intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Đồ án tốt nghiệp: Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16S rDNA trong xác định loại bằng phương pháp DGGE

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:95

Thêm vào BST
Báo xấu
36
lượt xem 6
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm ly trích và thu nhận DNA genomic từ mẫu vi khuẩn đã phân lập trong quá trình trồng ủ rơm; xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR của đoạn gene 16S rNDA dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. Trình tự cặp mồi 27F 5‘-GA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3‘, 1492R 5'-GG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3'... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16S rDNA trong xác định loại bằng phương pháp DGGE

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH ĐOẠN GENE 16S rDNA TRONG XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DGGE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh CN Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện : Hà Trầm Xuân MSSV: 0851110305 Lớp: 08DSH6 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ .................................................. vi DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... vii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................5 1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật ..................................................................... 5 1.2. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic .................................. 5 1.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong môi trường tự nhiên .............................................................................................................. 5 1.2.2. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch nuôi cấy. .................................................................................................................................. 7 1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR............................................................ 7 1.3.1. Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid. ....... 7 1.3.2. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh vật. .................................................................................................................................... 7 1.3.3. Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng. .................................................................................................. 9 1.3.4. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự. ................................................................................................................. 9 1.3.5. Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truyền. .................................................................................................................................. 10 1.4. Phương pháp DGGE và ứng dụng ............................................................... 10 1.5. Định danh nhóm vi khuẩn ........................................................................... 12 i
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống................................................ 12 1.5.2. Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử. .................................... 14 1.6. Xây dựng cây phát sinh loài chủng loài......................................................... 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................20 2.1. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................... 20 2.2. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................... 20 2.3. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 22 2.4. Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của từng chủng vi khuẩn. ...................................................................................................... 23 2.4.1. Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt. ....................... 24 2.4.2. Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA genomic trong mẫu sau khi ly trích. .................................................................................................................................. 26 2.4.3. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR. ............................................................................................................................. 27 2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng QIAGEN Kit.............................................. 28 2.4.5. Quy trình Applied Biosystems.......................................................................... 30 2.4.6. Xác định thành phần của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE. ................................................................................................................................... 32 2.5. Sử dụng phần mềm tin sinh học .................................................................... 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................37 3.1. Kết quả tăng sinh và kiểm tra hình thái tế bào của 9 chủng vi khuẩn. .......... 37 3.2. Kết quả ly trích DNA genomic bằng nhiệt của 9 chủng vi khuẩn. ................. 42 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. ............. 42 3.4. Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit.......................... 43 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn. ................ 44 ii
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài ................................................... 54 3.7. Kết quả khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE ................................. 56 3.8. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN .................................. 57 3.9. Kết quả vùng V3 trên gel polyacrylamide của 9 chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE. ............................................................................................. 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ............................................................59 4.1. Kết luận ........................................................................................................... 59 4.2. Kiến nghị......................................................................................................... 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61 PHỤ LỤC ...................................................................................................................1 iii
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyl – trimetyl – ammomiumbromide DNA Deoxyribonucleic acid DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid EtBr Ethidium bromide PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulfate RNA Ribonucleic acid TAE Tris – Acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris – EDTA UV Ultra Violet iv
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn ................................................................................ 20 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl ................................ 27 Bảng 2.3: Thành phần Big – Dye Reaction mồi xuôi 27F ...................................... 30 Bảng 2.4: Thành phần Big – Dye Reaction mồi ngược 1492R .............................. 30 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của DGGE ............................................................................................... 32 Bảng 2.6: Nồng độ pha gel polyacrylamide ........................................................... 34 Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn gel polyacrylamide vào hai xilanh ................................. 34 Bảng 3.1: Kết quả quan sát hình thái học của 9 chủng vi khuẩn. ........................... 37 Bảng 3.2: Kết quả soi dưới kính hiển vi 100X của 9 chủng vi khuẩn .................... 39 v
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn. .................................................................................................. 23 Sơ đồ 2.2: Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt ...................... 25 Sơ đồ 3.3: Kiểm tra DNA genomics sau khi ly trích ................................................ 26 Sơ đồ 3.4: Quy trình tinh sạch DNA sau khi chạy PCR ........................................... 29 Sơ đồ 3.5: Quy trình Applied Biosystems ................................................................ 31 vi
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Hệ thống thiết bị chạy DGGE. ................................................................. 36 Hình 3.1: Kết quả tăng sinh của 9 chủng vi khuẩn. Đó là các chủng A, B, C, D, E, F, G, H và K. ................................................................................. 41 Hình 3.2: Kết quả thu nhận DNA genomic của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1%.. ............................................................................................. 42 Hình 3.3: Kết quả thu nhận đoạn gene 16S rDNA khi chạy PCR trên gel agarose 1% ............................................................................................... 43 Hình 3.4: Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit trên gel agarose 1%. .............................................................................................. 44 Hình 3.5a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng A .................................................................................................... 45 Hình 3.5b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng A. ................................................................................................... 45 Hình 3.6a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng B .................................................................................................... 46 Hình 3.6b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng B .................................................................................................... 46 Hình 3.7a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng C .................................................................................................... 47 Hình 3.7b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng C .................................................................................................... 47 vii
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng D .................................................................................................... 48 Hình 3.8b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng D .................................................................................................... 48 Hình 3.9a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng E .................................................................................................... 49 Hình 3.9b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng E. ................................................................................................... 49 Hình 3.10a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng F. ................................................................................................... 50 Hình 3.10b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng F. ................................................................................................... 50 Hình 3.11a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng G. ................................................................................................... 51 Hình 3.11b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng G. ................................................................................................... 51 Hình 3.12a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng H. ................................................................................................... 52 Hình 3.12b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng H .................................................................................................... 52 Hình 3.13a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng K .................................................................................................... 53 Hình 3.13b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng K ................................................................................................... 53 viii
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.14: Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của 8 chủng khảo sát (chủng E, F, G, H, K) so với dữ liệu của ngân hàng gene. ...................... 55 Hình 3.15: Kết quả khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% ....................................................... 56 Hình 3.16: Kết quả chạy DGGE vùng V3 trên gel acrylamide biến tính .................. 57 ix
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc phân lập và định danh vi khuẩn có tầm quan trọng rất lớn trong các nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật như: môi trường, công nghiệp, y tế, nông nghiệp và sinh thái vi sinh vật. Trước đây công tác phân loại vi sinh vật cơ bản dựa vào các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa sinh của vi sinh vật: nhuộm, hình thái tế bào, bào tử, khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng lên men, sinh acid trong môi trường nuôi cấy cũng như các sắc tố được tạo thành v.v…Các đặc trưng này phần lớn đã định danh sơ bộ các họ và chi của vi sinh vật. Tuy nhiên, để định danh cụ thể và đạt độ chính xác cao về từng loài vi sinh vật thì cần phải kết hợp với phương pháp sinh học phân tử - một phương pháp định danh nhanh chóng và có độ tin cậy. Mỗi phương pháp có thể cho phép khẳng định tới một mức độ nhất định nào đó của hệ thống phân loại như: đến loài, dưới loài và một vài phương pháp có thể khẳng định đến cấp độ giống hay dòng. Các phương pháp định danh dựa trên nền tảng là DNA đang được sử dụng rộng rãi do độ tin cậy cao, đơn giản và rẻ tiền để xác định và phân loại vi khuẩn. Trong thực tế, sự phân biệt giữa giống và loài được thực hiện theo phương pháp lai DNA-DNA (Wayne and al., 1987). Hiện nay, dựa trên kỹ thuật phân tích trình tự đoạn gen16S rDNA ngày càng phát hiện ra loài mới (Woese.,1987; Stackebrandt và Goebel.,1994). Và một trong các phương pháp thường được dùng để định danh vi khuẩn gọi là kỹ thuật dấu vân tay di truyền Rep- PCR, hay Rep-PCR genomic fingerprinting, kỹ thuật này dựa trên nền tảng của sự khuếch đại DNA. Với kỹ thuật này cho kết quả nhanh chóng, hiệu quả và đạt độ tin cậy cao (Versalovicand et al., 1994; Louws et al., 1996). 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Thế giới Qui trình Rep-PCR genomic fingerprinting do nhóm nghiên cứu của tiến sĩ JR Lupski trường Baylor College of Medicine (Houston, Texas) phát triển và đã được 1
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ứng dụng trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học, xác định và phân loại vi khuẩn, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử của con người và bệnh cây. Và một trong những thành tựu lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử là công trình giải mã trình tự bộ gene người được công bố bản phát thảo vào năm 2000 và hoàn thiện vào năm 2003. Ứng dụng thành công của PCR là đã xác định tính đa dạng tập đoàn vi khuẩn trong quá trình xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở quy mô nhỏ hiện trường của Cộng hòa Liên bang Đức tại trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Helmholtz (GBF). 2.2. Trong nước Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử được quan tâm rất nhiều ở nước ta, thành tựu tiêu biểu nhất là kỹ thuật sinh học phân tử trong chuẩn đoán bất thường phôi thai. Đây được xem là thành tựu mang tính tiên phong trong việc hạn chế trẻ sơ sinh bất thường, góp phần nâng cao chất lượng dân số. Ứng dụng này sử dụng kỹ thuật QF-PCR trong việc chẩn đoán hội chứng Down và các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể,triển khai các chuẩn đoán di truyền cho các bệnh phổ biến khác như bệnh Hemophilia, giải trình tự DNA, chuẩn đoán đột biến gen AZF gây hiếm muộn, chuẩn đoán nhiễm CMV và Rubella thai kỳ. Một số thành công gần đây của kỹ thuật sinh hoc phân tử là ứng dụng PCR với giải trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mũ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn, xác định một số loài sâm thuộc chi PANAX, trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí, phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản. Và ứng dụng trong xây dựng lý lịch 16S rDNA của các chủng vi khuẩn dung trong kiểm chuẩn, làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn… 3. Mục đích nghiên cứu  Ly trích và thu nhận DNA genomic từ mẫu vi khuẩn đã phân lập trong quá trình trồng ủ rơm. 2
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR của đoạn gene 16S rNDA dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. Trình tự cặp mồi 27F 5‘-GA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3‘, 1492R 5'-GG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3'  Tiến hành tinh sạch đoạn gene 16S rDNA và giải mã trình tự đoạn gene này.  Kiểm tra độ tinh sạch của đoan gene 16s rDNA bằng phương pháp DGGE trong xác định loài. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu  Ly trích và thu nhận DNA genomic trực tiếp từ chủng vi khuẩn đã phân lập trong quá trình ủ rơm.  Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose.  Tinh sạch sản phẩm PCR và giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn xem chúng có thuần hay không.  Nếu mẫu không thuần thì khuếch đại vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel acrylamide biến tính.  Kiểm tra nồng độ DNA và tiến hành chạy DGGE để cho kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA được chính xác. 5. Phương pháp nghiên cứu  Ly trích và thu nhận DNA genomic bằng quy trình nhiệt.  Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR.  Tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit.  Giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA bằng quy trình Applied Biosystems  Khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE để kiểm tra độ nhiễm DNA. 6. Kết quả nghiên cứu  Ly trích và thu nhận DNA genomic của chủng vi khuẩn 3
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Xác định được mỗi chủng vi khuẩn dựa vào sự khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR.  Giải mã trình tự được đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn.  Xác định được chủng vi khuẩn của vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE.  Kiểm tra được nồng độ DNA và độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA trong quá trình xác định loài. 7. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:  Chương 1: Tổng quan.  Chương 2: Vật liệu và phương pháp.  Chương 3: Kết quả và thảo luận.  Chương 4: Kết luận và kiến nghị. 4
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật Vi sinh vật (microorganisms) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thái nhỏ bé nuốn thấy được mà phải dùng dưới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc nhiều giới (kingdom) sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có thể có chung những đặc điểm vể kích thước, sinh lí, sinh hóa.. Khoa học phát triển thì vai trò của vi sinh vật được ứng dụng càng nhiều trong sản xuất và đời sống, nó mang lại hiệu quả lớn. Ví dụ như việc chế vaccine phòng bệnh, sản xuất chất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác…Đặc biệt trong bảo vệ môi trường, người ta đã sử dụng vi sinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại. Sử dụng vi sinh vật trong việc tạo chế phẩm sinh học, phân bón sinh học và thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường bảo vệ sự cân bằng sinh thái. Trong thiên nhiên ngoài những nhóm vi sinh vật có ích như trên, còn có những nhóm vi sinh vật gây hại. Ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người, động vật và thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất, không khí…Nếu nắm vững cơ sở sinh học của tất cả các quá trình có lợi hay có hại trên thì sẽ có những biện pháp khoa học để phát huy những mặt có lợi và hạn chế những mặt gây hại của vi sinh vật, đặc biệt trong bảo vệ môi trường xung quanh ta sống. 1.2. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic 1.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong môi trường tự nhiên Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc tập đoàn vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá 5
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thông qua việc xác định bởi tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. [14] Sự ra đời kỹ thuật dựa trên phân tử nucleic acid đã dẫn đến sự thay đổi lớn trong phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi sinh vật cộng đồng trong tự nhiên. Mặc dù các phương pháp trong kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic này đã phá vỡ những hạn chế trong việc chọn lọc và tính chất đặc trưng trong việc ly trích DNA. Sự phục hồi tính đa dạng của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của việc ly trích DNA từ đất (Laurent et al. 2001). Độ tinh khiết của DNA từ đất và compost thường không đạt yêu cầu, đặc biệt trong trường hợp đất giàu hợp chất humic (Courtois et al. 2001). Sự hiện diện của hợp chất humic trong môi trường tự nhiên sẽ cản trở sự phát hiện DNA, đo lường và tinh sạch (Chu et al. 1996). Vì vậy lựa chọn các phương pháp ly trích và tinh sạch là rất quan trọng cho DNA của vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16]  Một số phương pháp trích ly DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên:  Phương pháp SDS (Sodium docetyl sulfate): đây được xem là phương pháp thích hợp nhất cho việc ly trích DNA của vi sinh vật. Đặc biệt là ly trích DNA từ đất vùng rễ nơi mà tập trung nhiều cộng đồng vi sinh vật. Sử dụng phương pháp SDS có thể loại bỏ các hợp chất Humic có trong đất, 1 hợp chất gây cản trở phát hiện DNA. [16]  Phương pháp CTAB (Cety- trimetyl- anmoniumbromide): Đây là phương pháp trong chiết suất acid nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. CTAB là dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. [16]  Phương pháp PVP (polyvinylpolypyrrolidone): Đây là phương pháp tách chiết acid nucleic hiệu quả. Trong thành phần dung dịch đệm ly trích có sử dụng chất PVP, nó đóng vai trò ràng buộc các tạp chất có trong đất và loại bỏ chúng giúp ly trích DNA dễ dàng hơn. [16] 6
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Phương pháp đóng băng và tan băng: Đây là phương pháp dùng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở nhiệt độ -650C trong 3 chu trình nhằm phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16] 1.2.2. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch nuôi cấy Để ly trích DNA tổng số từ dịch nuôi cấy vi sinh vật, có thể áp dụng nhiều quy trình khác nhau, nhưng trong bài báo cáo này sử dụng quy trình ly trích DNA genomic bằng nhiệt. Sau khi ly trích, DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 110V trong 45 phút và đo Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch. Phương pháp này sử dụng nhiệt để làm biến tính DNA. Do ở nhiệt độ cao (94- 950C) thì DNA mạch đôi được phân tách thành hai DNA mạch đơn. Điều này này giúp cho việc ly trích DNA đạt hiệu quả cao nhất. 1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR 1.3.1. Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide. Phương pháp này chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước và ứng dụng chủ yếu là nhẳm phát hiện nhanh một đột biến điểm. Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự được khuếch đại bằng phương pháp PCR. Sau đó, hai mạch của phân tử được tách rời nhau. Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi. Phản ứng tổng hợp xảy ra tương tự trong các phương pháp enzyme hay sử dụng dideoxynucleotide. 1.3.2. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh vật Ngày nay phương pháp PCR ngày càng có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Hiện nay trong nghiên cứu để xác định loài vi sinh vật thì phương pháp PCR đóng vai trò vô cùng quan trọng vì có độ nhạy rất cao, thao tác cũng rất đơn giản. Phương pháp PCR được xem là bước khởi đầu của 7
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP các nghiên cứu tiếp theo. Chính vì vậy phương pháp này càng được các nhà khoa học sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khoa học. Để xác định loài vi sinh vật thì điều đầu tiên là phải chọn được đại phân tử phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA. Để có thể giải trình tự các đoạn gene mong thi muốn, thì phải khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR. Từ đó người ta nghiên cứu về các trình tự DNA để thiết lập cây phát sinh chủng loại từ các phân tử này. Tiến hành PCR khuếch đại những đoạn gene đặc trưng của các loài vi sinh vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trưng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng xác định được chúng. Sử dụng phương pháp PCR để xác định giống Lactobacillus được thực hiện thông qua việc sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm: Lac 1 và Lac 2, trình tự các cặp mồi này như sau:  Lac 1: 5’ – AGC AGT AGG GAA TCT TCC A – 3’  Lac 2: 5’ – ATT CCA CCG CTA CAC ATG – 3’ Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA được thực hiện với hai mổi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm Lac 3 và Lac 4, trình tự các mồi như sau:  Lac 3: 5’ – GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG – 3’  Lac 4: 5’ – CAC CGC TAC ACA TGG AG – 3’ Sử dụng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA và đoạn gene ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men. Các cặp mồi được sử dụng khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA, ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men. Trình tự cặp mồi NL và ITS  Cặp NL: NL 4 5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG – 3’ NL 4 5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G – 3’  Cặp ITS: ITS1 5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’ ITS4 5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’ 8
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phương pháp PCR là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc xác định loài vi sinh vật. Đối với loài vi sinh vật cũng vậy, người ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại những đoạn gene của vi khuẩn. Kết quả thu được từ những phản ứng PCR là thu nhận những đoạn gene với kích thước như mong muốn. Mỗi loài vi khuẩn đều có những cặp mồi chuyên biệt. Dựa trên những cặp mồi chuyên biệt này kết hợp với những yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR thì việc xác định loài vi khuẩn trở nên đơn giản hơn. Trên thực tế người ta muốn xác định loại vi khuẩn thì không thường thì người ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn với những cặp mồi chuyên biệt. 1.3.3. Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản ứng để sau đó phát hiện chúng, do vậy PCR nay đang trở thành một công cụ chẩn đoán nhạy cảm nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp, để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau. 1.3.4. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự Nhờ có công cụ PCR trong kỹ thuật giải trình tự gene mà các nhà khoa học có thể hoàn tất được công trình giải mã bộ gene người sớm hơn dự định trên 10 năm và từ kết quả của công trình trình này, nhiều cánh cửa mới của y sinh học đã được mở với vô vàn các ứng dụng đầy triển vọng trong công nghệ dược phẩm protein, trong sinh-tin học (bio-informatic), trong chẩn đoán bệnh bằng các gen-chip. Lý do để nói PCR là đòn bẩy để thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự là vì nhờ có PCR mà các nhà khoa học đã thay đổi được phản ứng giải trình tự trong phương pháp giải trình tự với hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều và nhạy hơn rất nhiều. Ngoài ra, cũng nhờ có PCR mà các sản phẩm giải trình tự sẽ được nhân bản thành nhiều bản sao 9
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đồng nhất về chiều dài và trình tự, do vậy mà sẽ có được kết quả giải trình tự chính xác hơn. Với PCR kết hợp giải trình tự, nhà nghiên cứu có thể giải trình tự trọn vẹn DNA hay RNA bộ gene của virus gây bệnh có trong mẫu thử mà không cần phải nuôi cấy được virus này vào tế bào bằng cách thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng đoạn trên bộ gene mà các đoạn này có trình tự ở hai đầu trùng lắp nhau, rồi dung PCR để khuếch đại các đoạn DNA này lên. Giải trình tự các sản phẩm PCR này, cuối cùng so chuỗi để tìm những trình tự trùng lắp làm cơ sở để lắp ghép nối các đoạn trình tự đã giải được với nhau thành trình tự DNA bộ gene hoàn chỉnh. 1.3.5. Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truyền Có thể nói PCR là một công cụ duy nhất hữu hiệu trong phát hiện và sàng lọc bệnh di truyền do sự biến gen ở mức độ phân tử mà các phương tiện di truyền tế bào không thể phát hiện được. Không chỉ vậy, PCR còn là một công cụ hữu hiệu để sàng lọc trước sanh các bệnh di truyền qua sự phát hiện các biến đổi gene ở mức độ phân tử về mặt cấu trúc, ví dụ Thalassemia, Duchene… hay về số lượng như bệnh lý tam thể 13, 18, 21…trên các mẫu tế bào lấy từ gai nhau, từ dịch ối của sản phụ ngay trong những thời kỳ còn rất sớm của thai kỳ để giúp các nhà điều trị có biện pháp can thiệp như chấm dứt thai kỳ sớm nhờ vậy mà gia đình không phải chịu gánh nặng vì phải sanh những đứa con bị bệnh lý di truyền. Ngoài ra, PCR còn được dung để phát hiện các cá nhân khỏe mạnh nhưng mang gene tiềm ẩn bệnh di truyền, ví dụ bệnh Thalassemia, Duchene…để có thể có tham vấn tiền hôn nhân hay trước sanh, nhờ vậy mà sẽ có thể làm giảm đi hay loại trừ một bệnh lý di truyền trong quần thể, giảm được gánh nặng xã hội vì phải đối phó với bệnh lý di truyền này. 1.4. Phương pháp DGGE và các ứng dụng 1.4.1. Phương pháp DGGE 10
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1253 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2