Bài giảng Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein

Coâng cuï vaø kyõ thuaät khaùm phaù theá giôùi Protein

Thaønh Phoá Hoà Chí Minh 5/2004

Giôùi thieäu veà Proteomics

Thuaät ngöõ Proteome: caùc phaàn protein chuyeân bieät veà thôøi gian vaø veà maët teá baøo ñöôïc bieåu hieän töø Genome.

Boä gen: khaù oån ñònh, ñoàng nhaát trong teá baøo cuûa moät sinh vaät vaø khoâng coù nhieàu thay ñoåi trong loaøi.

Protein laïi bieán ñoäng theo thôøi gian vaø deã daøng phaûn öùng vôùi caùc yeáu toá beân ngoaøi, vaø ñaëc bieät laø khaùc nhau raát nhieàu veà caên baûn giöõa caùc loaïi teá baøo khaùc nhau.

Giôùi thieäu veà Proteomics

Proteomics laø quaù trình nghieân cöùu toaøn boä protein hay caùc phaàn protein boå sung hình thaønh töø moät moâ hay moät doøng teá baøo.

Ngaøy nay, proteomics coù theå ñöôïc chia thaønh proteomics kinh ñieån (Classical) vaø Proteomics chöùc naêng.

Classical proteomics taäp trung nghieân cöùu vaøo toaøn boä heä protein töø hai doøng teá baøo ñöôïc xöû lyù khaùc nhau, trong khi ñoù Proteomics chöùc naêng nghieân cöùu vaøo moät nhoùm protein giôùi haïn hôn.

Coù ba vaán ñeà chính ñöôïc ñaët ra cho Proteomics: 1) Caùc loaïi protein naøo hieän dieän? 2) Moät protein ñaëc tröng coù töông taùc gì vôùi caùc protein khaùc? 3) Protein ñaëc tröng ñoù nhö theá naøo (veà maët caáu truùc)?

Giôùi thieäu veà Proteomics

Thuaät ngöõ Proteomics bao haøm moät söï nghieân cöùu roäng nhaèm muïc ñích tìm hieåu vaø giaùm saùt hoaït ñoäng chöùc naêng cuûa caùc protein.

Proteomics bao goàm caùc coâng vieäc töông töï tìm trình töï di truyeàn baèng caáu truùc khoâng gian ba chieàu cuûa protein vaø trong chöùc naêng protein, phaùt trieâûn caùc kyõ thuaät taùch chieát protein vaø laäp hoà sô protein, nghieân cöùu caùc töông taùc giöõa protein vôùi protein.

Proteomics höùa heïn khaùm phaù ra nhöõng muïc tieâu môùi cho nghieân cöùu döôïc phaåm thoâng qua vieäc nghieân cöùu chöùc naêng cuûa haøng ngaøn protein chöa xaùc ñònh maø ngöôøi ta mong muoán seõ ñöôïc phaùt hieän trong nghieân cöùu boä gen ngöôøi.

Proteomics cung caáp döõ lieäu nghieân cöùu ñeå caûi thieän caùc chöông ttrình phaàn meàm maùy tính nhaèm döï ñoaùn caáu truùc protein töø caùc trình töï DNA; Noù cho pheùp chuùng ta coù theå giaûi thích thoâng tin coù chöùa trong toaøn boä gen.

Proteomes

Nghieân cöùu caùc protein ñöôïc bieåu hieän töø Gene

Phaân tích Protein moät caùch heä thoáng vaø ñoàng boä

Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu kyø dieäu???

Teá baøo

mRNA

proteins

DNA (genes)

Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu kyø dieäu???

Nhöng, chæ coù 30,000 gene trong boä gene ngöôøi, maø coù tôùi hôn 100,000 protein trong heä Proteome ngöôøi.

Genomics ñaõ cung caáp moät löôïng raát lôùn döõ lieäu, nhöng haàu heát chuùng ta vaãn chöa giaûi thích ñöôïc cho ñeán nay.

Trong moät soá tröôøng hôïp, Genomics cho chuùng ta nhieàu caâu hoûi hôn laø caâu traû lôøi.

Caùc vaán ñeà naûy sinh cuûa proteomics höùa heïn traû lôøi cho moät soá caâu hoûi ñoù baèng vieäc nghieân cöùu coù heä thoáng taát caû caùc protein ñöôïc maõ hoùa bôûi boä gene.

CAÙC PHÖÔNG PHAÙP TRONG PROTEOMICS

Ñieän di hai chieàu - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) laø coâng cuï thí nghieäm truyeàn thoáng ñaùng tin caäy nhaát trong phaân taùch haøng ngaøn protein treân cuøng moät baûn gel.

Xaùc ñònh Protein baèng khoái phoå (mass spectrometry) laø coâng cuï toát nhaát hieän nay trong phaân tích protein vaø laø moät trong nhöõng kyõ thuaät chuû yeáu trong caùc laõnh vöïc nghieân cöùu protein.

Protein microarrays cung caáp moät quaù trình phaân tích ñònh löôïng moät löôïng lôùn caùc töông taùc giöõa caùc phaân töû. Nhieàu thí nghieäm söû duïng Microarray thöôøng thöïc hieän chung vôùi khoái phoå.

Caùc phöông phaùp khaùc: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

• Keát hôïp giöõa isoelectic focusing (IEF) vaø SDS-PAGE – cho keát quaû coù ñoä phaân giaûi cao hôn raát nhieàu so vôùi töøng phöông phaùp rieâng bieät .

• IEF- phaân taùch protein döïa treân ñieän tích

hay ñeåm ñaúng ñieän (isoelectric points);

• SDS-PAGE – Phaân taùch protein theo kích

thöôùc (size).

2-D PAGE for Protein Separations

IPG

SDS-PAGE

Sample Prep

2-D Array

2-D array

Phaân ñoaïn/ Hoøa tan

Cô quan / moâ / Teá baøo

Stain / blot Nhuoäm hay chuyeån leân maøng lai

Öùng duïng ñieän di hai chieàu trong nghieân cöùu Proteomics

1) Phaùc thaûo neân moät phöông phaùp ñeå khaùm

phaù proteomics.

2) Xaùc ñònh caùc phöông phaùp ñeå toái öu hoùa caùc

keát quaû ñieän di hai chieàu.

3) Ñöa ra caùc choïn löïa cho vieäc chuaån bò maãu

ñeå phaân tích caùc heä thoáng phöùc taïp.

4) Cho pheùp phaân tích caùc bieåu hieän phaân bieät

trong Proteomics.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

Böôùc ñaàu tieân trong phaân tích 2-DE analysis laø quaù trình chuaån bò maãu; proteins coù trong teá baøo hay moâ caàn nghieân cöùu phaûi ñöôïc hoøa tan vaø taát caû DNA vaø caùc chaát taïp nhieãm phaûi ñöôïc loaïi ra khoûi dung dòch.

Caùc phöông phaùp chuaån bò maãu tuøy thuoäc vaøo muïc ñích cuûa nghieân cöùu vaø ñaây chính laø chìa khoaù ñeå caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän thaønh coâng.

Caùc yeáu toá nhö ñoä hoøa tan, kích thöôùc, ñieän tích vaø ñieåm ñaúng ñieän (pI) cuûa protein phaûi ñöôïc tính ñeán trong quaù trình chuaån bò maãu.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

Ñieän di chieàu thöù hai: quaù trình ñieän di SDS-PAGE thoâng thöôøng, caùc strip IPG ñöôïc duøng nhö laø maãu ñieän di. Vieäc choïn löïa gel söû duïng cho ñieän di chieàu thöù hai tuøy thuoäc vaøo troïng löôïng phaân töû (MW) caàn taùch.

Ñeå coù theå phaân tích löôïng lôùn protein, coù theå chaïy nhieàu gel cuøng luùc.

Caùc thang protein chuaån ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh troïng löôïng phaân töû cuûa protein caàn phaân tích.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng

Quaù trình chuaån bò maãu hieäu quaû seõ: 1. Hoøa tan taát caû protein coù trong maãu 2. Ngaên caûn söï tích tuï vaø giaûm tính tan trong khi ñieän di 3. Ngaên caûn vieäc giaûm hoaït tính veà maët hoùa hoïc hay

enzyme cuûa protein maãu.

4. Loaïi boû hoaëc tieâu huûy hoaøn toaøn caùc acid nucleic hay

caùc phaân töû gaây aûnh höôûng khaùc.

5. Hieäu suaát thu hoài caùc protein mong muoán ôû möùc phaùt

hieän ñöôïc.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng

Haàu heát caùc protein ñeàu caàn thieát moät soá thí nghieäm ñeå xaùc ñònh caùc ñieàu kieän toái öu cho ñieän di 2 chieàu. Söï khaùc nhau veà noàng ñoä caùc chaát söû duïng coù theå aûnh höôûng ñeán keát quaû phaân tích. Urea vaø thiourea ñöôïc duøng ñeå giuùp hoaø tan protein, Urea thöôøng ñöôïc söû duïng ôû noàng ñoä 8M. Caùc chaát taåy khaùc cuõng ñöôïc söû duïng ñeå laøm taêng tính hoøa tan cuûa protein ôû ñieåm ñaúng ñieän. Caùc chaát mang löôõng tính Ampholytes laøm trung hoøa vaø giuùp caùc protein khoâng keát tuûa trong quaù trình ñieän di.

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng

Caùc chaát khöû nhö DTT hay TBP ñöôïc söû duïng ñeå phaù vôõ caàu noái disulfide. Noàng ñoä DTT quaù cao seõ aûnh höôûng ñeán gradient pH vì pKa cuûa DTT xaáp xæ 8. Bio-Rad cung caáp moät giaûi phaùp toái öu cho quaù trình chuaån bò maãu Protein:

ReadyPrep sequential extraction Kit

ReadyPrep Sequential Extraction Kit

MAÃU

40–80%

Supernatant

Dung dòch 1 Tris, pH 9.5

Residue 1

12–49%

Supernatant

Dung dòch 2 Urea/CHAPS/Tris Bio-Lyte® / TBP

Residue 2

5–8%

Supernatant

Dung dòch 3 Urea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte® / TBP

Residue 3

1%– 6%

Extract 1

Sequential Extraction

16%

Extract 2

Whole lysate

200 g of E. coli proteins - each gel

Extract 3

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

2-D Electrophoresis

pH 3

pH 7.5

– pH 10

pH 3

pH 7.5

– pH 10

pH 3

pH 7.5

pH 3

pH 7.5

– pH 10

The 1st Dimension: Isoelectric Focusing (IEF)

First Dimension IEF

• PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)

– Thieát bò chính cuûa caùc PTN 2-D • Thieát keá phuø hôïp deã daøng söû duïng – Khay coù 12 keânh ñeå focusing – Caùc khay hydrat hoùa ñöôïc taùch rieâng ñeå ñaït ñöôïc löôïng maãu

lôùn.

– Coù theå laäp vaø löu chöông trình trong maùy.

• Caùc strip 7,11,17,18,& 24 cm • 10,000 volts and Peltier cooling • Boä load maãu coù 12 keânh.

ReadyStrip™ IPG Strips

3 -10

3 - 6

4 - 7

5 - 8

7 - 10

- 7 cm, 11 cm, 17 cm, 18 cm and 24 cm Naêm kích thöôùc: •

Coù theå söû duïng caùc strip overlap ñeå xaùc ñònh protein Caùc Ranges nhoû giuùp ñoä phaân giaûi cao vaø haïn cheá löôïng

protein quaù lôùn: 3.9 - 5.1, 4.7 - 5.9, 5.5 - 6.7, 6.3 - 8.3

Zoom In

4.7

5.9

Broad Range pH 3-10

4.7

5.9

Narrow Range pH 4-7

Micro Range pH 4.7-5.9

Nhieàu keát quaû vôùi khoaûng pH heïp cuûa IEF

pH 3-10

pH 7-10

pH 3- 6

pH 5- 8

The 2nd Dimension: SDS-PAGE

–

pH 3

pH 7.0

pH10

Proteins di chuyeån qua gel vôùi toác ñoä thích hôïp vôùi kích thöôùc cuûa chuùng.

Kích thuôùc

Protein nhoû nhaát seõ di chuyeån xa nhaát.

Ñieän tích

2nd Dimension: Pre-Cast Gel Technology

Mini-PROTEAN 3,

CRITERION Cell, PROTEAN II

Large, Mid and Mini Pre -

Cast Gels

Taát caû caùc loaïi hoaù chaát,

thuoác nhuoäm, dung dòch ñeäm vaø protein chuaån.

CRITERION Cell

Ñieän di treân gel löôïng lôùn Protein • PROTEAN Plus Dodeca Cell

– Chaïy cuøng luùc 12 gels – Ñoä laëp laïi cao (Excellent reproducibility)

– Coù theå duøng hai kích thöôùc gel khaùc nhau

• Heä thoáng laøm laïnh • Caùc ñieän cöïc daïng ñóa.

vôùi cuøng moät cell (18 vaø 20cm).

– Deã daøng thao taùc • Gel chuaån bò saün

A Complete Large-format Family

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

Sau khi chaïy ñieän di hai chieàu, ñeå quan saùt protein ta coù theå nhuoäm protein baèng nhieàu loaïi thuoác nhuoäm khaùc nhau. Tuøy thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá khaùc nhau bao goàm: -Ñoä nhaïy mong muoán -Ñoä tieän duïng -Giaù thaønh -Caùc loaïi thieát bò nhuoäm saün coù…

Moät soá loaïi protein coù theå ñöôïc nhuoäm sau khi ñaõ chuyeån leân maøng duøng trong lai protein. Caùc thuoác nhuoäm thoâng thöôøng söû duïng laø: Coomasie Blue, Sybro Ruby hay nhuoäm baïc.

Toái öu hoùa hieäu quaû nhuoäm protein

 Khay nhuoäm

 Keä laéc

 Dung dòch nhuoäm

 Moâ tô quay

Thieát bò laéc lyù töôûng

ñeå toái öu hoaù hieäu quaû nhuoäm protein

Caùc thuaän lôïi khi duøng 2-DE

Caùc nguyeân lieäu (caùc chaát phaân giaûi töø teá baøo, moâ) coù theå ñöôïc aùp duïng tröïc tieáp leân baûn gel.

• Coù theå phaùt hieän gaàn nhö toaøn boä protein coù trong maãu.

• Xem xeùt ñöôïc söï thay ñoåi giöõa maãu chuaån vaø maãu caàn

nghieân cöùu.

• Caùc protein ñöôïc taùch coù theå chieát ra ñeå thöïc hieän caùc nghieân cöùu tieáp theo trong vieäc tìm hieåu caáu truùc vaø chöùc naêng protein.

Differential Expression

E. Coli grown at 30º C E. Coli grown at 42º C

Ghi nhaän vaø phaân tích hình aûnh

• Nhaân toá quan troïng nhaát cuûa 2-D laø vieäc ghi laïi hình aûnh kyõ thuaät soá, moät phöông tieän thöïc teá ñeå thu nhaän caùc döõ lieäu veà protein.

• Noù cho pheùp so saùnh moät caùch khaùch quan thoâng tin veà proteome, chuyeån giao thoâng tin giöõa nhieàu nghieân cöùu khaùc nhau, vaø cho pheùp laäp danh muïc soá löôïng lôùn döõ lieäu veà protein.

• Caùc hình aûnh ñöôïc xöû lyù vaø so saùnh treân caùc phaàn meàm

vi tính.

Caùc heä thoáng thu nhaän hình aûnh

GS-800™ Calibrated Densitometer Reflectance and Transmittance Modes 30 x 40 cm scanning area

VersaDoc Imaging System CCD–Based UV / Visible, Fluorescence & Chemiluminescence

Molecular Imager® FX Pro Plus™ Multiimager System Fluorescence and Storage Phosphor Imaging

PDQuest 7.1: Neùt môùi yù nghóa

•

Taêng cöôøng hình aûnh cho gel nhuoäm bôûi SYPRO Ruby

• Heä döõ lieäu phaân bieät môùi. • Caûi thieän tính naêng cho caùc coâng cuï quan

•

saùt protein. – Quan saùt ñöôïc khoâng gian ba chieàu Taêng cöôøng ñoä nhaïy cho caùc coâng cuï phaân tích thoáng keâ – Caûi thieän caùc coâng cuï phaân tích so saùnh ñònh löôïng, ngöôøi söû duïng coù theå choïn löïa caùc möùc ñoä phaân tích khaùc nhau.

– Coù theå phaân tích cuøng luùc nhieàu hôn hai maãu.

Xaùc ñònh Protein

OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO

2-D array gel / blot

Mass spec identification

Protein excision

Image analysis

Imaging systems

Proteomics: Spot Cutter

• Töï ñoäng phaùt hieän vaø caét caùc ñieåm protein ñaõ ñöôïc taùch treân baûn gel.

• Phaân phoái vaøo caùc gieáng

hay caùc ñóa thu maãu.

• Hoaït ñoäng ñoäc laäp hay ñieàu

khieån bôûi phaàn meàm.

Proteomics: Spot Cutter

Analysis image Spot Cutter image

Xaùc ñònh Protein

• Caùc protein ñaõ ñöôïc phaân laäp töø gel ñöôïc phaân nhoû ñeå