Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 4

07/08/2017

Chỉ thị phân tử

TS. Vũ Thúy Hằng

1. KHÁI NIỆM CHỈ THỊ PHÂN TỬ

2. CÁC LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ

1. Khái niệm

Chỉ thị là một dấu hiệu cho một kiểu hình hay kiểu gen và

di truyền dễ dàng từ thế hệ này sang thế hệ khác;

Các loại chỉ thị:

- Chỉ thị hình thái: biến động về hình thái có thể đánh giá

trên từng cá thể. VD: màu hoa, thời gian sinh trưởng..

- Chỉ thị sinh hóa: biến động trong kích cỡ hoặc điện tích

của protein, hoặc trong thành phần hóa học sản phẩm trao

đổi chất (vd: đường…)

+ Chỉ thị DNA: biến động trong trình tự DNA

Chỉ thị di truyền DNA là gì?

Chỉ thị di truyền phân tử là một gen hay đoạn ADN bất

kì được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu

hình giữa các cá thể hay loài

Là biến động (hình thành do đột biến hay thay đổi ở các

locut trong genom)

Chỉ thị di truyền có thể là trình tự ADN ngắn, như trình

tự chỉ thay đổi một cặp ba zơ (SNP), hay trình tự dài

như minisatellites.

Chỉ thị di truyền = chỉ thị phân tử = chỉ thị ADN

Một chỉ thị phân tử DNA lý tưởng có các tính chất sau:

-Đa hình cao: xảy ra đồng thời cho một tính trạng trong

cùng một hoặc 2 quần thể

-Di truyền đồng trội: chỉ thị giúp phân biệt đồng hợp tử và

dị hợp tử;

-Xuất hiện thường xuyên trong genome của loài

-Phản ứng trung tính: trình tự DNA trung tính với điều kiện

môi trường và biện pháp canh tác;

-Tiếp cận dễ dàng, có sẵn;

-Sử dụng nhanh và dễ;

-Có khả năng lặp lại cao

-Dễ trao đổi số liệu với các phòng nghiên cứu

Đa hình

-P1 : 1 vạch (band)

-P2 : một vạch (đoạn có kích thước nhỏ hơn)

-Con cái 1 : dị hợp tử = có cả 2 vạch của P1, P2

-Con cái 2 : đồng hợp tử với P1

Đa hình

-P1 : 1 vạch

-P2 : không có vạch

-Con cái 1 : đồng hợp tử với P1

-Con cái 2: không biết: ????

P 2

P 1O 2

O 1

Gel configuration

Chỉthịđồng trội

P 2

Gel configuration

P 1O 1O 2

Chỉthịtrội

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

2. Các loại chỉ thị phân tử DNA

Có rất nhiều loại chỉ thị phân tử, các chỉ thị được phân

nhóm dựa trên:

- Hình thức di truyền: di truyền nhân, di truyền tế bào chất,

di truyền nhân theo mẹ, di truyền tế bào chất từ mẹ, di

truyền tế bào chất theo cả 2 bố mẹ;

- Hình thức hoạt động của gen: chỉ thị trội, đồng trội;

- Phương pháp phân tích: dựa trên lai, chỉ thị dựa trên PCR

Chỉ thị phân tử dựa trên phương pháp lai

Chỉ thị RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa

hình độ dài các đoạn DNA):

-Xác định sự khác nhau ở độ dài các đoạn DNA

-Yêu cầu DNA tinh sạch

-Thực hiện trên DNA tổng số của nhân

Các bước:

-Cắt phân tử DNA với 1 hoặc một số enzyme cắt

-Tách các đoạn cắt trên gel agarose

-Chuyển các đoạn cắt DNA từ agarose sang hệ thống lọc bằng

Sothern blotting (DNA ở dạng mạch đơn)

-Phát hiện các đoạn DNA bằng lai acid nucleotit với chỉ thị thăm dò

được đánh dấu phóng xạ;

-Soi autodiography để xác định

Các bước trong RFLP Ưu và nhược điểm của RFLP

• Ưu điểm

– Có thể lặp lại

– Đồng trội

– Đơn giản

• Nhược điểm

– Tốn thời gian

– Đắt

– Sử dụng đánh dấu

phóng xạ

Chỉ thị phân tử dựa vào PCR

Có nhiều phương pháp, các phương pháp này khác nhau

dựa trên kĩ thuật PCR sử dụng các mồi để khuyếch đại:

Mồi PCR bất kì được thiết kế không dựa trên thông tin

về trình tự

Mồi PCR được thiết kế để khuếch đại đoạn DNA đã

biết trình tự

Các bước gồm:

-Chọn mồi (primers)

-Thực hiện phản ứng PCR

-Chạy điện di và xác định các vạch ứng với sự có mặt

của sản phẩm PCR (score vạch)

Một số chỉ thị dựa trên PCR

RAPD (random amplified polymorphic DNA)

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Microsatellites (SSR)

Trình tự gen (SNPs)

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

RAPD (William et al., 1990)

RAPD là chỉ thị dựa trên trình tự ngẫu nhiên được khuếch

đại thông qua sử dụng các mồi ngẫu nhiên

Ưu, nhược điểm của RAPD

Nhược điểm:

Chỉ thị trội

Tính lặp lại kém

Ưu điểm:

Khuếch đại bất cứ đoạn DNA nào dùng mồi ngẫu nhiên

Nhanh và là phương pháp dễ sử dụng

Đa hình của RAPD Polymorphisms giữa các mẫu giống lúa

miến bản địa

Trình tự of 10-mer

RAPD primers

Name Sequence

OP A08 5’ –GTGACGTAGG- 3’

OP A15 5’ –TTCCGAACCC- 3’

OP A 17 5’ –GACCGCTTGT- 3’

OP A19 5’ –CAAACGTCGG- 3’

OP D02 5’ –GGACCCAACC- 3’

This image cannot currently b e displayed.

RAPD gel configuration

Chỉ thị AFLP

(Đa hình độ dài các đoạn được nhân lên)

Nguyên lý

Cắt DNA bằng 2 enzyme giới hạn khác nhau

Bổ sung các adaptor đặc hiệu vào DNA đã cắt tạo nên

các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn

Khuếch đại đoạn DNA đã được cắt bằng PCR. Mồi của

phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và

chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide;

Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor

và trình tự chọn lọc mới được khuếch đại

Sản phẩm PCR được chạy trên gel acrylamide

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

Các loại enzyme cắt giới hạn

Loại I

- Những enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu. Vị trí cắt của

các enzyme loại này nằm ngoài trình tự nhận biết một khoảng cách không

nhất định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide.

- Do không có tính đặc hiệu trong cắt đoạn nên sản phẩm của nó không đồng

nhất và không phát hiện được bằng điện di trên gel.

Loại II

- Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi

nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết.

- Do có tính đặc hiệu về cắt đoạn DNA nên sản phẩm thủy phân là tập hợp

những đoạn DNA đặc hiệu và cho phép phát hiện bằng điện di trên gel

agarose.

- Ngày nay có trên 1.000 RE loại II đã được tách ra từ các tế bào procaryote

khác nhau và có hơn 70 loại đang được thương mại hóa trên thị trường.

Loại III

- Bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu thì cắt

ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo ra một số đầu cắt khác nhau.

- Tuy rằng vị trí điểm cắt rất gần trình tự nhận biết nhưng khó đoán trước được

các điểm cắt đó. Vì vậy mà RE loại III cũng như RE loại I không được sử

dụng rộng rãi trong công nghệ di truyền.

Một số kiểu cắt của RE loại II

Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA

ngay chính giữa, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau

khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại.

Cắt đầu dính (đầu lệch): RE cắt tạo ra hai đầu lệch nhau một vài

bazơ. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp

trở lại.

Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng có chứa trình tự nhận

biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung

giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo ra

những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một

phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền.

Chỉ thị AFLP

Yêu cầu kỹ thuật

Có độ tin cậy và ổn định

Giá thành vừa phải

Cần sử dụng các kits khác nhau cho từng kích thước

genome phân tích

SSR (Simple sequence repeat)

Là đoạn DNA có chứa trình tự lặp lại nhiều lần liên tục

trong genome

Sequence Primer

ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT (AC)7

TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA

ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT (AC)8

TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA

ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC)10

TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA

ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC)12

TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

07/08/2017

AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG

AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG

P1P2

Đa hình SSR

Điện di trên gel

SNPs (Đa hình nucleotide)

Bất kì hai đoạn DNA nào khác nhau bởi 1 cặp nucleotide trong mỗi

1000 cặp thì được coi như SNPs.

Nhiều SNPs không ảnh hưởng đến chức năng của tế bào nên có thể

sử dụng làm chỉ thị

Lai sử dụng huỳnh quang

SNPs trên DNA strand

Là chị thị phân tử mà sự đa hình có thể được xác định bằng

sự khác nhau ở từng nucleotide

DNA sequencing

Sequencing gel

Sequencer

Sequencing graph

Đặc điểm của các chỉ thị di truyền

Đặc điểm Chỉ thị hình

thái

Chỉ thị

protein

RFLP RAPD SSR

Số locut Giới hạn Giới hạn Hầu như

không giới

hạn

Không giới

hạn

Nhiều

Di truyền Trội Đồng trội Đồng trội Trội Đồng trội

Ưu điểm Quan sát

thấy

Dễ phát

hiện

Sử dụng

trước khi có

kĩ thuật mới

khác

Nhanh với

nhiều chỉ thị

Phân bố

trên

genome,

đa hình

cao

Nhược điểm Có thể liên

kết gen với

tính trạng

không mong

muốn

Có thể cho

tế bào đặc

hiệu

Yêu cầu

phóng xạ,

đắt

Đầu tư cao Đắt

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

Hết chương IV

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 4 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi