intTypePromotion=1
ADSENSE

Tiểu luận môn Nhập môn công nghệ sinh học: Test kit

Chia sẻ: Phan Thị Băng Trâm | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:24

144
lượt xem
18
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tiểu luận môn Nhập môn công nghệ sinh học: Test kit sẽ làm rõ những một số vấn đề liên quan tới test kit để ta có thể hiểu rõ hơn về công dụng và cơ chế của chúng. Qua đó, chúng ta có thể chọn cho mình bộ test phù hợp để sử dụng. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu để nắm vững nội dung chi tiết.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận môn Nhập môn công nghệ sinh học: Test kit

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG TIỂU LUẬN MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Test Kit                                                                                                          Nhóm 8                                                                                                         Chi ều th ứ 6, ti ết 11­12      GVHD: Trần Hoàng Ngâu
  2. 2 Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 DANH SÁCH THÀNH VIÊN  VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ Họ và tên MSSV Nhiệm vụ Ghi chú Phan Thị Băng Trâm 2008130142 ­Tìm phần khái  Nhóm trưởng niệm và phương  Hoàn thành pháp miễn dịch ­Tổng hợp Trần Hoài Nam 2008130116 ­Tìm phần phương  Hoàn thành pháp miễn dịch Nguyễn Cao Thủy Tiên 2008140314 ­Tìm phần phương  Hoàn thành  pháp phân tử Vũ Thị Xuân Hiền 2008140083 ­Tìm phần phương  Hoàn thành  pháp phân tử
  3. 3 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Trong cuộc sống hiện đại, việc bảo vệ  sức khỏe đang là một vấn đề  hết sức được   quan tâm. Vì thế việc sử  dụng một công cụ  để  có thể  dễ  dàng hơn trong việc dự  đoán về  những căn bệnh hay vấn đề  thường gặp là rất cần thiết. Test kit là bộ  công cụ  như  thế.   Thuật ngữ   “test kit” không được dùng phổ  biến, thế  nhưng khi nhắc tới những sản phẩm   của nó thì lại rất quen thuộc. Test kit được dùng trong rất nhiều lĩnh vực trong cả  công   nghiệp hay nông nghiệp. Ngoài những loại test kit gần gũi mà ta đã biết thì bài viết này sẽ  trình bày thêm một số loại mới. Hơn nữa, bài viết còn đề  cập tới cơ chế hoạt động chung  của một số loại test kit ­ những loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học và y dược.  Bài viết sẽ làm rõ những một số vấn đề liên quan tới test kit để ta có thể hiểu rõ hơn   về công dụng và cơ chế của chúng. Qua đó, chúng ta có thể chọn cho mình bộ test phù hợp   để sử dụng. Bài viết bao gồm các phần:  ­ Khái niệm và phân loại. ­ Sự phát triển của test kit. ­ Cơ chế chẩn đoán miễn dịch và ứng dụng ­ Cơ chế chẩn đoán phân tử và ứng dung Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nhau nên chắc chắn sẽ có thiếu sót. Mong nhận   được sự thông cảm và góp ý. Xin cảm ơn! NỘI DUNG I.  Khái niệm và phân loại:    1.Khái niệm:  Test kit được hiểu nôm na là bộ kiểm tra. Nó là một bộ công cụ để  kiểm tra   một vấn đề cụ thể nào đó bằng cách lấy một lượng nhỏ mẫu và chờ xem kết quả  trong một thời gian ngắn.
  4. 4 Tesst kit không chỉ là những sản phẩm nhỏ gọn được bán ra ngoài thị  trường  như  ta đã thấy mà những bộ  kiểm tra/chẩn đoán trong bệnh viện hay phòng thí   nghiệm cũng gọi là test kit. Hiện nay chúng được thiết kế  nhỏ  gọn, dễ  sử  dụng, độ  chính xác khá cao.   Những sản phẩm đưa ra thị trường nước ta chỉ là một phần nhỏ và thông dụng như  que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất trong thực phẩm…  Nhưng ở các nước phát triển thì còn có các loại test kit phát hiện một số bệnh   như  tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc…thậm chí là test  HIV. 2.  Phân loại:  Có nhiều phương  pháp   sử   dụng   trong  test kit, nhưng phương  pháp   phổ   biến   sử  dụng trong ngành công  nghệ   sinh   học   và   y  dược cũng như  các ngành khác là phương pháp chẩn  đoán phân tử và phương pháp chẩn đoán miễn dịch
  5. 5 Phương pháp chẩn đoán miễn dịch, điển hình là ELISA:  Test kit ELISA giúp cung cấp kết quả chính xác, nhạy cảm và nhất quán.  Mỗi đầu dò protein được nghiên cứu và các bộ  dụng cụ  được điều chỉnh để  cung cấp đọ nhạy cảm về mặt sinh lý có liên quan. Ngoài ra, bộ dụng cụ được   xác nhận sử dụng các loại mẫu phổ  biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương   và dịch nổi nuôi cấy tế bào. Lysates (dịch phân giải) di động được sử dụng để  xác nhận bộ  dụng cụ  phát hiện các protein truyền tín hiệu hoặc phosphoryl  hóa. Ưu điểm của những bộ kit ELISA:  Dùng trên 800 đối tượng khác nhau.  Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, chính xác và nhất quán.  Kết quả có trong 2,5 ­ 4h.  Xác định với nhiều loại mẫu. Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình là PCR và RT­PCR: Từ một khuôn DNA rất nhỏ như giot máu, sợi tóc hay một tế báo… người  ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục  vụ cho quá trình khảo sát trong phản ứng PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm   HPV trong ung thư  cổ tử  cung, gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRC1 –  BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF­1,2   trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người…. Trong vi sinh vật thì PCR là một phương tiên hưu dụng để  phát hiện tác   nhân gây bệnh. II.  Sự phát triển của test kit:  1960s and earlier Phát hiện nhiều dấu ấn sinh học và xét nghiệm chẩn đoán  bệnh hoặc mầm bệnh. Xét nghiệm miễn dịch phát triển 1980’s to 1990’s Những công ty dược bán và mua những công ty chẩn đoán,  hơp nhất thành những đối thủ lớn
  6. 6 1983 Công nghệ PCR sử dụng nhiệt và Tag polymerase enzyme  để khuếch đại đoạn DNA, đây là công cụ chính trong  nghiên cứu công nghệ sinh học và phát triển trên toàn thế  giới 1991 Ra những sản phẩm microarray 1997 FDA phê chuẩn việc bán các thuốc thử cần phân tích cho  các phòng thí nghiệm được ủy quyền 2000 Hoàn thành công trình nghiên cứu bộ gen người. Phòng thí nghiệm tự động, công nghệ microaray tăng,  được thương mại hóa 2002 Khởi động đề án bản đồ haplotype (SNPs)(dự án  HAPMAP) 2003 FDA tổng hợp những hướng dẫn để sử dụng markers sinh  học trong những thử nghiệm lâm sàng.
  7. 7 Biểu đồ về sự phát triển của thị trường chẩn đoán trong ống nghiệm (IDV) toàn cầu   năm 2012, tỉ lệ các nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News) Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10   Global In­vitro Diagnostics của Business Insights)   ơ chế chẩn đoán miễn dịch:  III.C 1.   Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể:  Sự  kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể  phụ  thuộc vào cấu trúc bề  mặt   của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giwois  hạn giữa phần tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của   phần tử kháng thể (trung tâm hoạt động). Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa cùng một lúc có thể  kết hợp với hai phần tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị  nên cùng lúc   có thể kết hợp với rất nhiều phần tử kháng thể. Cho nên kháng nguyên và kháng   thể có thể kết hợp với nhau tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong khong  gian ba chiều. Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết. Kháng nguyên và kháng thể  có thể  kết hợp với nhau theo bất cứ  tỉ  lệ  nào   nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản   ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể.
  8. 8 Sự kết hợp giữa phần tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như:  lực liên kết ion giữa các nguyên tử  hoặc các nhóm hóa học mang điện tích trái  dấu; lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử  hydro mang điện tích   dương với các nguyên tử  mang điện tích âm, lực Van der Walls giữa hai phân tử  phụ thuôc vào tương tác giữa các đám mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thủy nếu  diện tiếp xúc cả phía kháng nguyên và kháng thể đều có các acid amine ố thủy thì   kháng nguyên và kháng thể kết hợp, nước sẽ bị  đẩy ra tạo nên lưc gắn kết giữa   các acid amine ố thủy đó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học. Phản  ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng  nguyên chỉ kết hợp với kháng thể  do nó kích thích cơ  thể  tạo thành. Do đó phản   ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên   hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử  đã biết. Hiệu giá của kháng thể  trong   huyết thành người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết  và do   đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ  kháng thể  đã  biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể  nhận mặt. Mặt  khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật   dùng để làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng. 2.  Phương pháp ELISA:  ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ  thuật sinh hóa dùng  để  phát hiện kháng thể  hay kháng nguyên trong mẫ  cần phân tích. Hiện nay ELISA  được sử  dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như  y học, nông nghiệp và  đặc biệt là trong quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm. Nguyên  tắc:  Phương  pháp  ELISA  (Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay­ xét  nghiệm hấp thụ  miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm  chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó  kháng thể  được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ  chất thích hợp (thường là  
  9. 9 nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có   màu. Sự  xuất hiện màu chứng tỏ  đã xảy ra phản  ứng đặc hiệu giữa kháng thể  với   kháng nguyên và thông qua cường độ  màu mà biết được nồng độ  kháng nguyên hay  kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này được thiết kế  cho việc phát hiện và định lượng vật chất như  peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi  khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc  kháng thể   ở  một nồng độ  rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch   phóng xạ (RIA­ Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn   đảm bảo độ  chính xác như  nhau. ELISA được dùng để  xác định nhiều tác nhân gây   bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản  ứng là: kháng nguyên, kháng  thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước: ­   Phản   ứng   miễn   dịch   học:   Là   sự   kết   hợp   giữa   kháng   nguyên   và   kháng   thể ­ Phản  ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy  nguyên tử  [O] từ  H2O2 để  oxy hóa cơ  chất chỉ thị  màu, do đó làm thay đổi màu của  hỗn   hợp   trong   dung   dịch   thí   nghiệm.    (Trích     từ Chemicon International)  3.  Phân loại ELISA:  3.1.  Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 
  10. 10  Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng  nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng  một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme). Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ­ Ưu điểm: Đơn giản nhất ­ Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện  kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope. + Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng. 3.2.  ELISA gián tiếp   Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng  nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác  (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme).   
  11. 11 Sơ đồ :  Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ­  Ưu điểm: Kháng thể  gắn enzyme có thể  sử  dụng để  đánh dấu cho nhiều loại kháng  nguyên   nên   tiện   lợi   và   kinh   tế   hơn,   dễ   dàng   thương   mại   hóa. ­ Nhược điểm: Độ  đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến  kết quả  khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử  nghiệm với nhiều kháng  huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được.  3.3.    Sandwich ELISA  Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản  ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông   qua sự  kết hợp của hai loại kháng thể  là kháng thể  bắt (capture antibodies) và kháng thể  phát  hiện   (detection  antibodies).   Kỹ   thuật   này  cũng   được   phân  làm   hai   dạng  là   Direct  sandwich ELISA (DAS­ELISA  ­ Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA  (TAS­ELISA – Triple antibody sandwich). DAS ELISA gồm sự  dính thụ  động của kháng thể  vào pha rắn (đáy giếng). Những  kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào. Những kháng nguyên   được pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào   pha rắn.  Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào  mà có thể  kết hợp với kháng thể  bắt. Sau khi  ủ  và rửa, chỉ  còn phức hợp kháng nguyên ­  kháng thể dính vào pha rắn.  Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự  kết hợp trực tiếp với kháng   nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác  về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào   và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống   bị  giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể  chuyên biệt.   Điều này giới hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ  như  mỗi kháng thể được sử  dụng  
  12. 12 phải được  đánh  dấu  riêng  (cho những kháng nguyên  khác   nhau).   Theo cách  này,   direct  ELISA bị  giới hạn về  sự  chuẩn bị  kháng thể. Hệ  thống cũng bị  giới hạn  ở  chỗ  kháng  nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả  hai kháng thể  bắt và phát hiện đều kết hợp trực  tiếp với kháng nguyên. Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác   nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự  khác biệt nhỏ  giữa   những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử  dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí   gắn kết sẵn có cho sự  phát hiện. Kích thước và mối quan hệ  không gian của các epitope  trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm. Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống: 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ :Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ­ Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng  thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau. ­ Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn  phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu. Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn  đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị  trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.
  13. 13 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp   Sơ đồ:  Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không  phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên. 3.4. Phản ứng ức chế /cạnh tranh Phản  ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản  ứng cùng ái lực bắt cặp   với chất thứ ba. Phản  ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào   đồng thời. Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai  kháng thể  phản  ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể  được  ủ  trước phản  ứng đó  được gọi là  ức chế  (blocking/ inhibition assays). Phản  ứng cạnh tranh mang nghĩa cả  hai   kháng thể được thêm vàođồng thời với nhau (hình 1).
  14. 14 Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh 3.4.1. Direct C­Elisa: Kiểm tra kháng nguyên Trong hệ  thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề  mặt đĩa và lượng kháng thể  gắn enzyme đã được chuẩn độ  để  tối  ưu. Kháng nguyên và kháng thể  gắn enzyme được  thêm vào đĩa cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh. Nếu kháng nguyên tương tự  hoặc cùng như  kháng nguyên đã được gắn trên đĩa thì   kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ  của kháng nguyên cạnh   tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên   bề  mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ  kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ  : pha   loãng) sự cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy nồng độ  kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ  hấp thu màu càng giảm. Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha loãng  trong blocking buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme. Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ  phân   tử  cần  kiểm tra  và  kháng  nguyên  trên  bề   mặt  đĩa  (và  mức  độ   tương  đồng của  kháng   nguyên). Sau khi  ủ và rửa, lượng kháng thể  được đánh dấu được định lượng sau khi thêm cơ  chất. khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự  tương đồng của   kháng nguyên thì không có sự  gắn kết với kháng nguyên được đánh dấu và không có sự 
  15. 15 cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa kháng nguyên thì sự  cạnh tranh   làm giảm cường độ màu còn đối chứng âm thì không. Sơ đồ : Direct C­ELISA kiểm tra kháng nguyên  3.4.2.    Direct C­Elisa: Kiểm tra kháng thể  Direct C­ELISA kiểm tra kháng thể tương tự  với Direct C­ELISA kiểm tra kháng thể.  Sự cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh dẫu với các vị trí   trên kháng nguyên trên đĩa. Mẫu và kháng thể đánh dấu được trộn với nhau trước khi thêm  vào đĩa. Sơ đồ :  Direct C­ELISA kiểm tra kháng thể
  16. 16  4.    Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA   Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự  nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng  bị nhiễm. Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối  với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều   kiện bảo quản Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả  mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất   tạo màu. Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với  đối  chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện   bảo quản. Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì  chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm.   Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch : rất nhiều các test kit về bệnh  hoặc dấu hiệu trong người hều hết đều cùng phương pháp này.   Nguyên tắc:   Phức hợp kháng kháng thể  (KKT) gắn chất màu  được phân bố  đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh   vật được gắn cố  định tại “vạch phản  ứng”. Khi nhỏ  huyết thanh cần xác định  kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp   với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT­KKT gắn màu này di chuyển trên giấy   sắc ký sẽ  bị  giữ  lại tại “vạch phản  ứng” do KT kết hợp v ới KN vi sinh v ật, k ết   quả  “vạch phản  ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở  “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu.   Giới   thiệu   bộ   test   kit   xét   nghiệm   chẩn   đoán   viêm   gan   B   (HbsAg) bằng phương pháp sắc ký miễn dịch: + Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm sắc ký  miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để  phát hiện sự  có   mặt của kháng nguyên vi rút Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương.   Màng kit thử  được phủ  một lớp kháng thể  kháng HBsAg  ở  vùng kết quả. Trong  quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản  ứng với các   phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di   chuyển hướng lên nhờ  các mao dẫn, gặp và phản  ứng kết tủa màu với các kháng   thể  kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự  có mặt của vạch màu  ở  vùng kết quả trên kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp   không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác  xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng)  để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt. + Kết quả: 
  17. 17 Dương tính: xuất hiện hai vạch đỏ  rõ rệt: một  ở  vùng chứng   gọi là vạch chứng (C), vạch kia ở vùng kết quả gọi là vạch kết quả (T). Lưu ý: độ  đậm màu đỏ  của vạch kết quả (T) sẽ  khác nhau phụ  thuộc vào  nồng độ  của HBsAg có trong mẫu phẩm. Vì vậy, bất cứ  độ  mờ  nào  ở  vạch  kết quả (T) cũng đều được coi là dương tính. Âm  tính: xuất   hiện   chỉ  một vạch   chứng (C)   .  Không   thấy   xuất  hiện vạch kết quả (T)  dù đậm hay mờ. Kết qủa  không   có   giá   trị: không  thấy   xuất   hiện vạch  chứng (C).   Nguyên   nhân  thường   gặp   là   do  lượng   mẫu   phẩm   không  đủ   hoặc   thao   tác   xét  nghiệm   sai.   Đọc   lại  hướng   dẫn   và   làm   lại  xét  nghiệm   bằng  kit   thử  mới khác. Nếu như tình trạng vẫn như cũ, hãy liên lạc với đại lý phân phối để  được giải đáp.   Giới thiệu bộ test kit chẩn đoán HIV :   + Nguyên lý: dựa trên nguyên tắc thử  nghiệm sắc ký miễn dịch in vitro để  xác định  định tính kháng thể kháng HIV tuýp 1 và 2 trong huyết thanh, huyết tương hoặc máu  toàn phần người. Khi thêm mẫu thử  và mẫu pha loãng vào “sample pad”, mẫu sẽ  di   chuyển đến “conjugate pad” và tái hỗn dịch với phức hợp kháng nguyên HIV tuýp 1   và 2 ­ vàng cộng hợp đã làm khô trên “conjugate pad”. Hỗn hợp sẽ di chuyển dọc theo   màng bằng hiện tượng mao dẫn và phản  ứng với kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 đã  giữ  cố  định trên vùng phản  ứng (ký hiệu T). Nếu kháng thể  kháng HIV có mặt đủ  trong mẫu thử, vạch màu trong vùng T sẽ xuất hiện. Nếu không có hoặc kháng thể  kháng HIV không đủ trong mẫu thử thì vùng T sẽ vẫn không màu. Mẫu thử tiếp tục  di chuyển đến vùng chứng (ký hiệu C) và tạo thành vạch có màu đỏ  hoặc tím, cho  thấy thử nghiệm đã được tiến hành đúng, thích hợp và kết quả là có giá trị.  + Kết quả: âm tính: Nếu chỉ  có 1 vạch xuất hiện  ở  vùng C. Dương tính: Nếu xuất  hiện vạch ở cả vùng C và vùng T (1 và hoặc 2) chứng tỏ thử nghiệm dương tính. 
  18. 18 Không có giá trị  chẩn đoán: Vùng C không xuất hiện vạch nào trong cửa sổ kết quả  sau khi tiến hành thử  nghiệm, thử  nghiệm được xem như  không có giá trị. Nguyên  nhân có thể do các bước tiến hành không đúng hoặc que thử đã bị hư. Khuyến cáo thử  nghiệm lại mẫu trên 1 que thử mới.    ơ chế chẩn đoán phân tử:  IV.C 1.  Kỹ thuật PCR:  Phương pháp PCR  (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đai nhanh  nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp được thực hiện  trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thê thu được rất nhiều bản sao  DNA. Kỹ thuật này có thể được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét  nghiệm các tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống mới và các đột  biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử…. Nói   đến   chẩn   đoán   bệnh,   kỹ   thuật   này   chủ   yếu   dùng   trong   các   phòng   xét  nghiệm chứ chưa thông dụng ngoài thị trường.  Nguyên tắc của kỹ  thuật PCR:  là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ  DNA  khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA­polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: ­  Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự  nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn  cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide. ­ Hai đoạn mồi ngắn để  xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu   chỉ   hướng   đi   (5’   →   3’)   của   enzyme   DNA­polymerase.   Mồi   dài   khoảng   20  nucleotide và các nucleotide  ở  hai đầu của mồi không tự  kết hợp với nhau theo   nguyên tắc bổ sung. ­ Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. ­ Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và   DNase. ­ Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl.
  19. 19 Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh 2.  Quy trình kỹ thuật:  Bước 1 ­ Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt Đưa DNA vào dung dịch phản  ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự  sao   chép), tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương  ứng khoảng   từ  30s÷1 phút. Tại nhiệt độ  này, các phân tử  DNA mạch kép bị  tách ra (do liên kết   hydrô bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới. Bước 2 ­ Thực hiện phản ứng lai Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm  của mồi, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt  cặp với sợi khuôn. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn   có thể  dựa vào trình tự  nucleotide  ở  đầu 3’ của khuôn để  tổng hợp mồi. Sau đó bổ  sung DNA­polymerase để kéo dài mồi.  Bước 3 ­ Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension) ­ Nâng   nhiệt   phản   ứng   lên   72°C   trong   vài   chục   giây   đến   1   phút   để   DNA­   polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, th ời gian và nhiệt độ  phản  ứng phụ  thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại. ­ Kết thúc một chu kỳ  từ  một DNA kép mẹ  tổng hợp 2 sợi DNA kép con. Cứ  như  vậy, phản  ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ  cuối, nhiệt độ  được   duy trì ở 72°C trong khoảng từ  5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và   tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm. ­ Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose   nồng độ từ  0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các  đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp).
  20. 20 3.  Phương pháp RT­PCR (PCR ngược)  Nguyên tắc cơ bản: Phản ứng RT­PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới  hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn  thứ nhất là sao chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép   ngược. Giai đoạn này được thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút. Giai đoạn 2 là   dùng chính DNA vừa sao chép làm khuôn cho phản  ứng PCR, quá trình được thực hiện  theo ba bưóc như đã trình bày ở trên. Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản  ứng PCR ngược được giảm xuống   4°C để bảo quản cho tới khi sử dụng. Để  đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược  người ta cũng điện di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chuẩn là DNA  λ được cắt bởi  enzyme HindIII có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb.  RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng  tin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò   chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát  hiện (hiện tượng FRET). Đầu dò DNA hay RNA gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai  đoạn mồi để định lượng chỉ những DNA chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng  kể độ đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả  một số sản   phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Khả  năng này còn cho phép làm thử  nghiệm đa   mồi khi sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau. Sơ đồ real­time PCR TaqMan Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất   chặn  ở  đầu kia (Quencher – 3’), vị  trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm  thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ  không phát 
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2