Tiểu luận: Công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng

ậ Ti u lu n

ể

Ọ Ệ

CÔNG NGH SINH H C TRONG CH N T O GI NG CÂY TR NG

Ọ Ạ Ố Ồ

Đ tài:

ề

Detection of RAPD Polymorphisms in Gladiolus Cultivars With Differing Sensitivities to Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli

Đa hình RAPD

các gi ng Hoa Lay n c m ng khác nhau

ở

ả ứ

ố

ớ

ơ v i Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli bai bao fusarium.pdf Sinh viên: Nông th Quỳnh Anh

ị

L p: ớ CNSH K52

ụ ụ M c l c

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results and Discussion

References

Abstract

• Fusarium oxysporum Schlecht.Cha. F.

ơ

ệ

quan tr ng nh t. ọ • M t trong nh ng ph

ộ

ươ

ể ụ

là tác nhân gây b nh cây lay n ấ ng pháp ữ thân thi n môi tr ng nh t đ ấ ể ườ ệ ki m soát lây lan c a nó là s ử ủ d ng gi ng cây tr ng nh y c m ả ồ ít nh t v i tác nhân gây b nh.

ố ấ ớ

ạ ệ

sp. gladioli (FOG)

• T i v trí mô n m ề ằ ở ố

ấ

RAPD phân tích b ộ ưở ị ỉ

ạ ị ố ế ự ử ụ ừ ơ ự ọ

ứ ớ

g c thân trong nhi u gi ng kháng đã sinh ra các l p suberin c ứ ớ ng s i n m. ch s tăng tr ợ • S d ng ch th phân t ử gen t 9 cây lay n l a ch n là kháng và nh y c m v i FOG, ti n hành xác minh m c ế ả ạ đ đa hình DNA. ộ

ố ượ

• Nucleic acid t ng s khai thác đ c th c ổ ự ng pháp s d ng DNA chi t ế ử ụ ươ ươ

3 giai đo n sinh ng pháp ạ ở

• ng. ệ ử ụ ệ

ồ

hi n v i ph ớ ệ tách t mô cây theo ph ừ chloroform-phenol tr ưở th c hi n thí nghi m b ng cách s d ng 14 ự ằ m i v i Taq polymerase và n ng đ m i ộ ồ ồ ớ khác nhau.

Introduction • 5 trong nh ng đo n m i đ ữ

ồ ượ

ệ

ộ

ươ

c 3

ở ả

c th ử ạ nghi m không cho đa hình, 5 m i ồ cho đa hình. Thông qua đó xac đ nh ị c m t hoăc nhi u tính kháng. đ ề Các test cho k t qu l p lai ả ặ ế ng. giai đoan sinh tr ạ ấ ự ệ

ặ

cây

ẽ ủ ế

ưở • Nhân dòng các đo n DNA đa hình quan tâm s cho th y s hi n di n ệ khác nhau c a các gen đ c tr ng ư liên quan đ n tính kháng FOG ở lay n.ơ

Introduction

ọ

ơ

ộ

ế ớ ặ

quan tr ng, ế i nh là m t cây ư ộ n ho c cho s n xu t hoa ấ ả

ườ ạ ấ

ự

ộ

ủ ng cành và hoa th

ẩ i ế ớ

ượ

ả ng ph m. ươ c tìm th y trên toàn th gi ậ ệ

ề

• Cây lay n là m t hoa kinh t canh tác trên toàn th gi tr ng trong v ồ c t. Các lo i n m soilborne, Fusarium ắ oxysporum Schlecht: Fr.. F. sp. gladioli (Massey) Snyd. Và Hans. (FOG) (Massey, 1926;. Nelson và c ng s , 1981), gây vàng và th i thân và c , là chính. Nó làm gi m ố ch t l ấ ượ N m này đ ấ ấ c lan truy n qua v t li u nhân và đ ượ gi ng, (et al Garcia-Jimenez, 1986.). ố

Introduction

ự

ố

ể ể ạ ấ ạ

ả

ớ

ư

• Đ ki m soát và s lây lan c a ủ lo i n m này, các gi ng cây ít nh y c m v i tác nhân gây b nh, ệ c đ a vào thí và các hóa ch t đ ấ ượ nghi m. ệ

c

ọ

ượ

ố

ề ữ

• Đi u quan tr ng là tìm đ ợ

ể

ị

ệ

nh ng gi ng cây phù h p nh y ạ c m hay kháng đ xác đ nh s ự ả hi n di n c a gen liên quan đ n ế ủ ệ s bi u hi n tính kháng. ự ể

ệ

Introduction

ạ ự

ọ

ở

ộ

• M t lo t các xét nghi m kháng FOG, ch ệ ủ ộ y u d a vào xét nghi m sinh h c đã đ c ượ ệ ế báo cáo b i (Palmer và Pryor, 1958; Jones và Jenkins, 1975; Dallavalle và Zechini D'Aulerio năm 1994; Löffler và c ng s , ự 1997; Straathof et al, 1998)... Tuy nhiên, các c ch kháng v n ch a đ ư ơ

c hi u rõ ể

ượ

ế

ẫ

• (Remotti và Loffler, 1996). đã quan sát c ơ

ậ

ế

ủ

ỉ

ở

ng

ủ ế ươ

ế

ố

ch xâm nh p c a s i n m FOG vào cây và ợ ấ mô ch qua các chu bì thân , ch y u là g c qua các đ t thân, và v t th ố (Dallavalle và Pisi, 1993).

ề

ủ

ệ

ể ệ

ả ứ bào, t o thành rào c n ngăn

ế

th hi n kháng qua vi c ph n ng v i ớ suberization t ả ch n các tác nhân n m.

• Các mô c a nhi u m u cây đem thí nghi m ẫ ệ ạ ấ

ặ

Introduction

ị

ộ

ố

ơ

ứ

ỉ ủ ớ

ự

ả ượ ả

ươ

ọ ạ

t ở

ứ

ả

ộ

• Dùng ch th RAPD phân tích b gen c a 9 m u gi ng cây ẫ lay n v i m c đ kháng, m n ộ ẫ c m khác nhau v i FOG đã ớ c th c hi n đ xác đ nh đ ị ể ệ ng kh năng áp d ng ph ụ pháp sàng l c ADN phân bi ệ m c đ nh y c m và kháng cây lay n.ơ

Materials and Methods

• S d ng mô cây lay n

ử ụ

ỉ

ắ

ồ

ơ ở đ nh ng n l y m t ng hay ủ ọ ấ ch i 3 kho ng cm, lá t cây ừ ả cao 30 cm • Cây m đ

ộ

ồ

c tr ng trong m t ẹ ượ nhà kính ch ng côn trùng ố t trùng. trong đ t ti ấ ệ

Materials and Methods

• Tách chi t DNA ế

1 g

c chi ố ượ l ng theo ph Acid nucleic t ng s đ ổ i trong nit ươ

c mô t

ậ ớ

c deionized ( n ướ ướ ử

t xu t t ế ấ ừ ng pháp mô t ươ ơ ỏ b i Prince et chloroform-phenol đ ả ở ượ al. (1993), ngâm trong 100 μLof1XTEbuffer (10 mM Tris Cl [pH 8], 1 mM EDTA [pH 8]) và pha loãng t i 20 ng / μL. Cu i cùng t p trung ố c kh ion) vô trong n trùng.

c ổ 1 μL DNA t ng s pha loãng này đã đ ố

ế

ệ c l u tr i đây và đ ượ ư d ả ướ ữ ở

ượ s d ng trong các xét nghi m khuy ch đ i ạ ử ụ mô t 1XTEbufferat-20 ° C.

Materials and Methods

• Phân tích RAPD • RAPD đ

c t o ra b ng cách s d ng

ượ ạ

ằ

ử ụ c ượ

operon c a (Alameda, CA,

ồ t k t ế ế ừ

12 m i khác nhau dài 10-Mers đ thi ủ USA): AD14, AD18, AF07, AF13, AG12, AL07, AL16, AM14, AM19, M18, S05, và C08.

• Ngoài ra, hai m i dài 11-mer, AL16 + và c s d ng. T t c các

ồ ượ ử ụ

ấ ả

+ AM14 cũng đ m i

ồ ở ồ

n ng đ c a 20 μM. ộ ủ

Materials and Methods

B ng 1. RAPD h n h p s d ng. ỗ

ử ụ

ả

ợ

ầ

Thành ph n Mix A Mix B Mix C Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50 MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50 d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00 Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50 Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods

i 2-4 l n c a m i gi ng m u

c l p l ượ ặ ạ

ủ

ầ

ẫ

ỗ

ố

ệ riêng r v i

ẽ ớ 2 n ng đ

ồ

ộ dNTP và taq polymerase

Thí nghi m RAPD đ ệ trong 25 μL Th nghi m ử (B ng 1) ả

B ng 1. RAPD h n h p s d ng. ỗ

ử ụ

ả

ợ

ầ

Thành ph n Mix A Mix B Mix C Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50 MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50 d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00 Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50 Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods

t đ g n m i (36-45 °C) ồ c khi thi ệ

ử

ệ ộ ắ t l p các ế ậ ướ i u. Các đi u ki n ệ ề ố ư trong 45 chu kỳ

c s d ng

• M t lo t các nhi ạ c th nghi m tr ượ ả ứ ệ ượ ử ụ

ộ đã đ đi u ki n ph n ng t ề tiêu chu n đ ẩ nh sau:

ư

94 ° C trong 2 phút, và

• 94 ° C trong 1 phút, • 38 ° C trong 1 phút, • 72 ° C trong 2 phút, • bi n tính ban đ u ầ ở

Ống có

ở

ả ứ

ế 72 ° C trong 8 phút. m r ng ở ộ ch a các thành ph n ph n ng ngo i tr ạ ừ ầ ứ DNA đ i ch ng âm.

ứ

ố

Results and Discussion

ệ

c th

ệ

ượ

ồ

• Sau các thí nghi m trên, các xét nghi m ệ t c đ ớ ấ ả các m i b ng cách s d ng n ng đ các ộ thành ph n khác nhau (B ng 1C).

ng xuyên th c hi n v i t ự ử ụ ả

ườ ồ ằ ầ • phân tích b ng đi n

ằ ộ ệ

ớ

ệ di trong gel agarose 2% v i 1 b đ m X TBE (0.09 M Tris- borat, 0,002 M EDTA, 1 M EDTA [pH 8]),

gel v i ớ ethidium bromide

• Sau đó nhu m ộ và ch p nh ụ ả

Results and Discussion

• Các thí nghi m so sánh 2 Taq ệ

ả

ấ

ả

ữ

ượ ắ

ồ

ớ ơ ề

ơ ớ

ồ ớ

ượ

ơ

ồ

A-B, Hình 1 polymerase (B ng 1 a-b) cho th y các băng DNA thu c v i nh ng m nh Stoffel đ ng n h n (hình 1b, m i AL16) và nhi u h n (hình 1b, m i AL16 +) h n so v i thu đ c v i cùng m t m i và Polymed Taq (Hình ộ 1a).

ng s n xu t

ườ

ấ

ả

ng nh đa hình đáng tin

• Đo n ạ Stoffel th ỏ ộ ượ

ề

m t l c yậ ở

ỉ ử ụ ế

ượ

• B i vì đi u này, ch s d ng Taq polymerase v i mix A .K t qu ả ớ c nhóm các vach băng thu đ ko phân bi

t rõ ràng (hình 2a)

ệ

Results and Discussion

• c th c hi n

ệ m uẫ cũng

v i đa hình phân ị

ớ t rõ ràng (Hình 2b). Thí nghi m đ ự ệ ượ v iớ Mix C s n xu t các ấ ả đã đ c ượ xác đ nh bi ệ

• S d ng h n h p C ử ụ ỗ ợ : 5 m i ồ (C08,

ấ

ưở

ồ ấ

ả

S05, AD18, AM19, AM14 +) không gi ng ố có các c u hình đa hình cho m u ẫ và giai đo n tăng tr ng khác ạ nhau. • B n m i (AL7, AF07, M18, AF13) ố s n xu t băng đa hình không ả t ộ ớ ươ ạ ệ . FOG c a ủ m uẫ th nghi m ng quan v i m c đ nh y c m ứ ử

Results and Discussion

ấ

ặ

ể

m c 2 kbp (hình 3).

• Năm m i ồ cho các c u hình tiêu bi u cho m t ho c ộ ẫ kháng. nhi u ề gi ng m u ố Đ c bi t, các m i AG12 đã ồ ệ ặ không t o ra m t ộ đo n ạ 0,5- ạ kbp trong gi ngố WP nh ng ư đã t o ra m t d i chênh ộ ả ạ l ch ở ứ ệ

Results and Discussion

i đ nh y c m c a các ả

ị khác không liên quan gi ngố th ử

• Các đa hình hi n thể ủ ạ Primer AD14 (hình 4a)

t ớ ộ nghi m. ệ

Results and Discussion

• ả

ồ

ệ ệ

ử ụ

ở

• M t m u không có Hình 1. hình nh rapd v i 3 m i th ngi m dài ử ớ 10-mers th nghi m ử b ng cách s d ng ằ Polymed Taqpolymerase v i mix A (a) và mix B ớ (b) ộ ẫ

(H2O),1 m u có (H2O) ẫ đ i di n đ i ch ng âm ố ứ ệ ạ

• 1-kbp DNA ladder

Results and Discussion

Hình 2. Đa hình

ế

ồ

ử ụ

ử ụ

c u hình thu ấ 6 gi ng c t đ ố ượ ừ cây lai n sau khi ơ khu ch đ i v i ạ ớ m i AL16, AL16 +, và AM14. (a) S d ng mix B . (b) S d ng mix C.

Results and Discussion

ớ ủ

ả ồ ấ

t tách t ộ ử ụ ừ ế

ng c a cv WP. Trong khi gi ng NL ủ ố

RAPD v i m i AD14(4a) , DNA c a cvs WP và NL. K t qu cho th y m t nhóm 1.1 kb. Nhóm này cũng th y khi ch y rapd s d ng DNA chi 2 giai ạ đo n sinh tr ưở hi n di n nhóm 0.9kbp. ế ấ ạ ể

S d ng m i AL16 (hình 4b), m u WP thi u m t ế ệ ử ụ

ạ ẫ ấ ả ệ ệ ạ

ộ t c các giai đo n ấ ẫ ỉ

ệ ể ủ ồ đo n 0,7-kbp hi n di n trong t c a các m u khác. Băng 0.5-kbp ch xu t hi n trong ủ t c các giai đo n c a m u WP và trong th không t ẫ ấ ả ho t đ ng c a m u NL. ủ ạ ộ ạ ẫ

Results and Discussion

ế

5 cvs

ơ

ạ ớ

ế

ả

ộ

• Hình 3. Đa hình liên quan đ n tính kháng FOG thu đ c t ượ ừ cây lai n sau khi khu ch đ i v i m i ồ AG12 trong mix C (B ng 1). M t m u ẫ không (H2O) là đ i ố ch ng âm.

ứ

Results and Discussion

ở

ấ

(a) và (b) cho th y ệ ố c th hi n cho ể ệ

ng trong đi u ki n Hình 4. hình nh RAPD ả ồ AD14 ở ả ơ ả ượ ở ả ưở ạ ề ệ

v i 2 m i ớ m i AL16 ồ k t qu c b n gi ng h t ế nhau đ ấ ả c 3 giai đo n t c t sinh tr C.(b ng 1). ả

Đa hình liên quan đ n ế

ề ủ

ố

nhi u tính kháng c a WP và NL. Đ i chúng âm là H2O, và lader.

Results and Discussion

ạ ẫ

t c các giai ượ ng c a m u NL v i 2 m i (AL16 + ớ c hi n ệ

c quan sát trong t Đa hình đã đ đo n sinh tr ưở ủ và AM14) th y r ng các nhóm khác bi ấ ằ di n đo n 0,7 và 1 kbp, t ấ ả ồ t đ ệ ượ ng ng (Hình 2b ) ươ ứ ệ ạ

Đ i ch ng không có m u có ho c không có s ự ẫ

ặ t rõ ràng t ấ ệ

t c các m i s d ng. ố ế ữ ứ ạ ẫ khu ch đ i các c u hình khác bi nh ng m u cây lay n v i t ớ ấ ả ừ ồ ử ụ ơ

Results and Discussion

ử ụ ầ

• Đây là báo cáo đ u tiên RAPD s d ng trên ế ệ ể

cây lay n đ phát hi n đa hình liên quan đ n ơ tính kháng FOG.

• ả ế ấ ị

ấ

c th nghi m v i FOG ệ ụ ể ớ ẫ ẫ ử ượ ữ ớ

Các k t qu cho phép xác đ nh các c u hình đa hình c th v i m u 2 kháng nh t trong s ố nh ng m u đ (Dallavalle và Zechini D'Aulerio, 1994)

• ự ế ả ạ ấ

RAPD đánh d u liên quan đ n s nh y c m c phát hi n trong khác nhau v i FOG đã đ ệ ớ lily (al Straathof và c ng s , 1996.) ượ ự ộ

Results and Discussion

• Đánh d u RAPD cũng đã đ

ượ

c báo i thích 85% s này không ố

ậ

ấ cáo đ gi ể ả có kh năng kháng (Jansen, 1996). ả ố

ệ ữ

ể ữ

• Đ xác nh n m i quan h gi a ả

ề ạ ả ể ệ

ổ

nh ng k t qu này và đ t o ra tính ế kháng v i FOG, nhân b n các trình t ớ ự t c a đo n RAPD th hi n kháng t ố ạ ủ t đ xác đ nh trình t nh t là c n thi ự ị ế ể ầ ấ ng đ ng v i gen có th tham DNA t ồ ể ớ ươ ng trao đ i ch t gia vào con đ ấ ườ phenol ho c suberin . ặ

References

•

•

• •

•

•

•

•

•

•

• •

•

•

•

•

•

•

•

•

Palmer JG and Pryor RL (1958) Evaluation of 160 varieties of Gladiolus for resistance to Fusarium yellow. Plant Dis Reptr 42: 1405-1407. Prince JP, Davis RE, Wolf TK, Lee I-M, Mogen BD, Dally EL, Bertaccini A, Credi R, and Barba M (1993). Molecular detection of diverse mycoplasmalike organisms (MLOs) associated with grapevine yellows and their classification with aster yellows, X-disease, and elm yellows MLOs. Phytopathol 83: 1130-1137. Remotti PC and Löffler HJM (1996) The involvement of Fusaric Acid in the Bulb-rot of Gladiolus. J Phytopathology 144: 405-411. Schilirò E, Predieri S, and Bertaccini A (2001) Use of random amplified polymorphic DNA analysis to detect genetic variation in Pyrus spp. Plant Mol Biol Rep 19: 271 a-h. Straathof TP, van Tuyl JM, Dekker B, van Winden MJM, and Sandbrink JM (1996) Ge- netic analysis of inheritance of partial resistance to Fusarium oxysporum in Asiatic hy- brid lily using RAPD markers. Acta Horticulturae 414: 209-218. Straathof TP, Roebroek EJA, and Löffler HJM (1998) Studies on Fusarium-Gladiolus In- teractions: The Development of a screening Assay. J Phytopathology 146: 83-88.

Dallavalle E and Pisi A (1993) Fusariosi del gladiolo: penetrazione e colonizzazione del patogeno osservate al SEM. Micologia italiana 3: 91-99. Dallavalle E and Zechini D’Aulerio A (1994) Resistenza varietale del gladiolo al Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli. Italus Hortus 4: 19-26. Garcia-Jimenez J, Piera VJ, and Alfaro A (1986) Mycological prospection of the gladiolus corm imports in Spain. Acta Horticulturae 177: 537- 540. Jansen RC (1996) A general Monte Carlo Method for mapping quantitative trait loci. Ge- netics 142: 305-311. Jones RK and Jenkins JM Jr (1975) Evaluation of resistance in Gladiolus sp. to Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli. Phytopathol 65: 481- 484. Löffler HJM, Straathof TP, Van Rijbroek, and Roebroek EJA (1997) Fusarium resistance in Gladiolus: The development of a screening Assay. J Phytopathology 145: 465-468. Massey LM (1926) Fusarium rot of Gladiolus corms. Phytopathol 52: 567-572. Nelson PE, Horst RK, and Woltz SS (1981) Fusarium disease of ornamental plants. In: Nelson PE, Tousson TA and Cook RJ (eds), Fusarium: disease, biology and taxonomy, pp. 121-128. Pennsylvania State University Press.

bai bao fusarium.pdf Thank you !