Tiểu luận Kỹ thuật di truyền: Phương pháp SSR

Ộ

Ệ

T NG LIÊN ĐOÀN LAO Đ NG VI T NAM

ƯỜ

Ạ Ọ

Ứ

Ắ

NG Đ I H C TÔN Đ C TH NG

Ổ TR

Ụ

Ọ Ứ Ậ

KHOA KHOA H C NG D NG Ề Ộ B MÔN: KĨ THU T DI TRUY N

ầ

ị

TS: Tr n Th Dung

ự

ệ

Sinh viên th c hi n:

ị

ễ

Ngô Th Dung61203022 Nguy n Kim Dung61203023 Nguy n Hoàng Thêm61203134

Ch đ :

ƯƠ

ủ ề PH

NG PHÁP SSR

Ộ

N I DUNG Ề ƯƠ Ệ

I. KHÁI NI M V PH

NG PHÁP

SSRs

Ặ

Ể

II. Đ C ĐI M

Ơ

Ế

Ế Ộ III. C CH Đ T Bi N HÌNH

THÀNH MICROSATELLITES

Ạ

IV. CÁC LO I SSRs

ƯƠ

Ị

V. PH

NG PHÁP XÁC Đ NH

MICROSATELLITES (SSRs)

ƯƠ

Ệ

VI. PH

NG PHÁP PHÁT HI N

MICROSATELLITES (SSRs)

Ữ

Ụ

Ủ

Ứ VII. NH NG NG D NG C A

MICROSATELLITES

Ư

ƯỢ

Ủ

Ể

VIII. U NH

C ĐI M C A

ƯƠ

PH

NG PHÁP

MICROSATELLITES

Ả

Ệ

IX. TÀI LI U THAM KH O

I.KHÁI NI M:Ệ

ự ặ ệ ủ ứ ự ặ • Microsatellite là nh ng trình t đ c bi t c a DNA mà có ch a s l p

ừ ữ ế ạ ố ế t l i n i ti p 2 đ n 6 bp

ọ

còn g i là SSR (simple sequence repeats), STR (short tandem repeats), VNTR (variable number of tandem repeats).

Ví d :ụ • • • • GTGTGTGTGTGT hay (GT)6 CTGCTGCTGCTGCTG hay (CTG)5 ACTCACTCACTCACTC hay (ACTC)4

Ặ

ọ ả

ị ố ượ ự ch n trong vi c l p b n đ phân t ồ

ứ Ể II.Đ C ĐI M: ử ự ệ ậ ồ , s Microsatellite là marker đ ồ ủ ố ổ tiên c a cây tr ng ữ xác đ nh nh ng gi ng cây tr ng, đánh giá ngu n g c t ự ế cho m c đích nghiên c u qu n th cây tr ng và s ti n hóa là vì

ể ế ị

ồ ẫ ắ ố ộ

ử ụ ễ ệ ặ ị c l a ồ ồ ầ Có tính đa alen và bi n d cao ộ Là marker đ ng tr i ậ Phân b ng u nhiên kh p b gen sinh v t ằ D dàng xác đ nh b ng PCR s d ng các primer đ c bi ụ • • • • t.

ộ ể ợ ẽ ầ ặ ạ ả ồ th có m t locus đ ng h p s có cùng s ố l n l p l i trên c hai

ể ị ợ ẽ ầ ặ ạ ố l n l p l i khác nhau trên hai

ễ M t cáộ nhi mễ ộ ể ắ s c th , trong khi m t cá th d h p s có s ắ nhi m s c

ể ữ ủ đ

ể

ữ ự c dùng nh thể đ

ượ ọ vùng c g i là ọ ấ . Đi u này r t quan tr ng ả ng ứ ủ ư primer c a ph n ẽ ả ồ ạ

ữ ữ ả ố th . Nh ng vùng xung quanh locus c a microsatellite, ề hai bên (flanking region) có th có cùng trình t ượ ở b i vì nh ng vùng hai bên có PCR khi nó sẽ khu chế đ i microsatellite, và vùng hai bên này s b o t n ọ ỉ gi a các gi ng hay th nh tho ng gi a các h .

•

ế ả ứ ể ượ

ị c khu ch đ i đ xác đ nh ph n ng dây chuy n ử ụ ấ ỗ

ể nhi

ạ ệ ộ t đ cao đ tách các s i đôi, sau ầ ở ộ ủ ợ ự m i và ph n m r ng c a trình t

ặ

• Quá trình này cho k t qu nhìn th y trên gel agarose ho c ệ t cho vi c khu ch ấ

ế ầ ng nh DNA c n thi

ế ộ ự ạ

ạ ộ ề ạ ể (SSRs có th đ ằ polymerase (PCR) quá trình, b ng cách s d ng chu i duy nh t ở ế ụ ị • DNA liên t c b làm bi n tính ủ ồ ể đó làm l nh đ cho phép nucleotide thông qua SSRS ấ ế ả ỏ ỉ ộ ượ polyacrylamide , ch m t l ạ ở đ i b i vì theo cách này thermocycling t o ra m t s gia tăng theo c p ố s nhân trong phân đo n nhân r ng.

ầ ủ ạ ặ ạ ự ấ ặ i có trình t r t đ c

ấ n) c a các đo n l p l ộ ạ t và th ng nh t chung cho cùng m t đo n DNA trên gen không

ữ ệ ể

ể ừ ế t

ể ặ

ẩ ặ ự ặ ạ l p l t đ

ữ ể Ủ NGUYÊN LÝ C A SSR MARKER ườ ự • D a vào hai đ u (vùng s ố ệ bi ư ộ t cá th trong cùng m t loài, nh ng gi a các cá th trong cùng phân bi ị ặ ạ ố ầ ặ ạ ủ ơ ộ i là khác nhau. T đó, thi i c a đ n v l p l m t loài s l n l p l ồ ặ ứ ả ệ ế k các c p m i đ c hi u đ nhân b n các c p DNA trên gen ch a các ệ ượ ự ả ệ trình t c s i. Đi n di s n ph m PCR cho phép phân bi ố gi ng và khác nhau gi a các cá th trong cùng loài.

Ế Ộ Ơ Ế III. C CH Đ T BI N HÌNH HÀNH MICROSATELLITE

ế ơ ế ộ ế ể c hi u bi

ầ ủ ả ấ ư ượ ẫ ề ế ượ c nhi u ng thuy t đ ộ t m t ậ i ch p nh m

ả ỗ ườ i trong quá trình gi m phân và

C ch đ t bi n hình thành Microsatellites v n ch a đ cách đ y đ . Tuy nhiên có hai gi là do 1) quá trinh b t chéo l 2) quá trình tr i trong quá trình sao mã. ắ ượ ỗ t l

ự ượ ỗ ủ t l

ủ

ấ ị ặ ạ

ợ ớ ợ ố ẹ i khác v i s i b m . Đi u

ữ ố ầ ặ ạ ề i (thêm vào

ả ặ ớ

ặ ạ ự l p l i ng n ắ này thành

ộ ượ ỗ i có t l ề ầ ặ ạ

ự ắ ặ ữ ả ủ ệ th ng s a ch a cho s b p c p sai cũng

ổ ủ

ả ổ ớ ầ ặ ạ ề ữ ả i c a polymerase (Polymerase slippage) 1. S tr ả ị ắ Khi DNA tái b n, enzyme polymerase không tìm th y v trí c a nó và c t ị ặ ạ ơ ớ ơ ề i hay thêm vào quá nhi u đ n v l p l b t đ n v l p l i. ố ầ ặ ạ ớ ả ế K t qu là s i m i có s l n l p l ỏ ổ ự i thích cho nh ng s thay đ i nh trong s l n l p l này gi ề ầ ặ ạ i). ho c b t đi m t hay nhi u l n l p l ữ ạ thể khu chế đ i nh ng trình t Sự tr ế ệ ế ti p. ế i qua các th h k nhi u l n l p l ố ạ ử ệ Bên c nh đó, hi u qu c a h ố ộ ế ọ ộ đóng m t vai trò quan tr ng trong t c đ bi n đ i c a microsatellite. ự ắ ặ ồ 2. S b t c p không đ ng đ u trong gi m phân ơ ơ ế C ch này gi i thích cho nh ng thay đ i l n h n trong s ố l n l p l i.

ễ ễ ơ ồ ướ ề ự ặ ạ i, và nhi m i, nhi m s c th A có quá nhi u s l p l

ắ ự ặ ạ ể i.

ồ ạ ủ i c a microsatellite

ổ

ấ ườ ng không có

ể ự ế ộ tác đ ng có ế

ườ ộ khi chúng đ t bi n, thông th i, 90% nh ng microsatellite đã bi

i, ầ ớ thể đo l ng là ế ượ t đ vùng mã hóa ngườ đ gây h i vàạ ấ c tìm th y trong ở ườ ng

ượ c bi

i thích có

ể ữ ấ ở ị là khi tìm th y trong vùng mã ấ ự ả ề ẽ ạ

ự ộ ẽ

ự ạ t cho s đa d ng di

i ba nucleotide. S gi i khác s gây h i nhi u cho vùng ị ồ ầ ủ ự ế ấ ổ ẩ

ữ

ườ ườ ớ ộ ộ

Microsatellite cung c p ngu n c n thi vi khu n, s bi n đ i alen c a microsatellite trong vùng mã hóa ộ ng khác nhau. Nghĩa là m t ng, và m t alen dài v i ệ ể thích nghi v i nh ng môi tr ớ thể thích nghi v i m t môi tr ộ ề ầ ặ ạ ườ ớ i có th thích nghi v i m t môi tr

ặ ộ ợ ể ỏ protein ng n cóắ

ể ơ

ạ

ữ ự ể ầ ẩ ng khác nhau. T

ớ ng khác. Đ c bi ớ ơ ả ự ố ươ ng t ể ự ạ

ằ ự ấ ề ạ

Trong s đ d ể ắ s c th B thì có quá ít s l p l Nguyên nhân t n t Microsatellite là DNA vô nghĩa, và s bi n đ i ph n l n không có tính c ượ ệ ch t rõ r t.Chúng th trên ki u hình, và không ườ i.ợ Ở ng ữ có l ủ ộ vùng không mã hóa c a b gen. Khi tìm th y ệ ế t là gây b nh. Thú v microsatellite đ ặ ạ ự l p l ườ ng là s hóa, microsatellite th ặ ạ ạ th là do nh ng d ng nucleotide l p l ế mã hóa, vì nó s gây ra s đ t bi n xê d ch khung. ế ề Ở truy n. ượ đ c cho là đ alen ng n cóắ nhi u l n l p l t là, thể làm cho vi khu nẩ ít nh t, và m t s i nh s i nhợ ỏ ệ ơ protein dài h n có th làm nó dính h n và gây b nh h n (Moxon và Wills, ủ ể ẽ ả ầ ự 1999). Do đó, có s đa d ng trong qu n th s đ m b o s s ng sót c a ườ , Kashi qu n th vi khu n trong nh ng môi tr ộ ủ và Soller (1999) tin r ng s đa d ng c a microsatellite có th là m t cách ể ề đ đ n bù cho s m t đi tính đa d ng di truy n do ở ự ọ ọ b i s ch n l c di

IV. CÁC LO I SSRs (cid:0) ầ ứ ị ặ ạ ấ ạ ủ ơ i (26 l n – dinucleotide

ấ ậ ượ c tìm ở ự ậ th c v t là đ ng v t có vú ch y u là GT/AC,

(cid:0) ả

ắ ồ

ề

ị i 1 l n mà có th c u t o t ự ặ ạ l p l

ầ ầ i 5 Mb. Satellites th i vài ở

ể ớ ớ ắ

Ạ Căn c vào c u t o c a đ n v l p l ạ repeat) chúng ta có tri nucleotide lo i di nucleotide đ ủ ế ề ở ộ th y nhi u AA/TT, AT/TA ự ắ ạ ể Chúng ta có th phân ra làm 3 lo i (hoàn h o không có s ng t ế ợ ự ố ợ ph i h p và ng t quãng bao g m k t h p quãng trong trình t ề ở ắ ạ ặ ạ i, ng t quãng b chèn b i 1 hay nhi u base. nhi u lo i l p l ể ấ ạ ớ ạ i). Satellites là đo n trình t ậ ườ ng t p trung ượ ử ụ c s d ng trong ề ượ ử ụ ủ ộ ể c s d ng nhi u trong quá trình

ễ t ki u gen c a các cá th mà đ ồ ph n trăm c a genome có th l n t ể ủ vùng tâm đ ng c a nhi m s c th do đó nó it khi đ ể ệ phân bi ả ậ l p b n đ gen g n vùng tâm đ ng

ị ủ ở ầ ii). Minisatellites có m t t

ở ớ ộ i hàng trăm ho c hàng nghìn v trí khác i 0,530 kb. i t

ặ ạ ộ ơ ườ 10 bp cho t ươ ể ẫ ặ ị ặ ạ ừ đó m t đ n v l p l ể i ta có th dùng ph

ng pháp m u dò ặ ạ t riêng cho

ữ ể ư ể ượ ử ụ ể ấ i. Nó đ

ể ạ ở ườ ng ố ủ ệ c s d ng đ xác ẫ ệ nhau trên gennome mà ệ Đ phát hi n ra minisatellite ng phóng x . Nh ng thông tin này có th t o nên thông tin đ c bi ừ t ng cá th nh ki u "d u vân tay" ậ ồ ị đ nh quan h trong gia đình và ngu n g c c a các m u v t

ạ ặ ạ ắ ướ i ng n 26bp và kích th c iii). Microsatellite là các đo n l p l

ỗ m i locus là 20100 bp.

ơ ơ ả ề ụ ượ ứ ơ ả c ng d ng nhi u h n c vì nó đ n gi n h n,

ề ủ ư

ả

ố ươ ổ

ầ ả

ữ ề

ấ ầ

ủ ậ ị ị

ế ớ ể ượ ằ ị c b ng PCR t ừ ộ ượ m t l

Microsatellite đ ố ề phân b đ u trên genome. ộ ề Các thông tin v đa allen c a m t locus cũng nh trên nhi u locus ộ ộ ể ủ ơ ể ượ cùng m t lúc có th đ c phân tích m t cách đ n gi n và nó có th đ ể ư ớ ề ề l n cho các ph ng pháp th ng kê đ đ a ra nhi u thông tin b ích v ự ọ ể ệ ấ c u trúc qu n th , h ph , khoa h c hình s . ấ Microsatellite có tính đa hình r t cao (chi u dài) là nh ng allen ộ ộ ế ồ t cho m t marker. đ ng tr i nó có các tính ch t c n thi ầ ố ộ T n s đ t bi n l n, nó tuân theo đ nh lu t menden, v trí c a nó ể ắ ễ trên nhi m s c th có th xác đ nh đ ng DNA ỏ ấ r t nh . ƯƠ Ị

ộ ố ư ị

ị ỏ ằ ắ ủ ụ ớ ạ . i h n

ệ ằ ạ

ạ ừ IV. PH NG PHÁP XÁC Đ NH MICROSATELLITES (SSRs) ể Đ tìm và xác đ nh Microsatellites ta có m t s các th t c xác đ nh nh sau: 1.C t nh ADN genome b ng các enzym gi ạ 2.Phân tách các đo n ADN b ng đi n di trên gen th ch agarose 1%, phân tách các đo n t 300 500bp

ể

ắ ấ ẫ

ẫ ự ự ADN t ượ ớ ươ ứ ng ng v i trình t

ớ ụ ươ ứ t ng ng v i Microsatellite

ộ ể

ự ư ằ ADN n m ngoài trình

ế ế ồ SSR, đây là vùng đ thi

ổ ể ồ ủ

ợ ỉ

ộ ơ

ở ặ ị ướ ữ ể ộ ợ i m t nucleotide A n a. Do v y đ xác đ nh kích th ỏ c các alen đòi h i

ể ạ ậ ộ ả

ạ

ủ ộ ộ t đ

ụ ư c th c a b gen, ví d nh trong m t exon c a m t c thi .

ồ ụ ể ủ ộ ế ế ằ t k b ng tay ể ượ ể ạ ả ở

ồ ẫ các loài đ u m i.

c v trí ể ượ ẫ ủ ạ ặ ẩ ộ

c phát tri n b i các phân đo n nhân b n ầ ồ ượ ư c đ a vào m t plasmid ho c vi khu n ẩ ừ ẫ ượ ấ 3. Chuy n lên màng lai (nylon membral) theo nguyên t c southernblot. ạ 4. Dùng các m u dò là các đo n ADN đã đ c đánh d u cho lai ghép ớ v i màng lai, các m u dò là các trình t Microsatellite mà chúng ta quan tâm. ạ 5. So sánh và khôi ph c các v ch AND mà chúng ta quan tâm 6. Chuy n vào m t vector sequencing. ị 7. Sequencing và xác đ nh SSR cũng nh trình t ự t k m i t ướ ự ể 8. T ng h p m i và ki m tra s đa hình c a Microsatellite. kích th c ặ ừ ủ c a các alen ch khác nhau t hai nucleotide tr lên m t khác trong quá trình ị ể ỏ ổ t ng h p PCR, polymeraza có th t o thêm ho c có th b sót m t đ n v ặ ạ l p l ệ quá trình đi n di ph i dùng gel có đ phân tách cao T o Microsatellites m i: N u ế bi ế ượ ị ồ gen, m i có th đ M i SSR ng u nhiên có th đ ng u nhiên c a DNA t Các phân đo n này ng u nhiên đ vector ,sau đó đ c c y vào vi khu n ecoli.

Ữ Ứ Ụ Ủ VI. NH NG NG D NG C A MICROSATELLI

ệ ẩ Trong chu n đoán b nh:

ự ề

ộ ố ệ ể ủ ệ

ư ư ớ ấ ữ ủ ữ

ị ữ ụ ệ ề trách nhi m v

ệ ứ ề ự ấ ậ ự ổ ề Vì ADN Microsatellite thay đ i v chi u dài trong s phát tri n c a ữ m t s b nh ung th , chúng là nh ng marker r t h u ích trong vi c dò tìm, phát hi n ung th s m. B i vì tính đa hình c a chúng h u ích trong ự s nghiên c u các liên k t đ đ nh v nh ng Gen chi nhi u s m t tr t t ở ế ể ị ọ ề di truy n h c

ể ầ ứ Nghiên c u qu n th :

ệ c s d ng đ phát hi n ra thay đ i đ t

ộ ể ượ ử ụ ủ ự ự ươ ể ạ ể ể ầ

ự ậ ầ ữ

ệ ứ ể ể ủ ủ ữ ữ ầ ầ ầ ổ ộ ADN Microsatellite có th đ ng ng t trong qu n th , hi u ng c a s phân đo n qu n th và s t tác c a nh ng qu n th khác nhau. Microsatellite h u ích trong s nh n ể ớ ra c a nh ng qu n th phôi thai và qu n th m i

Ư ƯỢ Ủ Ể ƯƠ Ể VIII. U ĐI M VÀ NH C ĐI M C A PH NG PHÁP

Ư ể 1. u đi m

ươ ậ ợ ớ ủ ự ng pháp i to l n c a s phân tích microsatellite là ph

ở ậ ớ ự đ u nành (Glycine ng l n s đa hình. M t

ệ ộ locus ơ ữ t các ượ c báocáo là có 26 alen . H n n a, khá năng phân bi

ể ươ ượ ự ế ợ ng pháp locus đ c ki m tra làm cho ph

ị ồ ả ệ

ố ệ

ồ ị ợ ử ộ ể ễ có th d dàng

ẽ ồ

ự ệ ầ ộ ủ ữ ủ ề

ữ

ơ ữ ớ ị ư th h F1 s làm cho

ẽ ở ữ ả

ậ ệ ượ ệ ọ ị c xác đ nh, vi c sàng l c các v t li u

ự ế

ệ ầ ữ ế Thu n l này bi uể hi n sệ ố l ượ max) đ cá thể khi có s k t h p các này r t hấ ữ ụ d ng trong các thí nghi m dòng ch y gen, xác đ nh cây tr ng và phân tích m iquan h cha con . Microsatellite là marker đ ng tr i, do đó d h p t cượ đ ả ị xác đ nh. Tính đ ng tr i c a microsatllite s gia tăng s hi u qu ể ự ộ và đ chính xác c a nh ng phép tính toán di truy n qu n th d a ữ trên nh ng marker này so v i nh ng marker khác, nh AFLP và ị ợ ử ở ế ệ ệ RAPD. H n n a, vi c xác đ nh d h p t ễ ố ả ệ ự nh ng phân tích ph h , s lai gi ng, dòng ch y gen tr nên d dàng h n ơ Khi các primer SSR đã đ ử ụ s d ng ạ ơ ữ ậ kỹ thu t này hoàn toàn không đ t ti n. H n n a, s khu ch đ i ữ sự xác đ nh nh ng primer SSR thích ữ SSR gi a các loài nghĩa là ầ ợ h p không c n thi ắ ề ị t trong nh ng loài có quan h g n.

ộ ụ ượ ế ế ở t k c thi

ấ

ạ thể khu chế đ i các loài Malus khác

ữ ế Ví d , ba b primer microsatellite đã đ Malus domestica (Rosaceae), các microsatellite này cung c p 35 loci, trong số đó có nh ng primer có 2.H n chạ

ạ ươ ế ủ ụ

ề ồ

ế ề ế ạ ở ể ng pháp microsatellite là không th áp d ng phân tích H n ch c a ph trên m t hộ ệ th ng l n bao g m nhi u loài có quan h di truy n xa nhau, ệ ề ớ ố ẫ ỉ ệ ộ đ t bi n quá cao d n đ n 2 tr ng i. đi u này là do microsatellite có t l

ứ ấ ườ ự 2 bên vùng microsatellite th

vùng flanking ế ộ ụ ữ ể ậ

ủ ở ng Th nh t: Trình t khác nhau gi a các loài do đ t bi n, vì v y khó có th áp d ng primer microsatellite c a loài này cho loài khác.

ế ả ế ứ ỉ ệ ộ

đ t bi n cao nên khi 2 loài có cùng k t qu phân microsatellite, ví d nh AC19, chúng ta cũng không

ụ ư ồ ậ r ng 2 loài đó có cùng ngu n g c t ể ầ tiên ban đ u, vì có th

ủ ế

ủ ố ổ r i đ t bi n thành AC19, ế ồ ộ ồ ộ tiên c a chúng là AC20 r i đ t bi n thành AC19.

Th hai,: Do t l ớ ự tích v i 1 trình t ằ ể ế th k t lu n 1 loài phân ly từ tổ tiên c a chúng là AC18 còn 1 loài phân ly từ t ổ 40

Ệ Ả

ậ ồ ệ ả ấ

IX.TÀI LI U THAM KH O ỹ ạ Ph m Văn Du , 2005. Giáo trình k thu t tr ng cây ăn qu . Nhà xu t ả b n Hà ộ N i. Trang 105. –