Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 2 - Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản nhất về nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức và quản lý các chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau khi ra trường có thể nắm được các kỹ năng cần thiết để xây dựng và quản lý chương trình Vi sinh đại cương một cách hiệu quả nhất. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 giáo trình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 2 - Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp

Chương 3 QUAN SÁT VI SINH VẬT Mỗi loại vi sinh vật khác nhau phát triển trên môi trường dinh dưỡng sẽ tạo ra những hình dạng khác nhau, hoặc thay đổi môi trường dinh dưỡng thì vi sinh vật cũng có những dạng khác nhau. Dựa vào những dạng đặc biệt này chúng ta có thể đoán biết chúng thuộc nhóm nào và có thể kiểm tra hình dạng chúng qua kính hiển vi quang học. 3.1. Mục đích – yêu cầu - Giúp sinh viên quan sát sự hiện diện của vi sinh vật xung quanh phát triển trên môi trường dinh dưỡng . - Nhận diện các nhóm vi sinh vật nầy bằng mắt thường và bằng kính hiển vi. 3.2. Nguyên, vật liệu thực hành - Đĩa petri, ống nghiệm và bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng có chứa vi sinh vật. - Kính hiển vi quang học - Kính mang vật (lame) phẳng và kính đậy vật (lamelle) - Đèn cồn, kim cấy… 3.3. Thực hành quan sát vi sinh vật bằng mắt 1. Trên môi trƣờng đặc Mỗi tế bào vi sinh vật khi mọc trên môi trường dinh dưỡng đặc, sẽ phát triển thành những dạng đặc biệt gọi là khuẩn lạc (colony). Khuẩn lạc là tập đoàn vi sinh vật sinh ra từ 1 tế bào hay 1 bào tử có trước. Tùy theo cách phát triển của từng nhóm vi sinh vật mà khuẩn lạc có hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc, độ nhớt… khác nhau. Quan sát mô tả khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để định danh, phân loại vi khuẩn. - Dựa vào hình dạng, khuẩn lạc có 5 loại: dạng điểm, dạng tròn, dạng không đều, dạng rễ cây và dạng hình thoi. 16
● Điểm Tròn không đều rễ cây Thoi - Bìa của khuẩn lạc, có 5 loại bìa: nguyên, gợn sóng, chia thùy, răng cưa và sợi Bìa nguyên Gợn sóng chia thùy răng cưa Dạng sợi - Độ nổi của khuẩn lạc có 4 loại: phẳng, lài, mô và cầu chồng Phẳng lài mô cầu chồng - Màu sắc của khuẩn lạc: màu trắng đục, trắng trong, mà vàng, màu cam, màu xám, màu đen, xanh rêu, nâu đen… - Kích thước của khuẩn lạc: tùy thuộc vào độ tuổi của khuẩn lạc, kích thứơc biến động từ bằng đầu kim cho đến đường kính của đĩa petri. Quan sát bằng mắt ta có thể phân biệt được 2 loại khuẩn lạc rất khác biệt nhau: - Khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men: khuẩn lạc của vi khuẩn là do nhiều tế bào cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn lạc trên môi trường đặc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường tròn, không đều, hình thoi; bìa của khuẩn lạc là bìa nguyên, gợn sóng, hoặc chia thùy hay răng cưa. 17
- Khuẩn lạc nấm mốc: do cấu tạo bởi nhiều sợi nấm nên khuẩn lạc trên môi trường đặc có hình dạng rễ cây, bìa của khuẩn lạc là các sợi, nhìn kỹ ta thấy như là các sợi gòn thật mịn, màu trắng hoặc xám và khi sinh bào tử (có màu sắc khác nhau) phát xuất từ giữa khuẩn lạc. 2. Môi trƣờng lỏng Vi sinh vật khi sinh trưởng trên môi trường lỏng tùy thuộc nhóm hiếu khí hay kỵ khí mà chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng (màng), tạo cặn (tích tụ) hay tạo kết tủa. - Nếu làm đục môi trường thì xem làm đục đều hay tạo dạng bông hay sóng lụa. - Nếu tạo màng thì cần nêu rõ đặc điểm của màng (mỏng hay dầy, phẳng hay gấp nếp). - Nếu tạo cặn hay kết tủa phải nêu đặc tính ít hay nhiều, xốp hay đặc dạng bông, dạng hạt hay dạng nhầy. 3.4. Thực hành quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi Quan sát trên kính hiển vi bằng 2 phương pháp sau đây: 1. Phƣơng pháp giọt ép: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 2 chiều để thấy chuyển động của chúng bằng cách: Nhỏ 1 giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật (phẳng) Khử trùng kim cấy trên ngọn đèn cồn và để nguội Châm đầu kim cấy vòng lên môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm men, lấy 1 ít vi khuẩn hoặc vi nấm rồi chấm vào giọt nước trên kính mang vật và trải mỏng ra. Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước (sao cho không có bọt khí) Quan sát dưới kính hiển vi x10, x40 để thấy sự chuyển động thật và chuyển động brown (nếu không có roi thì không có chuyển động thật). 2. Phƣơng pháp giọt treo: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 3 chiều, vi sinh vật chuyển động theo nhiều hướng bằng cách: Nhỏ 1 giọt nước hoặc môi trường lỏng tiệt trùng lên kính đậy vật. 18
Dùng kim cấy đã khử trùng bằng nhiệt để chuyển vi khuẩn từ đĩa petri vào giọt nước trên kính đậy vật. Thoa vaseline theo cạnh của kính đậy vật. Lật ngược và úp kính đậy vật lên lame lõm sao cho giọt nước ở giữa lõm. Quan sát sự chuyển động của vi khuẩn nơi lame lõm. CÂU HỎI 1. Tại sao khi quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi phải nhỏ giọt nước cất lên lam kính? 2. Tại sao có màu sắc của các khuẩn lạc khác nhau trên cùng môi trường? 3. Sinh viên quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri chứa môi trường đặc, mô tả và vẽ hình khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. 4. Quan sát và vẽ hình vi khuẩn trong giọt ép 5. Quan sát trên kính hiển vi, hãy cho biết sự di chuyển của các vi khuẩn, nấm men trong các mẫu? 19
Chương 4 KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN THUẦN KHIẾT Cấy vi khuẩn là công việc đưa vi khuẩn vào các môi trường nuôi cấy đã được khử trùng. Yêu cầu của việc nuôi cấy vi khuẩn là đảm bảo tính thuần khiết của một dòng vi khuẩn cần nuôi cấy. Muốn vậy, chúng ta phải thực hiện quá trình nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện vô trùng, không để cho bất kỳ một vi khuẩn nào từ môi trường xung quanh nhiễm bẩn vào. Chúng ta đã biết thế giới xung quanh ta từ không khí đến bề mặt các đồ vật, ngay cả quần áo, chân tay…đều luôn có một số lượng lớn vi sinh vật, và các vi sinh vật này luôn sẵn sàng gây nhiễm các môi trường nuôi cấy khi ta thực hiện việc nuôi cấy vi khuẩn. Các vi khuẩn thường được cấy trên các môi trường dinh dưỡng lỏng hoặc đặc đựng trong các ống nghiệm hoặc các hộp đĩa petri. Tất cả các dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước khi thực hành. 4.1. Mục đích yêu cầu - Trang bị cho sinh viên biết một số phương pháp gieo cấy, phân lập và cấy truyền vi khuẩn từ các loại mẫu khác nhau phục vụ cho công tác chẩn đoán, xét nghiệm . - Yêu cầu sinh viên biết cách lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu dùng cho việc cấy và phân lập vi khuẩn. - Sinh viên biết cách nhận biết một số dạng khuẩn lạc - Sinh viên phải nắm vững nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy và mục đích của việc cấy phân lập và cấy truyền 4.2. Vật liệu thực hành: - Kim cấy loại cứng và loại mềm (kim nhọn và kim tròn) - Dĩa petri và ống nghiệm chứa môi trường có vi sinh vật phát triển - Dĩa petri và ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng - Pipette, đèn cồn, bông gòn thấm, cồn khử trùng, dao mổ - 20
Kim cấy vòng đầu cứng Kim cấy vòng đầu mềm Dao mổ trong y tế Kim cấy vi khuẩn Kim cấy có móc Kim cấy dẹp Hình 2. Các dụng cụ chuyên dùng để cấy, chuyển vi sinh vật từ môi trƣờng này sang môi trƣờng khác. Kim cấy nhọn hoặc kim cấy vòng bằng sợi dây kim khí (platin hay nickel chrome) chóng nóng, chóng nguội và sẽ tránh bị rỉ sét khi đốt đỏ ở nhiệt độ cao lúc khử trùng. Kim cấy vòng dùng để cấy lướt trên mặt thạch. Kim cấy thẳng dùng để cấy đâm sâu vào thạch (cấy vi khuẩn kỵ khí) hay vào thạch mềm (xem di động) hay dùng để ly trích vi khuẩn trên các khuẩn lạc mọc gần nhau. Kim cấy dẹp và kim cấy có móc hình thước thợ để cấy nấm. 4.3. Phƣơng pháp gieo cấy vi khuẩn Gieo cấy vi khuẩn từ nốt rễ cây họ đậu Phòng cấy hoặc tủ cấy phải vô trùng có trang bị hệ thống lọc không khí và đèn cực tím để bảo đảm vô trùng. 21
- Thu nốt rễ từ cây đậu nành hoặc đậu nành hoang, rửa sạch đất, chọn nốt rễ ở gần cổ rễ (rễ chính) nốt to, chắc, mang về phòng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng thì cho nốt rễ vào bọc nilon cột chặt trữ trong tủ lạnh (ngăn đá). - Xử lý nốt rễ: Cho nốt rễ (đã rửa sạch đất) vào cốc sứ, thêm cồn 70oC cho ngập nốt rễ ngâm 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất. + Cho oxy già 3% vào cốc (ngập nốt rễ) để yên 3 phút, rồi rửa lại bằng nước cất (3 lần). + Dùng kẹp đã khử trùng gấp nốt rễ để lên giấy thấm sạch. - Các thao tác cấy lên đĩa petri: + Đĩa petri chứa môi trường KIA hoặc TSA, dùng bút lông dầu đánh dấu (dưới đáy đĩa petri) những điểm định cấy vi khuẩn. + Sử dụng kim cấy đầu nhọn đã khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn, đâm thẳng vào giữa nốt rễ (nơi có vi khuẩn phát triển mạnh) + Mở hé nắp đĩa petri, đưa kim cấy vào mặt agar rồi đâm thủng mặt thạch theo những điểm đã đánh dấu, đậy nắp đĩa petri lại, hơ kim cấy lên ngọn lửa đèn cồn trước khi để kim cấy lên giá. + Lật ngược đĩa petri đã cấy, ghi tên vi khuẩn đã cấy, ngày cấy, tên người cấy rồi cho vào tủ ủ ở 30-34oC/24 giờ. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn. 4.4. Phƣơng pháp cấy phân lập vi khuẩn Cấy phân lập (tách ròng) là phương pháp tách rời vi khuẩn từ một hổn hợp dựa trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy. Trong thủ thuật này, ta cần làm cho vi khuẩn tách rời từng tế bào và chúng sẽ phát triển lên thành khuẩn lạc độc lập (thuần khiết) phục vụ cho việc nghiên cứu chúng, xác định vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn tạp nhiễm…. Tùy theo nhóm vi sinh vật ta có nhiều phương pháp phân lập, có thể phân lập bằng que cấy vòng hoặc bằng que trang… 4.4.1. Nguyên tắc Phương pháp phân lập dựa trên nguyên tắc là mỗi một tế bào vi sinh vật sau một thời gian nuôi cấy (24 giờ) trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển thành một quần thể vi sinh vật đồng nhất, thuần khiết. Khi phát triển riêng biệt trên môi trường thạch các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành một nhóm vi sinh vật và được gọi là 22
khuẩn lạc. Như vậy mỗi khuẩn lạc có thể được tính như là một tế bào vi sinh vật. Khuẩn lạc thường có kích thước từ 0,5x 4-5mm và có thể nhìn thấy được bằng mắt thường. Trong khi đó muốn thấy được các tế bào vi sinh vật chúng ta phải dùng kính hiển vi. Các tế bào vi sinh vật càng được tách rời nhau, những khuẩn lạc tạo nên sẽ càng riêng biệt, rõ nét, càng giúp cho việc chọn lựa các dòng thuần được dễ dàng hơn. 4.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men Hai phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men bằng que cấy vòng thường dùng: Cách 1: Dùng kim cấy mềm lấy 1 ít vi sinh vật từ các khuẩn lạc. - Trải vi sinh vật (đường 1) - Hơ lửa kim cấy cho các vi sinh vật trên kim cấy chết bớt. - Vẽ đường 2 cắt ngang đường 1. - Hơ lửa kim cấy và tiếp tục vẽ đường 3. - Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy, và cuối đường 3 sẽ còn vài tế bào rời phát triển thành khuẩn lạc độc lập. Cách 1 Đường 1 Đường 2 Đường 3 Cách 2 23
4.5. Cấy truyền Vi sinh vật khi được phân lập có số lượng rất ít, không đủ cho các nghiên cứu định danh, xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, tính chất gây bệnh của chúng. Vì vậy cần phải nuôi cấy để làm gia tăng số lượng của chúng. Mặt khác, vi sinh vật sau khi định danh thường sẽ được giữ giống trong môi trường nhân tạo. Các môi trường nhân tạo tuy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng khi vi sinh vật được giữ giống trong môi trường thì đây là một hệ kín (vi sinh vật không được cung cấp dinh dưỡng mới trong suốt thời gian giữ giống), do đó sau một thời gian giữ giống, các chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ nghèo đi. Hơn nữa các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật tích tụ ngày càng nhiều trong môi trường. Tất cả những yếu tố đó đã làm ức chế, kìm hãm, giết chết vi sinh vật hoặc làm thay đổi các đặc tính sinh lý - sinh hóa, cũng như độc lực của những vi sinh vật được nuôi cấy lâu ngày trên môi trường nhân tạo. Điều này gây ảnh hưởng rất lớn đến việc nghiên cứu chúng. Để khắc phục tình trạng này người ta phải cấy truyền vi sinh vật. 4.5.1. Mục đích của việc cấy truyền - Nhằm gia tăng số lượng vi sinh vật để thực hiện việc nghiên cứu chúng sau khi phân lập được. - Tái sinh các chủng vi sinh vật sau thời gian nuôi cấy bảo quản chúng trên môi trường nhân tạo (phục hồi số lượng, các đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực… của vi sinh vật) 4.5.2. Cấy truyền vi sinh vật Có thể cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng hay môi trường thạch nghiêng, tùy theo tình trạng sinh lý của vi sinh vật cũng như mục đích nghiên cứu. Ghi rõ ký hiệu của loại vi sinh vật được cấy truyền, ngày, tháng cấy trên ống nghiệm.. Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi khuẩn hay nấm men chuyển sang môi trường mới với các thao tác như sau: 1. Cấy truyền từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng đặc a. Trên đĩa petri: Từ môi trường thạch đĩa, chọn những khuẩn lạc riêng biệt, quan sát kỹ bề mặt, rìa, màu sắc, kích thước…ghi lại trong sổ theo dõi, đánh dấu khuẩn lạc (đánh dấu 24
ở mặt đáy của đĩa petri) hoặc môi trường thạch nghiêng, dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít vi khuẩn cấy sang ống môi trường đã được chuẩn bị sẵn. Đối với vi khuẩn thì cấy theo đường zigzag, với vi nấm cấy dọc thành hàng hoặc cấy điểm. Đặt úp đĩa petri thứ 2 (ghi ký hiệu và chủng cấy, ngày cấy) và ủ ở 30-37oC/24 giờ. b. Ống nghiệm: - Tay phải cầm kim cấy (bằng ngón cái, trỏ và giữa), tay trái cầm 2 ống nghiệm (phần đáy ống nghiệm nằm trong lòng bàn tay được giữ chặt bởi ngón tay cái, 2 đầu ống nghiệm vạt ra theo hình chữ V với 2 thân ống nghiệm nằm giữa 2 ngón tay trỏ + giữa và tay giữa + ngón áp út). - Mở lỏng 2 nắp ống nghiệm, hơ nóng kim cấy gần đến cán, dùng các kẻ giữa ngón tay giữa + ngón áp út và ngón út + lòng bàn tay phải để kẹp 2 nắp ống nghiệm. - Hơ lửa 2 miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đưa kim cấy vào, cấy theo đường zigzag hoặc cấy thẳng (hình 3), cấy xong thì hơ miệng ống nghiệm và đóng nắp lại. 2. Gieo cấy từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng lỏng: Kỹ thuật này thường sử dụng trong trường hợp các vi sinh vật đã được giữ quá lâu trong môi trường nhân tạo, số lượng của chúng không còn nhiều, vi sinh vật 25
được giữ giống trong môi trường đất, môi trường lỏng có glycerin bảo quản ở 20 oC hoặc ở dạng đông khô…hoặc trong trường hợp cần thực hiện xét nghiệm liên quan đến khả năng di động của vi sinh vật. Trong môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển dễ dàng hơn nhất là những cấu trúc dạng chiên mao hoặc tiêm mao (lông di động, lông kết bám…) - Cách 1: Hơ kim cấy vòng trên ngọn lửa, chấm trên khuẩn lạc chứa trong đĩa Petri hay ống nghiệm, chuyển kim cấy sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng. - Cách 2: cho 1 ít nước cất tiệt trùng vào đĩa Petri hay ống nghiệm chứa vi sinh vật, dùng kim cấy vòng đã khử trùng như mô tả ở trên, cọ nhẹ cho vi sinh vật tách ra khỏi môi trường agar (dung dịch huyền phù). Dùng micropipette hút dung dịch huyền phù chuyển sang môi trường lỏng. Môi trường vừa cấy được ủ ở 37oC/24 giờ để vi sinh vật phát triển. Sau đó có thể thực hiện việc cấy truyền tiếp tục sang môi trường lỏng khác và giữ giống. 3. Gieo cấy từ môi trƣờng lỏng sang môi trƣờng đặc: - Cách 1: Chấm kim cấy vào môi trường lỏng ở ống nghiệm rồi cấy lên mặt môi trường agar trong đĩa petri hay ống nghiệm theo đường zigzag (không làm rách mặt agar). - Cách 2: Dùng ống hút đã khử trùng hút dung dịch huyền phù từ ống nghiệm rồi nhỏ lên mặt môi trường đặc. 4. Gieo cấy từ môi trƣờng lỏng sang môi trƣờng lỏng: Trường hợp này dùng micropipette hút 1 lượng dung dịch huyền phù từ ống nghiệm chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới. 4.6. Thực hành - Cấy vi khuẩn từ nốt rễ đậu nành hoặc nốt rễ cây điên điển và vi khuẩn đường ruột (Biolactyl). - Cấy chuyển nấm men từ môi trường đặc sang môi trường đặc (đĩa petri), môi trường lỏng sang môi trường đặc. - Phân lập vi khuẩn đậu nành hoặc điển điển và nấm men. 26
CÂU HỎI 1. So sánh sự giống và khác nhau giữa phương pháp cấy phân lập và cấy truyền? 2. Tại sao phải hơ lửa miệng ống nghiệm trước khi đưa kim cấy vào lòng ống nghiệm? 3. Có thể xác định độ ròng (thuần) của vi khuẩn hoặc nấm men bằng mắt được không? 27
Chương 5 CÁC PHƢƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN Nhuộm vi khuẩn có rất nhiều phương pháp nhuộm như nhuộm đơn, nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Nelsen và nhuộm bào tử… trong đó nhuộm đơn và nhuộm Gram là phương pháp nhuộm đơn giản và cơ bản nhất trong vi khuẩn học. Phương pháp nhuộm đơn chỉ sử dụng một loại phẩm màu duy nhất; nhuộm Gram còn gọi là nhuộm kép vì trong phương pháp này ta sẽ dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản nhau về màu sắc, đó là tím gentian và đỏ Fuchsin hoặc Safranin. 5.1. Mục đích - yêu cầu - Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành nhuộm tế bào vi khuẩn để phục vụ cho việc phân loại và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra - Yêu cầu sinh viên nắm vững nguyên lý của các kỹ thuật nhuộm: + Tế bào vi khuẩn chứa acid nhân nên muốn nhuộm vi khuẩn ta phải dùng các phẩm nhuộm có tính base + Chất rượu (alcohol) sẽ tẩy được màu của hợp chất “tím gentian-Iod” của vi khuẩn gram âm. + Sinh viên biết chuẩn bị mẫu vật và tiến hành phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép (nhuộm Gram) 5.2. Nguyên, vật liệu, dụng cụ 5.2.1. Dụng cụ - Đèn cồn - Kim cấy vòng - Bình tia chứa nước cất, 1 bình xịt chứa cồn 70o - Kính hiển vi - Lam - Bút lông dầu hoặc bút chì sáp 28
5.2.2. Vật liệu - Ống nghiệm chứa mẫu vi khuẩn (lactobacillus, Rhizobium, bacillus subtilis) nuôi cấy 24 giờ ở 37oC - Bông thấm nước cắt nhỏ, giấy lọc cắt miếng nhỏ 5.2.3. Hóa chất - Nước cất tiệt trùng trùng - Dung dịch tẩy màu (Ethanol + acetone) - Phẩm nhuộm: blue methylen, crystal violet, dung dịch Iod, Ethanol 95 oC, Fuchsin hay Safranin 5.3. Điều chế phẩm nhuộm a. Phẩm nhuộm đơn - Blue methylen (a) 0,3g - Ethanol (95o) (b) 30ml - Nước cất 100ml Cách điều chế: - Hòa tan (a) trong (b) rồi thêm vào hổn hợp 100ml nước cất - Dung dịch phẩm nhuộm pha chế xong được trử trong chai có nắp thủy tinh b. phẩm nhuộm Gram  Crystal violet Dung dịch 1: - Crystal violet (85%) 20g - Ethanol (95o) 100ml Dung dịch 2: - Ammonium oxalate 1g - Nước cất 100ml Cách điều chế: - Pha dung dịch (1) trong nước cất với tỷ lệ 1:10 ta có hổn hợp (c) - Pha dung dịch (2) 29
- Trộn dung dịch (2) với (1) theo tỷ lệ 4:1 - Trữ dung dịch phẩm nhuộm trong lọ có nắp thủy tinh  Dung dịch Iod - Iod (dạng tinh thể) 1g - Potassium iodin 2g - Sodium bicarbonat (5%) 60ml - Nước cất 245 ml Cách điều chế: - Hòa tan Iod và potassium iodin trong 5ml nước cất - Thêm vào hổn hợp vừa pha xong 240ml nước cất và 60ml sodium bicarbonat - Hòa tan thật đều các hóa chất và trữ trong lọ thủy tinh có màu nâu  Dung dịch rƣợu để tẩy màu crystal violet - Ethanol (95o) 250ml - Aceton 250ml Cách điều chế: Lắc đều 2 hóa chất trên và trữ trong lọ thủy tinh  Dung dịch safranin - Safranin 2,5g - Ethanol (95o) 100ml Cách điều chế: - Hòa tan 2 hóa chất trên rồi pha với nước cất tỉ lệ 1:10 - Trử 2 dung dịch pha xong trong chai có nắp thủy tinh * Lƣu ý: có thể thay dung dịch safranin bằng dung dịch fuchsin như sau: - Fuchsin 1g - Ethanol (95o) 100ml 30
- Dung dịch phenol 5% 100ml Cách điều chế: Lắc trộn đều các hóa chất trên và trử trong lọ thủy tinh 5.4 . Mục đích của việc nhuộm vi khuẩn - Phân biệt vi khuẩn dựa trên tính chất bắt màu của chúng nhằm phục vụ cho việc phân loại và điều trị - Nghiên cứu hình thái, cấu tạo đặc biệt của vi khuẩn (giáp mô, bào tử) để dùng trong phân loại chúng - Bảo tồn tiêu bản vi khuẩn để nghiên cứu, chụp hình 5.5. Phƣơng pháp nhuộm 5.5.1. Chuẩn bị mẫu vật a. Làm vết bôi - Làm sạch lame kính: lame kính trước khi sử dụng phải được lau chùi sạch bằn g cồn và lau lại bằng bông khô - Đánh dấu vị trí vết bôi: nếu vết bôi mỏng, thường sau khi nhuộm xong rất khó nhận ra vị trí của vết bôi. Do đó trước khi làm vết bôi cần phải đánh dấu vị trí mà chúng ta sẽ bôi trên lame. Dùng bút lông khoanh 1 vòng vừa phải trên 1 mặt của lame kính, vết bôi sẽ được làm ở mặt bên kia của lame, ngay vị trí được đánh dấu. - Ghi ký hiệu cho tiêu bản: để tránh nhầm lẫn kết quả xét nghiệm vi khuẩn của các mẫu khác nhau, có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng, khi làm tiêu bản nhuộm phải ghi ký hiệu tương ứng cho từng mẫu được xét nghiệm. Ký hiệu ghi ở phần đầu của lame kính, ở mặt có vết bôi. - Từ môi trường lỏng: dùng que cấy vòng vô trùng, bằng các thao tác vô trùng lấy 1 ít dịch vi khuẩn cho lên lame kính chỗ đã khoanh làm dấu (mặt trái với mặt làm dấu) rồi dàn đều giọt dịch vi khuẩn. Chú ý dàn càng mỏng càng tốt. - Từ môi trường đặc: nhỏ 1 giọt nước cất lên lame kính ở vị trí mặt trái của lame nơi đã khoanh làm dấu. Dùng que cấy vòng vô trùng lấy 1 ít vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trường chấm vào giọt nước vừa nhỏ trên lame và dàn đều chúng ở khu vực được đánh dấu. Chú ý dàn càng mỏng càng tốt. 31
b. Cố định tiêu bản - Mục đích của việc cố định tiêu bản là: + Giết chết vi khuẩn để đảm bảo an toàn, không lây lan + Gắn chặt vi khuẩn trên lame kính, không bị rửa trôi trong quá trình tẩy rửa + Làm cho sự bắt màu của vi khuẩn trở nên tốt hơn (vi khuẩn chết bắt màu tốt hơn vi khuẩn sống) - Các phương pháp cố định, có thể sử dụng một trong 2 cách: + Cố định bằng nhiệt độ (phương pháp lý học): hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 3-4 lần (lam kính cách ngọn lửa khoảng 10cm) + Cố định bằng hóa chất (cồn, aceton…): nhỏ vài giọt cồn lên vết bôi, để khô. 5.5.2. Nhuộm đơn Là phương pháp nhuộm tiêu bản đơn giản nhất trong vi khuẩn học. Mục đích nhuộm đơn là làm cho mẫu vật ăn màu 1 loại phẩm nhuộm để dễ quan sát dưới kính hiển vi. Phẩm nhuộm là xanh methylen hay Fuchsin. Kết quả của phương pháp này chỉ trả lời cho ta biết trong mẫu thí nghiệm có vi khuẩn hay không, cùng với hình dạng và cách sắp xếp của vi khuẩn đó. Cách nhuộm: - Nhỏ 1-2 giọt phẩm nhuộm lên mẫu vật đã cố định trong 1 phút - Rửa dưới vòi nước (nhẹ) cho trôi hết phẩm nhuộm thừa - Dùng giấy thấm chậm hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô, nhỏ lên vết nhuộm 1 giọt dầu cèdre. - Quan sát trên kính hiển vi với vật kính nhúng dầu: quan sát màu sắc, cách sắp xếp của từng loại vi khuẩn. 5.5.3. Nhuộm Gram (nhuộm kép) Mục đích giúp ta xác định mẫu vật nghiên cứu là Gram dương (G+) hay Gram âm (G-). Để công tác nhuộm cho kết quả chính xác ta phải có mẫu vi sinh vật ở giai đoạn mẻ cấy đang phát triển mạnh nhất (giai đoạn log) vì nếu sử dụng mẫu vi khuẩn già thì kết quả bị sai lệnh do 1 số tế bào vi khuẩn già sẽ đổi từ G + sang G- 32
Cách nhuộm: - Nhỏ Crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để 1-2 phút, Rửa nhẹ dưới vòi nước 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước. - Nhỏ dung dịch Iod (lugol) lên vết bôi vừa được nhuộm để khoảng 1’, Rửa nhẹ dưới vòi nước, chậm bớt nước. - Rửa bằng cồn 96 o + aceton thật nhanh, khoảng 30 giây để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, khi giọt cồn và aceton không còn màu tím nữa. Rửa nhẹ dưới vòi nước, chậm nhẹ. - Nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm loãng hoặc safranin lên vết bôi, để khoảng 1 phút. - Rửa nhẹ dưới vòi nước. - Thấm khô tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi, ở vật kính nhúng dầu. Kết quả: - Tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: G+ - Tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: G- 5.6. Thực hành - Sinh viên thực hiện 2 mẫu nhuộm đơn và 2 mẫu nhuộm kép các vi khuẩn đã cấy. CÂU HỎI 1. Mô tả qui trình nhuộm Gram và nêu kết quả của các mẫu nhuộm. 2. Quan sát và vẽ lại vi khuẩn đã nhuộm với màu sắc và đặc điểm riêng của chúng. 33
Hình 4. Sơ đồ phƣơng pháp nhuộm Gram 34
Chương 6 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯƠNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có một ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá chất lượng vi sinh các chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối… Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường được thực hiện theo 2 phương pháp chủ yếu là đếm trực tiếp và đếm gián tiếp. 6.1. Mục đích - Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật trong dung dịch hoặc môi trường nuôi cấy. - Yêu cầu sinh viên phải hiểu được ý nghĩa và nguyên tắc của việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật - Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành và thao tác đếm số lượng tế bào vi sinh vật từ các loại mẫu khác nhau 6.2. Vật liệu và thiết bị 6.2.1. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh - 1 kính hiển vi - 1 kim cấy và 1 đèn cồn - 1 Buồng đếm hồng cầu Thomas hoặc Neubaur - 3 kính đậy vật - 2 micropipette và 4 đầu col 1ml vô trùng, 4 đầu col 0, 1-0,2ml - 3 vial đã khử trùng - 6 ống nghiệm 10ml, 7 đĩa petri đã khử trùng. 6.2.2. Vật liệu và hóa chất - Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy trên môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…) - Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…) 35