TRƯỜNG ĐẠI HỌC XÂY DỰNG MIỀN TÂY
KHOA KỸ THUẬT HẠ TẦNG ĐÔ THỊ
 
\
TÀI LIỆU MÔN HỌC
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT KỸ THUẬT
MÔI TRƯỜNG
VĨNH LONG 2020
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM
1.1. Trang thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm
1.1.1. Máy móc
a) Nồi hấp vô trùng ở áp suất cao ( autoclave): Dùng để khử trùng rất nhiều loại dụng
cụ, môi trường nuôi cấy và một số nguyên liệu khác. Nó đạt hiệu quả cao nhất trong
các thiết bị vô trùng vì nó sử dụng hơi nước bão hòa ở áp suất cao để đốt nóng môi
trường.
b) Tủ sấy: Thiết bị này được làm bằng kim loại chịu nhiệt. Phía bên trên tủ có nút điều
chỉnh nhiệt độ tùy theo yêu cầu sử dụng. Nó dùng để khử trùng và làm khô các loại
dụng cụ bằng sắt, bằng thủy tinh có khả năng chịu nhiệt cao.
c) Tủ cấy vô trùng: Đó là thiết bị có cấu trúc dạng hộp, bằng kính, có khả năng vô
trùng nhờ hệ thống đèn tử ngoại hoặc bộ phận thổi khí vô trùng.
d) Dụng cụ lọc vi khuẩn: Dùng để khử trùng các loại môi trường không chịu được
nhiệt độ và áp suất cao.
e) Tủ ấm: Thiết bị này có khả năng duy trì nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy để
nghiên cứu các đặc điểm sinh lý vi sinh vật.
g) Máy lắc: Thiết bị này dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các
bình nuôi theo các chiều khác nhau một cách đều đặn để tăng lượng ooxxi hòa tan
trong môi trường.
h) Máy li tâm: Máy này dùng để tách sinh khối tế bào trong môi trường nuôi cấy hoặc
tách các tiểu phần có độ lắng khác nhau trong thành phần của tế bào.
i) Máy đo pH: Dùng để xác định pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật
k) Cân phân tích: Dùng để định lượng các chất trong quá trình làm môi trường nghiên
cứu vi sinh vật.
1.1.2. Các dụng cụ và thiết bị trong phòng thí nghiệm
a) Phiến kính: Dùng làm tiêu bản trong nghiên cứu hình thái, sinh lý tế bào
b) Lá kính: Dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản giúp cho việc quan sát, nghiên cứu vi
sinh vật dễ dàng hơn.
2
c) Phiến kính lõm: Phiến kính này giúp ta nghiên cứu khả năng di động, sự hình thành
bào tử và các đặc điểm về sinh sản của tế bào vi sinh vật.
d) Hộp lồng ( đĩa pêtri): Dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi
cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật
e) Bình tam giác: Dùng để nuôi cấy, nhân giống, chứa các loại môi trường. Nó gồm
nhiều loại: 100 ml, 250ml, 500 ml… Trong đó loại 250 ml là được sử dụng nhiều nhất
g) Que gạt: Dụng cụ này để phân lập, tuyển chọn tế bào vi sinh vật
h) Que cấy: Gồm có 3 loại que cấy: que cấy đầu tròn, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu
hình thước thợ. Công dụng chủ yếu của nó để lấy giống, cấy truyền và làm tiêu bản vi
sinh vật.
i) Các nguyên liệu và dụng cụ khác:
- Agar: Thường dùng ở dạng thạch dùng để nấu môi trường
- Các loại thuốc nhuộm
- Dầu bách hương: Dùng khi quan sát mẫu vật ở bội giác có độ phóng đại lớn của kính
hiển vi
- Axeton: Dùng để lau vật kính và các tiêu bản có dầu.
- Vải xô: Dùng để lọc tiêu bản và làm nút bông:
- Giấy lọc.
- Giấy báo cũ dùng để bao gói các dụng cụ.
- Bông thấm nước.
- Bông mỡ ( không thấm nước) để làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác.
- Các loại dụng cụ để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: dao, thớt, xoong nhôm,
vá…
1.1.3: Kính hiển vi
Là dụng cụ rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật. Nó cho phép ta quan sát,
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý tế bào nhờ khả năng phóng đại từ hàng chục
đến hàng vạn lần hình ảnh của mẫu vật quan sát.
Tùy theo yêu cầu mà người nghiên cứu có thể lựa chọn và sử dụng các loại kính
hiển vi khác nhau
a) Kính hiển vi thông thường:Dùng ánh sáng thường từ dưới chiếu lên. Kính này cho
phép ta quan sát và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh lý nói chung
của tế bào nên được sử dụng phổ biến trong giảng dạy và học tập.
3
b) Kính hiển vi nền đen: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt
của kính tụ quang nên ánh sáng chiếu vào mẫu vật từ phía bên. Kính này cho phép ta
nhìn thấy các cấu trúc khó quan sát trên kính hiển vi thường, ở tiêu bản không nhuộm
màu và tiêu bản các tế bào sống.
c) Kính hiển vi đổi pha: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt của
kính tụ quang, vật kính, thị kính làm đổi pha dao động của ánh sáng. Kính này cho
phép ta nhìn thấy rõ các cấu trúc nhỏ, rõ nét hơn như tiên mao, các lớp màng, không
bào, ti thể…
d) Kính hiển vi huỳnh quang: Dùng chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm
màu bởi các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác sẽ phát quang với màu
sắc khác nhau cho phép ta phân biệt rõ chúng.
e) Kính hiển vi điện tử: Dùng chùm tia điện tử với độ phân giải cao thay cho ánh
sáng thường cho phép nhìn thấy ảnh của mẫu vật được phóng đại từ 30- 50 vạn lần. Có
2 loại:
- Kính hiển vi điện tử truyền suốt: Dùng để nghiên cứu các đại phân tử sinh học.
- Kính hiển vi điện tử quét: Dùng để nghiên cứu các cấu trúc có kích thước lớn hơn
các đại phân tử sinh học. Tuy nhiên kính hiển vi điện tử thường được trang bị tạ các
phòng thí nghiệm có quy mô lớn với các cán bộ chuyên môn có đủ trình độ và kinh
nghiệm mới sử dụng được.
1.2. Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi
1.2.1. Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật
1.2.1.1 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời
- Cách làm tiêu bản giọt ép:
+ Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
+ Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không để tạo thành bọt
khí.Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.
+ Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
- Cách làm tiêu bản giọt treo: Dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả
năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích
+ Dùng phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa.
+ Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính.
+ Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính.
4
+ Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía đươi rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
- Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu:
a. Nguyên tắc:
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha
loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm.
b. Cách nhuộm:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh meetylen 0,001% lên phiến kính.
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40)
1.2.1.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định:
- Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định:
1. Làm vết bôi:
2. Cố định vết bôi:
Các cách cố định :
+ Cố định bằng nhiệt:
+ Cố định bằng hóa chất:
* Phương pháp này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến
đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.
* Người ta thường dùng các hóa chất là rượu và axeton để cố định vết bôi.
* Cách cố định: Có thể thực hiện một trong những cách sau:
Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết booit ừ 5-15 phút. Với rượu
CH3OH ngâm khoảng 2-5 phút.
Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút
Nhỏ vài giọt rượu 90-950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài
lần rồi để khô.
1.2.2. Phương pháp nhuộm vi sinh vật
1.2.2.1 Nhuộm màu tiêu bản cố định
a. Nguyên tắc:
- Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành
phần khác nhau của tế bào thành các hợp chất màu đặc trưng bền vững.
5