ƯỜ Ạ Ọ Ự Ẩ Ệ TR NG Đ I H C CÔNG NGHI P TH C PH M
Ố Ồ THÀNH PH H CHÍ MINH
Ọ Ậ Ỹ Ệ ƯỜ KHOA CÔNG NGH SINH H C VÀ K THU T MÔI TR NG
Ậ
Ể
Ọ
Ậ
TI U LU N Ệ MÔN: NH P MÔN CÔNG NGH SINH H C
ề
Đ tài: Test Kit
Nhóm 8
ứ ề ế Chi u th 6, ti t 1112
ầ GVHD: Tr n Hoàng Ngâu
2
ồ Tp H Chí Minh, tháng 11 năm 2016
DANH SÁCH THÀNH VIÊN
Ụ
VÀ PHÂN CÔNG NHI M VỆ
ụ ọ MSSV Nhi m vệ Ghi chú H và tên
ị 2008130142 ngưở Phan Th Băng Trâm ệ Nhóm tr Hoàn thành ng
ổ
ươ ầ 2008130116 ng Hoàn thành Tr n Hoài Nam
ươ ủ ễ 2008140314 ng Hoàn thành Nguy n Cao Th y Tiên
ươ ầ ề ị 2008140083 ng Hoàn thành Vũ Th Xuân Hi n ầ Tìm ph n khái ươ ni m và ph ị ễ pháp mi n d ch ợ T ng h p ầ Tìm ph n ph ị ễ pháp mi n d ch ầ Tìm ph n ph pháp phân tử Tìm ph n ph pháp phân tử
3
Ụ Ụ M C L C
ệ ạ ả ệ
Ờ Ở Ầ L I M Đ U ộ ố ế ệ ử ụ
ộ ấ ơ
ấ ệ ữ ấ ầ ặ
ậ ộ ắ ớ ữ ữ ế c dùng ph bi n, th nh ng khi nh c t
ề ấ
ế ầ ả t này s
ệ ộ ố ạ ữ ớ ề ế ứ ỏ ượ c ệ ự ể ễ ề ư ế ụ ế t. Test kit là b công c nh th . ẩ ả ư i nh ng s n ph m ự c dùng trong r t nhi u lĩnh v c trong c công ẽ i c ch ho t đ ng chung t còn đ c p t
ế t thì bài vi ạ ộ ế ọ ộ ố ạ ượ ữ ệ ứ Trong cu c s ng hi n đ i, vi c b o v s c kh e đang là m t v n đ h t s c đ ụ ể ộ quan tâm. Vì th vi c s d ng m t công c đ có th d dàng h n trong vi c d đoán v ề ườ ng g p là r t c n thi nh ng căn b nh hay v n đ th ổ ế ượ Thu t ng “test kit” không đ ượ ộ ạ ấ ủ i r t quen thu c. Test kit đ c a nó thì l ạ ữ ệ nghi p hay nông nghi p. Ngoài nh ng lo i test kit g n gũi mà ta đã bi ơ ề ậ ớ ơ trình bày thêm m t s lo i m i. H n n a, bài vi ớ ạ ủ c a m t s lo i test kit nh ng lo i liên quan t ế ệ i ngành công ngh sinh h c và y d c.
ế ẽ ộ ố ấ ể ớ t s làm rõ nh ng m t s v n đ liên quan t
Bài vi ụ ể ể ộ ọ
ữ ế ủ ồ ơ ế ầ ơ ề i test kit đ ta có th hi u rõ h n ề ợ ể v công d ng và c ch c a chúng. Qua đó, chúng ta có th ch n cho mình b test phù h p ể ử ụ đ s d ng. Bài vi t bao g m các ph n:
ệ ạ Khái ni m và phân lo i.
ể ủ ự S phát tri n c a test kit.
ơ ế ẩ ứ ụ ễ ị C ch ch n đoán mi n d ch và ng d ng
ơ ế ẩ ử ứ C ch ch n đoán phân t và ng dung
ắ ẽ ệ ế ắ ế ả ậ t tham kh o nhi u tài li u khác nhau nên ch c ch n s có thi u sót. Mong nh n
ượ ự ề Bài vi ả c s thông c m và góp ý. đ
ả ơ Xin c m n!
N I DUNG
ệ ạ
Ộ I. Khái ni m và phân lo i:
1.Khái ni m:ệ
ượ ể Test kit đ
ụ ể ể ế ờ ộ ộ ỏ ẫ ộ ể ấ ộ ượ ộ ấ ề ụ ể ằ c hi u nôm na là b ki m tra. Nó là m t b công c đ ki m tra ả ng nh m u và ch xem k t qu
ộ m t v n đ c th nào đó b ng cách l y m t l ắ ờ trong m t th i gian ng n.
4
ỏ ọ ượ ả
ữ Tesst kit không ch là nh ng s n ph m nh g n đ ộ ể c bán ra ngoài th tr ệ ỉ ữ ư ệ ẩ
ệ ọ ị ườ ẩ ng ấ nh ta đã th y mà nh ng b ki m tra/ch n đoán trong b nh vi n hay phòng thí nghi m cũng g i là test kit.
ượ
ệ ả c thi ị ườ ụ ữ ỉ
ễ ử ụ ế ế t k nh g n, d s d ng, đ chính xác khá cao. ư ầ ộ ng n ấ ỏ ọ c ta ch là m t ph n nh và thông d ng nh ướ ộ ỏ ự ử ẩ Hi n nay chúng đ ướ ư ẩ Nh ng s n ph m đ a ra th tr que th thai, đo pH, test nhóm máu, test n c, hóa ch t trong th c ph m…
ướ ể ệ ạ Nh ng
ư ở ườ ẩ ậ ố ộ ố ệ các n c phát tri n thì còn có các lo i test kit phát hi n m t s b nh ng, viêm gan B/C, test vi khu n, test DNA, thu c…th m chí là test
ư ể nh ti u đ HIV.
2. Phân lo i:ạ
ề Có nhi u ph ụ
ươ ẩ ng pháp ch n
ươ ng ử d ng trong pháp s ươ ư ng test kit, nh ng ph ử ổ ế pháp ph bi n s ụ d ng trong ngành công ệ ngh sinh h c và y ượ c cũng nh các ngành khác là ph d ẩ ọ ư ễ ị ử ươ đoán phân t và ph ng pháp ch n đoán mi n d ch
5
(cid:0) ươ ễ ể ẩ Ph ị ng pháp ch n đoán mi n d ch, đi n hình là ELISA:
ấ ấ
ượ ế ứ ạ ả ụ ượ ộ ụ
ề c đi u ch nh đ ộ ụ
ổ ị ế ộ i) di đ ng đ
c s d ng đ ặ ộ ụ ệ ệ ậ
ả Test kit ELISA giúp cung c p k t qu chính xác, nh y c m và nh t quán. ể ỉ ỗ ầ c nghiên c u và các b d ng c đ M i đ u dò protein đ ề ặ ụ ượ ấ ạ ả ọ c cung c p đ nh y c m v m t sinh lý có liên quan. Ngoài ra, b d ng c đ ế ươ ẫ ạ ồ ổ ế ậ ử ụ ng xác nh n s d ng các lo i m u ph bi n, bao g m huy t thanh, huy t t ể ượ ử ụ ả ị ấ ế bào. Lysates (d ch phân gi và d ch n i nuôi c y t ề ụ xác nh n b d ng c phát hi n các protein truy n tín hi u ho c phosphoryl hóa.
Ư ể ủ ữ ộ u đi m c a nh ng b kit ELISA:
ố ượ Dùng trên 800 đ i t ng khác nhau.
ố ư ệ ấ ạ ấ T i u hóa cho hi u su t nh y, chính xác và nh t quán.
ế ả K t qu có trong 2,5 4h.
ề ạ ẫ ớ ị Xác đ nh v i nhi u lo i m u.
(cid:0) ươ ẩ ử ể Ph ng pháp ch n đoán phân t , đi n hình là PCR và RTPCR:
ấ ỏ T m t khuôn DNA r t nh nh giot máu, s i tóc hay m t t
ừ ộ ể ế báo… ng ằ ộ ế ả ợ ế ệ ườ i ụ l n lên đ n hàng tri u b n nh m ph c
ư ậ ự ớ ạ ta có th khu ch đ i chính xác, tr t t ả ứ ả ụ v cho quá trình kh o sát trong ph n ng
ượ ứ ư ệ PCR đ
ụ ư ổ ử ư ệ
ư ạ ầ ầ ơ ầ ứ ẩ ọ ấ ộ c ng d ng r t r ng rãi trong y h c : ch n đoán b nh ung th (tìm cung, gen APC trong ung th đ i tràng, gen BRC1 – HPV trong ung th c t ẻ ạ BRCA2 trong ung th vú, gen TPMT trong b nh b ch c u tr em, gen NF1,2 ườ ạ trong u x th n kinh…), nghiên c u kháng nguyên b ch c u ng i….
ậ ộ ươ ư ụ ể ệ Trong vi sinh v t thì PCR là m t ph ng tiên h u d ng đ phát hi n tác
nhân gây b nh.ệ
ể ủ ự II. S phát tri n c a test kit:
ệ ệ ẩ ọ 1960s and earlier
ề ầ ệ ị
ữ ữ ẩ 1980’s to 1990’s
ố ấ ấ Phát hi n nhi u d u n sinh h c và xét nghi m ch n đoán ệ ễ ể ặ ệ b nh ho c m m b nh. Xét nghi m mi n d ch phát tri n ượ Nh ng công ty d c bán và mua nh ng công ty ch n đoán, ủ ớ ữ ấ ơ h p nh t thành nh ng đ i th l n
ệ ệ 6 1983 t và Tag polymerase enzyme
ế ể ử ụ ạ
ụ ể ứ ệ
iớ
ữ ẩ ả 1991 Công ngh PCR s d ng nhi ạ đ khu ch đ i đo n DNA, đây là công c chính trong ế ọ nghiên c u công ngh sinh h c và phát tri n trên toàn th gi Ra nh ng s n ph m microarray
ố ẩ ử ầ 1997
ệ ệ ượ ủ
ườ 2000 i.
ệ ề c y quy n ứ ộ ệ đ ng, công ngh microaray tăng,
ạ ng m i hóa
ự ề ả 2002
ể ử ụ ẫ ổ 2003
ướ ng d n đ s d ng markers sinh ệ FDA phê chu n vi c bán các thu c th c n phân tích cho các phòng thí nghi m đ Hoàn thành công trình nghiên c u b gen ng ự ộ Phòng thí nghi m t ươ ượ đ c th ồ ở ộ Kh i đ ng đ án b n đ haplotype (SNPs)(d án HAPMAP) ợ ữ FDA t ng h p nh ng h ử ữ ọ h c trong nh ng th nghi m lâm sàng.
7
ể ể ủ ị ườ ẩ ố
Bi u đ v s phát tri n c a th tr ầ ầ ỉ ệ ầ ng ch n đoán trong ng nghi m (IDV) toàn c u ẩ ồ ề ự năm 2012, t l các nhu c u c u ch n đoán (theo ệ Genetic Engineering News)
ớ
ủ Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu l n năm 2007(theo top 10 Global Invitro Diagnostics c a Business Insights)
ơ ế ẩ ễ ị III.C ch ch n đoán mi n d ch:
ấ ủ ự ế ợ ủ ả 1. ể B n ch t c a s k t h p c a kháng nguyên và kháng th :
ữ ự ế ợ ụ ể ấ
ể ự ế ợ ầ ấ ộ ữ ả
ộ ầ ấ ế ị ộ
ầ ử kháng nguyên (nhóm quy t đ nh) và m t ph n r t gi ể ạ ộ ề ặ S k t h p gi a kháng nguyên và kháng th ph thu c vào c u trúc b m t ủ c a kháng nguyên và kháng th . S k t h p này x y ra gi a m t ph n r t giwois ạ ớ ạ ủ ữ h n gi a ph n t i h n c a ầ ử ph n t kháng th (trung tâm ho t đ ng).
ẩ ử ể ườ ộ kháng th th ng hóa tri hai, nghĩa cùng m t lúc có th
Theo Pauling, ph n t ầ ử ị
ể ế ợ ầ ử ề
ể ứ ợ ể ế ợ ể ạ ộ ể kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa tr nên cùng lúc kháng th . Cho nên kháng nguyên và kháng i trong khong
ướ ư ứ ợ ế ủ ạ ặ ướ ế ớ ế ợ k t h p v i hai ph n t ớ ấ có th k t h p v i r t nhi u ph n t ớ th có th k t h p v i nhau t o thành m t ph c h p hình m ng l ớ ề gian ba chi u. Vì kích th c quá l n nên ph c h p k t t a ho c ng ng k t.
ấ ứ ỉ ệ ớ
ể ế ợ ế ể ừ ế ặ
ươ ươ ử ử ệ ố ớ nào Kháng nguyên và kháng th có th k t h p v i nhau theo b t c t l ả ể nh ng ph n ng y u đi n u th a hoăc thi u kháng nguyên ho c kháng th . Ph n ể ứ kháng th . ả ứ ư ế ấ ng rõ r t nh t lúc s phân t kháng nguyên t ng v i phân t ng đ
8
ầ ử ự ờ
ặ ử ự ế ợ ế
ự ữ ệ ầ ố
ớ ử ệ ng v i các nguyên t
mang đi n tích âm, l c Van der Walls gi a hai phân t ữ ữ ự ố ủ ự ng tác gi a các đám mây đi n t m t ngoài và l c
ư ể ả kháng nguyên và kháng th x y ra nh các l c nh : ệ ọ ho c các nhóm hóa h c mang đi n tích trái ử hydro mang đi n tích ử ế th y n u ố ủ th y thì ữ ế c s b đ y ra t o nên l c g n k t gi a ọ ệ ử ở ặ ể ề ướ ẽ ị ẩ ả ể ế ợ ự ế ợ ố ủ ả ứ ạ ộ ữ S k t h p gi a ph n t ữ ự l c liên k t ion gi a các nguyên t ế ủ ấ d u; l c liên k t c a các c u n i hydro gi a các nguyên t ươ d ụ ươ ph thuôc vào t ả ế ệ di n ti p xúc c phía kháng nguyên và kháng th đ u có các acid amine ư ắ kháng nguyên và kháng th k t h p, n các acid amine th y đó, s k t h p này không ph i là m t ph n ng hóa h c.
ệ ữ ả ứ ể ấ ặ ộ
ể ỉ ế ợ
ế ợ ơ ể ạ ể
ệ ế
ộ ặ ộ ế ậ ờ ể ượ ử ụ đã bi ị i ho c đ ng v t có th xác đ nh nh kháng nguyên đã bi
ể ế ườ ế ự ế ướ ờ ớ t s ti p xúc tr
ủ ế ậ ặ ộ
ượ ạ c l ậ ọ ế ấ ạ ự
ừ ệ ễ ế ợ Ph n ng k t h p gi a kháng nguyên và kháng th r t đ c hi u. M t kháng ả ớ nguyên ch k t h p v i kháng th do nó kích thích c th t o thành. Do đó ph n ị ứ c s d ng đ xác đ nh kháng nguyên ng k t h p kháng nguyên và kháng th đ ể ủ ử ặ t. Hi u giá c a kháng th trong ho c kháng th n u m t trong hai phân t ể ế t và do huy t thành ng ể i nh kháng th đã đó cho bi c đó v i kháng nguyên. Ng ặ ể ữ t nh ng kháng nguyên khác nhau c a m t vi sinh v t có th nh n m t. M t bi ậ ự ể t c u t o kháng nguyên cho phép l a ch n thích đáng vi sinh v t khác s hi u bi ể dùng đ làm vaccine phòng ng a b nh nhi m trùng.
ươ 2. Ph ng pháp ELISA:
ộ ỹ ậ
ệ ể
ẫ ầ ứ ề ộ
ấ ượ ư ả ự ẩ ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là m t k thu t sinh hóa dùng ệ ể đ phát hi n kháng th hay kháng nguyên trong m c n phân tích. Hi n nay ELISA ượ ử ụ ự đ c s d ng r ng rãi trong nhi u lĩnh v c nghiên c u nh y h c, nông nghi p và ệ ặ đ c bi ọ ệ ẩ ng các s n ph m th c ph m. ể t là trong quy trình ki m tra an toàn ch t l
Nguyên t c: ắ Ph ươ ễ ệ ề ặ ấ ạ ị
ế ớ ệ ặ ể
ự ế ợ ớ ườ ấ ắ ộ ợ ơ ng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay xét ể ụ ấ nghi m h p th mi n d ch liên k t v i enzyme) có r t nhi u d ng mà đ c đi m ữ ự ề chung là đ u d a trên s k t h p đ c hi u gi a kháng nguyên và kháng th , trong đó ể ượ ng là c g n v i m t enzyme. Khi cho thêm c ch t thích h p (th kháng th đ
9
ộ
ấ ự ơ ấ ệ ữ
ộ ộ ả ứ ả ỏ ng đ màu mà bi ẽ ủ ả ứ ế ượ t đ
ế ế ượ ươ ệ ệ ấ ấ nitrophenol phosphate) vào ph n ng, enzyme s th y phân c ch t thành m t ch t có ể ớ ặ ứ ệ màu. S xu t hi n màu ch ng t đã x y ra ph n ng đ c hi u gi a kháng th v i ồ ườ kháng nguyên và thông qua c c n ng đ kháng nguyên hay ệ ể ầ kháng th c n phát hi n. ng pháp này đ t k cho vi c phát hi n và đ nh l Ph
ị ượ ng v t ch t nh ộ ượ ọ ở ư ậ ọ c g i b i m t tên g i
c thi peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đ khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
ị ả
ớ ậ ễ ơ ấ ạ ộ ấ
ể ở ộ ồ ạ ơ
ộ ả ượ ẻ ề ể ề ị
ư ư ấ
ả ứ
ẩ ồ ự ệ ể
ặ ậ Kĩ thu t này khá nh y và đ n gi n, cho phép ta xác đ nh kháng nguyên ho c ị ả m t n ng đ r t th p (kho ng 0,1 ng/ml). So v i kĩ thu t mi n d ch kháng th ẫ ậ phóng x (RIA Radio Immuno Assay) thì kĩ thu t này r ti n và an toàn h n mà v n ả c dùng đ xác đ nh nhi u tác nhân gây đ m b o đ chính xác nh nhau. ELISA đ ệ b nh nh virus, vi khu n, n m, kí sinh. ầ th và ch t t o màu; th c hi n qua hai b ễ ậ ấ ạ ả ứ ọ ợ ị
ữ ủ ả
ạ ơ ỉ ọ H
ể i phóng oxy ừ 2O2 đ oxy hóa c ch t ch th màu, do đó làm thay đ i màu c a ủ ổ ị ệ nghi m. [O] t ợ h p ể trong ấ dung ị d ch thí
Kĩ thu t ELISA g m ba thành ph n tham gia ph n ng là: kháng nguyên, kháng ướ c: ự ế Ph n ng mi n d ch h c: Là s k t h p gi a kháng nguyên và kháng th ả ứ Ph n ng hóa h c: Thông qua ho t tính xúc tác c a enzyme làm gi ử nguyên t ỗ h n
(Trích ừ t Chemicon International)
ạ 3. Phân lo i ELISA:
ự ế 3.1. Direct ELISA (ELISA tr c ti p)
10
ấ ủ ươ ơ
ệ ẽ ượ ắ ẽ ượ ằ ầ ạ Direct ELISA: Đây là d ng đ n gi n nh t c a ph ề ặ c g n tr c ti p lên b m t giá th và s đ ng pháp ELISA. Trong đó, kháng ệ c phát hi n b ng
ượ ắ ể ộ ả ự ế nguyên c n phát hi n s đ ấ ể m t kháng th duy nh t (kháng th này đã đ ể c g n enzyme).
ả ứ ự ế ệ ự ế ơ ồ S đ : Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA tr c ti p
ả
Ư ể ượ ộ ặ ườ ệ
ộ ng pháp này ch s d ng 1 kháng th g n vào m t epitope.
ả ấ ệ ớ ừ ể ơ ấ u đi m: Đ n gi n nh t ể Nh c đi m: ị ớ ạ ệ i h n vì th + Đ đ c hi u b gi ươ ỉ ử ụ kháng nguyên) mà ph ừ + Ph i đánh d u cho t ng kháng th chuyên bi ấ ng thì kháng nguyên có ít nh t là 2 epitope (trình di n ể ắ ố ượ t v i t ng đ i t ng.
ươ ở ỗ ể ắ
3.2. ELISA gián ti pế Indirect ELISA: Ph ượ ắ ng pháp này khác Direct ELISA ặ ch kháng th b t kháng ộ ệ ủ ể ắ c g n enzyme mà nó là m c tiêu g n đ c hi u c a m t kháng th khác
ể ể ượ ắ ụ ớ c g n v i enzyme).
nguyên không đ ớ (kháng th này m i là kháng th đ
11
ả ứ ự ế ế ệ ơ ồ S đ : Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA gián ti p
Ư ể ề
ể ắ ợ ươ ấ dàng th ể ễ d
i và kinh t ệ ủ ừ ẫ
ử ệ ệ ề ả
ầ ượ ể ế ế ể ả ạ ể ử ụ u đi m: Kháng th g n enzyme có th s d ng đ đánh d u cho nhi u lo i kháng ệ ạ ơ ế ng m i hóa. h n, nguyên nên ti n l ế ề ộ ặ ượ ế ể Nh c đi m: Đ đ c hi u c a t ng kháng huy t thanh là khác nhau. Đi u này d n đ n ớ ữ ả ế k t qu khác nhau gi a các thí nghi m và do đó c n ph i th nghi m v i nhi u kháng ưở huy t thanh khác nhau đ k t qu có th tin t ng đ c.
3.3. Sandwich ELISA
ọ ạ ượ ấ ả ự ệ ễ ượ ượ ử ụ ng m nh và nh y. Đ c g i là “sandwich” là do k t qu thí nghi m đ
ạ ể ự ế ợ ộ ạ Đây là m t d ng ELISA đ ạ ủ
ỹ ậ ệ ượ ạ
ả ổ ế c s d ng ph bi n nh t trong th c ti n do nó cho ph n ế ứ c đánh giá thông ể ể ắ qua s k t h p c a hai lo i kháng th là kháng th b t (capture antibodies) và kháng th phát hi n (detection antibodies). c phân làm hai d ng là Direct K thu t này cũng đ sandwich ELISA (DASELISA Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TASELISA – Triple antibody sandwich). ồ ụ ộ ủ ế ắ
ể ượ ể ớ
ằ
ầ ủ ữ
ứ ấ ỳ ứ ể ắ ủ ử ớ ợ ỉ ữ DAS ELISA g m s dính th đ ng c a kháng th vào pha r n (đáy gi ng). Nh ng ữ c thêm vào. Nh ng kháng nguyên ệ ủ ự t c a chúng vào c pha loãng trong blocking buffer nh m ngăn s dính không chuyên bi ắ Ở đây, nh ng ph n c a blocking buffer không nên ch a b t k kháng nguyên nào và r a, ch còn ph c h p kháng nguyên
ắ ự ế ợ kháng th này sau đó k t h p v i các kháng nguyên đ ượ đ pha r n. ể ế ợ mà có th k t h p v i kháng th b t. Sau khi ể kháng th dính vào pha r n.
ượ ự ế ợ ự ậ
ể ắ Kháng th b t sau đó đ ể ắ ế ể ộ ể ứ
ồ ớ ặ ơ ấ ủ ử ậ ộ ộ
ế ớ ớ ầ
ổ i h n v tính chuyên bi ớ ạ ự ể ể ắ ắ ụ ề ư ỗ ệ ạ ủ c thêm vào. Do v y, đây là s k t h p tr c ti p v i kháng ể ố nguyên đích và kháng th b t. Kháng th th hai này có th gi ng kháng th m t ho c khác ấ ề , r a, thêm c ch t vào v ngu n đ ng v t hay loài đ ng v t s n xu t kháng th . Sau khi ệ ố ộ ọ và đ c trên máy đo quang ph . Vì s d ng m t kháng th g n k t v i enzyme nên h th ng ệ ị ớ ạ b gi t. ể ượ ử ụ ề c s d ng Đi u này gi ậ ả ử ụ ữ ề ươ i h n s linh ho t c a ph ể t và nh ng thành ph n g n li n v i kháng th chuyên bi ng pháp, ví d nh m i kháng th đ
ấ
ị ớ ạ ở ệ ố ữ ị ể ẩ i h n v s chu n b kháng th . H th ng cũng b gi
i h n ề ể ắ ệ ả
ế ớ 12 ả ượ c đánh d u riêng (cho nh ng kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ph i đ ề ự ỗ ị ớ ạ ch kháng ELISA b gi ự ế ợ ấ ả nguyên ph i có ít nh t hai epitope vì c hai kháng th b t và phát hi n đ u k t h p tr c ti p v i kháng nguyên.
ắ ể ữ Kháng th b t trên pha r n và kháng th phát hi n có th ch ng l
ể ắ ợ ứ ể ố ả ệ
ể
ạ ự ể ắ ề ế ộ
ệ ậ ợ i khi kh o sát s khác bi ệ ể ẫ ố ấ ệ ế ẵ ướ ự ệ i nh ng epitope khác ỏ ữ t nh gi a ệ ử ề ị ớ ạ i h n v v trí ủ c và m i quan h không gian c a các epitope
ưở ử ế ệ ạ ọ ng m nh đ n th nghi m.
ể ả ệ ố nhau trên ph c h p kháng nguyên. Do đó, thu n l ế ử ụ ữ nh ng kháng nguyên n u s d ng kháng th phát hi n và kháng th b t khác nhau. Vi c s ệ ể ắ ụ d ng cùng m t kháng th b t và phát hi n có th d n đ n v n đ khi có gi ắ g n k t s n có cho s phát hi n. Kích th ấ trên kháng nguyên đích là r t quan tr ng và có th nh h ể ượ c chia làm hai h th ng: Sandwich ELISA có th đ
ự ế 3.3.1 Sandwich ELISA tr c ti p
ự ế ơ ồ S đ :Ti n trình th c hi n ELISA Sandwich tr c ti p
ể ệ ỏ ữ ế ử ụ t nh gi a các kháng nguyên n u s d ng kháng
ế ệ ự ệ
ươ ươ ư ữ ơ ọ ể ng pháp này có u đi m h n h n nh ng ph
ng pháp khác mà chúng tôi ch n ứ ể ẩ ng pháp này đ ch n đoán b nh virus đang nghiên c u.
ế ử ụ ể ẫ ể ệ
ế ướ ệ ề ố ố ệ ị i h n v trí k t h p s n có đ phát hi n. M i quan h v kích th
ệ ể ắ ế ợ ẵ ả ế ệ ự Ư ể ệ u đi m: Có th phát hi n s khác bi ể ể ắ th b t và kháng th phát hi n khác nhau. ẳ Vì ph ươ ph ấ Chú ý: n u s d ng kháng th b t và kháng th phát hi n gi ng nhau có th d n đ n v n ị ể ự ớ ạ ề ế đ n u có s gi c và v ưở ủ trí không gian c a các epitope cũng có nh h ử ng đ n th nghi m.
13 3.3.2 Sandwich ELISA gián ti pế
ế ự ế ả ứ ơ ồ S đ : Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA Sandwich gián ti p
ể ượ ắ c g n enzyme không
ể ắ ế ạ
Chuyên bi ả ứ ph n ng v i kháng th b t kháng nguyên. 3.4. Ph n ng c ch /c nh tranh ạ ả ứ
ự ả ượ ư ấ ạ ả ứ ắ ạ ệ ệ ơ t h n Direct sanwich ELISA do antispecies kháng th đ ớ ả ứ ứ ắ ặ ấ ả ứ Ph n ng c nh tranh mang nghĩa là hai ch t tham gia ph n ng cùng ái l c b t c p ứ ấ c đ a vào
ớ v i ch t th ba. Ph n ng c nh tranh đúng đ n thì hai ch t c nh tranh ph i đ ồ đ ng th i.
ả ứ ự ế ề ạ ờ ự S khác bi
ể ữ ứ ớ ả ộ ế ể ượ ủ ướ c tr
ả ứ ế ả ủ t gi a c ch và c nh tranh. C hai ph n ng đ u có s tham gia c a hai ả ứ c ph n ng đó c g i là c ch (blocking/ inhibition assays). Ph n ng c nh tranh mang nghĩa c hai
ệ ả ứ ọ ứ ể ượ ờ ớ ồ kháng th ph n ng v i kháng nguyên. N u m t kháng th đ ạ ượ đ kháng th đ c thêm vàođ ng th i v i nhau (hình 1).
14
ệ ạ ự S khác bi ế t gi a c ch và c nh tranh
ữ ứ 3.4.1. Direct CElisa: Ki m tra kháng nguyên
ể ự ượ ng kháng th
ệ ố Trong h th ng tr c ti p, l ượ ng kháng nguyên trên b m t đĩa và l ể ắ ể ượ c
ượ ế ộ ể ố ư c chu n đ đ t ộ
ẩ ắ g n enzyme đã đ thêm vào đĩa cùng m t lúc đ t o u th c nh tranh. ư ề ặ i u. Kháng nguyên và kháng th g n enzyme đ ế ạ ặ ượ ắ ể ạ ư ự ng t N u kháng nguyên t
ho c cùng nh kháng nguyên đã đ ộ ủ ồ
ế ể ắ ẽ ể ắ ả ớ
ụ ạ ả ạ
ươ ẽ ắ ấ ỳ ự ế ợ ủ ế ồ ư ậ ẽ ả ự ạ ạ ồ ộ
ả
ể ượ ượ ự ế c thêm tr c ti p vào đĩa n u nó đ c pha loãng
c g n trên đĩa thì ạ kháng th g n enzyme s g n lên kháng nguyên này. Khi n ng đ c a kháng nguyên c nh tranh cao s ngăn c n b t k s k t h p c a kháng th g n enzyme v i kháng nguyên trên ộ ề ặ b m t đĩa (c nh tranh 100%). N u n ng đ kháng nguyên c nh tranh gi m (ví d : pha ộ loãng) s c nh tranh s gi m. Nh v y n ng đ kháng nguyên c nh tranh càng cao thì đ ấ h p thu màu càng gi m. ạ Kháng nguyên c nh tranh có th đ ướ trong blocking buffer tr ế c khi thêm kháng th g n enzyme.
ứ ộ ạ ủ ộ ồ ể ắ ộ
ố ươ ờ M c đ c nh tranh theo th i gian ph thu c vào m i t ứ ụ ề ặ ủ ể ồ c n ki m tra và kháng nguyên trên b m t đĩa (và m c đ t ng quan c a n ng đ phân ộ ươ ng đ ng c a kháng
ử ầ t nguyên).
ủ ượ ể ượ ấ ượ ượ Sau khi ử và r a, l ng kháng th đ c đánh d u đ ị c đ nh l
ấ ể ẫ ồ
ế ớ ự ắ ượ ng sau khi thêm c ự ươ ấ ch t. khi không có kháng nguyên trong m u ki m tra hay không có s t kháng nguyên thì không có s g n k t v i kháng nguyên đ ơ ủ ng đ ng c a ự c đánh d u và không có s
ự ạ ứ ả ẫ
ớ ườ ế ứ ả ố ộ 15 ạ c nh tranh v i kháng nguyên này. K t qu là m u có ch a kháng nguyên thì s c nh tranh làm gi m c ng đ màu còn đ i ch ng âm thì không.
ể
3.4.2.
ự ớ ể ơ ồ S đ : Direct CELISA ki m tra kháng nguyên ể ể Direct CElisa: Ki m tra kháng th ể ươ ể Direct CELISA ki m tra kháng th t ng t ể v i Direct CELISA ki m tra kháng th .
ở ự ạ ữ ể ẫ ị
ượ ể ấ ẫ ể ượ ẫ ớ c đánh d u v i các v trí đây là gi a kháng th trong m u và kháng th đ ướ ớ ộ c khi thêm c tr n v i nhau tr
S c nh tranh trên kháng nguyên trên đĩa. M u và kháng th đánh d u đ vào đĩa.
ể ể ơ ồ S đ : Direct CELISA ki m tra kháng th
16
ế ố ả ưở ế 4. Các y u t nh h ng đ n k t qu ELISA (cid:0) ế ế ứ ế ể
ể ượ ừ ấ ạ ng tính thì có th do s ặ ả ươ ấ ố ả ố N u các đ i ch ng âm cho k t qu d ặ ừ kháng th đ ch t t o màu ho c t ự ứ c đánh d u ho c chính các đ i ch ng
ễ nhi m t ễ ị b nhi m. (cid:0) ế ố ớ ố ứ ấ
ệ N u màu không xu t hi n đ i v i đ i ch ng d ấ ể ạ ử ụ ạ ấ ả ồ ả ố ặ ươ ng ho c đ i ề ộ ồ t c hoá ch t bao g m: h n s d ng, n ng đ , đi u i t
ẫ ớ v i m u thì ph i ki m tra l ả ả ệ ki n b o qu n (cid:0) ế ố ớ ố ươ ệ ng và c
ể N u màu xu t hi n quá th p đ i v i đ i ch ng d ả ấ ể ượ ắ ộ ủ ồ ả ứ ấ c g n enzyme và n ng đ c a ch t ấ ạ i kháng th đ
ể ẫ m u ki m tra thì ph i ki m tra l ạ t o màu. (cid:0) ư ạ ớ
ạ ạ ử ụ ẫ ố ố ố ớ ồ ứ ề ạ ế ể ể ng thì có th ki m tra l ố N u có t o màu đ i v i m u nh ng không t o màu v i đ i ệ i ngu n g c đ i ch ng, h n s d ng và đi u ki n
ươ ứ ch ng d ả ả b o qu n. (cid:0) ặ ự ố ử ệ ệ Khi ch y l ề i m t th nghi m trong đi u ki n đang g p s c thì
ỉ ổ
ễ ị ề ệ ề : r t nhi u các test kit v b nh
ặ ấ ườ ề ế ề ấ ươ . ộ ế ố ch nên thay đ i m t y u t ỹ ệ ho c d u hi u trong ng ộ ạ ạ ệ thí nghi m. ậ ắ ỹ K thu t s c k mi n d ch i h u h t đ u cùng ph ng pháp này
ợ ể ắ ấ
ứ ắ ủ ặ
ố ị ố ề ắ ế ầ ị
c g n c đ nh t ể ế ế
ễ ể ắ
ứ ợ ạ ậ ớ i t
ệ
ặ ệ ế ắ ả ứ ả ạ Nguyên t c:ắ Ph c h p kháng kháng th (KKT) g n ch t màu ấ ả ượ c phân b đ u trên b n gi y s c ký. Kháng nguyên (KN) đ c thù c a vi sinh đ ả ứ ạ ỏ ạ ậ ượ i “v ch ph n ng”. Khi nh huy t thanh c n xác đ nh v t đ ặ ẽ ế ợ ệ ả ắ kháng th (KT) lên b n s c ký, KT đ c hi u (n u có) trong huy t thanh s k t h p ấ ắ ị ớ v i KKT g n màu, ph c h p mi n d ch KTKKT g n màu này di chuy n trên gi y ả ứ ẽ ị ữ ạ ạ ế ế ợ ắ i “v ch ph n ng” do KT k t h p v i KN vi sinh v t, k t l s c ký s b gi ế ệ ở ả ứ ạ qu “v ch ph n ng” hi n màu. N u trong huy t thanh không có KT đ c hi u, ậ ể ữ ượ c KKT g n màu, vì v y không hi n màu. đ “v ch ph n ng” KN không th gi
ệ ộ ẩ
ằ ễ ắ ị (HbsAg) b ng ph ệ ớ Gi i thi u b test kit xét nghi m ch n đoán viêm gan B ươ ng pháp s c ký mi n d ch:
ệ ụ
ị ả ể ề ươ ử ẩ ằ
ộ ế ễ ị ặ ủ ặ
ể ử ượ ắ ệ ự ế ươ ả
ủ ộ ớ ệ ở ế ươ ế ớ
ế ả ứ ấ ợ ạ
ả ứ ướ ẫ ờ ớ
ể
ế ế ế ế ủ ự ng tính, ng ạ ặ ủ ườ i trong tr
ạ ạ ả ươ t k t qu d ằ ả ạ
ứ ệ ạ
ộ ạ ằ ượ ủ ấ ẫ ẳ ố ụ + Nguyên lý: Kit th ch n đoán Viêm gan B (HBsAg) là d ng c xét nghi m s c ký ng pháp dòng ch y m t chi u đ phát hi n s có mi n d ch đ nh tính b ng ph ng. m t c a kháng nguyên vi rút Viêm gan B trong huy t thanh ho c huy t t vùng k t qu . Trong Màng kit th đ c ph m t l p kháng th kháng HBsAg ặ ẫ quá trình làm xét nghi m, m u huy t thanh ho c huy t t ng ph n ng v i các ỗ ể ầ ử mang theo kháng th kháng HBsAg. H n h p t o thành th m theo màng di ph n t ặ ể ng lên nh các mao d n, g p và ph n ng k t t a màu v i các kháng chuy n h ớ ở th kháng HBsAg trên l p màng và t o ra v ch màu. S có m t c a v ch màu ử ợ ng h p vùng k t qu trên kit th cho bi ụ ả ế không có v ch màu là k t qu âm tính. Nh m m c đích ki m tra quy trình thao tác ọ ệ ạ ấ xét nghi m, m t v ch màu luôn luôn xu t hi n t i vùng ch ng (g i là v ch ch ng) ị ể đ kh ng đ nh r ng l ượ ạ c l ể ứ ớ ng m u đã đ và l p màng đã th m t t.
ả ế + K t qu :
17 (cid:0) ệ ứ vùng ch ng
ệ ạ ạ ộ ở ạ xu t hi n hai v ch đ rõ r t: m t ế vùng k t qu g i là
ỏ ả ọ ẽ ươ v ch ch ng ộ ậ ấ D ng tính: ứ (C), v ch kia ạ
ậ ấ ứ ộ ờ ế ở ỏ ủ v ch k t qu ẫ ả (T). v ch k t qu ả (T) s khác nhau ph thu c vào ộ ụ ở v chạ
ươ ề ượ c coi là d ế ẩ ng tính. g i làọ ư L u ý: ồ n ng đ c a HBsAg có trong m u ph m. Vì v y, b t c đ m nào k t quế (cid:0) ệ
ỉ hi n ch ấ th y xu t
ạ ạ (cid:0)
ẫ ẩ
ặ ọ
ằ ẫ
ư ạ ẫ
ạ đ đ m màu đ c a ộ ủ ả (T) cũng đ u đ ấ tính: xu t Âm ấ ứ (C) . m tộ v ch ch ng Không ờ ậ ả (T) ế hi nệ v ch k t qu dù đ m hay m . không có giá tr :ị không ế ủ K t q a ch ngứ (C). Nguyên nhân ấ ệ v chạ ấ th y xu t hi n ượ ặ ườ ng m u ph m không l ng g p là do th ạ ệ ủ nghi m sai. Đ c l i đ ho c thao tác xét ử ệ ạ ướ xét nghi m b ng kit th ng d n và làm l h i ố ể ạ ớ ạ ư ế ớ m i khác. N u nh tình tr ng v n nh cũ, hãy liên l c v i đ i lý phân ph i đ ượ ả i đáp. đ c gi ệ ộ ẩ ớ i thi u b test kit ch n đoán HIV :
ị ắ ắ ễ ử ự ể ị
ể ế ế ươ
ầ ẫ ử ườ
ế ứ ỗ ớ
ợ ẽ ợ ỗ ể ộ ợ ọ
ệ ượ ẫ
ả ứ ớ ế ể
ử ạ ế ấ ặ
ệ ẽ ẫ ủ ẫ
ẫ ỏ ử ệ ế ạ
ạ ế ể ử ế ệ ả ấ Gi ệ + Nguyên lý: d a trên nguyên t c th nghi m s c ký mi n d ch in vitro đ xác đ nh ặ ị ng ho c máu đ nh tính kháng th kháng HIV tuýp 1 và 2 trong huy t thanh, huy t t ẫ ẽ ẫ toàn ph n ng i. Khi thêm m u th và m u pha loãng vào “sample pad”, m u s di ị ể chuy n đ n “conjugate pad” và tái h n d ch v i ph c h p kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 vàng c ng h p đã làm khô trên “conjugate pad”. H n h p s di chuy n d c theo ả ứ ằ ng mao d n và ph n ng v i kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 đã màng b ng hi n t ặ ủ ệ ữ ố ị c đ nh trên vùng ph n ng (ký hi u T). N u kháng th kháng HIV có m t đ gi ể ẽ ẫ trong m u th , v ch màu trong vùng T s xu t hi n. N u không có ho c kháng th ử ế ụ kháng HIV không đ trong m u th thì vùng T s v n không màu. M u th ti p t c di chuy n đ n vùng ch ng (ký hi u C) và t o thành v ch có màu đ ho c tím, cho th y th nghi m đã đ ứ ặ ị ợ ượ c ti n hành đúng, thích h p và k t qu là có giá tr .
ế ạ ấ ỉ ấ vùng C. D ng tính: N u xu t
ả âm tính: N u ch có 1 v ch xu t hi n ệ ở ứ ạ ở ả ệ ặ ươ ệ ỏ ử ươ ế + K t qu : hi n v ch c vùng C và vùng T (1 và ho c 2) ch ng t ế ng tính. th nghi m d
18
ị ệ
ấ ượ ử ệ
ẩ ử ướ ử ổ ế ị ế ư ử ả c xem nh không có giá tr . Nguyên ử ị ư ặ c ti n hành không đúng ho c que th đã b h . Khuy n cáo th
ẫ
ử ớ ử :
ậ ạ Không có giá tr ch n đoán: Vùng C không xu t hi n v ch nào trong c a s k t qu ệ ế sau khi ti n hành th nghi m, th nghi m đ ể ế nhân có th do các b ạ ệ nghi m l i m u trên 1 que th m i. ơ ế ẩ IV.C ch ch n đoán phân t ỹ 1. K thu t PCR:
ươ Ph ng pháp PCR (polymerase chain reaction) là ph
ạ ạ ề ươ ả
ắ ng pháp đ ượ ấ
ỹ ấ
ả ề ự ố ế ng pháp khu ch đai nhanh ệ ự ượ c th c hi n ề ờ ả c r t nhi u b n sao ẩ ề c ng d ng trong r t nhi u lĩnh v c : ch n đoán, xét ộ ớ i mã di truy n, t o gi ng m i và các đ t
ế ứ ử ủ m c đ phân t …. ế ng, nghiên c u ti n hóa c a sinh v t
ỹ ẩ ệ ạ ậ ở ứ ộ ủ ế
ươ nhi u b n sao các đo n DNA mà không qua t o dòng. Ph trong các eppendoff và trong th i gian ng n ta có thê thu đ ụ ể ượ ứ ậ DNA. K thu t này có th đ ệ ệ nghi m các tác nhân vi sinh gây b nh, gi ị bi n đ nh h Nói đ n ch n đoán b nh, k thu t này ch y u dùng trong các phòng xét ệ ng.
ừ ặ ớ DNA
ụ ậ ạ ộ ướ ế ứ ư ắ ủ ỹ ơ ở ng l n các đo n DNA đ c thù t ớ ổ ạ ể ổ ợ ợ
ế ố ơ ả ể ự ệ ồ
ỏ ằ ỉ ầ ự ạ ạ ạ nucleotide c a đo n nh n m c nh đo n ả ứ t trình t
ể
ậ ị ườ nghi m ch ch a thông d ng ngoài th tr ạ ượ là t o l Nguyên t c c a k thu t PCR: ủ ự khuôn d a trên c s ho t đ ng c a DNApolymerase đ t ng h p s i m i b sung. c b n đ th c hi n ph n ng PCR bao g m: Các y u t ủ ế ợ t k hai m i oligonucleotide. ị ể ợ
ỉ ướ ả ồ
ự ế ợ ủ ầ ồ hai đ u c a m i không t
ắ ổ
ướ ệ ế ấ ng đ m cung c p ion Mg và n t không có enzyme RNase và c tinh khi
ệ
t Thermus aquaticus (Taq) ả ứ ị ổ ừ ả S i khuôn DNA ch c n bi ế ế ồ ầ c n nhân đ thi ệ ắ ạ ắ ầ ổ ể ồ Hai đo n m i ng n đ xác đ nh các đi m b t đ u t ng h p DNA. Là tín hi u → ủ 3’) c a enzyme DNApolymerase. M i dài kho ng 20 ch h ng đi (5’ ớ ở k t h p v i nhau theo nucleotide và các nucleotide nguyên t c b sung. ầ ủ ạ Có đ y đ các lo i nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. ườ Môi tr DNase. Enzyme ch u nhi ộ ố Dung tích t ng s cho m t ph n ng PCR kho ng t ế 20 µl đ n 50µl.
19
ọ ọ ả ứ ủ ể ạ ặ Đ c đi m c a ph n ng PCR là ch n l c, nh y và nhanh
ậ ỹ
2. Quy trình k thu t: ệ ướ ự ế ằ ệ B c 1 Th c hi n qúa trình bi n tính DNA b ng nhi t
ả ứ ự ầ ồ
ớ ị
ị t đ c a dung d ch lên t ạ ệ ộ ử ệ ộ ủ 30s÷1 phút. T i nhi t đ này, các phân t
ầ ế Đ a DNA vào dung d ch ph n ng (g m các thành ph n c n thi t cho s sao ả ứ ư ươ ờ ng ng kho ng i 90÷98°C, th i gian l u t ị ạ ế DNA m ch kép b tách ra (do liên k t ợ ợ ổ ợ ơ ị ứ ể ạ ớ ư chép), tăng nhi ừ t hydrô b đ t), t o nên các s i đ n dùng đ làm khuôn t ng h p s i m i.
ướ ả ứ ự B ệ c 2 Th c hi n ph n ng lai
ướ ậ ứ ệ ộ ượ ạ ố c 1, ngay l p t c nhi ỏ ơ và nh h n nhi c h xu ng t ừ ừ t
ả
ườ ồ ổ c và xuôi. Ng
Sau b ồ ớ ợ ể ự ồ ượ ổ ự ư ọ ủ ợ ồ
t đ đ ờ ượ ợ ở ầ ể ổ đ u 3’ c a khuôn đ t ng h p m i. Sau đó b ồ nucleotide ể ệ ộ t đ Tm ồ ể ồ ắ ủ c a m i, vào kho ng 37÷68°C và th i gian l u 30s÷1 phút. B sung m i đ m i b t ặ i ta còn c p v i s i khuôn. M i đ c t ng h p hóa h c, có m i ng ổ có th d a vào trình t sung DNApolymerase đ kéo dài m i.
ướ ợ ạ ổ ọ ớ B c 3 T ng h p m ch m i hay còn g i là kéo dài (extension)
ệ Nâng nhi
ế ệ ộ ả ứ ợ ự ế ổ t ph n ng lên 72°C trong vài ch c giây đ n 1 phút đ DNA ụ ờ ợ ể ả ứ t đ ph n ng ph ụ , th i gian và nhi
ớ ế ạ ợ ộ polymerase t ng h p s i m i. Trong th c t ầ thu c vào s i DNA c n khu ch đ i.
ỳ ừ ộ ế ộ ợ K t thúc m t chu k t ợ m t DNA kép m t ng h p 2 s i DNA kép con. C
ả ứ ế ả ỳ ẹ ổ ỳ
ấ ả ừ ả ở
5 đ n 10 phút sao cho t ể ả ố 72°C trong kho ng t ủ ả ẩ ứ ệ ộ ượ ố t đ đ c ợ ơ ắ ạ i và t c các s i đ n xo n l ẩ ả ả ư ậ nh v y, ph n ng x y ra trong 25 đ n 40 chu k . Sau chu k cu i, nhi ế duy trì ạ ạ t o nên s n ph m c a PCR. Sau đó h xu ng 4°C đ b o qu n s n ph m.
ẩ ượ ủ ệ ằ S n ph m c a PCR đ
ể ặ ặ
ế ổ ạ ể ả c ki m tra b ng cách ch y đi n di trên gel agarose ạ ồ ủ ệ ự ộ ừ 0,8%÷2% đ phát hi n s đa hình c a các đo n DNA đ c thù, ho c các n ng đ t ổ ợ ộ ị ạ đo n DNA b thay đ i do các tác nhân nào đó (đ t bi n, tái t h p).
20
ươ ượ 3. Ph ng pháp RTPCR (PCR ng c)
ấ ạ ả ứ ả ứ ắ ơ ả Ph n ng RTPCR th c ch t là ph n ng nhân m t đo n gi Nguyên t c c b n:
ồ ủ ộ ạ
ự ả ứ ợ ạ ộ ủ
ự ượ ờ ờ c th c hi n ạ c. Giai đo n này đ
ừ ả ứ ượ
ư ở ớ i ạ ạ ủ h n c a khuôn RNA, theo nguyên lý c a ph n ng PCR g m có hai giai đo n: Giai đo n ứ ấ th nh t là sao chép RNA khuôn thành DNA s i đôi nh ho t đ ng c a enzyme sao chép ạ ệ ở ượ 50÷55°C và th i gian là 30 phút. Giai đo n 2 là ng ệ ự dùng chính DNA v a sao chép làm khuôn cho ph n ng PCR, quá trình đ c th c hi n theo ba b óc nh đã trình bày
ả ứ ủ ả ẩ
trên. ả Sau khi ph n ng k t thúc, s n ph m c a ph n ng PCR ng ử ụ ư ả ứ ả ệ ả ể ế ớ i khi s d ng. Đ đánh giá và phát hi n s n ph m PCR ng
ườ ệ ẩ ượ ượ c đ ẩ ể ả λ i ta cũng đi n di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chu n là DNA ố c gi m xu ng ượ c ượ ắ ở c c t b i đ
ộ
4°C đ b o qu n cho t ng enzyme HindIII có đ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb. ỳ ử ụ ầ ấ RT – PCR s d ng đ u dò đánh d u hu nh quang (RT – PCR TaqMan)
ỳ ầ
ấ ấ ươ ươ ầ
ỳ ng hu nh quang t
ạ ầ ự ữ ệ
ượ ứ
ể ị
ử ệ ả ặ ạ
ế ử ụ ệ ầ ấ ặ ầ ấ ử ụ ộ S d ng đ u dò mang ch t hu nh quang là m t ph ng pháp chính xác và đáng ủ ắ ậ ư tin c y nh t, nh ng cũng đ t nh t. Nguyên lý c a ph ng pháp này là các đ u dò ượ ế ẩ ớ ả ưở ể ộ i s n ph m khu ch đ i c n phát ng c ng h chuy n năng l ặ ầ ệ ượ ắ ệ ng FRET). Đ u dò DNA hay RNA g n đ c hi u vào khu v c gi a hai hi n (hi n t ậ ự ầ ỉ ữ ồ ể ị ạ đ u dò, do v y làm tăng đáng ng ch nh ng DNA ch a trình t đo n m i đ đ nh l ặ ả ộ ố ả ể ộ ặ ượ ậ ệ k đ đ c hi u, và th m chí có th cho phép đ nh l ng khi có m t c m t s s n ẩ ệ ph m khu ch đ i không đ c hi u. Kh năng này còn cho phép làm th nghi m đa ồ m i khi s d ng các đ u dò đ c hi u đánh d u các m u khác nhau.
S đ realtime PCR TaqMan
ườ ở ộ ầ ầ Thông th ng, đ u dò mang hu nh quang
ộ ặ ơ ồ ỳ ị
ặ ở ầ ộ ầ ượ ữ ấ ấ ứ ấ ặ ề ầ ớ ỳ ấ m t đ u (Reporter – 5’) và m t ch t đ u kia (Quencher – 3’), v trí g n nhau gi a ch t mang và ch t ch n làm i ch t ch n g n đó ch không phát ng t ch n thu cố nhu m hu nh quang truy n năng l
21
ạ ạ ộ
ị ỏ ậ ạ ấ ữ
ị ỳ ặ ả ấ ầ ấ
ị
ữ ệ ả ứ do nên phát quang và tín hi u phát quang này s ỳ ượ
ả ề ỗ ụ ạ l i ngày càng nhi u.
ườ
ồ ủ
ệ ừ ị ệ ặ ợ ả ồ ự c th c hi n t
ỗ ượ ạ ạ
ấ ỏ ỳ
ặ ượ ủ ấ ự ấ ở ạ d ng t
ươ ứ
ỳ do. Ch t hu nh quang đ ỳ ể ấ ố ẩ ỳ ị ầ ấ ỳ ng ch t hu nh quang ấ ượ ng tăng trung bình nhân ch t hu nh quang t ượ ử ụ ủ ả ng tăng c p s mũ c a s n ph m và đ c s d ng đ xác đ nh chu k ng
ả ứ
4. M t s ph
quang. Khi taq polymerase ho t đ ng, do enzyme này có ho t tính 5’ – 3’ exonuclease ầ ẫ nên đ u dò b đánh b t kh i khuôn m u, lúc này, tr ng thái g n nhau gi a ch t mang ệ ượ ỡ ng FRET không x y ra n a, ch t hu nh quang và ch t ch n b phá v nên hi n t ẽ ặ ở ạ ự tr ng thái t không còn b ch n, ấ ẩ ả ạ Ề S n ph m đích tăng lên sau m i chu k ph n ng thì l ượ ng ch t i c máy đo l đ ự ượ ỳ i phóng ra cũng tích t do đ hu nh quang t c gi ỳ ầ ừ ệ ấ ế ượ vi c thêm đ u dò có đánh d u hu nh ng, tr c ti n hành bình th PCR đ ề ầ ắ ạ ắ ầ ở ả ứ giai đo n g n m i c a PCR, c m i và đ u dò đ u quang; Khi ph n ng b t đ u, ổ ắ v trí các g n đ c hi u vào DNA đích; Quá trình t ng h p chu i đ ủ ầ ồ m i, và khi taq polymerase ch m vào đ u dò thì ho t tính 5’ – 3’ exonuclease c a enzyme này phá h y đ u dò, tách ch t mang hu nh quang kh i ch t ch n và do đó ằ ượ c đo b ng làm tăng l ớ ng ng v i máy realtime PCR, l ưỡ ượ l ng ỗ ủ (Ct) c a m i ph n ng. ộ ố ươ ử ng pháp ch n đoán phân t khác:
ươ ẩ ử Ph ng pháp lai phân t (Hydrid)
ươ ệ ượ ử ụ ổ ế ạ Ph ng pháp lai là ph ng pháp khu ch đ i tín hi u đ c s d ng ph bi n đ
ươ ệ
ả ứ ứ ằ ồ ợ
ọ ủ ạ ệ ượ ữ ị ể ế ệ phát hi n HPV (Human Papillomavirus), HCV (virus viêm gan C),… trong b nh ể ị ẩ ph m, d a s phát quang b ng ph n ng hóa h c c a ph c h p g m kháng th b ắ b t gi ự ự dung d ch lai và tín hi u đ ế c khu ch đ i.
ươ ử Hình ph ng pháp lai phân t ệ phát hi n HPV
ệ Ví d v các ph ộ ng pháp lai trong các b test kit phát hi n HPV:
ệ ắ ữ ể ụ ề ươ (cid:0) H xét nghi m II b t gi ệ th lai (Hybrid Capture II Test System)
22
ươ ệ ậ ỹ
ụ ậ ượ ứ ượ ứ ỹ ấ
ữ ể ế ệ ệ ắ ỹ
ậ ố ư ắ c ng d ng phát hi n HPV nh ng k thu t lai b t ứ ổ ế ụ c ng d ng ph bi n nh t. Kit ng đ phát hi n HPV th h 2 (secondgeneration HPV ượ c US FDA công nh n vào
ậ ượ ử ụ ề ỹ ề Có nhi u ph ng pháp lai đ ữ (Hybrid Capture technology) là k thu t đ gi ậ ụ d ng k thu t lai b t gi ậ detection kitHCII) do t p đoàn Diegene công b và đ năm 1999 là k thu t đ ơ c s d ng nhi u h n trong lâm sàng.
ỹ ắ ậ ự
ể ượ Nguyên t c k thu t d a trên hi n t ệ ạ ằ
ầ ạ ượ ệ ở
ứ ợ ễ ỳ
ỗ ố ượ ệ ẽ ỳ ệ ệ
ệ ẫ ẩ ệ ượ ặ ớ ầ ng lai HPV DNA v i đ u dò RNA đ c ặ ấ ấ c đánh d u b ng phóng x ho c không đánh d u hi u. Đ u dò RNA có th đ ắ ể ặ ợ ứ phóng x . Ph c h p lai DNARNA đ c phát hi n b i kháng th đ c hi u đã g n ộ ị alkaline phosphatase trên máy mi n d ch hu nh quang. M i ph c h p lai s phát m t tín hi u hu nh quang (relative light unit RLU), s l ng tín hi u hu nh quang ươ ứ t ng DNA đích trong m u b nh ph m. ỳ ượ ng ng l
ồ ử ụ ệ ặ ơ
ơ ấ
ượ ệ ệ ạ ả ộ là xét nghi m có đ nh y cao và có kh năng phát hi n đ
ươ ứ ạ ớ Kit HCII s d ng m i DNA đ c hi u 13 type HPV “nguy c cao”: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 và 5 type HPV “nguy c th p”: 6, 11, 42, 43, 44. Lai ủ ữ ắ c 1pg/µl c a b t gi DNA HPV16, t ng ng v i 105 đo n gen sao chép.
(cid:0) ươ Ph ng pháp lai Southernblot
ắ ủ ế ậ
ờ ủ ươ
ả ệ ớ ạ ủ ự ắ i h n d a trên kích th
ắ ở ể ướ ơ ở ự Nguyên t c lai Southernblot d a trên kh năng ti p nh n DNA c a màng lai ng pháp đi n di trên gel đã cho phép phân tách các c c a chúng và ờ ự gel sang màng lai nitrocellulose là c s cho s ra đ i ng pháp chuy n DNA t
ươ ả ự nitrocellulose. S ra đ i c a ph ượ ạ c c t b i enzym c t gi đo n DNA đ ừ ươ ph ủ c a ph ng pháp lai do E.M Southern mô t năm 1975.
ượ ứ ệ ấ ớ
ươ ệ
ươ Lai Southernblot là ph ộ ấ ng pháp đ ạ ấ ằ ượ
ể ượ
c ki m soát t ổ ệ ộ ề ặ ể ố ờ ộ ằ ồ ụ c ng d ng s m nh t trong phát hi n HPV. ử ụ ạ ng pháp có đ nh y r t cao, cho phép phát hi n đo n DNA đích s d ng Đây là ph ạ ệ ố ằ ệ ẫ c đánh d u b ng phóng x (h th ng phát hi n b ng enzym). Các các m u dò đ ạ ể ệ đi u ki n cho quá trình lai có th đ i các th i đi m khác nhau trong ho c sau quá trình lai b ng cách thay đ i nhi t đ và n ng đ mu i.
ụ 5. M t s ng d ng trong test kit: (cid:0) ượ ệ ệ ắ ố ở tôm: ng
ộ ố ứ ộ ạ ệ ắ ặ
ệ ủ ệ ế ễ ấ ợ ị
ườ ộ c m t i ta đã tách đ B kit RTPCR phát hi n virus gây b nh đ m tr ng ế ế ặ ạ ồ ể ố t k c p m i đ nhân đo n đo n gen đ c hi u c a virus gây b nh đ m tr ng và thi ắ ắ này lên. Sau đó đi n di n u th y có băng thích h p thì ch c ch n tôm đã b nhi m ệ b nh này.
23
(cid:0) ộ ặ ự ắ ặ ộ b t c p có đ
ớ Kit có đ đ c hi u cao, các m i và trình t ự ệ ủ ự ộ ồ ỹ ự b gene c a Virus Zika d a trên s phân tích k
ồ ộ ệ ộ B kit phát hi n virus zika: ươ t ưỡ l ng đ ng 100% so v i trình t ủ ng b gene c a virus này.
(cid:0) ủ ể ể
ế ợ ươ ớ ệ ộ B kit ch n đoán virus HPV: có th phát hi n 23 ki u gen khác nhau c a HPV thông qua ph ẩ ươ ng pháp PCR k t h p v i ph ng pháp khác.
24
Ế
K T LU N ứ
Ậ ỏ
ượ ủ
S c kh e ngày càng đ ọ ầ
ế ậ ớ
ả ế ợ ng pháp đ
ổ ế ậ ự ầ ể c quan tâm vì v y s phát tri n c a test kit là vô cùng c n ế ươ ng pháp dùng trong test kit, còn ề ỉ ng pháp khác, th m chí là k t h p nhi u ph t ch nêu ng pháp v i nhau. Bài vi ượ ử ụ ươ c s d ng trong các quy trình hay trong các ệ ươ ng pháp ph bi n dùng trong công ngh ng pháp này là các ph
ượ ế t và quan tr ng. Trên đây không ph i là h u h t các ph thi ươ ươ ề nhi u ph ố ầ ộ ượ đ c m t ph n trong s các ph ẩ ươ ư ả s n ph m nh ng các ph ọ sinh h c và y d c.
ượ ủ ầ ng pháp đ
ầ c nêu trên đây nêu ch a đ ế ượ ươ ể Có th các ph ọ c ph n quan tr ng, giúp ng i đ c có th hi u đ
ư ế ư c th nào là test kit và chúng đ ẩ ể ể ế ộ ố ả ụ ể ư c đ y đ nh ng cũng nói ượ c ỗ t còn có m t s s n ph m c th cho m i
ượ ườ ọ đâu. Ngoài ra, bài vi ẩ ề ả ấ ượ đ ử ụ s d ng nh th nào, ươ ph ở ng pháp, còn r t nhi u s n ph m khác.
ạ ẩ
ể Ở ệ Vi ầ ấ ạ t Nam các lo i test kit còn r t h n ch v s n ph m ra th tr ườ ế ề ả ườ ướ ọ i th
ng xuyên không cao b ng các n ợ ệ ướ ứ ữ ơ ớ ị ườ ằ c ta h n, cũng nh
ỏ ủ ả ơ ề ơ ể ể ẽ ể ữ ế
ng vì giá thành và ả c nhu c u ki m tra s c kh e c a m i ng c phát ư ể ẩ ọ tri n. Hi v ng s có nh ng s n ph m Test kit phù h p v i đi u ki n n ệ ổ ề ườ ọ i có th quan tâm h n v nh ng bi n đ i trong c th đ nhanh chóng phát hi n m i ng ị ữ và ch a tr .
Ệ
ự ụ ậ ạ ọ
Ả TÀI LI U THAM KH O ủ ộ ố ứ 1. Lê Văn Phùng (2001), M t s ng d ng c a PCR trong vi sinh v t. T p chí Y h c th c hành 2011
ự ớ ủ ọ ử ạ Thành t m i c a sinh h c phân t ư ọ trong ung th h c. T p chí
2. Hoàng Văn S n (2002), Thông tin Y d ơ ượ ố c s 2.
ả ứ ộ ỗ ộ ọ ạ ph n ng chu i PCR, m t cu c cách mang trong sinh h c phân
3. Ph m Hùng Vân (1996), tử
ễ ậ ọ ụ vi sinh v t h c, NXB Giáo d c 1997 4. Nguy n Lân Dũng,
5. Genetic Engineering anh Biotechnology, ChoPra BL and Anwan N, 1990
6. Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994
ụ ề ọ ạ ổ Di truy n h c, NXB Giáo d c, 2000 7. Ph m Thành H ,
