Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS. Ngô Thị Hải Yến

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể các thầy cô đang làm việc tại Viện nghiên cứu và ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, cùng toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN và các bạn sinh viên cùng tham gia làm đề tài bộ môn Sinh lý người và động vật đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận với đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già”.

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Ngô Thị Hải Yến, người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận.

Do là lần đầu được tiếp xúc với nghiên cứu khoa học và bản thân cũng chưa có nhiều kinh nghiệm nên tôi còn nhiều thiếu sót trong quá trình thực hiện. Vì vậy, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận được hoàn chỉnh hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thanh Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già” là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Ngô Thị Hải Yến, giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Những số liệu kết quả trong khóa luận này là trung thực, không có sự sao chép của đề tài khác. Đề tài này chưa từng công bố ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác. Trong đề tài, tôi có trích dẫn một số dữ liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thanh Hà

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT KÍ KIỆU VIẾT TẮT NỘI DUNG

BC Bacterial cellulose 1

h Giờ 2

MT Môi trường 3

CVK Cellulose vi khuẩn 4

OD 5 Optical density

6 UV-vis Ultraviolet visible

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1

2. Mục đích của nghiên cứu ................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 2

5. Tính mới của đề tài (nếu có) .............................................................................. 3

NỘI DUNG ............................................................................................................ 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4

1.1.Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK) .............................................................. 4

1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus ................................... 4

1.1.2. Màng cellulose vi khuẩn .............................................................................. 4

1.2.Thuốc Diclofenac Natri .................................................................................... 5

1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi ....................................................................... 5

1.2.2.Tính chất ........................................................................................................ 6

1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac ............................................ 6

1.2.4. Động học giải phóng của thuốc ................................................................... 6

1.2.5.Dược lực học của thuốc ................................................................................ 7

1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc ........................................................ 7

1.3.Tình hình trên thế giới và Việt Nam ................................................................ 8

1.3.1. Trên thế giới ................................................................................................. 8

1.3.2. Ở Việt Nam .................................................................................................. 9

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 10

2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 10

2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian ................................................... 10

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 10

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 10

2.3.1.1. Chủng vi sinh ........................................................................................... 10

2.3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất .......................................................................... 10

2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 10

2.3.2. Cách bố trí thí nghiệm ................................................................................ 11

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 11

2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già ..................................... 11

2.3.3.2. Xử lí vật liệu CVK .................................................................................. 12

2.3.4. Phương pháp pha dung dịch đệm ............................................................... 14

2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac ............................ 14

2.3.6. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC ................................. 18

2.3.7.Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi trường nước

dừa già. ................................................................................................................. 19

2.3.8. Phương pháp xử lý thống kê ...................................................................... 20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 21

3.1. Màng CVK được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già ............................... 21

3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường................................................................ 21

3.3. Tinh chế màng CVK ..................................................................................... 23

3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng khỏi màng CVK .................... 23

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 36

Kết Luận ............................................................................................................... 36

Kiến nghị .............................................................................................................. 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 37

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn ..... 12

Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n=3) ở bước sóng 276nm ........................................................ 15

Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n=3) ở bước sóng 278nm ........................................................ 16

Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n =3) ở bước sóng 281nm ....................................................... 17

Bảng 3.1. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác

nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng không ép .. 26

Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác

nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép ............. 28

Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH

khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) ................... 30

Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép ở các môi trường pH khác

nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) ........................... 32

Bảng 3.5. Tỷ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng cực đại tại 24 giờ của màng

trong các môi trường pH khác nhau ................................................. 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac .................................................... 6

Hình 2.1. Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men .................................................. 13

Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm ... 15

Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm ... 16

Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm ... 17

Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già ............ 21

Hình 3.2. Màng thu được sau quá trình nuôi cấy ............................................ 22

Hình 3.3. Màng CVK được bảo quản trong tủ lạnh ........................................ 22

Hình 3.4. Màng CVK đang được xả dưới vòi nước ........................................ 23

Hình 3.5. Màng CVK thu được sau quá trình hấp thụ .................................... 24

Hình 3.6. Màng được cho vào máy giải phóng ............................................... 24

Hình 3.7. Mẫu được rút ra các lọ nhỏ để đo quang phổ .................................. 25

Hình 3.8. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng

0,5cm và 1cm chưa ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3) .. 27

Hình 3.9. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng

0,5cm và 1cm đã ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3) ...... 29

Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng

chưa ép ở các pH và thời gian khác nhau ......................................... 31

Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng

ép ở các pH và thời gian khác nhau .................................................. 33

Hình 3.12. Khả năng giải phóng thuốc cực đại của màng ở các môi trường pH

khác nhau tại 24 giờ .......................................................................... 34

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Ở nước ta những năm gần đây, tỉ lệ phụ nữ mắc các căn bệnh viêm

khớp mãn tĩnh ngày càng tăng cao. Đặc biệt trong độ tuổi từ 35- 55 tuổi, phụ

nữ hay bị hành hạ bởi các cơn đau do viêm khớp dạng thấp gây nên [2].

Theo các nghiên cứu cho thấy Diclofenac–một dẫn chất của acid

phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid có tác dụng chống viêm và

giảm đau. Vì vậy, người ta sử dụng Diclofenac để sản xuất ra thuốc dùng khi

chữa các bệnh viêm khớp.

Ngoài ra, Diclofenac còn là một chất ức chế mạnh hoạt tính của

cyclooxygenase vì vậy làm giảm sự tạo thành những chất trung gian của quá

trình viêm như prostacyclin, thromboxan và prostaglandin. Bên cạnh đó,

Diclofenac còn ức chế sự tạo thành mucin gây tổn hại cho đường tiêu hóa dẫn

đến làm giảm sự tổng hợp prostaglandin [3].

Các nghiên cứu gần đây đã phát hiên ra có một số loài vi khuẩn trong

tự nhiên có khả năng tạo màng cellulose. Khi được nuôi cấy trong môi trường

thích hợp những vi khuẩn này có khả năng hình thành trên một lớp màng

cellulose sinh học thuần khiết được gọi là màng cellulose vi khuẩn (CVK) [5].

Màng CVK đang là nguồn vật liệu mới được quan tâm, thu hút sự chú ý

của các nhà nghiên cứu nhờ những đặc tính ưu việt mà nó đem lại như: Màng

CVK có độ tinh khiết cao, độ dẻo dai cơ học lớn và đặc biệt có khả năng hút

nước và giữ nước rất tốt. Hiện nay màng CVK đang được áp dụng trong nhiều

lĩnh vực khác nhau. Điển hình, trong lĩnh vực y học, khi điều trị bỏng màng

CVK đã được ứng dụng làm da nhân tạo thay thế tạm thời. Ngoài ra màng

CVK còn là tác nhân chuyển thuốc và là chất làm co mạch. [12,21].

Ở Việt Nam, màng CVK có nhu cầu sử dụng cao nhưng giá thành

nhập khẩu từ nước ngoài rất lớn và việc nghiên cứu màng CVK còn ở mức

hạn chế.Tuy nhiên, bằng phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn

Gluconacetobacter Xylinus chúng ta hoàn toàn có thể tự sản xuất màng CVK

để ứng dụng trong thực tiễn.

Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng

Gluconacetobacter Xylinus, từ đó tìm hiểu khả năng giải phóng của thuốc

Diclofenac ở môi trường nước dừa già, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên

cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri

từ Gluconacebacter Xylinus trong môi trường nước dừa già.”

2. Mục đích của nghiên cứu

Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Diclofenac Natri của vật liệu

cellulose trong môi trường nước dừa già thông qua các thí nghiệm đã thiết kế.

3. Nội dung nghiên cứu

- Chế tạo màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường

nước dừa già.

- Nạp Diclofenac vào màng BC.

- Tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac qua màng, xác định lượng

thuốc giải phóng trong môi trường ở các pH khác nhau.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học

+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.

+ Nghiên cứu tìm hiểu tiềm năng của màng CVK Diclofenac Natri

trong việc giải phóng thuốc.

-Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng

Gluconacetobacter Xylinus

+ Tăng sinh khả dụng của thuốc Diclofenac Natri

Từ kết quả nghiên cứu có thể áp dụng vào thực tiễn

5. Tính mới của đề tài (nếu có)

Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclofenac

Natri từ các loại vật liệu CVK nạp thuốc trong các môi trường giải phóng

thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau.

Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản

xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu CVK nạp thuốc.

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK)

1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus

Gluconacetobacter Xylinus được xếp vào chi Gluconacetobacter, thuộc

họ vi khuẩn Acetobacteraceae [8].

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường nuôi cấy dịch thể, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose [8].

Sự phát triển của Gluconacetobacter và khả năng tổng hợp cellulose

tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu có trong môi trường nuôi cấy.

Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus: độ pH thấp, lượng oxy cần cung cấp rất lớn, nhiệt độ thích hợp là 25-30ºC [8].

1.1.2. Màng cellulose vi khuẩn

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết mắt xích β-D- Glucose, có công thức cấu tạo là ( C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích. Cellulose vi khuẩn ( CVK) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ[7].

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose thực vật (PC)[7]. Nhưng cellulose vi khuẩn có những đặc tính vượt trội do được cấu tạo từ các bó sợi microfibril và không có sự kết hợp của các hợp chất phân tử. những đặc tính ưu việt hơn của cellulose vi khuẩn là: độ chịu lực tốt hơn, tính đàn hồi, độ bền cơ học cao hơn, …

Cellulose vi khuẩn được tạo thành từ 2 loại cấu trúc tinh thể riêng biệt có nguồn sản xuất từ vi sinh vật, kích thước khoảng 20 micromet. Mức độ

polimer hóa của CVK thường từ 2000 – 6000 gốc glucose (1 số vi khuẩn đặc biệt có thể đạt 16000- 20000 gốc glucose).

Tính chất của cellulose vi khuẩn:

Có cấu trúc mạng tinh thể và có kích thước ổn định.

Có sức căng, độ bền sinh học, độ bền hóa học, độ bền cơ học và độ tinh

sạch cao.

Có khả năng phục hồi sau khi bị thủy phân bởi 1 số vi sinh vật.

Có khả năng chịu nhiệt và khả năng tạo tinh thể tốt.

Được tổng hợp một cách trực tiếp dưới dạng sợi chỉ nhỏ hoặc dạng

màng mỏng.

Do cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin và cấu trúc của CVK có thể biến đổi trong quá trình nuôi cấy nên ta có thể kiểm soát được kích thước, lý tính cũng như chất lượng của cellulose trong quá trình nuối cấy [6].

Cellulose được xem là nguồn vật liệu có nhiều ưu thế nên hiện nay ứng

dụng của cellulose đang được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực:

Trong y học: Màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus tẩm mù u có tác dụng giống màng sinh học trị bỏng. Đặc biệt, người ta đã sử dụng màng CVK tinh sạch để làm da nhân tạo trong chữa vết thương [12].

Trong thực phẩm: các sản phẩm ứng dụng của CVK như màng bao

thực phẩm, một số món tráng miệng, …

1.2. Thuốc Diclofenac Natri

1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi

Diclofenac là một thuốc chống viêm không steroid[2].

+ Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2

+ Tên quốc tế: Diclofenac Natri

+ Tên IUPAC: 2-(2-(2,6- dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid

+ Công thức cấu tạo: được mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac

1.2.2.Tính chất

- Diclofenac Natri là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ.

- Diclofenac Natri dễ tan trong methanol, trong ethanol 96%, hơi tan

trong nước, khó tan trong aceton [4].

- Nóng chảy ở khoảng 280°C [4].

1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac

Diclofenac- một dẫn chất của acid phenylacetic. Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid[2] có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Ngoài ra, Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị các cơn đau khác (như đau răng, đau sau khi sinh). Tuy nhiên với các cơn đau nghiêm trọng và bất ngờ thì nên sử dụng các thuốc giảm đau có tác dụng giảm đau nhanh hơn Diclofenac.

Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành những chất trung gian của quá trình viêm như prostaglandin, prostacyclin và thromboxan. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu

1.2.4. Động học giải phóng của thuốc

Diclofenac được hấp thụ qua đường tiêu hóa sau khi uống. Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với protein huyết tương, chủ yếu với albumin (chiếm khoảng 99 %) [2]. Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả dụng của liều tiêm tĩnh mạch. 2 giờ sau khi uống, nồng độ thuốc đạt tối đa trong huyết tương, 4 đến 6 giờ sau khi uống, nồng độ trong

dịch bao hoạt dịch đạt mức cao nhất. Tác dụng của thuốc xuất hiện 20 - 30 phút sau tiêm bắp, 30 - 60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 60 - 120 phút sau khi uống.

Nửa đời trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn; phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thụ, chuyển hóa và đào thải không phụ thuộc vào tuổi. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa các lần dùng thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy, ngay cả khi chức năng thận và gan bị giảm.

Chỉ định

Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp. Thống kinh nguyên phát. Ðau cấp (viêm sau chấn thương, sưng nề) và đau mạn. Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên.

1.2.5. Dược lực học của thuốc

Diclofenac có cấu trúc liên quan với Meclofenamat Natri và Acid Meclofenacmic và có tác động dược lí tương tự như các NSAID nguyên thủy khác. Thuốc có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt. Tác dụng của thuốc là làm thoái hóa mạch máu mới sinh trong mô viêm của động vật. Ngoài ra còn làm ức chế sự hình thành mạch máu. Cơ chế hoạt động của thuốc chưa được xác lập rõ ràng, nhưng có nhiều tác dụng liên quan đến sự ức chế tổng hợp prostaglandin [2].

1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc

(5 - 15% người bệnh dùng Diclofenac bị ảnh hưởng bởi tác dụng phụ ở

bộ máy tiêu hóa) [2].

Chú ý: Trong số các thuốc chống viêm không steroid, Diclofenac độc

hơn Ibuprofen và Ibuprofen, là thuốc ít độc nhất nhưng vẫn hiệu quả.

Tác dụng phụ thường gặp, ADR > 1/100

Toàn thân: Đau đầu, bồn chồn.

Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng,

chán ăn, khó tiêu.

Gan: Tăng các transaminase.

Tác dụng phụ ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100

Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen),

choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.

Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ (khi đặt thuốc vào trực tràng).

Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu,

dễ bị kích thích.

Da: Mày đay.

Hô hấp: Co thắt phế quản.

Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt.

Tai: Ù tai

Tác dụng phụ hiếm gặp, ADR <1/1000

Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc.

Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn.

Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng

bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu.

Gan: Rối loạn co bóp túi mật, test chức năng gan bất thường, nhiễm

độc gan (vàng da, viêm gan).

Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội

chứng thận hư.

1.3. Tình hình trên thế giới và Việt Nam

1.3.1. Trên thế giới

Trên thế giới, đã có những công trình nghiên cứu về thuốc Diclofenac

natri như:

- Laila Hassanein Emara, Nesrin Fouad Taha, Rania Mohamed Badr , Nadia Mohamed Mursi (2012)[21] đã nghiên cứu phát triển hệ thống bơm thẩm thấu để phân phối có kiểm soát Natri Diclofenac

- Mitra Jelvehgari , Hadi Valizadeh , Ramin Jalali Motlagh, Hassan Montazam (2014)[22] đã nghiên cứu xây dựng và đặc tính hóa lý của Buccoadhesive Microspheres chứa Diclofenac Sodium.

- Srikanth A ABSTRACT, Nagaveni, SaravanaKumar, Prasanna Raju Y(2013)[20] đã nghiên cứu đặc tính và chế tạo DICLOFENAC SODIUM loại MICROCAPSULES LOADED.

1.3.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới. Các nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK mới dừng lại ở mức độ khiêm tốn và hầu hết là ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Hiện nay, chúng ta đã có thể tự sản xuất màng CVK bằng phương pháp sản xuất đơn giản là lên men tĩnh. Phương pháp này sử dụng trang thiết bị đơn giản, giá thành thấp và tốc độ sinh sản nhanh, mang lại nhiều hiệu quả trong việc sản xuất màng CVK ứng dụng vào thực tiễn.

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Khả năng giải phóng Diclofenac của màng CVK được lên men từ môi

trường nước dừa già.

2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí

nghiệm.

- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường

ĐHSP Hà Nội 2.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1.1. Chủng vi sinh

Vi khuẩn cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi cấy tại phòng sạch Vi sinh- Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2.

2.3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu: nước dừa già, nước cất.

Hóa chất:

Thuốc Diclofenac dạng tinh khiết và dạng chế phẩm bán trên thị trường

(viên nén).

Vật liệu Cellulose được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn lên men

trong môi trường nước dừa già.

Đường glucose, acid acetic, peptone, diamoni photphat, amoni sulfat,

acid citric, cao nấm men, nước cất, cồn 96o.

2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ

- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản).

- Cân phân tích CP 224S, cân kỹ thuật TE 412 (Sartorius – Thụy Sỹ)

- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)

- Bể ổn nhiệt 1013

- Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)

- Bể rửa siêu âm TCP 280

- Tủ lạnh Daewoo

- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác. (hộp nhựa, cốc đong

500ml, 1000ml, pipet, bình tam giác, kéo, giấy bạc, giấy thấm, …)

2.3.2. Cách bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già

- Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK

- Thí nghiệm 3: Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc thông

qua hệ thống được thiết kế

- Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn Diclofenac

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi

trường nước dừa già

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già

Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ ở 200°C, sau khi sấy xong lấy

ra và để nguội

Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo Bảng 2.1

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn

Thành phần Môi trường nước dừa già

Glucose 30g

Peptone 10g

Diamoni photphat 0,3g

Amoni sulfat 0,5g

Acid acetic 2%

Nước dừa già 1000ml

Dịch giống 10%

Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trường [14]; pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6 [10, 19], pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác [10].

Bước 3: Hấp khử trùng môi trường ở 111°C trong 15 phút.

Bước 4: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV từ 15-30 phút rồi để

nguội môi trường.

Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho

giống phân bố đều trong dung dịch.

Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 28°C

Bước 7: Thu màng CVK thô, rửa sạch chủng dưới vòi nước

2.3.3.2. Xử lí vật liệu CVK

- Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời

phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.

- Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt

môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.

+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113°C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ

+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là trung tính, ta thu được CVK tinh khiết [13,6].

Màng Cellulose vi khuẩn thô được xử lý theo sơ đồ Hình 2.1

Tách màng CVK thô

Ngâm trong NaOH 3%

Ép loại nước

Ngâm trong HCl 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong nước

48 giờ, kiểm tra tạp chất

Thu CVK tinh chế

Hình 2.1. Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men

Màng sau khi thu được cần đạt những yêu cầu sau:

- Mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt

- Có độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô

- Độ dày thích hợp của màng CVK thô: chọn màng CVK có độ dày

0,5cm và 1cm để tiến hành làm thực nghiệm

2.3.4. Phương pháp pha dung dịch đệm

Lượng thuốc được giải phóng được tiến hành thử nghiệm ở dung dịch

đệm có pH là 2; 4,5; 6,8; 7,4.

Pha các dung dịch đệm có pH như trên: - Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm 11,9ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH).

- Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong

1000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH).

- Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 68,8g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).

- Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).

2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac

Pha thuốc Diclofenac trong Ethanol ở các nồng độ 10%, 20%, 40%,

60%, 80%, 100%

Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch mẫu chứa thuốc Diclofenac ở các bước sóng 276nm, 278nm, 281nm.

Tiến hành đo 3 lần sau đó lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc để

dựng đường chuẩn

Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau

thể hiện ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 276nm

STT Nồng độ Giá trị OD 276nm(n=3)

Giá trị trung bình ( mg/ml) Lần 1 Lần 3 Lần 2

1 10 0,105 0,108 0,108 0,107 ± 0,001

2 20 0,213 0,214 0,215 0,214 ± 0,001

3 40 0,426 0,42 0.444 0,43 ± 0,008

4 60 0,643 0,638 0,645 0,642 ± 0,003

5 80 0,85 0,86 0,87 0,86 ± 0,006

6 100 1,06 1,075 1,075 1,07 ± 0,006

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm

Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.2

OD 276nm

y = 0.1857x - 0.1333 R² = 0.9922

120%

100%

80%

60%

OD 276nm

40%

20%

Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm

Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm

Giá trị OD 278nm (n=3) Giá trị trung bình

STT Nồng độ (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3

10 0,116 0,116 0,119 0,117 ± 0,013 1

20 0,21 0,25 0,23 0,23 ± 0,013 2

40 0,49 0,46 0,46 0,47 ± 0,013 3

60 0,66 0,76 0,68 0,7 ± 0,04 4

80 0,95 0,94 0,96 0,94 ± 0,006 5

100 1,169 1,173 1,171 0,171 ± 0,001 6

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm

Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.3

OD 278nm

120%

100%

y = 0.218x - 0.1583 R² = 0.9917

80%

60%

OD 278nm

40%

20%

Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm

Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n =3) ở bước sóng 281nm

Giá trị OD 281nm (n=3) Giá trị trung bình

STT Nồng độ (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,118 0,123 0,1235 0,12 ± 0,002 10 1

0,24 0,28 1.005 0,25 ± 0,014 20 2

0,48 0,49 0,72 0,49 ± 0,001 40 3

0,7 0,8 0,5 0,74 ± 0,004 60 4

0 985 0,98 0,23 0,99 ± 0,04 80 5

1,233 1,234 0,119 1,234 ± 0,001 100 6

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm

Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.4

OD 281nm

y = 0.2297x - 0.1667 R² = 0.9926

120%

100%

80%

60%

OD 281nm

40%

20%

Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm

Ta thu được 3 phương trình đường chuẩn ở 3 bước sóng khác nhau:

+ Tại bước sóng 276 nm: Y = -0.2002x + 1.2522 (R2= 9905) (1)

+ Tại bước sóng 278 nm: Y = -0.218x + 1.3677 (R2= 9917) (2)

+ Tại bước sóng 281 nm: Y = -0.2297x + 1.4413 (R2 = 9926) (3)

Trong đó:

x - nồng độ Diclofenac (mg/ml).

y - giá trị OD tương ứng.

R2 là hệ số tương quan.

2.3.6. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC

Lượng thuốc Diclofenac hấp thụ vào màng CVK được tiến hành thử

nghiệm trên 2 mẫu:

Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm.

Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 1cm.

Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô và 2 bình tam giác có chữa sẵn 100ml dung dịch Diclfenac 5%. Sau đó cho vào bể rung siêu âm để ở nhiệt độ 37oC, trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi hoặc có thay đổi nhưng không đáng kể, thực hiện lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi lấy giá trị trung bình để tính toán.

Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn (1), (2), (3) tương ứng với các bước sóng ta được nồng độ Diclofenac (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Diclofenac có trong dung dịch theo công thức số 4[5]:

C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] × 100% (4)

Trong đó:

C%: nồng độ phần trăm khối lượng – thể tích chỉ số mg chất tan có trong 10ml dung dịch

Mct: khối lượng chất tan (mg)

Vdd: thể tích của dung dịch (ml)

Công thức tính lượng thuốc được hấp thụ qua vật liệu BC:

mBC = mBC(2) – mBC(1) (5)

Trong đó: mBC là khối lượng thuốc được hấp thụ qua vật liệu BC (mg)

mBC(1) là khối lượng của vật liệu BC lúc ban đầu (mg)

mBC(2) là khối lượng của vật liệu BC sau khi hấp thụ thuốc (mg)

(𝑄𝑡−𝑄𝑑 )

Hiệu suất nạp thuốc vào màng được tính theo công thức sau:

𝑄𝑡

× 100% H =

Trong đó:

EE: phần trăm thuốc nạp vào màng

Qt: lượng thuốc lí thuyết

Qd: lượng thuốc còn lại

2.3.7. Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi trường nước dừa già

❖ Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][24]

❖ Cách tiến hành:

- Lấy vật liệu BC đã được nạp thuốc Diclofenac với độ dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5) cho vào các bình chứa 900ml môi trường pH như trên.

- Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ

37oC ± 0,5°C.

- Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h, tiến

hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó.

- Sau mỗi khoảng thời gian số lượng mẫu rút ra là 5ml và được bổ sung

5ml dung dịch đệm tương ứng.

- Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị

trung bình.

❖ Công thức tính tỉ lệ giải phóng thuốc [24]:

𝐶𝑡𝑥𝑉1+ ∑

𝐶𝑖𝑥𝑉2

𝑖=𝑛−1 𝑖=1 𝑚

R% = x100% (6)

Trong đó:

R: Tỉ lệ giải phóng thuốc;

Ct: Nồng độ của Diclofenac trong dung dịch tại thời điểm t;

V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau; n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng;

V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào;

m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các vật liệu CVK.

2.3.8. Phương pháp xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, sau đó lấy giá trị trung bình để tính toán. Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và phần mềm JMP phiên bản 9.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng test thống kê. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi trị số p < 0,05.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Màng CVK được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già

Khi được nuôi cấy tĩnh trong bình tam giác ở điều kiện nhiệt độ phòng vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus sẽ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để sinh trưởng và phát triển. Vi khuẩn làm quen với môi trường, làm giảm nhẹ pH môi trường bằng cách sinh ra acid. Sau đó vi khuẩn bắt đầu sản sinh ra một lớp màng CVK trên bề mặt môi trường có màu trắng đục có lẫn nhiều tạp chất, lớp màng này dày dần lên đến khi môi trường hết chất dinh dưỡng, sau 7-10 ngày nuôi cấy tĩnh màng có độ dày khoảng 0,5-1cm, vào ngày thứ 10 màng có độ dày 1cm. Tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy mà ta thu được màng có độ dày khác nhau.

Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già

3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường

Khi nuôi cấy tĩnh trong môi trường nước dừa già màng CVK có màu trắng ngà, bề mặt phẳng, trơn, chứa nhiều nước. Ở mỗi thời điểm khác nhau ra thu được màng có độ dày mỏng khác nhau. Thu màng nuôi cấy ở ngày thứ 5 thì độ dày của màng khoảng 0,3cm, đến ngày thứ 7 độ dày của màng

khoảng 0,5cm. Như vậy ta có thể chế tạo được màng CVK có độ dày theo mong muốn, như Hình 3.2

Hình 3.2. Màng thu được sau quá trình nuôi cấy

Hình 3.3. Màng CVK được bảo quản trong tủ lạnh

3.3. Tinh chế màng CVK

Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn, giúp màng có thể hấp thụ được lượng thuốc tối đa.

Sau khi tách ra từ môi trường nuôi cấy, màng CVK được rửa với nước rồi ngâm trong dung dịch NaOH 3%, sau 48 giờ ngâm dung dịch có màu nâu, tiếp tục rửa màng CVK với nước rồi ngâm với HCl trong 48 giờ. Cuối cùng lấy màng ra rửa với nước và ta thu được màng CVK tinh chế có màu trắng.

Hình 3.4. Màng CVK đang được xả dưới vòi nước

3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng khỏi màng CVK

Màng sau khi hấp thụ Diclofenac được sấy khô ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 20 phút. Cho vào 2 lọ chứa sẵn 1000ml dung dịch đệm có pH =2, pH =4,5, pH = 6,8, pH = 7,4.

Hình 3.5. Màng CVK thu được sau quá trình hấp thụ

Cho màng BC vào các dung dịch đệm có độ pH lần lượt là 2; 4,5; 6,8; 7,4 (mỗi bình có dung tích 900ml). Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/ phút ở nhiệt độ 37oC

Hình 3.6. Màng được cho vào máy giải phóng

Sau 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h lấy mỗi mẫu 5ml dung dịch ra đo quang phổ đồng thời đưa lại vào các lọ vừa lấy 5ml dung dịch đệm tương ứng.

Hình 3.7. Mẫu được rút ra các lọ nhỏ để đo quang phổ

Giá trị OD đo được tại các thời điểm lấy mẫu được trình bày ở các

Bảng 3.1 và Hình 3.7, Bảng 3.2 và Hình 3.8.

Bảng 3.1. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng không ép

Thời gian giải phóng thuốc (giờ) pH

0,5 1 2 4 6 8 10 12 24

0,12

0,14

0,16

0,26

0,32

0,37

0,46

0,65

0,75

Độ dày của CVK (cm)

0,0021

0,0033

0,0028

0,0045

0,0043

0,0058

0,0034

0,0028

0,0045

0,5cm 2

0,15 ±

0,17 ±

0,19 ±

0,3 ±

0,36 ±

0,49 ±

0,57 ±

0,68 ±

0,82 ±

0,0039

0,002

0,004

0,0028

0,0067

0,0035

0,0048

0,0057

0,005

0,16

0,18

0,31

0,38

0,53

0,65

0,72

0,81

0,2

1cm

0,0042

0,0061

0,0084

0,0047

0,0048

0,0056

0,0029

0,0054

0,0077

0,17

0,2

0,22

0,32

0,43

0,58

0,69

0,78

0,85

0,5cm 4,5

0,0067

0,0074

0,0086

0,0057

0,0026

0,0045

0,0036

0,0019

0,0056

0,16

0,21

0,24

0,34

0,46

0,62

0,71

0,79

0,91

1cm

0,0061

0,0052

0,0034

0,0065

0,0051

0,0066

0,0078

0,0073

0,0035

0,24

0,39

0,41

0,49

0,56

0,64

0,75

0,83

0,95

0,5cm 6,8

0,0049

0,0025

0,0042

0,0063

0,0054

0,0037

0,0064

0,0045

0,0049

0,14

0,18

0,21

0,28

0,42

0,59

0,70

0,81

0,90

1cm

± 0,0026

± 0,0061

± 0,0064

± 0,0038

± 0,0022

± 0,0037

± 0,0046

± 0,0071

± 0,0049

0,5cm 7,4

0,23 ± 0,0078

0,28 ± 0,0033

0,32 ± 0,0045

0,38 ± 0,0076

0,51 ± 0,0029

0,62 ± 0,0044

0,74 ± 0,0019

0,82 ± 0,0086

0,93 ± 0,0027

1cm

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0.5

6 MẬT ĐỘ QUANG PHỔ (nm)

pH= 2 0,5cm

pH= 2 1cm

pH= 4,5 0,5cm

pH=4,5 1cm

pH= 6,8 0,5cm

pH= 6,8 1cm

pH= 7,4 0,5cm

pH= 7,4 1cm

Hình 3.8. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3)

Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép 50%

pH

Thời gian giải phóng thuốc (giờ)

Độ dày

của

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24 CVK

(cm)

0,5cm 2

0,13

0,16

0,19

0,26

0,39

0,47

0,59

0,64

0,78

0,0023

0,0037

0,0028

0,0075

0,0063

0,0088

0,0034

0,0085

0,0045

1cm

0,16

0,22

0,31

0,38

0,49

0,53

0,67

0,78

0,84

± 0,0049

± 0,003

± 0,007

± 0,008

± 0,0097

± 0,0055

± 0,0078

± 0,0067

± 0,005

0,5cm 4,5

0,17

0,19

0,29

0,35

0,57

0,65

0,76

0,79

0,82

0,0045

0,0077

0,0084

0,0095

0,0048

0,0056

0,0059

0,0054

0,0067

1cm

0,19

0,28

0,41

0,47

0,66

0,73

0,79

0,84

0,87

0,0067

0,0074

0,0096

0,0077

0,0067

0,0045

0,0036

0,0069

0,0056

0,5cm 6,8

0,19

0,24

0,45

0,56

0,68

0,79

0,87

0,93

0,95

0,0068

0,0052

0,0044

0,0035

0,0051

0,0066

0,0078

0,0083

0,0085

1cm

0,26

0,37

0,57

0,68

0,76

0,86

0,89

0,95

0,99

0,0069

0,005

0,0052

0,0063

0,0054

0,0037

0,0064

0,0045

0,0079

0,5cm 7,4

0,18

0,22

0,36

0,48

0,62

0,77

0,83

0,91

0,96

± 0,0026

± 0,0061

± 0,0064

± 0,0038

± 0,0072

± 0,0057

± 0,0046

± 0,0081

± 0,0049

1cm

0,24

0,34

0,46

0,51

0,70

0,82

0,85

0,94

0,98

± 0,0078

± 0,0033

± 0,0045

± 0,0096

± 0,0029

± 0,0084

± 0,0019

± 0,0046

± 0,0067

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0.5

6 MẬT ĐỘ QUANG PHỔ (nm)

pH= 2 0,5cm

pH= 2 1cm

pH= 4,5 0,5cm

pH=4,5 1cm

pH= 6,8 0,5cm

pH= 6,8 1cm

pH= 7,4 0,5cm

pH= 7,4 1cm

Hình 3.9. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm đã ép 50% trong các môi trường pH khác nhau (n=3)

Số liệu ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 cho thấy giá trị OD (y) trung bình của thuốc Diclofenac giải phóng từ màng CVK- Diclofenac ở cả 4 môi trường đệm pH đều tăng dần đến 1 thời điểm nhất dịnh thì dừng lại và không tăng nữa ở cả 2 độ dày màng 0,5cm và 1cm. Giá trị OD (y) đều đạt cực đại ở thời thời điểm như nhau dù ở các môi trường pH khác nhau.

Ở cả 4 môi trường đệm pH, giá trị OD (y) trung bình của thuốc Diclofenac giải phóng từ màng CVK – Diclofenac đều đạt cực đại tại 24 giờ và lớn nhất ở môi trường pH = 6,8.

Từ các giá trị OD (y) trung bình trong Bảng 3.1 và 3.2 của thuốc Diclofenac khi tiến hành giải phóng từ màng CVK, thay vào phương trình (1) (2) (3) tính được nồng độ CM tương ứng với từng khoảng thời gian. Sau khi tìm được giá trị nồng độ Diclofenac, thay vào công thức (6) ta tính được tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của màng CVK – Diclofenac trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau như trong Bảng 3.3 và Bảng 3.4.

Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3)

pH

Thời Gian

0,5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 24 h

Độ dày

màng

0,5cm

11,94

13,01

14,15

15,44

16,87

17,09

17,67

18,23

18,91

2

± 0,003

± 0,004

± 0,006

± 0,009

± 0,006

± 0,007

± 0,002

± 0,004

± 0,0058

1cm

12,21

13,63

14,22

14,59

15,18

15,85

18,94

19,02

20,67

± 0,003

± 0,001

± 0,007

± 0,009

± 0,008

± 0,002

± 0,009

± 0,008

± 0,0079

0,5cm

4,5

11,80 ±

12,44 ±

13,29 ±

13,94 ±

14,94 ±

15,31 ±

17,89 ±

18,98 ±

20,41 ±

0,009

0,003

0,005

0,002

0,004

0,007

0,004

0,002

0,0015

1cm

12,68

13,26

13,99

14,58

15,47

16,09

18,50

19,55

21,34

± 0,002

± 0,004

± 0,006

± 0,008

± 0,004

± 0,000

± 0,001

± 0,004

± 0,0063

0,5cm

6,8

12,44 ±

13,87 ±

13,95 ±

15,84 ±

16,59 ±

18,10 ±

19,12 ±

20,08 ±

21,87 ±

0,008

0,003

0,005

0,003

0,007

0,001

0,009

0,001

0,0027

1cm

13,48 ±

14,51 ±

14,74 ±

15,41 ±

16,00 ±

16,68 ±

18,74 ±

20,49 ±

22,31 ±

0,005

0,003

0,005

0,002

0,001

0,002

0,006

0,005

0,0016

0,5cm

12,16

12,80

13,01

13,79

15,22

15,81

17,89

20,01

21,25

7,4

± 0,006

± 0,005

± 0,002

± 0,004

± 0,007

± 0,001

± 0,003

± 0,009

± 0,0045

1cm

13,19 ±

13,93 ±

14,51 ±

15,11 ±

15,78 ±

16,52 ±

18,52 ±

20,08 ±

21,89 ±

0,003

0,006

0,009

0,004

0,007

0,003

0,001

0,002

0,0056

0.5 1 2 4 6 8 10 12 24

Thời gian

pH4.5 1cm

pH6.8 0.5cm

pH6.8 1cm

pH2 0.5cm pH2 1cm pH4.5 0.5cm

pH7.4 0.5cm pH7.4 1cm

Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng chưa ép ở các pH và thời gian khác nhau

Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép nước 50% ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3)

Thời gian

Độ

0,5 h

1 h

2 h

4 h

6 h

8 h

10 h

12 h

24 h

dày

màng

0,5cm 12,78

13,93

13,94

15,02

15,47

16,70

17,80

18,25

19,28

0,0017

0,0026

0,0045

0,0016

0,0019

0,0023

0,0048

0,0009

0,0026

1cm

13,40

14,43

15,76

16,88

17,49

18,17

18,25

19,06

21,02

± 0,0003

± 0,0014

± 0,0057

± 0,0027

± 0,0023

± 0,0017

± 0,0041

± 0,0053

± 0,0072

0,5cm 12,79

13,45

14,33

14,99

16,02

17,13

18,34

19,28

20,66

4,5

0,0046

0,0034

0,0025

0,0047

0,0019

0,0017

0,0062

0,0044

0,0011

1cm

13,48

14,07

14,81

16,87

17,77

18,39

19,22

19,73

21,71

0,0024

0,0012

0,0006

0,0043

0,0029

0,0038

0,0035

0,0072

0,0022

0,5cm 12,87

13,67

14,62

15,36

16,39

17,94

18,62

19,86

22,16

6,8

0,0011

0,0012

0,0021

0,0037

0,0054

0,0083

0,0039

0,0013

0,0047

1cm

14,29

15,32

16,29

17,70

18,31

19,00

19,89

20,03

22,99

0,0014

0,0009

0,0023

0,0024

0,0051

0,0034

0,0017

0,0046

0,0029

0,5cm 13,30

13,82

14,04

14,85

15,58

17,27

18,46

19,12

21,59

7,4

0,0021

0,0046

0,0018

0,0034

0,0035

0,0091

0,0067

0,0028

0,0021

1cm

14,14 ±

15,25 ±

16,14 ±

16,82 ±

17,72 ±

18,33 ±

18,94 ±

19,22 ±

22,03 ±

0,0016

0,0063

0,0039

0,0041

0,0053

0,0029

0,0015

0,0037

0,0025

0.5

24 Thời gian

pH4,5 0,5cm pH6,8 1cm

pH2 0,5cm pH4,5 1cm pH7,4 0,5cm pH2 1cm pH6,8 0,5cm pH7,4 1cm

Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng ép nước 50% ở các pH và thời gian khác nhau

Nhận xét

Theo số liệu từ Bảng 3.3 và 3.4, cùng với biểu đồ Hình 3.10 và 3.11 ta thấy tỉ lệ giải phóng thuốc tăng dần, môi trường đệm pH = 6,8 màng có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn pH =2, pH = 4,5 và pH = 7,4.

Tỷ lệ giải phóng của các loại màng ở các môi trường pH đều đạt cực

đại tại 24 giờ, được thể hiện trong Bảng 3.5 và Hình 3.12:

Bảng 3.5. Tỷ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng cực đại tại 24 giờ của màng trong các môi trường pH khác nhau

Màng chưa ép Màng ép

Độ dày 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm

18,91 21,07 19,28 21,62 2

20,41 21,34 20,66 21,71 4,5

21,87 22,89 22,16 22,99 6,8

22%

Màng không ép nước

21%

20%

Màng ép nước 50%

19%

18%

0,5cm

1cm

0,5cm

1cm

0,5cm

1cm

0,5cm

1cm

pH=2

pH=4,5

pH=6,8

pH=7,4

21,25 21,89 21,59 22,03 7,4

Hình 3.12. Khả năng giải phóng thuốc cực đại của màng ở các môi trường pH khác nhau tại 24 giờ

Trong cùng một môi trường pH =2, pH = 4,5, pH = 7,4 hoặc pH = 6,8 thì màng CVK dày 1cm có khả năng giải phóng thuốc Diclofenac nhanh hơn và tốt hơn màng CVK dày 0,5cm. Tại pH =2, tỷ lệ thuốc Diclofenac được giải

phóng từ màng chưa ép có độ dày 1cm (21,07%) lớn hơn ở màng 0,5cm (18,91%); ở màng ép nước 50% có độ dày 1cm (21,62 %) lớn hơn màng có độ dày 0,5cm (19,28%).

Trong cùng một môi trường pH, màng ép nước 50% có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn màng chưa ép. Tại pH =6,8, tỉ lệ thuốc Diclofenac giải phóng là tốt nhất. Tỉ lệ thuốc Diclofenac giải phóng được được từ màng CVK ép nước 50% 1cm (25,18%) lớn hơn ở màng chưa ép 1cm (23,16%). Tại pH= 4,5 ở màng có cùng độ dày 1cm, màng ép có tỷ lệ giải phóng thuốc lớn hơn màng chưa ép (21,71 % > 21,34 %).

Hàm lượng thuốc Diclofenac được giải phóng từ màng CVK đạt nhiều nhất tại 24 giờ và lớn nhất ở pH = 6,8. Với màng chưa ép có độ dày 0,5cm là 21,87%, màng chưa ép có độ dày 1cm là 22,89%. Với màng ép có độ dày 0,5cm là 22,16%, màng ép có độ dày 1cm là 22,99%.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết Luận

Từ những kết quả đạt được sau nghiên cứu, chúng tôi rút ra được

những kết luận sau:

Trong cùng một môi trường pH = 2; pH =4,5; pH = 6,8 hoặc pH =7,4 thì màng có độ dày 1cm có khả năng giải phóng thuốc Diclofenac tốt hơn màng có độ dày 0,5cm.

Trong cùng một môi trường pH, màng ép nước 50% có khả năng giải

phóng thuốc Diclofenac nhiều hơn màng chưa ép.

Hàm lượng thuốc Diclofenac được giải phóng từ màng CVK đạt nhiều nhất tại 24 giờ và ở pH = 6,8 lượng thuốc được giải phóng nhiểu hơn so với các môi trường pH khác.

Kiến nghị

- Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để làm tăng sinh khả dụng và kéo

dài thời gian giải phóng của thuốc.

- Ngoài nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng CVK tạo bởi chủng Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già, tiếp tục nghiên cứu khả năng giải phóng của các thuốc khác trong các môi trường khác nhau như nước chè xanh, nước nho,….

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1]. Trịnh Hữu Bằng, Đỗ Công Quỳnh.( 2001), Sinh lý học người và

động vật,Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.

[2]. Bộ Y tế (2009), “Dược thư Quốc Gia Việt Nam ”, NXB Hà Nội

2009.

[3]. Bộ Y tế (2013), “Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ VI”,

pp.18.

[4]. Hội đồng Dược điển Việt Nam, Dược điển Việt Nam IV, Nxb Y

học, 2009.

[5]. Phan Thị Thu Hồng và cộng sự (2015),“Sử dụng cellulose tổng hợp vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4): 114-124.

[6]. Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ (2003), “Chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn”,Tạp chí Di truyền học & Ứng dụng, 3:49-54.

[7]. Dương Minh Lam và cộng sự (2013), “Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng vi khuẩn BHN2 sinh màng cellulose vi khuẩn”, Tạp chí Sinh học, 35(1):74-79.

[8]. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. “Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”. Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18-20.

[9]. Tạ Long (Chủ tịch hội Khoa học Tiêu hóa Việt Nam), “Báo cáo Hội

nghị Khoa học Tiêu hóa toàn quốc lần thứ 19 (tháng 11/2013)”. Tại Hà Nội.

[10]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A. xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (4), 453-462.

[11]. Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng cho Acetobacter xylinum bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36(1), 10 – 12.

[12]. Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose

trị bỏng từ Acetobactor xylinum”, đề tài KH&CN cấp Bộ Y tế.

Tài liệu tiếng Anh

[13]. Amin M.C.I.M. et al. (2012), "Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties", Journal of Sain Malaysiana, 41, 561-568.

[14]. Bertleff M.J., Lange J.F. (2010), “Perforated peptic ulcer disease:

a review of history and treatment”, Dig Surg, 27, pp.161-169.

[15]. Brown. E. (2007), “Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites”, Master of sience in chemical engineerin, Washington state university.

[16]. Choi Y. et al. (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J. Chem. Technol. Biotechnol, 79, 79-84.

[17]. Ghanshyam V. Joshi, Bhavesh D. Kevadiya & Hari C. Bajaj ranitidinecontaining formulation “Controlled of release

(2016), montmorillonite and Eudragit® E- 100”, 1046-1053

[18]. GSK (2009) “Zantac® prescribing information”, updated

April2009

[19]. HeinzL, KlausM, etal (2005), “Coloratlasofpharmacology3th”,

Thieme, p.172

[20]. Hestrin S., Schramm M. (1954), “Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum, 2. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose”, Biochem J. 58(2): 345-352.

[21]. Huang L. et al. (2013), "Nano-cellulose 3D-networks as controlled-release drug carriers", Journal of Materials Chemistry B (Materials for biology and medicine), 1, 2976-2984.

[22]. Kyle A.et al. (2008), “Examination of metformin hydroclorid in a

continuous dissolution/ HDM system”, Int. J. Pharmaceutics, 351, 127 – 132.

[23]. Pinto R.J. et al. (2009), “Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279–2289.

[24]. Thanh Xuan Nguyen.et al. (2014), “Chitosan – coated nano – liposomes for the oral delivery of berberin hydrochloride”, J. Mater. Chem.B, 2, 7149 – 7159.