Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN

Chia sẻ: Tần Mộc Phong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN - ThS. Nguyễn Thanh Tố Nhi cung cấp cho học viên những kiến thức về chiết tách ADN; các phương pháp phân tích định tính và định lượng acid nucleic; kỹ thuật cắt, nối, lai ADN và ứng dụng; các phương pháp xác định trình tự ADN; kỹ thuật PCR;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN

Phương pháp phân tích ADN 1
CHIẾT TÁCH ADN CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC CÁC KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG KỸ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN CÁC KỸ THUẬT PCR
Phương pháp chiết tách ADN
Phương pháp chiết tách ADN Nguyên tắc chung: 3 bướ ước – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học họ – Chiết tách acid nucleic:: Phenol-Chloroform Phenol loại Protein trong pha tủa, thu ADN trong pha tan – Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt tuy ñối hoặc isopropanol, …
Phương pháp chiết tách ADN Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: loại NST bằng sự khác khá nhau về cấu dạng - kích thước – ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid – Tế bào Thực vật: phá tế bào o bằng cách nghiền – Tế bào ðộng vật: phá tế bào o bằng enzym - chất tẩy
Tinh chế acid nucleic Ly tâm phân ñoạn:: acid nucleic ñược siêu ly tâm trong thang t trọng saccarose hay CsCl2 (lượng lượng acid nucleic cần tinh chế lớn Sắc ký • Lọc gel: tách acid nucleic theo kích thước phân tử ở qui mô lớn • Trao ñổi ion trên vi cột thu hồi những lượng ADN rất nhỏ • HPLC:ñối với các oligonucleotide, ñộ phân giải cao (1 nucleotid • Hấp phụ (ái lực): mARN ñược hấp phụ bằng resin có gắn oligo dT hay dU. • ðiện di gel, polyacrylamid
ðịnh tính - ñịnh lượng ng acid nucleic ðịnh lượng = Quang phổ ph kế: – Nguyên tắc: sự hấp thụ̣ mạnh của base ở λ = 260 nm – 1 ñơn vị OD260nm tương ñương nồng ñộ: 50 µg/ml dung dịch ADN (hoặc ( ARN) sợi ñôi 40 µg/ml dung dịch ARN (hoặc ( ADN) sợi ñơn 20 µg/ml oligonucleotid (tới tới 70 base) – ðộ tinh khiết: OD260/230 hoặc ho OD260/280 và OD320nm(ADN tinh khiết: 1.8 ≤ OD260/280 280 ≤ 2).
ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện tron gel – Định tính theo kích thước khi so với chuẩn – Định lượng bằng so sánh vớ ới chuẩn Nguyên tắc: ADN tích điện âm, di chuyển về cực dương Hệ gel: agarose hay acrylamide Tốc độ điện di ADN qua gel tùy thuộc vào: Kích thước ADN Cấu dạng ADN: siêu xoắn, vòng, vòng thẳng Nồng độ gel Điện thế
ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic Điện di trong trường xung (đổi hướng điện trường): ph tích ADN lớn (>50kb) ADN NST ĐV có vú kích thước lớn: thủy phân với RE trước khi phân tích
ðiện di
CẮT, NỐI, LAI ADN & ỨNG DỤNG CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN (RE) CÁC LIGASE & ỨNG DỤNG ðỂ NỐI CÁC ð0ẠN ACID NUCLEIC KỸ THUẬT LAI NUCLEOTID & ỨNG DỤNG
CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN Cấu tạo: – Enzym cắt hạn chế (restriction enzym - RE): các endonuclease cắt ADN tại hay gần một trình tự nhận diện ñặc hiệu. Chức năng – Cắt và thoái hóa các ADN ngoại lai (ví dụ ADN phage) bộ gen của vi khuẩn ñược ổn ñịnh.
CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN I & III II Hoạt tính Endonuclease Endonuclease Metyl hóa ATP Cần Không Vị trí cắt Khá xa ñiểm nhận diện Tại hoặc rất gần vị trí nhận diện Ứng dụng Ít Phổ biến trong nghiên cứu Danh pháp 3 ký tự Latin (in nghiêng) nghiêng - tên chi và loài (ký tự thứ tư ñể chỉ chủng (strain) hoặc plasmid), 1 số La mã - thứ tự phát hiện enzym. VD: BamHI: là RE của Bacillus amyloliquefaciens chủng H, ñược phát hiện ñầu tiên.
ðặc ñiểm RE loại II và các cá kiểu cắt của nó Trình tự nhận diện cắtt gồm 4-8 nucleotid, thường có kiểu palindrome (2 mạch của tt hoàn toàn giống nhau khi ñọc theo chiều 5’ – 3’), Kiểu cắt: – ðầu tù: cắt hai mạch tại tạ cùng một ñiểm – ðầu so le/dính: cắt mỗi mạch tại một ñiểm khác nhau Ứng dụng – Cắt ADN trong kỹ thuật tái tổ hợp di truyền – Phân tích ña hình cắt giớ ới hạn ñịnh danh, phân biệt
ðầu cắt của RE -AATCAGCTGTTA- -TAAGGATCCAAA- -TTAGTCGACAAT- -ATTCCTAGGTTT- Cắt với HaeIII Cắt với BamHI -AATCAG CTGTTA- -TAAG GATCCAAA- -TTAGTC GACAAT- -ATTCCTAG GTTT- Đầu tà (tù) Đầu so le (dính)
ðầu cắt của RE
Ligase - ứng dụng Là enzyme tạo liên kếtt phosphodiester giữa 3’- OH và 5’-P của hai sợii acid nucleic ADN ligase ARN ligase ðối tượng ADN ñôi ADN ñơn, ARN ADN ligase của phage T4 ADN ligase của E.coli Năng lượng ATP NAD Cơ chế Nối ñầu dính & ñầu tù Chỉ nối ñầu dính
Phản ứng nối của ligase A T C A G T C C A T C A T A G T C A G G T A G T
Lai acid nucleic (lai phân tử) Lai hóa: 2 phân tử acid nucleic sợi ñơn bắt cặp bổ sung với nhau phân tử sợi ñôi = phân tử lai = duplex Biến tính: duplex tách ra thành các sợi ñơn Phản ứng lai ñặc hiệu: bắt cặp bổ sung hoàn toàn xảy ra trên một vùng liên tục giữa hai mạch Phản ứng lai không ñặc hiệu:: một phân tử chỉ bắt cặp một phần với phân tử kia G-T-A-G-T-C-C Lai hóa G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T Biến tính T-C-A-G-G-T
Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng ðộ ñặc hiệu và ñộ bền của duplex phụ thuộc vào: – Nhiệt ñộ: quyết ñịnh ñộ bền của liên kết hydro – ðộ dài các trình tự lai: càng lớn duplex càng bền; thời gian phản ứng càng lâu. – Tỷ lệ GC trong duplex: càng cao duplex càng bền – Nồng ñộ ion: ảnh hưởng ñến ñộ bền của liên kết hydro – Nồng ñộ các phân tử (ADN) và thời gian phản ứng