Tiểu luận Công nghệ sinh học thực vật: Sản suất Anthocyanyl trong nuôi cấy rễ bất định củ cải đường L. CV. Peking Koushin

NG Đ I H C CÔNG NGHI P TH C PH M TPHCM

ƯỜ

Ạ Ọ

Ự

Ẩ

Ệ

KHOA CNSH – KTMT

CÔNG NGH SINH H C TH C V T

Ự Ậ

Ọ

Ệ

Đ tàiề

Ả

Ủ Ả

Ễ Ấ

Ấ Ấ

Ị

S N SU T ANTHOCYANYL TRONG NUÔI C Y R B T Đ NH C C I NG L. CV. PEKING KOUSHIN Đ

ƯỜ

GVHD:

N i dung

ộ

1 Tóm t

tắ

2 Gi

i thi u

ớ

ệ

3 V t li u và ph

ng pháp

ậ ệ

ươ

4 K t qu và th o lu n

ế

ả

ậ

I. Tóm t

tắ

ủ ừ đo n r cây ạ ễ

T o r b t đ nh c a c C i đ gi ng in vitro trong môi tr ng L. cv. Peking Koushin t ng 1/2 MS l ng + 0,5 mg/l IBA ạ ễ ấ ị ố ủ ả ườ ườ ỏ

ấ ườ ả

i đi u ki n chi u sáng ỏ ướ ố

i. Khi nuôi c y d ng ng 1/2 MS l ng + 0,5 mg/l IBA s n ề ấ có 0,5 mg/l IBA s n xu t ế ấ ườ ờ

R b t đ nh nuôi c y trong môi tr ễ ấ ị xu t anthocyanin trong bóng t ấ 14 gi anthocyanin nhi u h n môi tr ệ ả ng có 0,1 ho c 0,5 mg/l NAA /ngày, r b t đ nh trong môi tr ễ ấ ị ơ ề ườ ặ

ủ

ủ ế t xu t r cho ấ ễ ằ

ấ ế ớ ễ

Quá trình th y phân acid c a các d ch chi ị th y anthocyanidin chính là pelargonidin Ngoài ra, so sánh tinh s ch hoàn ạ t xu t r b t đ nh b ng toàn chi ấ ễ ấ ị DPPH v i r nguyên c a cây cùng ủ lo i trong nghiên c u này ứ ạ

II. Gi

ớ

i thi u ệ

ng pháp

ươ

ưở

ng c a r b t đ nh ủ ễ ấ ị

III. V t li u và ph ậ ệ 1. S hình thành và sinh tr ự và củ

R a m t l n n

c c t vô trùng

ộ ầ

ử

ướ

ấ

Đ t h t trên môi

ớ

ử

ố

ạ

ứ

H t gi ng ngâm v i ớ ethanol 75% trong 30 phút

Kh trùng v i 2% NaOCl có ch a 0.1% Tween 20 trong 10 phút

ặ ạ ng 0.5% tr ườ agar + 0.5% saccharose. Nuôi c y d i đi u ề ướ ấ ki n chi u sáng ế ệ 250C 14h/ngày

ở

c c t vô trùng

R a 3 l n b ng n ầ

ử

ằ

ướ

ấ

ng pháp

ươ

ưở

ng c a r b t đ nh ủ ễ ấ ị

III. V t li u và ph ậ ệ 1. S hình thành và sinh tr ự và củ

ng pháp

ậ ệ

ươ

t anthocyanin

III. V t li u và ph 2. Phân tích s c tắ ố a. Tách chi ế

ng pháp

ậ ệ

ươ

III. V t li u và ph 2. Phân tích s c tắ ố b. Th y phân acid c a anthocyanin ủ

ủ

ng pháp

ậ ệ

ươ

III. V t li u và ph 3. Phân tích HPLC

ờ ư

ẫ ễ ấ ị ấ ữ ượ ủ ằ ẩ ớ

Th i gian l u c a anthocyanidins chính trong các m u r b t đ nh và r ễ ủ c so sánh v i nh ng ch t chu n c a nguyên phân tích b ng HPLC đ anthocyanin (pelargonidin chloride, cyanidin chloride, peonidin chloride và delphinidin chloride).

Đi u ki n c a HPLC ủ ệ ề

C t: TOSOH TSKgel ODS-80Ts, 4.6×150mm ộ

Pha đ ng: 0.4% TFA trong H2O – CH3CN (9:1→7:1 trong 25 phút) ộ

T c đ dòng ch y: 0.8ml/min ả ố ộ

Nhi t đ c t 400C, b c sóng 520nm ệ ộ ộ ướ

III. V t li u và ph ậ ệ 4. Phân tích đ nh l

ng pháp ng anthocyanin

ươ ượ

ị

t riêng ế L c qua nút bông, l y

ẫ

ứ ấ ọ t. Đo 2ml d ch chi ế ị 521nm đ h p thu ở ộ ấ và tính toán n ng đ ồ ộ ng anthocyanin t ươ

ngứ

Chi kho ng 20mg m u ả khô v i 2ml ớ methanol 80% có ch a 1% TFA b ng sóng siêu ằ âm trong 20 phút.

ươ

III. V t li u và ph ậ ệ 5. Tinh s ch hoàn toàn b ng DPPH ạ

ng pháp ằ

• Tinh s ch hoàn toàn b ng ph

ng pháp s 1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl ằ ươ ử

• Hòa tan 10mg d ch chi

ạ (DPPH)

t t i ho c khô vào 1ml methanol 80% có r t ế ừ ễ ươ ặ

• Thêm vào m i dung d ch m u 500μl dung d ch DPPH ethanol 0,5mM và

ch a 1% TFA r i l y 100μl. ứ ị ồ ấ

ỗ ị ị

400μl methanol 80% có ch a 1% TFA. ẫ ứ

i 20 phút ắ ả ứ ố ở

nhi ệ ộ

• Sau đó l c nh , h n h p ph n ng đ ẹ ỗ ồ ph n trăm tinh s ch đ ạ

ượ ợ t đ phòng r i đem đi đo đ h p thu ượ ể 517nm. ằ ỷ ệ ứ ầ

ộ ấ ạ ằ c đ yên trong bóng t ở c tính b ng công th c: ủ

T l Tinh s ch hoàn toàn b ng DPPH (%) = 100 – (Abs c a m u ph n ng)/(Abs c a m u ki m ch ng) × 100 ả ứ ứ ủ ể ẫ ẫ

ng pháp

ng pháp 2–

ằ

ươ

III. V t li u và ph ươ ậ ệ 6. Đo ho t tính ch ng oxy hóa b ng ph ố ạ thiobarbituric acid (TBA)

ượ ằ

Ho t tính ch ng oxy hóa đ ố ph c đo b ng ng pháp TBA s d ng acid linoleic ử ụ ạ ươ

ng pháp

ng pháp 2–

ằ

ươ

III. V t li u và ph ươ ậ ệ 6. Đo ho t tính ch ng oxy hóa b ng ph ố ạ thiobarbituric acid (TBA)

ph n trăm ho t tính ch ng oxy hóa đ ầ ứ ạ ằ ố

ượ ủ ẫ ố

c tính b ng công th c: T l ỷ ệ Ho t tính ch ng oxy hóa (%) = 100 – (Abs c a m u ph n ng)/(Abs ả ứ ạ c a m u ki m ch ng) × 100 ủ ứ ể ẫ

ả

IV. K t qu và th o lu n ậ 1. S hình thành và sinh tr

ế ự

ưở

ng c a r b t đ nh ủ ễ ấ ị

ả

ưở

ng c a r b t đ nh ủ ễ ấ ị

ng s c t ưở

ế ự S n l ả ượ sinh tr ơ

ể ự ẹ

ủ ễ ấ ị ở

IV. K t qu và th o lu n ậ 1. S hình thành và sinh tr c a r b t đ nh ắ ố ủ ễ ấ ị ng trong bóng t i th p ấ ố h n so v i r nhánh c a cây ủ ớ ễ nguyên v n cùng lo i trong nghiên ạ c u này ứ

ệ

ượ ề

ườ

ố c c y truy n R b t đ nh đ ấ ễ ấ ị vào môi tr ng 1/2 MS l ng b ổ ỏ sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) ho c ặ IBA (0,1; 0,5 mg/l), nuôi c y ấ

S phát tri n c a r b t đ nh không b nh h ng b i hai đi u ề ị ả ưở i. Khi nuôi c y ki n ánh sáng/t ấ ố r b t đ nh (kho ng 45mg tr ng ọ ả ễ ấ ị ng t l i/bình 100ml) trong môi ượ ươ ng 1/2 MS l ng + 0,5 mg/l tr ỏ ườ IBA,chi u sáng trong b n tu n, ế s hình thành s c t tăng rõ r t ự ắ ố ầ ệ l ng l c t c đ 100rpm ỏ ộ

chi u sáng 14gi ở /ngày ho c ắ ố ế ờ 250C, ặ

trong bóng t i.ố

ng anthocyanin c a r b t đ nh ủ ủ ễ ấ ị

ả ượ ấ

ấ ấ

ng c a auxin lên s n l ưở ng anthocyanin r t th p ng anthocyanin th p ng anthocyanin trung bình ng anthocyanin cao B ng. nh h Ả ả ± : S n l ả ượ  : S n l ả ượ  : S n l ả ượ  : S n l ả ượ

S c t đ (Anthocyanin) ắ ố ỏ

Bóng t iố 14h chi u sáng ế

0.1mg/l NAA

± 

0.5mg/l NAA

± 

0.1mg/l IBA

c nuôi c y trong bình tam giác 100ml (ch a môi ứ ấ ±

0.5mg/l IBA 250C, chi u sáng ượ ỏ ả ế

±  ầ ở  R b t đ nh đ ễ ấ ị tr ườ 14 gi /ngày ng ½ MS l ng + 0.5 mg/l IBA) kho ng 4 tu n ờ

ế

ậ

ả

IV. K t qu và th o lu n ả 2. Phân tích anthocyanidin b ng HPLC

ằ

ủ Hàm l ượ

ị

ấ ị

ằ ứ

ằ

ấ

ẩ ng khô), m c

ượ ự Phân tích HPLC đ ể ch ng minh r ng anthocyanidin chính c a r b t đ nh và r ủ ễ ấ ị ễ c c a Peking ủ ủ Koushin là pelargonidin

ng anthocyanin c a r ủ ễ b t đ nh đông l nh ạ ng (0,15% tr ng l ượ ọ khô) cao h n c a r ủ ễ ơ c m t chút (0,11% ủ ộ tr ng l ặ ọ dù s khác nhau không có ý nghĩa ở m c 5% c a F test ủ ứ đ Th y phân s c t ắ ố ỏ r b t t t tách chi ế ừ ễ ấ đ nh và r c b ng ễ ủ ằ HCl 2M, sau đó phân tích b ng HPLC và so sánh v i b n ch t ớ ố chu n anthocyanidin: pelargonidin clorua, cyanidin clorua, peonidin clorua và delphinidin clorua

K t qu phân tích HPLC c a ủ ế ả

ch t chu n (A) và d ch th y ủ ấ ẩ ị

phân c a r c (B) và r b t ủ ễ ủ ễ ấ

đ nh (C). ị

Hàm l ng anthocyanin trong nuôi ượ

ng c y r c và r b t đ nh. Hàm l ấ ễ ủ ễ ấ ị ượ

anthocyanin t ng đ ng v i l ng ươ ươ ớ ượ

pelargonidin. Cây đ c tr ng kho ng ượ ả ồ

3 tháng và khi r b t đ nh đ c 4 ễ ấ ị ượ

tu n tu i thì nuôi c y trong đi u ki n ấ ệ ề ầ ổ

chi u sáng đã đ ế ượ c phân tích. S ố

ạ ệ ẩ li u trung bình c a 3 l n thí nghi m. ệ ủ ệ ầ

ố ấ ễ ấ ị

Thanh đ i di n cho sai s chu n. 1, r khô; 2, nuôi c y r b t đ nh ễ khô.

ả

ậ

ng và hàm l

ng anthocyanin trong

ượ

IV. K t qu và th o lu n ả 3. Th i gian tăng tr ưở nuôi c y r b t đ nh

ế ờ ấ ễ ấ ị

i) trong môi tr ng ½ ượ ọ ườ

ỏ ả 250C, chi u sáng 14 gi ế ng t ờ ở ươ /ngày trong máy l c t c đ ộ ắ ố

ng t i và khô c a r b t đ nh tăng lên nhanh chóng trong 2 tu n Nuôi c y r b t đ nh (kho ng 45 mg tr ng l ấ ễ ấ ị MS l ng + 0.5 mg/l IBA 100rpm Tr ng l ọ ủ ễ ấ ị ươ ượ ầ

đ u tiên, tăng đ n tu n th 7. Athocyanin s n xu t giai đo n đ u quá trình ứ ế ầ ầ ấ ạ ả ầ

nuôi c y, kh i l ấ ố ượ ng l n nh t trong tu n 5 (kho ng 250 μg/ bình 100ml), sau ả ấ ầ ớ

đó gi m d n. ả ầ

ng (A) và hàm ưở

ủ c nuôi c y trong môi tr

/ngày.

ủ ầ

ệ

Th i gian tăng tr ờ ng anthocyanin trong nuôi c y r l ấ ễ ượ b t đ nh c a Peking Koushin. R b t ễ ấ ấ ị đ nh đ ng ượ ườ ấ ị ½ MS l ng + 0.5 mg/l IBA trong 4 ỏ 250C, chi u sáng 14gi tu n, ờ ế ầ ở S li u trung bình c a 3 l n thí ố ệ nghi m. Thanh đ i di n cho sai s ố ạ ệ chu nẩ

ế

ả

IV. K t qu và th o lu n ậ 4. Tinh s ch hoàn toàn b ng DPPH ằ

ạ

ạ ả ứ ủ ằ ị

nh ng m u khác nhau đã đ ị ừ ữ ả ị

ẫ ạ ấ ấ ớ ị

Tinh s ch hoàn toàn b ng DPPH c a 0.2 và 1 mg/ml dung d ch ph n ng chu n b t c kh o sát. 0.2 mg/ml dung d ch ượ ẩ ph n ng cho th y ho t tính th p h n nhi u so v i 1 mg/ml dung d ch ả ứ ề ơ ph n ng ả ứ

ệ

ươ

ấ ị

i. S li u trung bình trong 3 ố ệ l n thí nghi m. Thanh đ i ạ ầ di n cho sai s chu n. 1, r ẩ ễ ố Peking Koushin t i; 2, r ễ Peking Koushin khô; 4, r ễ b t đ nh Peking Koushin khô; 5, r Aokubi t ễ ươ