07/08/2017
Chỉ thị phân tử
1. KHÁI NIỆM CHỈ THỊ PHÂN TỬ 2. CÁC LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ
TS. Vũ Thúy Hằng
1. Khái niệm
Chỉ thị di truyền DNA là gì?
Chỉ thị là một dấu hiệu cho một kiểu hình hay kiểu gen và di truyền dễ dàng từ thế hệ này sang thế hệ khác; Chỉ thị di truyền phân tử là một gen hay đoạn ADN bất kì được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu hình giữa các cá thể hay loài Các loại chỉ thị: Là biến động (hình thành do đột biến hay thay đổi ở các locut trong genom) - Chỉ thị hình thái: biến động về hình thái có thể đánh giá trên từng cá thể. VD: màu hoa, thời gian sinh trưởng..
Chỉ thị đồng trội
Chỉ thị di truyền có thể là trình tự ADN ngắn, như trình tự chỉ thay đổi một cặp ba zơ (SNP), hay trình tự dài như minisatellites. - Chỉ thị sinh hóa: biến động trong kích cỡ hoặc điện tích của protein, hoặc trong thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất (vd: đường…) Chỉ thị di truyền = chỉ thị phân tử = chỉ thị ADN + Chỉ thị DNA: biến động trong trình tự DNA
Gel configuration
P 1
P 2
O 1
O 2
Đa hình -P1 : 1 vạch (band) -P2 : một vạch (đoạn có kích thước nhỏ hơn) -Con cái 1 : dị hợp tử = có cả 2 vạch của P1, P2 -Con cái 2 : đồng hợp tử với P1
Chỉ thị trội
Đa hình
-P1 : 1 vạch
-P2 : không có vạch
Gel configuration P 1 P 2
O 2
O 1
-Con cái 1 : đồng hợp tử với P1
-Con cái 2: không biết: ????
Một chỉ thị phân tử DNA lý tưởng có các tính chất sau: - Đa hình cao: xảy ra đồng thời cho một tính trạng trong cùng một hoặc 2 quần thể - Di truyền đồng trội: chỉ thị giúp phân biệt đồng hợp tử và dị hợp tử; - Xuất hiện thường xuyên trong genome của loài - Phản ứng trung tính: trình tự DNA trung tính với điều kiện môi trường và biện pháp canh tác; - Tiếp cận dễ dàng, có sẵn; - Sử dụng nhanh và dễ; - Có khả năng lặp lại cao - Dễ trao đổi số liệu với các phòng nghiên cứu
1
07/08/2017
Chỉ thị phân tử dựa trên phương pháp lai
2. Các loại chỉ thị phân tử DNA
Chỉ thị RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa
hình độ dài các đoạn DNA):
- Xác định sự khác nhau ở độ dài các đoạn DNA
- Yêu cầu DNA tinh sạch
- Thực hiện trên DNA tổng số của nhân
Các bước:
Có rất nhiều loại chỉ thị phân tử, các chỉ thị được phân nhóm dựa trên:
- Cắt phân tử DNA với 1 hoặc một số enzyme cắt
- Tách các đoạn cắt trên gel agarose
- Chuyển các đoạn cắt DNA từ agarose sang hệ thống lọc bằng
Sothern blotting (DNA ở dạng mạch đơn)
- Phát hiện các đoạn DNA bằng lai acid nucleotit với chỉ thị thăm dò
được đánh dấu phóng xạ;
- Soi autodiography để xác định
- Hình thức di truyền: di truyền nhân, di truyền tế bào chất, di truyền nhân theo mẹ, di truyền tế bào chất từ mẹ, di truyền tế bào chất theo cả 2 bố mẹ; - Hình thức hoạt động của gen: chỉ thị trội, đồng trội; - Phương pháp phân tích: dựa trên lai, chỉ thị dựa trên PCR
Ưu và nhược điểm của RFLP
• Ưu điểm
• Nhược điểm
Các bước trong RFLP
Chỉ thị phân tử dựa vào PCR
Một số chỉ thị dựa trên PCR
– Có thể lặp lại – Đồng trội – Đơn giản – Tốn thời gian – Đắt – Sử dụng đánh dấu phóng xạ
Có nhiều phương pháp, các phương pháp này khác nhau dựa trên kĩ thuật PCR sử dụng các mồi để khuyếch đại: RAPD (random amplified polymorphic DNA) Mồi PCR bất kì được thiết kế không dựa trên thông tin về trình tự AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Mồi PCR được thiết kế để khuếch đại đoạn DNA đã Microsatellites (SSR) biết trình tự Trình tự gen (SNPs) Các bước gồm: - Chọn mồi (primers) - Thực hiện phản ứng PCR - Chạy điện di và xác định các vạch ứng với sự có mặt của sản phẩm PCR (score vạch)
2
07/08/2017
Ưu, nhược điểm của RAPD
RAPD (William et al., 1990)
RAPD là chỉ thị dựa trên trình tự ngẫu nhiên được khuếch đại thông qua sử dụng các mồi ngẫu nhiên Ưu điểm: Khuếch đại bất cứ đoạn DNA nào dùng mồi ngẫu nhiên Nhanh và là phương pháp dễ sử dụng
Nhược điểm: Chỉ thị trội Tính lặp lại kém
Chỉ thị AFLP (Đa hình độ dài các đoạn được nhân lên)
Name
Sequence
Trình tự of 10-mer RAPD primers
Đa hình của RAPD Polymorphisms giữa các mẫu giống lúa miến bản địa
OP A08 OP A15 M OP A 17 OP A19 OP D02
5’ –GTGACGTAGG- 3’ 5’ –TTCCGAACCC- 3’ 5’ –GACCGCTTGT- 3’ 5’ –CAAACGTCGG- 3’ 5’ –GGACCCAACC- 3’
This image cannot currently be display ed.
Nguyên lý Cắt DNA bằng 2 enzyme giới hạn khác nhau Bổ sung các adaptor đặc hiệu vào DNA đã cắt tạo nên RAPD gel configuration các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước Khuếch đại đoạn DNA đã được cắt bằng PCR. Mồi của
phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide; Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự chọn lọc mới được khuếch đại Sản phẩm PCR được chạy trên gel acrylamide
3
07/08/2017
Các loại enzyme cắt giới hạn
Loại I - Những enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu. Vị trí cắt của các enzyme loại này nằm ngoài trình tự nhận biết một khoảng cách không nhất định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide.
- Do không có tính đặc hiệu trong cắt đoạn nên sản phẩm của nó không đồng
nhất và không phát hiện được bằng điện di trên gel.
Loại II
- Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. - Do có tính đặc hiệu về cắt đoạn DNA nên sản phẩm thủy phân là tập hợp những đoạn DNA đặc hiệu và cho phép phát hiện bằng điện di trên gel agarose. - Ngày nay có trên 1.000 RE loại II đã được tách ra từ các tế bào procaryote khác nhau và có hơn 70 loại đang được thương mại hóa trên thị trường.
Loại III - Bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu thì cắt
ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo ra một số đầu cắt khác nhau.
- Tuy rằng vị trí điểm cắt rất gần trình tự nhận biết nhưng khó đoán trước được các điểm cắt đó. Vì vậy mà RE loại III cũng như RE loại I không được sử dụng rộng rãi trong công nghệ di truyền.
Một số kiểu cắt của RE loại II
Cắt đầu dính (đầu lệch): RE cắt tạo ra hai đầu lệch nhau một vài bazơ. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại.
Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo ra những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền.
SSR (Simple sequence repeat)
Chỉ thị AFLP
Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại.
Primer (AC)7
Sequence ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)8
ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)10
ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
(AC)12
ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
Là đoạn DNA có chứa trình tự lặp lại nhiều lần liên tục trong genome Yêu cầu kỹ thuật Có độ tin cậy và ổn định Giá thành vừa phải Cần sử dụng các kits khác nhau cho từng kích thước genome phân tích
4
07/08/2017
Đa hình SSR
AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG P1
AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG P2
DNA sequencing
SNPs (Đa hình nucleotide) Là chị thị phân tử mà sự đa hình có thể được xác định bằng sự khác nhau ở từng nucleotide
SNPs trên DNA strand
Lai sử dụng huỳnh quang
P1 P2 Điện di trên gel
Bất kì hai đoạn DNA nào khác nhau bởi 1 cặp nucleotide trong mỗi 1000 cặp thì được coi như SNPs.
Nhiều SNPs không ảnh hưởng đến chức năng của tế bào nên có thể sử dụng làm chỉ thị
Sequencer
Đặc điểm của các chỉ thị di truyền
Đặc điểm
RFLP
RAPD
SSR
Chỉ thị hình thái
Chỉ thị protein
Số locut
Giới hạn
Giới hạn
Nhiều
Không giới hạn
Hầu như không giới hạn
Di truyền
Trội
Đồng trội
Đồng trội
Trội
Đồng trội
Ưu điểm
Quan sát thấy
Dễ phát hiện
Nhanh với nhiều chỉ thị
Sử dụng trước khi có kĩ thuật mới khác
Phân bố trên genome, đa hình cao
Đầu tư cao
Đắt
Có thể cho tế bào đặc hiệu
Yêu cầu phóng xạ, đắt
Nhược điểm Có thể liên kết gen với tính trạng không mong muốn
Sequencing gel Sequencing graph
