Bài giảng phương pháp phân tích ADN: Kinh nghiệm và hướng dẫn chi tiết

Phương pháp

phân tích ADN

1

(cid:1)CHIẾT TÁCH ADN (cid:1)CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC (cid:1)KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG (cid:1)CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN (cid:1)KỸ THUẬT PCR

Phương pháp chiết tách ADN

Phương pháp chiết tách

ADN

(cid:2) Nguyên tắc chung: 3 bướ

ước

– Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa họ

học

– Chiết tách acid nucleic: Phenol

: Phenol-Chloroform (cid:3) loại Protein trong

pha tủa, thu ADN trong pha

tan

– Kết tủa acid nucleic: cồn tuy

tuyệt ñối hoặc isopropanol, …

Phương pháp chiết tách

ADN

(cid:2) Các trường hợp cụ thể:

– Plasmid: loại NST bằng sự khá

khác nhau về cấu dạng - kích thước

– ADN thực khuẩn: tủa phage

phage bằng PEG, loại bỏ capsid

– Tế bào Thực vật: phá tế bào

o bằng cách nghiền

– Tế bào ðộng vật: phá tế bào

o bằng enzym - chất tẩy

Tinh chế acid nucleic

: acid nucleic ñược siêu ly tâm trong thang tỷ

(cid:2) Ly tâm phân ñoạn: acid nucleic trọng saccarose hay CsCl2 (lượng

(cid:2) Sắc ký

lượng acid nucleic cần tinh chế lớn

• Lọc gel: tách acid nucleic theo • Trao ñổi ion trên vi cột (cid:3) thu

theo kích thước phân tử ở qui mô lớn

• HPLC:ñối với các oligonucleotide, • HPLC:ñối với các oligonucleotide,

thu hồi những lượng ADN rất nhỏ

• Hấp phụ (ái lực): mARN ñược

oligonucleotide, ñộ phân giải cao (1 nucleotid oligonucleotide, ñộ phân giải cao (1 nucleotid

ñược hấp phụ bằng resin có gắn oligo

• ðiện di gel, polyacrylamid

dT hay dU.

ng acid nucleic ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic

phổ kế: ̣ mạnh của base ở λ = 260 nm ñương nồng ñộ: ADN (hoặc ARN) sợi ñôi ARN (hoặc ADN) sợi ñơn

(cid:2) ðịnh lượng = Quang ph – Nguyên tắc: sự hấp thụ – 1 ñơn vị OD260nm tương ñương (cid:2) 50 µg/ml dung dịch ADN ( (cid:2) 40 µg/ml dung dịch ARN ( (cid:2) 20 µg/ml oligonucleotid (tới – ðộ tinh khiết: OD260/230 ho – ðộ tinh khiết: OD260/230 ho tinh khiết: 1.8 ≤ OD260/280

tới 70 base) hoặc OD260/280 và OD320nm(ADN hoặc OD260/280 và OD320nm(ADN 280 ≤ 2).

acid nucleic ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic

(cid:2) Điện di gel: phân tách acid nucleic

acid nucleic bằng dòng điện trong

gel – Định tính theo kích thước khi – Định lượng bằng so sánh vớ

khi so với chuẩn ới chuẩn

ADN qua gel tùy thuộc vào:

vòng, thẳng

(cid:4) Nguyên tắc: chuyển về cực dương chuyển về cực dương (cid:5) ADN tích điện âm, di chuyển (cid:5) ADN tích điện âm, di chuyển acrylamide (cid:5) Hệ gel: agarose hay acrylamide (cid:4) Tốc độ điện di ADN qua gel (cid:5) Kích thước ADN (cid:5) Cấu dạng ADN: siêu xoắn, vòng (cid:5) Nồng độ gel (cid:5) Điện thế

acid nucleic ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic

(cid:2) Điện di trong trường xung

xung (đổi hướng điện trường): phân

tích ADN lớn (>50kb)

(cid:2) ADN NST ĐV có vú kích thước

thước lớn: thủy phân với RE

trước khi phân tích

ðiện di

CẮT, NỐI, LAI ADN & ỨNG DỤNG CẮT, NỐI, LAI ADN & ỨNG DỤNG

CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN (RE) (cid:2) CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN (RE)

CÁC LIGASE & ỨNG DỤNG ðỂ NỐI CÁC ð0ẠN ACID NUCLEIC (cid:2) CÁC LIGASE & ỨNG DỤNG ðỂ NỐI CÁC ð0ẠN ACID NUCLEIC

KỸ THUẬT LAI NUCLEOTID & ỨNG DỤNG (cid:2) KỸ THUẬT LAI NUCLEOTID & ỨNG DỤNG

CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN

(cid:2) Cấu tạo:

– Enzym cắt hạn chế (restriction

(restriction enzym - RE): các

ADN tại hay gần một trình tự

endonuclease cắt ADN nhận diện ñặc hiệu.

(cid:2) Chức năng

– Cắt và thoái hóa các ADN

phage) (cid:3) bộ gen của

ADN ngoại lai (ví dụ ADN vi khuẩn ñược ổn ñịnh.

CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN

I & III

II

Hoạt tính

Endonuclease

Endonuclease Metyl hóa

ATP

Cần

Không

Tại hoặc rất gần vị trí nhận diện

Vị trí cắt

diện Khá xa ñiểm nhận diện

Ứng dụng

Ít

Phổ biến trong nghiên cứu

Danh pháp

nghiêng) - tên chi và loài (ký tự thứ tư ñể hoặc plasmid), 1 số La mã - thứ tự phát

của Bacillus amyloliquefaciens chủng H,

3 ký tự Latin (in nghiêng chỉ chủng (strain) hoặc hiện enzym. VD: BamHI: là RE của ñược phát hiện ñầu

tiên.

ðặc ñiểm RE loại II và cá

và các kiểu cắt của nó

(cid:2) Trình tự nhận diện cắt

t gồm 4-8 nucleotid, palindrome (2 mạch của tt hoàn ñọc theo chiều 5’ – 3’),

tại cùng một ñiểm

mạch tại một ñiểm khác nhau

thường có kiểu palindrome toàn giống nhau khi ñọc Kiểu cắt: – ðầu tù: cắt hai mạch tạ – ðầu so le/dính: cắt mỗi (cid:2) Ứng dụng Ứng dụng – Cắt ADN trong kỹ thuật – Phân tích ña hình cắt giớ

tái tổ hợp di truyền ới hạn (cid:3) ñịnh danh, phân biệt

ðầu cắt của RE

-TAAGGATCCAAA- -ATTCCTAGGTTT-

Cắt với HaeIII

Cắt với BamHI

-TAAG GATCCAAA- -ATTCCTAG GTTT- -ATTCCTAG GTTT-

-AATCAGCTGTTA- -TTAGTCGACAAT- -AATCAG CTGTTA- -TTAGTC GACAAT- -TTAGTC GACAAT-

Đầu tà (tù)

Đầu so le (dính)

ðầu cắt của RE

Ligase - ứng dụng

(cid:2) Là enzyme tạo liên kết OH và 5’-P của hai sợi

t phosphodiester giữa 3’- i acid nucleic

ADN ligase ADN ligase ARN ligase

ðối tượng ñôi ADN ñôi ADN ñơn, ARN

ADN ligase của của phage T4 ADN ligase của

E.coli

Năng lượng ATP NAD

Cơ chế Nối ñầu dính & ñầu ñầu tù Chỉ nối ñầu dính

Phản ứng nối của ligase

A T C A G

T C C A T C A

T A G T C

A G G T A G T

Lai acid nucleic (lai phân tử) Lai acid nucleic (lai phân tử)

acid nucleic sợi ñơn bắt cặp bổ sung với nhau

lai = duplex thành các sợi ñơn

(cid:2) Lai hóa: 2 phân tử acid nucleic (cid:3) phân tử sợi ñôi = phân tử lai (cid:2) Biến tính: duplex tách ra thành (cid:2) Phản ứng lai ñặc hiệu: bắt cặp

cặp bổ sung hoàn toàn xảy ra trên mạch một vùng liên tục giữa hai mạch

(cid:2) Phản ứng lai không ñặc hiệu:

: một phân tử chỉ bắt cặp một phần

với phân tử kia

Lai hóa Lai hóa

G-T-A-G-T-C-C

T-C-A-G-G-T

Biến tính Biến tính

G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T

yếu tố ảnh hưởng Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng

(cid:2) ðộ ñặc hiệu và ñộ bền của duplex – Nhiệt ñộ: quyết ñịnh ñộ bền – ðộ dài các trình tự lai: càng

duplex phụ thuộc vào: bền của liên kết hydro

càng lớn duplex càng bền; thời gian

phản ứng càng lâu.

càng cao duplex càng bền

– Tỷ lệ GC trong duplex: càng – Nồng ñộ ion: ảnh hưởng ñến – Nồng ñộ các phân tử (ADN)

ñến ñộ bền của liên kết hydro

(ADN) và thời gian phản ứng

yếu tố ảnh hưởng Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng

(cid:2) Nhiệt ñộ chảy (Tm): nhiệt ñộ

ñộ mà 50% số duplex ñược hình

thành

GC của duplex, nồng ñộ ion

(cid:2) Phụ thuộc chiều dài và tỷ lệ Tm (oC) = 4(GC) + 2(AT)

To > Tm: biến tính duplex duplex To < Tm: phản ứng lai (hồi hồi tính)

Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng

(cid:2) Phản ứng lai diễn ra giữa một phân

phân tử ñích (phân tử cần ñược

(probe). phát hiện) và một ñoạn dò (probe).

(cid:2) Kỹ thuật

– Lai trên màng rắn: kỹ thuật blot

blot. Các biến thể của lai trên màng:

Lai sau

sau khi ñiện di, cố ñịnh trên màng cellulose

(cid:2) Southern blot: ñích ADN (cid:2) Northern blot: ñích ARN (cid:2) Dot blot: hh acid nucleic ñích ñược

ñược chấm trực tiếp

– Lai tại chỗ – Lai trong dung dịch: chẩn ñoán – Lai trong dung dịch: chẩn ñoán

ñoán phát hiện dựa trên acid nucleic. ñoán phát hiện dựa trên acid nucleic.

ðoạn dò

(cid:2) ðoạn dò là oligonucleotid ñược

ñược ñánh dấu: , enzyme, … – phóng xạ, huỳnh quang, enzyme, … diễn ra hay không hay phân tử

(cid:2) (cid:3) phát hiện ñược sự lai có diễn ñích có tồn tại hay không.

Ứng dụng:

tại của acid nucleic ñích, nghiên •Trong shpt, phát hiện sự tồn tại

cứu sự biểu hiện gen.

hiện bệnh dựa trên acid nucleic và •Trong y học : chẩn ñoán phát hiện

nghiên cứu bệnh học.

l l

t t o o b b

n n r r e e h h t t u u o o S S

ADN in vitro Kỹ thuật PCR: sao chép ADN in vitro

(cid:2) Khuôn ADN sợi ñơn ñượ

ược gắn mồi nhờ lai hóa

ñặc hiệu

dài mồi theo nguyên tắc ADN sợi ñơn (cid:3) ADN sợi ñôi

vòng nhờ

(cid:2) ADN polymerase kéo dài bổ sung với khuôn ADN (cid:2) Phản ứng ñược quay vò • Mồi thừa • Mồi thừa • Tái tạo khuôn ADN sợi

i ñơn từ sản phẩm sợi ñôi

bằng nhiệt ñộ cao

Polymerase

nucleotid nucleotid

3’-OH

5’-P 3’-OH

5’-P

PCR

ADN đích

3’ 5’

5’ 3’

Sau mỗi chu kỳ số

ADN sợi ñơn làm

3’ 5’ ADN đích biến tính 5’ 3’

3’

Gắn mồi

3’

Kéo dài Kéo dài

khuôn mẫu cho việc

Đoạn đích đích quay lại

Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài

Biến tính và gắn mồi

Kéo dài

gắn mồi tăng gấp ñôi (cid:3) số sản phẩm tăng theo cấp số nhân theo cấp số nhân

Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20

20-40 chu kỳ

bước Kỹ thuật PCR gồm 3 bước

(cid:2) biến tính ADN sợi ñôi thành các sợi ñơn

thành các sợi ñơn nhờ

sợi ñơn,

nhiệt ñộ, ủ các ñoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp (cid:2) ủ các ñoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp ñặc hiệu) với các AND (cid:2) enzym kéo dài các ñoạn mồi theo nguyên tắc enzym kéo dài các ñoạn mồi theo nguyên tắc mẫu. mẫu. bổ sung với khuôn mẫu bổ sung với khuôn mẫu

PCR - Các yếu tố kỹ thuậ

ật

(cid:2) Chương trình PCR

5-10 phút ặp lại 25-40 lần

giây (cid:3) vài phút

– Biến tính khởi ñầu: 95oC / 5 – Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặ (cid:2) Biến tính: 94-95oC, 30 giây (cid:2) Gắn mồi: 40-70oC (< Tm củ (cid:2) Kéo dài: nhiệt ñộ ≈ nhiệt ñộ

của mồi), 30 - 60 giây ñộ tối thích của enzym (thường là 65-

polymerase chịu nhiệt), thời gian tùy theo ñộ

74oC ñối với enzym polymerase dài khuôn (thường 1 phút cho

cho mỗi kb)

– Kéo dài kết thúc: 72-74oC / – Kéo dài kết thúc: 72-74 C / (cid:2) Thành phần phản ứng: 20

– Khuôn mẫu: 1 pg - 1 µg, nồng – Mồi: 0,1 - 1 µM, nồng ñộ quá

C / vài lần thời gian kéo dài C / vài lần thời gian kéo dài 20-100 µl nồng ñộ cao sẽ ức chế phản ứng. quá cao sẽ dẫn ñến bắt cặp sai và làm

giảm tính ñặc hiệu.

– ðệm: cung cấp pH thích hợp

hợp cho phản ứng và có nồng ñộ Mg2+

thay ñổi (cần tối ưu hóa), thường

thường trong khoảng 0,5-5 mM.

và C, nồng ñộ 200-250 µM : 0,5 - 2,5 ñơn vị cho mỗi phản ứng

– Hỗn hợp các dNTP: A, T, G va – ADN polymerase chịu nhiệt: – Nước vừa ñủ.

Nguồn gốc và ñặc ñiểm một s

t số ADN polymerase chịu nhiệt

(cid:2) Lựa chọn tùy theo

ốn

– ðộ chính xác mong muố – ðộ dài của khuôn mẫu Giá thành và tính sẵn có – Giá thành và tính sẵn có

Yêu cầu của mồi (primer)

(primer) trong PCR

(cid:2) Chiều dài 18-30 nucleotid,

, có trình tự bổ sung ñặc hiệu

với khuôn mẫu

cặp trên khuôn mẫu giữa hai nhất là < 3kb)

Các nucleotid AT và GC ñược vào một chỗ. Trình tự của mồi tóc và hai mồi không bắt cặp với

(cid:2) Khoảng cách các vị trí bắt mồi không quá 10 kb (tốt (cid:2) Tỷ lệ GC chiếm 40-60%. Các phân bố ñều, tránh dồn vào không tạo cấu trúc kẹp tóc nhaunhau

(cid:2) Nhiệt ñộ chảy của hai mồi

phải gần nhau và trong

khoảng 40-65oC, nhưng tốt

tốt nhất là 52-58oC

Nồng ñộ mồi, nhiệt ñộ bắ

ắt cặp

µM (cid:2) Nồng ñộ: 0,1 µM - 1 µM 2(A+T) + 4(G+C) (cid:2) Công thức tính Tm = 2 p = Tm - 5oC (cần ñược tối ưu) (cid:2) Nhiệt ñộ bắt cặp = Tm

Các yếu tố cần ñược tối ưu hóa trong PCR Các yếu tố cần ñược tối ưu hóa trong PCR

(cid:2) Nồng ñộ Mg2+: liên quan ñến khả năng xử lý liên quan ñến khả năng xử lý

khuôn mẫu của polymerase, cần tối ưu hóa cho khuôn mẫu của polymerase, cần tối ưu hóa cho từng khuôn mẫu khác nhau. Thường trong từng khuôn mẫu khác nhau. khoảng 0,5-5 mM

(cid:2) Nhiệt ñộ gắn mồi = Tm

= Tm - 5oC (cần ñược tối ưu)

quyết ñịnh tính ñặc hiệu của phản ứng. – quyết ñịnh tính ñặc hiệu của phản ứng. quá cao phản ứng khó diễn ra, quá thấp → không ñặc – quá cao phản ứng khó diễn ra, quá thấp hiệu.

Yếu tố quyết ñịnh kích thước ñoạn khuếch ñại Yếu tố quyết ñịnh kích thước ñoạn khuếch ñại

Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược (cid:2) Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược Tối ña tùy theo khả năng xử lý của enzym (cid:2) Tối ña tùy theo khả năng xử lý của enzym kb ñối với enzym thông thường. Có (cid:2) Thường <3 kb ñối với enzym thông thường. Có kb ñối với một số enzym ñặc biệt. thể ñến 40 kb ñối với một số enzym ñặc biệt.

Vai trò, nồng ñộ Mg++

(cid:2) Liên quan ñến cấu trúc nhiệt ñộ chảy và sự gắ (cid:2) Thường ñược cung cấp

c, tính ổn ñịnh của khuôn, ắn mồi p dưới dạng muối chlorid

hay sulfat

ng ñộ Mg++ tối ưu khác

(cid:2) Mỗi phản ứng có nồng nhau (cid:3) cần khảo sát b nhau (cid:3) cần khảo sát b (cid:2) Nồng ñộ thường dùng:

bằng thực nghiệm bằng thực nghiệm : 0,5-5 mM

Nồng ñộ dNTP trong PCR Nồng ñộ dNTP trong PCR

/ mỗi loại

(cid:2) Nồng ñộ: 20-200 µM / quá cao làm tăng tỷ lệ lỗi hoặc ức chế (cid:2) Nồng ñộ quá cao làm tăng tỷ lệ lỗi hoặc ức chế

Taq polymerase

ệ các nucleotid (cid:3) tăng lỗi

hoạt ñộng enzym Taq (cid:2) Mất cân bằng về tỷ lệ cá Nồng ñộ quá thấp tạo các sản phẩm không (cid:2) Nồng ñộ quá thấp tạo các sản phẩm không hoàn chỉnh hoàn chỉnh

Ưu nhược ñiểm

(cid:2) Ưu

– Nhanh, ðơn giản, Nhạy,

y, ðặc hiệu

(cid:2) Nhược

– Phải biết trình tự 2 ñầu – Ngoại nhiễm (cid:3) mất tính ñ

u ñể thiết kế mồi nh ñặc hiệu

Kiểm soát ngoại nhiễm trong PCR Kiểm soát ngoại nhiễm trong PCR

(cid:2) Phản ứng dễ bị nhiễm

tạp của các ñoạn ADN thể ñược khuếch ñại cùng

ngoại lai và chúng có thể với mẫu.

thể ñược mang sang từ các ñó (amplicon) hoặc từ các

(cid:2) Các ADN lạ này có thể sự khuếch ñại trước ñó nguồn khác.

(cid:2) Kiểm soát:

ñược tuân thủ chặt chẻ,

enzym một cách nghiêm ngặt

– qui trình thực hiện phải – kiểm tra chất lượng enzym – sử dụng bộ pipet riêng – các thành phần phản ứng – khu vực chiết tách ADN, hiện sản phẩm nên tách chiếu UV ñể làm giảm acid nucleic

ứng nên ñược phân liều trước, ADN, thực hiện phản ứng và phát tách biệt và thường xuyên ñược acid nucleic trong không khí.

: Nested PCR (PCR tổ) Các Biến thể: Nested PCR (PCR tổ)

Khi khuôn mẫu có chất lượng kém hoặc việc thiết kế mồi có tính (cid:2) Khi khuôn mẫu có chất lượng kém hoặc việc thiết kế mồi có tính sản phẩm PCR không ñặc hiệu ñặc hiệu gặp khó khăn → sản phẩm PCR không ñặc hiệu

(cid:2) PCR (tổ): thực hiện 2 phản ứng PCR liên tiếp với

phản ứng PCR liên tiếp với 2 bộ mồi khác

nhau: – Phản ứng 1: thực hiện trên khuôn mẫu nguyên thủy, dùng bộ

: thực hiện trên khuôn mẫu nguyên thủy, dùng bộ mồi

ngoài, cho sản phẩm chứa khuôn mẫu của bộ mồi thứ

cho sản phẩm chứa khuôn mẫu của bộ mồi thứ 2 (mồi trong) dùng sản phẩm của phản ứng 1 làm khuôn mẫu, với bộ

– Phản ứng 2: dùng sản phẩm của phản ứng

mồi trong (1 trong 2 mồi trong

mồi trong có thể trùng với mồi ngoài)

Tăng tính ñặc hiệu hoặc khuếch ñại các khuôn mẫu không tốt Tăng tính ñặc hiệu hoặc khuếch ñại các khuôn mẫu không tốt Tăng tính ñặc hiệu hoặc khuếch ñại các khuôn mẫu không tốt (cid:2) Tăng tính ñặc hiệu hoặc khuếch ñại các khuôn mẫu không tốt

Phản ứng 1

Sản phẩm 1

Phản ứng 2

Sản phẩm cuối cùng

Biến thể PCR: Multiplex PCR Biến thể PCR: Multiplex PCR

(cid:2) Dùng nhiều bộ mồi của nhi

a nhiều khuôn mẫu trong

một phản ứng Cho phép khuếch ñại cùng lúc nhiều khuôn (cid:2) Cho phép khuếch ñại cùng lúc nhiều khuôn ứng dụng trong chẩn ñoán-phát mẫu, ñược ứng dụng trong chẩn ñoán , vd. phát hiện ñề kháng ña kháng sinh hiện, vd. phát hiện ñề kháng ña kháng sinh Cần thiết kế mồi và ñiều kiện PCR ñể: Cần thiết kế mồi và ñiều kiện PCR ñể: (cid:2) Cần thiết kế mồi và ñiều kiện PCR ñể: (cid:2) Cần thiết kế mồi và ñiều kiện PCR ñể: Các phản ứng không ức chế hay cạnh tranh lẫn nhau – Các phản ứng không ức chế hay cạnh tranh lẫn nhau Các sản phẩm của khuôn mẫu khác nhau có kích – Các sản phẩm của khuôn mẫu khác nhau có kích thước hoặc ñánh dấu khác nhau. thước hoặc ñánh dấu khác nhau.

PCR (PCR ngược) Biến thể PCR: RT-PCR (PCR ngược)

(cid:2) Khuôn mẫu là ARN (cid:2) Gồm 2 phản ứng liên tiếp trong

phản ứng liên tiếp trong 1 ống: : sử dụng ARN làm khuôn, enzym – Phiên mã ngược: sử dụng ARN làm khuôn, enzym revese transcriptase, nhiệt ñộ thấp (40-50oC): tạo revese transcriptase, nhiệt ñộ thấp ( bản sao ADN

: sử dụng bản sao ADN làm khuôn – PCR: sử dụng bản sao ADN làm khuôn

Khuôn ARN, phản ứng 1 Khuôn ARN, phản ứng 1

Khuôn ADN, phản ứng 2, sản phẩm sợi ñôi

Khuôn ADN, phản ứng 2, tiếp tục

Sản phẩm cuối cùng

Ứng dụng PCR

n ADN mong muốn

n và ñịnh danh sinh vật

(cid:2) Tạo ñoạn ADN mong mu (cid:2) Giải trình tự (cid:2) Gây ñột biến (cid:2) Chẩn ñoán, Phát hiện di truyền (cid:2) Xác ñịnh quan hệ di truy m,…m,… (cid:2) Nhận dạng tội phạm,… (cid:2) Nhận dạng tội phạm,…

Các phương pháp xác ñịnh

ñịnh trình tự ADN

(cid:2) Phương pháp hóa học (cid:2) Phương pháp enzym Sanger &

Maxam & Gilbert Sanger & cộng sự

Phương pháp giải trình t

nh tự Maxam và Gilbert

(cid:2)

vào sự thủy giải ñặc trưng của

(cid:2) Qui trình:

Phương pháp hóa học: dựa Walter Gilbert) ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert)

– Tạo ADN sợi ñơn từ ñoạn – ðánh dấu các phân tử ADN ở – Thực hiện 4 (hoặc 5) ống 1. G: + dimethyl sulphate 2. AG: + formic acid (cid:3) Adenin 2. AG: + formic acid (cid:3) Adenin 3. TC: + Hydrazine (cid:3) biế 4. C: + Hydrazine + 1,5

n ADN cần giải trình tự ADN ở một ñầu ng phản ứng riêng biệt: sulphate (cid:3) Guanine bị methyl hóa

Adenin và Guanine bị metyl hóa Adenin và Guanine bị metyl hóa ến ñổi Thymin và Cytosin 5 M NaCl (cid:3) biến ñổi Cytosin

piperidine 1M/90oC ñể cắt ADN ở liên

– Xử lý 4 ống trên với piperidine kết phosphat kế nucleotid 5. A>C: NaOH 1,2N/90oC

nucleotid bị biến ñổi

– Mỗi ống ñược nạp vào m – Kết quả ñiện di ñược ñọc

C cắt ADN ở Adenin > Cytosin

một giếng ñiện di c và biện luận (cid:3) trình tự

Phương pháp giải trình tnh tự Maxam và Gilbert

Phương pháp giải trình t

tự Sanger

(cid:2) Phương pháp enzym/dideoxy:

p enzym/dideoxy: dựa vào sự p ADN khi gặp phải dideoxy

ngừng tổng hợp ADN khi g (Frederick Sanger) nucleotid (Frederick Sanger)

(cid:2) Qui trình:

– Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng bi

ng PCR riêng biệt với 1 mồi:

1. A: có dNTP + ddATP T: có dNTP + ddTTP 2. T: có dNTP + ddTTP 3. G: có dNTP + ddGTP 4. C: có dNTP + ddCTP – Mỗi ống sản phẩm ñược – Kết quả ñiện di ñược ñọ

c nạp vào một giếng ñiện di ọc (cid:3) trình tự