07/08/2017
Nuôi cấy mô thực vật là gì?
ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
• Nuôi cấy tế bào trần, tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật để tái sinh cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh trong điều kiện vô trùng (vi nhân giống) - Gọi chung là NUÔI CẤY MÔ.
• Đây là khái niệm chung sử dụng cho tất cả các dạng nuôi cấy trong điều kiện vô trùng dẫn đến sinh trưởng và biệt hóa của mẫu cấy.
Nguyên lý của nuôi cấy mô (NCM)
Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô
Dr. Vũ Thị Thúy Hằng
• Môi trường nuôi cấy
• Yếu tố môi trường
NCM dựa trên các nguyên lý sau: • Chất khoáng, chất điều tiết sinh trưởng, hocmon, nguồn carbon TÍNH TOÀN NĂNG
• Di truyền
• Ánh sáng, nhiệt độ, quang hợp, chiếu sáng, vô trùng, Tiềm năng di truyền của tế bào thực vật để tạo ra cây hoàn chỉnh KHẢ NĂNG BIỆT HÓA môi trường • Nguồn mẫu cấy TB giữ được khả năng biệt hóa và phát sinh hình thái • Chủ yếu thường mẫu mô ở đỉnh sinh trưởng SỰ PHẢN PHÂN HÓA TẾ BÀO
Tác nhân gel hóa
Môi trường nuôi cấy
Đối với NCM môi trường sử dụng có thể là bán rắn/đặc hay lỏng. Môi trường đặc cần tác nhân gel. Natri alginate, agar-agar là những tác nhân được sử dụng chủ yếu
Chất điều hòa sinh trưởng
Nguyên tố vi lượng
1. Auxin:
Mục đích của chất điều tiết sinh trưởng là phân chia tế bào và sinh trưởng. Vd. IAA, 2 4-D, NAA
2. Cytokinin:
Chất điều hòa sinh trưởng
Nguyên tố đa lượng - Kali (K) - Phốt pho (P) - Magie (Mg) - Canxi (Ca) - Na - Sulfur…
- Kẽm (Zn) - Mangan (Mn) - Boron (B) - Đồng (Cu) - Sắt (Fe) - Cobalt (Co) I, Ni ... -
- Auxin - Cytokinin
Chức năng chính là phân chia tế bào. Đây là những dẫn xuất của purin. Vd: Zeatin, BAP, KN, TDZ;
3. Gibberellin
Điều hòa sự kéo dài tế bào, sử dụng phổ biến là GA3
Agar Agarose
Đường - Sucrose - Các loại khác
4. Abscisic acid
Tác nhân gel hóa - - - Gelrite
Vitamin - Thiamine (B1) - Nicotinic acid (niacin) - Pyridoxine (B6) - Myo-inositol
Ức chế phân bào, thường sử dụng trong phát sinh phôi soma
• Các loài khác nhau thể hiện khả năng nuôi cấy mô khác Khả năng của tế bào phản ứng với kích thích khởi phát quá trình phát triển dẫn tới sự phát sinh cơ quan. nhau • Trong nhiều trường hợp, các kiểu gen khác nhau trong cùng một loài cũng phản ứng khác nhau với nuôi cấy
1
07/08/2017
Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy
• 2 hormones ảnh hưởng đến phân hóa tế bào:
Cytokinin - Chồi; phôi Mẩu lá • Auxin: Kích thích rễ phát triển • Cytokinin: Kính thích mầm phát triển Mầm
Rễ
• Nhìn chung, tỷ lệ của 2 hocmon này sẽ quyết định sự phát triển cây: • Auxin ↓Cytokinin = Rễ phát triển • Cytokinin ↓Auxin = Mầm phát triển • Auxin = Cytokinin = Mô sẹo phát triển
Môi trường MS
Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy
Murashige , T. and Skoog, F. (1962): Physiol. Plant., 15: 473-497
Mô sẹo Auxin rễ; - callus -
PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ
1. Không gian chuẩn bị môi trường Diện tích này có các thiết bị:
. Cân phân tích . Máy đo pH . Máy khử trùng/Autoclave . Tủ lạnh 2. Buồng vô trùng Cần để phân lập mẫu cấy và cấy mẫu 3. Khu nuôi cấy Buồng nuôi cấy chiếu sáng cường độ 2000 lux, nhiệt độ 25°±1°C
2
07/08/2017
Quy trình tổng quát trong nuôi cấy mô
B1. Nguồn mẫu cấy
Là mẫu mô được cắt khỏi mô hoặc cây
Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy
Bước 2: Khử trùng
Cơ quan dự trữ tươi Chồi ngọn Mầm, hoặc đỉnh sinh trưởng Rễ, các phần của hoa Lá và lá mầm.
Phải sử dụng mẫu cấy vô trùng cho NCM
Bước 3: Tạo chồi
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng mô cấy:
mùa vụ, sinh lý, chất lượng cây nguồn, kích thước.
Bước 4: Tạo rễ
Bước 5: Cấy cây vào môi trường thích hợp
B6 - Thích nghi khí hậu
B2. KHỬ TRÙNG Khử trùng để tránh sự nhiễm tạp Rửa bằng nước máy
- Cây con in vitro phải được thích nghi khí hậu/tôi luyện để dưa ra môi trường sống tự nhiên.
Làm sạch bằng chất tẩy Teepol, Dettol, Tween- 20,
- Tất cả các điều kiện kiểm soát phải giảm dần để cây có thể tự thích nghi với điều kiện môi trường.
- Giá thể sử dụng: đa dạng, có thể sử dụng vermiculate, peat moss làm giá thể.
Khử trùng bằng các chất khử trùng như
70% cồn, HgCl2, NaOCl
PHẦN 2. CÁC DẠNG NUÔI CẤY
Cây được thích nghi khí hậu Trong nhà lưới
* Phân loại theo nguồn mẫu nuôi cấy
Bước 6: Trồng cây trong vườn ươm
Nuôi cấy cơ quan/Organ culture Nuôi cấy callus/Callus culture Nuôi cấy tế bào trần/Protoplast culture
Tất cá các dạng nuôi cấy như noãn, bầu, bao phấn, phôi, nội nhũ đều nằm trong các phạm trù này
3
07/08/2017
Phân loại theo cấu trúc hình thành khi nuôi cấy
NUÔI CẤY CƠ QUAN Nuôi cấy noãn,
Nuôi cấy bầu, bao phấn, phôi, nội nhũ
NUÔI CẤY CALLUS
Nuôi cấy TB đơn Nuôi cấy huyền phù/dung dịch treo
NUÔI CẤY PROTOPLAST
2.1. Phát sinh chồi/plantlets
2.1.1. Hình thành chồi trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh
• Phát sinh chồi/Plantlets • Cây con/Seedlings • Mô sẹo/Callus • Phát sinh phôi soma/Somatic Embryogenesis
2.1.2. Hình thành chồi bất định/Adventitious shoot formation
• Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng/ Meristem culture • Nuôi cấy chồi/ Shoot culture
Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E) Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.
- Chồi mới bất định hình thành từ mầm mới. Nguồn mẫu cấy là đoạn lóng, lá, rễ hoặc các bộ phận khác mà không phải là mô phân sinh/đỉnh sinh trưởng.
- Chồi hình thành trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh (đỉnh sinh trưởng, chồi nách). Nguồn mẫu cấy: chồi mầm hoặc một đoạn thân nhỏ có đốt/mắt
• Tái tạo cây nhị bội (Diploid plant regeneration) • Tái tạo cây đơn bội/tam bội (Haploid and triploid regeneration)
Chồi phát sinh trực tiếp
Phát sinh cơ quan gián tiếp Chồi mới Mô phân sinh Lóng
Chồi mới Chồi nách Lá
4
07/08/2017
2.1.1 Hình thành chồi từ mô phân sinh
Nuôi cấy chồi Hình thành chồi cành
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
- Sử dụng đỉnh sinh trưởng kích
Mẫu cấy có một số đốt/mắt trên thân
thước < 1 mm
- Sử dụng trong vi nhân giống, loại
bỏ bệnh do virut
Các chồi được kích thích mọc thành cụm chồi
Tách các cụm chồi và chuyển sang môi trường nuôi cấy khác
Nuôi cấy chồi:
- Sử dụng một phần đoạn thân có một số đốt/mắt
- Hình thức phổ biến để vi nhân giống
Nuôi cấy chồi (tiếp)
Nuôi cấy chồi (tiếp)
- Chồi mang một số đốt được đặt
nằm ngang trên bề mặt môi trường;
- Thân nhú mọc;
Nuôi cấy mắt Chồi đứng
- Cụm chồi được tách chuyển sang
môi trường nuôi cấy khác
- Đoạn thân dài được cắt thành các đoạn nhỏ có chứa mắt và đặt thẳng đứng trong môi trường - Chồi mới mọc dài và quá trình lại lặp lại.
Pseudocorms là cấu trúc hình thành khi hạt phong lan nảy mầm
Nuôi cấy chồi (tiếp) - Pseudocorms Nuôi cấy chồi (tiếp) - Minitubers
Phong lan nuôi cấy mô có thể cho rất nhiều pseudocorms.
Minitubers (củ siêu nhỏ) sản xuất các cây có củ như khoai tây, khoai sọ.
Mỗi một củ siêu nhỏ dùng để nhân giống
5
07/08/2017
2.1.2. Hình thành chồi bất định
Nuôi cấy chồi (tiếp) – Vi ghép
Tái tạo cây nhị bội Nguồn mẫu nuôi cấy: mảnh lá
- Vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép; - Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắt ghép được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, - Gốc ghép là mầm giá mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại; - Toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng
Nhánh củ
Mục đích: - Tạo cây con sạch bệnh, đặc biệt bệnh
virut;
- Nhân giống; - Trẻ hóa lại cây trồng qua một loạt vi ghép; - Trao đổi nguồn gen giữa các nước
Tái tạo cây nhị bội (tiếp)
Hình thành chồi bất định - Tái tạo cây đơn bội
Cuống lá
Nguồn vật liệu nuôi cấy:
- Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa (phương pháp này hay được áp dụng cho
những loài có hoa nhỏ).
- Noãn chưa thụ tinh.
Ứng dụng: • Vi nhân giống, đặc biệt ở cây một lá mầm • Chuyển gen
- Thụ tinh giả: là quá trình thụ phấn nhưng không xảy ra sự thụ tinh. Mặc dù vậy, tế bào trứng vẫn được kích thích phát triển thành cây đơn bội.
- Cứu phôi sau lai xa.
2.2. Hình thành cây con
Nuôi cấy hạt:
- Chủ yếu cho hạt phong lan có kích thước vô cùng nhỏ và không có chất dự trữ
- Từ nuôi cấy hạt - Nuôi cấy phôi - Cứu phôi - Nuôi cấy bầu noãn và noãn
- Trong tự nhiên, hạt phong lan thường phụ thuộc vào một loài nấm cộng sinh để nảy mầm;
- Tuy nhiên, hạt có thể nảy mầm và phát triển thành cây con trên môi trường phù hợp mà không cần có sự cộng sinh với nấm
Mô sẹo/Callus Lóng Rễ
6
07/08/2017
Nuôi cấy phôi
Cứu phôi - Phôi chưa thành thục được tách khỏi noãn;
Nuôi cấy noãn, bầu noãn
- Chủ yếu sử dụng trong cứu phôi khi tiến hành lai xa - Phôi thành thục có thể nẩy mầm dễ dàng trên môi trường nuôi cấy;
2.3. Hình thành mô sẹo
Hình thành mô sẹo - Tế bào trần
- Mô sẹo có thể hình thành từ bất cứ nguồn mẫu nuôi cấy nào;
- Sử dụng trong các lai xa có khó khăn; - Ứng dụng: cho nghiên cứu, sử dụng làm gốc ghép trong vi ghép, nhân giống - Noãn không thụ tinh được đưa vào môi trường nuôi cấy và thụ tinh nhân tạo; - Noãn thụ tinh được đưa sang môi trường mới và phát triển thành hạt
- Mô sẹo có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng và lắc để tạo dung dịch huyền phù
- Bioreactors: là hệ thống tự động để tạo mô sẹo;
- Tế bào trần được phân lập và màng tế bào được hòa tan nhờ enzyme;
- 2 tế bào trần có thể dung nạp để hình thành 1 tế bào. Nhân dung hợp và tạo thành một kiểu gen; Phương pháp sử dụng để tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt di truyền và bất hợp trong tự nhiên;
Dùng để sản xuất các loại enzyme, thuốc, màu và hương vị tự nhiên
2.4 Phát sinh phôi soma
Hạt nhân tạo
- Thành tế bào và chồi mới được tái sinh từ mô sẹo;
tái
- Hạt nhân tạo gồm phôi soma hoặc chồi được bao bọc bởi một lớp vỏ bảo vệ nhân tạo nhằm tạo điều kiện cho các phôi tạo thành cây một cách hiệu quả .
- Phôi soma hình thành từ tế bào sinh dưỡng;
Hạt nhân tạo dùng để:
- Phôi soma cũng trải qua các giai đoạn tương tự của hình thành phôi so với hạt lưỡng bội;
1. Nhân vô tính, thay thế phương pháp nhân bằng hạt.
2. Thay thế hạt lai.
- Dùng để nhân dòng vô tính, khôi phục cây chuyển gen
3. Vận chuyển các vi sinh vật có ích, thuốc trừ sâu và chất điều hòa sinh trưởng
- Tuy nhiên phôi soma không có nội nhũ, vỏ hạt và thường nhỏ hơn hoặc lá mầm bất thường
7
07/08/2017
PHẦN 3. ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ
1. Nhân nhanh cây con từ nguồn gen ưu việt = nhân vô tính/dòng hóa thông qua vi nhân giống Vd. Khoai tây, dâu tây, cẩm chướng, v.v. 2. Rút ngắn chu kỳ chọn giống: Nuôi cấy phôi. Vd Táo tây, đào, lê, cam quýt 3. Bảo quản lạnh sâu
Vi nhân giống/nhân giống sạch bênh Bảo quản nguồn gen Biến dị dòng soma & chọn lọc in vitro Cứu phôi (lai xa) Nuôi cấy noãn và bầu Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (tạo đơn bội/đơn bội Thực liệu có thể bảo quản vô hạn ở nhiệt độ rất thấp mà không can thiệp vào gen kép)
-196°C trong ni tơ lỏng hạt phấn, tế bào, DNA, mô, cơ quan, nụ, hạt,v,v. 4. Cây sạch bệnh có thể tạo ra bằng phát sinh phôi soma. Nuôi cấy callus và tế bào trần (protoplast) Dung hợp tế bào trần Tạo hạt nhân tạo Tạo chất chuyển hóa thứ cấp Có thể tạo biến dị soma bằng đột biến phôi soma
3.1. Vi nhân giống
5. Chất chuyển hóa thứ cấp có thể tách chiết qua nuôi cấy callus Vd. Shiconin, Digitoxin 6. Cây chuyển gen Tái sinh tế bào chuyển gen thành cây hoàn chỉnh 7. Tạo hạt nhân tạo
Các bước nuôi cấy mô/vi nhân giống
• Giai đoạn 0 – chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Khử trùng mô thực vật
• Giai đoạn I - khởi động nuôi cấy
Đặt mô cấy vào môi trường dinh dưỡng
• Giai đoạn II – Nhân giống
Chuyển mô cấy (callus, phôi vô tính, cụm chồi) sang môi trường nhân chồi; chia cắt chồi liên tục
• Giai đoạn III – Ra rễ
Chuyển mô cấy (chồi) sang môi trường tạo rễ
• Giai đoạn IV – Chuyển ra đất
Chuyển cây hoàn chỉnh ra đất, tôi luyện/thích nghi
Bất kỳ phần soma nào của cây có thể làm thành hạt bọc bằng vỏ hạt nhân tạo; hạt nhân tạo có khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh trong bất kỳ điều kiện nào. 8. Tạo con lai soma/tổ hợp di truyền
8
07/08/2017
Sản xuất giống khoai tây
Chương trình làm sạch bệnh vi rút cho khoai tây thương phẩm
A B
C D
Thân ngọn (A) từ đỉnh sinh trưởng không vi rút nhân in vitro (B) chuyển ra môi trường đất và trồng trong nhà lưới (C, D) để tránh vector truyền bệnh
Nhược điểm của vi nhân giống
Ưu điểm của vi nhân giống
Quy trình làm sạch vi rút của dòng KT nhiễm và sản xuất củ giống hạt nhân
Ứng dụng vi nhân giống
Cách loại bỏ virut
Hệ số nhân cao, nhanh Cần thiết bị chuyên dụng Nhân giống trong điều kiện có kiểm soát trong PTN Đồi hỏi chuyên môn kỹ thuật nhiều hơn Nhân giống liên tục quanh năm Quy trình không tối ưu cho tất cả các loài Tiềm năng tạo ra vật liệu sạch bệnh Cây tạo thành có thể không phù hợp tiêu chuẩn công nghiệp Giảm thiểu không gian cây giống gốc Đầu tư ban đầu cao
Tăng nhanh vật liệu trồng giống cây trồng mới (nhân Xử lý nhiệt nhanh) Cây sinh trưởng nhanh hơn virut ở nhiệt độ cao. Loại bỏ bệnh Sử dụng Đỉnh sinh trưởng Dòng hóa các loại cây không dễ nhân bằng phương pháp truyền thống (ít cành/hạt; chà là, ferns)
Virut được vận chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua cầu liên bào và mô mạch. Đỉnh sinh trưởng thường không có virut. Không phải tất cả tế bào trong cây đều bị nhiễm.
Chồi bất định tạo thành từ các tế bào đơn có thể cho chồi không có virut.
9
07/08/2017
3.2. Bảo tồn nguồn gen
Loại bỏ virut
Cây từ ruộng Nội vi : Bảo tồn trong môi trường sống tự nhiên – rừng, vườn, trang trại Trồng trong nhà lưới Ngoại vi :
Sinh trưởng tự nhiên Xử lý nhiệt 35oC /tháng Hình thành chồi bất định – Bảo tồn Tập đoàn trên đồng ruộng, vườn thực vật – Tập đoàn hạt – Tập đoàn In vitro: áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô ‘Cây sạch virut
Bảo tồn in vitro
Kiểm tra virut • Sinh trưởng bình thường (bảo quản ngắn hạn) • Sinh trưởng chậm (bảo quản trung hạn) • Bảo quản lạnh sâu (bảo quản dài hạn) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngân hàng DNA Nhân giống
• Mục tiêu cơ bản của hệ thống bảo quản in vitro
• Hai loại hệ thống:
Ưu điểm của bảo tồn in vitro
Bảo quản lạnh
* Tầm quan trọng của bảo tồn nguồn gen: • Bảo tồn kiểu gen quý hiếm – Duy trì sự ổn định di truyền • Bảo tồn nguồn vật liệu – Bảo quản vô hạn mà không mất sức sống * Những nhược điểm của bảo tồn truyền thống • Hạt: sức sống, sâu bệnh - Bảo quản lạnh (1-9 ˚C) - Bảo quản lạnh sâu: trong môi trường ni-tơ lỏng (-196 ˚C) • Các cây trồng sinh sản vô tính: chi phí cho không gian và nhân công
- Tiết kiệm không gian bảo quản và nhân công Bảo quản ở nhiệt độ không đóng băng,1-9 °C tùy theo loài. - Cây sạch sâu bệnh và virut Bảo quản nuôi cấy chồi (giai đoạn I hoặc II) - Môi trường bảo quản có thể được sử dụng làm môi trường nhân trong bảo tồn cây sinh sản vô tính • Tốt với dâu tây, khoai tây, nho, và nhiều loài cây trồng khác. - Vận chuyển quốc tế thuận lợi • Chuyển sang môi trường mới 6 tháng hoặc 1 năm 1 lần • Không có đất • Cây sạch bệnh
10
07/08/2017
Bảo quản lạnh sâu
Ưu điểm:
• Các loài sinh sản vô tính (rễ và củ, cay cảnh, cây ăn quả)
• Các loài có hạt khó bảo quảns (dừa, cà phê, chôm chôm)
Bảo quản mô sống ở nhiệt độ cực thấp (-196°C) Đơn giản, Tỉ lệ sống cao, Bảo quản nguồn gen TV Có ích đối với vi nhân giống (đặc biệt trong thời kì có nhu cầu thấp)
Nhược điểm
• Các dòng tế bào sản sinh thuốc và cồn
Bảo tồn mô có đặc điểm đặc biệt
• Các mô chuyển nạp di truyền
Các bước bảo quản lạnh sâu
• Có thể không thích hợp đối với các loài nhiệt đới vì TV nhiệt đới mẫn cảm với tổn thương lạnh Bảo tồn thể gây bệnh TV (nấm, tuyến trùng) • Cần có máy làm lạnh, đắt hơn bảo quản lạnh sâu
3.3 Biến dị dòng soma
Biến dị di truyền
Chọn Cắt mô hay cơ quan Nuôi cấy vật liệt nguồn Chọn nuôi cấy khỏe mạnh Phun chất bảo vệ lạnh sâu Xử lý trước sinh trưởng Làm lạnh Bảo quản Làm ấm và dã đông Phục hồi sinh trưởng Kiểm tra sức sống Sau dã đông
Biến dị hình thành trong các tế bào soma phân chia • Biến dị sẵn có/có trước trong các tế bào của mẫu cấy nguyên nhiễm trong quá trình nuôi cấy • Gây ra bởi đột biến và những thay đổi khác của DNA- sự Hiện tượng phổ biến của tất cả hệ thống tái sinh có pha sắp xếp lại của NST callus • Xảy ra với tần suất cao Biến dị ở các tính trạng được tạo ra bởi chu kỳ nuôi cấy
Biến dị không di truyền – biểu sinh
Hai loai biến dị dòng soma:
• Có thể di truyền, những thay đổi di truyền (thay đổi DNA) • Ổn định, nhưng sự thay đổi không di truyền (thay đổi sự • Biến dị tạo thành trong quá trình nuôi cấy mô biểu hiện của gen - biểu sinh) • Gây ra bởi sự thay đổi kiểu hình tạm thời • Xảy ra với tần suất thấp
11
07/08/2017
Biến dị xô ma
Phát sinh cơ quan
Nguyên nhân sinh lý
Nguyên nhân sinh hóa
Callus Nguyên nhân biến dị dòng xô ma
Nguyên nhân di truyền
Tế bào nuôi cấy tiếp xúc với chất điều tiết sinh trưởng. Điều kiện nuôi cấy
Tôi luyện và tự thụ Cây tái sinh
Nguyên nhân di truyền
Nguyên nhân sinh lý
Các bước tạo và chọn lọc biến dị dòng xô ma
Nguyên nhân sinh hóa
1 Thay đổi số NST • Tế bào nuôi cấy tiếp xúc với chất điều tiết sinh trưởng. • Điều kiện nuôi cấy • Bội nguyên: thay đổi cả bộ NST – đơn bội, đa bội • Lệch bội: thay đổi một phần của bộ NST -
Nguyên nhân di truyền
Nguyên nhân di truyền
2 Thay đổi cấu trúc NST • Mất khả năng quang hợp do thay đổi quá trình đồng hóa carbon • Sinh tổng hợp tinh bột thông qua chu trình carotenoid • Mất đoạn • Đảo đoạn • Lặp đoạn • Chuyển đoạn • Đồng hóa ni tơ • Kháng sinh.
6. Trình tự ADN 3 Đột biến gen Thay đổi trong ADN • Chuyển trạng thái (transition) Phát hiện thay đổi kích thước phân đoạn bằng enzym hạn chế • Chuyển chéo (transversion): thay đổi mạnh hơn • Chèn bazơ Thay đổi protein • Mất bazơ Mất hay thêm băng protein Thay đổi hàm lượng protein đặc trưng 4. Hoạt hóa phần tử chuyển vị trí 5. Khuyếch đại gen – làm tăng sự biểu hiện của gen Methyl hóa ADN (epigenetic)
Methyl hóa cytosin làm bất hoạt quá trình phiên mã
12
07/08/2017
Biến dị không di truyền – Biểu sinh
Phát hiện và phân lập các biến dị dòng soma
1. Phân tích các đặc điểm hình thái
• Tính trạng chất lượng: chiều cao cây, TGST, ngày ra
hoa, kích thước lá, ...
• Tính trạng số lượng: năng suất hạt, hoa, ...
2. Phát hiện biến dị bằng quan sát tế bào
• Nhuộm màu các mô phân sinh như đầu rễ, đầu lá bằng feulgen và acetocarmin để nhận biết số lượng và hình thái NST.
3. Phát hiện biến dị thông qua xác định hàm
lượng ADN
• Phát hiện nhân nhuộm màu feulgen bằng quang kế tế
bào có thể sử dụng để đo hàm lượng ADN
- mất nhu cầu đối với yếu tố sinh trưởng ngoại sinh (chất điều tiết sinh trưởng), ví dụ, auxin, cytokinin • callus mất nhu cầu chất điều tiết sinh trưởng trong quá trình cấy chuyển sang môi trường mới • Không truyền qua sinh sản hữu tính
Phát hiện và phân lập các biến dị dòng soma
4. Phát hiện biến dị bằng điện dị trên gel
7. Phát hiện biến dị chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường
• Chọn lọc các dòng tế bào chịu mặn (thuốc lá)
• Thay đổi nồng độ enzym, protein, các sản phẩm hóa học như sắc tố, alkaloid và a xít amin có thể phát hiện thông qua các mô thức điện di
• Chọn lọc các dòng tế bào chịu úng và chịu hạn (cà chua, lúa
nước)
5. Phát hiện biến dị kháng bệnh
• Chọn lọc dòng tế bào chịu nhiệt độ bất lợi (lê).
• Có thể sử dụng độc tố làm tác nhân chọn lọc trong quá trình nuôi
cấy (mía)
• Chọn lọc khả năng chịu độc khoáng, chủ yếu là độc nhôm (cao
lương)
6. Phát hiện biến dị kháng thuốc trừ cỏ
• Bổ sung thuốc trừ cỏ vào môi trường nuôi cấy làm tác nhân chọn
lọc có thể chọn lọc được cây kháng thuốc trừ cỏ.
Ưu điểm của biến dị dòng soma
Nhược điểm của biến dị dòng soma
Phát hiện và phân lập các biến dị dòng xô ma
• Hỗ trợ trong cải lương giống cây trồng • Tạo ra sự không đồng nhất trong quá trình nhân hàng loạt các kiểu gen ưu tú, như cây ăn quả, cây lâm nghiệp • Tạo ra các biến dị di truyền bổ sung • Các biến dị chọn lọc không ổn định về di truyền • Tăng, cải tiến sản xuất các chất đồng hóa thứ cấp • Đòi hỏi nhiều thí nghiệm đồng ruộng • Chọn cây kháng với nhiều độc tố khác nhau, thuốc trừ cỏ, độ mặn cao, độc khoáng chất • Không thích hợp cho các tính trạng nông học phức tạp như năng suất, chất lượng, ... • Thích hợp cho các loài cây vô tính, thân gỗ • Có thể hình thành các biến dị với tính đa hiệu.
13
07/08/2017
Yêu cầu đối với chọn dòng soma
Quy trình chọn dòng soma
• Quy trình chọn lọc hiệu quả
• Hướng vào các tế bào đơn trong nuôi cấy đa bào
• Sử dụng nuôi cấy làm vật liệu khởi đầu
• thường nuôi cấy dung dịch huyền phù, nhưng có thể sử dụng nuôi
• Ruồi hại quả, tỉ lệ là ~800:1 có hại : có lợi
cấy callus (càng tiếp xúc nhiều với tác nhân chọn lọc càng tốt)
• Phần lớn đột biến có hại
• Phương án lựa chọn: sử dụng tác nhân đột biến lý, hóa học
• Phải sang lọc thế hệ M2 hoặc các thế hệ sau
• Mục tiêu (tỉ lệ chết cao)
• Ước lượng: ~10,000 cây để có một đột biến có lợi
• Tạo ra liều lượng sàng lọc (liều lượng gây chết phụ thuộc vào số
tế bào sống sót mong đợi
• Mục tiêu rõ ràng
• Phần lớn đột biện là lặn • Áp dụng áp lực chọn lọc cho nuôi cấy • Cần quần thể lớn để xác định đột biến có lợi:
- Phát sinh cơ quan hay phát sinh phôi
3.4 Nuôi cấy phôi/cứu phôi
• Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào sống sót
Embryo Culture of Citrus
• Cứu phôi con lai xa (khác loài/chi)
• Con lai xa thường chết phôi sớm
• Nguyên nhân: mất cân bằng phôi-nội nhũ
Bông, cây thập tự, Lily, Lanh
• Tạo ra đơn bội
• Có ích để thu nhận đơn bội ở đại mạch, lúa mì, và các cây khác
• Hệ thống đại mạch sử dụng làm bố cho phấn
Phương pháp Bulbosum
Nuôi cấy phôi dừa
Hordeum vulgare Đại mạch 2n = 2X = 14 Hordeum bulbosum Hoang dai họ hàng 2n = 2X = 14
X ↓ Cứu phôi
• Phương pháp này hiệu quả hơn phương pháp nuôi cấy tiểu bào tử
trong tạo ra đại mạch đơn bội.
• Ngày nay, với các môi trường nuôi cấy cải tiến (sucrose thay thế bằng maltose), nuôi cấy tiểu bào tử hiệu quả hơn nhiều (~2000 cây trên 100 bao phấn)
Đại mạch đơn bội 2n = X = 7 NST của H. bulbosum bị đào thải
14
07/08/2017
Kỹ thuật Bulbosum
Tách phôi non:
Hordeum vulgare là mẹ “lai xa” giữa lúa mì và mì đen đòi hỏi phải cứu phôi và xử lý hóa chất để nhân đôi số nhiễm sắc thể. Hợp tử phát triển thành phôi với sự đào thải các nhiễm sắc thể của Hordeum bulbosum Có thể, chỉ còn lại nhiễm sắc thể của H. vulgare Phôi được “cứu“ để tránh chết non
Triticale
Tạo cây đơn bội
Nuôi cấy hạt phấn
Thụ phấn bằng tay hoa mới nở Khử trùng bề mặt – EtOH trên cấu trúc mở Mổ cắt dưới kính hiển vi là cần thiết Đặt trên môi trường đặc – thường sử dụng môi trường nghiêng để tránh ngưng tụ
Khởi động từ nhị và nhụy
Đa bội hóa
Cứu phôi của con lai/tổ hợp lai xa • Tạo ra thể đơn bội Nuôi cấy bao phấn/Nuôi cấy tiểu bào tử • Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn (tiểu bào tử) • Tạo ra cây thành thục từ một tiểu bào tử Nuôi cấy noãn • Nuôi cấy noãn không thụ tinh (đại bào tử)
Mô cấy nhị Hình thành callus từ Mô kết nối Hình thành Callus từ đầu chỉ nhị
Callus phát sinh phôi Phôi phát triển Phôi nảy mầm
15
07/08/2017
Kỹ thuật lai soma
3.5. Lai soma (dung hợp tế bào trần)
1. Phân lập TBT Phát triển cây lai thông qua dung hợp tế bào trần soma của hai loài/giống khác nhau
2. Dung hợp TBT của hai loài/giống mong muốn
3. Xác định & chọn lọc tế bào lai
4. Nuôi cất TB lai
Phương pháp cơ giới
5. Tái sinh cây lai soma
Phân lập tế bào trần (Tách tế bào trần từ mô thực vật)
TB con nguyên sinh Mô TV
Quan sát TB dưới kính hiển vi 2. Phương pháp enzym 1. Phương pháp cơ giới
Giải phóng nguyên sinh Cắt thành TB bằng dao
Phương pháp enzym
Phương pháp cơ giới
Thu tế bào trần
Tế bào con nguyên sinh
Tế bào con nguyên sinh
Khử trùng lá, loại bỏ biểu bì Được sử dụng đối với tế bào có không bào như vảy củ hành, củ cải
Pectinase +cellulase
Pectinase
Giải phóng chất nguyên sinh
Giải phóng chất nguyên sinh
Giải phóng tế bào phân lập
cellulase
Tế bào trần phân lập
Năng suất tế bào trần thấp Tốn công Khả năng sống của tế bào trần thấp
16
07/08/2017
Phương pháp Enzym
Dung hợp tế bào trần (Dung hợp TBT của hai hệ gen khác nhau)
Được sử dụng đối với nhiều loại mô và cơ quan gồm lá, cuống lá, quả, rễ, bao mầm, thân mầm, thân, đỉnh chồi, v.v. Mô thịt lá – nguồn thích hợp nhất năng suất tế bào trần cao dễ thực hiện sức sống tế bào trần cao hơn
Trong loài
Giữa các loài
Dung hợp điện
Dung hợp hóa học
Dung hợp cơ học
Dung hợp tự phát
1. Dung hợp tự phát 2. Dung hợp cảm ứng
Những ứng dụng của dung hợp tế bào trần
- Tế bào trần dung hợp tự phát trong quá trình phân lập do tiếp xúc về lý học: • Trong loài tạo ra thể đồng nhân • Giữa các chi không có ý nghĩa
Dung hợp cảm ứng - Dung hợp hóa học: Dung hợp cảm ứng bởi hóa chất. Các loại tác nhân dung hợp:
• Một con đường để tạo đa bội thể khác nguồn
Kết hợp hai bộ gen đầy đủ
• Trao đổi một hay một số tính trạng giữa các loài
• Có thể cần hoặc không cần chiếu xạ ion hóa
Thụ tinh in vitro Chuyển một phần hệ gen Polyethylene Glycol (PEG) NaNo3 Ca 2+ Polyvinyl alcohol
• Vi tiêm, xung điện, Agrobacterium
• Duy nhất đối với dung hợp TBT
• Chuyển ti thể và/hoặc sắc lạp thể giữa các loài
- Dung hơp cơ học: Dung hợp của tế bào trần dưới kính hiển vi bằng vi thao tác và tiểu pippete (perfusion micropipette) Kỹ thuật di truyền - Dung hợp điện: Cảm ứng dung hợp bằng kích thích điện. Chuyển các cơ quan tử Dung hợp tế bào trần được cảm ứng nhờ áp dụng từ trường điện cao (100kv m-1) trong micro giây
17
07/08/2017
Xác định dung hợp mong muốn
Kết quả có thể của dung hợp hai tế bào trần khác nhau về di truyền
• Chọn lọc kiểu bổ sung
• Có thể thực hiện nếu mỗi bố mẹ có chỉ thị có thể chọn lọc khác nhau (vd. Kháng kháng sinh hay thuốc trừ cỏ), sản phẩm dung hợp có cả hai chỉ thị
• Trước tiên đánh dấu tế bào bằng chị thị huỳnh quang; sản phẩm dung
hợp có hai chỉ thị
• Tốn công nhưng thực hiện được nếu bắt đầu bằng các lọai tế bào
khác nhau
= Sắc lạp thể • Máy phân loại/lọc hoạt hóa bằng huỳnh quang = Ti thể Dung hợp = nhân Thể dị nhân • Phân lập cơ giới
• Về cơ bản, không chọn lọc; tái sinh tất cả và sau đó sàng lọc các tính
trạng mong muốn
• Nuôi cấy hỗn hợp
Ưu điểm của lai soma
cybrid hybrid cybrid hybrid
• Pomato (con lai cà chua và khoai tây)
DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ TBT ĐIỂN HÌNH + TBT LÁ, DUNG HỢP BẰNG PEG • Tạo ra con lai khác loài và khác chi mới
CÂY LAI SOMA MỚI
• Tạo ra thể lưỡng bội và đa bội hữu dục từ thể đơn bội, tam bội và lệch bội bất dục • Chuyển gen kháng bệnh, kháng các điều kiện bất lợi, kháng thuốc trừ cỏ và nhiều tính trạng chất lượng khác • Tạo ra các dòng dị hợp tử trong một loài không thể nhân giống bằng phương tiện vô tính • Nghiên cứu số phận của các gen tế bào chất • Tạo ra con lai độc nhất của nhân và tế bào chất
18
07/08/2017
3.6. Thụ tinh in vitro
Một quy trình sử dụng trứng và tinh trùng và đặt chúng cùng nhau trong đĩa để thụ tinh
Sử dụng các tế bào trứng và tinh trùng đơn và dung
hợp chúng bằng điện
Sản phẩm dung hợp được nuôi cấy riêng trong 'Millicell' lồng vào một lớp tế bào nuôi dưỡng
Phôi tạo thành được nuôi cấy để tạo ra cây mới hữu
dụcs
