao mổ tách nụ lấy các bao phấn
cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng đã chuẩn
bị sẵn (Bảng 4.1, cột 2). Mỗi ống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và đặt ở nhiệt độ 25-27oC, chiếu sáng từ 10-12
giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux.
210
Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn sẽ nứt ra và xuất hiện
các cây thuốc lá đơn bội, cấy chuyển những cây thuốc lá
này sang những bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL của
cùng một loại môi trường để cây đơn bội phát triển.
Chú ý: Các thí nghiệm nuôi cấy đơn bội chỉ thành
công với điều kiện hạt phấn phải ở giai đoạn tứ tử hoặc đơn
nhân, do đó thường người ta phải làm tiêu bản hiển vi để
quan sát sự phát triển của hạt phấn, chọn giai đoạn thích
hợp rồi mới tiến hành nuôi cấy.
4. Nhị bội hóa thông qua giai đoạn callus
Thân của cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống
nghiệm được cắt thành từng đoạn dài 5 mm và cấy lên môi
trường tạo callus (Bảng 4.1, cột 3). Sau 7-10 ngày, từ đoạn
thân cây thuốc lá 1n sẽ hình thành một khối callus nhỏ
được gọi là callus sơ cấp. Tế bào callus sơ cấp thường dễ
tái sinh thành chồi khi gặp điều kiện thuận lợi. Các cây tái
sinh từ tế bào callus nuôi cấy trên môi trường ở bảng 4.1,
cột 4 có độ biến động về số lượng nhiễm sắc thể rất lớn.
211
- Phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thể
Mảnh lá non (1-2 mm) hoặc đầu rễ (2 mm) được tách
ra từ cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm, cố
định bằng hỗn hợp cồn: acetic (3:1) trong 24 giờ. Mẫu
được bảo quản ở cồn 70%, nhuộm nhiễm sắc thể bằng
acetocarmin. Đếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển
vi.
Kết quả phân tích số lượng nhiễm sắc thể của các cây
tái sinh từ quần thể tế bào callus đơn bội là không đồng
nhất, cho thấy: cây 1n chiếm tỷ lệ khoảng 21,9 %, cây 2n
khoảng 61,5 % và khoảng 11,5 % là những cây có mức bội
thể cao hơn nhị bội.
212
213
Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù
I. Mục đích và yêu cầu
Trong nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng),
dịch nuôi cấy chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh
trưởng phân tán trong môi trường lỏng. Nuôi cấy tế bào
dịch lỏng thường được khởi đầu bằng cách đặt các khối mô
callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc
hoặc khuấy). Vì thế quá trình nuôi cấy này là sự tiến triển
từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới tế bào
dịch huyền phù. Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù thích hợp
hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với
nuôi cấy callus do quá trình nuôi cấy này được thao tác
tương tự như nuôi cấy vi sinh vật trong nồi lên men.
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch huyền phù chủ yếu
được sử dụng để sản xuất các hợp chất thứ cấp (các hợp
chất tự nhiên) với hiệu suất cao. Các sản phẩm thứ cấp như:
các chất dùng làm dược liệu, các chất tạo mùi, các chất
dùng làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trong nông
nghiệp, ngày nay đã được sản xuất thành công trong nhiều
214
nuôi cấy in vitro tế bào thực vật. Sản xuất các hợp chất thứ
cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật dựa trên cơ sở lập luận là
sản phẩm có cùng giá trị được sản xuất tự nhiên trong các
cơ quan, quả, hoặc các mô khác nhau của cây có thể được
kích thích để tích lũy trong các tế bào chưa phân hoá rõ.
Những đột phá trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào (ví dụ
nuôi cấy rễ tơ) cho thấy trong tương lai gần phần lớn những
hóa chất công nghiệp nào có nguồn gốc thực vật cho dù đó
là dược liệu, thuốc nhuộm hay chất màu thực vật đều có thể
sản xuất trong các nồi phản ứng sinh học (bioreator) hay
còn gọi là hệ lên men (fermenter).
215
Hình 5.1. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trong
bioreactor
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
216
1. Dụng cụ
- Bình tam giác (250 mL)
- Giấy nhôm
- Giấy lọc vô trùng
- Lọ khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ lạnh
- Laminar
- Tủ sấy
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
217
- Máy cất nước
- Máy lắc
- Máy hút chân không
- Phễu sứ Buchner
3. Hóa chất
- Dung dịch stock: môi trường MS (MS1, MS2, MS3,
MS4 và MS5)
- Dung dịch HgCl2 0,1%
- Cồn 90%
- Agar
- Saccharose
- Nước dừa
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: KIN,
BAP, NAA và 2,4-D.
- Nước cất vô trùng
III Phương pháp tiến hành
218
1. Nguyên liệu thực vật
- Hạt lúa (Oryza satica): nuôi cấy tạo callus.
- Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria) in vitro: nuôi cấy
tạo callus.
2. Môi trường nuôi cấy tạo callus
a. Lúa
- MS đầy đủ
- Saccharose 3 %
- Agar 0,8 %
- 2,4-D 5 mg/L
- KIN 0,1 mg/L
- pHmôi trường ~ 5,8
b. Nghệ đen
- MS đầy đủ
- Saccharose 2 %
- Agar 0,8 %
219
- BAP 3 mg/L
- 2,4-D 3 mg/L
- pHmôi trường ~ 5,8
3. Môi trường nuôi cấy tế bào dịch lỏng
Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo
callus nhưng không bổ sung agar.
4. Tiến hành
a. LÚA: chuẩn bị môi trường theo các bước tương tự
các bài trước.
- Tạo callus
Hạt lúa bóc vỏ, rửa sạch bằng xà phòng dưới dòng nước
chảy. Cho hạt lúa vào bình khử trùng, khử trùng sơ bộ bằng
cồn 70% trong 1 phút. Sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1 %
trong 6 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần trước
khi cấy.
220
Cấy hạt lúa đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 8-10
giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux .
Sau 4-5 tuần các callus màu trắng sữa xuất hiện trên các
hạt lúa.
- Nhân callus
Dùng dao mổ tách lấy các khối callus nhỏ có đường
kính 1-2 mm cấy chuyển lên môi trường nhân callus (thành
phần môi trường tương tự như môi trường tạo callus). Sau
3-4 tuần, các callus sẽ phát triển nhanh chóng thành các
khối callus lớn (đường kính khoảng 3-5 mm).
- Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch huyền phù. Các bước
tiến hành và khử trùng tương tự môi trường có agar. Mỗi
bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường.
Chọn các khối callus có màu trắng ngà, rắn từ môi
trường nhân để chuyển vào môi trường lỏng. Một gam
callus cho vào 1 bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL
221
môi trường (các thao tác tiến hành trong điều kiện vô
trùng).
Đặt các bình môi trường chứa callus trên máy lắc ở trong phòng nuôi cấy (nhiệt độ 25 ± 2oC) với tốc độ khoảng
100-150 vòng/phút
Cứ 2 ngày lấy ra một bình nuôi cấy, lọc sinh khối tế
bào bằng máy hút chân không, cân lượng mẫu tươi thu được. Sau đó, đem sấy mẫu ở 65oC trong 2 giờ để cân trọng
lượng khô. So sánh với kết quả ban đầu để theo dõi tốc độ
sinh trưởng của callus
Xây dựng đường cong sinh trưởng (từng 2 ngày) cho
trọng lượng tươi và trọng lượng khô của tế bào.
b. NGHỆ ĐEN
Sử dụng các cây nghệ đen in vitro, cắt các đoạn gốc
lá cấy vào môi trường tạo callus. Sau 4-5 tuần các callus
màu vàng bắt đầu xuất hiện. Tách các callus này cấy lên
môi trường nhân callus (thành phần môi trường nhân callus
tương tự môi trường tạo callus).
222
Các bước tiến hành nuôi cấy tế bào dịch huyền phù
tương tự như đối với lúa.
Bài 6 Nuôi cấy protoplast
I. Mục đích và yêu cầu
Kỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình
của Takebe (1971) khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast
của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lập protoplast,
đó là:
223
- Cơ học (không dùng các enzyme)
- Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước)
- Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời)
Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng
độ của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là
tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ
nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt
phấn), mô sẹo, tế bào đơn...
Protoplast thực vật có ba ứng dụng chính sau:
- Chọn dòng tế bào biến dị soma.
- Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật.
- Biến nạp di truyền: đưa các cơ quan tử, virus và
DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
1. Dụng cụ
- Bình tam giác (100 mL), đĩa petri nhựa đã vô trùng
(disposable)
- Giấy thấm vô trùng
224
- Forceps, kéo, dao mổ
- Đĩa petri thủy tinh vô trùng
- Giấy parafilm, giấy nhôm
- Tube ly tâm loại 15 mL
- Lưới lọc có đường kính lỗ lọc 65µm
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ sấy
- Laminar
- Tủ lạnh
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
- Máy cất nước 2 lần
- Máy ly tâm (tốc độ 6000-10000 rpm), rotor cho
tube 15 mL
225
- Máy lắc
- Buồng đếm
- Kính hiển vi đảo ngược
3. Hóa chất
- Dung dịch enzyme tách protoplast
- Môi trường phân lập (PI), môi trường nuôi cấy
protoplast (PC)
- Cồn 90%
- Nước cất vô trùng
III. Phương pháp tiến hành
1. Nguyên liệu thực vật
Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm
nguyên liệu tách protoplast. Sử dụng các lá được tách trong
ngày.
2. Chuẩn bị môi trường
226
Dung dịch enzyme tách protoplast:
+ Onozuka cellulase R10 0,5 %
+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
+ pHmôi trường ~ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc
Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm.
3. Tiến hành
a. Ngày thứ nhất
Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và
đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ
các mảnh lá.
Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại
50 mL bổ sung 10 mL dung dịch enzyme tách protoplast.
Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối
qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
b. Ngày thứ hai
227
Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc
vô trùng ( = 65µm) đặt trong cốc loại 50 mL.
Bổ sung thêm 3 mL dung dịch rửa (PI + 10%
mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc
tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-
enzyme của bước trên.
Bổ sung thêm 2 mL dung dịch rửa để rửa
proptoplast hết khỏi lưới lọc (dùng forceps để giữ lưới lọc
trong lúc rửa). Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng
cộng 15 mL) vào tube ly tâm loại 15 mL và ly tâm 50g
trong 10 phút.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu
thể bằng 10mL dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm
1mL dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và
protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt
nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành
tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50g
trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt
dung dịch (thể nổi).
228
Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục
nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm
sạch, thêm 10 mL dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ
lắng xuống đáy tube và có dạng viên (cục tròn).
Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 mL dung
dịch rửa. (lần rửa này có thể bỏ qua nếu các “hạt”
protoplast quá bé hay quá ít chỉ vừa đủ dùng). Loại bỏ phần
nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng
chừng 1 mL môi trường nuôi cấy protoplast (PC).
Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và
ước lượng mật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm
10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000
tế bào/mL môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang
một đĩa petri vô trùng.
Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở
28oC.
c. Ngày thứ ba
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn hùynh
229
quanh ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi
trong 2 ngày.
d. Ngày thứ năm
Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải
thưa ra.
e. Ngày thứ bảy
Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy protoplast, số tế
bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một
mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự
nhiễm bẩn không.
Chú thích: Nếu có thể tìm thấy tập đoàn tế bào,
protoplast có thể được pha loãng với môi trường nuôi cấy
sạch có lượng nhỏ mannitol để quan sát sự phát triển của
callus có nguồn gốc protoplast. Sau khoảng 8-10 tuần,
callus này có thể được chuyển lên môi trường tạo chồi.
230
231
Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens
I. Mục đích và yêu cầu
Các thực vật chuyển gen đã được tạo ra bằng nhiều kỹ thuật
khác nhau. Có hai phương thức chính:
- Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điện, vi tiêm, siêu
âm, silicon carbide, thông qua ống phấn, điện di ...
- Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vật): Agrobacterium
tumefaciens.
Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém hơn
cả là chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium.
Agrobacterium tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm
có trong đất, thường được sử dụng để tiến hành biến nạp di
truyền trên đối tượng thực vật. Đoạn DNA muốn chuyển
vào một cây nào đó có thể được thao tác dễ dàng trên E.
coli và sau đó chuyển trở lại vào Agrobacterium. Việc
chuyển gen vào thực vật qua Agrobacterium đã thực hiện
thành công trên nhiều loại cây: thuốc lá, đậu tương, các cây
họ đậu nhiệt đới, bông cải, khoai tây.
232
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
1. Dụng cụ
- Bình tam giác (250 mL), ống nghiệm có nắp vặn
- Giấy thấm vô trùng
- Forceps, kéo, dao mổ
- Que cấy vi sinh
- Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng
- Giấy parafilm
- Giấy nhôm
- Tube eppendorf (1,5-2 mL)
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ sấy
- Laminar
233
- Tủ lạnh
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
- Máy cất nước 2 lần
- Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 mL
3. Hóa chất
- Môi trường cơ bản MS
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB
- Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và
cefotaxim
- Agar
- MgSO4 10mM
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng:
NAA và BAP
- Cồn 90%
- Nước cất vô trùng
234
III. Phương pháp tiến hành
1. Nguyên liệu
- E. coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper
plasmid)
- E. coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+
insert DNA (gen ngoại lai mang tính trạng mong muốn)
- Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404.
- Cây thuốc lá in vitro.
2. Chuẩn bị môi trường
2.1. Môi trường LB
- Bacto-tryptone 3 g
- Yeast-Extract 1,5 g
- NaCl 3 g
- Nước cất đến đủ 300mL.
2.2. Môi trường LB đặc
235
Môi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL.
2.3. Môi trường LB-R
Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin.
2.4. Môi trường LB-K
Môi trường LB bổ sung 50 µg/mL kanamycin.
2.5. Môi trường LB-RK
Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin và 50
µg/mL kanamycin.
2.6. Môi trường MSO
- MS đầy đủ
- Agar 0,8 %
- Saccharose 3 %
- pHmôi trường ~ 5,8
236
2.7. Môi trường nuôi cấy (MS 104)
- MS đầy đủ
- Agar 0,8 %
- Saccharose 3 %
- BAP 2 mg/mL
- NAA 0,2 mg/mL
- pHmôi trường ~ 5,8
2.8. Môi trường chọn lọc (MS SEL)
- MS đầy đủ
- Agar 0,8 %
- Saccharose 3 %
- BAP 2 mg/mL
- NAA 0,2 mg/mL
- Kanamycin 1,5 mL
- Cefotaxim 2 mL
- pHmôi trường ~ 5,8
237
2.9. Môi trường tạo rễ (MSR)
- MS đầy đủ
- Agar 0,8 %
- Saccharose 3 %
- Kanamyin 1,5 mL
- Cefotaxim 2 mL
- pHmôi trường ~ 5,8
Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản
trong điều kiện không có ánh sáng. Chất kháng sinh được
bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường (để nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-60oC) ở điều kiện vô trùng của
laminar.
3. Tiến hành
3.1. Triparental mating (giao phối bộ ba)
a. Nuôi cấy vi khuẩn
238
Các môi trường LB lỏng được chuẩn bị trong các ống
nghiệm có nắp vặn, khử trùng để tiến hành nuôi cấy các vi
khuẩn. Các bước như sau:
Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28oC, thời gian 48 giờ (nuôi trước khi tiến hành
triparental mating 2 ngày).
Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E.
coli có mang vector pBI 121 + insert DNA trong môi
trường LB-K (nuôi trước khi tiến hành lai bộ ba 1 ngày).
b. Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩn
Các bước tiến hành:
Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly
tâm tốc độ khoảng 10.000 rpm, trong 5 giây.
Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để
trộn (để loại bỏ chất kháng sinh).
Lập lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 µl môi trường LB.
3 loại vi khuẩn trên được cấy lên mặt đĩa chứa môi
trường LB đặc (đã được chuẩn bị trước các đĩa petri chứa
239
môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất
kháng sinh, mỗi loại vi khuẩn lấy 100 µl. Dàn đều trên bề
mặt môi trường đến khi khô hoàn toàn.
Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28oC, đến khi các “thảm”
vi khuẩn được hình thành.
c. Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trộn 3 loại
vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinh
Các bước tiến hành:
Lấy 5 mL MgSO4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một
ít vi khuẩn trong “thảm” đã nuôi cấy ở trên cho vào để có
một dịch lỏng.
Chuẩn bị 4 tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube
900 µL MgSO4 10 mM.
Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.
Lấy 100 µl mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên 5
đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ sung 2 % agar.
240
Nuôi trong 2-3 ngày tại 26-28oC trong điều kiện tối để
phát triển khuẩn lạc.
Nuôi cấy 1 khuẩn lạc trong 5 mL môi trường LB-RK tại 26-28oC từ 1-2 ngày để thu được sinh khối E. coli, xác định
Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào 15% glycerin và bảo quản ở -70oC).
3.2. Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium
Các bước tiến hành:
Lấy 1 khuẩn lạc ở trên cấy chuyển vào 5 mL môi trường
LB-K lỏng, nuôi cấy lắc ở điều kiện tối, nhiệt độ từ 27- 28oC trong 2-3 ngày.
Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy ở trên bằng cách cho
môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạc vào tube eppendorf,
ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc độ 12.000 rpm. Lặp lại nhiều lần.
Loại bỏ môi trường LB ở phía trên, các tế bào thu được
hòa tan trong 1 mL môi trường MSO lỏng.
Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO trên đĩa petri.
241
Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước
ước chừng khoảng 0,5-0,7 cm 0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân
lá), chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO.
Tế bào Agrobacterium hòa trong 1 mL môi trường MSO
được cấy chuyển sang môi trường MSO có chứa các mảnh
lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ trong 10 phút.
Sau khi đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách
chuyển chúng lên giấy lọc vô trùng trong 0,5-1 phút. Các
mảnh lá đó được nuôi trên môi trường nuôi cấy (MS 104)
trong 2 ngày trong tối.
Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường
chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy trong 3 tuần để tái sinh
chồi ở điều kiện chiếu sáng.
Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường
MSR để tạo rễ. Các cây hoàn chỉnh được chuyển sang nuôi
cấy trong các bình. Các cây này là các cây đã được tiến
hành chuyển gen. Để biết việc chuyển gen có thành công
hay không cần phải tiến hành các thí nghiệm kiểm tra (tách
chiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với cặp primer
242
đặc hiệu cho insert DNA và điện di sản phẩm PCR trên
agarose gel 1 %).
TÀI LIỆU ĐỌC THÊM
- Murashige T and Skoog F. 1962. A revised medium for
rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.
Physiol. Plant. 15:473-497.
- Nistch JP and Nistch C. 1969. Haploid plants from
pollen grains. Science 163:85-87.
- Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture
concepts and laboratory exercises.
- Street HE. 1977. Plant tissue and cell culture. Blackwell
Scientific Publication. Osney, Mead, Oxford, UK.
- Nguyễn Văn Uyển. 1995. Những phương pháp công
nghệ sinh học thực vật. T1 và T2. NXB Nông nghiệp. TP
Hồ Chí Minh.
243
