Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc phân lập được hai hợp chất saponin khung ocotillol từ HVG là vinaginsenosid R1 (V-R1) và pseudo-ginsenosid F11 (p-F11). Đồng thời, nghiên cứu cũng cho thấy cao chiết toàn phần HVG và hợp chất V-R1 có tác dụng kháng viêm tiềm năng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô

Nghiên cứu Dược học Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học;27(5):43-52 ISSN : 1859-1779 https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06 Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô Nguyễn Ngọc Kim Ngân1, Hoàng Thị Thanh Trúc 1, Phạm Ngọc Khánh Vân 1, Vũ Huỳnh Kim Long1,* Khoa Dược, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam 1 Tóm tắt Đặt vấn đề: Sâm Việt Nam - Panax vietnamensis, Araliaceae là loài dược liệu quý và đặc hữu của Việt Nam, có giá trị cao và đối mặt nguy cơ tuyệt chủng. Sự phát triển của công nghệ sinh học giúp tạo ra lượng lớn sinh khối Sâm Việt Nam trong thời gian ngắn. Mặc dù vậy, thành phần saponin cũng như tác dụng sinh học của rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô (Vietnamese Ginseng hairy root – HVG) chưa được nghiên cứu nhiều. Mục tiêu: Nghiên cứu thành phần saponin và tác dụng kháng viêm của HVG. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bột HVG được chiết với ethanol để thu được cao toàn phần, sau đó chiết phân bố với n-butanol bão hòa nước để thu được phân đoạn n-butanol (Bu). Cao Bu được tách phân đoạn bằng sắc ký cột silica gel và tinh chế bằng HPLC điều chế. Các hợp chất được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm (MS, 1H và 13 C-NMR). Tác dụng kháng viêm được xác định thông qua khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7. Kết quả: Từ cao toàn phần HVG, quá trình chiết tách thu được hai hợp chất pseudoginsenosid F11 và vina-ginsenosid R1. Cao toàn phần HVG và hợp chất vina-ginsenosid R1 cho thấy hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 lần lượt là 71,07±2,7 và 79,59±5,10 µg/mL cao hơn khoảng 6,5 lần so với IC50 của chứng dương dexamethason là 12,64±1,28 µg/mL. Kết luận: Từ HVG phân lập được hai saponin khung ocotillol là pseudoginsenosid F11 và vina-ginsenosid R1. Cao toàn phần và hợp chất vina-ginsenosid R1 thể hiện tác dụng kháng viêm và có tiềm năng sử dụng bên cạnh Sâm Việt Nam trồng. Từ khóa: Rễ tóc Sâm Việt Nam, saponin, vina-ginsenosid R1, kháng viêm Abstract STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENT AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF HAIRY ROOT CULTIVATED FROM CALLUS PANAX VIETNAMENSIS Nguyen Ngoc Kim Ngan, Hoang Thi Thanh Truc, Pham Ngoc Khanh Van, Vu Huynh Kim Long Ngày nhận bài: 05-07-2024 / Ngày chấp nhận đăng bài: 25-11-2024 / Ngày đăng bài: 28-11-2024 *Tác giả liên hệ: Vũ Huỳnh Kim Long. Khoa Dược, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. E-mail: vuhuynhkimlong@tdtu.edu.vn © 2024 Bản quyền thuộc về Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh. https://www.tapchiyhoctphcm.vn 43
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5* 2024 Introduction: Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis, Araliaceae) is a precious and endemic medicinal herb with high economic value and is currently endangered. Advances in biotechnology facilitate the production of a large amount of Vietnamese Ginseng biomass in a short period. However, the chemical composition and bioactivity of hairy root from cultured callus Vietnamese Ginseng (HVG) have not been extensively studied. Objective: Isolation of saponins from HVG and in vitro evaluation of the anti-inflammatory effect of ethanol extract and isolated saponin. Methods: HVG powder was extracted with ethanol to obtain the total extract. The n-butanol fraction (Bu) was obtained by partitioning the total extract with water-saturated n-butanol. The Bu fraction was fractionated using silica gel column chromatography and subsequently purified by preparative HPLC. The compounds were identified by MS, 1H, and C-NMR spectroscopy. The anti-inflammatory activity was determined through their ability to inhibit the NO production 13 by RAW 264.7 macrophage cells. Results: From the total HVG extract, two compounds were isolated and identified as pseudoginsenoside F11 and vina-ginsenoside R1 by spectrometric methods. The HVG ethanol extract and vina-ginsenoside R1 showed anti-inflammatory activity with IC50 values of 71.07±2.7 and 79.59±5.10 µg/mL, respectively, which was about 6.5 times higher than that of dexamethasone used as positive control, which was 12.64±1.28 µg/mL. Conclusion: Vietnamese Ginseng hairy root contains characteristic components pseudoginsenoside F11 and vina-ginsenoside R1. The total extract and vina-ginsenoside R1 compound demonstrated potential anti-inflammatory effect, which could be an alternative source of therapeutic reagent for natural cultured Vietnamese Ginseng. Keywords: hairy root Vietnamese Ginseng; saponin; vina-ginsenoside R1; anti-inflammatory 1. ĐẶT VẤN ĐỀ (Vietnamese Ginseng hairy root - HVG) với giá thành hợp lý, đáp ứng nhu cầu của đại đa số người tiêu dùng. Các nghiên cứu bước đầu khảo sát thành phần hoá học Sâm Việt Nam (SVN) được phát hiện năm 1973 tại của HVG bằng phương pháp khối phổ (Mass vùng núi Ngọc Linh với tên khoa học Panax vietnamensis Spectrometry - MS) bước đầu cho thấy HVG cũng chứa thuộc họ Araliaceae. Đây là dược liệu quý, đặc hữu của các saponin khung ocotillol [5]. Tuy nhiên, chưa có Việt Nam và có giá trị kinh tế cao. Thành phần hóa học nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các chính của SVN là các ginsenosid khung protopanaxatriol saponin này cũng như đánh giá tác dụng kháng viêm (ginsenosid Rg1, notoginsenosid R1…), protopanaxadiol của HVG vẫn chưa được đánh giá. Trong nghiên cứu (G-Rb1, G-Rd…) và đặc biệt là các saponin khung này, từ sinh khối HVG, chúng tôi đã phân lập được ocotillol như majonosid R2 (M-R2) và vina-ginsenosid hai hợp chất saponin khung ocotillol từ HVG là vina- R2 (V-R2) với hàm lượng rất cao làm nên sự khác biệt ginsenosid R1 (V-R1) và pseudo-ginsenosid F11 (p-F11). cho SVN với các loài Panax khác [1]. Nhiều tác dụng Đồng thời, nghiên cứu cũng cho thấy cao chiết toàn dược lý của SVN và M-R2 đã được chứng minh như phần HVG và hợp chất V-R1 có tác dụng kháng viêm chống ung thư, chống trầm cảm, kháng viêm [2-4]... Do tiềm năng. đó, việc sử dụng và khai thác sâm Việt Nam quá mức làm cho loài sâm này cạn kiệt trong tự nhiên và nguồn trồng trọt không đáp ứng đủ cho nhu cầu thị trường. Điều này 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP khiến cho giá thành của dược liệu này hiện đang rất cao NGHIÊN CỨU và là rào cản cho đa số người tiêu dùng có thể tiếp cận sử dụng. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy 2.1. Đối tượng nghiên cứu mô sẹo, SVN được nuôi trong môi trường in vitro nhằm Rễ SVN nuôi cấy mô tươi (n=10, 3 kg) được Trung tâm tạo ra sinh khối trong thời gian ngắn. Điều này hứa hẹn sẽ Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh (2374 QL1A, Khu phố là nguồn cung sinh khối rễ tóc SVN nuôi cấy mô 44 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5 * 2024 2, Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp. Rễ được lọc qua màng lọc 0,22 µm và phân tích bằng HPLC-ESI-MS nuôi cấy trong 90 ngày theo quy trình đã được công bố bởi sử dụng cột Phenomenex Kinetex (50×4,6 mm, 2,7 µm) với Hà Thị Loan và cộng sự [5]. Rễ tươi được sấy ở nhiệt độ pha động gồm acetonitril (A) và nước (B) chứa 0,1% dưới 50 ºC thu được 312 g rễ khô có độ ẩm dưới 13%. Các acid formic ở cả hai kênh với chương trình rửa giải gradient: mẫu được xay riêng biệt thành bột thô để dùng cho chiết xuất. 0-10 phút: 22% A; 10-15 phút: 22-30% A; 15-25 Một phần bột thô của mỗi mẫu được tiếp tục xay thành bột phút: 30-40% A; 25-35 phút: 40-60% A; 40-45 phút: mịn để dùng cho phân tích HPLC-ESI-MS. Thân rễ và rễ củ 60-95% A; 45-46 phút: 95-22% A; 46-55 phút: 22% A. Tốc SVN trồng (n=10) được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Sâm độ dòng được cài đặt ở 0,6 ml/phút với thể tích tiêm Ngọc Linh Tu Mơ Rông, Kon Tum. Rễ được sấy ở nhiệt độ mẫu 10 µl. Đầu dò MS được cài đặt ở chế độ quét ion âm ở dưới 60 ℃ và xay thành bột mịn. khoảng 100-1500 Da với điện thế mao quản: 3,5 kV, áp suất hóa hơi: 45 psi, lưu lượng khí làm khô: 5 l/phút, nhiệt độ khí 2.2. Hóa chất và thiết bị làm khô: 300 °C, điện áp vòi phun: 500 V, điện thế phân Sắc ký lớp mỏng (SKLM) dùng bản mỏng silica gel 60 mảnh: 150 V. Các hợp chất được xác định sơ bộ bằng các so F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Đức). Sắc ký cột sánh m/z của phân mảnh giả ion [M+Cl]- và so sánh với dữ (SKC) có pha tĩnh là silica gel 40-60 µm được cung cấp bởi liệu khối lượng phân tử của các saponin đã biết. Merck (Đức). Các dung môi và hóa chất sử dụng trong phân Chiết xuất lập như chloroform, methanol, ethanol n-butanol… được cung cấp bởi công ty Chemsol (Việt Nam), acid sulfuric Bột HVG (300 g) được chiết bằng Soxhlet với 1.500 ml được cung cấp bởi Xilong (Trung Quốc). Acetonitril và ethanol 96% trong thời gian 12 giờ. Dịch chiết ethanol được methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký được cung cấp bởi J. T. Baker cô quay dưới áp suất giảm để thu được cao đặc. Cao toàn (Mỹ), acid formic đạt tiêu chuẩn sắc ký được cung cấp bởi phần sau đó được chiết phân bố lỏng-lỏng bảy lần, mỗi lần Merck (Đức). Nước cất hai lần thu được từ hệ thống cất nước 600 ml n-butanol bão hòa nước, cô dưới áp suất giảm để thu hai lần Aquatron 4000 (Stuart, Anh). Lipopolysaccharid (LPS) cao n-butanol (Bu). chiết xuất từ Escherichia coli được cung cấp bởi Sigma Phân lập các saponin từ cao n-butanol Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) và huyết thanh nhau thai Cao n-butanol được phân tách bằng sắc ký cột silica gel bê (FBS) được cung cấp bởi Life Technologies, Inc., với pha động CHCl3 - MeOH - H2O với tỷ lệ thay đổi dần từ (Gaithersburg, MD, USA). Natri nitrit, sulfanilamid, 10:1:0,2 đến 3:1:0,2. Các phân đoạn được theo dõi bằng N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid và dimethyl SKLM thu được 18 phân đoạn 1-18. Các phân đoạn này sulfoxid (DMSO) của hãng Sigma Chemical Co. (St. Louis, được phân tích bằng HPLC-ESI-MS với điều kiện tương tự MO, USA). Hệ thống sắc ký lỏng điều chế Shimadzu LC-8A điều kiện sử dụng để phân tích thành phần hóa học với pha sử dụng cột sắc ký Supelco C18 (250×21 mm, 10 µm). Phân động gồm acetonitril (A) và nước (B) chứa 0,1% acid formic tích định tính được thực hiện trên hệ thống HPLC Agilent ở cả hai kênh rửa giải gradient theo chương trình: 0-20 phút: 1260 Infinity với đầu dò MSD Single Quadrupole G6125B sử 24-95% A, 20-25 phút: 95% A, 25-26 phút: 95-24% A, 26-32 dụng cột Phenomenex Kinetex C18 (50×4,6 mm, 2,7 µm). phút: 24% A. Phân đoạn có khối lượng nhiều và sắc Phổ HR-MS được ghi trên hệ thống LC-QTOF-MS SCIEX ký đồ đơn giản được chọn để tinh chế thu được saponin X500R QTOF. Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR được ghi trên tinh khiết. hệ thống Bruker AvanceNEO 600 MHz. Tinh khiết hoá các saponin bằng HPLC điều chế Các phân đoạn tiềm năng được phân tách bằng HPLC điều 2.3. Phương pháp nghiên cứu chế sử dụng Hệ thống HPLC Shimadzu LC-8A với cột 2.3.1. Phân tích thành phần hóa học bằng Supelco C18 25×21,2 cm; 10 µm. Pha động sử dụng là hỗn HPLC-ESI-MS hợp acetonitril và nước với tỷ lệ phù hợp ở tốc độ dòng Bột HVG hoặc SVN trồng (100 mg) được chiết bằng siêu 20 ml/phút. Các đỉnh được phát hiện ở bước sóng 190 nm. âm với 10 ml methanol 70% trong 40 phút. Dịch chiết được Thể tích tiêm mẫu 5 ml. https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06 https://www.tapchiyhoctphcm.vn | 45
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5* 2024 Xác định cấu trúc các hợp chất thu được tuyến tính tương quan giữa nồng độ và tỷ lệ ức chế sử dụng phần mềm TableCurve 2Dv4. Cấu trúc các chất phân lập được xác định bằng dữ liệu phổ Hàm lượng NOmẫu thử ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR và so sánh với tài liệu đã % ức chế= 100- Hàm lượng NOmẫu trắng ×100 (1) công bố. Mức độ sống của tế bào RAW được đánh giá bằng phương Đánh giá tác dụng kháng viêm pháp MTT. Cụ thể, đĩa nuôi cấy tế bào sau khi thu dịch nổi, Quy trình được thực hiện theo phương pháp của Liao H và mỗi giếng được thêm 90 µl môi trường nuôi tế bào và 10 µl cộng sự [6] tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ dung dịch MTT pha trong đệm DPBS (5 mg/ml). Sau khi ủ 4 Sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ giờ, môi trường được loại bỏ và tinh thể formazan được hoà Việt Nam. Cụ thể, tế bào RAW 264.7 được nuôi môi trường tan bằng 50 µL DMSO và mật độ quang (OD) được đo ở bước DMEM được bổ sung 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, HEPES sóng 540 nm bằng máy ELISA BioTek Elx800. Tỷ lệ tế bào 10 mM, và natri pyruvat 1,0 mM. Sau khi đạt mật độ 70-80 %, sống được xác định bằng công thức (2). tế bào được chuyển vào đĩa 96 giếng với mật độ 2×105 tế bào % tế bào sống = ẫ - ×100 (2) - o cho mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ 37 C trong môi trường chứa 5 % CO2 trong 24 giờ. Thay môi trường DMEM không có FBS để tế bào tiếp xúc trong 3 h và sau đó được ủ với mẫu thử 3. KẾT QUẢ (0,8-100 µg/ml) hoặc chứng dương dexamethasone (0,8-100 µg/ml) trong 2 giờ. Các giếng chỉ ủ với môi trường được coi 3.1. Khảo sát thành phần hóa học rễ tóc Sâm Việt là đối chứng âm. Tế bào sau đó được kích thích sản sinh NO Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam trồng bằng LPS trong 24 giờ ở nồng độ 10 μg/mL. Sau đó môi Sắc ký đồ HPLC-ESI-MS đại diện của các mẫu SVN trường ủ mẫu (100 µl) được chuyển sang đĩa 96 giếng khác và trồng và HVG được trình bày tại Hình 1. Các đỉnh chính của thêm vào thuốc thử Griess (100 µl) chứa 1% sulfanilamid các mẫu được xác định và liệt kê tại Bảng 1. Kết quả cho trong acid phosphoric 5% và N-1-naphthylethylenediamin thấy dịch chiết của HVG không phát hiện các saponin đặc dihydrochlorid pha trong nước (50 μl). Hỗn hợp phản ứng trưng của SVN trồng như ginsenoside Rg1, Re, Rb1, Rh1, Rc được ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút và đo ở bước nhưng lại có các peak chính của các hợp chất trong 540 nm trên máy đọc đĩa 96 giếng. Mẫu trắng là môi pseudoginsenoside F11 (Rt 7,2 phút) và vina-ginsenosid R1 trường DMEM không FBS. Nồng độ nitrit của từng giếng (Rt 16,4 phút). Đây là các saponin khung ocotillol vốn chiếm được tính toán dựa vào đường tuyến tính của chuẩn natri nitrit hàm lượng rất thấp trong SVN trồng. Điều này cho thấy và so sánh với mẫu chứng âm. Hoạt tính ức chế sinh NO được HVG được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo có quá trình tính toán dựa theo công thức (1). Nồng độ ức chế 50% sự hình sinh tổng hợp khác biệt với SVN sinh trưởng trong môi thành NO (IC50) được xác định bằng phương trình hồi quy trường tự nhiên. Hình 1. Sắc ký đồ HPLC-ESI-MS của Sâm Việt Nam trồng (A) và rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô (B) 1: Vinaginsenosid R24; 2: Notoginsenosid R1; 3: Majonosid-R1; 4: Ginsenosid Rg 1; 5: Ginsenosid Re; 6: Majonosid R2; 7: Vinaginsenosid R11; 8: Pseudoginsenosid RT4; 9: chưa xác định; 10: Vinaginsenosid R2; 11: Chikusetsusaponin L8; 12: chưa xác định; 13: Ginsenosid Rh1; 14: Ginsenosid Rb1; 15: Notoginsenosid Fc; 16: Ginsenosid Rc; 17: Ginsenosid Rd; 18-24: chưa xác định; 25: Pseudoginsenosid F11; 26: chưa xác định; 27: Vinaginsenosid R1; 28: chưa xác định; 29: chưa xác định; 30: Ginsenosid IX; 30: Chikusetsusaponin IV; 31: Pseudoginsenoside RT1 46 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5 * 2024 Bảng 1. Thành phần saponin của Sâm Việt Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam trồng phát hiện bằng HPLC-ESI-MS Rt (phút) Tên hợp chất m/z [M+Cl]- M Công thức phân tử Rễ tóc SVN SVN trồng 2,9 Vinaginsenosid R24 998,0 962,5 C48H82O19 o × 3,4 Notoginsenosid R1 968,0 932,5 C47H80O18 o × 3,8 Majonosid R1 852,5 817,0 C42H72O15 o × 4,7 Ginsenosid Rg1 836,0 800,5 C42H72O14 o × 4,9 Ginsenosid Re 982,1 946,6 C48H82O18 o × 5,5 Majonosid R2 822,5 787,0 C41H70O14 o × 5,8 Vinaginsenosid R11 822,0 786,5 C41H70O14 o × 6,1 Pseudoginsenosid RT4 35,5 654,4 C36H62O10 o × 6,5 Chưa xác định 35,5 800,5 C42H72O14 × o 7,2 Pseudoginsenosid F11 835,5 800,0 C42H72O14 × o 15,5 Chưa xác định 864,0 828,5 C43H72O15 o × 15,5 Vinaginsenosid R2 864,0 828,5 C43H72O15 o × 16,1 Chưa xác định 878,0 842,5 C44H74O15 o × 16,4 Vinaginsenosid R1 878,0 842,5 C44H74O15 × o 18,1 Chikusetsusaponin L8 806,0 770,5 C41H70O13 o × 18,6 Chưa xác định 655,9 620,4 C36H60O8 o × 19,0 Ginsenosid Rh1 674,4 638,9 C36H62O9 o × 19,4 Chưa xác định 1144,1 1108,6 C54H92O23 × o 19,5 Ginsenosid Rb1 1144,1 1108,6 C54H92O23 o × 20,2 Notoginsenosid Fc 1246,1 1210,6 C58H98O26 o × 20,8 Ginsenosid Rc 1114,1 1078,6 C52H90O22 o × 21,0 Chưa xác định 1114,1 1078,6 C52H90O22 × o 22,2 Ginsenosid Rd 982,1 946,6 C48H82O18 × × 25,1 Ginsenosid IX 952,0 916,5 C47 H80 O17 × o 26,4 Chưa xác định 655,9 620,4 C36H60O8 o × 27,1 Chưa xác định 655,9 620,4 C36H60O8 o × 28,6 Chikusetsusaponin IV 961,0 926,5 C47H74O18 × o 28,6 Pseudoginsenoside RT1 961,0 926,5 C47H74O18 × o 29,2 Chưa xác định 784,5 820,0 C42H72O13 × × 29,5 Chưa xác định 784,5 820,0 C42H72O13 o × 32,8 Chưa xác định 802,0 766,5 C42H70O12 o × 33,2 Chưa xác định 802,0 766,5 C42H70O12 o × Chú thích: ×: Có phát hiện trong mẫu; o: Không phát hiện trong mẫu https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06 https://www.tapchiyhoctphcm.vn | 47
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5* 2024 quả trên sơ bộ xác định phân đoạn 13 có thể có thành 3.2. Chiết xuất và phân lập phần chính là vina-ginsenosid R1 (V-R1). Phân đoạn Từ 300 g bột HVG, sau khi chiết xuất thu được 76,9 g cao 15 (1,67 g) có đỉnh có thời gian lưu 4,4 phút có mảnh Bu giàu saponin (hiệu suất 25,63 %). Cao Bu được tách bằng ion phân tử [M+Cl]- có m/z 835,1 tương ứng với hợp SKC cổ điển với pha động CHCl3- MeOH - H2O được tăng chất có công thức nguyên C42H72O14 (M=800). Kết quả dần độ phân cực thu được 18 phân đoạn. Thành phần của các này giúp sơ bộ xác định pic này có thể là pseudo- phân đoạn được phân tích bằng UHPLC-ESI-MS. Sắc ký đồ ginsenosid F11 (p-F11). Ngoài ra, ở chế độ ion dương, ở Hình 2 cho thấy phân đoạn 13-15 có thành phần đơn giản. các pic này đều cho mảnh ion phân tử m/z 457,1. Theo Trong đó phân đoạn 13 (2,05 g) có đỉnh có thời gian lưu 9,3 nghiên cứu của Qi và cộng sự (2012), các chất tương - phút có mảnh ion phân tử [M+Cl] có m/z 878,1 tương ứng ứng với các đỉnh này có khung ocotillol giúp khẳng với hợp chất có công thức nguyên C44H74O15 (M=842). Kết định thêm các nhận định trên [7]. Hình 2. Sắc ký đồ UHPLC-ESI-MS của 18 phân đoạn (PĐ) thu được sau khi phân tách bằng sắc ký cột. Phân đoạn 13 và 15 được chọn để cho các bước tinh chế tiếp theo 13 Phân đoạn 13 và phân đoạn 15 do có khối lượng nhiều và C-NMR (125 MHz, C5D5N) được liệt kê trong Bảng 2. So thành phần đơn giản nên được lựa chọn để tiếp tục được tinh sánh dữ liệu phổ của CGV1 với tài liệu tham khảo [8] cho chế bằng HPLC điều chế. Từ phân đoạn 13 thu được hợp thấy đây là hợp chất V-R1. chất HVG1 (79,59 mg) có thời gian lưu 45,1 phút. Từ phân Hợp chất HVG2 thu được ở dạng bột vô định hình có đoạn 15 thu được hợp chất HVG2 (1,87 mg) có thời gian lưu màu trắng, phổ HR-QTOF-MS cho ion phân tử [M-H] + 17,4 phút. ở m/z 801,4922 tương ứng với hợp chất có công thức phân tử C42H72O14 (M= 840,4922). Phổ MS của HVG2 cho các ion phân tử 457,3659 và 439,3530 cho thấy hợp 3.3. Cấu trúc của hợp chất phân lập chất này cũng có aglycon là khung ocotillol [7]. Phổ Hợp chất HVG1 thu được ở dạng bột vô định hình có màu 1 H-NMR (600 MHz, C5D5N): 0,90; 0,99; 1,24; 1,27; trắng, phổ HR-QTOF-MS cho ion phân tử [M-H]- ở 1,30; 1,34; 1,44; 2,01 (3H, s, CH3×8); 5,25 (1H, d, J = 5,20 Hz, m/z 843,5038 tương ứng với hợp chất có công thức phân tử H-1 của Glc); 6,46 (1H, d, J = 6,44 Hz, H-1 của Rha). C44H74O15 (M= 842,5028). Phổ MS của HVG1 còn cho các 13 Phổ C-NMR (125 MHz, C5D5N) được liệt kê trong ion phân tử 457,3652 và 439,3540 cho thấy khung aglycon Bảng 2. So sánh dữ liệu phổ với tài liệu đã công bố [9] của hợp chất này là ocotillol [7]. Phổ 1H-NMR (600 MHz, cho thấy đây là hợp chất p-F11, là hợp chất deacetyl của C5D5N): 0,96; 1,04; 1,27; 1,30; 1,34; 1,44; 2,05 (3H, s, CH3×8); 2,08 (3H, s, CH3CO); 5,21 (1H, d, J = 5,20 Hz, V-R1. Cấu trúc của hợp chất V-R1 và p-F11 được trình bày H-1 của Glc); 6,43 (1H, d, J = 6,44 Hz, H-1 của Rha). Phổ ở Hình 3. 48 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5 * 2024 Bảng 2. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, C5D5N) của HVG1 và HVG2 so sánh với tài liệu tham khảo C V-R1 [9] HVG-1 p-F11 [9] HVG-2 1 39,5 39,5 39,3 39,5 2 27,7 27,6 27,6 27,5 3 78,2 78,3 78,4 78,5 4 39,8 39,8 39,8 39,9 5 60,7 60,7 60,8 60,9 6 73,4 73,4 74,0 73,9 7 46,0 46,0 45,8 45,9 8 41,1 41,1 40,9 41,0 9 49,8 49,8 49,7 49,8 10 39,6 39,5 39,4 39,5 11 32,1 32,1 32,0 32,0 12 70,8 70,7 70,7 70,7 13 49,1 49,0 48,9 48,9 14 52,2 52,2 52,1 52,1 15 32,1 32,1 32,4 32,4 16 25,7 25,7 25,6 25,7 17 49,4 49,4 49,2 49,3 18 17,7 17,6 17,7 17,7 19 17,5 17,4 17,4 17,5 20 87,0 87,0 86,9 87,0 21 26,9 26,8 26,8 26,7 22 32,5 32,5 32,4 32,4 23 28,6 28,6 28,5 28,5 24 88,3 88,3 88,2 88,3 25 70,0 69,9 69,9 69,9 26 26,4 26,4 26,4 26,4 27 28,9 28,9 28,8 28,8 28 31,9 31,9 31,9 32,0 29 16,8 16,8 16,8 16,9 30 17,9 17,8 17,8 17,8 6-Glc 1 102,0 101,9 101,7 101,8 2 79,0 78,8 79,2 78,5 3 78,3 78,3 78,2 78,2 4 72,2 72,2 72,2 72,2 5 75,4 75,3 78,2 78,2 6 64,9 64,9 62,9 62,9 Rha 1 101,2 101,2 101,6 101,7 2 72,2 72,0 72,1 72,1 3 72,3 72,2 72,4 72,4 4 74,0 73,9 74,2 74,4 5 69,3 69,3 69,3 69,4 6 18,6 18,6 18,6 18,6 CH3CO 20,9 20,8 - - CH3CO 170,7 170,8 - - https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06 https://www.tapchiyhoctphcm.vn | 49
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5* 2024 R V-R1: Glc—Rha | Ac p-F11: Glc—Rha Glc: Glucose Rha: Rhamnose Ac: Acetyl Hình 3. Cấu trúc các hợp chất đã phân lập 3.4. Tác dụng kháng viêm Hình 4. Khả năng ức chế sản sinh NO của cao toàn phần Sâm Việt Nam nuôi cấy mô (HVG), V-R1 và chứng dương dexamethason Bảng 3. Phương trình hồi quy tương quan tỷ lệ ức chế sinh NO nồng độ 20 µg/ml và 100 µg/ml lần lượt là 55,08% và với nồng độ và giá trị IC50. 87,47%. Cao toàn phần HVG và hợp chất V-R1 đều thể hiện Mẫu Phương trình R2 IC50 (µg/ml) hoạt tính kháng viêm thông qua việc ức chế sự hình thành hồi quy NO trên tế bào RAW264.7 tăng dần theo nồng độ. Ở nồng HVG y = -0,0024x 2 0,9945 71,07±2,77 độ 100 µg/ml, cao chiết HVG và V-R1 cho khả năng ức chế + 0,9191x + lần lượt là 70,56% và 58,54% sự sản sinh NO. Phương trình 1,1476 hồi quy ở Bảng 3 cho thấy có sự tương quan tốt giữa nồng V-R1 y = -0,0011x2 0,9984 79,59±5,10 độ các mẫu thử và chứng dương với tỷ lệ ức chế sản sinh NO + 0,6497x + của tế bào RAW264.7 (R2>0,99). Từ phương trình hồi quy, 5,3419 giá trị IC50 của cao chiết HVG và V-R1 lần lượt là Dexamethason y = -0,0074x2 0,9921 12,64±1,28 71,07±2,77 µg/ml và 79,59±5,10 µg/ml (tương đương +1,2849x 93,82±6,05 µM), gấp lần lượt 6,5 lần và 2,9 lần so với +32,918 chứng dương dexamethason (IC50 12,64±1,28 µg/ml, Hợp chất V-R1 được lựa chọn để đánh giá tác dụng kháng tương đương 32,21±3,26 µM). Cao chiết HVG và V-R1 ở viêm trên mô hình in vitro do lượng phân lập phù hợp cùng nồng độ 100 µg/ml đều không ảnh hưởng đến mức độ với cao toàn phần HVG. Kết quả ở Hình 4 cho thấy sống của tế bào RAW264.7 với mức độ sống của tế bào dexamethason được dùng làm chứng dương cho hoạt tính ổn lần lượt là 91,85% và 98,18% so với mẫu trắng chỉ chứa định trong thử nghiệm với khả năng ức chế sản sinh NO ở môi trường nuôi cấy tế bào. 50 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5 * 2024 4. BÀN LUẬN của V-R1 đến từ khung ocotillol của hợp chất này. Tuy nhiên, IC50 của hợp chất V-R1 không cao hơn cao toàn phần có thể được giải thích do tác dụng kháng viêm của cao toàn phần là Các công bố trước đây cho thấy thành phần saponin của tác dụng tổng hợp của nhiều thành phần trong cao HVG và rễ Sâm Việt Nam sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên rất V-R1 đóng góp một phần trong tác dụng đó. Bên cạnh V-R1, phong phú với hơn 70 saponin thuộc các khung p-F11 cũng là một saponin khung ocotillol tương tự V-R1 protopanaxadiol, protopanaxatriol và đặc biệt là khung nhưng do lượng phân lập ít nên chưa thể đánh giá hoạt tính ocotillol với hàm lượng cao [1]. Tuy nhiên Sâm Việt Nam kháng viêm của hợp chất này. Vì vậy, cần đánh giá thêm tác thiên nhiên hiện nay đang cạn kiệt và nguồn nuôi trồng giới dụng kháng viêm của hợp chất p-F11 để làm rõ vai trò của các hạn không đáp ứng được nhu cầu sử dụng của thị trường. saponin khung ocotillol trong tác dụng kháng viêm của cao rễ Sâm Việt Nam nuôi cấy mô có lợi thế ứng dụng công nghệ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy mô. Tuy nhiên, tác dụng kháng nuôi cấy mô để tạo sinh khối lớn trong thời gian ngắn. Tuy viêm của cao toàn phần HVG hứa hẹn Sâm Việt Nam nuôi cấy nhiên, quá trình nuôi cấy in vitro vẫn tạo ra được các saponin mô và các sản phẩm từ dược liệu này có tiềm năng được sử khung ocotillol như p-F11 và V-R1 trong Sâm Việt Nam nuôi dụng làm giảm nhẹ các triệu chứng viêm trong cơ thể. cấy mô. Hai saponin này vốn là hợp chất chiếm tỷ lệ rất thấp trong Sâm Việt Nam thiên nhiên. Đây là điều rất đáng khích lệ cho các nghiên cứu nuôi cấy mô. Kết quả này tương đồng 5. KẾT LUẬN với công bố trước đây nghiên cứu sơ bộ bằng LC-MS của Hà Thị Loan và cộng sự, trong đó cho thấy p-F11 và V-R1 là Kết quả phân tích thành phần hóa học sơ bộ cho thấy Sâm hai hợp chất chính trong cao chiết HVG [5]. Trong nghiên Việt Nam nuôi cấy mô có thành phần chính là hai hợp chất cứu này, các phân đoạn thu được sau khi sắc ký cột được saponin khung ocotillol là V-R1 và p-F11 vốn là những hợp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối chất có hàm lượng rất thấp trong Sâm Việt Nam trồng. Hai phổ. Với sự định hướng của UHPLC-MS giúp xác định sơ hợp chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc dựa vào bộ các phân đoạn tiềm năng với thành phần tương đối đơn các phương pháp phổ nghiệm. Nghiên cứu cũng sơ bộ cho giản có thể tiếp tục tinh chế bằng HPLC điều chế. Với lợi thế thấy cao chiết của nguyên liệu này cũng như hợp chất V-R1 của đầu dò khối phổ giúp cung cấp thông tin cấu trúc có thể thể hiện hoạt tính kháng viêm rõ rệt. Tuy nhiên cần thực hiện sơ bộ định hướng hợp chất phân lập được là p-F11 và V-R1. những nghiên cứu sâu hơn trên mô hình in vivo để làm rõ cơ Ở chế độ ion dương, việc phát hiện các ion phân tử có m/z chế kháng viêm của cao chiết Sâm Việt Nam nuôi cấy mô 457,1 giúp xác định đây là các saponin khung ocotillol vốn cũng như của hợp chất V-R1 trên cơ thể động vật. không có liên kết đôi trong phân tử. Điều này giúp xác định Lời cảm ơn điều kiện phát hiện trong quá tinh chế bằng HPLC điều chế, Tác giả xin chân thành cảm ơn TS. Hà Thị Loan đã cung trong đó đầu dò phải được cài đặt ở bước sóng rất thấp (dưới cấp mẫu cho nghiên cứu. 200 nm) mới có thể phát hiện được các đỉnh này. Trong nghiên cứu này, bước sóng 190 nm vẫn có thể giúp việc phát Nguồn tài trợ hiện và hướng dẫn việc thu phân đoạn tương ứng với các Nghiên cứu này không nhận tài trợ. chất này một cách chính xác và hiệu suất cao. Xung đột lợi ích Trong hai hợp chất thu được, hợp chất V-R1 có khối lượng cao (79,59 mg) nên được lựa chọn cho bước đánh giá hoạt Không có xung đột lợi ích nào liên quan đến nghiên cứu này. tính kháng viêm cùng với cao toàn phần. Với IC50 ORCID 79,6 µg/ml, hợp chất V-R1 thể hiện hoạt tính kháng viêm khá Vũ Huỳnh Kim Long và tương đương với cao toàn phần (IC50 71,1 µg/ml). Jeong và cộng sự (2015) công bố các hợp chất khung ocotillol trong https://orcid.org/0000-0003-3888-4174 Sâm Việt Nam như vina-ginsenosid R2, majonosid R2 và Đóng góp của các tác giả phần aglycon là ocotillol genin thể hiện tác dụng kháng viêm Ý tưởng nghiên cứu: Vũ Huỳnh Kim Long. rõ rệt [2]. Điều này có có thể giải thích tác dụng kháng viêm https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06 https://www.tapchiyhoctphcm.vn | 51
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 5* 2024 Đề cương và phương pháp nghiên cứu: Vũ Huỳnh Kim Long. 5. Ha TL, Nathalie PJ, Michelle PL, Michèle BC, Hoa XD, Gontier E. Hairy root cultures of Panax vietnamensis, a Thu thập dữ liệu: Nguyễn Ngọc Kim Ngân, Hoàng Thị promising approach for the production of ocotillol-type Thanh Trúc, Phạm Ngọc Khánh Vân. ginsenosides. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Giám sát nghiên cứu: Vũ Huỳnh Kim Long. 2016;126(1):93-103. Nhập dữ liệu: Hoàng Thị Thanh Trúc, Phạm Ngọc Khánh Vân. 6. Liao H, Banbury L, Liang H, Wang X, Lü X, Hu L, Wu Quản lý dữ liệu: Nguyễn Ngọc Kim Ngân. J. Effect of Honghua (Flos Carthami) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells and α-glucosidase Phân tích dữ liệu: Nguyễn Ngọc Kim Ngân. activity. Journal of Traditional Chinese Medicine. Viết bản thảo đầu tiên: Vũ Huỳnh Kim Long. 2014;34(3):362-8. Góp ý bản thảo và đồng ý cho đăng bài: Nguyễn Ngọc Kim 7. Qi LW, Wang HY, Zhang H, Wang CZ, Li P, Yuan CS. Ngân, Hoàng Thị Thanh Trúc, Phạm Ngọc Khánh Vân. Diagnostic ion filtering to characterize ginseng saponins by rapid liquid chromatography with time-of-flight mass Cung cấp dữ liệu và thông tin nghiên cứu spectrometry. Journal of Chromatography A. Tác giả liên hệ sẽ cung cấp dữ liệu nếu có yêu cầu từ Ban 2012;1230:93-9. biên tập. 8. Duc NM, Kasai R, Ohtani K, Ito A, Nham NT, Yamasaki K, Tanaka O. Saponins from Vietnamese ginseng, Panax TÀI LIỆU THAM KHẢO vietnamensis Ha et Grushv. collected in central Vietnam. II. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1. Nguyen HT, Phuong TT. Vietnamese Ginseng 1994;42(1):115-22. (Panax vietnamensis Ha and Grushv.): phylogenetic, 9. Duc NM, Nham NT, Kasai R, Ito A, Yamasaki K, Tanaka phytochemical and pharmacological profiles. O. Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Pharmacognosy Reviews. 2019;13(26):59-62. Ha et Grushv. collected in central Vietnam. I. Chemical and 2. Jeong JJ, Le THV, Lee SY, Eun SH, Nguyen MD, Park Pharmaceutical Bulletin. 1993;41(11):2010-4. JH, et al. Anti-inflammatory effects of vina-ginsenoside R2 and majonoside R2 isolated from Panax vietnamensis and their metabolites in lipopolysaccharide-stimulated macrophages. International Immunopharmacology. 2015;28(1):700-6. 3. Nguyen TTH, Kinzo Matsumoto, Yamasaki K, Nguyen MD, Nguyen TN, Watanabe H. Crude saponin extracted from Vietnamese ginseng and its major constituent majonoside-R2 attenuate the psychological stress- and foot-shock stress-induced antinociception in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1995;52(3):427-32. 4. Takao K, Takasaki M, Tokuda H, Nishino H, Nguyen MD, Kasai R, et al. Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. (I). Biological and Pharmaceutical Bulletin. 1998;21(8):834-8. 52 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.05.06