BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------------------------
NGUYỄN TÙNG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CLADE 7 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
C : Ký si trù v vi si vật ọc t ú
s : 62.64.01.04
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ
HÀ NỘI, năm 2013
Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS Nguyễn Bá Hiên
2. TS Nguyễn Văn Cảm
Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thanh Hòa
Phản biện 2: PGS.TS. Trương Văn Dung
Phản biện 3: TS. Bùi Trần Anh Đào
L ậ á sẽ được bảo vệ trước Hội đồ c ấm L ậ á cấp trườ ọp tại
Trườ Đại ọc Nô iệp H Nội…………………………
v o ồi……… iờ…… ……t á …… ăm………….....
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- T ư việ q c ia Việt Nam
- T ư việ Trườ Đại ọc Nô iệp H Nội
1
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh cúm gia cầm xảy ra lầ đầu tiên ở Việt Nam và cu i ăm 2003 đầ ăm 2004 được ghi nhậ l do vir s cúm A/H5N1 độc lực cao (HPAI). Kể từ đó c o đến nay Dịch cúm gia cầm H5N1 vẫn liên tục xảy ra ở Việt Nam tuy nhiên quy mô dịc đ t a đổi trở nên nhỏ và lẻ tẻ. Cũ tro ữ ăm q a, ở các ước trong khu vực c â Á ư N ật Bản, Hàn qu c, Trung qu c, L o T ái la , I do esia… dịch cúm gia cầm cũ ả ra. Việc kh ng chế dịch cúm gia cầm đ được tiến hành một cách mạnh mẽ, đ iảm thiể đi iều những thiệt hại m vir s â ra ư nhữ cơ bệnh tái phát vẫn luôn tồn tại.
Vir s cúm A/H5N1 độc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà còn rất nguy hiểm đ i với co ười. Từ ăm 2003 c o đến nay, thế giới đ i ận Virus cúm gia cầm đ â iễm l ười ở 15 ước, với 602 ca bệ v 355 ười đ chết. (WHO,2012). Vir s cúm A/H5N1 có đặc tính biến đổi rất a v đế a đ có nhiề biế c ủ H5N1 đ được phát hiện và phân lập ở nhiề ước khác nhau từ châu Á sang châu Âu.
Đầ ăm 2008 Tr tâm C ẩ đoá T ú Tr ươ đ p át iện và phân lập được một chủng virus A/H5N1 mới thuộc clade 7 từ gà nhập lậu ở biên giới. vir s cúm A/H5N1 mới trước đó mới chỉ được phát hiện ở gà Trung qu c và từ được phát hiệ tr ười ăm 2003. Tr Q c đ sản xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 v đ sử dụng phòng bệnh ở một s địa p ươ từ ăm 2006 [42]. Với thực tế có rất nhiều gà nhập lậu vào Việt nam qua biên giới cho thấy nguy cơ vir s sẽ xâm nhập và nhiễm l các đ ia cầm của Việt Nam và có cơ đ i với cả co ười.
Vì vậy cần phải tiến hành nghiên cứu về đặc tính sinh học của vir s ư k ả ă si bệ đ i với các đ i tượng gia cầm khác nhau, khả ă bảo hộ của vacxin hiệ đ i với c ú . Từ đó có ữ p ươ á c ủ độ t c cực để đ i p ó ế vir s âm ập v o đ ội địa ước ta.
Đứ trước thực tế trên chúng tôi tiế đề tài: “Nghiên cứu m t đặc tính sinh học của viru c m A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam” nhằm góp phần cung cấp t ô ti l m cơ sở cho việc xây dựng biện pháp phòng ch ng bệnh cúm gia cầm. Mục tiêu của đề tài - ác đị đặc t di tr ề ọc, t k á v độc lực của cúm A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam ăm 2008; - Tạo cơ sở iể biết rõ ơ về vir s cúm ia cầm độc lực cao H5N1, óp p ầ â dự biệ p áp p ò c bệ cúm ia cầm.
Ý nghĩa khoa học của đề tài Đâ là một tro ữ i cứ đầu tiên ở Việt Nam có hệ th ng về đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7. - L m cơ sở tham khảo cho việc nghiên cứu về sự biế đổi virus cúm gia cầm, đặc biệt l đ i với ngành thú y.
2
- Kết q ả i cứ của đề t i có t ể được sử dụ p ục vụ c o cô tác iả dạ
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết q ả i cứ l cơ sở c o việc iể biết rõ ơ về một s đặc t si ọc của vir s cúm ia cầm.
- Kết q ả i cứ có t ể được sử dụ l m tiề đề để tiếp tục i cứ các vir s cúm ia cầm t ể độc lực cao H5N1, cũ ư cúm ia cầm độc lực t ấp, v các loại vir s cúm k ác tr độ vật. - Khuyến cáo cho việc sử dụng vacxin cúm phù hợp với virus mới lư trong thực tế. - C ủ độ tro cô tác p ò ừa sự âm ập của c ủ vir s cúm mới v o ội địa.
Những đóng góp mới của đề tài - Đ ác đị được các đặc t si ọc của vir s cúm ia cầm độc lực cao H5N1 clade 7, ư đặc t k á , độc lực, k ả ă â l tr độ vật cảm iễm, môi trườ ôi cấ . - Đ ác đị được đặc t di tr ề , cụ t ể l iải tr tự và phân tích các e HA-H5, NA-N1 v e atri của vir s cúm A/H5N1 clade 7. - Đá iá được khả ă bảo hộ của vacxin H5N1 Re-1 với vir s cúm A/H5N1 clade 7 tại Việt Nam.
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguyên nhân của bệnh cúm gia cầm
Cúm gia cầm (Avian Influenza-AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm type A, thuộc họ Ort om oviridae â ra. Đâ l óm vir s có bi độ vật c ủ rộ , được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA. Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) và 9 subtype NA (từ N1 đến N9). Sự tổ hợp (reassortment) giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau. Mặt khác, vir s cúm A có đặc tính quan trọng là dễ d đột biến trong gen/hệ e đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ dẫ đế việc tạo iề s bt pe có độc t v k ả ă â bệ k ác a .
Họ Ort om oviridae đ được phát hiện bao gồm 4 óm vir s, đó l : óm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein. 1.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm
Vir s cúm t pe A được ác định subtype dựa tr cơ sở kháng nguyên (protein) bề mặt là HA (Hemagglutinin-viết tắt là H) và NA(Neuraminidase-viết tắt là N) có vai
3
trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ. Hema l ti i được coi là yếu t vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết đị độc lực của virus cúm A. 1.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả ă â ư kết hồng cầu gà trong ng nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ư kết đó, được gọi là kháng thể ă trở ư kết hồng cầu (HI- Hema l ti i I ibitor a tibod . Có 16 s bt pe HA đ được phát hiện (H1 - H16), ba subtype (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở ười li q a đế các đại dịch cúm trong lịch sử. Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ. 1.2.2. Protein NA (Neuraminidase)
Protein neurominidase còn gọi là sialidase là một protein enzyme có bản chất là glycoprotei được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trư t eo từng subtype NA. Có 9 subtype (từ N1 đế N9 được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, ai s bt pe N1 v N2 được tìm thấy ở vir s cúm ười liên quan đế các đại dịch cúm trong lịch sử. Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa g c sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của vir s tro cơ t ể vật chủ, v ă cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết tro iai đoạ “ òa m ”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “ coati ” iải phóng hệ gen của virus vào trong bào tươ tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễ ra a ơ . 1.2.3. Đ c lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm
Khả ă lâ iễm virus phụ thuộc v o tác động của men protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hoá học sau khi dịch mã của phân tử liên kết. Các enzym gi ư tr psi có k ả ă p á vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử arginin, trong k i đó các me protease k ác lại cần nhiề ami oa it cơ bản, vì thế đá iá độc lực của vir s tr cơ sở gây nhiễm cho gia cầm v sa đó p â t c sự sắp xếp các aminnoaxit của virus. Cụ thể ười ta q a tâm đến việc giải trình tự vù “cleava e site” của gen HA mà sự có mặt của các axit amin ư ar i i e R a l si e K sẽ cho phép dự đoá rằ vir s đó có độc lực cao hay không. Trong thực tế ười ta chia virus cúm ra làm 2 loại: Loại vir s có độc lực thấp (LPAI) và loại vir s có độc lực cao (HPAI). - LPAI là loại virus khi phát triể tro cơ t ể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứ lâm s điển hình và không làm chết vật chủ.
- HPAI là loại virus cúm A có khả ă â tổ t ươ iề cơ q a ội tạng tro cơ t ể nhiễm, trên gia cầm c ú t ường gây chết 100% s gia cầm bị nhiễm trong vòng 48-72 giờ sau nhiễm. Các vụ dịch lớ đề do vir s HPAI â ra, t ường là virus có kháng nguyên H5 và H7.
4
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. N i dung 2.1.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm A H N1 t các mẫu dịch ngoáy nhớp - ác đị vir s cúm ia cầm A/H5N1 bằ p ươ p áp Realtime RT-PCR (RRT-PCR) - Phân lập virus trên phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi đ i với các mẫ t iệm dươ t cúm A/H5N1. - Giám đị vir s p â lập được bằng phản ứng HA, HI và RRT-PCR.
M i quan hệ về di truyền của virus A/H5N1 clade 7 với các virus A/H5N1
2.1.2. Xác định đặc tính di truyền học của viru c m A/H5N1 clade 7 khác thông qua phân tích hệ phả của e HA, NA v . 2.1.3. Xác định m t s đặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7
- Tính thích ứng trên phôi gà, trên tế b o ơ p ôi - ác đị độc lực của vir s cúm A/H5N1 clade 7 trên một s độ vật t iệm (gà, vịt và ngan). - Một s đặc điểm bệ lý cơ bả của vir s cúm A/H5N1 clade 7 tr . 2.1.4. Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên)
- M i quan hệ về kháng nguyên học của virus A/H5N1 clade 7 với các virus A/H5N1 khác thông qua HI chéo với một s c ủ vir s cúm A/H5N1 t ộc một s clade khác. 2.1. . Xác định hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1 - Hiệu quả của vacxin cúm gia cầm Re-1 ở Việt Nam đ i với virus cúm gia cầm
A/H5N1 clade 7 tr . 2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Nơi t t ập mẫ ở vù bi iới Lạ ơ - P ò Vir s – Tr tâm C ẩ đoá T ú Tr ươ - Cục T ú . - ộ p ậ Cúm, Tr tâm P ò c dịc bệ C C – Hoa K
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu:
- Dịch swab (ngoáy ổ nhớp) từ gà nhập lậu; Vir s cúm A/H5N1 phân lập từ dịch swab; Phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi, tế b o ơ p ôi c ế từ phôi gà 9-10 ngày tuổi; Gia cầm (gà, vịt v a k ỏe mạ âm t kháng thể cúm gia cầm.
- Vắc i cúm ia cầm A/H5N1 Re-1; Kháng nguyên và kháng thể chuẩn cúm gia cầm H5N1; Kít chiết tách Qiagen Rneasy minikit và Kít realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII; Primer v probe c o H5N1, Primer v k t để giải trình tự gen 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.2.1. Phương pháp điều tra hồi cứu
K i iải tr tự e v p â t c câ p át si lo i p át iệ vir s A/H5N1 clade 7, điề tra ược lại các mẫ đ được t iệm tro p ò t iệm từ cù ồ .
5
2.3.2.2. Phương pháp phân lập virus trên phôi trứng gà
Bệnh phẩm dịch ngoáy ổ nhớp từ ập lậ được xử lý, và phân lập trên xoang niệu mô phôi trứng gà ngày tuổi, t eo dõi đế 96 iờ; kiểm tra bằng phản ứ HA để ác định khả ă â ư kết hồng cầu gà và phản ứng HI với kháng thể chuẩn cúm gia cầm để iám định virus phân lập được. 2.3.2.3. Xác định ch ID50
Virus được p a lo t iề ồ độ t eo cơ s 10 v iễm l oa iệ mô p ôi trứ . T ực iệ p ả ứ HA đ i với ước trứ để ác định phôi iễm virus A/H5N1 và ác đị c ỉ s I 50 của virus. 2.3.2.4. Xác định ch TCID50
Virus được p a lo t iề ồ độ t eo cơ s 10 v iễm lên tế b o ơ phôi gà. Quan sát CPE để ác định sự iễm virus A/H5N1 và ác đị c ỉ s TCID50 của virus. 2.3.2.5. Phương pháp gây bệnh cho đ ng vật thí nghiệm (gà, vịt và ngan):
Gây nhiễm bệ q a đườ mũi bằng cách nhỏ dịc vir s pha loãng 1/10 oặc dù liề â iễm l 10-6 TCID50. T eo dõi tro vò 10 để đá iá độc lực của vir s. T eo p ươ p áp của OIE). 2.3.2.6. Phương pháp HA, HI giám định viru và ác định đặc tính kháng nguyên của viru c m A/H5N1 clade 7 Chúng tôi sử dụ q tr HA, HI của OI để iám định virus phân lập được. 2.3.2.7. Phát hiện viru bằng realtime RT-PCR (RRT-PCR)
- Chiết tách RNA của vir s cúm A/H5N1bằng kít Qiagen Rneasy minikit. - Chạy phản ứng RRT-PCR phát hiện virus cúm 2.3.2.8. Phương pháp làm tiêu bản xét nghiệm bệnh tích vi thể Các mẫu phủ tạng được xử lý, đúc k ô , cắt lát bằng microtome và nhuộm HE
để quan sát các biế đổi bệnh lý bằng kính hiển vi. 2.3.2.9. Phương pháp giải trình tự gen:
Sản phẩm PCR được giải trình tự bằng máy sequence tự động ABI 3730; Sử dụng phần mềm ioedit 7.0.9 để thực hiện việc so sánh chu i trình tự (Alignment); Lập hệ phả gen HA, NA và M dựa tr p ươ p áp Nei bor-joining (NJ) với phần mềm MEGA so sánh với các vir s cúm A/H5N1thuộc các clade (nhánh) khác nhau với g c là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996). 2.3.2.10. Tiêm phòng vacxin cho gà, đánh giá các ch s gây bệnh lâm sàng.
G được tiêm phòng vacxin cúm A/H5N1 Re-1 sa đó được thử t ác cườ độc bằng virus cúm A/H5N1clade 7 là 106TCID50/100 µl/ q a đường nhỏ mũi tro k c ồ ôi độ vật đảm bảo điề kiệ a to si ọc. Theo dõi các biểu hiện lâm s tro vò 10 sa k i cô , đá iá các c ỉ s gây bệnh lâm v ác định tỷ lệ bảo hộ.
6
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và giám định virus cúm A/H5N1 clade 7
Tro iai đoạ ăm 2008, đ có tổng cộng 495 mẫu swab ngoáy ổ nhớp từ gà nhập lậ được thu thập và gửi đến Trung tâm Chẩ đoá T ú Tr ươ xét nghiệm. Tro đó có 275 mẫ dịc s ab từ ệ Cao Lộc v 220 mẫ dịc s ab từ ệ Lộc của tỉ Lạ ơ . Đ p át iện thấy 17 mẫu bệnh phẩm dươ t với vir s cúm A, tro đó có 10 mẫ p át iệ ở Cao Lộc v 7 mẫ ở Lộc , đạt tỷ lệ trung bình 3,43% (17/495).
Xét nghiệm các mẫ dươ tính virus cúm A bằ p ươ p áp Realtime RT- PCR phát hiện 15/17 mẫ dươ t vir s A/H5N1, đạt tỷ lệ trung bình 3,03%. Các mẫ dươ t vir s cúm A/H5N1 đề được phát hiện ở cả 2 huyện Cao Lộc và Lộc Bình. Tiếp tục phân lập trên phôi trứng, chúng tôi đ p â lập được 5 c ủ vir s cúm A/H5N1. Cả 5 c ủ đề l các mẫ từ ệ Cao Lộc.
Bảng 3.1. Kết quả xét nghiệm và phân lập virus t chương trình giám át biên giới (Lạng Sơn)
P â lập vir s H ệ mẫ ươ t cúm A (RRT-PCR) Kết q ả ươ t H5N1 (RRT-PCR) mẫ Tỷ lệ % mẫ Tỷ lệ % mẫ Tỷ lệ %
Cao Lộc Lộc 275 220 495 10 7 17 3,64 3,18 3,43 8 7 15 2,91 3,18 3,03 5 0 5 1,82 0,00 1,01
3.2. Xác định đặc tính di truyền của viru c m A H N1 thu c clad phân lập ở Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự và lập cây phát sinh loài. 3.2.1. Giải trình tự gen HA/H5 và phân tích cây phát sinh loài (phylogeny) dựa trên chuỗi nucleotide gen H5.
Tên của các mẫ đ p â lập được vir s cúm A/H5N1và tên của các mẫu RNA đ p át iệ dươ t vir s cúm A/H5N1 được đặt theo danh pháp qu c tế: Tên t pe cúm A/Lo i/T ước/Tên viết tắt Trung tâm Chẩ đoá T ú Tr ươ bằng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫ . Kết q ả c i tiết về các mẫ đ p â lập và phát hiệ dươ t vir s cúm A/H5N1 được trình bày ở bảng 3.2.
Việc tìm kiếm sự tươ đồng của các virus cúm trên ngân hàng dữ liệu bằng gen HA cho thấy các mẫ vir s có độ tươ đồng rất cao với hai chủ vir s đ được mô tả trước đâ thuộc clade 7 là virus A/chicken/Hebei/326/2005/H5N1 và virus A/c icke / a i/2/2006/H5N1 độ tươ đồng trung bình của gen HA ở mức độ nuleotide lầ lượt l 96,1 v 96,3 v cả 15 mẫ đề được sắp ếp ằm tro một óm.
7
Bảng 3.2. ết uả giải trình tự g n và phân tích cây phát inh loài các chủng viru c m A H N1 phát hiện ở Lạng Sơn
Subtype
Tên chủng virus cúm phân lập được
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008
S TT 1 2 3 4 5
Địa điểm phát hiện Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc
Phân loai clade/nhóm 7 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm A
H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1
Tên mẫu dương tính virus cúm (không phân lập được virus) A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008 6 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008 7 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008 8 9 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008 10 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008 11 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008 12 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008 13 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008 14 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008 15 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008
Cao Lộc Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình Cao Lộc Cao Lộc Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình
7/Nhóm B 7/Nhóm A 7/Nhóm B 7/Nhóm A 7/Nhóm A 7 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B
H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1
Đá c ú ý, k i q a sát tr câ p át si lo i dựa tr e HA có t ể t ể t ấ rõ có 13 trong s 15 mẫ vir s cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam tác t 2 óm nhỏ rõ rệt tr câ p át si lo i (xem hình 3.2.), tạm được gọi l óm A v óm để p â t c .
Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B hiển thị sự khác biệt trong cùng nhóm ở mức độ rất t ấp đ i với chu i cleotide cũ ư c i axit amin, cụ thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về a it ami l 0,38 . N ược lại, sự khác nhau giữa ai óm A v óm đạt trung bình 4,05% và 5,69% lầ lượt ở các mức độ nucleotide và amino acid trên khắp vùng gen HA mã hóa.
ặc dù các e HA của nhóm A hoặc B khác biệt về chu i nucleotide hoặc axit amin rất t ấp tro cù óm, ư sự khác biệt giữa ai óm đạt tr b 4,1 ở mức độ cleotide v 5,7 ở mức độ axit amin trên gen HA (Bảng 3.4). Mức độ khác biệt cao tươ đươ với sự thay thế ≥ 30 a it ami iữa các chu i protein HA ở hai nhóm.
8
Hình 3.2. Cây phát inh loài dựa trên chuỗi nucleotide gen H5 của những viru c m A/H5N1 clade 7 (Phương pháp phân tích Neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
Ngoài ra, sự khác biệt trung bình của tất cả các vir s á 7 đ iải trình tự trong nghiên cứu này so với tổ tiên gần nhất về gen HA là A/chicken/Shanxi/2/2006 là 3,8% (3,3-3,9%) ở mức độ cleotide v 5,8 5,4-6,1 ở mức độ v a it ami (Bảng 3.4). Tóm lại, những dữ liệu này cho thấy virus A/chicken/Shanxi/2/2006 là tổ tiên gần nhất của á 7 HA e được ác định trong nghiên cứu này.
9
Bảng 3.4. So ánh mức đ khác biệt về di truyền trên g n HA của chủng viru A H N1 clad với m t chủng tham chiếu 8 2
10
11
12
9
1
5
4
7
3
6
Virus (Xắp ếp th o clad )
Ký hiệu
13 Axit amin (%)
1 A/goose/Guangdong/1/1996 (0)
3.9 3.8 4.3 4.3 4.5 3.6 6.5 8.4 9.1
9
8.8
9
4
2 A/goose/Guiyang/337/2006 (4)
4.8 5.6 6.1 5.9 4.3
7
8.2
9
8.2 8.1 8.4
3.5 4.5
3 A/Viet Nam/1203/2004 (1)
3.2 3.4 3.4 4.7 7.2
9
9.7 9.3 9.1 9.3
4.4 5.4 3.7
4 A/Indonesia/5/2005 (2.1.3)
3.6 3.2 4.5
7
8.4 9.5 8.8 8.6
9
4.3 5.4 3.5 3.5
5 A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2)
3.1
5
7.9 8.6 9.1 9.1
9
9.1
4
5.3 3.3 3.4 3.1
6 A/Anhui/1/2005 (2.3.4)
4.5 7.2
9
9.1
9.1 9.1
9
3.1
4
3.7 4.6 4.4 4.1
7 A/Beijing/01/2003 (7)
7
7.4
7.9 7.2
5
7
4.6 5.7 5.3
6
6.2 5.6 3.3
8 A/chicken/Shanxi/2/2006 (7)
5.4 5.9 5.9 5.7 6.1
6.2 6.5 6.6 7.1 6.9 6.8 4.4 3.3
9 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam)
6.1 3.2 3.1 3.4
6.3 6.7 6.8 7.3 7.1 6.9 4.7 3.6
4
10 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 (7, Vietnam, nhóm A)
5.7 5.6 5.9
6.8 6.8
7
7.5 7.3
4.7 3.9 2.8 4.1
7
11 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 (7, Vietnam, nhóm B)
0.2 0.5
6.7 6.7 6.9 7.5 7.2
4.7 3.9 2.8 4.1 0.1
7
12 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhóm B)
0.4
6.6 6.6 6.9 7.4 7.2 6.9 4.6 3.8 2.7
4
0.4 0.3
13 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhóm B)
Nucleotide (%)
- Các c ủ vir s A/H5N1 óm t ộc clade 7 Việt Nam đều bị xóa mất một alanine ở vị trí 253 và chèn thêm 3 axit amin được gạch chân) vào vị trí poly basic gần cleavage site, tạo ra một chu i polybasic ở vị trí cleavage site n ư sa PQREREGGRRRKR*GLF.
- Các virus A/H5N1 nhóm A của clade 7 vẫn duy trì chu i trình tự axit amin t ô t ườ PQI GRRRKR*GLF ư các vir s cúm A/H5N1 clade 7 k ác. Đá c ú ý là virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016/2008, dườ ư l vir s tổ tiên (ng ồ c) của cả 2 óm vir s A v , bởi vir s có một chu i poly basic trung gian mang một a it ami được c è v o ư của nhóm B (PQREGGRRRKR*G). tr ia k ác iữa 2 nhóm A và B - Một c ủ vir s
là A/chicken/Vietnam/NCVD-s ab19/2008, cũ có chu i trình tự trung gian với alanine bị óa tại vị tr 253 v iệ tượ c è một axit amin (glycine) gần vị trí cleavage site tạo nên chu i trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G gi ư óm . 3.2.2. Giải trình tự gen NAN1 và phân tích cây phát sinh loài dựa trên chuôi nucleotide gen N1 Chúng tôi tiến hành lập cây phát sinh loài của gen N1 dựa trên chu i nucleotide và kết quả được biểu diễn ở hình 3.4.
Kết quả phân tích phát sinh loài dựa tr e N1 cũ đồng nhất đ i với kết quả so sánh dựa trên ge H5. N a l e N1 các c ủ vir s cúm A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam có độ tươ đồ cao đ i với gen N1 của các c ủ vir s cúm t ộc clade 7 của Trung Qu c và cụm với nhau trên cây phát sinh loài. Các chủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam bị đột biế óa deletio mất 20 axit amin ở vị trí từ 49-68 trên vùng thân của p â tử k á NA.
Trong 5 chủ vir s A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam có 4 chủng là A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008,
10
A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 cụm t óm. Tro k i đó c ủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 lại nằm tách khá xa khỏi nhóm này và có mức độ tươ đồng gần với chủ vir s t ộc clade 7 của Trung Qu c phân lập từ ăm 2003(A/Beijing/01/2003).
l
i
n m a
A H 7 e d a c s u r i
V
t i x a
0 2
i
n m a
t i x a
9 1
Hình 3.4. Cây phát sinh loài dựa trên chuỗi nucleotide g n N1 của các chủng virus A/H5N1 clade 7 (Phương pháp phân tích Neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
Giữa các chủ vir s cúm A/H5N1clade 7 cũ g có sự tiế óa k ác a đ i với gen N1, cụ thể là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 khác biệt với nhóm còn lại
11
của các virus clade 7 của Việt Nam. Tuy nhiên, có thể nhận thấ rõ r l các vir s cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Trung Qu c cũ ư Việt Nam đề có độ tươ đồng cao và khác biệt hoàn toàn với các clade khác hiện tại đa lư tro k vực.
Việc phân tích sự khác biệt di truyền trên gen N1 về cleotide v mức độ axit amin của các c ủ vir s A/H5N1 t ộc clade 7 ở Việt Nam và một s c ủ vir s của Trung Qu c v của Việt Nam được trình bày ở bảng 3.6.
đ tr A/chicken/Viet am/NCV -05/2008
So sánh cho thấy sự sai khác di truyền giữa óm 4 vir s cúm A/H5N1 clade 7 l A/c icke /Viet am/NCV -03/2008, của Việt Nam A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, v A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 l rất thấp, ≤ 2 ở mức độ cleotide v ≤2,7 ở mức độ axit amin. N óm vir s có độ khác biệt tươ đ i lớn so với c ủ vir s khác của Việt Nam cũ t ộc clade 7 là A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008. Sự sai k ác về cleotide v a it ami của óm 4 c ủ vir s tr v vir s A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lầ lượt là 4,7±0,2% (4,5-4,9%) và 5,6±0,3% (5,3-6,0%).
Bảng 3.6. Mức đ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng viru c m A/H5N1 clade 7 so sánh với m t s chủng tham chiếu 11 4
13
10
12
1
2
7
8
3
9
6
5
14
Tên chủng
Ký iệ
Axit amin (%)
1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
2.5
2.7
2.7
5.3
2.3
3.0
3.4
5.0
4.8
6.2
9.5
9.7
5.3
2 A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008
1.9
2.0
2.5
3.6
5.8
5.5
6.2
9.7
9.9
5.3
0.7
0.4
5.5
3 A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008
2.0
0.5
2.3
3.0
4.1
6.0
5.8
6.7 10.2 10.4 5.8
0.4
6.0
4 A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008
2.0
0.4
0.4
2.3
2.7
3.6
6.0
5.8
6.2 10.0 10.2 5.3
5.5
5 A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 4.5
4.7
4.9
4.5
5.5
4.1
2.5
5.5
5.0
5.3
9.7
9.9
4.1
4.5
6 A/chicken/Shanxi/10/2006
1.6
1.4
1.6
1.7
2.7
3.6
5.5
5.5
6.5 10.2 10.4 5.3
2.4
7 A/chicken/Shanxi/2/2006
2.7
2.5
2.7
2.7
4.1
2.0
4.6
4.1
4.8
8.5
8.5
3.9
2.3
2.3
8 A/Beijing/01/2003
2.4
2.7
3.0
2.8
2.3
3.6
3.2
3.6
8.2
8.2
2.3
2.8
9 A/Viet_Nam/1194/2004
4.7
5.2
5.4
5.4
4.3
4.7
4.6
0.9
5.0
8.7
8.7
3.4
1.0
10 A/Viet_Nam/1203/2004
4.2
4.8
5.0
5.0
3.8
4.3
4.1
2.3
4.6
8.2
8.2
3.4
5.6
4.9
11 A/goose/Viet_Nam/113/2001
6.6
6.7
6.8
6.4
5.7
6.5
6.0
4.5
7.9
7.7
2.8
12 A/Hong_Kong/156/97
14.2 14.8 15.1 14.7 13.8 14.4 13.2 13.0 13.8 13.3 12.2
1.1
6.9
13 A/goose/Vietnam/3/05
13.0 13.4 13.7 13.3 12.3 13.0 11.9 11.4 12.3 11.7 10.9 1.8
6.9
14 A/Goose/Guangdong/1/96
5.2
5.6
5.9
5.5
4.3
5.3
5.0
3.0
3.6
3.3
3.2 11.1 9.8
Nucleotide (%)
Chủ vir s A/c icke /Viet am/NCV -093 về mặt q a ệ ệ p ả ần nhất với chủ vir s A/ ei i /01/2003, l c ủ vir s p â lập ở ười ăm 2003 của Trung Qu c. Cụ thể sự sau khác chỉ là 2,3% ở mức độ nucleotide và 2,5% ở mức độ axit amin. Sự sai khác lớn nhất có thể q a sát t ấy giữa các vir s cúm A/H5N1 t ộc clade 7 t t ập ở Việt Nam so với các c ủ vir s A/H5N1 có hiệ tượ đột biế óa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 và virus A/goose/Vietnam/3/05 l 12,3-15,1 ở cleotide v 9,5 - 10,4%.ở mức độ axit amin.
12
3.2.3. ết uả giải trình tự gen M và lập cây phát sinh loài dựa trên chuỗi nucleotide gen M
Dựa trên sự sai k ác c i gen M của các c ủ vir s A/H5N1 so sá c ú tôi đ lập cây phát sinh loài (phylogenetic tree để theo dõi sự tiến hóa của các chủng virus này (Hình 3.5).
Clade 7
Clade 7
Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên g n M của cácchủng viru A/H5N1 clade 7 (Được lập bằng phương pháp phân tích n ighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
Kết quả phân tích cho thấy các c ủ vir s cúm ia cầm A/H5N1 t ộc clade 7 của Việt Nam có độ tươ đồ cao v ằm trong nhóm với các c ủ vir s cúm A/H5N1Clade 7 Trung Qu c, chứng tỏ gen M của các vir s cúm A/H5N1clade 7 của
13
Việt Nam và Trung Qu c có cùng nguồn g c. Để thấ rõ ơ sự khác biệt di truyền ở mức độ nucleotide và axit amin, chúng tôi so sánh gen M của các c ủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với một s vir s cúm A/H5N1của Trung Qu c. Kết quả được biểu thị ở bảng 3.8.
là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% của 2 nhóm này lượt lầ Mức độ sai khác về di truyền gen M giữa các c ủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với a k ô đá kể, sự sai khác t i đa về mức độ nucleotide là 1% và mức độ axit amin là 0,6%. Mức độ sai khác giữa các c ủ vir s cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt Nam v các c ủ t ộc clade 7 của Tr Q c cũ rất thấp. Sự sai khác t i đa về di truyền ở mức độ nucleotide và axit amin giữa các virus (virus A/chicken/Shanxi/2/2006).
t ộc clade 0
Sự sai k ác về di tr ề iữa các c ủ vir s cúm t ộc clade 7 do c ú tôi p â lập với các c ủ vir s t ộc clade k ác tr cơ sở gen M về cleotide v a it ami k ô iề , c ỉ tro k oả 3,6 về cleotide v 2-4 về a it amin. Hai c ủ A/goose/Vietnam/3/05 và chủ A/Ho Ko /156/97 t ộc clade 0 t có sự k ác biệt k á lớ : sự sai k ác về mức độ cleotide tới 10 v về mức độ a it ami tới 7%.Một c ủ vir s A/H5N1 k ác cũ là chủng A/Goose/G a do /1/96, được coi là thủy tổ của các c ủ vir s cúm A/H5N1độc lực cao, có độ sai khác về di truyền với các c ủ vir s t ộc clade 7 của Việt Nam ở mức độ nucleotide là 5,3±0.2% (5,2-5,6%) và ở mức độ axit amin là 4,2±0.2 % (4,1- 4,4%).
Bảng 3. . So ánh mức đ khác biệt về di truyền trên gen M của 5 chủng viru c m A H N1 thu c clad 7 so sánh với m t s chủng tham chiếu 13
Tên chủng viru
14
10
11
12
7
1
3
2
4
6
5
8
9
15
hiệu
Axit amin (%)
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
1
0.6
0.3
0.3
0.3
1.6
1.3
3.5
1.9
7.4
1.9
2.1
3.8
4.4
7.4
1.0
A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008
2
0.3
0.3
0.3
1.6
1.3
3.5
1.9
7.4
1.9
1.8
3.8
4.4
7.4
0.9
0.3
A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008
3
0.0
0.0
1.3
0.9
3.2
1.6
7.1
1.6
1.8
3.5
4.1
7.1
A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008
0.9
0.3
0.2
4
0.0
1.3
0.9
3.2
1.6
7.1
1.6
1.8
3.5
4.1
7.1
A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008
0.9
0.3
0.2
0.0
5
1.3
0.9
3.2
1.6
7.1
1.6
1.8
3.5
4.1
7.1
A/chicken/Shandong/A-10/2006
1.3
1.3
1.2
1.2
1.2
6
0.9
3.8
1.6
7.4
1.6
1.8
3.5
4.4
7.4
A/chicken/Shanxi/10/2006
0.8
0.9
0.8
0.8
0.8
0.8
7
4.1
1.6
7.4
1.6
1.8
3.5
4.4
7.4
A/chicken/Shanxi/2/2006
3.1
3.1
2.8
2.9
2.9
2.8
3.0
8
3.2
7.4
3.2
3.5
5.1
5.8
7.4
A/Beijing/01/2003_2003
2.4
2.4
2.3
2.3
2.3
1.7
2.1
3.5
9
5.8
0.0
0.7
1.9
2.8
5.8
10 A/goose/Vietnam/3/05
10.0 10.1 9.7
9.7
9.7 10.0 10.4 9.3
8.7
5.8
5.7
5.8
3.8
0.0
11 A/Anhui/2/2005
3.0
3.1
3.0
3.0
3.0
2.4
2.7
4.0
0.9
8.1
0.7
1.9
2.8
5.8
12 A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
2.6
2.7
4.0
1.4
9.3
1.3
2.1
3.2
5.7
13 A/goose/Fujian/bb/2003
4.0
4.1
3.8
3.8
3.8
3.4
3.7
4.4
2.1
8.1
2.0
2.3
2.8
5.8
14 A/Goose/Guangdong/1/96
5.5
5.6
5.2
5.2
5.2
5.0
5.3
5.7
3.5
6.0
3.4
3.8
3.2
3.8
15 A/Hong_Kong/156/97
10.7 10.8 10.5 10.5 10.5 10.7 11.1 9.3
9.4
1.3
8.8
9.8
8.8
7.5
Nucleotide (%)
Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di truyền dựa trên gen H5, N1 và M của các c ủ vir s cúm A/H5N1Clade 7 của Việt Nam
14
cho thấ , các c ủ vir s t ộc clade 7 của Việt Nam có độ tươ đồng cao với a c ứ tỏ c ú có cù ồn g c, v tươ đồ với các c ủ vir s A/H5N1 cũ t ộc clade 7 p â lập ở Tr Q c. 3.3. Xác định m t s đặc tính sinh học của viru A H N1 clad phân lập ở Việt Nam (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) 3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà ( ác định ch s EID50)
Virus bắt đầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũ p ù ợp với các nghiên cứ trước đâ rằ vir s cúm độc lực cao t ường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm xoang niệu mô. Kết quả ác đị k ả ă â iễm tr p ôi v c ỉ s I 50 của c ủ virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày ở bảng 3.10. - Ở nồ độ pha loãng 10-3, toàn bộ phôi trứng chết trong vòng 40h sau khi gây nhiễm.
Lầ t iệm
Hiệ iá p a lo
p ôi bị iễm
p ôi â iễm
p ôi k ô iễm
Tỷ lệ iễm virus (%) A/(A+B)×100
Nhiễm virus (A)
Tổng cộng (A+B)
Lầ 1
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -)
5 5 5 4 1 0 0
0 0 0 1 4 5 3
t c lũ Không nhiễm (B) 0 0 0 1 5 10
20 15 10 6 6 10
20 15 10 5 1 0
100 100 100 83.3 16.7 0
Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ s ng/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
107 t eo cô t ức Reed-Muench)
Lầ 2
5 5 5 3 1 0 0
0 0 0 2 4 5 3
0 0 0 1 5 10
19 14 9 5 6 10
19 14 9 4 1 0
100 100 100 80.0 16.7 0
106.9 t eo cô t ức Reed-Muench)
Lầ 3
5 5 5 3 1 0 0
0 0 0 2 4 5 3
0 0 0 1 5 10
19 14 9 5 6 10
19 14 9 4 1 0
100 100 100 80.0 16.7 0 0
106.9 t eo cô t ức Reed-Muench)
5 5 5 5 5 5 3 EID50/0,1ml 10-3 5 10-4 5 10-5 5 10-6 5 10-7 5 10-8 5 3 ĐC -) EID50/0,1 ml 10-3 5 10-4 5 10-5 5 10-6 5 10-7 5 10-8 5 3 ĐC -) EID50/0,1 ml
- Nồ độ 10-4:toàn bộ s phôi trứng chết trong ngày thứ hai, trong khoảng 40-48 giờ sau khi nhiễm. - Nồ độ 10-5: giết chết toàn bộ phôi trứ ư tro t ời ia lâ ơ so với nồ độ 10-3 và 10-4, ư cũ k ô q á 72 kể từ khi gây nhiễm.
15
- Nồ độ 10-6: p ôi t ườ c ết tro vò 72-96 . Ở độ p a lo t ườ vẫ có 1-2 phôi vẫn còn s ng (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau). - Nồ độ pha loãng cao nhất gây chết phôi trứng là 10-7, tuy nhiên chỉ có 1/5 phôi chết ở thời điểm 96h , và 4 phôi vẫn còn s ng.
- Đ i c ứ âm: các p ôi trứ s k ỏe mạ , b t ườ . T tr b c ẩ độ của vir s tr p ôi l 107,9EID50/ml. 3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào ơ phôi gà ( ác định ch s TCID50) Kết quả ác đị k ả ă â iễm tr tế b o ơ p ôi v c ỉ s TCI 50 của c ủ vir s A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày ở bảng 3.12.
- Từ nồ độ 10-2 đến nồ độ 10-5 toàn bộ các giếng tế b o đều có CPE và thảm tế b o đ bị virus phá hủy trong vòng 24-72 giờ. Đặc biệt ở nồ độ 10-2 v 10-3 thảm tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 24 giờ nhiễm. - Nồ độ 10-6 t ườ c ỉ có 3-4 giếng có hiệ tượng bệnh tích tế bào CPE bị virus phá hủy.
Lầ t iệm
Hiệ iá p a lo
giếng có CP
iế â iễm
iế k ô có CPE
Tỷ lệ iễm virus (%) A/(A+B)×100
Nhiễm virus (A)
Tổng cộng (A+B)
Lầ 1
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -)
5 5 5 5 5 5 5 5
0 0 0 0 3 3 5 5
t c lũ Không nhiễm (B) 0 0 0 0 3 6 11
24 19 14 9 7 8 11
24 19 14 9 4 2 0
100 100 100 100 57.1 25 0
Lầ 2
0 0 0 0 1 5 5 5
0 0 0 0 1 6 11
24 19 14 9 5 6 11
24 19 14 9 4 0 0
100 100 100 100 80 0 0
Lầ 3
Bảng 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
TCID50/0,1ml 10-2 5 10-3 5 10-4 5 10-5 5 10-6 5 10-7 5 10-8 5 ĐC -) 5 TCID50/0,1ml 5 10-2 10-3 5 10-4 5 10-5 5 10-6 5 10-7 5 10-8 5 5 ĐC -)
0 0 0 0 2 5 5 5
0 0 0 0 2 7 12
23 18 13 8 5 7 12
23 18 13 8 3 0 0
100 100 100 100 60 0 0
TCID50/0,1ml
5 5 5 5 2 2 0 0 106,2 5 5 5 5 4 0 0 0 106,4 5 5 5 5 3 0 0 0 106,2
- Nồ độ 10-7 chỉ có 2 giếng nhiễm virus ở lần thí nghiệm thứ nhất, lần thứ 2 và 3 không có giếng nào nhiễm virus.
16
- Nồng độ 10-8 không có CPE, tức là không có hiệ tượng nhiễm virus. T tr b c ẩ độ của vir s tr tế b o ơ p ôi l 107,3TCID50/ml.
3.3.3.Kết quả ác định đ c lực của viru c m A/H5N1clade 7 3.3.3.1. Thông s đ c lực dựa trên đặc tính phân tử
Độc lực và mức độ lây nhiễm của virus cúm trên gia cầm phụ thuộc v o tác động của enzyme protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hóa học và tính thụ cảm của ư kết t , và sự phá vỡ liên kết của men protease phụ thuộc vào s lượng các axit ami cơ bản tại vù “Cleava e site” của gen HA của vir s, đó l các a it ami arginine (R) và lysine (K).
Khi giải trình tự e HA, c ú tôi ác định mức độ có mặt và s lượng của các a it ami cơ bản arginine và Lysine tại vù “cleava e site” của các c ủ vir s cúm A/H5N1 clade 7. Kết quả trình tự vù “cleava e site” của c ủ vir s đại diệ c o clade 7 Việt Nam l A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 v một s vir s cúm A/H5N1 thuộc một s clade k ác được so sánh tại bảng 3.13.
Bảng 3.13. Các a it amin vùng ‘cl avag it ” của m t s virus cúm H N1 đ c lực cao và m t chủng tham chiếu
Virus strain
Clade Nơi phân lập HA0 cleavage site
PQREGGRRRKR*GLF
7
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
0
A/goose/Guangdong/1/96
Tr Q c PQRERRRKKR*GLF PQRERRRKKR*GLF
1
A/Hong_Kong/213/03
Hong Kong
PQREGRRKKR*GLF
1
A/chicken/Vietnam/15/2007
Việt Nam
PQGERRRKKR*GLF
A/chicken/Egypt/9403/2007
2.2 Ai Cập
PQRERRRKR*GLF
A/chicken/Primorje/1/2008
2.3.2 Nga
PQRERRRKR*GLF
A/duck/Vietnam/568/2005
A/Anhui/1/2005
2.3.2 Việt Nam 2.3.4 Tr Q c PLRERRRKR*GLF
PLRERRRKR*GLF
A/duck/Vietnam/37/2007
2.3.4 Việt Nam
A/chicken/Yunnan/493/2005
2.4
Tr Q c PQRERRRKR*GLF PQRE-RRKKR*GLF
A/crow/Osaka/102/2004
2.5 N ật ả
PQRERRRKKR*GLF
3
A/Pheasant/Hong_Kong/FY155/01
4
A/goose/Guiyang/337/2006
Hong Kong Tr Q c PQRERRRKKR*GLF
5
A/duck/Guangxi/668/2004
6
7
Tr Q c PQREIRRKKR*GLF Tr Q c PQRERRRKKR*GLF Tr Q c PQREGGRRKR*GLF
PQRERRRKKR*GLF
8
A/chicken/Yichang/lung-1/04 A/chicken/Shanxi/2/2006 A/Chicken/Hong_Kong/YU22/2002
Hong Kong
Tr Q c PQRERRRKKR*GLF
9
A/goose/Shantou/1621/05 0 1 2
Chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có motif chứa nhiều axit ami cơ bả ư ar i i e v L si e tại vù “cleava e site”, cho thấ vir s cúm A/H5N1 được ếp loại v o óm vir s cúm có độc lực cao đ i với gia cầm.
17
3.3.3.2. Đánh giá đ c lực trên đ ng vật thí nghiệm
Để đá iá độc lực của virus này chúng tôi chỉ sử dụng một chủng virus là A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 vì qua phân tích phát sinh loài (phylogeny) giựa tr e HA, vir s ằm tại c của óm các c ủ vir s A/H5N1 clade 7 của Việt Nam v ầ ất với các vir s cúm A/H5N1clade 7 ở Tr Q c.
M i động vật thí nghiệm được cô cườ độc với liều 106TCI 50/100µl vir s cúm A/H5N1clade 7 q a đường nhỏ mũi. T iệm được lặp lại 2 lầ . Kết quả tổng hợp theo dõi thí nghiệm đá iá độc lực của virus A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016/2008 được trình bày trong bảng 3.14. Bảng 3.14: Kết quả đánh giá đ c lực của viru c m A/H5N1 Clade 7 trên gia cầm
Lầ t iệm Chết (con) Tỷ lệ(%)
Lầ 1
Lầ 2 Động vật thí nghiệm Gà Vịt Ngan Gà Vịt Ngan S lượng (con) 11 10 10 10 10 10 11 0 0 10 0 0 100 0 0 100 0 0 Điểm lâm sàng 1.9 0 0 1.7 0 0 Thời gian chết trung bình (ngày) 5,4 0 0 6,2 0 0
Vir s cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) gây chết 100% s gà thí nghiệm. Theo tiêu chí về độc lực của virus cúm gia cầm của Tổ chức Thú y thế giới- OIE, vir s cúm A/H5N1clade 7 l vir s cúm có độc lực cao đáp ứng tiêu chí phân loại của OIE và kết quả tươ đồng với các chỉ thị độc lực ở mức độ phân tử của vùng “Cleava e site”.
Thời gian gây chết động vật thí nghiệm trung bình - MDT (Mean death time) của vir s cúm A/H5N1Clade 7 đ i với l 5,4 ở t iệm lầ 1 v 6,2 ở t iệm lầ 2.
C ú tôi cũ tiế â iễm a v vịt. Tất cả s vịt v a đều còn s ng sau khi kết thúc thí nghiệm. T m v o đó, toàn bộ s vịt v a tr đều khỏe mạ , ă b t ường và không thể hiện bất k triệu chứng lạ nào trong su t 2 tuần theo dõi.
Quan sát gà chết có hiệ tượng phù nhẹ vù đầ , l m c o đầ sư l . K i mổ khám các bệ t c t ường gặp l cơ đùi uất huyết, m o, t c t âm t m, da c â vù không lông xuất huyết, p ù keo dưới da vù đầu, não sung huyết, phổi viêm, sư , p ù v ất huyết. (Hình 3.8). Một s bệnh tích khác rải rác ở một s co l cơ tim xuất huyết, sung huyết t mạch vành tim. Thận sung huyết. Ruột non xuất huyết. Túi k d đục, viêm.
Đầu phù nhẹ
Sung huyết não
ơ đù x ất huyết
ù x ấ ế
Thận sung huyết
Phổi viêm xuất huyết
18
Hình 3.9. M t s hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh bằng viru c m A/H5N1Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016)
3.3.4. Kết quả đánh giá đ bài thải của viru trên đ ng vật thí nghiệm au gây nhiễm C ú tôi đá iá độ bài thải virus sau gây nhiễm bằng phản ứng realtime RT- PCR, kết quả trình bày ở bảng 3.16. - Toàn bộ s mẫ s ab của t iệm đề dươ t vir s cúm A/H5N1 khi xét nghiệm bằng phản ứng RRT-PCR.
- Toàn bộ các mẫu vịt kiểm tra đều âm tính, chứng tỏ vir s cúm A/H5N1clade 7 không có khả ă â iễm vịt. Điề cũ p ù ợp với thực tế, khi ở Trung qu c cũ c ỉ phát hiện thấ vir s A/H5N1 t ộc clade 7 trên gà mà không hề phát hiện thấy trên vịt.
19
ĐVTN Vịt Ngan
Stt ĐVTN
Bảng 3.1 : Đánh giá đ bài thải viru khi gây nhiễm bằng viru A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Gà C ể đổi mức độ b i t ải) ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++++ +++ ++ +++ Ct Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính C ể đổi - - - - - - - - - - - (0) C ể đổi ++ + +++ + ++ + + + + +(1) Ct ưỡ vòng) 25.3 21.7 23.9 20.7 28.5 23.2 22.5 19.9 20.6 25.2 22.2 23.1 Ct 27.8 33.7 24.9 34.1 26.4 32.6 Neg 36.1 31.7 31.3 31.0 +++ (3) Âm tính 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Trung bình Tỷ lệ nhiễm 100% 0% 80%
- Tuy nhiên, các mẫu dịch ngoáy họng ngan có kết quả khác với kết quả của các mẫu vịt. Có 8/10 mẫ a dươ t vir s cúm k i t iệm bằng RRT-PCR, mặc dù toàn bộ s a đều khỏe mạnh về mặt lâm sàng. Điề có a l a có thể nhiễm vir s cúm A/H5N1clade 7 ư k ông mắc bệnh.
Về chi tiết mức độ virus bài thải, hầu hết các mẫ s ab lấ từ 8/11 mẫ đều có mức độ là 3 - 4 (+) giá trị Ct nằm trong khoảng 19,9 - 23,9, và chỉ có một s ít mẫ 3/11 mẫ ) ở mức độ 2 (+). Tính trung bình, mức độ bài thải virus cúm ở gà nhiễm vir s cúm A/H5N1clade 7 là mức độ 3(+). Kết quả này cho thấy khi gà bị nhiễm vir s cúm A/H5N1clade 7 sẽ bài thải lượng lớ vir s trước khi chết. 3.3. . ết uả đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng của chủng viru c m A H N1 thu c clad 7
Theo nhiều tác giả,virus cúm gia cầm H5N1 độc lực cao bên cạnh khả ă t c ứng lây nhiễm cao với biể mô đường hô hấp, còn có khả ă tác động gây tổn t ươ iề cơ q a k ác tro cơ t ể của động vật cảm nhiễm gọi là khả ă nhiễm đa p ủ tạng. Chí đặc tính này là sự phân biệt về khả ă â bệ v độc lực của vir s cúm có độc lực cao v vir s cúm có độc lực thấp. 3.3. .1.Định lượng virus trong phủ tạng bằng phản ứng Realtime RT-PCR Để đá iá k ả ă iễm đa p ủ
tạng của c ủ vir s cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, chúng tôi thu thập mẫu phủ tạ o, p ổi, a , lác , t ậ , r ột v tụ ) và xét nghiệm bằ p ươ p áp RRT-PCR đặc hiệu cho gen H5/HA của virus cúm A/H5N1.
20
P ả ứ RRT-PCR có t ể t toá tươ đ i c ác lượ vir s có tro mẫ t iệm, v vậ c ú tôi đ c ể đổi kết q ả t iệm RRT-PCR sa c ẩ độ vir s tr tế b o lo 10 TCI 50 dựa tr ồ độ của vir s đ biết k i c ẩ độ tr tế b o C F để đá iá c i tiết ơ về mức độ iễm vir s của từ loại p ủ tạ . Kết q ả c i tiết t iệm RRT-PCR được tr b ở bả 3.17.
Bảng 3.1 . ết uả t nghiệm RRT-PCR đ i với m t loại phủ tạng gà gây bệnh bằng viru A/H5N1 clade 7 (NCVD) và chuyển đ i ang nồng đ viru .
N o
Tụy
Thận
Ph i
Ru t
Gan
Lách
Gà
Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10
1
13.3
7.6
21.6
5.1
19.4
5.7
18.1
6.2
19.7
5.7
22.5
4.8
24.6
4.2
2
14.5
7.2
21.4
5.1
22.7
4.7
20.2
5.5
22.6
4.8
27.9
3.2
32.4
1.8
3
15.2
7.0
17.7
6.3
19.7
5.6
25.2
4.0
23.2
4.6
26.7
3.5
26.5
3.6
TB 14.3
7.3
20.2
5.5
20.6
5.4
21.1
5.2
21.8
5.0
25.7
3.9
27.8
3.2
Std 1.0
0.3
0.7
0.6
3.6
1.1
1.9
0.6
2.8
0.9
4.1
1.2
1.8 2.2 – nh đ
Kết quả đá iá mức độ iễm vir s của p ủ tạ được biể t ị ở 3.11.
8.0
6.0
I
4.0
2.0
0 5 D C T 0 1 g o L
Tụy Thậ Phổi Ruộ Gan Lách
Não Series1 7.3
5.5
5.4
5.2
5.0
3.9
3.2
0.0
3.11. Bi u diễn mứ đ nhiễm virus của các lo i phủ t ng
qua xét nghi m RRT-PCR(chuy đổi sang log10) 3.3. .2.Phát hiện viru và bệnh tích vi thể gây ra bởi viru c m A/H5N1Clade 7 ở phụ tạng bằng phương pháp nhu m hóa mô miễn dịch
Điểm đặc trư của bệnh tích vi thể cũ t ể hiện rõ là hiệ tươ vi m mạch rất nặng ở tất cả các cơ q a ội tạng với dịch phù bao quanh thành mạch; tế bào nội mạc bị hoạt tử, bong tróc; các tế b o l mp o v đại thực bào bao quanh thành mạch.
Điều này giải thích lý do tất cả các cơ q a p ủ tạ của bị iễm vir s cúm đều bị xuất huyết ặ . P ươ p áp ộm óa tổ c ức miễ dịc IHC có độ tươ đồ với kết q ả của p ươ p áp vi t ể ộm H . T i có t ể ói rằ p ươ p áp óa mô miễ dịc có độ ạ cao ơ so với p ươ p áp vi t ể.
21
B nh tích vi th thận (nhu m IHC)
B nh tích vi th tim (nhu m IHC)
B nh tích vi th não (nhu m IHC)
B nh tích vi th tụy (nhu m IHC)
Hình 3.13. M t hình ảnh nhu m hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh
Các tổ t ươ về đại t ể, vi t ể cũ ư đá iá bằ p ươ p áp óa mô miễ dịc tro i cứ k đị rằ c ủ vir s H5N1 t ộc clade 7 cũ có ướ iễm đa p ủ tạ i các vir s A/H5N1 độc lực cao k ác ư iề tác iả k ác đ i cứ . 3.3.6. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng viru c m A H N1 clad phân lập ở Việt Nam
Kết quả phản ứng HI chéo giữa virus và kháng huyết thanh của các clade virus A/H5N1 khác nhau cho thấy có một sự tươ đồng cao giữa các virus và kháng huyết t a đồng chủng (hiệu giá HI 160 ư k ô có p ản ứng chéo hoặc phản ứng chéo có hiệu giá rất thấp giữa các c ủ vir s từ các clade khác nhau (Bảng 3.19).
Kháng huyết t a A/H5N1 t ộc clade 7 được chế từ ba chủng virus khác nhau thuộc nhóm B, và một chủng thuộc óm A được sử dụ để t ực hiện phản ứng HI chéo với các c ủ vir s cúm A/H5N1của các clade khác. Trong khi kháng huyết thanh kháng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 không có phản ứng với các virus clade 1 hoặc clade 2.3.4, thì có phản ứng chéo với một c ủ vir s của nhóm B ở mức độ hạn chế HI 20 v k ô p ản ứng chéo với các c ủ vir s cúm óm A. Hiệ tượng kháng huyết thanh kháng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016/2008 có phản ứng chéo rất hạn chế (hiệu giá HI thấp) hoặc không có phản ứng chéo với các c ủ vir s cúm A/H5N1khác thuộc clade 7 cho thấy sự tươ đồng về mặt kháng nguyên giữa các vir s cúm A/H5N1trong cùng clade 7 là rất thấp.
22
Bảng 3.19. Kết quả ác định đặc tính kháng nguyên của viru c m A/H5N1 clade 7 phân lập được bằng phản ứng HI
háng huyết thanh chuẩn
0
1
2.3.4
2.3.4
7
7B
7A
Clade
háng nguyên chuẩn
A/goose/Guangdong/1/96
0
A/Vietnam/1203/2004
1
A/Anhui/1/05
A/chicken/Vietnam/NCVD-035/2008
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
7
GS/GD VN/1203 AN/1/05 CK/VN/35 CK/VN/016 CK/VN/03 CK/VN/93 1280 80 20 2.3.4 2.3.4 <10 <10 <10 <10
80 80 1280 80 <10 <10 <10
<10 <10 <10 <10 <10 160 <10
<10 320 <10 <10 <10 <10 <10
<10 <10 20 <10 640 20 <10
80 160 160 320 10 20 80
<10 <10 <10 <10 <10 <10 160
A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-93/2008
7B 7A
háng nguyên kiểm tra
A/duck/Vietnam/NCVD-159/2008
A/duck/Vietnam/NCVD-160/2008
A/chicken/Vietnam/NCVD-185/2008
A/duck/Vietnam/NCVD-186/2008
A/duck/Vietnam/NCVD-187/2008
A/chicken/Vietnam/NCVD-188/2008
<10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
160 160 320 320 320 320 <10
40 80 80 80 80 80 10
10 10 10 10 <10 <10 <10
<10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008
<10 10 10 10 <10 <10 160
2.3.4 <10 2.3.4 <10 2.3.4 <10 2.3.4 <10 2.3.4 <10 2.3.4 <10 <10 7B
3.3.7. Đánh giá khả năng bảo h của vacxin Re-1 đ i với viru c m A H N1Clad trên gà.
Gà được tiêm phòng 1 mũi vacxin vacxin H5N1 Re-1 lúc 14 ngày tuổi và công cườ độc lúc 4 tuần sau khi tiêm vacxin. S lượng gà tiêm phòng vacxin là 10 con và s đ i chứng không tiêm vacxin l 5 co . Trước k i cô cườ độc, toàn bộ s gà (cả lô tiêm vacxin v lô đ i chứ đề được lấy máu và kiểm tra kháng thể.
Cô cườ độc được tiến hành tại khu chuồ cô cườ độc an toàn sinh học của Trung tâm Chẩ đoá T ú Tr ươ . i được cô cườ độc với liều 106TCID50/co q a đường nhỏ mũi. T eo dõi t iệm trong vòng 10 ngày, ghi lại đặc điểm lâm sàng hàng ngày và tính tỷ lệ s ng chết nhằm đá iá sự bảo hộ. Kết quả chi tiết theo dõi thí nghiệm đá iá iệu lực vacxin H5N1 đ i với virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày ở bảng 3.20.
S được tiêm vacxin H5N1 Re-1 s ng sót 100% sa k i cô cườ độc, lô đ i chứ c ết 100 . T ời ia c ết trong vòng từ ngày thứ ba đến ngày thứ bảy sa k i cô cườ độc. Kết quả này cho thấy vacxin H5N1 Re-1 đ bảo hộ cho gà ch ng lại c ủ vir s cúm A/H5N1t ộc clade 7.
Để đá iá rõ ơ về iệ lực của vắc i A/H5N1 Re-1 tro việc k c t c đáp ứ miễ dịc , c ú tôi lấ má lô t i m v o t ứ 10 sau khi công v t iệm bằ p ả ứ ă trở ư kết ồ HI. Kết q ả c o t ấ có sự tă iệ iá k á t ể so với trước k i cô , t ậm c có mẫ tă cao ơ 4 đơ vị p a lo V 1 . N ư vậ k á t ể do vắc i vừa có t ể bảo ộ c o c lại
23
virus vừa có t ể được k c t c bởi vir s cô cườ độc m được tă cao t m. Điề có ý a tro t ực tế l ế được ti m p ò t t có t ể có sức đề k á c bệ t t.
Bảng 3.20. Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường đ c gà thí nghiệm au tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 Re-1 N sa cô Ký iệ Tỷ lệ chết 1 2 3 4 5 6 7 8/10 S con chết/tổng s Hiệ iá KT Trước khi công Sau khi công
0/10 0%
VX 1 VX 2 VX 3 VX 4 VX 5 VX 6 VX 7 VX 8 VX 9 VX 10 Lô t iệm ti m vắc i ) 8 8 7 8 7 7 8 7 8 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ≥12 9 10 10 10 9 10 10 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Lô đ i c ứ k ô ti m vắc i )
5/5 100%
- - ẹ - - ế Kết quả này có thể giúp lý giải tại sao c o đế a c ú ta c ưa p át iện thấy virus A/H5N1 clade 7 ở bất k ổ dịc o. Đó l do, iề đ đ đề được tiêm p ò văc i H5N1 Re-1 v đ có k á t ể bảo hộ ch ng lại virus này nếu có tiếp xúc.
ĐC 1 ĐC 2 ĐC 3 ĐC 4 ĐC 5 - - - - - 0 0 1 1 1 2 3 0 0 2 2 3 0 0 1 2 3 0 0 2 3 0 0 1 1 2 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1) Đ tiến hành thu thập mẫu swab gà nhập lậ tại 2 ệ Cao Lộc v Lộc tỉ Lạ ơ , t iệm bằ p ả ứ RRT-PCR phát hiệ được 15 mẫ dươ t cúm A/H5N1 v p â lập được 05 c ủ vir s cúm A/H5N1 t ộc clade 7 lầ đầ ti ất iệ ở Việt Nam.
2) Giải tr tự e H5, N1 v c o t ấ vir s cúm A/H5N1 clade 7 ở Việt Nam có sự k ác biệt rất lớn về di tr ề , đặc biệt l e H5 so với các clade virus khác. Các chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam cũ p â t 2 óm với sự
24
khác biệt về nucleotide và axit amin ở cấp độ gen HA giữa hai phân nhóm của virus clade 7 được phát hiện tại Việt Nam óm A v tươ ứ đạt mức độ trung bình 4,1% và 5,7%, với sự thay thế ơ 30 a it ami iữa các virus của hai nhóm này.
Kết q ả ác đị độc lực của của vir s cúm A/H5N1 clade 7 tr độ vật t 3) C ủ vir s cúm A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam t c i t t tr các môi trườ ôi cấ : đạt iệ iá 107,9EID50 tr p ôi trứ v iệ iá 107,3TCID50 tr môi trườ tế b o ơ p ôi . iệm c o t ấ : - Vir s có độc lực cao, â c ết 100 s â bệ , với t ời ia â c ết tr b từ 5,9-6,2 .
- Vir s â iễm đa p ủ tạ v p át triể tro các tổ c ức ư o, tụ , p ổi, t ậ , a , lác , r ột của gà. Ở nhữ cơ q a có ồ độ virus khác nhau, não là ơi virus có thể phát triể đạt nồ độ cao nhất. - Virus cúm A/H5N1 clade 7, có khả ă â iễm cho ngan, không gây
Kết quả nghiên cứ đ c o
nhiễm cho vịt v o to k ô có độc lực với 2 loài thuỷ cẩm này. t ấ vir s cúm A/H5N1 clade 7, A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, phân lập từ gia cầm nhập lậ l vir s có độc lực cao và có khả ă â bệnh trên gà, ư kéo dài thời gian bài thải vir s trước khi chết, điề cũ l m tă ếu t cơ c o sức khoẻ của co ười.
4) Đặc t k á t ô q a p ả ứ HI c o t ấ vir s cúm A/H5N1 clade 7 cũ có sự khác biệt rất lớn về mặt k á t tươ đồ ) với các clade k ác đa lư ở Việt Nam. ự tươ đồ iữa các vir s tro cù clade 7 ở Việt Nam cũ k ô cao (<10 ÷ 20).
5) Vac i cúm A/H5N1 Re-1 do Trung Qu c sản xuất v được sử dụng ở Việt Nam có tác dụng bảo hộ t t ch ng lại vir s cúm A/H5N1clade 7, với tỷ lệ s ng sót sau cô cườ độc l 100 lô đ i chứng chết 100%).
Đề nghị
- Tiếp tục tiến hành giám sát virus trên gia cầm và chim hoang dã ở Việt Nam để giám sát khả ă dò vir s cúm A/H5N1 clade 7 cũ ư các clade k ác có k ả ă lâ la .
- Tiếp tục nghiên cứu về khả ă bảo hộ của các loại vacxin cúm gia cầm khác hiệ a đa được sử dụng tại Việt Nam ch ng lại vir s cúm clade 7 này khi mà vir s đ â dịch tại Trung Qu c v a mar, đặc biệt là Trung Qu c đ sản xuất riêng một loại vacxin chế bằ vir s cúm A/H5N1clade 7 này.
- Tiếp tục nghiên cứu về di truyền các gen khác của vir s cúm A/H5N1clade 7, cũ ư các clade k ác để phát hiệ v đá iá k ả ă tái tổ hợp của các chủng virus cúm gia cầm có mặt ở Việt Nam.
