Báo cáo đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Chia sẻ: Never Give Up | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:38

Thêm vào BST

Báo xấu

259
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài báo cáo đồ án tốt nghiệp "Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)" dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở KHU VỰC BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)” GVHD: Th.S Hoàng Văn Trung SVTH: Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị Nga Lớp: 51K_CNTP
MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài  Với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.  Hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới đều công nhận giá trị khoa học các loài nấm, nấm được coi là một thực phẩm chức năng, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, nguồn dược phẩm quý.  Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống. Vì vậy việc xác định axit amin trong nấm là rất cần thiết.
 Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm... Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu. 3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu xác định các axit amin trên nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng Bắc Trung Bộ.
Tuần hoàn vật chất Dược phẩm, chống lão hóa 1 6 Thực phẩm giàu dinh dưỡng 2 Ngăn ngừa, điều trị bệnh NẤM 5 Các chất 3 có hoạt tính 4 Vitamin, khoáng sinh học cao chất
1.3. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Chú thích: 1. Bình chứa dung môi pha động 2. Bộ phận khử khí 3. Bơm cao áp 4. Bộ phận tiêm mẫu 5. Cột sắc ký 6. Đầu dò 7. Hệ thống máy tính 8. Máy in
1.2. Axit amin H R _ H R O O + N C C H N C C O H O H H H H Bảng 1.1: Cấu trúc của 17 axit amin tiêu chuẩn LAlanin LArginin Axit LAspartic LCystin LHistidin LMethionin Axit LGlutamic Lisoleucin LLeucin LLysin LPhenylalanin LProlin LSerin LThrionin LTyrosin LValin LGlycin
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thu thập mẫu nấm Các mẫu Nấm Thượng hoàng, nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, nấm PL4 được thu thập từ các rừng Quốc Gia Pù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng vào 82013. Sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hình 2.1: Mẫu nấm PL1 Hình 2.2: mẫu nấm PL2 Hình 2.3: mẫu nấm PL3
Hình 2.4: Mẫu nấm PL4 Hình 2.5: Mẫu nấm Thượng hoàng 2.6: Mẫu nấm Linh Chi
2.2 Quy trình phân tích
2.3. Điều kiện chạy máy Cột sắc ký: cột C18 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5μm. Nhiệt độ cột: 450C. Tốc độ dòng: 0,5ml/phút. Pha động: Pha động A: Hỗn hợp dung môi nước và tetrahydrofuran Pha động B: Hỗn hợp dung môi nước, axetonitril và methanol theo gradient: Flow TT Time (min) A % B % (ml/min) 1 0 100 0 0,5 2 18 0 100 0,5 3 18,1 0 100 0,5 4 18,5 0 100 0,8 5 23,9 0 100 0,8 6 24 0 100 0,5 7 25 100 0 0,5
Chương trình bơm mẫu: TT Chương trình 1 Hút 5 l từ vial 10 – Đệm borate 2 Hút 1 l từ vial 11 – Dẫn suất OPA 3 Hút 0 l từ vial 12 – Nước 4 Hút 1 l từ vial chứa mẫu 5 Hút 0 l từ vial 11 – Nước 6 Trộn mẫu 7 Hút 1 l từ vial 14 – FMOC 8 Hút 0 l từ vial 12 – Nước 9 Trộn mẫu 10 Bơm mẫu
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu 3.1.1. Khảo sát nồng độ axit HCl Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm Thượng hoàng) cùng với chuẩn axit amin 25pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ : 3M; 4M; 5M; 6M; 6,5M ; 7M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi axit amin Nồng độ Axit Nồng độ (pmol) Cos TT Cs+mẫu Cmẫu H% HCl (M) amin Cs+mẫu Cmẫu (pmol) 4 Val 78,20105 58,60855 19,5925 25 78,37 6 Val 77,12652 53,83017 23,29635 25 93,19 1 7 Val 94,67967 82,07970 12,59997 25 50,40 4 Ser 70,0778 51,12522 18,95251 25 75,81 6 Ser 46,55488 37,16798 9,38690 25 93,87 2 7 Ser 80,16694 60,07444 20,09250 25 80,37 4 Gly 56,85719 43,16463 15,69256 25 62,77 6 Gly 57,20037 35,11787 22,0825 25 88,33 3 7 Gly 71,83441 59,46321 12,3712 25 49,48 4 Leu 60,70277 46,69294 14,00983 25 56,04 4 6 Leu 57,87564 38,27814 19,5975 25 78,39 7 Leu 75,05681 61,20772 14,74909 25 59,00
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl Từ đồ thị cho thấy khi nồng độ axit HCl 6M ở các axit amin đều cho hiệu suất thu hồi cao nhất. Từ nồng độ 66,5M thì hiệu suất thu hồi ổn định và các hiệu suất thu được lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị mẫu nấm Thượng hoàng và mẫu nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 25pmol tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 6M, nhiệt độ 1250C và thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau : 20h, 22h, 24h, 26h.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi Thời gian Axit Nồng độ (pmol) Cos TT Cs+mẫu Cmẫu H% (h) amin Cs+mẫu Cmẫu (pmol) 20 Met 13,89374 3,74293 10,15081 25 101,51 Met 22 46,39152 32,79879 11,59273 25 115,93 Met 1 24 31.81972 7,07722 24,74251 25 98,97 Met 26 53.60454 30,87333 22,73 25 90,92 20 Ser 173,41949 164,48299 8,93650 25 89,36 22 Ser 136.45201 113,74197 22.71003 25 90,84 24 Ser 2 46.55488 37,16798 9,38690 25 93,87 26 Ser 115,10768 104,07405 11,03318 25 110,33 20 Thr 190.99758 169,27693 21.72065 25 86.88 22 Thr 140.40317 119,86729 20.53586 25 82.14 3 24 Thr 24.48210 0,627899 23.85420 25 95.42 26 Thr 134.14618 109,49253 24.65365 25 98.61 20 Ala 157.45626 130,81709 26.63917 25 106,56 22 Ala 136.99577 114,66710 22.32867 25 89.31 24 Ala 87.02606 62,92079 24.10527 25 96.42 4 26 Ala 121,07270 111,74550 9,32720 25 93,21
Hình 3.2: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân Kết quả ở hình 3.2 cho thấy khi thời gian thủy phân lớn hơn 22h hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 24h26h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%). Vậy nên chúng tôi chọn 24h là thời gian thủy phân mẫu phân tích.
3.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol để xác định khoảng tuyến tính của các axit amin. Kết quả đo được như sau:
Bảng 3.3: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/ ) l của axit amin TT Axit Nồng Diện tích Nồng Diện tích Nồng Diện tích amin độ độ độ 1 Asp 10 918,90765 25 1710,64294 100 5496,87207 2 His 10 510,25375 25 1177,97742 100 4722,54395 3 Thr 10 948,26996 25 2164,69751 100 8251,57422 4 Tyr 10 878,52673 25 2247,63525 100 8347,11035 5 Ile 10 1316,59045 25 3005,27686 100 11251,700 6 Glu 10 570,48480 25 1088,09412 100 4358,87207 7 Ser 10 1021,77795 25 2183,39722 100 8127,51758 8 Gly 10 1089,90881 25 2269,00244 100 8475,58496 9 Ala 10 1964,74426 25 4545,54541 100 12645,000 10 Cys 10 278,71521 25 746,77118 100 2604,47350 sscys 11 Val 10 1036,72620 25 2218,25806 100 8452,68523 12 Met 10 1049,86084 25 2753,15942 100 10393,100 13 Phe 10 725,73773 25 1790,02100 100 6737,20166 14 Leu 10 1069,91785 25 2494,30664 100 9461,74219 15 Lys 10 348,24469 25 912,37457 100 3495,46118 16 pro 10 1648,60986 25 4539,64209 100 6955,32373