Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến sự sinh trưởng và khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactobacillus trên chủng nấm mốc lasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh trên chôm chôm sau thu hoạch

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHITOSAN ĐẾN SỰ SINH<br /> TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS<br /> TRÊN CHỦNG NẤM MỐC LASIODIPLODIA PSEUDOTHEOBROMAE GÂY BỆNH<br /> TRÊN CHÔM CHÔM SAU THU HOẠCH<br /> Đỗ Thị Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Trúc, Nguyễn Phan Thảo<br /> Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM<br /> Ngày nhận bài: 09/5/2016<br /> <br /> Ngày chấp nhận đăng: 14/6/2016<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Chôm chôm sau thu hoạch dễ bị hư hỏng do nấm bệnh phát triển. Chitosan sử dụng làm màng bao thực<br /> phẩm, có tính kháng khuẩn, kháng nấm và hạn chế tổn thất chất dinh dưỡng cho thực phẩm (Allan và Hadwiger,<br /> 1979). Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L.plantarum CC6, L.fermentum DC2 và L.fermentum DG2)<br /> được chứng minh có hoạt tính kháng nấm cao. Đề tài đã kết hợp tính ưu việt của Chitosan và ba chủng vi khuẩn<br /> Lactobacillus spp nhằm tăng hoạt tính kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh trên chôm chôm<br /> sau thu hoạch. Kết quả khảo sát cho thấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus ở nhiệt độ 130C phát triển tốt hơn<br /> nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C). Kết hợp với 0,01% chitosan ở cả hai điều kiện nhiệt độ, vi khuẩn Lactobacillus<br /> có khả năng kháng nấm bệnh tốt nhất. Ở 130C nhiệt độ tốt ưu cho sự phát triển của vi khuẩn L.plantarum CC6 và<br /> kháng nấm tốt nhất.<br /> Từ khóa: Chôm chôm, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Chitosan, Lasiodiplodia<br /> pseudotheobromae<br /> <br /> INVESTIGATION OF THE EFFECT OF CHITOSAN CONCENTRATIONS ON THE<br /> GROWTH AND ANTIFUNGAL ACTIVITY OF LACTOBACILLUS ON<br /> POSTHARVESTING RAMBUTAN DAMAGED BY FUNGI OF LASIODIPLODIA<br /> PSEUDOTHEOBROMAE<br /> ABSTRACT<br /> Harvested rambutan is easy to be damaged because of fungi. Chitosan has been used to make food<br /> covering and has been proved to have antibiotic and antifungal manner and having ability to slow down the<br /> nutrition loss (Allan and Hadwiger, 1979). Some kinds of Lactobacillus spp (L.plantarum CC6, L.fermentum<br /> DC2 and L.fermentum DG2) has been proved to have high antifungal ability. The subject combined the<br /> advantages of Chitosan and 3 kinds of Lactobacillus spp to increase the antifugal ability against Lasiodiplodia<br /> pseudotheobromae which causes disease on rambutan fruit. The survey results show that Lactobacillus spp at<br /> 130C developed better than the room temperature (25±20C). Chitosan was combined at 0,01% w/w with<br /> Lactobacillus spp at both temperature conditions. The result was shown that the L.plantarum CC6 have the best<br /> quality of the development and the antifugal ability at 13 0C<br /> <br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Chôm chôm là một loại quả nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, là một nguồn cung cấp vitamin<br /> C (36,8mg/100g ăn được) và canxi (22mg/100g ăn được). Ngoài ra, loại trái cây này còn cung<br /> cấp lượng niacin, kẽm, protein và chất xơ. Số lượng sản xuất lớn, chủ yếu để ăn tươi (Srilaong<br /> và ctv, 2002). Ở nhiệt độ cao và ẩm độ thấp chôm chôm dễ bị hư hỏng do sự phát triển của<br /> nấm bệnh, do đó chôm chôm có thời gian bảo quản ngắn. Sử dụng thường xuyên thuốc diệt<br /> nấm để kiểm soát bệnh sẽ ảnh hưởng xấu đến môi trường và ít được người tiêu dùng chấp<br /> nhận (Sivakumar và ctv, 2002). Sau thu hoạch, chôm chôm còn được bảo quản bằng phương<br /> pháp xử lý hóa chất hoặc kiểm soát khí quyển (Paull và ctv, 1995) nhưng kết quả chưa thực<br /> sự khả quan.<br /> Chôm chôm thường có thời gian bảo quản ngắn do nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae<br /> gây bệnh thối lan mờ. Bệnh xảy ra trên một vùng vỏ quả, bệnh thường xuất hiện vào ngày thứ<br /> 61<br /> <br /> 3, thứ 4 trong quá trình bảo quản. Ban đầu, trên vỏ quả chỉ xuất hiện một vệt màu nâu rất<br /> nhạt, rất mờ có đường kính khoảng 0,8 cm. Vết bệnh tiếp tục phát triển lan dần ra bề mặt vỏ<br /> quả với tốc độ khá nhanh. Sau khi xuất hiện 1 đến 2 ngày vết bệnh chuyển sang màu nâu đậm,<br /> chảy nước và bắt đầu hỏng. Quả chôm chôm bị hỏng có màu đen và xuất hiện các khuẩn ty<br /> nấm (Trần Thượng Tuấn, 1994; Trần Thụy Ái Tâm, 2012).<br /> <br /> Hình 1: Triệu chứng bệnh thối lan mờ do Lasiodiplodia pseudotheobromae gây ra trên<br /> chôm chôm<br /> <br /> Chitosan ở thể rắn, có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong<br /> nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong axit loãng với pH=6. Chitosan<br /> được sử dụng phổ biến như một lựa chọn thay thế cho thuốc diệt nấm tổng hợp. Chitosan là<br /> một dẫn xuất của chitin đang được nghiên cứu chế tạo làm màng bao thực phẩm thay thế PE,<br /> PP. Màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm và hạn chế tổn thất chất dinh<br /> dưỡng cho thực phẩm (Allan và Hadwiger, 1979). Ở 4oC với 2% chitosan có thể kéo dài thời<br /> gian bảo quản cà rốt trong 4 tuần (Wójci và ctv., 2008).<br /> Hiện nay, việc nghiên cứu, phân lập các chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng chống<br /> lại một số bệnh sau thu hoạch trên trái cây tươi nói chung và chôm chôm nói riêng cũng đang<br /> được quan tâm. Có thể kể đến 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. (CC6, DC2 và DG2) được<br /> phân lập và tuyển chuyển chọn từ 56 chủng vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính đối kháng<br /> chống lại nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae và Phomopsis mali gây bệnh thối trên chôm<br /> chôm.<br /> Với mong muốn kết hợp những đặc tính ưu việt của chất mang chitosan với 3 chủng vi<br /> khuẩn Lactobacillus spp nhằm tăng hoạt tính đối kháng chống lại nấm Lasiodiplodia<br /> pseudotheobromae gây bệnh thối lan mờ trên chôm chôm để có thể kéo dài thời gian bảo quản<br /> và xuất khẩu được nên đề tài đã được thực hiện.<br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> Sử dụng chôm chôm tại viện cây ăn quả Miền Nam, hai giống vi khuẩn L.plantarum CC6<br /> (phân lập từ chôm chôm), L.fermentum DC2 (phân lập từ dưa cải) và L.fermentum DG2 (phân<br /> lập từ dưa gang) được thực hiện bởi tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trúc và ctv, đăng báo năm<br /> 2013, tạp chí Đại học Cần Thơ. Nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae được phân lập bởi tác<br /> giả Trần Thụy Ái Tâm (luận văn Thạc Sỹ đã bảo vệ, năm 2012) tại viện Nghiên cứu và phát<br /> triển công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Môi trường MRS để nuôi cấy, môi trường PDA<br /> khảo sát hoạt tính kháng nấm của hai vi khuẩn trên. Chất mang chitosan mua tại Công ty<br /> TNHH Phương Duy (Suntze Chemical Co.,Ltd). Dung dịch đối kháng là dung dịch tăng sinh<br /> vi khuẩn Lactobacillus spp có bổ sung chitosan với các nồng độ khác nhau. Đối tượng đối<br /> kháng là nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae được phân lập từ chôm chôm.<br /> 62<br /> <br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sự sinh trưởng các dòng<br /> vi khuẩn Lactobacillus spp.<br /> Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nhân tố với 36 nghiệm thức, lặp lại<br /> ngẫu nhiên 3 lần. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C) và 130C. Nồng độ chitosan: 0;<br /> 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%). Ba chủng vi khuẩn: L.plantarum (CC6), L.fermentum - DG2,<br /> L.fermentum - DC2.<br /> Phương pháp thực hiện: Hút 1ml dung dịch vi khuẩn Lactobacillus mật độ 108CFU/ml,<br /> tăng sinh trong môi trường MRS lỏng trong 24 giờ. Sau đó, bổ sung lần lượt các dung dịch<br /> chitosan vào dịch tăng sinh vi khuẩn; tiến hành pha loãng mẫu từ nồng độ 10 -1 đến 108<br /> CFU/mL trong môi trường có nồng độ chitosan 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%). Dùng<br /> micropipet hút 0,01ml từ mỗi nồng độ pha loãng mẫu canh trường có nồng độ chitosan và<br /> mật độ Lactobacillus như trên vào đĩa môi trường MRS agar đã chuẩn bị trước (mỗi nồng độ<br /> lặp lại 3 lần). Đợi khô, đậy đĩa, úp ngược lại và ủ kỵ khí ở nhiệt độ độ phòng (khoảng<br /> 25±20C) và nhiệt độ 13oC. Lấy chỉ tiêu ở 6 khoảng thời gian (1, 3, 5, 7, 14, 21 ngày).<br /> Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc rời hiện diện trên đĩa đếm mật số trong môi trường MRS agar từ<br /> những nồng độ pha loãng ở các nghiệm thức khảo sát.<br /> 2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến hoạt tính kháng nấm các<br /> dòng vi khuẩn Lactobacillus spp.<br /> Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nhân tố với 36 nghiệm thức, lặp lại<br /> ngẫu nhiên 3 lần. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C) và 130C. Nồng độ chitosan: 0;<br /> 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%). Sinh khối của các giống vi khuẩn: L.plantarum (CC6), L.fermentum<br /> DG2, L.fermentum DC2..<br /> Phương pháp thực hiện: Tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường MRS lỏng<br /> trong 24 giờ. Sau đó, chủng lần lượt các nồng độ chitosan 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%) vào<br /> dịch tăng sinh vi khuẩn. Hút 1 ml dung dịch đối kháng phủ lên môi trường PDA agar. Tiến<br /> hành cấy nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae lên môi trường PDA agar phủ dịch đối kháng<br /> đã được để khô, kích thước nấm ở các nghiệm thức khảo sát như nhau. Đậy kín và úp ngược<br /> đĩa ủ kỵ khí ở 130C và nhiệt độ phòng. Theo dõi hoạt tính đối kháng của dung dịch kết hợp ở<br /> nhiệt độ phòng sau 40 giờ và 13 ngày ở nhiệt độ 130C.<br /> Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính nấm phát triển trên bề mặt đĩa thạch PDA. Đường kính<br /> nấm của vi khuẩn được tính từ điểm tơ nấm hiện hiên trên đĩa đo đối xứng qua tâm là thạch<br /> nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae cấy trên môi trường PDA agar. Kết quả đo đường kính<br /> là trung bình của 3 lần lặp lại. Khả năng ức chế của vi khuẩn đối với nấm được xác định như<br /> sau:<br /> Khả năng kháng nấm (%) = [(Ā – ā)/ Ā]x100<br /> Trong đó: Ā: đường kính trung bình ba lần lặp lại của đĩa nấm đối chứng; ā: đường kính<br /> trung bình ba lần lặp lại của các nghiệm thức khảo sát.<br /> 2.2.3. Xử lý số liệu<br /> Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận và xử lý thống kê bằng phần<br /> mềm Statgraphic Centurion XV.I, Excel 2013 với mức độ tin cậy 95%.<br /> <br /> 63<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sự sinh trưởng và hoạt tính kháng nấm<br /> của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp ở nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C)<br /> 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến sự sinh trưởng các chủng vi khuẩn<br /> Lactobacillus spp ở nhiệt độ phòng<br /> Kết quả khảo sát ảnh hưởng chitosan đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn,<br /> cho thấy: thời gian tồn tại của các chủng vi khuẩn L.fermentum DC2, L.fermentum DG2 và<br /> L.plantarum CC6 trong môi trường MRS chỉ kéo dài trong khoảng 14 ngày. Tuy nhiên, khi<br /> kết hợp với chitosan ở những nồng độ khác nhau, mật số vi khuẩn Lactobacillus hầu như thấp<br /> hơn so với các nghiệm thức đối chứng (dịch tăng sinh vi khuẩn trong môi trường MRS không<br /> bổ sung chitosan). Do màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm nên ở nồng<br /> độ càng cao thì hoạt tính đối kháng càng mạnh (Theo Allan và Hadwiger, 1979 ). Mỗi nghiệm<br /> thức khảo sát có sự khác biệt lớn về mật độ và sự biến động của đường sinh trưởng. Điều này<br /> thể hiện cụ thể ở từng chủng vi khuẩn Lactobacillus ở Hình 2.<br /> Mật độ (Log<br /> CFU/ml)<br /> <br /> 8<br /> 6<br /> 4<br /> 2<br /> 0<br /> 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày<br /> <br /> Thời gian (ngày)<br /> <br /> Hình 2a<br /> Mật độ (Log<br /> CFU/ml)<br /> <br /> 8<br /> 6<br /> 4<br /> 2<br /> 0<br /> <br /> 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày<br /> <br /> Thời gian (ngày)<br /> <br /> Mật độ<br /> (LogCFU/ml)<br /> <br /> Hình 2b<br /> 10<br /> 5<br /> 0<br /> 1 ngày<br /> <br /> 3 ngày<br /> <br /> 5 ngày<br /> <br /> Hình 2c<br /> <br /> 7 ngày 14 ngày 21 ngày<br /> <br /> ĐC<br /> 0,01<br /> 0,05<br /> 0,1<br /> 0,15<br /> 0,2<br /> <br /> Thời gian (ngày)<br /> <br /> Hình 2: Biểu đồ biểu diễn sự sinh trưởng của vi khuẩn L.fermentum DC2 (Hình 2a), L.fermentum<br /> DG2 (Hình 2b), L.plantarum CC6 (Hình 2c) kết hợp Chitosan ở nhiệt độ phòng (ĐC = đối chứng;<br /> 0,01 = DC2 + 0,0,1% chitosan; 0,05 = DC2 + 0,05% chitosan 0,1 = DC2 + 0,1% chitosan; 0,15 =<br /> DC2 + 0,15% chitosan; 0,2 = DC2 + 0,2% chitosan)<br /> <br /> Xét về ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn<br /> L.fermentum DC2, có thể thấy ở nhiệt độ phòng nồng độ chitosan càng cao càng hạn chế sự<br /> phát triển của vi khuẩn, đường cong sinh trưởng của vi khuẩn L.fermentum DC2 ở từng nồng<br /> độ chitosan có sự khác biệt lớn thể hiện ở biểu đồ sinh trưởng (Hình 2a)<br /> 64<br /> <br /> Từ kết quả ( Hình 2a) cho thấy vi khuẩn tồn tại được trong các nghiệm thức khảo sát có<br /> bổ sung chitosan ở nồng độ từ 0,01% đến 0,1%. Nồng độ cao hơn, không có sự hiện diện của<br /> vi khuẩn L.fermentum DC2 trong đĩa đếm mật độ. Nồng độ 0,01% chitosan, sau 3 ngày có<br /> mật số cao nhất là 106 CFU/ml (tăng từ 104 lên 106). Sau đó giảm mạnh và đạt mật độ thấp<br /> nhất trong các nghiệm thức còn tồn tại vi khuẩn. Ở nồng độ chitosan 0,05% và 0,1%, vi khuẩn<br /> L.fermentum DC2 có đường tăng trưởng tương đồng, tăng dần và cao nhất sau 7 ngày. Trong<br /> đó, nồng độ 0,05% chitosan vi khuẩn phát triển tốt hơn và đạt mật số cao hơn khoảng 10 lần<br /> so với nồng độ 0,1% chitosan. Đường sinh trưởng của vi khuẩn L.fermentum DC2 ở nghiệm<br /> thức kết hợp 0,15% chitosan có sự khác biệt lớn với những nghiệm thức khác. Sự khác biệt<br /> này có thể do lỗi thao tác. Nhìn chung, các nghiệm thức kết hợp chitosan ở hầu hết các ngày<br /> đều thấp hơn nghiệm thức đối chứng trong môi trường MRS với đường sinh trưởng giảm<br /> mạnh sau 3 ngày ( từ 107 CFU/ml xuống 104 CFU/ml), sau đó ổn định đến ngày thứ 7. Nồng<br /> độ chitosan tỉ lệ nghịch với sự phát triển của vi khuẩn L.fermentum DC2.<br /> Cùng điều kiện nhiệt độ phòng, kết quả khảo sát cho thấy vi khuẩn L.fermentum DG2 tồn<br /> tại được trong môi trường MRS có bổ sung chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,2% (Hình 2b).<br /> Đường sinh trưởng của vi khuẩn L.fermentum DG2 có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm<br /> thức khảo sát. Nồng độ 0,01% chitosan, sau 1 ngày có mật độ cao nhất là 107 CFU/ml. Mật độ<br /> cao hơn khoảng 10 lần so với nghiệm thức đối chứng ở ngày thứ 7 và đến ngày thứ 14 vi<br /> khuẩn L.fermentum DG2 không còn hiện diện trên đĩa đếm mật độ. Các nghiệm thức kết hợp<br /> chitosan còn lại vi khuẩn L.fermentum DG2 có thể phát triển được nhưng thời gian sinh<br /> trưởng ngắn. Có thể thấy, sự sinh trưởng của vi khuẩn L.fermentum DG2 bị ức chế ở những<br /> nồng độ chitosan cao.<br /> So với vi khuẩn L.fermentum DG2, vi khuẩn L.plantarum CC6 có khả năng sinh trưởng<br /> tốt hơn khi kết hợp với chitosan ở những nồng độ khác nhau nhưng vẫn thấp hơn so với chủng<br /> vi khuẩn L.fermentum DC2. Điều đó thể hiện cụ thể ở biểu đồ tăng trưởng của vi khuẩn<br /> L.plantarum CC6 khi kết hợp chitosan ở nhiệt độ phòng (Hình 2c).<br /> Từ kết quả thí nghiệm (Hình 2c), nhận thấy vi khuẩn L.plantarum CC6 có thể tồn tại ở<br /> các nồng độ thí nghiệm từ 0,01% đến 0,15%. Nồng độ cao hơn, không có sự hiện diện của vi<br /> khuẩn trong đĩa đếm mật độ. Nồng độ 0,01% và 0,05%, mật độ cao nhất nằm trong khoảng<br /> 103 đến 104 CFU/ml. Trong khi đó, nghiệm thức đối chứng mật độ vi khuẩn L.plantarum CC6<br /> đạt 108CFU/ml, cao hơn khoảng 104 CFU/ml. Vi khuẩn L.plantarum CC6 tồn tại trong môi<br /> trường MRS có bổ sung chitosan nồng độ 0,1% và 0,15% với thời gian tương đối ngắn (từ 3<br /> đến 5 ngày) trong khi nghiệm thức ĐC (dung dịch tăng sinh vi khuẩn không bổ sung chitosan)<br /> thời gian tồn tại kéo dài khoảng 14 ngày. Có thể thấy, trong điều kiện nhiệt độ phòng nồng độ<br /> chitosan làm giảm khả năng sự sinh trưởng của vi khuẩn L.plantarum CC6.<br /> 3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến hoạt tính kháng nấm các dòng vi khuẩn<br /> Lactobacillus spp ở nhiệt độ phòng.<br /> Nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae được cấy lên môi trường PDA agar phủ dịch đối<br /> kháng theo dõi trong 40 giờ. Kết quả kháng nấm được thể hiện ở Bảng 1 và Hình 3.<br /> <br /> 65<br /> <br />