Bài giảng Nguyên lý hoá sinh: Bài 4

David L. Nelson and Michael M. Cox

LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Sixth Edition

BÀI.4 ENZYME

© 2016 PGS.TS. BÙI VĂN LỆ

6.1 Giới thiệu về enzyme

Cuộc sống phụ thuộc vào các chất xúc tác mạnh và đặc hiệu là enzyme. Hầu hết mỗi phản ứng sinh hóa đều được xúc tác bởi enzyme.

cần

có

Với trường hợp ngoại lệ là một vài RNA xúc tác, tất cả các enzyme đã được biết đến là các enzyme protein. Nhiều coenzyme hoặc các cofactor có bản chất không phải protein cho hoạt động xúc tác của chúng

Không tính một số phân tử RNA có chức năng xúc tác, tất cả enzyme đều là protein Nhóm protein lón nhất. Hơn 3000 enzyme được biết. Enzyme là các chất xúc tác sinh học làm tăng tốc độ phản ứng. Enzyme thường có tính đặc hiệu cao và và chỉ phản ứng với 1 cơ chất để hình thành một sản phẩm và có thể tăng tốc độ phản ứng lên 1017 lẩn.

Một só enzyme cần cofactors / coenzymes cho hoạt tính của chúng

Coenzymes act as transient carriers of specific functional groups

Một cofactor hay coenzymes gắn chặt hoặc gắn cộng hoá trị với protein enzyme được gọi là prosthetic group.

Toàn bộ enzyme có hoạt tính xúc tác: holoenzyme

Chỉ có phần protein (không có cofactor và/hay coenzyme): apoenzyme hay apoprotein

Các enzyme được phân loại

tùy theo dạng phản ứng mà nó xúc tác. Tất cả các enzyme đều có số E.C và tên ; và hầu hết là các tên thông thường.

Các enzyme được phân nhóm dựa vào các phản ứng chúng xúc tác

Hệ thống phân loại quốc tế (danh pháp):

(Four-part classification number and a systematic name)

Systematic name: ATP:glucose phosphotransferase

ATP + D-glucose --> ADP + D-glucose-6-phospate

Classification number: 2.7.1.1. 2. --> Transferase (class)

7. --> phosphotransferase (subclass)

Hexokinase

1. --> phosphotransferase with a hydroxyl group as acceptor

1. --> D-glucose as the phosphoryl group acceptor

6.2 Cơ chế hoạt động của enzyme

• Enzyme là chất xúc tác hiệu quả cao. Nó có thể

đẩy tốc độ phản ứng khoảng 105 đến 107.

• Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme được mô tả bằng sự hình thành một phức hợp giữa cơ chất và enzyme (phức hợp ES). Việc gắn với cơ chất xảy ra tại vị trí hoạt động

• Hoạt động của enzyme và các chất xúc tác khác thấp hơn năng lượng hoạt hóa ∆G của một phản ứng và vì thế làm tăng tốc độ phản ứng. Sự cân bằng phản ứng không bị ảnh hưởng bởi enzyme

Sự gắn của một cơ chất vào enzyme ở vị trí hoạt động

Biểu diễn một phản ứng enzyme đơn giản

E + S  ES  EP  E + P

Enzyme chỉ tác động lên tốc độ phản ứng, không ảnh hưởng đến cân bằng phản ứng

Biểu đồ toạ độ phản ứng của một phản ứng hoá học

Biểu đồ so sánh phản ứng được xúc tác bởi enzyme và phản ứng không có xúc tác

There is an energy barrier between formation of product from substrate There is an activation energy for formation of the transition state

Enzymes enhance reaction rates by lowering activation energies Enzymes do not affect equilibrium

Equilibrium

S  P

Reaction

S → P

Reaction rate = V = k [S]

If the rate depends only on the concentration of S (first-order)

From the Transition-State Theory:

‡





Tk B h

Một phần năng lượng đáng kể được dùng cho việc làm tăng tốc độ enzyme có nguồn gốc từ các tương tác yếu (liên kết hydro và các tương tác kỵ nước và ion) giữa cơ chất và enzyme. Vị trí hoạt hóa của enzyme được cấu trúc sao cho một vài tương tác yếu này có thể xảy ra trong trang thái chuyển tiếp của phản ứng, từ đó ổn định trạng thái chuyển tiếp. Năng lượng liên kết ∆GB có thể được sử dụng để làm giảm entropy của cơ chất hoặc để gây ra sự thay đổi cấu hình trong enzyme. Năng lượng liên kết cũng giải thích cho tính đặc hiệu tinh tế của enzyme đối với cơ chất

Những tương tác yếu của enzyme và cơ chất được tối ưu hoá trong trạng thái chuyển tiếp

Các cơ chế phản ứng phụ được thực hiện bởi enzyme bao gồm quá trình xúc tác acid – base, xúc tác đồng hóa trị và xúc tác ion kim loại. quá trình xúc tác thường bao gồm các tương tác đồng hóa trị chuyển tiếp giữa cơ chất và enzyme nhằm đưa ra con đường phản ứng mới có năng lượng thấp hơn

Xúc tác acid-base tổng quát và cộng hóa trị

Amino acids trong phản ứng xúc tác acid-base thông thường

Các chuỗi amino acid ở rìa và các nhóm chức năng của một số cofactors có thể đóng vai trò như nucleophiles trong sự hình thành các liên kết cộng hóa trị với cơ chất

Chymotrypsin and its substrate

6.3 Động học enzyme

Hầu hết các enzyme đều có đặc điểm động học giống nhau. Khi cơ chất gắn vào enzyme, phản ứng tạo ra trạng thái ổn định một cách nhanh chóng mà ở đó tốc độ hình thành phức hợp ES cân bằng với tốc độ phân giải nó. Khi nồng độ cơ chất [S] tăng thì hoạt động của nồng độ enzyme đã được gắn ở trạng thái ổn định tăng theo dạng hyperbol để đạt đến tốc độ cực đại, Vmax, mà ở đấy tất cả các enzyme hình thành phức hợp với cơ chất.

Enzyme Kinetics

E + S

E + P

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên tố độ khởi đầu của một phản ứng được xúc tác enzyme

k-1

k-2

E + S

E + P

k-1

Michaelis-Menten kinetics

initial rate measurements

[S] >> [E]

[ES] ~ constant

V0 = K2 [ES]

V0 

K m 

Vmax [S] K m  [S]

k 2 + k -1 k1

Michaelis constant

Theo mô hình Michaelis-Menten: k2 là không đáng kể so với k1 và vận tốc hình thành ES bằng với vận tốc phân hủy nó ở hầu hết các phản vận tốc= V0= P/t = k2[ES] ứng. Để có lợi, vận tốc phản ứng phải được xác định bởi [S], [E]. Vận tốc tạo thành ES bằng với k1[E][S] trong khi vận tốc phân ly của ES bằng với (k-1 + k2)[ES]. Giả sử trạng thái bền (steady state) cân bằng hai vận tốc này :

k1[E][S] = (k-1 + k2)[ES] hay [ES] = [E][S]/[ (k-1 + k2) / k1] Michaelis và Menten giới thiệu một hằng số mới là Km, hằng số Michaelis Km = k-1 + k2 /k1 và pt có thể viết:

Km[ES] ={E][S}

Từ nồng độ đầu của enzym là [E]o = [E] + [ES] thế [E] vào phương trình trên có thể viết Km[ES]=[E]o[S]-[S][ES] hay [ES] = [E]o[S]/Km+[S] và vận tốc phản ứng làV0=k2[E]o[S]/Km+[S] ở điều kiện cực đại Vmax=k2[E]o và phương trình Michaelis-Menten là:

Nồng độ cơ chất trong tốc độ phản ứng cân bằng với phân nửa Vmax là hằng số Michaelis Km. Phương trình Michaelis- Menten mô tả sự liên quan giữa nồng độ cơ chất [S], tốc độ cực đại Vmax và hằng số Km:

Vo= Vmax[S]/(Km+[S])

Km và Vmax có ý nghĩa khác nhau đối với các enzyme khác nhau. Vận tốc hạn chế của một phản ứng xúc tác bởi enzyme tại trạng thái bão hòa được phản ánh qua hằng số kcat. Tỷ lệ giữa kcat/Km cho thấy hiệu quả xúc tác. Phương trình Michaelis – Menten cũng áp dụng cho các phản ứng hai cơ chất xảy ra bởi phức hợp bậc ba hoặc con đường Ping-Pong.

Dependence of initial velocity on substrate concentration

E + S

E + P

k-1

V0 

Vmax [S] K m  [S]

V0 

When km > > [S]

Vmax [S] K m

K m 

k 2 + k -1 k1

When [S] > > km

V0  Vmax

A double-reciprocal or Lineweaver-Burk plot

V0 

Vmax [S] K m  [S]





1 V0

K m Vmax [S]

1 Vmax

Lineweaver-Burk equation

kcat = Vmax / [E]total

kcat has units of reciprocal time

kcat / Km is a measure of catalytic efficiency

Nhiều enzyme xúc tác các phản ứng với hai hay nhiều cơ chất

Các cơ chế chung của những phản ứng hai cơ chất được xúc tác enzyme

Động lực của trạng thái tiền ổn định cung cấp bằng chứng cho các bước phản ứng chuyên biệt

Phản ứng Ping-Pong (double displacement)

Phức hợp 3 thành phần (ternary complex) được hình thành trong phản ứng (Thể hiện bằng các đường giao nhau)

 Phản ứng thuận nghịch của một enzyme có tính cạnh tranh, không cạnh tranh hoặc phối hợp. các chất ức chế cạnh tranh với cơ chất

DIPF = DIFP = diisopropylfluorophosphate

Molecules that are transition state analogs are effective reversible competitive inhibitors

Irreversible enzyme inhibition

DIPF = DIFP =

Ức chế không thuận nghịch của chymotrypsin

Three types of reversible inhibition

Competitive inhibition

Uncompetitive inhibition

Mixed inhibition

Các enzyme chịu sư ức chế thuận nghịch và không thuận nghịch

pH – activity profiles for two enzymes

6.4 Các ví dụ về các phản ứng enzyme

• Chymotrypsine là một serine protease có cơ chế hoạt động được biết rõ ràng, đặc trưng cho quá trình xúc tác acid-base, xúc tác đồng hóa trị và quá trình ổn định trạng thái chuyển tiếp.

• Hexokinase là một ví dụ điển hình cho sự điều chỉnh do cảm ứng (induced fit) như là một phương tiện sử dụng năng lượng liên kết cơ chất

• Phản ứng của enolase theo hướng xúc tác ion kim loại • Lysozyme trong xúc tác đồng hóa trị và xúc tác acid nói chung vì nó thúc đẩy 2 phản ứng thay thế ưa nhân liên tiếp.

• Sự hiểu biết về cơ chế enzyme cho phép phát triển các

loại thuốc ức chế hoạt động của enzyme

Structure of chymotrypsin, a serine protease

Chymotrypsin

Chymotrypsin là một protease chuyên biệt cho liên kết peptide liền kề các amino acids thơm (aromatic) (Trp, Tyr, Phe)

Các amino acid chính ở tâm hoạt động Ser195, His57, và Asp102

Chuỗi bên của amino acid thơm

Hốc nơi gắn với các chuỗi bên amino acid của cơ chất

Ba chuỗi polypeptide được nối bởi các cầu nối disulfide

Hexokinase

Enolase

Lysozyme (Peptidoglycan N acetylmuramoylhydrolase)

Tác nhân diệt Thủy khuẩn: kết liên giải của glucosidic peptidoglycan vách tế bào vi khuẩn có trong lòng trắng trứng (gà, chim)

Tâm hoạt động và vị trí cắt của lysozyme

Phát triển các loại thuốc ức chế hoạt động của enzyme

Mechanism of action of penicillin

Beta lactamase inactivates penicillin

Inactivation of beta lactamase by clavulanic acid

Mechanism of action of HIV protease

Phát triển các loại thuốc ức chế hoạt động của enzyme

6.5. Các enzyme điều hòa

Các hoạt động của con đường biến dưỡng trong các tế bào được điều hòa bằng cách kiểm soát các hoạt động của các enzyme nhất định

Trong ức

chế

hồi

(feedback phản inhibition), sản phẩm cuối cùng của con đường ức chế enzyme đầu tiên của con đường đó.

Ức chế phản hồi (Feedback inhibition)

Sự tích lũy sản phẩm cuối cùng làm chậm một cách đáng kể toàn bộ con đường

Example of heterotropic allosteric inhibition

Trong nhiều con đường, bước điều hòa được xúc tác bởi 1 enzme allosteric

Hoạt động của enzyme allosteric được điều chỉnh bằng cách gắn thuận nghịch một chất điều hòa đặc hiệu vào vị trí điều hòa. Chất điều hòa có thể là chính cơ chất hoặc một vài chất biến dưỡng khác và ảnh hưởng của chất điều hòa có thể có tính ức chế hoặc kích thích. Động học của enzyme allosteric phản ánh các tương tác phối hợp của các tiểu đơn vị của enzyme

Các enzyme điều hòa

Allosteric enzymes trải qua sự biến đổi cấu hình do sự liên kết điều chỉnh

Conformational change

Các tương tác của tiểu phần trong enzyme allosteric và các tương tác với tác nhân ức chế,

tác nhân hoạt hóa

Aspartate transcarbamoylase, an allosteric enzyme

Hai mặt của enzyme điều hòa aspartate transcarbamoylase

Enzyme điều hòa allosteric này có hai vị trí xúc tác chồng lên nhau, mỗi vị trí có 3 chuỗi polypeptide xúc tác (màu xanh dương và tím) và ba vị trí điều hòa, mỗi vị trí có

2 chuỗi polypeptide điều hòa (màu đỏ và vàng).

Liên kết điều chỉnh tạo nên các thay đổi lớn về cấu hình và hoạt tính của enzyme

Aspartate Transcarbamoylase

Các tiểu phần điều hòa

Các tiểu phần xúc tác

Các enzyme điều hòa khác được kiểm soát nhờ sự thay đổi đồng hóa trị một nhóm chức đặc hiệu cần cho hoạt tính. Sự phosphoryl hóa các thành phần acid amin đặc hiệu là con đường phổ biến điều hòa hoạt động enzyme

Regulation of enzyme activity by covalent modification

Các nhóm phosphoryl ảnh hưởng lên cấu trúc và hoạt tính xúc tác của enzyme

Sự điều hòa hoạt tính của glycogen phosphorylase ở cơbằng nhiều cơ chế khác nhau

• Nhiều enzyme phân giải protein được tổng hợp như những tiền chất bất hoạt gọi là zymogen, và những chất này sẽ được hoạt hoạt hóa bằng cách cắt bỏ các đoạn peptide nhỏ

• Các enzyme ở những điểm giao quan trọng của quá trình biến dưỡng có thể được kiểm soát bằng sự kết hợp phức tạp của các chất effector, cho phép nối liền các hoạt động của những con đường liên quan nối liền nhau.

• Một số enzyme được tạo ra và dự trữ ở dạng tiền chất bất hoạt gọi là tiền enzyme (proenzyme hay zymogen). Zymogen được chuyển thành enzyme họat động bằng cách cắt không thuận nghịch một hoặc nhiều liên kết peptide. Ví dụ : chymotrypsin được tạo ra trong tuyến tụy. Sau khi được tiết vào ruột non, chymotrypsin bị chuyển sang dạng hoạt động thông qua một số phản ứng. Lúc đầu, trypsin cắt liên kết peptide giữa Arg 15 và Ile 16. sau đó, chymotrypsin cắt một liên kết peptide khác tạo thành một enzyme hoạt hóa có khả năng phân giải protein thực phẩm. Các enzyme khác được hoạt hóa bằng quá trình phân giải protein từng phần là pepsin, trypsin, elastase, collagenase, thrombin.

Regulation of enzyme activity by proteolytic cleavage

Example: Activation of zymogens, inactive precursors of proteases