K thu t PCR trong ch n đoán lao ỹ ậ ẩ
K THU T PH N NG CHU I POLYMERASE (PCR) Ỹ Ậ Ả Ứ Ỗ
PHÁT HI N M. TUBERCULOSIS TR C TI P TRONG M U B NH PH MỆ Ự Ế Ẫ Ệ Ẩ
K thu t PCR cho phép xác đ nh tác nhân gây b nh tr c ti p trong b nh ph m nh kh năng nh n bi tỹ ậ ị ệ ự ế ệ ẩ ờ ả ậ ế
và sao chép đ khuy ch đ i v m t s l ng đo n trình t đ c hi u trên genom c a vi khu n. Đ i v iể ế ạ ề ặ ố ượ ạ ự ặ ệ ủ ẩ ố ớ
M.tuberculosis, k thu t PCR phát hi n trình t 249 đôi baz n m trên đo n IS 6110, là trình t g n (IS-ỹ ậ ệ ự ơ ằ ạ ự ắ
insert sequence) đ c hi u và có kh năng t sao chép v i s l ng l n (1-25 l n) trong genome vi khu nặ ệ ả ự ớ ố ượ ớ ầ ẩ
thu c nhóm ộM.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).
Quá trình sao chép đ c th c hi n trong m t chu trình nhi t l p l i v i s tham gia c a enzyme ch uượ ự ệ ộ ệ ặ ạ ớ ự ủ ị
nhi u Taq polymerase có b n ch t là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat t do (dATP,ệ ả ấ ự
dTTP, dGTP, dCTP) và c p đo n m i đ c hi u cho đo n trình t đ nh sao chép. ặ ạ ồ ặ ệ ạ ự ị
S n ph m PCR đ c phát hi n b ng k thu t đi n di trên gen agarosa ho c các k thu t lai ghép mi nả ẩ ượ ệ ằ ỹ ậ ệ ặ ỹ ậ ễ
d ch khác nh lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot ho c lai ghép v i c ch tị ư ặ ớ ơ ấ
trên phi n nh a, v.v.ế ự
I. CÁC THÔNG TIN CHUNG C N BI T V PCRẦ Ế Ề
I.1. Nguyên lý c a PCRủ
PCR là k thu t khuy ch đ i s l ng ADN d a trên trình t ADN khuôn m u v i quy trình ti n hànhỹ ậ ế ạ ố ượ ự ự ẫ ớ ế
g m 3 giai đo n: bi n tính, g n m i và t ng h p kéo dài v i s tr giúp c a ADN polymerase ch uồ ạ ế ắ ồ ổ ợ ớ ự ợ ủ ị
nhi t, primers và deoxy-nucleotide triphosphatesệ (dNTPs)
I.2. Thông s chu kỳ PCRố
PCR đ c th c hi n v i các chu trình b nh ph m đã x lý 3 nhi t đ khác nhau t ng ng v i 3ượ ự ệ ớ ủ ệ ẩ ử ở ệ ộ ươ ứ ớ
giai đo n c n thi t cho vi c t ng h p ADN. M i chu kỳ bao g m 3 giai đo n: Bi n tính 90-95ạ ầ ế ệ ổ ợ ỗ ồ ạ ế ở 0C, g nắ
m i 40-65ồ ở 0C và t ng h p kéo dài 70-75ổ ợ ở 0C. Tuỳ theo n ng đ ADN đích có trong b nh ph m mà xácồ ộ ệ ẩ
đ nh s l ng chu kỳ c n th c hi n, s l ng trình t khuy ch đ i càng nhi u n u s chu kỳ càng tăng. ị ố ượ ầ ự ệ ố ượ ự ế ạ ề ế ố
I.3. Các b c c n thi t đ tránh nhi m v i M.tuberculosis ho c s n ph m PCR (amplicon) tướ ầ ế ể ễ ớ ặ ả ẩ ừ
đ t tr cợ ướ
I.3.1. Yêu c u đ i v i phòng thí nghi m:ầ ố ớ ệ
Quy trình th c hi n PCR c n đ c ti n hành t i 3 phòng thí nghi m khác nhau và theo nguyên t c l uự ệ ầ ượ ế ạ ệ ắ ư
thông m t chi u đ gi m thi u lây nhi m gây d ng tính gi .ộ ề ể ả ể ễ ươ ả Phòng th nh t: chu n b h n d ch n nứ ấ ẩ ị ỗ ị ề
(Mix) ch y PCR; phòng th hai: chu n b và x lý m u b nh ph m và cho b nh ph m vào ng ch aạ ứ ẩ ị ử ẫ ệ ẩ ệ ẩ ố ứ
mix; phòng th ba: phân tích s n ph m PCR. V n chuy n d ng c và hoá ch t c n theo chi u t phòngứ ả ẩ ậ ể ụ ụ ấ ầ ề ừ
th nh t (chu n b mix) đ n phòng th ba, ứ ấ ẩ ị ế ứ không đ cượ theo h ng ng c l i.ướ ượ ạ
Các dung d ch hoá ch t pha ch và x lý c n đ c kh trùng b ng h p t 121ị ấ ế ử ầ ượ ử ằ ấ ướ ở 0C trong 20 phút.
Nguyên v t li u nh ng ch y PCR, đ u côn, pipet Pasteur, ng đ ng b nh ph m, găng tay, v.v.ậ ệ ư ố ạ ầ ố ự ệ ẩ c nầ
đ c vô trùng và ch đ c dùng 1 l n, không dùng l i.ượ ỉ ượ ầ ạ
I.3.2. S d ng enzyme tiêu di t lây nhi m s n ph m PCR (amplicon) c a nh ng đ t tr c:ử ụ ệ ễ ả ẩ ủ ữ ợ ướ
Enzyme uracil ADN glycosylasa (UDG) có tác d ng nh n bi t và c t trình t ADN-s n ph m PCR vụ ậ ế ắ ự ả ẩ ở ị
trí Uracil (U) và t o nh ng m nh ADN gãy v n, vô hi u hoá amplicon nhi m t nh ng đ t PCR tr cạ ữ ả ụ ệ ễ ừ ữ ợ ướ
đó. Do v y, tr c khi th c hi n các chu kỳ khuy ch đ i trong chu trình PCR, c n b nh ph m 40ậ ướ ự ệ ế ạ ầ ủ ệ ẩ ở 0C
trong 10 phút v i enzyme UDG đ phá các trình t s n ph m PCR nhi m t các đ t tr c. Các chu trìnhớ ể ự ả ẩ ễ ừ ợ ướ
khuy ch đ i ti p theo s làm b t ho t ho t tính c a UDG v i nhi t đ > 55ế ạ ế ẽ ấ ạ ạ ủ ớ ệ ộ 0C. Sau khi ch y xong cácạ
chu kỳ khuy ch đ i, m u 72ế ạ ủ ẫ ở 0C trong th i gian h n 30 phút đ b t ho t hoàn toàn ho t tính c aờ ơ ể ấ ạ ạ ủ
UDG, không gây c n tr cho vi c đ c k t qu PCR.ả ở ệ ọ ế ả
II. K THU T PCR XÁC Đ NH M.TUBERCULOSISỸ Ậ Ị
II.1. Pha h n d ch Mix (th c hi n t i phòng chu n b Mix)ỗ ị ự ệ ạ ẩ ị
Đ pha ch h n d ch mix, tính s l ng m u c n xét nghi m và tính toán l ng Mix c n thi t v i cácể ế ỗ ị ố ượ ẫ ầ ệ ượ ầ ế ớ
thành ph n t ng ng. D i đây là ví d cách tính đ pha đ cho 50 ng PCR v i l ng 50ul mix/ ng.ầ ươ ứ ướ ụ ể ủ ố ớ ượ ố
Thành ph nầTrình
tự cho vào
S l ng (ul) choố ượ
t ng 50ul/ ngổ ố N ng đ cu iồ ộ ố
cùng
N c c t 2 l n Milli Qướ ấ ầ
Đ m ph n ng (10x)ệ ả ứ
Tris 100mM, pH 8,3
NaCl 500 mM
Gelatin 0,1% (w/v)
MgCl2 25mM
dNTP (h n h p)ỗ ợ
- dATP 20mM
- dCTP 20mM
- dGTP 20mM
- dUTP 20mM
M i: 50uMồ 330ug/ml
Ampli Taq polymerasa
Uracil-ADN-glycosylase
(UDG) 1U/ul
B nh ph m, ADN ho c TEệ ẩ ặ
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(g)
(h)
(i)
(k)
Tính l ng c n thi tượ ầ ế
5
5
4 ho c 6ặ
0,5
0,2
0,2
0,2
5-15
10mM TrisHCl
50 mM NaCl
0,01%
2-3 mM
0,2 mM/lo iạ
0,2 uM
1U/50ul
0,2/ ngố
5-15ul/ ngố
II.2. X lý b nh ph mử ệ ẩ
B c 1:ướ
- D ch : Ly tâm l y c n trong ng Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phútị ấ ặ ố
- Đ m : Kh nhi m b ng 1 th tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 th tích Natri Citrat 0,1M (29,4gr Na-ờ ử ễ ằ ể ể
citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml), l c cho đ m loãng đ u trong 15ắ ờ ề
phút, ly tâm tách c n nh đ i v i d chặ ư ố ớ ị
- M nh sinh thi t và m : Ly gi i b ng Protease K qua đêm 56ả ế ủ ả ằ ở 0C
B c 2:ướ X lý b nh ph m có máu b ng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH 8.3, 1mử ệ ẩ ằ
EDTA): cho 1 ml dung d ch TTE vào m u đã tách c n, l c k cho tan máu, ly tâm lo i b n c n i.ị ẫ ặ ắ ỹ ạ ỏ ướ ổ
B c 3:ướ B t ho t 100ấ ạ OC trong 10 phút
II.3. Tách ADN c a vi khu n lao trong b nh ph m (Ph ng pháp BOOM)ủ ẩ ệ ẩ ươ
B c 1:ướ Phá t bào gi i phóng ADNế ả
Cho 0,9ml dung d ch ly gi i t bào L6 (120g GuSCN, 100mlị ả ế 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH
8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20ml diatom 20% vào m i b nh ph mỗ ệ ẩ
L c k b ng máy l c trong ít nh t 10phút ắ ỹ ằ ắ ấ
Ly tâm, l y c nấ ặ
B c 2:ướ Tinh s ch ADNạ
R a 2 l n b ng dung d ch L2ử ầ ằ ị (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4)
R a 2 l n b ng Ethanol 70% ử ầ ằ
R a 1 l n b ng acetoneử ầ ằ
Ph i khô trong b n c 56ơ ể ướ oC (10-15 phút )
B c 3:ướ Thu h i ADNồ
Cho 70ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào m i m u, 56 ỗ ẫ ủ 0 C, 10 phút .
L c k , ly tâm 12000 vòng / 2 phút ắ ỹ
Tách n c n i ch a ADN và s d ng đ ch y PCRướ ổ ứ ử ụ ể ạ
II.4. Cho m u vào ng ph n ng PCRẫ ố ả ứ
Dung d ch có ch a ADN sau khi đ c tách t b nh ph m đ c cho vào ng ph n ng đã ch a s n 35 ulị ứ ượ ừ ệ ẩ ượ ố ả ứ ứ ẵ
h n d ch mix. M i b nh ph m c n có hai ng ph n ng ( ng a và ng b). ng a s d ng đ ch y ph nỗ ị ỗ ệ ẩ ầ ố ả ứ ố ố ố ử ụ ể ạ ả
ng v i b nh ph m,ứ ớ ệ ẩ ng b dùng đ ki m tra ch t c ch n u có trong b nh ph m. ng b ngoài ADNố ể ể ấ ứ ế ế ệ ẩ ố
tách t b nh ph m còn đ c cho thêm ADN c a ừ ệ ẩ ượ ủ M.smegmatis đã đ c bi n đ i b ng g n thêm m tượ ễ ổ ằ ắ ộ
đo n trình t IS6110. C p m i Pt18 và INS2 có kh năng khuy ch đ i trình t 249 đôi baz trên IS 6110ạ ự ặ ồ ả ế ạ ự ỏ
c a ủM. tuberculosis, và khuy ch đ i c trình t 305 đôi baz trên ế ạ ả ự ơ IS6110 c a ủM. smegmatis.
- ng a:ố 10ml d2 ADN đã tách t b nh ph mừ ệ ẩ
- ng b:ố 5ml d2 ADN đã tách t b nh ph m + 5ml dừ ệ ẩ 2 ADN M. smegmatis 10-11g/ml
- ng ch ng d ng : 10 ml ADN c a ố ứ ươ ủ M. tuberculosis 10-12g/ml (hay 10 femtogram trong m t ng ph nộ ố ả
ng t ng đ ng l ng ADN tách t 2-3 vi khu n)ứ ươ ươ ượ ừ ẩ
- ng ch ng âm : 10 ml dố ứ 2 TE
II.5. Ch ng trình ch y PCRươ ạ
II.6. Đi n di s n ph m PCRệ ả ẩ
S n ph m PCR đ c đi n di trên gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đ m TBE pH 8,3 v i 0,89M Tris,ả ẩ ượ ệ ệ ớ
0,89M axit boric và 0,02 EDTA): 20ul/gi ng, hi u đi n th 110V, dòng đi n 40 mA, t 30 đ n 45 phút.ế ở ệ ệ ế ệ ừ ế
Gel đ c l y ra và nhu m trong dung d ch ethidium bromide 0.2mg/ml (20 phút)ượ ấ ộ ị
II.7. Ch p nh và đ c k t quụ ả ọ ế ả
Soi gel d i đèn UV, ch p nh b ng phim Polaroidướ ụ ả ằ
Phân tích k t qu :ế ả B nh ph m có k t qu PCR d ng tính n u c 2 ng ph n ng a và b cùng d ngệ ẩ ế ả ươ ế ả ố ả ứ ươ
tính, ng th nh t cho v ch đ c hi u c a đo n ADN có đ dài phân t là 249 đôi baz và ng th haiố ứ ấ ạ ặ ệ ủ ạ ộ ử ơ ố ứ
cho v ch đ c hi u ng v i các phân t có đ dài 305 đôi baz , PCR cho k t qu âm tính n u ng thạ ặ ệ ứ ớ ử ộ ơ ế ả ế ố ứ
nh t âm tính (không có v ch) và ng th hai d ng tính, n u c hai ng cùng cho k t qu âmấ ạ ố ứ ươ ế ả ố ế ả
tính thì b nh ph m có ch t c ch ph n ng (hình 1).ệ ẩ ấ ứ ế ả ứ
K t qu cũng có th đ c b ng các ph ng pháp khác nh lai ghép Dot-blot v i probe đánh d u b ngế ả ể ọ ằ ươ ư ớ ấ ằ
ch t phóng x ho c v i h th ng biotinấ ạ ặ ớ ệ ố
III. CHU N B HOÁ CH T, DUNG D CH C N THI T CHO PCR CH N ĐOÁN LAOẨ Ị Ấ Ị Ầ Ế Ẩ
Dung d ch TTEị: 1% Triton X 100 pha trong 20mM Tris-HCl pH=8,3 + 1mM EDTA (b o qu n trong đôngả ả
l nh); H p t kh trùng 121ạ ấ ướ ử 0C x 15 phút
Dung d ch TEị: 10 mM Tris HCl + 1mM EDTA, pH 8,3; H p t kh trùng 120ấ ướ ử 0C x 20 phút
Dung d ch x lý đ m:ị ử ờ
Dung d ch 1 ( NaOH 1M): 40 gr NaOH / 1 lít Hị2O
Dung d ch 2 (Na-citrate 0,1M): 29,4gr Na-citrate.2Hị2O/lit,
Dung d ch 3 (N-acetyl-L-cysteine-NALC): 15 mg trong 3ml dd 1+ dd 2ị
H p t kh trùng 120ấ ướ ử 0C x 20phút đ i v i dung d ch 1 và 2 ố ớ ị
Dung d ch proteinase Kị: 5% Triton X-100, 1mg proteinase K hoà trong 1ml
20 mM Tris-HCl pH 8,3 + 1mM EDTA
Dung d ch phá v t bào và tách ADNị ỡ ế :
Dung d ch L6ị: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Th y s ) pha trong 100ml 0,1M Tris HCl,ụ ỹ
pH 6,4 + 22ml EDTA 0,2M và 2,6ml Triton X-100; h p t kh trùng 120ấ ướ ử 0Cx20 phút
Dung d ch r a L2ị ử : 10 gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6,4; h p t kh trùng 120ấ ướ ử 0Cx20 phút
H n d ch Diatom (celiteỗ ị ): 10 gr pha trong 50ml H2O + 500ul HCl 32% (ho c 445ul HCl 36%)ặ
Dung d ch ch y đi n diị ạ ệ
Dung d ch đ m TBE đ c 10X, pH=8,3:ị ệ ặ
- 0,89M Tris 108g
- 0,89M boric axit 55g
- 0,02M EDTA 40ml 0,5M EDTA pH8,0
- H2O 1 lít
Đ m ch y m u (loading buffer):ệ ạ ẫ 100% glycerol: 50ml
TE 10X 50ml
Bromophenol blue 0,015g