S, mµu tr¾ng ®ôc, låi nhµy. Vi khuÈn Clostridium Ýt mÉn c¶m víi m«i tr−êng, nhÊt lµ m«i tr−êng
thõa p, k, ca vµ cã tÝnh æn ®Þnh víi pH, nã cã thÓ ph¸t triÓn ë pH 4,5 ÷ 9, ®é Èm thÝch hîp 60 -
80%, nhiÖt ®é 25 - 30oC. Vi khuÈn Clostridium ®ång ho¸ tèt tÊt c¶ c¸c nguån thøc ¨n nit¬ v« c¬
vµ h÷u c¬, cø 1 gam ®−êng gluco th× ®ång ho¸ ®−îc 5 - 12 mgN.
Vi khuÈn Clostridium cã rÊt nhiÒu loµi kh¸c nhau: Clostridium butyrium; Clostridium
beijerinskii; Clostridium pectinovorum...
2.2. Qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö céng sinh
Lµ qu¸ tr×nh ®ång hãa nit¬ trong kh«ng khÝ d−íi t¸c dông cña c¸c loµi vi sinh vËt céng sinh
víi c©y bé ®Ëu cã ho¹t tÝnh Nitrozenaza.
Mèi quan hÖ ®Æc biÖt nµy ®−îc gäi lµ mèi quan hÖ céng sinh, trong tù nhiªn th−êng gÆp
nhiÒu mèi quan hÖ céng sinh kh¸c nhau nh−: Mèi céng sinh gi÷a nÊm vµ t¶o (®Þa y); mèi quan hÖ
gi÷a vi khuÈn nèt sÇn víi c©y hä ®Ëu...
Tõ xa x−a con ng−êi ®· biÕt ¸p dông nh÷ng quy luËt tÊt yÕu nµy vµo trong s¶n xuÊt, hä ®·
biÕt trång lu©n canh hoÆc xen canh gi÷a c©y hä ®Ëu víi c©y hoµ th¶o ®Ó thu ®−îc n¨ng suÊt c©y
trång cao vµ båi bæ ®é ph× cho ®Êt.
N¨m 372 - 287 tr−íc C«ng nguyªn, nhµ triÕt häc cæ Hy L¹p (theo Pharates) trong tËp “Nh÷ng
quan s¸t vÒ c©y cèi” ®· coi c©y hä ®Ëu nh− vËt båi bæ l¹i søc lùc cho ®Êt. ë ViÖt Nam, trong cuèn
“V©n ®µi lo¹i ng÷” (1773) Lª Quý §«n ®· ®Ò cËp ®Õn phÐp lµm ruéng: “Thø nhÊt lµ trång ®Ëu
xanh thø hai lµ trång ®Ëu nhá vµ võng”.
N¨m 1886, Hellriegel vµ Uynfac ®· kh¸m ph¸ ra b¶n chÊt cña qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö.
Hä ®· chøng minh ®−îc kh¶ n¨ng cña c©y hä ®Ëu lÊy ®−îc nit¬ khÝ quyÓn lµ nhê vi khuÈn nèt sÇn
(VKNS) sèng ë vïng rÔ c©y hä ®Ëu. Hä ®Æt tªn cho loµi VSV nµy lµ Bacillus radicicola. N¨m
1889, Pramovskii ®· ®æi tªn VSV nµy lµ Bacterium radicicola. Cuèi n¨m 1889 Frank ®Ò nghÞ ®æi
tªn lµ Rhizobium.
Vi khuÈn Rhizobium lµ lo¹i trùc khuÈn gram ©m kh«ng sinh nha bµo, h¶o khÝ. KÝch th−íc tÕ
bµo dao ®éng 0,5 ÷1,2 x 2,0 ÷ 3,5 µm, khuÈn l¹c thuéc nhãm S, nhµy låi, mµu tr¾ng trong hoÆc
tr¾ng ®ôc, kÝch th−íc khuÈn l¹c dao ®éng 2,3 ÷ 4,5 mm sau mét tuÇn nu«i trªn m«i tr−êng th¹ch
b»ng. Vi khuÈn Rhizobium cã tiªn mao, cã kh¶ n¨ng di ®éng ®−îc, chóng thÝch hîp ë pH tõ 6,5 ÷
7,5, nhiÖt ®é 25 - 28oC, ®é Èm 50 ÷ 70%. Khi giµ cã mét sè loµi t¹o ®−îc nang x¸c, khuÈn l¹c sÏ
chuyÓn sang mµu n©u nh¹t. Vi khuÈn Rhizobium gåm nhiÒu loµi kh¸c nhau: Rh. leguminosarum;
Rh. phaseoli; Rh. trifolii; Rh. lupini; Rh. japonicum; Rh. meliloti; Rh. cicer; Rh. simplese; Rh.
vigna; Rh. robinii; Rh. lotus...
HiÖn nay ng−êi ta t¹m chia VKNS thµnh 4 nhãm lín:
+ Sinorhizobiumfredy lµ nh÷ng loµi mµ trong ho¹t ®éng sèng cña chóng s¶n sinh ra axit, hay
lµ chóng lµm axit hãa m«i tr−êng.
+ Bradyrhizobium lµ nh÷ng loµi mµ trong ho¹t ®éng sèng cña chóng s¶n sinh ra chÊt kiÒm,
hay lµ chóng lµm kiÒm hãa m«i tr−êng.
+ Agrobacterium vµ Phyllobacterium, hai gièng nµy lµ VKNS nh−ng kh«ng céng sinh ë c©y
hä ®Ëu, mµ céng sinh ë rÔ-th©n-kÏ l¸ c©y rõng vµ nh÷ng c©y thuû h¶i s¶n. Hai gièng nµy kh«ng
cã ý nghÜa nhiÒu trong n«ng nhiÖp.
2.3. C¸c VSV cè ®Þnh nit¬ ph©n tö kh¸c
Ngoµi nh÷ng gièng VSV cè ®Þnh nit¬ ph©n tö nãi trªn, cßn v« sè nh÷ng gièng kh¸c ®Òu cã
kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ ph©n tö, chóng cã nhiÒu ý nghÜa trong s¶n xuÊt n«ng l©m, ng− nghiÖp.
* Vi khuÈn:
+ Nhãm vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ ph©n tö h¶o khÝ: Azotomonas insolita; Azotomonas
fluorescens; Pseudomonas azotogenis; Azospirillum...
+ Nhãm vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ ph©n tö h¶o khÝ kh«ng b¾t buéc: Klebsiella pneumoniae;
Aerobacter aerogenes...
+ Nhãm vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ ph©n tö kþ khÝ quang hîp: Rhodospirillum rubrum;
Chromatium sp.; Chlorobium sp.; Rhodomicribium sp.,...
+ Nhãm vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ ph©n tö kþ khÝ kh«ng quang hîp: Desulfovibrio
desulfuricans; Methanobacterium sp.
* X¹ khuÈn: Mét sè loµi thuéc gièng: Streptomyces; Actinomyces; Frankia; Nocardia;
Actinopolyspora; Actinosynoema...
* NÊm: Thodotorula...
* T¶o - Vi khuÈn lam: Glococapsa sp.; Lyngbyaps; Plectonema; Boyryanum; Anabaena
azollae; Anabaena ambigua; Anabaena cycadae; Anabaena cylindrica; Anabaena fartilissima;
Calothrix brevissima; Calothrix elenkii; Nostoccaloicola commune; Nostoccaloicola cycadae;
Nostoccaloicola entophytum; Nostoccaloicola muscorum; Nostoccaloicola paludosum...
H×nh 4: H×nh th¸i cña mét sè chñng gièng vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ ph©n tö
3. C¬ chÕ cña qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö
Trong mét thêi gian dµi, c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö lµ mét bÝ Èn ®Çy hÊp dÉn
cña tù nhiªn.Trong khi con ng−êi ph¶i sö dông nh÷ng ®iÒu kiÖn kü thuËt rÊt cao, rÊt tèn kÐm (400
÷500oC, 200 ÷ 1000atm víi nh÷ng chÊt xóc t¸c rÊt ®¾t tiÒn) ®Ó ph¸ vì mèi liªn kÕt 3 cña ph©n tö
nit¬ ®Ó cã ph©n ®¹m ho¸ häc, b»ng c¸ch tæng hîp tõ:
NH3 + CO2 CO(NH
xóc t¸c
⎯⎯⎯→2)2
Trong khi ®ã VSV víi sù trî gióp cña ho¹t tÝnh Nitrogenaza l¹i ph¸ vì mèi liªn kÕt 3 cña
ph©n tö nit¬ mét c¸ch dÔ dµng ngay trong ®iÒu kiÖn rÊt b×nh th−êng vÒ nhiÖt ®é vµ ¸p suÊt. Ph©n
tö nit¬ cã n¨ng l−îng lµ 9,4 x 105 J/mol.
Cã thÓ nãi qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö lµ qu¸ tr×nh khö N2 thµnh NH3 cã xóc t¸c cña
enzyme nitrogenaza, khi cã mÆt cña ATP.
N2 + AH2 + ATP nitro
g
enaza
⎯⎯⎯⎯⎯→ NH3 + A + ADP + P
(AH2 lµ chÊt cho electron).
N¨m 1992 c¸c nhµ khoa häc ®· hoµn thiÖn ®−îc c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh cè ®Þnh nit¬ ph©n tö
nh− sau:
N = N → NH = NH → H2N - NH2 → NH3
N2 + 8H+ + 8e- +16 Mg.ATP +16O nitro
g
enaza
⎯⎯⎯⎯⎯→ 2NH3 + H2 + 16 Mg.ADP +16 P.
Nitrogenaza ®−îc cÊu t¹o bëi hai phÇn:
- Fe - protein cã träng l−¬ng ph©n tö l−îng kho¶ng 6. 104.
- Mo- F e - protein cã träng l−îng ph©n tö l−îng kho¶ng 2,2. 105.
4. Ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ ph©n tö (®¹m sinh häc)
Vµi thËp kû nay, ë ViÖt Nam chÕ phÈm VSV vµ ph©n VSV cè ®Þnh nit¬ ®· ®−îc nhiÒu
ng−êi d©n biÕt ®Õn, nh÷ng lo¹i chÕ phÈm nµy ®· thùc sù gãp phÇn lµm t¨ng n¨ng suÊt c©y trång
vµ t¨ng chÊt l−îng n«ng s¶n vµ thóc ®Èy ph¸t triÓn nÒn n«ng nghiÖp bÒn v÷ng ë n−íc ta.
4.1. §Þnh nghÜa
Ph©n bãn vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ (Biological nitrogen fixing fertilzer) (tªn th−êng gäi: ph©n
vi sinh vËt cè ®Þnh ®¹m, ph©n ®¹m vi sinh) lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt
sèng (tù do, héi sinh, céng sinh, kþ khÝ hoÆc hiÕu khÝ) ®· ®−îc tuyÓn chän víi mËt ®é ®¹t tiªu
chuÈn hiÖn hµnh, cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ cung cÊp c¸c hîp chÊt chøa nit¬ cho ®Êt vµ c©y trång;
t¹o ®iÒu kiÖn n©ng cao n¨ng suÊt c©y trång vµ (hoÆc) chÊt l−îng n«ng s¶n, t¨ng ®é mµu mì cña ®Êt.
Ph©n bãn vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ kh«ng g©y ¶nh h−ëng xÊu ®Õn ng−êi, ®éng thùc vËt, m«i tr−êng
sinh th¸i vµ chÊt l−îng n«ng s¶n.
4.2. Quy tr×nh s¶n xuÊt
4.2.1. Ph©n lËp tuyÓn chän chñng VSVC§N
Muèn cã chÕ phÈm VSVC§N tèt ph¶i cã chñng VSV cã c−êng ®é cè ®Þnh nit¬ cao, søc c¹nh
tranh lín, thÝch øng ë pH réng, ph¸t huy ®−îc ë nhiÒu vïng sinh th¸i kh¸c nhau. V× vËy c«ng t¸c
ph©n lËp tuyÓn chän chñng VSVC§N vµ ®¸nh gi¸ ®Æc tÝnh sinh häc cña c¸c chñng khuÈn lµ viÖc
lµm kh«ng thÓ thiÕu ®−îc trong quy tr×nh s¶n xuÊt chÕ phÈm VSVC§N.
Th«ng th−êng ®¸nh gi¸ mét sè chØ tiªu sau: Thêi gian mäc; kÝch th−íc khuÈn l¹c vµ kÝch
th−íc tÕ bµo VSV; ®iÒu kiÖn sinh tr−ëng ph¸t triÓn (nhu cÇu dinh d−ìng, nhu cÇu oxy, pH vµ
nhiÖt ®é thÝch hîp); kh¶ n¨ng c¹nh tranh vµ c−êng ®é cè ®Þnh nit¬ ph©n tö. Chñng gièng vi sinh
vËt sau khi tuyÓn chän ®−îc b¶o qu¶n phï hîp víi yªu cÇu cña tõng loµi vµ sö dông cho s¶n xuÊt
chÕ phÈm d−íi d¹ng chñng gièng gèc. Quy tr×nh s¶n xuÊt chÕ phÈm VSVC§N ®−îc tãm t¾t trong
(h×nh 5).
4.2.2. Nh©n sinh khèi
Tõ chñng vi sinh vËt tuyÓn chän ng−êi ta tiÕn hµnh nh©n sinh khèi vi sinh vËt theo ph−¬ng
ph¸p lªn men ch×m hoÆc lªn men xèp. Sinh khèi vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ ®−îc nh©n qua cÊp 1, 2,
3 trong c¸c ®iÒu kiÖn phï hîp víi tõng chñng lo¹i vi sinh vËt vµ môc ®Ých s¶n xuÊt. C¸c s¶n phÈm
ph©n vi sinh vËt s¶n xuÊt tõ vi khuÈn ®−îc t¹o ra chñ yÕu b»ng ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m
(Submerged culture). C¸c c«ng ®o¹n chÝnh trong s¶n xuÊt ®−îc tãm t¾t theo s¬ ®å 1. Trong s¶n
xuÊt c«ng nghiÖp m«i tr−êng dinh d−ìng chuÈn kh«ng ®−îc sö dông v× gi¸ thµnh qu¸ cao. C¸c
nhµ s¶n xuÊt ®· ph¶i t×m m«i tr−êng thay thÕ tõ c¸c nguån vËt liÖu s½n cã ®ã lµ: Tinh bét ng«,
s¾n, rØ mËt, n−íc chiÕt ng«, thay cho nguån dinh d−ìng cacbon, n−íc chiÕt men, n−íc chiÕt ®Ëu
t−¬ng, amoniac thay cho nguån dinh d−ìng nit¬. Walter thuéc c«ng ty W.R. Grace (Hoa Kú)
(1996) ®· tæng kÕt ®−îc mét sè m«i tr−êng tæng hîp trong s¶n xuÊt ph©n vi sinh vËt tõ vi khuÈn.
Thµnh phÇn m«i tr−êng phï hîp víi tõng ®èi t−îng vi khuÈn ®−îc tr×nh bµy trong (b¶ng 3).
Trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt viÖc kiÓm tra vµ ®iÒu chØnh c¸c yÕu tè m«i tr−êng (pH, liÒu l−îng,
tèc ®é khÝ, ¸p suÊt, nhiÖt ®é...) lµ hÕt søc cÇn thiÕt. C¸c yÕu tè nµy theo Walter (1996) nªn ®−îc
®iÒu chØnh tù ®éng. C¸c hÖ thèng lªn men hiÖn nay ®· ®−îc trang bÞ hiÖn ®¹i cã c«ng suÊt tõ hµng
chôc ®Õn hµng tr¨m ngµn lÝt.
Trªn c¬ së nghiªn cøu, kh¶o s¸t t×nh h×nh thùc tÕ ë mét sè quèc gia gÇn ®©y, ViÖn cè ®Þnh
nit¬ sinh häc (NifTAL - Hoa Kú) vµ Trung t©m cè ®Þnh nit¬ (óc) ®· nghiªn cøu vµ chÕ t¹o thµnh
c«ng nåi lªn men ®¬n gi¶n ®Ó t¹o ra sinh khèi vi khuÈn cã thÓ sö dông trong ®iÒu kiÖn b¸n c«ng
nghiÖp ë c¸c n−íc ph¸t triÓn. Nåi lªn men ®¬n gi¶n kiÓu nµy ®ang ®−îc sö dông t¹i Th¸i Lan, Ên
§é vµ mét sè quèc gia kh¸c trong ®ã cã ViÖt Nam.
4.2.3. Xö lý sinh khèi, t¹o s¶n phÈm
Sinh khèi vi sinh vËt ®−îc phèi trén víi chÊt mang v« trïng (hoÆc kh«ng v« trïng) ®Ó t¹o ra
chÕ phÈm trªn nÒn chÊt mang v« trïng (hoÆc kh«ng v« trïng), hay ®−îc bæ sung c¸c chÊt phô gia,
chÊt dinh d−ìng, b¶o qu¶n ®Ó t¹o ra chÕ phÈm d¹ng láng hoÆc c« ®Æc, lµm kh« ®Ó t¹o ra chÕ phÈm d¹ng
®«ng kh« hoÆc kh«.
ChÊt mang
Phèi trén
ChÕ phÈm trªn nÒn
chÊt mang
Gièng gèc ChuÈn bÞ m«i tr−êng
lªn men cÊp 1
CÊy gièng
Lªn men cÊp 1 ChuÈn bÞ m«i tr−êng
lªn men cÊp 2
Lªn men cÊp 2
Sinh khèi vi sinh vËt KiÓm tra
Xö lý ChÕ phÈm d¹ng láng