246
Phần 2. HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH
Bài 1. LÀM TIÊU BẢN VÀ NHUỘM TẾ BÀO VI SINH VẬT
I. NGUYÊN LÝ
Để quan sát được VSV ta phải biết cách làm tiêu bản. Tùy thuộc đối tượng nghiên
cứu là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc hay nấm men… mà có cách làm các dạng tiêu bản
khác nhau. Có hai dạng tiêu bản phổ biến là tiêu bản tạm thời và tiêu bản cố định nhuộm
màu.
Các tiêu bản tạm thời (tế bào còn sống) như tiêu bản giọt ép được sử dụng để xác
định hình dạng, sự sắp xếp các tế bào cũng như khả năng di động, tiêu bản “ép lam” chỉ
dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc, như hình
dạng chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống bào tử ở xạ khuẩn hay nấm mốc.
Các tiêu bản cố định (tế bào chết) rất thuận tiện vì giữ được lâu, được sử dụng để
phát hiện các đặc điểm hình thái, cấu trúc và đếm số lượng VSV.
Khi sử dụng ngọn lửa đèn cồn (hay đèn ga) phải điều chỉnh sao cho không có khói.
Chỗ nóng nhất của ngọn lửa đèn cồn là phần ngọn lửa xanh.
Có nhiều phương pháp cố định tiêu bản như nhỏ lên vết bôi 1– 2 giọt cồn 960, đốt
cháy và dập tắt ngay (khoảng 30 giây) hay cố định tiêu bản bằng hóa chất: ngâm tiêu bản
trong acetone 5 phút, trong dung dịch 40% formaline vài giây ...
Tế bào VSV gần như là không màu, do đó quan sát bằng phương pháp xem trực tiếp
rất khó, vì vậy cần phải làm tiêu bản rồi đem nhuộm màu. Nhuộm VSV có 4 mục đích:
-Để nghiên cứu hình thái, cấu tạo đặc biệt của VSV như màng nhầy, bào tử...
-Để phân loại VSV căn cứ vào tính chất bắt màu Gram, tính kháng cồn, kháng acid.
-Để dễ có thể phân biệt và quan sát được các vi cấu tạo trong tế bào VSV.
-Để lưu giữ tiêu bản trong một thời gian, để chụp ảnh hiển vi.
II. THỰC HÀNH
1. Mục đích yêu cầu
Biết cách làm tiêu bản và sử dụng kính hiển vi, kính lúp để phân biệt, nhận diện hình
thái, cấu tạo, cơ quan sinh sản của vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc thường gặp
trong một số cơ chất tự nhiên và trên môi trường nuôi cấy.
Nắm vững các phương pháp nhuộm và phân biệt vi khuẩn Gram dương, Gram âm.
2. Mẫu vật, dụng cụ, hóa chất
2.1. Mẫu vật
Để buổi thực hành đạt kết quả tốt, cần chuẩn bị:
247
- Nguyên liệu chứa vi sinh vật:
+ Rác thải hữu cơ đang bị phân hủy 200 g, đất 100 g, trái cây bị thối và mốc 200 g,
nước thải 500 ml, thực phẩm hỏng 200 g.
+ Bánh men rượu 5 bánh, men bột Pháp (S.cerevisiae) 20 g
- Các chủng vi sinh vật hiện có của phòng thí nghiệm:
+ Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus.
+ Trực khuẩn: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bact.prodiginosum, Pseudomonas
aeruginosa.
+ Trực khuẩn sinh bào tử: Bacillus mesentericus, Clostridium pasteurianum,
Bacillus subtilis, Bacillus mycoides. Xoắn khuẩn: Rhodospirillum rubrum
+Nấm men: Sacchromyces cerevisiae
+ Vi nấm: Penicillium notatum, Aspergillus oryzae. Mucor mucedo, Rhizopus oryzae
+Xạ khuẩn: Streptomyces fradiae, Streptomyces cylindrosporum
Có thể cấy truyền vi khuẩn trên môi trường thạch–thịt–peptone (MPA), nấm men
trên môi trường Hansen, nấm mốc trên môi trường Czapek, xạ khuẩn trên môi trường
Gause–1 hay Czapek–Tinh bột.
2.2. Dung cụ: Lam kính (phiến kính) và la men (lá kính)
Muốn làm tiêu bản VSV, cần có lam kính và la men đúng quy cách và thật sạch.
Lamkínhthường có kích thước 70×26 mm và dày 1,1–1,4 mm. La men thường có kích
thước 18×18 mm và có chiều dày không quá 0,15–0,17 mm. Các lam kính và la men cần
làm sạch. Để làm tiêu bản giọt treo người ta dùng một lam kính có lỗ lõm ở giữa.
2.3. Hóa chất
Cách pha chế một số loại thuốc nhuộmcho bài 1
1) Dung dịch fuchsine kiềm
Công thức:
Fuchsine kiềm ...............................1 g Cồn nguyên chất 960…………10ml
Acid phênic kết tinh ......................5 g Nước cất……………………100 ml
Cách pha: Nghiền fuchsine với 5ml cồn trong cối sạch, quấy đều, đổ từ từ 2/3 lượng
nước vào, quấy đều, xong cho thêm acid phenic, trộn đều cho vào lọ kín để 24 giờ, đem
lọc qua giấy, thu được dung dịch fuchsinee đặc, khi dùng nhuộm đơn hoặc nhuộm Gram
thì đem pha loãng dung dịch này gấp 10 lần với dung dịch acid phenic 5%.
Dung dịch fuchsine ....................10 ml Dung dịch acid phenic5% ……90 ml
2) Pha dung dich xanh methylene
Công thức
Xanh methylen...............................1 g acid phenic kết tinh………………1 g
Cồn nguyên chất 96o ................10 ml Nước cất………………………10 ml
Cách pha: giống như fuchsine ở trên.
248
3) Pha dung dịch lactophenol để thấm ướt sợi nấm
Công thức:
Acid lactic ............................... 10 g Glycerol..............................20 g
Nước cất................................10 ml Acid phenic (phenol) .........10 g
Cách pha: Đầu tiên trộn acid lactic, phenol và nước lắc đều, sau đó thêm phenol.
Lúc mới pha dung dịch không màu sau đó chuyển sang màu nâu nhạt. Giữ trong lo màu.
4) Pha dung dịch lugol
Công thức:
Kali ioddua (KI)........................1 g Iod tinh thể (I)........................0,5 g
Nước cất..............................150 ml
Cách pha:
Nghiền kali iodua - KIvới một ít nước cất, sau đó cho Iod đã tán nhỏ vào lắc cho tan
hết, cuối cùng cho đủ nước cất, lắc đều, để 24 giờ rồi đem lọc. đựng vào chai màu. Không
nên pha nhiều vì dễ bị biến chất.
5) Pha dung dịch tẩy màu cồn acetone
Cồn nguyên chất 5 phần, Acetone 1 phần
Nếu không có acetone thì dùng cồn nguyên chất hoặc 90ocũng được.
6) Pha dung dich thuốc nhuộm bào tử
- Dung dịch lục malachite (C23H25N2Cl) bão hòa trong ethanol 950, khấy cho tan, sau
đó đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối có nút mài.
- Dung dịch safranin O (C20H19N4Cl = 350,80) 0,5% (hòa tan 5 g safranin O trong
100 ml cồn ethanol 950), trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có
dung dịch 0,5%. Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch fuchsine ziehl: fuchsine kiềm (C19H18N3Cl
= 323,82) 1g, phenol 5g, ethanol, 90% 10 ml, nước cất 200 ml (hòa tan fuchsine với
ethanol; hòa tan phenol với nước cất sau đó trộn lại).
3. Các bước tiến hành
3.1. Làm tiêu bản vi sinh vật
3.1.1. Làm tiêu bản vi sinh vật sống không nhuộm màu
1) Phương pháp làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự sắp xếp tế bào, sự nảy mầm, sự di
động... của VSV. Khi quan sát VSV bằng tiêu bản giọt treo cần cường độ chiếu sáng ít
hơn bình thường (đóng bớt màn chắn ánh sáng trên tụ quang kính).
Cách tiến hành:
- Dùng que cấy hoặc pipette nhỏ một giọt dịch huyền phù vi sinh vật (khoảng10–20
µl lên mặt lamen sạch vô trùng. Lật ngược lamen sao cho giọt dịch huyền phù VSV treo ở
mặt dưới lamen.
- Úp lamen vào lam kính đặc biệt có phần lõm hình cầu ở giữa, quanh lỗ đã được bôi
249
vaseline. Lúc này ta được giọt dịch huyền phù vi sinh vật treo lơ lững trong khoang kính
do lamen và lam kính lõm tạo ra.
Chú ý:
Không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào vào đáy của phần lõm.
Nếu cần theo dõi các vi sinh vật trong giọt treo nhiều ngày thì pha dịch huyền phù vi
sinh vật bằng môi trường dinh dưỡng vô trùng.
Tất cả các thao tác làm tiêu bản phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng gần
ngọn lửa đèn cồn như đã hướng dẫn.
Hình 9. Cách làm tiêu bản giọt treo (Prescot, et al.,2002)
2) Phương pháp làm tiêu bản giọt ép
Chuẩn bị mẫu: Dịch đất hay dịch rác thải đang phân hủy, nước thải cống rãnh
Tiến hành theo các bước:
- Đặt một giọt nước vào lam kính
- Dùng ống hút nhỏ 1 giọt dịch VSV đã pha loãng đặt vào giọt nước.
- Để một mép lamen tiếp xúc với lam kính rồi nhẹ nhàng hạ lamen xuống, tránh tạo
bọt khí.
- Thấm nhẹ lớp dịch trào ra xung quanh bằng giấy thấm.
Quan sát tiêu bản ở hệ kính khô (×10; ×20; ×40). Nếu cần soi ở hệ kính dầu thì nhỏ
lên lamen một giọt dầu cede. Vật kính soi dầu thường có đường viền đỏ (×100).
250
Hình 10. Các bước làm tiêu bản giọt ép (Prescot, et al.,2002). a– Đặt một giọt nước vào lam
kính; b–Cho mẫu vật vào giọt nước hòa đều, c– Đặt lamen nằm nghiêng chạm cạnh giọt
dịch, d– Từ từ hạ thấp lamen sao cho không tạo bong bóng. khí.
3) Phương pháp làm tiêu bản xẻ rãnh thạch
Dùng để quan sát hệ sợi và cuống sinh bào tử của nấm sợi hoặc xạ khuẩn.
- Cấy bào tử hay hệ sợi của vi sinh vật lên môi trường dinh dưỡng đặc trong đĩa Petri
bằng phương pháp cấy zic zac, hoặc trải dày bằng que trang.
- Dùng dao vô trùng xẻ một rảnh thạch trong đĩa Petri
- Đặt lamen vô trùng lên bờ của rảnh thạch vừa xẻ.
- Đậy đĩa Petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Có thể cải tiến phương pháp trên như sau: Sau khi cấy vi sinh vật có hệ sợi lên bề
mặt môi trường, cắm chéo góc 450một lamen vô trùng vào mặt thạch.
Lật ngược và đặt đĩa Petri vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
3.1.2.Làm tiêu bản cố định nhuộm màu
Tiêu bản cố định được sử dụng rất phổ biến để phát hiện hàng loạt các đặc điểm
hình thái và đếm số lượng vi sinh vật. Những tiêu bản này rất thuận tiện vì có thể giữ được
lâu. Xem các tiêu bản cố định bằng các vật kính khô hay vật kính dầu.
Làm tiêu bản cố định theo các bước sau:
1) Làm vết bôi: Có thể làm vết bôi theo một trong hai cách:
Cách 1: Dùng que cấy lấy một vòng que cấy dịch nuôi cấy VSV (vi khuẩn hay nấm
men) dàn trên lam kính (khoảng 2cm2)
Cách 2: Đặt một giọt nước cất vô trùng vào giữa lam kính sạch, dùng que cấy lấy
một ít VSV từkhuẩn lạc hay dịch nuôi rồi dàn mỏng giọt huyền phù đó trên lam kính.
2) Làm khô vết bôi:Dùng kẹp giữ lam kính sao cho vết bôi khô tự nhiên hay hơ nhẹ
trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy lam kính áp lên mu bàn tay thấy nóng vừa là được, không làm
lam kính quá nóng, VSV sẽ biến dạng.
3) Cố định vết bôi: Nhỏ lên vết bôi 1–2 giọt cồn 960. Đốt cháy và dập tắt ngay
(khoảng 30 giây).
250
Hình 10. Các bước làm tiêu bản giọt ép (Prescot, et al.,2002). a– Đặt một giọt nước vào lam
kính; b–Cho mẫu vật vào giọt nước hòa đều, c– Đặt lamen nằm nghiêng chạm cạnh giọt
dịch, d– Từ từ hạ thấp lamen sao cho không tạo bong bóng. khí.
3) Phương pháp làm tiêu bản xẻ rãnh thạch
Dùng để quan sát hệ sợi và cuống sinh bào tử của nấm sợi hoặc xạ khuẩn.
- Cấy bào tử hay hệ sợi của vi sinh vật lên môi trường dinh dưỡng đặc trong đĩa Petri
bằng phương pháp cấy zic zac, hoặc trải dày bằng que trang.
- Dùng dao vô trùng xẻ một rảnh thạch trong đĩa Petri
- Đặt lamen vô trùng lên bờ của rảnh thạch vừa xẻ.
- Đậy đĩa Petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Có thể cải tiến phương pháp trên như sau: Sau khi cấy vi sinh vật có hệ sợi lên bề
mặt môi trường, cắm chéo góc 450một lamen vô trùng vào mặt thạch.
Lật ngược và đặt đĩa Petri vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
3.1.2.Làm tiêu bản cố định nhuộm màu
Tiêu bản cố định được sử dụng rất phổ biến để phát hiện hàng loạt các đặc điểm
hình thái và đếm số lượng vi sinh vật. Những tiêu bản này rất thuận tiện vì có thể giữ được
lâu. Xem các tiêu bản cố định bằng các vật kính khô hay vật kính dầu.
Làm tiêu bản cố định theo các bước sau:
1) Làm vết bôi: Có thể làm vết bôi theo một trong hai cách:
Cách 1: Dùng que cấy lấy một vòng que cấy dịch nuôi cấy VSV (vi khuẩn hay nấm
men) dàn trên lam kính (khoảng 2cm2)
Cách 2: Đặt một giọt nước cất vô trùng vào giữa lam kính sạch, dùng que cấy lấy
một ít VSV từkhuẩn lạc hay dịch nuôi rồi dàn mỏng giọt huyền phù đó trên lam kính.
2) Làm khô vết bôi:Dùng kẹp giữ lam kính sao cho vết bôi khô tự nhiên hay hơ nhẹ
trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy lam kính áp lên mu bàn tay thấy nóng vừa là được, không làm
lam kính quá nóng, VSV sẽ biến dạng.
3) Cố định vết bôi: Nhỏ lên vết bôi 1–2 giọt cồn 960. Đốt cháy và dập tắt ngay
(khoảng 30 giây).
250
Hình 10. Các bước làm tiêu bản giọt ép (Prescot, et al.,2002). a– Đặt một giọt nước vào lam
kính; b–Cho mẫu vật vào giọt nước hòa đều, c– Đặt lamen nằm nghiêng chạm cạnh giọt
dịch, d– Từ từ hạ thấp lamen sao cho không tạo bong bóng. khí.
3) Phương pháp làm tiêu bản xẻ rãnh thạch
Dùng để quan sát hệ sợi và cuống sinh bào tử của nấm sợi hoặc xạ khuẩn.
- Cấy bào tử hay hệ sợi của vi sinh vật lên môi trường dinh dưỡng đặc trong đĩa Petri
bằng phương pháp cấy zic zac, hoặc trải dày bằng que trang.
- Dùng dao vô trùng xẻ một rảnh thạch trong đĩa Petri
- Đặt lamen vô trùng lên bờ của rảnh thạch vừa xẻ.
- Đậy đĩa Petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Có thể cải tiến phương pháp trên như sau: Sau khi cấy vi sinh vật có hệ sợi lên bề
mặt môi trường, cắm chéo góc 450một lamen vô trùng vào mặt thạch.
Lật ngược và đặt đĩa Petri vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
3.1.2.Làm tiêu bản cố định nhuộm màu
Tiêu bản cố định được sử dụng rất phổ biến để phát hiện hàng loạt các đặc điểm
hình thái và đếm số lượng vi sinh vật. Những tiêu bản này rất thuận tiện vì có thể giữ được
lâu. Xem các tiêu bản cố định bằng các vật kính khô hay vật kính dầu.
Làm tiêu bản cố định theo các bước sau:
1) Làm vết bôi: Có thể làm vết bôi theo một trong hai cách:
Cách 1: Dùng que cấy lấy một vòng que cấy dịch nuôi cấy VSV (vi khuẩn hay nấm
men) dàn trên lam kính (khoảng 2cm2)
Cách 2: Đặt một giọt nước cất vô trùng vào giữa lam kính sạch, dùng que cấy lấy
một ít VSV từkhuẩn lạc hay dịch nuôi rồi dàn mỏng giọt huyền phù đó trên lam kính.
2) Làm khô vết bôi:Dùng kẹp giữ lam kính sao cho vết bôi khô tự nhiên hay hơ nhẹ
trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy lam kính áp lên mu bàn tay thấy nóng vừa là được, không làm
lam kính quá nóng, VSV sẽ biến dạng.
3) Cố định vết bôi: Nhỏ lên vết bôi 1–2 giọt cồn 960. Đốt cháy và dập tắt ngay
(khoảng 30 giây).