Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 2

07/08/2017

ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TRONG

CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

Dr. Vũ Thị Thúy Hằng

Nuôi cấy mô thực vật là gì?

• Nuôi cấy tế bào trần, tế bào, mô hoặc cơ quan

thực vật để tái sinh cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh

trong điều kiện vô trùng (vi nhân giống) - Gọi

chung là NUÔI CẤY MÔ.

• Đây là khái niệm chung sử dụng cho tất cả các

dạng nuôi cấy trong điều kiện vô trùng dẫn đến

sinh trưởng và biệt hóa của mẫu cấy.

Nguyên lý của nuôi cấy mô (NCM)

NCM dựa trên các nguyên lý sau:

TÍNH TOÀN NĂNG

Tiềm năng di truyền của tế bào thực vật để tạo ra cây hoàn

chỉnh

KHẢ NĂNG BIỆT HÓA

TB giữ được khả năng biệt hóa và phát sinh hình thái

SỰ PHẢN PHÂN HÓA TẾ BÀO

Khả năng của tế bào phản ứng với kích thích khởi phát quá

trình phát triển dẫn tới sự phát sinh cơ quan.

Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô

• Môi trường nuôi cấy

• Chất khoáng, chất điều tiết sinh trưởng, hocmon, nguồn

carbon

• Yếu tố môi trường

• Ánh sáng, nhiệt độ, quang hợp, chiếu sáng, vô trùng,

môi trường

• Nguồn mẫu cấy

• Chủ yếu thường mẫu mô ở đỉnh sinh trưởng

• Di truyền

• Các loài khác nhau thể hiện khả năng nuôi cấy mô khác

nhau

• Trong nhiều trường hợp, các kiểu gen khác nhau trong

cùng một loài cũng phản ứng khác nhau với nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy

Nguyên tố đa lượng

- Kali (K)

- Phốt pho (P)

- Magie (Mg)

- Canxi (Ca)

- Na

- Sulfur…

Nguyên tố vi lượng

- Kẽm (Zn)

- Mangan (Mn)

- Boron (B)

- Đồng (Cu)

- Sắt (Fe)

- Cobalt (Co)

- I, Ni ...

Chất điều hòa

sinh trưởng

- Auxin

- Cytokinin

Vitamin

- Thiamine (B1)

- Nicotinic acid (niacin)

- Pyridoxine (B6)

- Myo-inositol

Đường

- Sucrose

- Các loại khác

Tác nhân gel hóa

- Agar

- Agarose

- Gelrite

Tác nhân gel hóa

Đối với NCM môi trường sử dụng có thể là bán rắn/đặc hay lỏng.

Môi trường đặc cần tác nhân gel. Natri alginate, agar-agar là

những tác nhân được sử dụng chủ yếu

Chất điều hòa sinh trưởng

1. Auxin:

Mục đích của chất điều tiết sinh trưởng là phân chia tế bào và

sinh trưởng. Vd. IAA, 2 4-D, NAA

2. Cytokinin:

Chức năng chính là phân chia tế bào. Đây là những dẫn xuất

của purin. Vd: Zeatin, BAP, KN, TDZ;

3. Gibberellin

Điều hòa sự kéo dài tế bào, sử dụng phổ biến là GA3

4. Abscisic acid

Ức chế phân bào, thường sử dụng trong phát sinh phôi soma

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

•2 hormones ảnh hưởng đến phân hóa tế bào:

•Auxin: Kích thích rễ phát triển

•Cytokinin: Kính thích mầm phát triển

•Nhìn chung, tỷ lệ của 2 hocmon này sẽ quyết

định sự phát triển cây:

•Auxin ↓Cytokinin = Rễ phát triển

•Cytokinin ↓Auxin = Mầm phát triển

•Auxin = Cytokinin = Mô sẹo phát triển

Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi

trường nuôi cấy Cytokinin

- Chồi; phôi

Auxin

- rễ;

- callus

Mẩu lá

Mầm

Rễ

Mô sẹo

Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi

trường nuôi cấy Môi trường MS

Murashige , T. and Skoog, F. (1962): Physiol. Plant., 15: 473-497

PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ

1. Không gian chuẩn bị môi trường

Diện tích này có các thiết bị:

. Cân phân tích

. Máy đo pH

. Máy khử trùng/Autoclave

. Tủ lạnh

2. Buồng vô trùng

Cần để phân lập mẫu cấy và cấy mẫu

3. Khu nuôi cấy

Buồng nuôi cấy chiếu sáng cường độ 2000 lux, nhiệt

độ 25°±1°C

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

Quy trình tổng quát trong nuôi cấy mô

Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy

Bước 2: Khử trùng

Bước 3: Tạo chồi

Bước 4: Tạo rễ

Bước 5: Cấy cây vào môi trường thích hợp

Bước 6: Trồng cây trong vườn ươm

B1. Nguồn mẫu cấy

Là mẫu mô được cắt khỏi mô hoặc cây

Cơ quan dự trữ tươi

Chồi ngọn

Mầm, hoặc đỉnh sinh trưởng

Rễ, các phần của hoa

Lá và lá mầm.

Phải sử dụng mẫu cấy vô trùng cho NCM

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng mô cấy:

mùa vụ, sinh lý, chất lượng cây nguồn, kích thước.

B2. KHỬ TRÙNG

Khử trùng để tránh sự nhiễm tạp

Rửa bằng nước máy

Làm sạch bằng chất tẩy

Teepol, Dettol, Tween- 20,

Khử trùng bằng các chất khử trùng như

70% cồn, HgCl2, NaOCl

B6 - Thích nghi khí hậu

- Cây con in vitro phải được thích nghi khí

hậu/tôi luyện để dưa ra môi trường sống tự

nhiên.

- Tất cả các điều kiện kiểm soát phải giảm dần

để cây có thể tự thích nghi với điều kiện môi

trường.

- Giá thểsửdụng: đa dạng, có thểsửdụng

vermiculate, peat moss làm giá thể.

Cây được thích nghi khí hậu

Trong nhà lưới PHẦN 2. CÁC DẠNG NUÔI CẤY

* Phân loại theo nguồn mẫu nuôi cấy

Nuôi cấy cơ quan/Organ culture

Nuôi cấy callus/Callus culture

Nuôi cấy tế bào trần/Protoplast culture

Tất cá các dạng nuôi cấy như noãn, bầu, bao phấn,

phôi, nội nhũ đều nằm trong các phạm trù này

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

NUÔI CẤY CƠ QUAN

Nuôi cấy TB đơn

Nuôi cấy huyền phù/dung dịch treo

NUÔI CẤY CALLUS

Nuôi cấy noãn,

Nuôi cấy bầu, bao phấn, phôi, nội nhũ

NUÔI CẤY PROTOPLAST

Phân loại theo cấu trúc hình thành khi

nuôi cấy

• Phát sinh chồi/Plantlets

• Cây con/Seedlings

• Mô sẹo/Callus

• Phát sinh phôi soma/Somatic Embryogenesis

Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta

spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E) Tái sinh cây từ C.

roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của

Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ

cây Psacalium decompositum.

2.1. Phát sinh chồi/plantlets

2.1.1. Hình thành chồi trực tiếp từ mô phân sinh

đỉnh

• Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng/ Meristem culture

• Nuôi cấy chồi/ Shoot culture

2.1.2. Hình thành chồi bất định/Adventitious shoot

formation

• Tái tạo cây nhị bội (Diploid plant regeneration)

• Tái tạo cây đơn bội/tam bội (Haploid and triploid

regeneration)

- Chồi hình thành trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh (đỉnh sinh

trưởng, chồi nách).

Nguồn mẫu cấy: chồi mầm hoặc một đoạn thân nhỏ có

đốt/mắt

Mô phân

sinh

Chồi nách

Chồi phát

sinh trực tiếp

- Chồi mới bất định hình thành từ mầm mới.

Nguồn mẫu cấy là đoạn lóng, lá, rễ hoặc các bộ phận khác mà

không phải là mô phân sinh/đỉnh sinh trưởng.

Phát sinh cơ quan gián tiếp

Lóng

Lá

Chồi mới

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

2.1.1 Hình thành chồi từ mô phân sinh

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

- Sử dụng đỉnh sinh trưởng kích

thước < 1 mm

- Sử dụng trong vi nhân giống, loại

bỏ bệnh do virut

Nuôi cấy chồi:

- Sử dụng một phần đoạn thân có một

số đốt/mắt

- Hình thức phổ biến để vi nhân giống

Nuôi cấy chồi

Mẫu cấy có một số đốt/mắt

trên thân

Các chồi được kích thích

mọc thành cụm chồi Tách các cụm chồi và chuyển

sang môi trường nuôi cấy khác

Hình thành chồi cành

- Đoạn thân dài được cắt

thành các đoạn nhỏ có

chứa mắt và đặt thẳng

đứng trong môi trường

- Chồi mới mọc dài và quá

trình lại lặp lại.

Nuôi cấy chồi (tiếp)

Nuôi cấy mắt

Nuôi cấy chồi (tiếp)

- Chồi mang một số đốt được đặt

nằm ngang trên bề mặt môi trường;

- Thân nhú mọc;

- Cụm chồi được tách chuyển sang

môi trường nuôi cấy khác

Chồi đứng

Nuôi cấy chồi (tiếp) - Pseudocorms

Pseudocorms là cấu trúc hình

thành khi hạt phong lan nảy

mầm

Phong lan nuôi cấy mô có thể

cho rất nhiều pseudocorms.

Minitubers (củ siêu nhỏ) sản

xuất các cây có củ như

khoai tây, khoai sọ.

Mỗi một củ siêu nhỏ dùng

để nhân giống

Nuôi cấy chồi (tiếp) - Minitubers

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi