Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút cúm gia cầm tại khu vực lân cận thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin navet-fluvac 2 đối với vi-rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 9.64.01.02

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP. HCM - Năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 9.64.01.02

DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ

TP. HCM - Năm 2021

iii

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tại khu vực lân

cận Thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2

đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1” được thực hiện nhằm đánh giá tình hình

lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận;

xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và các chủng vi-rút sử dụng

trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2; đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia

cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc

clade 2.3.2.1. Kết quả đạt được như sau:

Kết quả khảo sát 2.880 mẫu xét nghiệm tại cơ sở giết mổ trên đàn gia cầm có

nguồn gốc từ 8 tỉnh gồm Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh,

Long An, Tiền Giang, Bến Tre và Thành phố Hồ Chí Minh và 1.800 mẫu xét

nghiệm thu thập trên đàn gia cầm khỏe mạnh tại 5 huyện: Củ Chi, Hóc Môn, Bình

Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ không phát hiện trường hợp dương tính vi-rút cúm

A/H5N1. Nghiên cứu đã phát hiện 51/63 mẫu xét nghiệm dương tính với vi-rút

Cúm A/H5N1, từ các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm tại các hộ chăn

nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận.

Dấu hiệu lâm sàng phổ biến trên đàn gà, vịt mắc bệnh Cúm A/H5N1 gồm có ủ

rũ, bỏ ăn, phù đầu, thở khò khè, liệt chân, sả cánh, phân trắng xanh, xoay vòng

vòng, co giật. Dấu hiệu thần kinh trên vịt là điển hình. Bệnh tích điển hình gồm có:

não, phổi xuất huyết, xuất huyết lớp mỡ vành tim, gan và lách sưng xuất huyết, khí

quản xuất huyết có thể sử dụng để chẩn đoán lâm sàng. Da chân xuất huyết trên gà

là bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia cầm ở gà.

Kết quả phân tích di truyền 26/51 chủng vi-rút Cúm A/H5N1 được chọn ngẫu

nhiên trong giai đoạn 2013 - 2015 ghi nhận, có 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 3

chủng thuộc clade 1.1.2 và 1 chủng thuộc clade 2.3.2.1a.

Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c trong nghiên cứu có sự

tương đồng trình tự nucleotide rất cao với 2 chủng vi-rút sử dụng công cường độc

A/chicken/DL/NAVET 0292(14)/2013 và A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-

17A261/2017 thuộc clade 2.3.2.1c, trong khoảng 96,1 - 99,1%; và với 2 chủng vi-

rút sử dụng trong vắc-xin, 95,0 - 96% với chủng A/reassortant/USCDC_RG30 và

91,3 - 92,2% với chủng A/reassortant/NIBRG-14.

Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thực địa thuộc clade 1.1.2 chỉ tương đồng di

truyền ở mức 89,7 - 89,8% với chủng vi-rút sử dụng trong vắc-xin

A/reassortant/USCDC_RG30, nhưng tương đồng cao hơn với chủng vi-rút trong

vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 ở mức 93,3 - 93,4%.

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt độ an toàn theo

tiêu chuẩn sau khi tiêm phòng cho đàn gà, vịt và vịt trời, ngay cả khi tiêm với liều

gấp đôi liều chỉ định.

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có hiệu quả bảo hộ rất cao đối với vi-rút Cúm gia cầm

thuộc clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c trên gà, vịt và vịt trời. Đối với gà chỉ cần

tiêm 1 lần ở thời điểm 2 tuần tuổi; đối với vịt và vịt trời phải tiêm phòng lặp lại 2

lần ở thời điểm 14 ngày tuổi và tiêm lặp lại mũi tiêm thứ 2 sau 14 ngày kể từ ngày

tiêm mũi 1.

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng giảm mạnh sự bài thải chủng vi-rút Cúm

gia cầm A/H5N1 độc lực cao sau khi công độc. Tỷ lệ bài thải vi-rút sau khi công

cường độc 3 ngày, giữa gà, vịt được tiêm phòng và không được tiêm phòng vắc-xin

Navet-Fluvac 2, có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Thời gian miễn dịch bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên đàn gà và vịt

được tiêm phòng tối thiểu là 6 tháng với hiệu giá kháng thể HI trung bình đạt trên

6log2 ở gà và trên 4log2 ở vịt .

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 tạo được miễn dịch bảo hộ đối với công cường độc

chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao không chỉ ở những vịt có hiệu giá

kháng thể HI trung bình >4log2, mà cả ở những vịt có hiệu giá kháng thể HI thấp

hơn 4log2.

SUMMARY

Thesis “Prevalence of Avian Influenza Virus in Ho Chi Minh region and

evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy against Avian Influenza Virus

clade 2.3.2.1 in poultry” was conducted in order to (i) determine the prevalence of

Avian Influenza Virus (AIV) in poultry in Ho Chi Minh region, (ii) analyze genetic

relation of field and vaccine virus strains, and (iii) evaluate the protective efficacy

of Navet-Fluvac 2 for poultry against AIV clade 2.3.2.1. The results showed that:

All of these 2,880 samples at slaughterhouses on poultry flocks originating from 8

provinces: Dong Nai, Binh Duong, Ba Ria Vung Tau, Tay Ninh, Long An, Tien

Giang, Ben Tre, Ho Chi Minh City and 1,800 samples collected from healthy

poultry flocks in 5 districts: Cu Chi, Hoc Mon, Binh Chanh, Nha Be and Can Gio

were negative for influenza A/H5N1 virus by RT-PCR test. However, from

suspected cases of avian Influenza in livestock households in Ho Chi Minh City and

neighboring provinces, the study detected 51/63 samples that were positive for

Influenza A/H5N1 virus.

The common clinical signs in chickens and ducks infected with influenza A/H5N1

were lethargy, anorexia, swollen head, wheezing, leg paralysis, drooping wings,

greenish white feces, torticollis, incoordination. Neurological signs in ducks are

typical for AI. Haemorrhage lesions were observed on brain and many visceral

organs including lungs, coronary pericardium, liver, spleen, and trachea.

Haemorrhage on foot skin of chickens is a typical lesion of Avian Influenza in

chickens.

The results of genetic analysis of 26/51 strains of Influenza A/H5N1 virus randomly

selected in the period 2013-2015 recorded 22 strains belonging to clade 2.3.2.1c, 3

strains of clade 1.1.2, and 1 strain of clade 1.1.2 belonging to clade 2.3.2.1a.

Influenza A/H5N1 virus strains belonging to clade 2.3.2.1c in the study have very

high nucleotide sequence similarity with 2 virus strains A/chicken/DL/NAVET

0292(14)/ 2013 and A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 belong to

clade 2.3.2.1c using in challenge, in the range of 96.1 - 99.1%; and with 2 vaccine

virus strains in the range of 95.0 - 96% with strain A/reassortant/USCDC_RG30

and 91.3 - 92.2% with strain A/reassortant/NIBRG-14.

AIV clade 1.1.2 in this study were low homologous to those of vaccine virus strains

A/reassortant/NIBRG-14 and A/reassortant/USCDC_RG30 with 93.3 – 93.4% and

89.7 – 89.8%, respectively.

The results of study showed that Navet-Fluvac 2 vaccine was safety in vaccinated

poultry (chicken, duck and mallard), even when injected with double dose.

Evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy in vaccinated poultry by virus

challenge method was shown as follow:

The Navet-Fluvac 2 vaccine is highly effective against clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b and

2.3.2.1c Avian Influenza viruses in chickens, ducks and mallards. For chickens,

only 1 injection is needed at 2 weeks of age; ducks and mallards must be vaccinated

twice, at 14 days of age and repeat the second injection 14 days after the first

injection.

Navet-Fluvac 2 vaccine has the ability to strongly reduce the shedding of highly

virulent Avian Influenza A/H5N1 virus after challenge. The rate of viral shedding

after 3 days of challenge, between vaccinated and unvaccinated chickens and ducks

with Navet-Fluvac 2 vaccine, was statistically significant with P<0.05.

The duration of protective immunity of Navet-Fluvac 2 vaccine in vaccinated

chickens and ducks is a minimum of 6 months with mean antibody titers above

6log2 in chickens and above 4log2 in ducks.

Navet-Fluvac 2 vaccine confers protective immunity against highly virulent Avian

Influenza A/H5N1 viruses not only in ducks with mean HI antibody titers >4log2,

but also in those ducks with HI antibody titers lower than 4log2.

vii

MỤC LỤC

TRANG

Trang phụ bìa

TÓM TẮT ................................................................................................................ iii

SUMMARY ............................................................................................................... v

MỤC LỤC ................................................................................................................ vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................... x

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... xii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ ............................................... xiv

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1 TỔNG QUAN ......................................................................................... 5

1.1. Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm ..................................................................................... 5

1.2 Các phương thức biến đổi kháng nguyên vi-rút Cúm ..................................................... 8

1.2.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift) .......................................................... 8

1.2.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên ...................................................................................... 9

1.2.3. Hiện tượng glycosyl hóa .............................................................................................. 10

1.3. Độc lực vi-rút Cúm gia cầm ............................................................................................ 11

1.3.1. Protein HA ..................................................................................................................... 11

1.3.2. Protein NA ..................................................................................................................... 13

1.3.3. Protein NS1 ................................................................................................................... 14

1.3.4. Nhóm RNA-polymerase .............................................................................................. 14

1.3.5. Protein M2 và PB1-F2 .................................................................................................. 14

1.4. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm (H5) trên thế giới và tại Việt Nam .............. 15

1.4.1. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm phân type H5 trên thế giới ........................ 15

1.4.2. Tình hình lưu hành các nhánh vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam ............................ 16

1.5 Đặc điểm bệnh lý bệnh Cúm gia cầm ............................................................................. 18

1.5.1 Dấu hiệu lâm sàng của gia cầm mắc bệnh................................................................... 18

viii

1.5.2 Bệnh tích trên gia cầm mắc bệnh ................................................................................. 18

1.6. Miễn dịch đối với vi-rút Cúm gia cầm ........................................................................... 19

1.6.1. Miễn dịch thụ động ....................................................................................................... 19

1.6.2. Miễn dịch chủ động ...................................................................................................... 20

1.6.3. Miễn dịch chéo đối với vi-rút Cúm gia cầm .............................................................. 25

1.6.4. Cơ chế né tránh miễn dịch của vi-rút Cúm gia cầm .................................................. 26

1.7. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam .................... 28

1.7.1. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới ........................................ 28

1.7.2. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm tại Việt Nam ...................................... 33

1.7.3. Hiệu lực của vắc-xin Cúm gia cầm và phương pháp đánh giá ................................. 37

1.8. Tình hình bệnh và sử dụng vắc-xin Cúm gia cầm tại khu vực khảo sát ..................... 38

1.8.1. Tình hình chăn nuôi và bệnh Cúm gia cầm ................................................................ 38

1.8.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm .............................................. 40

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 42

2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ....................................................................................... 42

2.1.1. Địa điểm ......................................................................................................................... 42

2.1.2. Thời gian: Từ tháng 01/2014 đến 12/2019. ................................................................ 42

2.2. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 42

2.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 43

2.4. Vật liệu, hóa chất .............................................................................................................. 43

2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................. 43

2.5.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ...................................... 43

2.5.2. Nghiên cứu phả hệ, so sánh sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm ................................... 46

2.5.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia

cầm clade 2.3.2.1 ..................................................................................................................... 50

2.6. Xử lý thống kê .................................................................................................................. 60

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 61

3.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ......................................... 61

3.1.1 Khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm tại cơ sở giết mổ ..................... 61

3.1.2 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí

Minh .......................................................................................................................................... 64

3.1.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 đối với các trường hợp gia

cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm .......................................................................................... 66

3.1.4 Dấu hiệu lâm sàng ở gà, vịt bệnh dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1 ................... 68

3.2. Nghiên cứu phả hệ của vi-rút Cúm A/H5N1 ................................................................ 77

3.2.1. Kết quả giải trình tự và phân tích gien HA ................................................................. 77

3.2.1.1 Xác định phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm theo trình tự gien HA .......................... 77

3.2.1.2 Phân tích trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA thành HA1 và HA2 ............ 79

3.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia

cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1. .......................................................................................... 90

3.3.1 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 .............................................. 90

3.3.2. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên gà .................................. 96

3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên vịt................................ 106

3.3.4. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời ..................... 114

3.3.5. Đánh giá khả năng bài thải vi-rút sau công độc ....................................................... 117

3.3.6. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 ......................................... 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 125

4.1 Kết luận ............................................................................................................................ 125

4.2 Đề nghị ............................................................................................................................. 126

DANH MỤC .......................................................................................................... 127

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ....................................... 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 128

PHỤ LỤC ............................................................................................................... 141

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AI : Avian Influenza

AIV : Avian Influenza Virus

APC : Antigen Presenting Cell

BALT : Bronchus associated lymphoid tissues

BCR : B Cell Receptor

BNNPTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

CD : Cluster of Differenciation

CTL : Cytotoxic T lymphocyte

DC : Dendritic cell

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ECF : Eosinophil chemoratic factor

FAO : Food and Agriculture Organization

GP : Glycoprotein

GrA : Granzyme

GALT : Gut associated lymphoid tissues

GMT : Geometric Mean Titer

HA : Hemagglutination

HI : Hemagglutination Inhibition

HPAI : Highly Pathogienic Avian Influenza

IL : Interleukin

LPAI : Low Pathogienic Avian Influenza

MPAI : Medium Pathogienic Avian Influenza

MHC : Major Histocompatibility Complex

NA : Neuraminidase

OIE : World organisation for animal health

(Office Internationale dé Epizooties)

: Polymerase Chain Reaction PCR

: Photphate Buffered Salin PBS

: Retinoic acid inducible gene 1 RIG-1:

RT-PCR : Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction

SPF : Specific Pathogens Free

TCR : T cell receptor

WHO : World Health Organization

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Hiệu quả của một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm ............................ 30

Bảng 1.2. Một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm được lưu hành tại Việt

Nam ........................................................................................................................................... 36

Bảng 2.1. Phân bổ số mẫu xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm

thu tại cơ sở giết mổ gia cầm An Nhơn ................................................................................. 44

Bảng 2.2. Phân bổ mẫu khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ............................. 45

Bảng 2.3. Danh sách các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo trong phân tích so

sánh trình tự gien và mối quan hệ phả hệ .............................................................................. 48

Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà .......... 50

Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt ......... 51

Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

trời ............................................................................................................................................. 51

Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2 .................................................................................................................................... 56

Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt được tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2 .................................................................................................................................... 57

Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt trời được tiêm vắc-xin Navet

Fluvac 2 .................................................................................................................................... 58

Bảng 2.10. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet Fluvac 2 ..... 59

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại cơ sở giết mổ .................................. 61

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ

Chí Minh .................................................................................................................................. 64

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên vịt tại hộ chăn nuôi .................................... 65

ở Thành phố Hồ Chí Minh ..................................................................................................... 65

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm đối với các trường hợp nghi ngờ .......... 66

xiii

Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 theo loài trên gia cầm nghi ngờ

bệnh Cúm gia cầm ................................................................................................................... 68

Bảng 3.6. Tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng trên gà, vịt (+) Cúm A/H5N1 ........ 69

Bảng 3.7. Tần suất xuất hiện các bệnh tích trên gà, vịt (+) với vi-rút Cúm A/H5N1 ...... 73

Bảng 3.8. Trình tự axít amin tại vị trí cắt gien HA (HA1-HA2) của các chủng vi-

rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong đề tài .................................................................................. 80

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà .................. 90

Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt ................ 91

Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời ......... 92

Bảng 3.12. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng trên gà theo quy trình

tiêm 1 mũi và 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 ....................................................................... 96

Bảng 3.13. Kết quả công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-

xin Navet-Fluvac 2 ................................................................................................................ 100

Bảng 3.14. Đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fluvac 2 .................................................................................................................................. 106

Bảng 3.15. Kết quả công cường độc trên vịt được tiêm và không được tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 ....................................................................................................................... 110

Bảng 3.16. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể trên vịt trời có và không có tiêm vắc-

xin Navet-Fluvac 2 ................................................................................................................ 114

Bảng 3.17. Kết quả công cường độc trên vịt trời có và không tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2 .................................................................................................................................. 116

Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau khi công

cường độc trên gà, vịt được và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 ...................... 118

Bảng 3.19. Đánh giá độ dài miễn dịch trên gà sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 .... 120

Bảng 3.20. Đánh giá độ dài miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên

vịt ............................................................................................................................................. 122

Bảng 3.21. Kết quả công cường độc trên vịt tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2 ......................................................................................................... 123

xiv

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

TRANG

Hình 1.1. Các đoạn RNA của vi-rút Cúm gia cầm tuýp A và các protein tương ứng ....... 6

Hình 1.2. Sơ đồ minh họa sự đột biến điểm của vi-rút Cúm gia cầm ................................. 9

Hình 1.3. Minh họa sự thay đổi di truyền của vi-rút Cúm .................................................... 9

Hình 1.4. Trình diện kháng nguyên của vi-rút Cúm A qua MHC-I và cơ chế né

tránh đáp ứng miễn dịch tế bào .............................................................................................. 27

Hình 2.1. Quy trình xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 (TCVN 8400-26:2014) ................ 46

Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên gà sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2 ........................................................................................................... 53

Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2 ........................................................................................................... 54

Hình 3.1. Gà ủ rũ, bỏ ăn, chết tại hộ chăn nuôi xã Tân Nhựt, huyện Bình Chánh,

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2013 ..................................................................................... 70

Hình 3.2. Vịt ủ rũ, chết tại hộ chăn nuôi xã Xuân Thới Thượng, huyện Hóc Môn,

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2014 ..................................................................................... 71

Hình 3.3. Gà mắc bệnh với dấu hiệu lâm sàng mồng, tích tím tái ..................................... 71

Hình 3.4. Vịt mắc bệnh có dấu hiệu rối loạn thần kinh ...................................................... 72

Hình 3.5. Xuất huyết da chân ................................................................................................ 74

Hình 3.6. Khí quản xuất huyết............................................................................................... 74

Hình 3.8. Phổi sung huyết, xuất huyết .................................................................................. 75

Hình 3.9. Xuất huyết mỡ vành tim ........................................................................................ 76

Hình 3.10. Gan sưng, xuất huyết ........................................................................................... 76

Hình 3.11. Lách sưng, xuất huyết ......................................................................................... 77

Hình 3.12. Cây di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gien HA của các chủng

AIV (Giá trị Bootstrap 1000 lần lặp lại) ................................................................................ 86

Hình 3.13. Sự khác biệt trình tự gien của vi-rút Cúm A/H5N1 ......................................... 89

Hình 3.14. Tiêm phòng vắc xin Navet-Fluvac 2 cho đàn vịt thí nghiệm .......................... 93

Hình 3.15. Đàn vịt trời lô thí nghiệm và lô đối chứng vận động, ăn uống bình

thường sau tiêm phòng ............................................................................................................ 93

Hình 3.16. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin tại vị trí tiêm trên gà được

tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, liều 0,5ml/con sau 3 tuần ......................................... 94

Hình 3.17. Mổ khám ghi nhận còn vài hạt lấm tấm vắc-xin tại vị trí tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 trên gà, liều 1ml/con sau 3 tuần .................................................................. 94

Hình 3.18. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin trên vịt tại vị trí tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 tiêm phòng liều 0,5ml/con sau 3 tuần ........................................................ 95

Hình 3.19. Mổ khám ghi nhận vài chấm nhỏ lấm tấm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên

vịt tiêm phòng liều 1ml/con sau 3 tuần ................................................................................. 95

Hình 3.20. Trung tâm Nghiên cứu Thú y, an toàn sinh học cấp độ 3 .............................. 103

Hình 3.21. Công cường độc trên gà bằng cách nhỏ mắt, nhỏ mũi................................... 103

Hình 3.22. Lô gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 không có biểu hiện bất

thường sau công cường độc .................................................................................................. 104

Hình 3.23. Lô gà đối chứng được không tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 chết 3

ngày sau công cường độc ..................................................................................................... 104

Hình 3.24. Bệnh tích xuất huyết bàn chân trên gà lô đối chứng khi công độc ............... 105

Hình 3.25. Bệnh tích mồng, tích tím tái trên gà lô đối chứng khi công độc ................... 105

Hình 3.26. Công cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi trên vịt ................................. 112

Hình 3.27. Vịt tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 khỏe mạnh bình thường ................ 113

Hình 3.28. Vịt lô đối chứng chết sau 3 ngày công cường độc ......................................... 113

MỞ ĐẦU

Bệnh Cúm gia cầm do vi-rút A/H5N1 thể độc lực cao là một bệnh nguy hiểm

gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và đe dọa tới sức khỏe của

cộng đồng. Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là RNA vi-rút, gồm 8

sợi đơn âm. Vi-rút dạng đa hình thái, kích thước 80 - 120 nm. Dựa trên cấu trúc

kháng nguyên của hai protein bề mặt Hemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA),

vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype NA, trong đó tác

nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là subtype H5, H7 và H9 (CDC, 2020)

Kết quả khảo sát sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 của Cục Thú y tại

Việt Nam cho thấy, giai đoạn đầu tiên từ năm 2003 đến 2005, trong phạm vi cả

nước, vi-rút Cúm gia cầm lưu hành thuộc nhánh 1 (Nguyễn Tiến Dũng, 2008); giai

đoạn 2007 - 2009, tại miền Bắc xuất hiện nhánh mới 2.3.4 và nhánh 7 trên gà nhập

trái phép qua biên giới, trong khi các tỉnh miền Nam chủ yếu là vi-rút nhánh 1

(Nguyễn Tùng, 2013); từ giữa năm 2010, nhánh 2.3.2.1 xuất hiện thay thế nhánh

2.3.4 ở phía Bắc; đến năm 2013 các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long vẫn tồn tại

nhánh vi-rút 1.1, trong khi các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên lưu hành

chủ yếu nhánh vi-rút 2.3.2.1 gồm 3 nhóm nhỏ gọi là nhóm a, b và c. Nhóm a xuất

hiện từ giữa năm 2010 đến đầu năm 2012 ở hầu hết các tỉnh, trừ các tỉnh thuộc

Đồng bằng Sông Cửu Long. Nhóm b phát hiện trong năm 2011 và 2012 ở Quảng

Ninh, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Nam Định, Thái Bình, Sơn La,

Ninh Bình, Nghệ An, rất độc với gà và vịt mẫn cảm. Nhóm 2.3.2.1c được phát hiện

từ giữa năm 2012 ở hầu hết các ổ dịch tại các tỉnh từ Lạng Sơn đến Quảng Ngãi dọc

theo quốc lộ 1A. Giai đoạn 2010 - 2013, sự tiến hoá của vi-rút Cúm A/H5N1 dẫn đến

làm thay đổi tính kháng nguyên ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được

tiêm phòng vắc-xin. Vi-rút Cúm A/H5N1 phân nhóm 2.3.2.1 với 3 phân nhóm nhỏ

2.3.2.1 a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c tại các tỉnh phía Bắc có xu hướng di chuyển vào phía

Nam, trong đó 2.3.2.1c vẫn lưu hành chủ yếu tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam

Bộ (Cục Thú y, 2015).

Sự đa dạng lưu hành vi-rút Cúm gia cầm trong giai đoạn này làm cho dịch tễ

bệnh Cúm gia cầm trở nên phức tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin

phòng bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam, trong đó có Thành phố Hồ Chí Minh và các

tỉnh lân cận. Vì vậy bên cạnh các vắc-xin đã sử dụng trước đây (Re1 và Re5), trong

năm 2014, Việt Nam đã nhập khẩu vắc-xin Re6 để phòng bệnh Cúm gia cầm. Tuy

nhiên các vắc-xin Re-1 và Re-5 chỉ bảo vệ được 1 phần vịt được tiêm vắc-xin chống

lại vi-rút chủng H5N1 độc lực cao clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm,

2011). Vắc-xin Navet-Vifluvac với chủng NIBRG-14 bảo hộ được gia cầm chống

lại clade 1 và 2.3.2.1a và 2.3.2.1c, nhưng không có hiệu quả đối với vi-rút Cúm gia

cầm thuộc phân nhóm 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và ctv, 2012).

Tổng đàn gia cầm tại 8 tỉnh, thành thực hiện khảo sát chiếm khoảng 18,25%

tổng đàn gia cầm trong cả nước và cần thiết phải xây dựng vùng an toàn dịch bệnh

đối với bệnh Cúm gia cầm. Để xây dựng các biện pháp phòng, chống và kiểm soát

tốt, hiệu quả đối với bệnh Cúm gia cầm đòi hỏi phải có thông tin cập nhật các chủng

vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành và đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin đối với

các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành trên thực địa. Vắc-xin đa giá, phối hợp

các chủng vi-rút khác nhau, là một giải pháp có thể gia tăng hiệu quả bảo hộ của

vắc-xin Cúm gia cầm đối với các biến chủng khác nhau, đối phó tình hình lưu hành

phức tạp các biến chủng vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam, bao gồm các nhánh 1.1,

2.3.2.1 a, 2.3.2.1 b, 2.3.2.1 c và vi-rút Cúm A/H5N6.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài được thực hiện với:

Giới hạn nghiên cứu:

- Đánh giá tình hình lưu hành, kiểu di truyền và mối liên hệ di truyền giữa các

chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận

(Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Long An, Tiền Giang, Bến

Tre).

- Hiệu quả miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm

tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời.

Mục tiêu nghiên cứu:

- Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ

Chí Minh và 7 tỉnh lân cận, phục vụ cho công tác quản lý, kiểm soát lây truyền vi-

rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong khu vực khảo sát;

- Xác định một số đặc điểm lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia

cầm tuýp A H5N1 góp phần định hướng trong chẩn đoán lâm sàng và phi lâm sàng

bệnh Cúm gia cầm A/H5N1, giúp nâng cao hiệu quả công tác phòng chống bệnh

Cúm gia cầm A/H5N1;

- Xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và sự tương đồng di

truyền với chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2, góp phần

làm rõ hơn sự tiến hoá của vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, cung cấp cơ sở dữ liệu cho

các nghiên cứu dịch tễ và vắc-xin phòng bệnh do vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1,

trong khu vực khảo sát, cũng như ở Việt Nam và trên thế giới;

- Đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 phục vụ cho chiến

lược tiêm phòng kiểm soát bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 trên đàn gia cầm tại khu vực

khảo sát.

Ý nghĩa của Luận án

Đây là công trình nghiên cứu khoa học về tình hình lưu hành các chủng vi-rút

Cúm gia cầm tuýp A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận giai

đoạn 2013 - 2015; xác định tính tương đồng về di truyền giữa các chủng vi-rút Cúm

gia cầm lưu hành với các chủng vi-rút sử dụng để làm vắc-xin Navet-Fluvac 2.

Đánh giá được hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia

cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời. Kết quả nghiên cứu của Luận

án đã góp phần khẳng định hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong thực tiễn và

đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép lưu hành, sử dụng trong

cả nước.

Những điểm mới của Luận án

- Xác định được phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm H5N1 lưu hành và gây bệnh

tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận trong giai đoạn nghiên cứu chủ yếu

thuộc nhánh 2.3.2.1c và 1.1.

- Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh Cúm gia cầm của vắc-xin Navet-Fluvac

2 trên đàn gia cầm đối với các chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, phân nhóm

mới hiện diện ở miền Nam Việt Nam: vi-rút Cúm gia cầm 2.3.2.1 phân nhóm a, b,

c, bằng phương pháp công cường độc và phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể.

- Công trình đầu tiên nghiên cứu về khả năng bảo hộ của vắc-xin phòng bệnh

Cúm gia cầm trên vịt trời. Vịt trời được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả

năng phòng bệnh tốt với vi-rút Cúm gia cầm phân nhánh 2.3.2.1c, hiện đang lưu

hành chủ yếu tại khu vực các tỉnh phía Nam.

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm

Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là vi-rút RNA sợi âm, đa

hình thái, kích thước 80 - 120 nm. Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của protein bề

mặt HA và NA, vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype

NA, trong đó tác nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là các subtype H5, H7 và

H9 (CDC, 2020). Kháng nguyên HA (Haemagglunitin) và NA (Neuraminidase) có

vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi-rút Cúm A.

HA và NA là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá

trình xâm nhiễm của vi-rút vào tế bào cảm nhiễm, phân bố không đồng đều trên bề

mặt vỏ (tỉ lệ khoảng 1NA/ 4HA). HA là protein gây ngưng kết hồng cầu và NA có

chức năng là enzyme phá hủy liên kết của vi-rút với thụ thể trên tế bào vật chủ.

(Wagner và ctv., 2002).

Vật chất di truyền của vi-rút cúm A là RNA có độ dài 13.500 nucleotit với 8

phân đoạn riêng biệt (PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M và NS) mã hóa cho 11

protein của vi-rút, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân

đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein

là PB1 và PB1-F2 (Ito và ctv., 1998; Conenello và ctv., 2007).

Phân đoạn 1 (gien PB2 - polymerase basic 2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa

tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme

polymerase của vi-rút, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA. Protein PB2 có

khối lượng phân tử khoảng 87 kDa. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ

được cho là có liên quan đến vị trí axít amin 627 ở protein PB2 (ở vi-rút Cúm gia

cầm, vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở vi-rút

cúm trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37oC) (Wasilenko

và ctv., 2008).

Hình 1.1. Các đoạn RNA của vi-rút Cúm gia cầm tuýp A và các protein tương ứng

(Breen và ctv., 2016)

Phân đoạn 2 (gien PB1 - polymerase basic 1) cũng có kích thước 2.431 bp, mã

hóa tổng hợp enzyme PB1, đây là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym

polymerase trong quá trình tổng hợp RNA vi-rút, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA

(Murphy và Webster, 1996). Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2)

được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng

apoptosis (hiện tượng tế bào chết có lập trình) (Tumpey và ctv, 2002).

Phân đoạn 3 (gien PA - polymerase acidic) có kích thước 2.233 bp, là phân

đoạn gien bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử

khoảng 83 kDa (trên thực tế là 96 kDa). PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu

trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của vi-rút

(Palese, 2007).

Phân đoạn 4 (gien HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng phân type vi-rút Cúm

A (A/H1N1 là 1.778 bp, H9N1 là 1.714 bp, H5N1 là khoảng 1.704 - 1.707 bp). Đây

là gien chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt vi-rút

cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số

axít amin mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt

của enzym protease, là vùng quyết định độc lực của vi-rút. Protein HA có khối

lượng phân tử khoảng 63 kDa (nếu không được glycosyl hóa) và 77 kDa (nếu được

glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) (Gambotto và ctv., 2008,

Keawcharoen và ctv., 2005).

Phân đoạn 5 (gien NP) kích thước khoảng 1.556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

chuyển RNA giữa nhân và bào tương của tế bào chủ. NP là một protein được

glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm vi-rút, tồn tại trong các

hạt vi-rút ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử khoảng

50 - 60 kDa (Salzberg, 2007).

Phân đoạn 6 (gien NA) có chiều dài thay đổi theo từng chủng vi-rút Cúm A

(A/H6N2 là 1.413 bp, A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1.350 – 1.410 bp) (Nguyễn Thị

Bích Nga, 2006), mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của vi-

rút, có khối lượng phân tử theo khoảng 50 - 60 kDa. Các nghiên cứu phân tử gien

NA của vi-rút cúm cho thấy, phần đầu 5’- của gien này có tính biến đổi cao và phức

tạp giữa các chủng vi-rút Cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng

và gây bệnh của vi-rút cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau (Wagner và ctv.,

2002). Đặc trưng biến đổi của gien NA ở vi-rút Cúm A là hiện tượng đột biến trượt-

xóa một đoạn gien là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn

có trước đây của NA(N1) là 1.410 bp còn 1.350 bp (Keawcharoen và ctv., 2005).

Phân đoạn 7 (gien M) có kích thước khoảng 1.027 bp, mã hóa cho protein

khung (matrix protein - M) của vi-rút. Cùng với HA và NA, có khoảng 3.000 phân

tử MP trên bề mặt capsid của vi-rút Cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với

hemagglutinin (Scholtissek và ctv., 2002). Protein M1 là một protein nền, là thành

phần chính của vi-rút, có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham

gia vào quá trình “nẩy chồi” của vi-rút. Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối

lượng phân tử theo tính toán là 11 kDa (trên thực tế là 15 kDa), là protein chuyển

màng - kênh ion (ion channel), cần thiết cho khả năng lây nhiễm của vi-rút, chịu

trách nhiệm cởi vỏ capsid của vi-rút trình diện hệ gien ở bào tương tế bào chủ trong

quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek và ctv., 2002).

Phân đoạn 8 (gien NS) là gien mã hóa protein không cấu trúc (non structural

protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gien của vi-rút Cúm A, kích thước khoảng

890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP - nuclear

export protein), có vai trò bảo vệ hệ gien của vi-rút, nếu thiếu chúng vi-rút sinh ra sẽ

bị thiểu năng (defective virus) (Chen và ctv., 2008; Zhu và ctv, 2008).

1.2 Các phương thức biến đổi kháng nguyên vi-rút Cúm

Vi-rút Cúm A không có gien mã hóa enzyme sửa chữa RNA, do vậy chúng dễ

dàng bị đột biến điểm trong các phân đoạn gien trong quá trình sao chép, dẫn đến

thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng vi-rút Cúm A mới. Hiện tượng

này được gọi là lệch kháng nguyên (antigenic drift). Mặt khác, khi trong cùng một

tế bào bị nhiễm hai chủng vi-rút khác nhau, do 8 sợi RNA của mỗi chủng được tổng

hợp riêng biệt nên khi hình thành hạt vi-rút mới sẽ có thể có sự tổ hợp

(reassortment) của các sợi RNA của cả hai chủng vào một hạt vi-rút. Từ đó tạo ra

một loại vi-rút mới và hiện tượng này được gọi là trượt kháng nguyên (antigenic

shift) (Suarez và Schultz-Cherry, 2000). Sự thay đổi kháng nguyên giúp cho vi-rút

lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài vật chủ khác nhau. Có ba phương thức

chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở vi-rút Cúm A (Wu và ctv., 2008).

1.2.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift)

Thực chất là các đột biến điểm xảy ra tại các phân đoạn gien/hệ gien của vi-

rút. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc

RNA sẽ có thể “gài” thêm, làm mất đi hoặc thay thế (Lê Thanh Hòa, 2006) một hay

nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của

vi-rút (Conenello và ctv., 2011).

Hình 1.2. Sơ đồ minh họa sự đột biến điểm của vi-rút Cúm gia cầm

(Ô màu đỏ là mã bộ ba ribonucleotide bị thay đổi qua quá trình sao chép dưới

xúc tác RNA polymerase; Ô màu tím là mã bộ ba ribonucleotide bị đột biến qua quá

trình sao chép trong tế bào chủ)

Tùy thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, có thể trực tiếp làm

thay đổi các axít amin trong trình tự của protein được mã hóa, dẫn đến thay đổi

thuộc tính của protein, hoặc tích lũy trong phân đoạn gien xảy ra đột biến. Tần suất

xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide, có 1 nucleotide sai khác

(Webster, 1998).

1.2.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hình 1.3. Minh họa sự thay đổi di truyền của vi-rút Cúm

(Chen và ctv., 2008)

Hiện tượng này còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp các gien kháng nguyên

(antigienic shift) chỉ có ở vi-rút cúm và rất ít ở một số vi-rút RNA gây bệnh gia cầm

khác, cho phép vi-rút có khả năng biến chủng rất cao.

Trường hợp khi 2 chủng vi-rút Cúm A khác nhau đồng nhiễm trong một tế bào

có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort), hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gien của

chúng và trong quá trình kết hợp lại hệ gien, tạo ra các tổ hợp khác nhau của hệ gien

của các hạt vi-rút mới từ hai hệ gien của những vi-rút ban đầu. Kết quả tạo ra thế hệ

vi-rút mới có các phân đoạn gien kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây

nhiễm ở loài vật chủ mới, hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Chen và ctv., 2008).

1.2.3. Hiện tượng glycosyl hóa

Sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) với axít amin

asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay

một số polypeptide khác của vi-rút cúm được gọi là hiện tượng glycosyl hoá. Hiện

tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine,

tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA

hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho vi-

rút thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể vật chủ và điều hoà sự nhân lên

của vi-rút (Baigient và McCauley, 2001).

Sự hiện diện của các N-glycosylation cũng có tác động làm giảm đáp ứng

miễn dịch của gia cầm đối với vi-rút Cúm gia cầm, hậu quả là làm giảm hiệu quả

của vắc-xin với kháng nguyên là vi-rút có nhiều vị trí N-linked glycosylation trên

protein HA, dù tỷ lệ tương đồng axít amin ở mức rất cao, chẳng hạn chủng vi-rút

vắc-xin (2.1.3.2/Indo/05) trong nghiên cứu (Criado và ctv., 2020). Sự hiện diện của

N-glycosylation ở HA có thể che dấu các tín hiệu kháng nguyên trên HA và làm

giảm đáp ứng miễn dịch đối với HA.

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời

gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của vi-

rút Cúm A khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau. Đây

cũng chính là vấn đề đáng lo ngại đối với vi-rút Cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù vi-

rút này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây

bệnh được cho người, và rất có thể vi-rút Cúm A/H5N1 tái tổ hợp gien HA hay NA,

hoặc cả hai gien với các chủng vi-rút Cúm A đã thích nghi ở người để tạo ra một biến

chủng vi-rút mới thích ứng, lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại

dịch cúm mới (Korteweg và ctv., 2008).

1.3. Độc lực vi-rút Cúm gia cầm

Độc lực của vi-rút Cúm A ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó chủ yếu do

đặc tính của protein HA và NA.

1.3.1. Protein HA

Protein HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm. Kháng

thể đặc hiệu với HA có thể ức chế sự ngưng kết hồng cầu, được gọi là kháng thể

ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI). Có 18 phân tuýp HA đã được báo cáo (CDC,

2020). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3

đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị là

HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-).

Protein HA vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định độc lực của vi-rút, là

đích của miễn dịch trung hoà, đặc hiệu với từng subtype HA, nhằm ngăn chặn sự

xâm nhiễm của vi-rút ở cơ thể nhiễm và là cơ sở để sản xuất các vắc-xin phòng cúm

hiện nay (Horimoto và Kawaoka, 2006).

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu sialic acid trên bề mặt màng tế bào

khởi đầu quá trình xâm nhiễm của vi-rút trên vật chủ, giúp cho vi-rút xâm nhập, hòa

màng và giải phóng hệ gien, thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm.

Vị trí axít amin 226 (aa226) của đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù

hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu trên tế bào. Ở hầu hết các chủng vi-rút Cúm A lưu

hành trong tự nhiên, axít amin ở vị trí thứ 226 là glycine, vùng HA sẽ gắn với thụ

thể sialic acid α-2,3 galactose (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH)

của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia

cầm.

HA đóng vai trò trung gian liên kết thụ thể cho phép xảy ra quá trình dung hợp

màng và giải phóng ribonucleprotein (RNP) vào bên trong tế bào. Tuy nhiên, sự

dung hợp chỉ xảy ra khi HA được các protease của tế bào vật chủ thủy phân thành

HA1 và HA2. Như vậy, sự phân cắt thành HA1 và HA2 là điều kiện quyết định khả

năng xâm nhập tế bào của vi-rút. Khả năng HA bị phân cắt phụ thuộc vào trình tự

axít amin tại vị trí cắt và các gốc carbohydrate gần kề. Theo sự phân loại của OIE,

dựa theo trình tự axít amin kiềm tại vị trí cắt của gien HA (HA1-HA2) có thể xác

định chủng vi-rút Cúm gia cầm thuộc nhóm độc lực cao hay thấp. Những chủng vi-

rút cúm có trình tự axít amin tại vị trí cắt (cleavage site) của protein HA với sự lặp

lại của những axít amin kiềm (arginine - R hoặc lysin-K) được xếp vào nhóm vi-rút

cúm có độc lực cao (OIE, 2020). Cũng theo OIE (2020), số lượng axít amin kiềm

tại vị trí cắt của HA ở vi-rút Cúm tuýp A độc lực cao có thể khác nhau tuỳ theo

clade, trong khoảng 4 - 6 axít amin kiềm, ví dụ đối với clade 2.3.2 là từ 5 - 6 (--

KRRKR--; --RRRKR-- hoặc --RRRRKR--).

HA của các phân type (subtype) vi-rút Cúm gà có độc tính thấp bị phân cắt

giới hạn ở một số loại tế bào nhất định như tế bào của hệ hô hấp và tiêu hóa. Ngược

lại, HA của các subtype vi-rút cúm độc lực cao (H5 và H7) có khả năng phân cắt

thành HA1 và HA2 ở nhiều loại tế bào khác nhau, cả trong điều kiện không có các

exo - protease (là enzyme rất cần thiết cho sự phân cắt HA của các subtype vi-rút có

độc tính thấp). Điều này chứng minh rằng trình tự axít amin tại vị trí nhạy cảm với

protease của HA có ảnh hưởng trực tiếp đến độc tính của vi-rút (Wagner và ctv.,

2002).

Theo tổ chức dịch tễ thế giới (OIE, 2009) vi-rút Cúm gia cầm được xem là có

độc lực cao (HPAI: High pathology avian influenza) khi thỏa mãn một trong các

điều kiện sau đây:

- Chủng vi-rút Cúm gia cầm được tiêm vào phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, thu hoạch

lấy nước trứng và pha loãng 1/10. Sau đó dùng nước pha loãng này (với lượng 0,2

ml) tiêm vào tĩnh mạch cho gà mẫn cảm ở 4 - 8 tuần tuổi. Vi-rút cúm độc lực cao

(HPAI) sẽ gây chết 75% - 100% gà trong vòng 10 ngày sau khi tiêm.

- Vi-rút Cúm gia cầm không thuộc subytpe H5 hoặc subtype H7 nhưng gây

chết từ 1 - 5 con gà trong số 8 con gà 4 - 8 tuần tuổi sau khi được tiêm giống như

điều kiện ở trên, và gây bệnh tích tế bào khi nuôi cấy vi-rút trên tế bào không có bổ

sung trypsin.

- Tất cả vi-rút cúm thuộc subtype H5 và H7 có độc lực thấp và các vi-rút cúm

khác, không phát triển và gây bệnh tích tế bào (CPE) khi nuôi cấy không bổ sung

trypsin, nhưng có sự hiện diện lặp lại của các axít amin kiềm tại vị trí phân cắt HA.

Bảng 1.1. Các kiểu trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA của vi-rút Cúm H5N1

Loại vi-rút Trình tự axít amin ở điểm cắt (R = Arginine, K = Lysine)

Độc lực thấp ...QERG...

Độc lực trung bình ...QERRG...

...QRERRKKRG...chủng A/Chicken/Vn/27/03[H5N1]

Độc lực cao ...QRERIRKKRG…chủng A/Ck/VNM/147/04[H5N1]

…QREGKKRG…chủng A/Dk/VNM/2/07[H5N1]

(Nguyễn Tiến Dũng, 2008)

1.3.2. Protein NA

Protein NA còn gọi là sialidase, đây là một enzyme có bản chất là

glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của vi-rút Cúm A, mang tính kháng

nguyên đặc trưng theo từng phân type NA (Baigient và McCauley, 2001; Wagner

và ctv., 2002). Có 11 phân tuýp (từ N1 đến N11) được phát hiện chủ yếu ở vi-rút

Cúm gia cầm. Hai phân tuýp N1 và N2 được tìm thấy ở vi-rút cúm người liên quan

đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996 ). Protein NA là một

enzyme có vai trò cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với

phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt vi-rút ra khỏi màng tế bào

nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của vi-rút trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập

hợp của các hạt vi-rút mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt

liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating”

giải phóng hệ gien của vi-rút vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình

nhân lên của vi-rút diễn ra nhanh hơn (Wagner và ctv., 2002). Ngoài ra, NA còn

phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid, làm tan loãng màng

nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho vi-rút nhanh chóng tiếp cận tế

bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Do đó, protein NA là

đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế vi-rút không đặc hiệu hiện nay, đặc

biệt là oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải

phóng hạt vi-rút mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Castrucci và Kawaoka,

1993; Aoki và ctv., 2007).

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của vi-rút, tham gia kích

thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng

nguyên NA của các chủng vi-rút đương nhiễm, có tác dụng phong tỏa protein NA

(Doherty và ctv., 2006 ). Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA

của vi-rút là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể vật chủ với

vi-rút Cúm A và là cơ sở điều chế vắc-xin phòng cúm hiện nay cho người và gia

cầm (Suarez và Schultz-Cherry, 2000; Wu và ctv., 2008).

1.3.3. Protein NS1

Protein NS1 cũng đóng vai trò như một yếu tố độc lực của vi-rút nhờ khả năng

thoát khỏi tác động của IFN (interferon) trong quá trình lây nhiễm vi-rút Cúm A do

ức chế sự tổng hợp IFN. Cùng với việc ngăn chặn đáp ứng của IFN, protein NS1

còn liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phá vỡ chức năng của chúng.

Sự đột biến xoá đi 15 nucleotide (vị trí 263 - 277) của NS làm gia tăng độc tính của

vi-rút Cúm A/H5N1 (Lê Thanh Hòa, 2008).

1.3.4. Nhóm RNA-polymerase

Nhóm RNA-polymerase bao gồm protein PB1, PB2 và PA cũng có liên quan

đến độc lực của vi-rút Cúm A. Một số đột biến có thể làm nâng cao hoạt lực của

polymerase và làm tăng độc lực của vi-rút Cúm A/H5N1. Chủng vi-rút Cúm

A/H5N1 có độc lực cao trên chuột có lysine ở vị trí 627 trong PB2, trong khi các

chủng A/H5N1 không độc lực trên chuột có glutamic xít ở vị trí này (Ahlquist,

2002).

1.3.5. Protein M2 và PB1-F2

Các protein M2 và PB1-F2 có liên quan đến sự thích ứng của vi-rút H5N1 trên

vật chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài. Protein PB1-F2 làm tăng độc lực

của vi-rút Cúm A do gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực

bào, do đó làm giảm đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của

vi-rút Cúm A (Conenello và ctv., 2011).

1.4. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm (H5) trên thế giới và tại Việt Nam

1.4.1. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm phân type H5 trên thế giới

Năm 1996, vi-rút Cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở

Quảng Đông (Trung Quốc) và chủng này được coi là chủng nguyên thủy tạo nên

các dòng vi-rút gây bệnh Cúm gia cầm trong những năm qua (Xu và ctv., 1999).

Chủng vi-rút nguyên thủy này, cung cấp nguồn gien HA (H5) cho tiến trình tái tổ

hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm

1997 và là nguồn gien của vi-rút Cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ vi-rút

Cúm A có ở chim cút (Guan và ctv., 2002).

Trong các năm 1997 - 2002, một số biến chủng vi-rút Cúm A/H5N1 mang

nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của subtype H5 được hình thành tạo nên

nhóm kháng nguyên clade 1, có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi

biến mất trong những năm 2001 - 2002 (Guan và ctv., 2002; Lee và ctv., 2007).

Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gien HA (H5) có những đột biến mới do hậu quả

của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift), tạo nên biến chủng có tính gây

bệnh cực kỳ cao, đặc biệt đối với vịt và lây sang người (Guan và ctv., 2002; Sturm-

Ramirez và ctv., 2005).

Cuối năm 2005, có nhiều dưới dòng (subclade) của vi-rút Cúm A/H5N1 cùng

lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and

Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like

sublineage), phân bố rộng khu vực châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng Kông , Việt

Nam, Indonesia, Thái Lan (Lee và ctv., 2007; Sims và ctv., 2005 ; Simmons và ctv.,

2007), Trung Á, châu Âu và châu Phi, có tính gây bệnh cao đối với người (Ducatez

và ctv., 2007).

Trong các năm 2006 - 2008, tuy bình diện dịch Cúm gia cầm không ác liệt như

những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng A/H5N1 có biến động

kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học Cúm A/H5N1 có thể đã trở nên phức

tạp hơn (Zhao và ctv., 2008; Gambotto và ctv., 2008).

Trong giai đoạn 1996-2001, vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 chủ yếu

chỉ lưu hành ở phía Nam Trung Quốc. Giai đoạn này ghi nhận có 4 clade vi-rút

A/H5N1 khác nhau là clade 0, clade 3, clade 5 và clade 9, trong đó clade 0 là vi-rút

thuỷ tổ A/Goose/Guangdong/96 và những vi-rút khác cùng loại. Có thể nhận thấy

sự biến đổi liên tục của vi-rút cúm, đặc biệt là có những clade vi-rút tiếp tục tiến

hoá và hình thành các nhánh phụ như clade 2: Năm 2004 chỉ có 1 lớp clade 2; Năm

2005 clade 2 đã tiến hoá thành 5 nhánh phụ thuộc lớp thứ 2 từ clade 2.1 - 2.5, rồi

đến năm 2008 chúng lại tiến hoá thành lớp thứ 3. Hiện nay các chuyên gia quốc tế

đang tiếp tục tổng hợp và phân tích sự phát sinh loài của vi-rút cúm và có thể sự

phát sinh loài còn đa dạng hơn nữa.

Cho đến nay tất cả 10 clade của vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 đã

được phát hiện và phân lập ở khu vực Đông Á, có thể cùng hoặc ở các thời điểm

khác nhau (Pfeiffer và ctv., 2011). Hầu hết các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 của khu

vực Đông Á đều bắt nguồn từ Trung Quốc và Hồng Kông và cũng được tìm thấy tại

Nhật Bản và Hàn Quốc.

Một số clade không phát hiện thấy ở Đông Á là clade 2.1.2 và 2.1.3. Dường

như chúng đã tiến hóa ở Indonesia sau khi tổ tiên của chúng xâm nhập từ tỉnh Hồ

Nam của Trung Quốc năm 2002 - 2003. Một số clade cho đến nay chỉ mới phát

hiện thấy ở Trung Quốc (ví dụ các clade 4, clade 6 và clade 9), trong khi các clade

khác có liên quan đến các vụ dịch chính (clade 1 ở khu vực sông Mê Kông từ năm

2004 - 2005, clade 2.1 ở Indonesia năm 2004, clade 2.2 lan rộng từ châu Á sang

châu Âu và châu Phi từ năm 2005, clade 2.3.4 đã tấn công các nước Việt Nam, Lào

và Thái Lan từ năm 2005) đều đã được phân lập ở Trung Quốc trước khi được phát

hiện thấy ở những nơi khác. Clade 7 cũng mới chỉ xuất hiện ở Trung Quốc từ năm

2007 trở về trước (Wang và ctv., 2008).

1.4.2. Tình hình lưu hành các nhánh vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam

Giai đoạn 2001 - 2007: Vi-rút Cúm A/H5N1 gây nên dịch Cúm gia cầm ở Việt

Nam từ cuối năm 2003. Tuy nhiên, qua điều tra, người ta đã từng phát hiện thấy vi-

rút A/H5N1 ở chợ gia cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyễn Tùng, 2013). Phân

tích phát sinh loài các vi-rút cúm tại Việt Nam từ năm 2001 - 2007 (Wallace và ctv.,

2007) đã ghi nhận có ít nhất có 6 clade khác nhau của vi-rút Cúm A/H5N1 độc lực

cao từng xuất hiện và lưu hành ở Việt Nam. Sáu clade vi-rút này nằm cùng nhóm

với các vi-rút tiền thân được phân lập trước đây tại Trung Quốc và Hồng Kông, các

vi-rút tiền thân này có thể được coi là tổ tiên của các dòng vi-rút Cúm gia cầm độc

lực cao xâm nhập vào Việt Nam (Wallace và ctv., 2007).

Giai đoạn 2008 - 2010: Khảo sát sự biến đổi trong giai đoạn này các chủng vi-

rút A/H5N1 ở Việt Nam, đặc biệt là ở phía Bắc, chủ yếu thuộc về clade 2.3.4, đồng

thời các chủng vi-rút trong clade này tạo thành 1 lớp thứ tư với 4 nhóm (2.3.4.1-

2.3.4.4). Clade 1 chỉ còn lưu hành ở phía miền Nam. Vi-rút A/H5N1 thuộc clade

2.3.2 cũng đã xuất hiện ở Việt Nam và về mặt di truyền những vi-rút này tương tự

các vi-rút A/H5N1 ở chim hoang và gia cầm của nhiều nước ở Đông Âu, Hồng

Kông, Trung Quốc, Hàn Quốc. Một số chủng vi-rút A/H5N1 thuộc clade 7 được

phân lập ở biên giới phía Bắc và một số chợ gia cầm sống ở phía Bắc Việt Nam

(Nguyễn Tùng, 2010).

Giai đoạn 2010-2013: Sự tiến hoá của vi-rút Cúm A/H5N1 dẫn đến làm thay

đổi tính kháng nguyên ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm

phòng vắc-xin. Clade 1.1 tập trung ở phía Nam vùng Đồng bằng sông Cửu Long và

phân nhóm 2.3.2.1 tại các tỉnh phía Bắc có xu hướng di chuyển vào phía Nam. Phân

tích chuyên sâu đã phát hiện vi-rút H5N1 phân nhánh 2.3.2.1 lại được chia làm 3

phân nhánh nhỏ hơn đó là 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c. Sự đa dạng lưu hành vi-rút

Cúm gia cầm trong giai đoạn này làm cho dịch tễ bệnh Cúm gia cầm trở nên phức

tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm ở Việt

Nam (Creanga và ctv., 2013; Lê Thanh Hòa và Nguyễn Thị Bích Nga, 2012).

Từ năm 2014 đến nay, bệnh Cúm gia cầm xảy ra với quy mô dịch địa phương,

trong đó chủ yếu vi-rút H5N1 gây bệnh tại các tỉnh Đông Nam Bộ và Đồng bằng

sông Cửu Long, vi-rút H5N6 chủ yếu gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc. Trong 6 tháng

đầu năm 2020 đã xảy ra 40 ổ dịch Cúm gia cầm, trong đó có 34 trường hợp do vi-

rút H5N6 và 6 trường hợp do vi-rút H5N1 (Cục Thú y, 2020).

1.5 Đặc điểm bệnh lý bệnh Cúm gia cầm

1.5.1 Dấu hiệu lâm sàng của gia cầm mắc bệnh

Vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao gây bệnh với dấu hiệu lâm sàng rất trầm

trọng, tỷ lệ tử vong cao trên gà. Các loài thủy cầm có dấu hiệu lâm sàng ở mức độ

thấp hơn và có thể là dạng mang trùng (Nguyễn Tùng, 2013).

Dấu hiệu lâm sàng trên gia cầm:

- Gà bệnh do vi-rút Cúm gia cầm có biểu hiện như: Chết đột ngột, tỷ lệ tử

vong cao có thể đến 100%; ủ rũ, lông xơ xác, bỏ ăn; giảm năng suất đẻ trứng; phù

thủng đầu và cổ; mào và tích sưng to hoặc có màu tím tái; tiêu chảy phân xanh

trắng; xuất huyết da chân; có triệu chứng thần kinh, loạng choạng; chảy nước mũi,

miệng.

- Các loài thuỷ cầm bệnh do vi-rút Cúm gia cầm có một số biểu hiện lâm sàng

bao gồm: Ủ rũ; bỏ ăn; có triệu chứng thần kinh, quay vòng vòng; mắt có màu khói,

đục mắt; có thể chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cũng có thể lên đến 100%, năng suất đẻ

trứng giảm. Những con khỏi bệnh yếu ớt, có thể đẻ lại sau vài tuần khỏi bệnh (Lê

Văn Năm, 2004).

1.5.2 Bệnh tích trên gia cầm mắc bệnh

Trong cùng một ổ dịch, bệnh tích đại thể trên gà thường trầm trọng hơn các

loài thủy cầm. Đối với gà, bệnh tích thường gặp là mào tích sưng to, tím tái; phù

quanh mí mắt; thể nhẹ bệnh tích ở các xoang cơ thể đặc trưng bởi viêm ca ta, lắng

đọng fibrin. Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẻ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ.

Xuất huyết điểm trên bề mặt niêm mạc. Xuất huyết toàn bộ đường tiêu hóa, rõ nhất

là manh tràng và dạ dày tuyến (Alexander, 2007). Túi fabricius sung huyết và xuất

huyết. Bệnh tích ghi nhận trên loài thủy cầm tương tự như trên gà, nhưng tần suất

biến đổi chủ yếu ở phổi, túi khí, buồng trứng và đường tiêu hóa (Lê Văn Năm,

2004).

Bệnh tích vi thể chủ yếu là sung huyết, xuất huyết, xâm nhiễm bạch cầu đơn

nhân ở não và một số cơ quan khác. Mạch máu các cơ quan như mào, tích, gan,

lách, phổi, thận, cơ tim, cơ vân bị giãn rộng và xâm nhiễm tế bào xung quanh mạch

quản (Beard, 1998).

1.6. Miễn dịch đối với vi-rút Cúm gia cầm

1.6.1. Miễn dịch thụ động

Kháng thể mẹ truyền giữ vai trò quan trọng bảo vệ thú non khỏi sự nhiễm

trùng, tuy nhiên đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tiêm vắc-xin ở thú

non. Hiệu lực bảo hộ của kháng thể mẹ truyền ở gia cầm tương đối ngắn, chỉ kéo

dài không quá 2 - 3 tuần (De Vriese và ctv., 2010). Gà con 11 ngày tuổi từ trứng

của đàn gà mẹ đã được tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm, sẽ không được bảo hộ khi

bị công cường độc với chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 độc lực cao, với 83% gia

cầm chết do công cường độc (De Vriese và ctv., 2010). Để có thể được bảo hộ khỏi

sự tấn công của vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, gia cầm con cần có hiệu giá kháng

thể HI ở mức cao hơn 4log2. Để gia cầm con có thể có hiệu giá HI kháng thể mẹ

truyền ở mức 4log2, đàn gà mẹ cần phải có mức hiệu giá kháng thể HI cao hơn

7log2 (De Vriese và ctv., 2010).

Ở vịt, kháng thể mẹ truyền chỉ duy trì trong vòng 2 tuần đầu, với giá trị GMT

chỉ ở mức 2,13log2, dưới ngưỡng kháng thể bảo hộ HI (≥4log2) theo quy định của

Cục Thú y (Phan Chí Tạo và Trần Ngọc Bích, 2016).

Mặt khác, kháng thể mẹ truyền đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm (H5N1) có

tác động ức chế rõ đáp ứng tạo kháng thể ở gà khi được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm

(Shaimaa Talat và ctv., 2020; De Vriese và ctv., 2010; Kim và ctv., 2010), ngay cả

khi gà con có mức kháng thể mẹ truyền thấp (dưới 5log2 - 6log2) hoặc không phát

hiện được kháng thể trước khi tiêm vắc-xin (Riks Maas và ctv., 2011).

Hiệu quả bảo hộ của vắc-xin vô hoạt Cúm gia cầm H9N2 ở gà được tiêm lúc 7

ngày tuổi cao hơn rõ so với gà 1 ngày tuổi được tiêm vắc-xin. Ảnh hưởng của

kháng thể mẹ truyền đến hiệu quả miễn dịch ở gà con được tiêm vắc-xin Cúm gia

cầm H9N2 xảy ra rõ khi hiệu giá kháng thể HI ở mức cao (trung bình từ 6log2 -

8log2). Việc tăng liều kháng nguyên trong vắc-xin có thể khắc phục được tác động

của kháng thể mẹ truyền đối với đáp ứng tạo kháng thể khi tiêm vắc-xin Cúm gia

cầm ở gà con (Shaimaa Talat và ctv., 2020).

Nghiên cứu của De Vriese và ctv. (2010) chỉ ra rằng, gà con có kháng thể mẹ

truyền khi được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm ở 1 ngày tuổi, dù có hay không kháng

thể phát hiện được, đều đáp ứng miễn dịch bảo hộ rất kém chống lại công cường

độc chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 độc lực cao, so với gà con 10 ngày tuổi. Vì

vậy, khuyến cáo là nên tiêm vắc-xin Cúm gia cầm vào khoảng 5 - 7 ngày tuổi

(Shaimaa Talat và ctv., 2020) hoặc 10 ngày tuổi cho gà con nở ra từ trứng của gà

mẹ đã được tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm (De Vriese và ctv., 2010). Hoặc có thể

lựa chọn tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm vector sống nhược độc có đáp ứng tạo

kháng thể sau tiêm vắc-xin không bị ức chế bởi kháng thể mẹ truyền (Bublot và

ctv., 2006).

1.6.2. Miễn dịch chủ động

1.6.2.1. Miễn dịch dịch thể

Phản ứng miễn dịch dịch thể ở gia cầm có thể bao gồm sản xuất kháng thể

toàn thân cũng như niêm mạc (miễn dịch tại chỗ). Kháng thể được tạo ra nhằm mục

tiêu chống lại nhiều loại protein vi-rút cúm có tầm quan trọng đối với cả việc bảo vệ

khỏi bệnh và chẩn đoán vi-rút cúm. Vi-rút cúm có 11 protein khác nhau có thể được

chia thành ba loại chính: protein bề mặt, protein bên trong và protein phi cấu trúc.

Hạt vi-rút chứa ba protein bề mặt: protein HA, neuraminidase (NA) và matrix

2 (M2). Các protein bề mặt là các kháng nguyên duy nhất có khả năng tạo ra kháng

thể trung hòa và do đó tạo được miễn dịch bảo hộ. Các subtype khác nhau có phản

ứng miễn dịch đặc hiệu với các chủng vi-rút khác trong cùng subtype HA hoặc NA,

nhưng không phản ứng chéo với các vi-rút không cùng subtype. Protein HA có hai

chức năng chính đó là gắn kết vi-rút với thụ thể trên màng tế bào và gây ra sự hoà

màng tế bào với vỏ vi- rút để giải phóng RNA của vi-rút vào tế bào chủ. Protein HA

là một protein màng tích hợp glycosyl hóa tạo thành một homotrimer (ba phân tử

HA liên kết với nhau) trên bề mặt của vi-rút (Wiley và ctv.,1981).

Các kháng thể đặc hiệu với protein HA là yếu tố quyết định trong miễn dịch

gia cầm chống lại vi-rút Cúm (Johansson và ctv.,1989). Chuẩn độ kháng thể đối với

protein HA thường dùng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). Xét nghiệm HI

là một xét nghiệm đặc hiệu về subtype. Hiệu giá HI của huyết thanh ở gia cầm có

mối tương quan chặt chẽ với mức độ bảo hộ chống lại việc công cường độc bằng vi-

rút thuộc cùng subtype HA.

Protein NA có hoạt tính enzyme quan trọng trong việc tách axít sialic, giúp vi-

rút tách ra khỏi bề mặt tế bào nhiễm. Protein NA cũng tạo ra kháng thể trung hòa ở

gà, vắc-xin NA đặc hiệu subtype có thể bảo vệ chống lại thử thách cường độc với

vi-rút HPAI (McNulty và ctv., 1986). Kháng thể kháng protein NA có tác dụng hỗ

trợ tăng khả năng bảo hộ đối với vi-rút Cúm gia cầm. Sự bảo hộ được tăng lên khi

chuột được tiêm vắc-xin DNA bao gồm cả gien HA và NA (Chen và ctv., 1999).

Chuột được tiêm vắc-xin chứa một mình protein NA chỉ có tác dụng làm giảm

lượng vi-rút được giải phóng ra từ tế bào, trong khi đó, tiêm vắc-xin với protein HA

đã ngăn chặn hoàn toàn quá trình nhân lên của vi-rút (Johansson và ctv.,1989).

Protein M2 là một protein màng tích hợp có chức năng như một kênh ion cho

hạt vi-rút. Khi hạt vi-rút gắn vào thụ thể tế bào chủ và bị ẩm bào, việc giảm pH

trong thể nội bào (endosome) cũng làm giảm độ pH bên trong hạt vi-rút do kênh ion

M2, từ đó kích hoạt protein HA tạo ra sự hoà màng (fusion) của màng (envelope)

vi-rút với màng tế bào vật chủ. Kháng thể kháng protein M2 ở chuột không bảo hộ

chuột hoàn toàn chống lại vi-rút cúm, nhưng làm giảm lượng vi-rút thải ra và có

tính bảo hộ từng phần (Frace và ctv., 1999). Ưu điểm chính của kháng thể kháng

protein M2 có khả năng bảo hộ vật chủ chống lại tất cả vi-rút thuộc bất kỳ subtype

HA và NA nào. Tuy nhiên, chưa có công trình nào được công bố để xác định xem

kháng thể của gia cầm kháng protein M2 có bảo hộ được gia cầm chống vi-rút Cúm

gia cầm (Slepushkin và ctv., 1995).

Phản ứng miễn dịch cũng tạo ra kháng thể chống lại các protein bên trong

khác của vi-rút Cúm gia cầm, đặc biệt là các protein nucleoprotein (NP) và matrix 1

(M1). Cả hai loại protein này đều là kháng nguyên quan trọng và được sử dụng

trong các xét nghiệm chẩn đoán vì có tính bảo tồn cao về mặt di truyền. Kháng thể

kháng hai loại protein này đặc hiệu về tuýp vi-rút, được dùng để phân biệt vi-rút

Cúm type A với vi-rút tuýp B và vi-rút Cúm tuýp C.

Kháng thể tiết (IgA) trong đáp ứng miễn dịch niêm mạc có thể đóng một vai

trò quan trọng trên gia cầm đã bị nhiễm bệnh và bảo vệ gia cầm khỏi sự tái nhiễm,

đặc biệt là với vi-rút cúm gia cầm có độc lực trung bình (MPAI) chủ yếu gây ra

nhiễm trùng niêm mạc. Phản ứng miễn dịch niêm mạc có vai trò bảo vệ khỏi nhiễm

trùng HPAI vì sự phơi nhiễm ban đầu với vi-rút là qua bề mặt niêm mạc. Ở vịt, IgA

kháng vi-rút cúm được phát hiện trong mật của những con vịt bị nhiễm vi-rút

(Magor và ctv., 1998). Gà đã được chứng minh là tạo ra phản ứng miễn dịch IgA

sau khi nhiễm vi-rút bệnh Newcastle và vi-rút viêm phế quản truyền nhiễm. Hơn

nữa, đã có bằng chứng về IgA chịu trách nhiệm phản ứng miễn dịch cục bộ bảo hộ

vật chủ khi bị thử thách cường độc với các vi-rút (Russell và ctv., 1993).

Nhìn chung, hệ thống miễn dịch dịch thể tạo ra kháng thể kháng lại các kháng

nguyên khác nhau của vi-rút cúm. Kháng thể đặc hiệu kháng protein HA là quan

trọng nhất đối với việc trung hòa vi-rút thông qua việc gắn kết với một đầu của

kháng nguyên HA, ức chế gắn kết vi-rút vào các tế bào chủ. Kháng thể đặc hiệu

kháng protein HA cũng có thể liên kết với các thụ thể Fc tế bào bị nhiễm để tạo

thuận lợi cho quá trình thực bào các hạt vi-rút. Kháng thể kháng protein NA làm

hạn chế sự lây lan của vi-rút cúm bằng cách ức chế hoạt động của enzym

neuraminidase. Kháng thể đặc hiệu kháng protein M2 được tạo ra ở mức độ hạn chế

sau khi nhiễm vi-rút cúm tự nhiên, vì bản thân protein này có mặt ở nồng độ thấp

trong các tế bào bị nhiễm. Bên cạnh đó, các kháng thể đặc hiệu kháng protein NP

cũng góp phần hạn chế sự lây nhiễm vi-rút cúm. Các kháng thể này có thể kích hoạt

sự phân giải tế bào bị nhiễm qua trung gian bổ thể (Carragher và ctv., 2008).

Đường xâm nhập chính của vi-rút cúm là các mô niêm mạc. Do đó, IgA và

IgM có thể hoạt động như các kháng thể ở các mô niêm mạc, trung hòa vi-rút ở

niêm mạc, ngăn chặn sự xâm nhập và sự nhân lên của vi-rút cúm. Các kháng thể

trung hòa, chủ yếu là dạng IgA, hoạt động đặc hiệu kháng lại protein HA và NA của

vi-rút cúm. Sự kích thích của đáp ứng miễn dịch tiên phát xảy ra ở các tổ chức mô

bạch huyết và đáp ứng miễn dịch thứ phát xảy ra ở trong máu. Trong đáp ứng miễn

dịch tiên phát, kháng thể IgM ban đầu chiếm ưu thế, còn kháng thể Ig Y chiếm ưu

thế ở đáp ứng miễn dịch thứ phát. Mức IgM cao hơn có thể kết hợp với vi-rút nhanh

hơn, đáp ứng IgM tốt và sớm thường dẫn đến đáp ứng kháng thể IgY tốt hơn sau đó.

Điều này cho thấy rằng, có thể tồn tại một mối liên kết bẩm sinh giữa đáp ứng IgM

sớm đặc hiệu với vi-rút Cúm A và sản xuất kháng thể IgY tiếp theo (Carolien và

ctv., 2012).

1.6.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Các tế bào TCD4+ và TCD8+ được tạo ra khi nhiễm vi-rút cúm sẽ kích hoạt tế bào

T giúp đỡ CD4+ đặc hiệu vi-rút, các loại tế bào Th1 và Th2, các peptit liên kết

MHC phân lớp II có nguồn gốc từ vi-rút trên các tế bào trình diện kháng nguyên;

Ngoài ra, T helper 17 (Th17) và các tế bào T điều chỉnh (Tregs) kiểm soát đáp ứng

miễn dịch tế bào chống lại nhiễm vi-rút cúm đã được xác định. Tế bào Th17 cải

thiện phản ứng của T helper bằng cách sản xuất IL-6 ngăn ngừa chức năng của

Tregs. Tregs kiểm soát cả tế bào TCD8+ và tế bào T helper sau khi nhiễm vi-rút. Bên

cạnh đó, Tregs không có bất kỳ ảnh hưởng nào đối với đáp ứng của tế bào B, nhưng

chúng có thể ngăn chặn đáp ứng của T helper (Campell và Koch, 2011). Hơn nữa,

IL-35 tiết ra bởi Tregs, hoạt động như thuốc ức chế phản ứng viêm. IL-35 đã được

chứng minh trong viêm phế nang thứ phát sau khi nhiễm cúm (Chen và ctv., 2016).

Các tế bào TH được chia thành hai nhóm phụ gồm các tế bào TH1 và TH2 dựa

trên cấu trúc cytokine khác nhau của chúng. Tế bào Th1 tạo ra IFN-γ và IL-2 và liên

quan chủ yếu đến đáp ứng miễn dịch tế bào, trong khi các tế bào Th2 tạo ra IL-4 và

IL-13 liên quan đến kích thích đáp ứng của tế bào B. Phân nhóm tế bào TCD4+ đặc

trưng có tên là tế bào T follicular helper (Tfh) có tác động hiệu quả đối với bộ nhớ

miễn dịch và tiêm chủng (Kreijtz và ctv., 2011).

Khi nhiễm vi-rút cúm, epitopes vi-rút kết hợp với phân tử MHC lớp I kích

hoạt các tế bào TCD8+ nguyên thủy trong các hạch bạch huyết. Việc kích hoạt dẫn

đến việc di chuyển của các tế bào này đến nơi chúng phát hiện các tế bào nhiễm vi-

rút cúm, loại bỏ chúng thông qua hoạt tính ly giải và ức chế sự sản sinh của vi-rút.

Hoạt động ly giải được thực hiện bởi các chất tiết perforin và granzyme. Màng tế

bào bị nhiễm sẽ bị chọc thủng bởi perforin, làm cho quá trình xâm nhập các

granzymes vào các tế bào được dễ dàng, cuối cùng là quá trình chết theo chương

trình - apoptosis. GrA (Granzyme) ngăn chặn sự nhân lên của vi-rút thông qua sự

tổng hợp protein của vi-rút và tế bào chủ (Domselaar và Bovenschen, 2011).

Tế bào T gây độc CTL (Cytotoxic T lymphocyte) đặc hiệu sau khi nhiễm vi-

rút được phát triển và bảo tồn theo sự điều tiết của các tế bào T, IL-17 và tế bào tua

gai (Dendritic cell), các cơ quan bạch huyết và tại vị trí nhiễm trùng (Geurtsvan

Kessel và ctv., 2009).

Miễn dịch tế bào bẩm sinh tạo nên hàng rào bảo vệ nhanh và đầu tiên chống

lại sự xâm nhập của vi-rút gây bệnh. Hàng rào miễn dịch tế bào này có tác dụng làm

chậm sự xâm nhiễm, giảm sự nhân lên của vi-rút, thúc đẩy miễn dịch thu được xảy

ra nhanh và mạnh hơn, giúp cơ thể nhanh chóng loại trừ vi-rút và hồi phục.

Các nghiên cứu của Saranya và ctv. (2013), Wang và ctv. (2016), Hayward và

ctv. (2015) đều ghi nhận vai trò của miễn dịch tế bào ở người nhiễm vi-rút cúm. Tế

bào lympho T gây độc (cytotoxic T lymphocytes - CTLs) bảo vệ người nhiễm vi-rút

cúm, làm giảm mức độ lâm sàng, tăng khả năng loại trừ vi-rút cúm khỏi cơ thể và

giúp người bệnh nhanh hồi phục. Saranya và ctv. (2013) còn cho rằng các vắc-xin

kích ứng được miễn dịch tế bào có thể tạo được miễn dịch chéo quan trọng ở vật

chủ được tiêm vắc-xin.

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, kháng thể không phải là yếu tố duy nhất bảo

vệ gia cầm chống vi-rút cúm (Leung và ctv., 2013); Nghiên cứu của Van der Goot

và ctv. (2005) ghi nhận sự bảo hộ khi công cường độc liều cao vi-rút Cúm H7N7

độc lực cao ở những gia cầm đã được tiêm vắc-xin sau 1 tuần nhưng không phát

hiện được kháng thể đo bằng kỹ thuật HI.

Ngoài miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào cũng có vai trò bảo vệ gia cầm

chống lại vi-rút Cúm gia cầm chủng độc lực cao. Nghiên cứu của Seo và ctv.,(2001)

ghi nhận, gà con được tiêm tế bào lympho T thu được từ gà đã được tiêm vắc-xin

Cúm gia cầm H9N2 vẫn sống sót sau khi bị công cường độc bởi chủng vi-rút Cúm

gia cầm độc lực cao H5N1. Mặt khác, mức độ nhận diện các tế bào nhiễm vi-rút

Cúm gia cầm H5N1 hoặc H9N2 tuỳ thuộc vào hàm lượng tế bào lympho T hoặc

CD8+. Kết quả này cho thấy vai trò quan trọng của miễn dịch tế bào đối với bệnh

Cúm gia cầm và khả năng miễn dịch chéo của các tế bào lympho T trong bảo vệ gà

chống lại sự công cường độc chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1.

1.6.3. Miễn dịch chéo đối với vi-rút Cúm gia cầm

Hiệu giá kháng thể HI thay đổi tuỳ theo loại kháng nguyên HA sử dụng trong

chuẩn độ. Nghiên cứu của Zeng và ctv. (2016) ghi nhận hiệu giá kháng thể HI thấp

hơn 4 và 8 lần khi chuẩn độ bằng vi-rút Cúm A khác chủng (chủng DK/DPRK/1/13

và chủng Swan/HeN/2/15) so với chủng gốc DK/GD/S1322/10. Điều này cho thấy

hiệu giá kháng thể HI không phải là chỉ số chắc chắn cho việc đánh giá hiệu quả

bảo hộ của vắc-xin và cần cẩn thận khi giải thích kết quả chuẩn độ kháng thể bằng

kỹ thuật HI với hiệu quả bảo hộ của vắc-xin trên thực tế.

Vắc-xin Cúm gia cầm có thể có bảo hộ chéo với các chủng vi-rút thuộc các

clade, thậm chí các subtype khác nhau (Seo và ctv., 2001; Kang và ctv., 2020). Tuy

nhiên mức độ bảo hộ chéo tuỳ thuộc vào mức độ tương đồng di truyền giữa chủng

vi-rút vắc-xin và chủng vi-rút công cường độc hoặc thực địa.

Nghiên cứu của Zeng và ctv. (2016) đánh giá hiệu quả vắc-xin vô hoạt Re-6

dựa trên kháng nguyên HA và NA chủng vi-rút Cúm A/duck/Guangdong/S1322/10

(DK/GD/S1322/10), H5N1 clade 2.3.2.1, trong bảo vệ gia cầm khi công cường độc

bằng các chủng vi-rút Cúm H5N1 clade 2.3.2.1, 2.3.4.4 và 7.2 đã ghi nhận hiệu quả

bảo hộ hoàn toàn đối với các chủng công cường độc thuộc clade 2.3.2.1, kém hiệu

quả hơn đối với clade 7.2 và hiệu quả rất kém đối với clade 2.3.4.4.

Mặc dù vắc-xin vô hoạt dựa trên kháng nguyên HA và NA chủng vi-rút Cúm

H5N1 clade 2.3.2.1 bảo hộ 80% gà bị công cường độc bởi chủng vi-rút Cúm A

clade 2.3.4.4, 20% gà còn lại vẫn bài thải vi-rút sau công độc, nghĩa là vắc-xin

không thể bảo hộ gà hoàn toàn khỏi nhiễm vi-rút Cúm A H5N1 clade 2.3.4.4, hay

nói khác hơn vắc-xin với kháng nguyên của chủng vi-rút Cúm A clade 2.3.2.1

không thể được sử dụng thể kiểm soát hoàn toàn bệnh Cúm gia cầm do vi-rút Cúm

A H5N1 clade 2.3.4.4.

Trong thực tế, chủng vi-rút Cúm gia cầm sử dụng trong vắc-xin thường khác

biệt so với chủng vi-rút Cúm gia cầm thực địa, điều này dẫn đến hiệu quả bảo hộ

của vắc-xin trên thực tế tiêm phòng không thể đạt được 100%.

1.6.4. Cơ chế né tránh miễn dịch của vi-rút Cúm gia cầm

- Né tránh miễn dịch tự nhiên

Protein NS1 góp phần vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên thông qua việc ức chế

thụ thể RIG-1, cũng như làm thay đổi biểu hiện gien của tế bào vật chủ qua việc gắn

kết với yếu tố CPSF30 (cleavage polyadenylation specificity factor) (Pichlmair và

ctv., 2006).

Cả hai protein PB2 (đặc biệt trên những biến chủng của vi-rút Cúm chứa axít

aspartic tại vị trí số 9) và protein PB1-F2 (những biến chủng chứa serin tại vị trí 66)

cũng có vai trò trong né tránh miễn dịch tự nhiên qua việc ức chế sự sản xuất IFN-β

(Conenello và ctv., 2011).

Ngoài ra, vi-rút Cúm tuýp A ức chế sự sản xuất protein kinase R (PKR) có

chức năng kháng vi-rút. Để điều hòa sự sản xuất protein kinase R, protein NP của

vi-rút Cúm tương tác với phức hợp p58-hsp40 gây sự giải phóng protein p58, từ đó

gây ức chế protein kinase R (Sharma và ctv., 2011).

Vi-rút Cúm tuýp A cũng tương tác và né tránh các tế bào miễn dịch trong hệ

thống miễn dịch tự nhiên. Protein NS1 có thể ức chế sự trưởng thành của các tế bào

tua gai và gián tiếp ức chế sự đáp ứng của tế bào T CD8+. Vi-rút Cúm cũng có thể

nhiễm trực tiếp và tiêu diệt tế bào giết tự nhiên (Boliar và Chambers, 2010).

- Né tránh đáp ứng miễn dịch dịch thể

Có nhiều cơ chế khác nhau của vi-rút Cúm A né tránh đáp ứng miễn dịch dịch

thể. Vi-rút cúm thường xuyên biến đổi gien tích tụ và kết quả là hình thành nhiều

kiểu kháng nguyên H và N khác nhau, dẫn đến sự ra đời của chủng vi-rút cúm mới

mà kháng thể đối với các chủng vi-rút trước nó không nhận ra được. Trên những vi-

rút biến chủng, có sự đột biến trên cấu trúc gien HA tạo ra những thay thế axít amin

trong protein HA mà kháng thể trung hòa không còn nhận biết được. Hiện tượng

này được gọi là lệch kháng nguyên, tạo ra sự né tránh kháng thể (Rambaut và ctv.,

2008).

Nghiên cứu của Throsby và ctv. (2008) ghi nhận, biến chủng của vi-rút H5N1

được cấy truyền nhiều đời trên môi trường tế bào in vitro đã né tránh một phần đáp

ứng kháng thể trung hòa CR6261 đặc hiệu cho HA1 và HA2.

Trong một nghiên cứu gần đây của Thontiravong và ctv. (2012) cho thấy chim

cút cũng đóng vai trò rất quan trọng trong việc tái tổ hợp gien của vi-rút Cúm A để

tạo ra những chủng vi-rút Cúm A mới, thoát khỏi hệ thống miễn dịch dịch thể.

1 2

Bình thường

Hình 1.4. Trình diện kháng nguyên của vi-rút Cúm A qua MHC-I và cơ chế né

tránh đáp ứng miễn dịch tế bào

(Carolien và ctv., 2012)

Né tránh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Cơ chế né tránh miễn dịch qua trung gian tế bào của vi-rút Cúm chủ yếu tập

trung ở những vùng gien NP hơn những gien khác và né tránh chủ yếu tế bào T độc

(cytotoxic T cell). Sự thay đổi của một số axít amin trên những quyết định kháng

nguyên giúp vi-rút tránh né sự nhận diện của tế bào T độc (Berkhoff và ctv., 2005).

1.7. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam

1.7.1. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới

Vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm đã được sử dụng ở nhiều quốc gia, căn cứ

vào các nghiên cứu và sử dụng trong thực tế, vắc-xin Cúm gia cầm có thể phân

thành 4 nhóm: Vắc-xin vô hoạt toàn phần, vắc-xin vô hoạt tiểu phần, vắc-xin vector

và vắc-xin DNA.

- Vắc-xin vô hoạt toàn phần: Phần lớn vắc-xin Cúm gia cầm đang lưu hành là

vắc-xin vô hoạt toàn phần, được chế tạo từ các chủng vi-rút cúm thực địa có độc lực

thấp, và một số ít loại vắc-xin sử dụng chủng vi-rút có độc lực cao. Các vắc-xin có

độ tương đồng kháng nguyên cao với chủng vi-rút gây bệnh sẽ bảo hộ lâm sàng rất

tốt cho gia cầm và làm giảm bài thải vi-rút. Để kịp thời tạo ra các dòng vi-rút được

sử dụng để sản xuất vắc-xin, có sự tương đồng kháng nguyên cao, công nghệ di

truyền ngược đã được sử dụng để tạo ra chủng vi-rút có gien HA và NA tương đồng

với chủng vi-rút thực địa, các thành phần khác được lấy từ chủng vi-rút có độc lực

thấp, như A/Puerto Rico/8/34 (PR8) có khả năng phát triển tốt trên phôi trứng, để

đảm bảo vắc-xin được sản xuất an toàn và với số lượng lớn (Li và ctv., 2018). Công

nghệ di truyền ngược đã được sử dụng để sản xuất vắc-xin thương mại cho gia cầm

ở Trung Quốc, Ai Cập, Việt Nam và nhiều quốc gia khác trong nhiều năm và gần

đây chủng vi-rút vắc-xin bằng công nghệ di truyền ngược đã được cấp phép lưu

hành tại Mỹ và Mexico (Chen, 2009, Kilany và ctv., 2016).

- Vắc-xin vô hoạt tiểu phần: Vắc-xin sử dụng 1 hoặc 2 protein kháng nguyên

của vi-rút cúm (chủ yếu là protein HA), thực hiện bằng cách chèn gien HA vào tế

bào nấm, thực vật, các vector vi-rút (baculovirus) (Ge và ctv., 2016) hoặc vi khuẩn

Escherichia coli (Farsad và ctv., 2016) để sản xuất HA của vi-rút cúm, sau đó được

nhũ hóa với dầu để tạo vắc-xin. Vắc-xin HA biểu hiện trên baculovirus gần đây đã

được cấp phép sử dụng ở Ai Cập (Suarez và Pantin-Jackwood, 2017).

- Vắc-xin vector: Vắc-xin sử dụng các vector vi-rút hoặc vi khuẩn sống mang

cDNA hoặc RNA mã hóa các kháng nguyên như HA, NA, M2 của vi-rút cúm. Hầu

hết các vắc-xin vector thương mại hiện nay là vắc-xin vector vi-rút biểu hiện protein

HA. Các vắc-xin vector có sẵn hiện nay như là vắc-xin vector đậu gà, vector HVT

(Herpesvirus of Turkey), vector Newcastle và vector alphavirus (Suarez và Pantin-

Jackwood, 2017). Vắc-xin vector có thể sử dụng cho gà 1 ngày tuổi ngay sau khi ấp

và cung cấp bảo hộ sớm cho gà với chi phí gây miễn dịch thấp. Tuy nhiên hiệu quả

bảo hộ của vắc-xin vector có thể bị ảnh hưởng do kháng thể mẹ truyền hoặc kháng

thể đang có sẵn của gà phản ứng với vector. Vắc-xin có thể cho hiệu quả bảo hộ tốt

nếu được tiêm nhắc lại bằng các loại vắc-xin vô hoạt khác sau 2-3 tuần.

- Vắc-xin DNA: chủ yếu sử dụng các plasmid DNA được chèn cDNA mã hóa

HA của vi-rút cúm. Vắc-xin này cung cấp bảo hộ thông qua việc thu nhận và biểu

hiện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên hoặc bạch cầu đơn nhân để gây đáp ứng

miễn dịch. Vắc-xin DNA dựa trên gien HA vi-rút cúm cần có công nghệ hiện tại,

chi phí cao, hiệu quả bảo hộ của vắc-xin chưa tốt nếu chỉ sử dụng vắc-xin DNA mà

không kết hợp tiêm nhắc lại bằng vắc-xin vô hoạt (Hussein và ctv., 2016).

Theo OIE (2018), vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm cần đạt được các điều

kiện sau đây: (1) Thời điểm công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ là ít nhất 3

tuần sau tiêm vắc-xin; (2) Chủng vi-rút Cúm gia cầm sử dụng để công cường độc

phải gây chết ít nhất 90% gia cầm không được tiêm vắc-xin; (3) Liều công cường

độc ở mức 106 liều trung bình gây chết phôi gà; (4) Tỷ lệ bảo hộ ở gia cầm được

tiêm vắc-xin khi bị công cường độc phải cao hơn 80%; (5) Gia cầm được tiêm vắc-

xin Cúm gia cầm phải giảm bài thải vi-rút công cường độc rõ rệt so với gia cầm

không được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm qua xét nghiệm dịch phết hầu họng hoặc hậu

môn; (6) Hiệu giá kháng thể HI tối thiểu phải đạt ở mức 5log2 ở gà tiêm thực địa và

7log2 ở gà khi công cường độc thí nghiệm đánh giá bài thải vi-rút.

Bảng 1.1. Hiệu quả của một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm

STT

Loại vắc-xin

Lịch tiêm

Công cường độc

Tỷ lệ bảo hộ (%)

Bài thải vi-rút

Tham khảo

Loài gia cầm

Hiệu giá kháng thể HI (log2)

Chủng DKSH/04

Vịt

100% vịt tiêm vắc- xin bảo hộ.

Không bài thải vi-rút . Lô đối chứng bài thải vi-rút 3-5 ngày

3 tuần, IM; 0.5 ml chứa 4,6 µg kháng nguyên HA/liều

100% bảo hộ

Gà

A/Gs/Guangdong/ 1/96

Bài thải vi-rút đường miệng 3 ngày

Tian và ctv. (2005), Qiao và ctv. (2006)

Vắc-xin tái tổ hợp - Re-1. HA và NA từ A/Gs/Guangdong/1/ 96

3 tuần, IM; 0.5 ml chứa 2,8 µg kháng nguyên HA/ liều

10 (3 tuần), >4 (sau tiêm 40 tuần)

100% bảo hộ

Chủng DKSH/04

Ngỗn g

10 (35 sau tiêm 35 tuần)

Không bài thải vi-rút 3 tuần sau tiêm

3 tuần, 4 tuần và 17 tuần, 4,6 µg kháng nguyên HA/liều

7-8

100% bảo hộ

Gà

Giảm bài thải 101

Lee, Senne , Suarez (2004)

H5N2 (A/chicken/Puebla /8623-607/94)

2 tuần, 4 tuần, 0.8 µg kháng nguyên HA/liều

Vắc-xin vô hoạt H5N2 A/CK/mexico/ 232/94/CPA

8-9

100% bảo hộ

Gà

Giảm bài thải 104-5

H5N2 (A/chicken/Indone sia/7/03

Swayne, Lee , Spackman (2007)

3 tuần,6 tuần, 1,2 µg kháng nguyên HA/liều

STT

Loại vắc-xin

Lịch tiêm

Công cường độc

Tỷ lệ bảo hộ (%)

Bài thải vi-rút

Tham khảo

Hiệu giá kháng thể HI (log2)

Loài gia cầm

Gà

1tuần,5 tuần

8-9

90-100%

Liu và ctv. (2003)

H5N1 (A/CK/HK/86.3/0 2)

Dương tính dịch khí quản,huyệt và truyền qua tiếpxúc

Gà

>11

86-100%

Webster và ctv. (2006)

H5N1 (A/Chicken/Vietn am/C58/04)

0,25-1,2 µg kháng nguyên HA/liều

Bài thải vi-rút đường miệng 5 ngày

Vịt

100%

Webster và ctv. (2006)

H5N1 (A/Duck/Thailand /71.1/04)

Không bài thải vi-rút,bảo hộ đến 4 tháng

Vắc-xin tái tổ hợp H5N3, A/Chicken/Vietnam/ C58/04 (H5N1) và A/Duck/Germany/1 215/73 (H2N3

Gà

6,5-8,5

100% bảo hộ

Liu và ctv. (2003)

H5N1 (A/CK/HK/86.3/0 2)

Giảm bài thải vi-rút và lây truyền

1-2 tuần, 1,2 µg kháng nguyên HA/liều, một liều đơn

Vắc-xin tái tổ hợp H5N3, A/Goose/HK/437.4/ 99 (H5N1) và A/Duck/Germany/ 1215/73 (H2N3)

Gà

100 %bảo hộ

Giảm bài thải 102,5-4,5

Bublot và ctv. (2006)

H5N1 (A/CK/Vietnam/0 008/2004)

2,5, sau công cường độc 3 tuần

Vắc-xin tái tổ hợp Fowlpox H5 Trovac, A/turkey/Ireland/13

STT

Loại vắc-xin

Lịch tiêm

Công cường độc

Tỷ lệ bảo hộ (%)

Bài thải vi-rút

Tham khảo

Loài gia cầm

Hiệu giá kháng thể HI (log2) 7,6

78/83 (H5N8)

Gà

3-4 tuần

100% bảo hộ

Không bài thải vi-rút

Qiao và ctv. (2006)

H5N1 (A/Goose/Guangd ong/1/96)

3,58 (1tuần), 7 (2 tuần), 3- 4 (40 tuần)

Vắc-xin tái tổ hợp Fowlpox H5N1 A/Goose/Guangdon g/1/96 (H5N1);

Gà

100% bảo hộ

H5N1 (BHG/QH/O5)

Không bài thải vi-rút

Ge và ctv. (2007)

1 tuần, 0,16 µg kháng nguyên HA/liều

Vắc-xin tái tổ hợp H5 NDV, A/Bar- headed goose/ Qinghai/3/2005

Gà

3 tuần, 6 tuần

9-10

90% Bảo hộ

Giảm bài thải 104-5

Swayne, Lee, Spackman (2006)

H5N2 (A/chicken/Indone sia/7/03)

Vắc-xin vô hoạt H5N2, A/duck/postdam/14 02/86

Vịt

7,69

100% bảo hộ

1 ngày tuổi, 4 tuần

Không bài thải vi-rút

Beato và ctv. (2007)

H5N1 (A/duck/Vietnam/ 12/05

1.7.2. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các vắc-xin Cúm gia cầm sử dụng cho tiêm phòng cho đàn gia

cầm chủ yếu là vắc-xin vô hoạt toàn phần. Năm 2006, Việt Nam lần đầu sử dụng

vắc-xin Re-1 (clade 0) để triển khai chương trình tiêm phòng quốc gia phòng bệnh

Cúm gia cầm H5N1 clade 1 và kết quả rất khả quan trong việc kiểm soát bệnh Cúm

gia cầm.

Giai đoạn 2007 - 2009, dịch Cúm gia cầm tái phát với sự lưu hành phổ biến

của vi-rút H5N1 clade 2.3.4, sau tiến hóa thành 2.3.4.1, 2.3.4.3 ở các tỉnh phía Bắc;

vi-rút H5N1 thuộc clade 1, clade 1.1 lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, vắc-xin

Re-1 và Re-5 (clade 2.3.4) đã được sử dụng (Nguyễn Văn Cảm, 2012).

Giai đoạn 2010 - 2012, vi-rút cúm H5N1, clade 2.3.2 xuất hiện tại các tỉnh

phía Bắc, sau tiến hóa thành clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c (Nguyễn Thị Bích

Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) trong khi đó vi-rút H5N1 clade 1.1, sau tiến hóa thành

1.1.1/1.1.2 vẫn lưu hành chủ yếu tại các tỉnh phía Nam. Tại các tỉnh phía Bắc sử

dụng vắc-xin Navet-Vifluvac thay thế vắc-xin Re-1/Re-5. Tại các tỉnh phía Nam

vắc-xin Re-1 vẫn được sử dụng do phù hợp với vi-rút clade 1.1.1/1.1.2 đang lưu

hành (Carrel và ctv., 2012).

Giai đoạn 2013 - 2014, vi-rút H5N1 clade 2.3.2.1b không còn xuất hiện, clade

2.3.2.1 c chiếm ưu thế trong các ổ dịch Cúm gia cầm được phân lập, đồng thời bắt

đầu có sự xâm nhập vi-rút Cúm gia cầm H5N6 tại các tỉnh giáp biên giới Trung

Quốc. Vắc-xin Re-6 được nhập khẩu để phòng bệnh H5N1 do vi-rút nhánh 2.3.2.1c.

Vắc-xin Cúm gia cầm được sử dụng chủ yếu giai đoạn này bao gồm Navet-

Vifluvac, Re-5 và Re-6 để phòng bệnh đối với vi-rút H5N6 clade 2.3.4.4 và H5N1

clade 2.3.2.1c (Cục Thú y, 2014).

Từ năm 2015 đến nay: có sự xâm nhập của vi-rút Cúm gia cầm H5N6 từ các

tỉnh biên giới phía Bắc đến các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ, duyên hải

miền Trung, riêng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 clade 2.3.2.1c vẫn lưu hành chủ yếu

tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ (Cục Thú y, 2019). Vắc-xin Cúm gia cầm

được sử dụng chủ yếu giai đoạn này bao gồm Navet-Vifluvac, Re-5, Re-6, Vắc-xin

NavetFluvac 2 với thành phần kháng nguyên gồm chủng NIBRG-14 thuộc clade 1

và chủng CDC-30 thuộc clade 2.3.2.1 để phòng bệnh đối với vi-rút H5N6 clade

2.3.4.4 và H5N1 clade 2.3.2.1c (Cục Thú y, 2020).

Kết quả thử nghiệm công cường độc đánh giá một số loại vắc-xin phòng bệnh

Cúm gia cầm do các phòng thí nghiệm của Cục Thú y trong thời gian qua cho thấy

các loại vắc-xin: Navet-Vifluvac, Navet-Fluvac 2, K-New-H5 có hiệu quả bảo hộ

với vi-rút Cúm gia cầm H5N1 nhánh 2.3.2.1c và H5N6 nhánh 2.3.4.4 (Cục Thú y,

2020).

Một trong những nghiên cứu quan trọng đó là nhập các chủng vi-rút từ các

phòng thí nghiệm tham chiếu về để sản xuất vắc-xin. Chủng vi-rút NIBRG-14 là

chủng vi-rút vắc-xin đã được Tổ chức Y tế thế giới cho phép sử dụng để làm vắc-

xin. Chủng vi-rút này do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học

(NIBSC) - Anh tái tổ hợp từ 2 chủng virút Cúm A/Vietnam/1194/2004(H5N1) và

A/PR/8/34, trong đó gien mã hóa H5 (được cắt bỏ 4 axit amin mang tính kiềm) và

N1 lấy từ chủng vi-rút của Việt Nam, 6 gien còn lại lấy từ chủng A/PR/8/34.

Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn Hiệp (2006), Lê Trần Bình (2007). Với chủng

vi-rút vắc-xin này, Công ty Navetco đã thực hiện đề tài nghiên cứu giai đoạn 2006 -

2012 để xây dựng qui trình sản xuất vắc-xin Cúm A/H5N1 nhũ dầu để phòng chống

bệnh Cúm gia cầm. Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc-xin dùng chủng NIBRG-14

của Công ty Navetco tạo được hiệu giá kháng thể trung bình từ 3,5log2 - 3,8log2 ở

gà tiêm 1 mũi lúc 3 tuần tuổi và 6,3log2 - 6,7log2 ở gà tiêm 1 mũi lúc 4 tuần tuổi

(Nguyễn Văn Dung, 2007). Kết quả thử nghiệm cho thấy vắc-xin NIBRG-14 bảo hộ

được gia cầm chống lại clade 1 và 2.3.2.1a nhưng không bảo hộ được chống lại

2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng, 2012).

Chủng vi-rút CDC-RG30 đã được nhập khẩu từ Trung tâm phòng chống Dịch

bệnh Quốc gia Hoa Kỳ. Chủng vi-rút CDC-RG30 mang gien HA và NA của chủng

A/Hubei/1/2010 và các gien PB2, PB1, PA, NP, M và NS của chủng vi-rút Cúm

A/PuertoRico/8/1934(H1N1). Kết quả phân tích kháng nguyên cho thấy, chủng

CDC-RG30 có sự tương đồng kháng nguyên với các chủng vi-rút clade 2.3.2.1c và

không tương đồng với các chủng vi-rút clade 1.1 và 2.3.4. Kết quả thử nghiệm công

cường độc cho thấy, vắc-xin CDC-RG30 có thể bảo hộ gà, vịt chống lại các vi-rút

clade 1.1 và 2.3.2.1c. Công ty Navetco đã sử dụng chủng vi-rút CDC-RG30 và

chủng vi-rút NIBRG-14 để nghiên cứu sản xuất vắc-xin nhị giá Navet-Fluvac 2

phòng bệnh Cúm gia cầm từ năm 2013 - 2018. Đề tài nghiên cứu đã được Bộ Khoa

học và Công nghệ nghiệm thu năm 2018. Vắc-xin Navet-Fluvac 2 được đánh giá có

hiệu quả phòng bệnh với các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam gồm

các nhánh 1.1, 2.3.2.1 a, 2.3.2.1 b, 2.3.2.1 c và vi-rút Cúm A/H5N6 (Cục Thú y,

2019).

Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin trong nước, nhiều loại vắc-xin

phòng bệnh Cúm gia cầm đã được nhập khẩu và đưa vào sử dụng. Giai đoạn 2007 -

2010, vắc-xin tái tổ hợp Re-5 (clade 2.3.4) được nhập khẩu từ Trung Quốc để phòng

bệnh đối với vi-rút Cúm A/H5N1 clade 2.3.4. Thử nghiệm trên gà cho thấy, với liệu

trình tiêm 1 mũi, tỉ lệ có kháng thể bảo hộ đạt thấp, nhưng với liệu trình tiêm 2 mũi

tỉ lệ có kháng thể bảo hộ trên 80%. Vắc-xin vô hoạt Nobilis Influenza H5N2

(Intervet, Hà Lan) và vắc-xin vô hoạt nhũ dầu chế từ chủng H5N2 (Weike, Trung

Quốc) cho hiệu giá kháng thể đạt cao từ 8,76log2 - 10log2 vào lúc 6 tuần tuổi sau

khi tiêm lần 1 (Tô Long Thành, 2006). Một số vắc-xin được đánh giá lại bằng thí

nghiệm công cường độc đối với các chủng vi-rút cúm đang lưu hành. Vắc-xin Re-1

có thể bảo hộ 80% gà chống lại các vi-rút clade 1, 100% gà đối với clade 2.3.4; vắc-

xin Re-5 có thể bảo hộ 90% gà chống lại vi-rút clade 1 và 2.3.4, 70% gà chống lại

vi-rút clade 2.3.2.1a và 0% với clade 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm, 2011). Vắc-xin

tái tổ hợp Re-6 (clade 2.3.2.1) nhập khẩu từ Trung Quốc được khảo nghiệm trên gà

có kết quả bảo hộ 70% chống lại clade 1.1, 100% chống lại 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và

2.3.2.1c (Công ty Thuốc Thú y Trung ương I, 2013). Nhìn chung tất cả các vắc-xin

thương mại trên đều có hiệu quả bảo hộ tốt cho gia cầm trong từng thời gian nhất

định.

Bảng 1.2. Một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm được lưu hành tại Việt Nam

STT

Tên vắc-xin

Chủng vi-rút sử dụng trong vắc-xin

Nước sản xuất

H5N1, chủng NIBGR-14

Việt Nam

Navet-Vifluvac (Tái tổ hợp, vô hoạt)

Việt Nam

Navet-Fluvac 2 (Tái tổ hợp, vô hoạt)

H5N1, chủng NIBGR-14 và H5N1,A/Hubei/1/2010 (H5N1)-PR8-IDCDC-RG30

H5N2

Hà Lan

Nobilis influenza H5 (Vắc-xin vô hoạt)

Vectormune HTV AIV

H5N1, clade 1.1 và 2.3.2.1c

Mỹ

Vi-rút Cúm gia cầm H5

Mexico

K-New H5 (Tái tổ hợp phòng bệnh Newcastle và Cúm)

H5N2

Đức

Volvac AI KV Vắc-xin vô hoạt

Medivac AI

H5N1

Indonesia

Subtype H5N1, Strain Re-1

Subtype H5N1, Strain Re-5

Subtype H5N1, Strain Re-6

Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-1 (DAHUANONG) Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-5 (DAHUANONG) Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-6 (DAHUANONG)

Trung Quốc

Subtype H5N1, Strain Re-5

Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-5 (QYH)

Subtype H5N1, Strain Re-6

Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-6 (QYH)

Subtype H5N1, Strain Re-5

Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-5 (HARBIN)

Subtype H5N1, Strain Re-6

Vắc-xin tái tổ hợp vô hoạt Re-6 (HARBIN)

(Cục Thú y, 2020)

1.7.3. Hiệu lực của vắc-xin Cúm gia cầm và phương pháp đánh giá

Hiện tại chưa có vắc-xin nào có thể đáp ứng đầy đủ tất cả các tiêu chí như hiệu

lực, an toàn, bền với nhiệt độ môi trường, giá rẻ, hiệu quả sau một liều tiêm (Peyre

và ctv., 2009). Ngoài ra, vắc-xin Cúm gia cầm cũng phải cho phép có thể phân biệt

được gia cầm được chủng ngừa vắc-xin và gia cầm nhiễm vi-rút tự nhiên.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm vắc-xin

vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm như sau:

- Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 10 con gà từ 2 - 3 tuần tuổi, khỏe mạnh, âm

tính với kháng thể kháng vi-rút Cúm gia cầm; 30 con gà từ 4 - 5 tuần tuổi, mẫn cảm,

khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng vi-rút Cúm gia cầm; 45 con vịt hoặc ngan

từ 2 đến 3 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng vi-rút Cúm

gia cầm.

- Kiểm tra tính an toàn: Trên gà, tiêm cho 10 con gà từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi

con 2 liều vắc-xin ghi trên nhãn. Trên vịt hoặc ngan: tiêm cho 10 con vịt hoặc ngan

từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi con 2 liều vắc-xin ghi trên nhãn. Theo dõi động vật

thí nghiệm trong 14 ngày. Vắc-xin được coi là an toàn nếu tất cả gà/vịt/ngan sống

khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay

triệu chứng toàn thân.

- Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp trọng tài:

+ Đối với gà: Sử dụng 15 con gà khỏe từ 4 đến 5 tuần tuổi, chia làm 2 nhóm:

Nhóm 1: Gồm 10 con gà, mỗi con được tiêm 1 liều vắc-xin ghi trên nhãn, theo

đường dưới da cổ; Nhóm 2: gồm 5 con gà làm đối chứng, không tiêm vắc-xin.

+ Đối với vịt, ngan: Sử dụng 15 vịt hoặc ngan khỏe từ 2 đến 3 tuần tuổi, chia

làm 2 nhóm: Nhóm 1: gồm 10 con vịt hoặc ngan, tiêm dưới da 2 liều vắc-xin (0,5

ml/con vào ngày tuổi thứ 14 và 1 ml vào ngày tuổi thứ 35); Nhóm 2: gồm 5 con vịt

hoặc ngan làm đối chứng, không tiêm vắc-xin.

Sau khi tiêm 21 ngày đối với gà, 14 ngày sau mũi tiêm cuối cùng đối với vịt

hoặc ngan, động vật ở lô được tiêm và lô đối chứng được thử thách với chủng vi-rút

Cúm gia cầm cường độc H5N1 hiện hành bằng phương pháp nhỏ mũi, liều

106 EID50/con. Theo dõi động vật thí nghiệm trong 10 ngày. Vắc-xin được coi là đạt

nếu: Ít nhất 80 % động vật ở lô được tiêm sống, không có bất kỳ biểu hiện nào của

bệnh Cúm gia cầm; ít nhất 80% động vật ở lô đối chứng chết.

- Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp thay thế: Sau khi tiêm 21 ngày đối với

gà, 14 ngày sau mũi thứ 2 đối với vịt/ngan, tất cả động vật được lấy máu, thu huyết

thanh làm phản ứng HI. Vắc-xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng thể trung bình

(GMT) của lô miễn dịch phải ≥4log2, trong khi đó lô đối chứng âm tính.

1.8. Tình hình bệnh và sử dụng vắc-xin Cúm gia cầm tại khu vực khảo sát

1.8.1. Tình hình chăn nuôi và bệnh Cúm gia cầm

Căn cứ số liệu của Cục Thú y tại Hội nghị xây dựng chuỗi liên kết và vùng an

toàn dịch bệnh phục vụ xuất khẩu, tổ chức tại tỉnh Bình Phước tháng 4/2021, tổng

đàn gia cầm tại 8 tỉnh, thành thực hiện khảo sát là 91,25 triệu con, chiếm khoảng

18,25% tổng đàn gia cầm trong cả nước, trong đó các trang trại chăn nuôi gia cầm

tập trung chiếm khoảng 70% tổng đàn gia cầm của các tỉnh, thành.

Bảng 1.3: Tình hình chăn nuôi gia cầm tại các tỉnh khảo sát

Địa phương Tổng đàn gia cầm (triệu con)

Đồng Nai 32,6

Tiền Giang 17,7

Bình Dương 13,3

Long An 9

Bến Tre 8,1

Bà Rịa - Vũng Tàu 5,5

Tây Ninh 5,1

TP. Hồ Chí Minh 0,35

Tổng cộng 91,25

(Cục Thú y, 2021)

Tình hình bệnh Cúm gia cầm trong cả nước nói chung và các tỉnh thành khảo

sát trong giai đoạn 2013-2015 diễn biến phức tạp do sự xuất hiện các nhánh vi-rút

thuộc nhóm 2.3.2.1. Trong năm 2013 cả nước có 31 tỉnh thành phát sinh bệnh Cúm

gia cầm, trong đó có các tỉnh Tây Ninh, Tiền Giang, Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu

và Đồng Nai . Năm 2014 cả nước có 33 tỉnh, thành xảy ra bệnh Cúm gia cầm, trong

đó có tác tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Long An, Bến Tre và Bà Rịa - Vũng Tàu.

Năm 2015 cả nước có 24 tỉnh, phát sinh bệnh Cúm gia cầm, trong đó có 13 tỉnh

phía Bắc do vi-rút Cúm A/H5N6, 11 tỉnh phía Nam do vi-rút Cúm A/H5N1, trong

khu vực khảo sát có các tỉnh Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre.

Về chủng vi-rút gây bệnh Cúm gia cầm trong khu vực có sự lưu hành đan xen

nhiều nhánh vi-rút gây bệnh tại các tỉnh khảo sát gây khó khăn cho công tác phòng

chống dịch: Clade 1.1 được phát hiện tại Long An, Thành phố Hồ Chí Minh, Tiền

Giang, Tây Ninh; clade 2.3.2.1a được ghi nhận tại Tây Ninh, Long An, Thành phố

Hồ Chí Minh; clade 2.3.2.1c ghi nhận tại Thành phố Hồ Chí Minh, Long An, Tiền

Giang (Cục Thú y, 2014).

Từ năm 2016 đến nay có sự xâm nhập của vi-rút Cúm gia cầm H5N6 từ các

tỉnh phía Bắc vào khu vực phía Nam. Đối với các tỉnh phía Nam bệnh Cúm gia cầm

chủ yếu do vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c; bên cạnh đó đã ghi nhận các ổ

dịch cúm gia cầm do vi- rút Cúm A/H5N6 xảy ra trên địa bàn một số tỉnh: Bà Rịa -

Vũng Tàu, Đồng Nai, Tiền Giang, Bến Tre (Cục Thú y, 2020).

Một số tỉnh đã xây dựng vùng an toàn dịch bệnh đối với bệnh Cúm gia cầm và

được Cục Thú y công nhận như : Đồng Nai (05 huyện: Trảng Bom, Thống Nhất,

Định Quán, Long Khánh và Vĩnh Cửu); Bình Dương (05 huyện: Phú Giáo, Bàu

Bàng, Dầu Tiếng, Bến Cát và Bắc Tân Uyên), Tây Ninh (01 huyện: Dương Minh

Châu). Các tỉnh đã hoàn chỉnh hồ sơ công nhận vùng an toàn dịch bệnh, chờ thẩm

định gồm có: Thành phố Hồ Chí Minh đăng ký vùng an toàn dịch bệnh Cúm gia

cầm trên phạm vi toàn Thành phố, 06 huyện của 03 tỉnh đã hoàn thiện hồ sơ, đang

tiến hành thẩm định công nhận vùng an toàn dịch bệnh. Trong đó, 02 huyện của tỉnh

Đồng Nai (Long Thành, Cẩm Mỹ), 03 huyện của tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (Châu

Đức, Phú Mỹ, Côn Đảo) và 01 huyện của tỉnh Bình Phước (Đồng Phú).

1.8.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm

Việc lưu hành đan xen các clade vi-rút gây bệnh gây khó khăn trong việc chọn

lựa vắc-xin phù hợp để kiểm soát dịch bệnh, dẫn đến tình hình bệnh Cúm gia cầm

trong giai đoạn 2013-2015 có gia tăng so với các năm trước.

Về hiệu lực các loại vắc-xin đang lưu hành trong giai đoạn 2013 - 2015, được

Cục Thú y đánh giá như sau:

- Vắc-xin Navet-Vifluvac (Công ty Navetco): Tỷ lệ bảo hộ trên gà đạt 80% đối

với vi-rút H5N1 nhánh 1.1 và 2.3.2.1a; Tỷ lệ bảo hộ trên vịt đạt 90% với nhánh 1.1.

- Vắc-xin H5N1 Re-5 (Trung Quốc): Tỷ lệ bảo hộ trên gà đạt 90% đối với vi-

rút H5N1 nhánh 1.1; 100% đối với vi-rút H5N1 nhánh 2.3.2.1a; 30% đối với vi-rút

H5N1 nhánh 2.3.2.1b; 10% đối với vi-rút H5N1 nhánh 2.3.2.1c. Tỷ lệ bảo hộ trên

vịt đạt 100% đối với vi-rút H5N1 nhánh 1.1; 2.3.2.1a và 2.3.2.1b.

- Vắc-xin H5N1 Re-6 (Trung Quốc): Tỷ lệ bảo hộ trên gà đạt 50% đối với vi-

rút H5N1 nhánh 1.1; 100% đối với vi-rút H5N1 nhánh 2.3.2.1, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c.

Tỷ lệ bảo hộ trên vịt đạt 100% đối với vi-rút H5N1 nhánh 1.1; 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và

2.3.2.1c.

Về chủng loại vắc-xin Cúm gia cầm sử dụng, căn cứ tình hình lưu hành vi-rút

Cúm gia cầm đối với các tỉnh ghi nhận có lưu hành đan xen 2 nhánh vi-rút Cúm

A/H5N1 và Cúm A/H5N6 như Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Tiền Giang, Bến

Tre... cần sử dụng vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng bảo hộ đối với cả 2 nhánh

vi-rút lưu hành, đối với các tỉnh chỉ ghi nhận lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc

nhánh 2.3.2.1 c có thể sử dụng vắc-xin Navet-Vifluvac, Re-6, Navet-Fluvac 2 để

tiêm phòng.

Về quy trình tiêm phòng đối với các hộ nuôi gà quy mô nhỏ lẽ chỉ thực hiện

tiêm phòng 1 mũi tiêm, đối với thủy cầm thực hiện quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin

cách nhau 14 ngày.

Đối với các trang trại nuôi gà thịt lông trắng có thời gian nuôi ngắn (40 - 45

ngày) đa số áp dụng các biện pháp an toàn sinh học và giám sát lưu hành vi-rút

trong từng đợt chăn nuôi và không thực hiện tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh Cúm

gia cầm.

Đối với các trang trại nuôi gà thịt lông màu đa số áp dụng các biện pháp an

toàn sinh học và kết hợp phòng bệnh bằng vắc-xin với quy trình tiêm 1 mũi vắc-xin

phòng bệnh Cúm gia cầm.

Đối với các trang trại nuôi gà đẻ trứng, nuôi gà giống kết hợp an toàn sinh học

và kết hợp phòng bệnh bằng vắc-xin với quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin phòng bệnh

Cúm gia cầm, cách nhau 14 ngày và tái chủng định kỳ sau mỗi 6 tháng.

Đối với trang trại nuôi vịt thịt công nghiệp, thời gian xuất chuồng ngắn (Từ 48

- 52 ngày/mỗi đợt nuôi) áp dụng các biện pháp an toàn sinh học và kết hợp phòng

bệnh bằng vắc-xin với quy trình tiêm 1 mũi vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm, thực

hiện giám sát lưu hành vi-rút sau mỗi đợt xuất chuồng.

Đối với loại hình nuôi vịt khai thác trứng, nuôi vịt chạy đồng phải áp dụng

nghiêm ngặt quy trình phòng bệnh bằng vắc-xin với quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin

phòng bệnh Cúm gia cầm, cách nhau 14 ngày và tái chủng định kỳ sau mỗi 6 tháng.

Chi cục Chăn nuôi và Thú y tổ chức lấy mẫu giám sát huyết thanh sau tiêm

phòng tại các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ (lấy 60 mẫu/xã hoặc 60 mẫu/huyện), riêng đối với

các trang trại thì thực hiện lấy mẫu giám sát định 1 lần/năm (60 mẫu/trại). Kết quả

giám sát cho thấy hiện nay các loại vắc-xin sử dụng phòng bệnh Cúm gia cầm là

phù hợp tình hình dịch tễ tại các địa phương; tỷ lệ đáp ứng miễn dịch của đàn gia

cầm luôn đạt trên 70% (Cục Thú y, 2021).

Kết quả giám sát lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại các chợ kinh doanh

gia cầm sống tại các tỉnh khu vực khảo sát là 2,78%, điều này khẳng định nguy cơ

phát sinh bệnh Cúm gia cầm là khá cao (Cục Thú y, 2021).

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

2.1.1. Địa điểm

- Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm và Điều trị - Chi cục Chăn nuôi và Thú y

Thành phố Hồ Chí Minh.

- Trung tâm Nghiên cứu Thú y - Công ty cổ phần Thuốc Thú y Trung ương

Navetco.

- Xí nghiệp chăn nuôi gà, xã An Phú, huyện Củ Chi.

- Trại vịt Nghĩa, xã Tân An Hội, huyện Củ Chi.

- Trại vịt trời anh Du, xã An Phú, huyện Củ Chi.

- Giải trình tự gen: Tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc.

2.1.2. Thời gian: Từ tháng 01/2014 đến 12/2019

2.2. Đối tượng nghiên cứu

- Vi-rút Cúm A/H5N1 từ các mẫu bệnh phẩm trên gà, vịt, chim cút, chim trĩ

(não, lách, khí quản, phổi, vết phết dịch hầu họng) thu thập từ các trường hợp nghi

ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm tại Thành phố Hồ Chí Minh, các trường hợp gia cầm

nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm được gửi từ 7 tỉnh lân cận Thành phố Hồ Chí Minh đến

Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh; mẫu trên gia cầm khỏe mạnh thu thập tại

cơ sở giết mổ gia cầm và hộ chăn nuôi nhỏ lẻ tại Thành phố Hồ Chí Minh.

- Gà, vịt, vịt trời được nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu Thú y - Công ty cổ phần

Thuốc Thú y Trung ương Navetco, Xí nghiệp Chăn nuôi gà - Công ty Chăn nuôi

chế biến thực phẩm Sài Gòn; Trại vịt Nghĩa, huyện Củ Chi.

- Đàn gà từ 7 tỉnh nhập về cơ sở giết mổ gia cầm tại Thành phố Hồ Chí Minh;

đàn gà, vịt được nuôi tại các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ tại 5 huyện Củ Chi, Hóc Môn,

Bình Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ.

- Vắc-xin Navet-Fluvac 2: Chứa 2 chủng (chủng NIBRG-14 thuộc clade 1 và

chủng CDC-30 thuộc clade 2.3.2.1a).

2.3. Nội dung nghiên cứu

1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Thành phố Hồ

Chí Minh và các tỉnh lân cận.

2. Nghiên cứu phả hệ giữa các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 được thu thập

và giải trình tự với các chủng vi-rút sử dụng trong thành phần của vắc-xin Navet-

Fluvac 2.

3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia

cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1.

2.4. Vật liệu, hóa chất

- Khu vực nuôi thú thí nghiệm của Công ty Navetco được cách ly nghiêm

ngặt, khu vực công cường độc được kiểm soát chặt chẽ bằng các hệ thống lọc heppa

và tạo chênh áp âm tại trung tâm phòng công cường độc so với bên ngoài. Phòng

công cường độc được Cục Thú y đánh giá đạt cấp độ an toàn sinh học cấp độ 3.

- Vắc-xin Navet-Fluvac 2: Chứa 2 chủng (chủng NIBRG-14 thuộc clade 1 và

chủng CDC-30 thuộc clade 2.3.2.1a). Các chủng vi-rút vắc-xin được tiêm truyền

qua phôi trứng gà 9 - 10 ngày tuổi. Nước trứng chứa vi-rút được kiểm tra hiệu giá

vi-rút bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và được vô hoạt bằng formalin.

Vắc-xin sử dụng chất bổ trợ miễn dịch là nhũ dầu.

- Chủng vi-rút cường độc: Chủng A/chicken/DL/NAVET 0293(14)/2013,

A/H5N1 nhánh 2.3.2.1c; A/duck/Vn0611/NAVET/2011 (H5N1, clade 2.3.2.1b);

chủng A/duck/VietNam/NCVD-1206/2012, A/H5N1 nhánh 2.3.2.1a (Công ty cổ

phần Thuốc Thú y Trung ương Navetco).

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

2.5.1.1. Phương pháp thu thập mẫu xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

với các trường hợp gia cầm nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm A/H5N1

Trong thời gian thực hiện nghiên cứu (năm 2013 - 2015), chúng tôi tiến hành

phân tích mẫu đối với 63 trường hợp gia cầm, thủy cầm, chim trĩ có triệu chứng

nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm như ủ rũ, bỏ ăn, mào, tích thâm tím, sệ cánh, liệt

chân, chân xuất huyết, có triệu chứng thần kinh, trong đó 11 trường hợp tại các hộ

chăn nuôi trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh và 52 trường hợp từ 7 tỉnh lân cận

gởi mẫu chẩn đoán xác định nguyên nhân gia cầm bệnh, chết.

Mẫu xét nghiệm kháng nguyên vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1: lấy khoảng 3 - 5

gram bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột) của gia cầm bị bệnh, nghi mắc

bệnh. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8oC, vận chuyển về phòng xét nghiệm

trong vòng 24 giờ. Xử lý mẫu nghiền 1gram bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung

dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %. Ly tâm ở tốc độ 8.000

v/phút min trong 15 giây. Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống 1,5 ml. Một ống

dùng cho xét nghiệm realtime RT-PCR (rRT-PCR), ống còn lại dùng làm mẫu lưu

bảo quản ở nhiệt độ - 80oC (TCVN 8400-26:2014)

2.5.1.2. Phương pháp đánh giá lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tuýp

A/H5N1 trên đàn gia cầm tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận

* Nguồn mẫu thu thập tại cơ sở giết mổ: Đàn gà từ các tỉnh nhập về cơ sở

giết mổ gia cầm An Nhơn tại Thành phố Hồ Chí Minh được xác định nguồn gốc căn

cứ vào Giấy chứng nhận kiểm dịch xuất tỉnh do Chi cục Chăn nuôi và Thú y các

tỉnh cấp, thực hiện lấy mẫu theo Thông tư số 07/2016/TT-BNNPTNT: Thực hiện 6

đợt lấy mẫu/mỗi đợt lấy mẫu chọn ngẫu nhiên 60 nguồn gà (60 trại khác nhau, căn

cứ nguồn gốc ghi trong chứng nhận kiểm dịch xuất tỉnh) của mỗi tỉnh. Nghiên cứu

tiến hành trong 3 năm (2013, 2014 và 2015), mỗi năm lấy mẫu khảo sát 2 đợt, mỗi

đợt lấy 60 mẫu/nguồn gà nhập về từ mỗi tỉnh.

Mẫu vết phết dịch hầu họng của 5 con gà trong cùng một trại được gộp thành

1 mẫu. Mẫu vết phết được bảo quản trong dung dịch bảo quản mẫu và trữ lạnh, vận

chuyển về phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm bằng phương pháp

realtime RT-PCR. Phân bổ số mẫu cụ thể theo Bảng 2.1:

Bảng 2.1. Phân bổ số mẫu xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm thu

tại cơ sở giết mổ gia cầm An Nhơn

Nguồn gốc mẫu

Số lượng mẫu /năm

Tổng cộng

Năm 2013

Năm 2014

Năm 2015

120

Đồng Nai

120

360

120

Bình Dương

120

360

120

Long An

120

360

120

Tây Ninh

120

360

120

Tiền Giang

120

360

120

Bến Tre

120

360

120

Bà Rịa - Vũng Tàu

120

360

120

TP. Hồ Chí Minh

120

360

2.880

960 Tổng cộng * Nguồn mẫu thu thập tại hộ chăn nuôi: Đàn gà, vịt tại các hộ chăn nuôi

nhỏ lẻ trên địa bàn 5 huyện: Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ,

Thành phố Hồ Chí Minh: Thực hiện 6 đợt lấy mẫu để khảo sát lưu hành vi-rút Cúm

gia cầm. Nghiên cứu tiến hành trong 3 năm (2013, 2014 và 2015), mỗi năm lấy mẫu

khảo sát 2 đợt, mỗi đợt lấy 30 mẫu trên gà và 30 mẫu trên vịt/các huyện khảo sát.

Mẫu vết phết dịch hầu họng từ 5 con gà hoặc vịt của cùng 1 hộ chăn nuôi được

gộp thành 1 mẫu; được bảo quản trong dung dịch bảo quản và trữ lạnh, vận chuyển

về phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 bằng phương pháp

realtime RT-PCR. Phân bổ số mẫu cụ thể theo (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Phân bổ mẫu khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi

Năm 2013

Năm 2014

Năm 2015

STT Địa phương

Tổng

Gà

Vịt

Gà

Vịt

Gà

Vịt

Củ Chi

360

Hóc Môn

360

Bình Chánh

360

Nhà Bè

360

Cần Giờ

360

Tổng cộng

300

1.800 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ dương tính Cúm A/H5N1 theo loài gia cầm lấy mẫu,

theo thời gian; theo địa phương; tần suất xuất hiện các triệu chứng, bệnh tích

thường gặp trên các trường hợp dương tính Cúm A (H5N1) theo loài gia cầm.

Quy trình xử lý mẫu, tiến hành xét nghiệm thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.1.

Hình 2.1. Quy trình xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 (TCVN 8400-26:2014)

(Phụ lục 1)

2.5.2. Nghiên cứu phả hệ, so sánh sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm

2.5.2.1. Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA

Trong giai đoạn 2013 - 2015, nghiên cứu ghi nhận tất cả các trường hợp gia

cầm dương tính Cúm A/H5N1 tại các hộ chăn nuôi trên địa bàn Thành phố và các

trường hợp mẫu xét nghiệm dương tính với Cúm A/H5N1 của người chăn nuôi tại 7

tỉnh khảo sát gởi tại Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm và Điều trị, Chi cục Chăn nuôi và

Thú y Thành phố Hồ Chí Minh. Chọn ngẫu nhiên các mẫu vi-rút Cúm gia cầm

A/H5N1 theo nguyên tắc mỗi tỉnh, thành có ít nhất một mẫu, mỗi loài gia cầm có ít

nhất một mẫu để phân tích trình tự gien HA và xây dựng cây sinh dòng với các

chủng tham khảo.

Các bước thực hiện quy trình giải trình tự gien

Các primer và quy trình nhân bản gien HA Cúm gia cầm H5N1 để giải trình tự

được thực hiện theo quy trình nội bộ (không công bố) của CSIRO Livestock

Industries Australian Animal Health Laboratory, 2010.

Gien HA được khuếch đại theo 4 đoạn HA 10 , HA 20, HA 30 và HA 40 có

kích thước tương ứng 358bp, 747bp, 741bp và 741bp, sau khi giải trình tự được nối

lại thành gien HA hoàn chỉnh có kích thước 1.778 bp. Kiểm tra kích thước sản phẩm

khuếch đại bằng phương pháp điện di trên thạch 1%, chọn những mẫu có sản phẩm

khuếch đại gien HA có kích thước phù hợp gởi đến Công ty Macrogen, Hàn Quốc

giải trình tự gien.

2.5.2.2 Phương pháp phân tích mức độ tương đồng với chủng tham chiếu

Kết quả giải trình tự được xử lý và phân tích bằng phần mềm Sequencher

5.4.6 (Genecodes). Trình tự nucleotide và axít amin của các mẫu được phân tích, so

sánh với các trình tự tham khảo đã công bố trên Ngân hàng gien bằng phần mềm

BioEdit 7.2.6 (Hall, 1999). Tiến hành phân tích trình tự axít amin tại vị trí cắt của

protein HA và so sánh sự khác biệt của các chủng vi-rút Cúm gia cầm phân lập

được với các chủng vi-rút Cúm gia cầm tham khảo.

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các

chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 phân lập với các chủng vi-rút tham khảo, các

chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet fluvac 2.

2.5.2.3. Phương pháp xây dựng cây phả hệ

Tiến hành xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của gien HA của

các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 được phân lập với các chủng vi-rút đang được

sử dụng làm vắc-xin, các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành tại Việt Nam và

trên thế giới. Các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tham khảo được phân lập từ

nhiều nguồn vật chủ khác nhau (người, gà, vịt, ngỗng,…) tại Việt Nam, Trung

Quốc, Lào, Hồng Kông, Campuchia,… đã được công bố trên Ngân hàng gien.

Trong đó có 2 chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam mới nhất, thuộc clade

2.3.2.1c, được công bố trên Ngân hàng gien vào năm 2019: chủng

A/duck/Vietnam/HU12-1542/2019 (MT200019) và A/duck/Vietnam/HU12-

1572/2019 (MT200027) (Bảng 2.3). Phân tích trình tự nucleotide gien HA và xây

dựng cây di truyền theo phương pháp Neighbor - Joining, bằng phần mềm MEGA

6.06. Chỉ số bootstrap được tính toán dựa trên 1.000 lần lặp lại.

Bảng 2.3. Danh sách các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo trong phân tích so

sánh trình tự gien và mối quan hệ phả hệ

Tên chủng

Loài mắc

Nơi phân lập

Phân nhánh

ST T

Năm phân lập

Số đăng ký ngân hàng gien

Gà

2013

Đắk lắk

A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013

2.3.2.1c

Vịt

2017

Bắc Ninh

A/duck/Vietnam/BacNinh/NC VD-17A261/2017

2.3.2.1c

A/reassortant/USCDC_RG30

2.3.2.1a

Vắc- xin

A/reassortant/NIBRG-14

Vắc- xin

Tên chủng

Loài mắc

Nơi phân lập

Phân nhánh

ST T

Năm phân lập

Số đăng ký ngân hàng gien

Vịt

2012

Việt Nam

EPI424362

2.3.2.1a

A/duck/Vietnam/NCVD- 1206/2012

Vịt

2012

Việt Nam

EPI425440

2.3.2.1a

A/duck/Vietnam/NCVD- 1210/2012

Vịt

2011

Việt Nam

EPI425200

2.3.2.1b

A/duck/Vietnam/NCVD129- 7/2011

Vịt

2011

Việt Nam KR732414 2.3.2.1 b

A/duck/Vietnam/NCVD- 672/2011

Vịt

2011

Việt Nam

EPI425931

A/duck/Vietnam/NCVD- 1544/2012

2.3.2.1 c

Vịt

2011

Việt Nam

EPI424984

2.3.2.1c

A/duck/Vietnam/NCVD- 1584/2012

11 A/Vietnam/HN31432M/2008

Người

2008

Việt Nam HM114617

2.3.4.2

Vịt

2019

Việt Nam MT200019

2.3.2.1c

A/duck/Vietnam/HU12- 1542/2019

Vịt

2019

Việt Nam MT200027

2.3.2.1c

A/duck/Vietnam/HU12- 1572/2019

Vịt

2007

Việt Nam CY030383

2.3.4.3

A/chicken/Vietnam/NCVD- 20/2007

15 A/Vietnam/UT31412II/2008

Người

2008

Việt Nam HM114601

2.3.4.3

Gà

2008

Việt Nam

FJ842476

7.1

A/chicken/Vietnam/NCVD- 016/2008

Gà

2008

Việt Nam KR732465

7.1

A/chicken/Vietnam/NCVD- 03/2008

Gà

2008

Việt Nam

FJ842480

7.2

A/chicken/Vietnam/NCVD- 093/2008

19 A/Vietnam/1194/2004

Người

2004

Việt Nam

EF541402

20 A/Viet_Nam/HN30408/2005

Người

2005

Việt Nam

EF456803

Vịt

2012

Việt Nam AB727935

1.1.1

A/duck/Vietnam/OIE- 0062/2012

22 A/Cambodia/S1211394/2008

Người

2008

Việt Nam HQ200596

1.1.1

Ngan

2012

Việt Nam AB728619

1.1.2

A/muscovy_duck/Vietnam/OIE -0043/2012

Tên chủng

ST T

Loài mắc

Nơi phân lập

Phân nhánh

Năm phân lập

Số đăng ký ngân hàng gien

24 A/chicken/Lao/LH2/2010

Gà

2010

Lào

CY098304

2.3.4.1

25 A/Cambodia/V0219301/2011

Người

2011

Campuchia

JN588806

1.1.2

26 A/duck/Hunan/8/2008

Vịt

2008

GU182166

2.3.2.1a

Trung Quốc

27 A/Hubei/1/2010

Người

2010

CY098758

2.3.2.1a

Trung Quốc

Gà

2011

Bangladesh

JN795924

2.3.4.2

A/chicken/Bangladesh/11rs198 4-30/2011

Gà

2018

Lào

MN453573

2.3.2.1c

A/chicken/Laos/NL- 1942888/2018

30 A/chicken/Hebei/A-8/2009

Gà

2009

HM172081

7.2

Trung Quốc

31 A/Goose/Guangdong/1/96

Ngỗng

1996

AF144305

Trung Quốc

32 A/Hong_Kong/156/97

Người

1997

Hồng Kông AF036356

33 A/Hong_Kong/6841/2010

Người

2010

Hồng Kông HQ636461

2.3.2.1c

34 A/Hunan/1/2009

Người

2009

CY098723

2.3.4.1

Trung Quốc

2.5.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm

gia cầm clade 2.3.2.1

2.5.3.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2

Thí nghiệm được thực hiện dựa theo hướng dẫn của Tiêu chuẩn Quốc gia

TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Cúm

gia cầm, cụ thể như sau:

* Thí nghiệm 1 (thực hiện trên gà)

- Gà giống Lương Phượng, 250 con, 2 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng

vắc-xin Cúm gia cầm. Gà được nuôi tại Trung tâm Thú y, xã Nhuận Đức, huyện Củ

Chi, Thành phố Hồ Chí Minh. Gà 2 tuần tuổi, được chọn ngẫu nhiên, chia làm 3 lô,

bố trí như sau:

Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà

Diễn giải Lô 1 ( Tiêm 1 liều) Lô 2 (Tiêm 2 liều) Lô 3 ( Đối chứng)

Số lượng gà (con) 100 100 50

- Liều vắc-xin tiêm/con 1ml/con 0,5ml/con

- Số lần tiêm 1

- Vị trí, đường tiêm 2 (cách nhau 2 tuần) 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da

* Thí nghiệm 2 ( Thực hiện trên vịt)

- Vịt siêu thịt, 285 con, 2 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vắc-xin Cúm

gia cầm. Vịt được nuôi tại trại vịt Nghĩa, ấp Mũi lớn 1, xã Tân an hội, huyện Củ

Chi, Thành phố Hồ Chí Minh. Vịt được chọn ngẫu nhiên chia ra làm 3 lô, bố trí như

Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

Diễn giải Lô 1 ( Tiêm 1 liều) Lô 2 (Tiêm 2 liều) Lô 3 ( Đối chứng)

Số lượng vịt (con) 185 50 50

- Liều vắc-xin/con 1ml/con 0,3ml/con

- 1 Số lần tiêm 1

- Vị trí, đường tiêm 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da

* Thí nghiệm 3 ( thực hiện trên vịt trời)

- Vịt trời, 100 con, 7 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm vắc-xin Cúm gia cầm,

được nuôi tại Trại vịt trời của Ông Du. Vịt trời được chia làm 3 lô, bố trí như sau :

Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

trời

Diễn giải Lô 1 ( Tiêm 1 liều) Lô 2 (Tiêm 2 liều) Lô 3 ( Đối chứng)

20 Số lượng vịt trời (con) 60 20

Liều vắc-xin/con 1ml/con 0,3ml/con -

1 Số lần tiêm 1 -

Các lô gà, vịt, vịt trời thí nghiệm và đối chứng được nuôi nhốt cùng nhau,

Vị trí, đường tiêm - 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da 1/3 phía sau cổ, tiêm dưới da

trong cùng một điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc. Sau khi tiêm, các lô gà, vịt thí

nghiệm được theo dõi trong 3 tuần, quan sát tình trạng sức khỏe gia cầm lô thí

nghiệm, lô đối chứng và kiểm tra bệnh lý tại vị trí tiêm. Trong trường hợp có gia

cầm bệnh hoặc chết phải tiến hành mổ khám, lấy mẫu xét nghiệm để xác định

nguyên nhân chết.

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Trạng thái sức khoẻ gà, vịt, vịt trời thí nghiệm trước và sau tiêm: các dấu

hiệu bỏ ăn, ủ rũ, chết 1 - 5 ngày sau tiêm phòng.

+ Phản ứng ở vị trí tiêm, thời gian xuất hiện.

2.5.3.2. Đánh giá đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vắc-xin Navet -Fluvac 2

* Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI trên gà

Gà giống Lương Phượng, 190 con, 2 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng

vắc-xin Cúm gia cầm. Thí nghiệm được bố trí gồm 3 lô, được bố trí như sau:

+ Lô thí nghiệm 1, tiêm 1 mũi vắc-xin: 100 con gà, 2 tuần tuổi, chọn ngẫu

nhiên 30 con gà để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng;

toàn bộ 100 con gà được tiêm vắc-xin liều 0,5 ml/con. Ở thời điểm 3 tuần sau tiêm

phòng, chọn ngẫu nhiên 30 con gà, lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI.

+ Lô thí nghiệm 2, tiêm 2 mũi vắc-xin: 40 con gà, 2 tuần tuổi, chọn ngẫu nhiên

30 con gà để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng; toàn bộ

40 con gà được tiêm vắc-xin với liều 0,5 ml/con. Sau tiêm 2 tuần, chọn ngẫu nhiên

30 con gà để lấy máu kiểm tra đáp ứng kháng thể; sau đó toàn bộ 40 con gà được

tiêm nhắc lại vắc-xin với liều 0,5 ml/con. Ở thời điểm 3 tuần sau mũi 2, chọn ngẫu

nhiên 30 con gà được lấy máu kiểm tra kháng thể, bằng phương pháp HI.

+ Lô đối chứng: 50 gà không tiêm vắc-xin, dùng làm đối chứng. Gà thí

nghiệm và đối chứng được nuôi trong cùng một điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc,

chọn ngẫu nhiên 10 con gà để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI cùng thời

điểm với các lô thí nghiệm.

Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên gà sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2

* Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI trên vịt

Vịt siêu thịt, 235 con, 2 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vắc-xin Cúm

gia cầm. Thí nghiệm được bố trí gồm 3 lô, được bố trí như sau:

+ Lô thí nghiệm 1 tiêm 1 mũi vắc-xin: 135 con vịt siêu thịt, chọn ngẫu nhiên

30 con vịt để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng; toàn bộ

135 con vịt được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 với liều 0,5 ml/con. Sau tiêm phòng

2 tuần, chọn ngẫu nhiên 35 con vịt để lấy máu kiểm tra đáp ứng kháng thể. Ở thời

điểm 5 tuần sau tiêm phòng, chọn ngẫu nhiên 25 con vịt được lấy máu kiểm tra hiệu

giá kháng thể bằng phương pháp HI.

+ Lô thí nghiệm 2 tiêm 2 mũi vắc-xin: 50 con vịt, chọn ngẫu nhiên 30 con vịt

để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng; toàn bộ 50 con vịt

được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 liều 0,5 ml/con. Ở thời điểm 2 tuần sau tiêm

phòng, chọn ngẫu nhiên 25 con vịt lấy máu kiểm tra kháng thể, đồng thời tiêm lặp

lại mũi 2 cho toàn bộ đàn vịt thí nghiệm với liều 0,5 ml/con. Ở thời điểm 3 tuần sau

tiêm phòng mũi 2, chọn ngẫu nhiên 25 con vịt lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể

bằng phương pháp HI.

+ Lô đối chứng: 50 vịt, dùng làm đối chứng như động vật chỉ báo. Vịt thí

nghiệm và đối chứng được nuôi nhốt cùng nhau, trong cùng một điều kiện nuôi

dưỡng và chăm sóc, chọn ngẫu nhiên 10 con vịt để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng

thể HI cùng thời điểm với các lô thí nghiệm.

Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2

* Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI trên vịt trời

Vịt siêu thịt, 80 con vịt trời, 7 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vắc-xin

Cúm gia cầm. Thí nghiệm được bố trí gồm 3 lô, được bố trí như sau:

+ Lô thí nghiệm 1 tiêm 1 mũi vắc-xin: 30 con vịt trời, được lấy mẫu kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng; toàn bộ số vịt trời được tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 với liều 0,3 ml/con. Sau tiêm phòng 2 tuần, chọn ngẫu nhiên 20 con

vịt trời để lấy máu kiểm tra đáp ứng kháng thể. Ở thời điểm 5 tuần sau tiêm phòng,

chọn ngẫu nhiên 20 con vịt trời lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI.

+ Lô thí nghiệm 2 tiêm 2 mũi vắc-xin: 30 con vịt trời, được lấy mẫu kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI trước khi tiêm phòng; toàn bộ 30 con vịt được tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 liều 0,3 ml/con. Ở thời điểm 2 tuần sau tiêm phòng, chọn ngẫu

nhiên 20 con vịt trời lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI, đồng thời tiêm lặp lại

mũi 2 cho toàn bộ đàn vịt trời thí nghiệm với liều 0,5 ml/con. Ở thời điểm 3 tuần

sau tiêm phòng mũi 2, chọn ngẫu nhiên 20 con vịt trời lấy máu kiểm tra hiệu giá

kháng thể bằng phương pháp HI.

+ Lô đối chứng : 20 vịt trời, dùng làm đối chứng, vịt trời lô thí nghiệm và đối

chứng được nuôi trong cùng một điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc, chọn ngẫu

nhiên 10 con vịt trời để lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể HI cùng thời điểm với

các lô thí nghiệm.

Sơ đồ 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt trời sau tiêm

phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Hiệu giá kháng thể HI của đàn gà, vịt, vịt trời ở thời điểm trước khi tiêm

phòng; 2 tuần sau khi tiêm phòng vắc-xin mũi 1, 3 tuần sau khi tiêm phòng mũi 2.

+ Chỉ số GMT (Geometric Mean Titer) đánh giá miễn dịch quần thể đàn gia

cầm thí nghiệm. Hiệu giá kháng thể trung bình GMT: được tính theo công thức (Hồ

Thị Việt Thu, 2012) và (Trần Ngọc Bích, 2014):

GMT = Antilog [∑log2(mshg)/n]

Trong đó:

mshg: mẫu số hiệu giá của mẫu dương tính theo kỹ thuật HI

n : tổng số mẫu dương tính

2.5.3.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet Fluvac 2 bằng phương

pháp công cường độc

Tại thời điểm nghiên cứu, các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 clade

2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c hiện diện và gây bệnh chủ yếu tại các tỉnh khảo sát. Vì

thế nghiên cứu công cường độc đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-

Fluvac 2 được thực hiện với các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, clade

2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c tùy theo loài vật thí nghiệm.

Địa điểm công cường độc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu, Công ty

NAVETCO, được đánh giá an toàn sinh học cấp độ 3, đảm bảo an toàn sinh học tổ

chức thí nghiệm. Công cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi với liều 106 EID50/

con đối với gà và 107 EID50/con đối với vịt (Đậu Huy Tùng và ctv, 2012).

* Bố trí thí nghiệm trên gà:

- Bố trí 4 lô thí nghiệm, trong đó từ lô 1 đến lô 3, chọn ngẫu nhiên mỗi lô 15

con gà được tiêm phòng 1 liều vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong thí nghiệm kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI, riêng lô thí nghiệm 4 chọn 15 con gà được tiêm phòng 2 mũi

vắc-xin cách nhau 2 tuần.

- Lô đối chứng: Chọn 20 con gà chưa được tiêm phòng từ lô đối chứng trong

thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI sau tiêm phòng ở mục 2.5.3.2. và phân

thành 4 lô đối chứng, mỗi lô đối chứng gồm 5 con gà, được nuôi từng khu vực

riêng biệt và cùng điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng với lô thí nghiệm tương ứng.

Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2

Thí nghiệm Lô thí nghiệm

Số gà công cường độc 15 Clade vi-rút công cường độc 2.3.2.1ª

Thí nghiệm 1 5 2.3.2.1ª

15 2.3.2.1b

Thí nghiệm 2 5 2.3.2.1b

15 2.3.2.1c Thí nghiệm 3 Lô TN (gà tiêm 1 mũi vắc-xin) Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) Lô TN (gà tiêm 1 mũi vắc-xin) Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) Lô TN (gà tiêm 1 mũi vắc-xin)

Thí nghiệm Lô thí nghiệm

Số gà công cường độc 5 Clade vi-rút công cường độc 2.3.2.1c

15 2.3.2.1c

Thí nghiệm 4 5 2.3.2.1c Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) Lô TN (gà tiêm 2 mũi vắc-xin) Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin)

Thời điểm công cường độc là 3 tuần sau khi tiêm phòng mũi 1 đối với gà

được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 theo quy trình 1 mũi (lô 1, 2 và 3); và tại thời

điểm 3 tuần sau khi tiêm mũi 2 đối với gà được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 theo

quy trình 2 mũi (lô 4).

* Bố trí thí nghiệm trên vịt :

- Lô thí nghiệm: Chọn 45 con vịt được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin Navet-

Fluvac 2. Số vịt trên được phân thành 3 lô thí nghiệm mỗi lô thí nghiệm có 15 con

vịt .

- Lô đối chứng: Chọn ngẫu nhiên 15 con vịt chưa được tiêm phòng. Số vịt này

được chia làm 3 lô đối chứng, mỗi lô 5 con vịt.

Các lô vịt thí nghiệm và vịt đối chứng tương ứng sẽ được công cường độc với

vi-rút Cúm gia cầm nhánh 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c. Thời điểm công cường độc là

3 tuần sau khi tiêm phòng mũi 2.

Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt được tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2

Thí nghiệm Lô thí nghiệm Số vịt công cường độc Clade vi-rút công cường độc

Lô TN (vịt tiêm 2 mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1a

Thí nghiệm 1

Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 5 2.3.2.1a

Lô TN (vịt tiêm 2 mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1b

Thí nghiệm 2

Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 5 2.3.2.1b

15 2.3.2.1c Thí nghiệm 3 Lô TN (vịt tiêm 2 mũi vắc-xin)

Thí nghiệm Lô thí nghiệm Số vịt công cường độc Clade vi-rút công cường độc

Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 5 2.3.2.1c

* Bố trí thí nghiệm trên vịt trời:

- Lô thí nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 15 con vịt trời được tiêm phòng 2 mũi vắc-

xin Navet-Fluvac 2 từ thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI.

- Lô đối chứng: Chọn ngẫu nhiên 5 con vịt trời chưa được tiêm phòng từ lô

đối chứng trong thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể HI sau tiêm phòng.

Chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1 c được sử dụng để công độc.

Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt trời được tiêm vắc-xin Navet

Fluvac 2

Thí nghiệm Lô thí nghiệm Số vịt trời công cường độc Clade vi-rút công cường độc

Lô TN (vịt trời tiêm 2 mũi vaccin) 15 2.3.2.1c

Thí nghiệm

Lô ĐC (vịt trời không tiêm vaccin) 5 2.3.2.1c

*Các chỉ tiêu theo dõi

- Hiệu giá kháng thể HI thời điểm 3 tuần sau khi gia cầm (gà, vịt, vịt trời)

được tiêm phòng mũi 1, mũi 2, trước và sau khi công cường độc 10 ngày.

- Tỷ lệ gia cầm bệnh, tỷ lệ gia cầm chết sau công cường độc, tỷ lệ gia cầm bảo

hộ sau khi công cường độc đối với các nhánh vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1/2.3.2.1

a, 2.3.2.1 b và 2.3.2.1 c.

- Tỷ lệ gia cầm bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ở lô thí nghiệm và lô đối

chứng tại thời điểm 3 ngày sau khi công cường độc.

2.5.3.4. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet Fluvac 2 ở gia cầm được

tiêm vắc-xin

Nhằm đánh giá độ dài miễn dịch sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2

trên gà và vịt, so sánh với các loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm đã được cấp

phép lưu hành.

Đối với gà, khảo sát độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 được tiến

hành với cả 2 quy trình: gà được tiêm 1 mũi vắc-xin và 2 mũi vắc-xin.

Đối với vịt, đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 chỉ được

thực hiện với vịt được tiêm 2 mũi vắc-xin. Thí nghiệm được bố trí như sau (Bảng

2.10):

Bảng 2.10. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet Fluvac 2

Lô thí nghiệm Công cường độc Loài gia cầm Tiêm phòng 1 mũi Tiêm phòng 2 mũi 5 6 4 1 Thời điểm lấy mẫu xét nghiệm hiệu giá kháng thể HI sau tiêm phòng 3 2 (Tháng)

Lô TN1 - 15 15 15 15 15 15 15

Lô TN2 15 15 15 15 15 15 15 15 Gà Không thực hiện

Lô ĐC - 5 5 5 5 5 5 -

Lô TN 15 15 15 15 15 15 15 15

Vịt Lô ĐC - 5 5 5 5 5 5 - Thực hiện công cường độc

Tham khảo kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể HI sau khi tiêm phòng vắc-xin

Navet-Vifluvac trên gà và vịt tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng, gà có tỷ lệ mẫu

đạt bảo hộ rất cao, đạt yêu cầu so với quy định nên không bố trí thí nghiệm công

cường độc. Tuy nhiên đối với vịt hiệu giá kháng thể HI đạt tỷ lệ bảo hộ không cao,

do đó trong nghiên cứu này có bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt với chủng

vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c, qua đường nhỏ mắt, mũi với liều 107

EID50/con.

* Các chỉ tiêu theo dõi

- Hiệu giá kháng thể HI sau khi gia cầm (gà, vịt) được tiêm phòng 1 tháng, 2

tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng và 6 tháng;

- Tỷ lệ vịt có hiệu giá kháng thể HI đạt bảo hộ tại thời điểm 6 tháng sau tiêm

phòng.

- Tỷ lệ vịt đạt bảo hộ, tỷ lệ vịt bệnh, chết sau khi công cường độc ở lô thí

nghiệm và lô đối chứng đối với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1/2.3.2.1c ở thời điểm 6

tháng sau tiêm phòng.

- Theo quy định của Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình

kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm, gia cầm có hiệu giá kháng

thể HI đạt bảo hộ khi hiệu giá kháng thể HI >4log2.

2.6. Xử lý thống kê

Các số liệu được xử lý phân tích thống kê sinh học bằng phần mềm MS Excel

và phần mềm thống kê Minitab phiên bản 16.2.0 (https://www.minitab.com/). Trắc

nghiệm T được dùng trong các thí nghiệm đánh giá tính an toàn của vắc-xin Navet-

Fluvac 2 trên gà, vịt và vịt trời, so sánh hiệu giá kháng thể trước và sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà, vịt, vịt trời. Trắc nghiệm F và trắc nghiệm χ2 được

dùng so sánh thống kê các tỷ lệ khảo sát vi-rút Cúm A/H5N1 trên gà tại cơ sở giết

mổ, tại hộ chăn nuôi, so sánh tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng, các bệnh tích

trên gia cầm mắc bệnh Cúm gia cầm A/H5N1, kết quả bài thải vi-rút sau tiêm

phòng.

Chương 3

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

3.1.1 Khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm tại cơ sở giết mổ

Theo số liệu báo cáo của Cục Thú y, tổng đàn gia cầm tại 8 tỉnh, thành thực

hiện khảo sát chiếm khoảng 18,25% tổng đàn gia cầm trong cả nước, đây cũng là

vùng chăn nuôi gia cầm trọng điểm được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

định hướng phát triển phục vụ tiêu dùng trong nước và hướng đến xuất khẩu, trong

đó các trang trại chăn nuôi gia cầm tập trung chiếm khoảng 70% tổng đàn gia cầm

của các tỉnh, thành (Cục Thú y, 2021). Trong năm 2013 và 2014 đã ghi nhận dịch

bệnh Cúm gia cầm tại tất cả các tỉnh, thành khảo sát gồm: Tây Ninh, Tiền Giang,

Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bến Tre và Thành phố Hồ

Chí Minh với sự xuất hiện các nhánh vi-rút thuộc nhóm 2.3.2.1.

Thành phố Hồ Chí Minh là đầu mối tiêu thụ gia cầm lớn nhất khu vực phía

Nam, bình quân lượng gia cầm nhập về giết mổ và tiêu thụ khoảng 200.000

con/ngày. Vì vậy, để kiểm soát tốt bệnh Cúm gia cầm trên đàn gia cầm từ các tỉnh

nhập về Thành phố giết mổ, việc tầm soát lưu hành vi-rút Cúm thông qua lấy mẫu

xét nghiệm tại các cơ sở giết mổ là một trong những nhiệm vụ trọng tâm của các

đơn vị chức năng và của nghiên cứu.

Vi-rút Cúm gia cầm H5N1 thuộc tuýp A, vì thế theo quy trình xét nghiệm,

định danh vi-rút Cúm H5N1, bước đầu tiên trong quy trình tầm soát vi-rút Cúm gia

cầm là xét nghiệm vi-rút Cúm tuýp A. Các trường hợp dương tính với vi-rút Cúm

tuýp A sẽ được xét nghiệm tiếp theo để xác định vi-rút Cúm gia cầm phân tuýp H5

và sau đó là N1.

Nghiên cứu đã thực hiện tầm soát vi-rút Cúm A trên 2.880 mẫu gà có nguồn

gốc từ 7 tỉnh lân cận và Thành phố Hồ Chí Minh, được giết mổ tại cơ sở giết mổ gia

cầm An Nhơn, quận Gò Vấp. Kết quả ghi nhận được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại cơ sở giết mổ

Xét nghiệm Cúm A Nguồn gốc mẫu Số mẫu (+) (%)

360 8 2,22 Đồng Nai

360 7 1,94 Bình Dương

360 11 3,05 Long An

360 12 3,33 Tây Ninh

360 6 1,67 Tiền Giang

360 9 2,50 Bến Tre

360 13 3,61 Bà Rịa - Vũng Tàu

360 8 2,22 TP. HCM

2.880 74 2,57 Tổng cộng

P>0,05

Kết quả xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm trên 2.880 mẫu trên gà có nguồn gốc

từ 7 tỉnh, thành lân cận và Thành phố Hồ Chí Minh nhập vào cơ sở giết mổ gia cầm

An Nhơn, quận Gò Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, có 74/2.880 mẫu dương

tính với vi-rút Cúm A, chiếm tỷ lệ 2,57%. Tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A cao nhất là ở

trên gà có nguồn gốc từ Bà rịa - Vũng Tàu (3,61%), tiếp theo là từ Tây Ninh (3,3%)

và thấp nhất là trên gà có nguồn gốc từ Tiền Giang (1,67%). Tuy nhiên sự khác biệt

về tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A trên gà giết mổ giữa 8 tỉnh thành khảo sát không có ý

nghĩa thống kê, với P>0,05.

Kết quả 74/2.880 mẫu dương tính với vi-rút Cúm A trên gà giết mổ có nguồn

gốc từ 7 tỉnh và Thành phố Hồ Chí Minh (Bảng 3.1) cho thấy có nguy cơ tiềm ẩn

của vi-rút Cúm gia cầm H5N1 trên gà khảo sát. Do vậy, tất cả 74 mẫu dương tính

với vi-rút Cúm A này đã được tiếp tục xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm H5N1 bằng

realtime RT-PCR. Kết quả kiểm tra cho thấy không phát hiện trường hợp mẫu

dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1. Kết quả nghiên cứu có khác biệt với báo cáo

của Tiền Ngọc Tiên (2020), đã phát hiện vi-rút Cúm A/H5N1 trên gia cầm tại cơ sở

giết mổ tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, với tỷ lệ là 5,1%. Khác biệt này có

thể là do khác biệt về thời điểm nghiên cứu. Nghiên cứu này được thực hiện trong

giai đoạn năm 2013 - 2015, trong khi báo cáo của Tiền Ngọc Tiên (2020) được thực

hiện giai đoạn năm 2014 - 2016. Mặt khác, nguồn mẫu thu thập trong 2 nghiên cứu

cũng khác biệt. Nghiên cứu này khảo sát trên gà có nguồn gốc từ 7 tỉnh lân cận và

Thành phố Hồ Chí Minh, trong khi nghiên cứu của Tiền Ngọc Tiên chủ yếu thực

hiện tại các tỉnh khu vực Đồng bằng sông Cửu Long gồm An Giang, Bạc Liêu, Cà

Mau, thành phố Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Trà

Vinh, Vĩnh Long.

Nghiên cứu của Okamasu và ctv.(2013) về lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 tại

Bạc Liêu, Cà Mau và Đồng Tháp ghi nhận, tỷ lệ lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 thay

đổi theo thời gian và địa điểm khảo sát, dao động từ 0,6% tại Đồng Tháp trong khảo

sát tháng 10/2012, 0,5% trong đợt khảo sát tháng 2/2011 và 5% trong khảo sát vào

tháng 10/2011 tại Cà Mau.

Hơn nữa, nghiên cứu này chỉ đánh giá tình trạng nhiễm vi-rút Cúm gia cầm

H5N1 trên nguồn gà nhập từ các cơ sở chăn nuôi công nghiệp, quy mô lớn, điều

kiện an toàn sinh học tốt hơn so với nguồn gia cầm chủ yếu tại các cơ sở giết mổ ở

các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long là chăn nuôi hộ gia đình, trang trại quy mô vừa

và nhỏ, gia cầm được thu gom từ nhiều nguồn khác nhau.

Một lý do khác có thể là do sự lây nhiễm chéo trong quá trình giết mổ tại các

cơ sở giết mổ. Các cơ sở giết mổ gia cầm ở các tỉnh giết mổ cả gà và vịt. Trong

kháo sát nhiễm vi-rút Cúm A/H5N1 của Tiền Ngọc Tiên (2020), mẫu được thu thập

từ cả 2 loài gà và vịt tại lò mổ. Theo các nghiên cứu, vi-rút Cúm gia cầm thường

nhiễm trên vịt ở dạng mang trùng và vịt tại Đồng bằng sông Cửu Long thường được

chăn nuôi theo phương thức chạy đồng, tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm gia cầm chiếm tỷ lệ

khoảng từ 3 - 7% trong các đợt giám sát hàng năm của Cục Thú y trên nguồn vịt

khảo sát tại các chợ và các cơ sở giết mổ.. Trong điều kiện cơ sở giết mổ chung gà

và vịt, nếu không được kiểm soát tốt, nhất là ở các lò mổ thủ công, sẽ có nguy cơ

lây nhiễm chéo giữa gà và vịt trong quá trình nuôi nhốt chờ giết mổ, môi trường

khu vực giết mổ không được tiêu độc khử trùng thường xuyên.

3.1.2 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ

Chí Minh

Khảo sát trên gà giết mổ tại Thành phố Hồ Chí Minh đã không phát hiện

nhiễm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1. Tuy nhiên, để làm rõ hơn nguy cơ bệnh do vi-

rút Cúm gia cầm H5N1 trên đàn gia cầm tại Thành phố Hồ Chí Minh, nghiên cứu

đã thực hiện đánh giá khả năng nhiễm vi-rút Cúm H5N1 trên gà, vịt tại các hộ chăn

nuôi quy mô nông hộ ở Thành phố Hồ Chí Minh.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ

Chí Minh

Số mẫu XN (+) Cúm A Tỷ lệ (%) (+) Cúm A/H5N1 Nguồn gốc mẫu

180 2 1,11 0 Củ Chi

180 7 3,89 0 Hóc Môn

180 6 3,33 0 Bình Chánh

180 4 2,22 0 Nhà Bè

180 6 3,33 0 Cần Giờ

900 25 2,78 0 Tổng cộng

P>0,05

Kết quả khảo sát ghi nhận tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A trên đàn gà tại các hộ

chăn nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh trong khảo sát là 2,78%. Tỷ lệ này có cao

hơn so với tỷ lệ nhiễm (2,22%) vi-rút Cúm A trên gà giết mổ có nguồn gốc từ

Thành phố Hồ Chí Minh (Bảng 3.1). Tuy nhiên, tương tự như ở gà được khảo sát tại

lò mổ, qua khảo sát 900 mẫu swab trên gà khỏe mạnh tại các hộ chăn nuôi trong

giai đoạn 2013 - 2015 tại 5 huyện ngoại thành Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu

không phát hiện trường hợp dương tính Cúm A/H5N1.

Kết quả giám sát lưu hành vi-rút Cúm A trên gà được giết mổ tại Thành phố

Hồ Chí Minh và đàn gà tại các hộ chăn nuôi đều ghi nhận sự hiện diện của vi-rút

Cúm A với tỷ lệ tương ứng là 2,2% và 2,78%, nhưng không có trường hợp nào

dương tính với vi-rút Cúm gia cầm phân type H5N1.

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên vịt tại hộ chăn nuôi

ở Thành phố Hồ Chí Minh

Số mẫu XN (+) Cúm A Tỷ lệ (%) (+) Cúm A/H5N1 Nguồn gốc mẫu

180 8 4,44 0 Củ Chi

180 6 3,33 0 Hóc Môn

180 10 5,55 0 Bình Chánh

180 9 5,00 0 Nhà Bè

180 6 3,33 0 Cần Giờ

900 39 4,33 0 Tổng cộng

P>0,05

Kết quả khảo sát ghi nhận tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A trên đàn vịt tại các hộ

chăn nuôi nhỏ lẻ tại 5 huyện: Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ là

4,33%. Tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A trên vịt cao hơn so với kết quả khảo sát trên gà

cùng thời điểm cũng như phương thức chăn nuôi, tuy nhiên sự khác biệt này không

có ý nghĩa về thống kê với P>0,05. Đối với 39 mẫu phát hiện vi-rút Cúm A, tiếp tục

xét nghiệm tìm vi-rút Cúm A/H5N1, kết quả tất cả các mẫu dương tính Cúm A trên

vịt đều không phát hiện trường hợp nào dương tính Cúm A/H5N1.

Kết quả ghi nhận về lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 trong nghiên cứu phù hợp

với công bố của Nomura và ctv. (2012), khảo sát lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tại

các hộ chăn nuôi, chợ buôn bán gia cầm sống và gia cầm tại các cơ sở giết mổ tại

Bạc Liêu, không phát hiện sự lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm trong

giai đoạn 2009 - 2010. Nghiên cứu của Tiền Ngọc Tiên (2020) cũng không phát

hiện sự lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 trên gia cầm khỏe mạnh tại các hộ chăn nuôi

tại các tỉnh miền Tây Nam Bộ.

Điều này cho thấy, về cơ bản, đàn gia cầm nếu được chăn nuôi, quản lý tốt sẽ

ít có nguy cơ bị nhiễm vi-rút Cúm gia cầm. Tuy nhiên, ngoài vi-rút Cúm gia cầm

phân tuýp H5N1, vi-rút Cúm A nhiễm trên gia cầm còn có thể thuộc các phân tuýp

khác như: H5N2, H5N6, H7N9…

Trương Văn Dung (2008), cho rằng, trên đàn gia cầm tại Việt Nam không chỉ

lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 mà còn lưu hành các chủng vi-rút Cúm A khác. Theo

Cục Thú y, từ năm 2014, vi-rút Cúm gia cầm H5N6 đã xuất hiện và gây bệnh trên

đàn gia cầm ở Việt Nam, trong đó vi-rút H5N1 gây bệnh chủ yếu tại các tỉnh Đông

Nam Bộ và Đồng bằng Sông Cửu Long, trong khi vi-rút H5N6 chủ yếu gây bệnh ở

các tỉnh phía Bắc, đặc biệt trong năm 2021 đã ghi nhận vi-rút Cúm A/H5N8 gây

bệnh trên đàn gia cầm tại các tỉnh khu vực miền Bắc (Cục Thú y, 2021).

3.1.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 đối với các trường hợp gia

cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm

Sự lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên đàn gia cầm còn được đánh giá

qua sự phát hiện vi-rút trên gia cầm bệnh với các triệu chứng nghi ngờ. Khảo sát 63

trường hợp gia cầm có dấu hiệu nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm, gồm 52 trường

hợp do người chăn nuôi tại 7 tỉnh : Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Tây Ninh,

Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bến Tre gởi mẫu tại Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm

và Điều trị, Chi cục Chăn nuôi và Thú y Thành phố Hồ Chí Minh và 11 trường hợp

hộ chăn nuôi trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh có gia cầm chết bất thường, nghi

ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm. Kết quả được trình bày qua Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm đối với các trường hợp nghi ngờ

Nguồn gốc mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu xét nghiệm Dương tính Cúm A/H5N1

Đồng Nai 8 6 75,00

Long An 9 8 88,89

Tiền Giang 12 11 91,67

Tây Ninh 7 6 85,71

Bình Dương 6 4 66,67

Bà Rịa - Vũng Tàu 5 3 60,00

Bến Tre 5 3 60,00

TP. Hồ Chí Minh 11 10 90,91

Tổng 63 51 80,95

Trong số 63 trường hợp gia cầm nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm, kết quả xét

P>0,05

nghiệm có 51/63 mẫu dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, chiếm tỷ lệ

80,95%, trong đó Tiền Giang, Thành phố Hồ Chí Minh, Long An và Tây Ninh có tỷ

lệ mẫu dương tính cao nhất.

Qua rà soát thông tin phiếu nhận mẫu đối với các trường hợp hộ chăn nuôi từ

các tỉnh gởi mẫu xét nghiệm, cũng như kết quả điều tra dịch tễ các trường hợp

dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại các hộ chăn nuôi trên địa bàn Thành

phố Hồ Chí Minh, ghi nhận bệnh phát sinh chủ yếu tại các hộ chăn nuôi gia cầm

quy mô nông hộ, phương thức nuôi thả rông hoặc chuồng hở, gia cầm chưa được

tiêm vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm. Kết quả này cho thấy, có sự lưu hành vi-rút

Cúm gia cầm A/H5N1 trên đàn gia cầm của tất cả các địa phương khảo sát. Tỷ lệ

dương tính vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 giữa các tỉnh khảo sát không có sự khác

biệt có ý nghĩa về thống kê với P>0,05.

Trong giai đoạn 2013 - 2015 do sự xuất hiện các chủng vi-rút Cúm A/H5N1

thuộc nhánh 2.3.2.1, hiệu quả các loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm đang sử

dụng bị giảm rõ rệt, làm cho tình hình bệnh Cúm gia cầm có xu hướng gia tăng

(Cục Thú y, 2015).

Tuỳ theo khả năng mẫn cảm, điều kiện, quy trình chăn nuôi, vắc-xin… sự lưu

hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên các loài có thể khác nhau. Tỷ lệ dương tính

với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm được

trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm vi-rút cúm A/H5N1 theo loài trên gia cầm nghi ngờ

bệnh Cúm gia cầm

Số mẫu (+) H5N1

Loài

Số mẫu XN

Số mẫu (+) H5N1

%

77,78

Gà

83,33

Vịt

80,00

Cút

100

Trĩ

63

51 80,95

Tổng cộng

P>0,05

Trong 51/63 mẫu gia cầm dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1, tỷ lệ mẫu

dương tính trên gà bệnh là 21/27 trường hợp, chiếm tỷ lệ 77,78%, thấp hơn so với tỷ

lệ mẫu dương tính trên vịt là 25/30 trường hợp, chiếm tỷ lệ 83,33%. Tuy nhiên, sự

khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, với P> 0,05. Tỷ lệ dương tính với vi-rút

Cúm gia cầm A/H5N1 cao ở vịt bệnh cho thấy tình trạng mang trùng Cúm gia cầm

A/H5N1 có thể chuyển sang thể lâm sàng trong những điều kiện nhất định.

3.1.4 Dấu hiệu lâm sàng ở gà, vịt bệnh dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1

Trong tổng số 27 gà và 30 vịt nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm, chỉ có 21 gà và 25

vịt dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 qua xét nghiệm realtime RT-PCR

(Bảng 3.4). Biểu hiện lâm sàng của 46 gà và vịt dương tính với vi-rút Cúm gia cầm

A/H5N1 được ghi nhận và trình bày qua Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng trên gà, vịt (+) Cúm A/H5N1

Trên gà (n = 21) Trên vịt (n= 25)

Triệu chứng

Tần suất xuất hiện Tỷ lệ % Tần suất xuất hiện Tỷ lệ %

21a 100 25a 100 Ủ rũ, bỏ ăn

10b1 47,62 13b 52,00 Phân xanh trắng

6b1,b2 28,57 - - Mào, tích thâm tím

4b1,b2 19,05 10b 40,00 Liệt chân

4b1,b2 19,05 12b 48,00 Xoay vòng, co giật

3b2 14,29 6b 24,00 Xệ cánh

5 b1,b2 23,80 5b 20,00 Phù đầu, mặt

6b1,b2 28,57 6b 24,00 Thở khò khè

Ghi chú: Trong cùng một cột, số liệu mang chữ cái khác nhau có sai khác thống kê

(P<0,05).

Dấu hiệu lâm sàng phổ biến của gia cầm nhiễm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

là ủ rũ, bỏ ăn, chiếm tỷ lệ 100%, kế đến là đi phân xanh trắng, chiếm tỷ lệ 47,62% ở

gà và 52% ở vịt. Trên vịt còn ghi nhận dấu hiệu co giật, xoay vòng chiếm tỷ lệ 48%

và liệt chân chiếm tỷ lệ 40%, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) khi so với gà,

chỉ chiếm tỷ lệ 19,05%.

Kết quả ghi nhận dấu hiệu lâm sàng ở gia cầm nhiễm vi-rút Cúm A/H5N1

trong nghiên cứu này tương đồng với khảo sát dấu hiệu lâm sàng các trường hợp

mắc bệnh Cúm gia cầm tại các tỉnh phía Bắc của Lê Văn Năm (2004), Bùi Quang

Anh và Văn Đặng Kỳ (2004), mặc dù chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh

chủ yếu trong giai đoạn này thuộc clade 1. Nghiên cứu của Tiền Ngọc Tiên (2020)

khảo sát dấu hiệu lâm sàng các trường hợp gà, vịt, ngan mắc bệnh Cúm A/H5N1 tại

các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, chủng vi-rút gây bệnh chủ yếu thuộc clade

2.3.2.1c cũng có kết quả tương tự.

Có nhiều nghiên cứu ghi nhận, trong cùng một ổ dịch Cúm gia cầm A/H5N1,

gà thường bị bệnh trầm trọng hơn so với vịt. Theo Barbera và ctv.(2010), yếu tố

RIG-1 (Retinoic acid inducible gene 1), có vai trò ức chế, làm sạch vi-rút Cúm khỏi

cơ thể vật chủ nhiễm vi-rút chỉ hiện diện ở vịt nhưng không có ở gà.

Hình 3.1. Gà ủ rũ, bỏ ăn, chết tại hộ chăn nuôi xã Tân Nhựt, huyện Bình Chánh,

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2013

Hình 3.2. Vịt ủ rũ, chết tại hộ chăn nuôi xã Xuân Thới Thượng, huyện Hóc Môn,

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2014

Hình 3.3. Gà mắc bệnh với dấu hiệu lâm sàng mồng, tích tím tái

Hình 3.4. Vịt mắc bệnh có dấu hiệu rối loạn thần kinh

Huang và ctv. (2012) đã ghi nhận đáp ứng miễn dịch tế bào xảy ra mạnh hơn ở

vịt và số lượng tế bào lympho T, đặc biệt là CD4(+), CD8(+), CD25(+) ở vịt cao

hơn so với ở gà khi nhiễm vi-rút Cúm gia cầm H9N2.

Theo nghiên cứu của Kuchipudi và ctv. (2014), vịt nhiễm vi-rút Cúm gia cầm

A/H5N1 độc lực cao có sự điều hoà tăng IL-18, trong khi ở gà lại điều hoà giảm;

IL-18 có vai trò kiểm soát sự nhân lên của vi-rút cúm trong phổi, nhất là ở giai đoạn

nhiễm sớm, thông qua sự hoạt hoá IFN và tế bào giết tự nhiên (natural killer - NK

cells), tăng khả năng tiêu diệt tế bào nhiễm.

Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể lý giải, khi mắc bệnh Cúm gia cầm vịt

thường có dấu hiệu lâm sàng nhẹ hơn so với gà trong cùng một ổ dịch, thậm chí một

số cá thể có kết quả xét nghiệm dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 nhưng

không có biểu hiện lâm sàng.

Các trường hợp gà, vịt dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong thời

gian nghiên cứu được mổ khám ghi nhận các bệnh tích, thống kê tần suất xuất hiện

các bệnh tích chủ yếu tại các cơ quan đường hô hấp, tiêu hóa... Kết quả được trình

bày qua Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Tần suất xuất hiện các bệnh tích trên gà, vịt (+) với vi-rút Cúm A/H5N1

Trên gà (n = 21)

Trên vịt (n = 25)

Triệu chứng

Tần suất xuất hiện

Tỷ lệ %

Tần suất xuất hiện

Tỷ lệ %

Não xuất huyết

66,67

52,00

Phổi xuất huyết

38,10

32,00

Xuất huyết mỡ vành tim

33,33

28,00

Gan sưng, xuất huyết

38,10

24,00

Lách sưng, xuất huyết

38,10

24.00

Thận sưng, xuất huyết

28,57

20,00

Xuất huyết chân

23,80

8,00

P>0,05

Nghiên cứu ghi nhận các bệnh tích phổ biến trên gia cầm bệnh dương tính với

vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 là não xuất huyết, chiếm tỷ lệ 66,67% trên gà và 52%

trên vịt. Bệnh tích sưng và xuất huyết các cơ quan nội tạng có tần suất ghi nhận trên

gà cao hơn so với trên vịt.

Ngoài ra, dấu hiệu xuất huyết chân được ghi nhận với tỷ lệ 23,80% trên gà,

nhưng tỷ lệ này trên vịt chỉ có 8%, có thể đây là một trong các dấu hiệu đặc trưng

để chẩn đoán lâm sàng gia cầm bệnh nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm A/H5N1.

Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lê Văn Năm (2004)

ghi nhận trên gia cầm mắc bệnh tại các tỉnh miền Bắc. Theo Lê Văn Năm (2004),

tần suất xuất hiện các bệnh tích trên vịt dương tính với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

đều thấp hơn so với trên gà. Trên gà bệnh do vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, bệnh

tích chủ yếu bao gồm xuất huyết mỡ vành bao tim (44%), gan sưng xuất huyết

(38%), lách sưng, xuất huyết (26%), thận sưng xuất huyết (36%). Tuy nhiên nghiên

cứu của Lê Văn Năm được thực hiện vào thời điểm năm 2004, chủng vi-rút Cúm

A/H5N1 lưu hành chủ yếu thuộc clade 1.

Hình 3.5. Xuất huyết da chân

Hình 3.6. Khí quản xuất huyết

Hình 3.7. Xuất huyết não

Hình 3.8. Phổi sung huyết, xuất huyết

Hình 3.9. Xuất huyết mỡ vành tim

Hình 3.10. Gan sưng, xuất huyết

Hình 3.11. Lách sưng, xuất huyết

3.2. Nghiên cứu phả hệ của vi-rút Cúm A/H5N1

3.2.1. Kết quả giải trình tự và phân tích gien HA

3.2.1.1 Xác định phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm theo trình tự gien HA

Dựa trên trình tự gien HA của 26 chủng vi-rút Cúm gia cầm type A/H5N1,

năm 2013 là 5 chủng (từ chim trĩ, chim cút, gà mỗi loài 1 chủng; 2 chủng từ vịt),

2014 là 13 chủng (8 vi-rút lưu hành trên gà, 4 vi-rút lưu hành trên vịt, 1 vi-rút lưu

hành trên trên cút) và năm 2015 là 8 chủng (3 vi-rút lưu hành trên gà, 3 vi-rút lưu

hành trên vịt, 2 vi-rút lưu hành trên cút), cây phả hệ của 26 chủng trong nghiên cứu

đã được thiết lập cùng với các chủng tham khảo trên thế giới (Hình 3.12).

Kết quả phân tích di truyền và phả hệ dựa trên trình tự gien HA theo Bảng 3.8

cho thấy, phần lớn chủng (22/26) thuộc về clade 2.3.2.1c, chỉ có 1 chủng thuộc về

clade 2.3.2.1a và 3 chủng thuộc về clade 1.1.2.

Vào thời điểm cuối năm 2004, biến thể mới của vi-rút Cúm gia cầm H5N1

clade 2.3.2.1c từng xuất hiện và hoành hành ở khu vực Đài Loan, Hồng Kông, miền

Nam Trung Quốc (Creanga. A và ctv, 2020). Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục

Thú y (2014), năm 2012 vi-rút H5N1 clade 2.3.2.1c lưu hành và gây ra các ổ dịch ở

các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Tuy nhiên đến cuối năm 2013 đầu

năm 2014, clade vi-rút này mới xuất hiện, xâm nhập vào các tỉnh phía Nam và gây

bệnh, thay cho clade 1.1 đang lưu hành phổ biến trong những năm trước đây.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Nga

(2012), đã tìm thấy sự có mặt của vi-rút Cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c tại Khánh

Hoà, và đã có sự di chuyển nhanh chóng theo khoảng cách không gian từ Bắc vào

Nam. Và theo kết quả nghiên cứu của Hồ Phước Thành (2016), vi-rút Cúm gia cầm

clade 1.1.2 và clade 2.3.2.1c cùng tồn tại và gây bệnh tại các tỉnh thuộc khu vực

miền Đông Nam Bộ, từ cuối 2013 đến 5/2015 vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1c

dần chiếm ưu thế và gây bệnh ở hầu hết các ổ dịch tại đây.

Kết quả phân tích cho thấy, tình hình lưu hành các clade vi-rút Cúm gia cầm

tại các tỉnh khảo sát khá phức tạp, đối với tỉnh Tây Ninh phát hiện cả 3 clade vi-rút

Cúm gia cầm gồm: 1.1.2, 2.3.2.1a, 2.3.2.1c; Tiền Giang và Long An có hiện diện 2

clade vi-rút Cúm gia cầm gồm clade 1.1.2 và 2.3.2.1c. Tuy nhiên về cơ bản, vi-rút

Cúm gia cầm A/H5N1 lưu hành tại các tỉnh khu vực phía Nam và Thành phố Hồ

Chí Minh phổ biến là clade 2.3.2.1c. Điều này có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong

việc lựa chọn vắc-xin phù hợp trong phòng bệnh Cúm gia cầm tại khu vực phía

Nam và Thành phố Hồ Chí Minh.

Điều đáng lưu ý khi phân tích cây di truyền (Hình 3.12) đó là, các chủng AIV

trong nghiên cứu tuy cùng thuộc về clade 2.3.2.1c nhưng lại xếp thành 2 nhóm.

Nhóm 1 gồm các chủng: A/Vit/ Long An/2015; A/Ga/HoChiMinh/2015;

A/ChimCut/DongNai/2015; A/Vit/TayNinh/2014; A/Ga/LongAn/2015;

A/Vit/BenTre/2015; A/ChimCut/TienGiang2015; A/Ga/TPHCM-XTT-HM/2014;

A/ChimCut/TienGiang/2014; A/Vit/TienGiang/2014; A/Vit/LongAn/2014; và

A/Ga/TienGiang/2014. Nhóm 2 gồm: 2 chủng công cường độc

A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 và A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-

17A261/2017; A/Ga/DongNai/2014; A/Vit/TPKCM-XTT/2013;

A/ChimTri/TienGiang/2013; A/ChimCut/TienGiang/2013; A/Ga/TPHCM-

LongBinh-Q9/2014; A/Ga/BenTre/2014; A/Vit/BinhDuong/2014; A/Ga/BR-

VT/2014 và A/Vit/TPHCM-LongBinh-Q9/2015. Xem xét thành phần các chủng

theo từng nhóm có thể thấy, không có chủng AIV nào của năm 2013 nằm trong

nhóm 1 và rõ ràng AIV trên thực tế đã có sự tiến hoá và hình thành các biến chủng

mới theo thời gian.

Trong số 26 chủng được phát hiện, có 3 chủng thuộc clade 1.1.2, đây là clade

mới xuất hiện tại Việt Nam mấy năm trở lại đây, nhất là ở các tỉnh Đồng bằng Sông

Cửu Long từ năm 2003 đến năm 2013 (Cục Thú y, 2014). Dựa trên phân tích cây

phả hệ theo gien HA, chúng tôi ghi nhận 3 chủng thuộc clade 1.1.2 được phát hiện

trong nghiên cứu giai đoạn 2013-2015 đều ở trên gà: chủng A/Ga/TienGiang/2013,

A/Ga/TayNinh/2014, A/Ga/LongAn/2014. Điều đáng lưu ý là 3 chủng này nằm

cùng một nhóm với chủng A/Cambodia/V0219301/2011, cũng thuộc clade 1.1.2,

phân lập ở Campuchia năm 2011, thời điểm phân lập chủng này xảy ra trước thời

điểm phát hiện 3 chủng vi-rút Cúm gia cầm của đề tài, năm 2013. Như vậy, có thể

thấy nguy cơ lây truyền xuyên biên giới của các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

thuộc clade 1.1.2.

3.2.1.2 Phân tích trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA thành HA1 và

HA2

Dựa theo kết quả phân tích trình tự axít amin tại vị trí cắt của protein HA (HA1

- HA2) của các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 được trình bày trong bảng 3.8 có

thể thấy sự khác biệt rõ ràng về trình tự axít amin tại vị trí cắt của gien HA giữa 2

chủng vi-rút Cúm gia cầm được sử dụng để công cường độc với 2 chủng vi-rút vắc-

xin. Hai chủng vi-rút cúm được sử dụng để công cường độc đều có 4 - 5 axít amin

kiềm lặp lại, A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 (PQRERRRKRG) và

A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 (PQRERRRKGG) tại vị trí cắt của

HA, trong khi đó tại vị trí cắt của gien HA của 2 chủng vi-rút vắc-xin đều không có

trình tự axít amin kiềm lặp lại, (PQGETX--) với chủng

A/reassortant/USCDC_RG30, và (PQRETX--) với chủng A/reassortant/NIBRG-14.

Trong nghiên cứu của Creanga và ctv (2013), điểm phân cắt giữa HA1/HA2

của các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1c ở Việt Nam

theo motif QRERRRKR↓G, còn đa số các chủng thuộc clade 2.3.2.1b theo motif

QIERRRRKR↓G. Dựa trên kết quả phân tích 26 chủng vi-rút trong nghiên cứu

(Bảng 3.8) cho thấy, trừ các chủng thuộc clade 1.1.2 (A/Ga/TienGiang/2013,

A/Ga/LongAn/2014, A/Ga/TayNinh/2014) có trình tự axít amin kiềm lặp lại tại vị

trí cắt của HA là --RRKKR--, 23 chủng còn lại, kể cả chủng A/Vit/TayNinh/2013

thuộc clade 2.3.2.1a có trình tự axít amin kiềm lặp lại tại vị trí cắt của HA là --

RRRKR--.

Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng

(2008) và sự phân loại của OIE (2020), tuy có sự biến đổi di truyền, thay đổi trình

tự nucleotide của gien HA và axít amin của protein HA ở các chủng vi-rút Cúm gia

cầm độc lực cao, nhưng dường như sự biến đổi này chỉ liên quan đến đặc tính kháng

nguyên, dấu hiệu nhận diện, tương tác miễn dịch của HA với hàng rào bảo vệ của

vật chủ hơn là biến đổi liên quan trực tiếp đến độc lực của vi-rút Cúm gia cầm độc

lực cao. Tất cả 26 chủng vi-rút Cúm gia cầm trong nghiên cứu đều là những chủng

độc lực cao.

Bảng 3.8. Trình tự axít amin tại vị trí cắt gien HA (HA1 - HA2) của các chủng vi-

rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong đề tài

Phân nhánh STT Chủng H5N1/VN Ghi chú Vị trí cắt (Cleavage site)

2.3.2.1c 1 Công độc PQRERRRKRG

2.3.2.1c 2 Công độc PQRERRRKGG A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD- 17A261/2017 2.3.2.1a 3 A/reassortant/USCDC_RG30 Vắc-xin PQGETRG

1 4 A/reassortant/NIBRG-14 Vắc-xin PQRETRG

2.3.2.1c 5 A/ChimTri/TienGiang/2013 * PQRERRRKRG

2.3.2.1c 6 A/ChimCut/TienGiang/2013 * PQRERRRKRG

Phân nhánh STT Chủng H5N1/VN Ghi chú Vị trí cắt (Cleavage site)

2.3.2.1a * PQRERRRKRG 7 A/Vit/TayNinh/2013

1.1.2 * PQREERRKKRG 8 A/Ga/TienGiang/2013

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 9 A/Vit/TPHCM-XTT/2013

1.1.2 * PQREERRKKRG 10 A/Ga/LongAn/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 11 A/ChimCut/TienGiang/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 12 A/Vit/TayNinh/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 13 A/Ga/TienGiang/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 14 A/Ga/TPHCM-LongBinh- Quan9/2014 2.3.2.1c * PQRERRRKRG 15 A/Vit/BinhDuong/2014

1.1.2 * PQREERRKKRG 16 A/Ga/TayNinh/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 17 A/Ga/DongNai/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 18 A/Vit/TienGiang/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 19 A/Vit/LongAn/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 20 A/Ga/BenTre/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 21 A/Ga/TPHCM-XTT-HM/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 22 A/Ga/BR-VT/2014

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 23 A/Vit/TPHCM-LongBinh- Quan9/2015 2.3.2.1c * PQRERRRKRG 24 A/Vit/LongAn/2015

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 25 A/Ga/TienGiang/2015

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 26 A/Ga/HoChiMinh/2015

2.3.2.1c * PQRERRRKRG 27 A/ChimCut/DongNai/2015

Phân nhánh STT Chủng H5N1/VN Ghi chú Vị trí cắt (Cleavage site)

2.3.2.1c 28 A/Ga/LongAn/2015 * PQRERRRKRG

2.3.2.1c 29 A/ChimCut/TienGiang/2015 * PQRERRRKRG

(*): các chủng vi-rút cúm gia cầm A/H5N1 trong đề tài

2.3.2.1c 30 A/Vit/BenTre/2015 * PQRERRRKRG

3.2.2. Kết quả phân tích mức độ tương đồng với chủng tham chiếu

Phân tích sự tương đồng di truyền dựa trên gien HA cho thấy (Bảng 3.8,), 26

chủng vi-rút Cúm gia cầm trong nghiên cứu có sự khác biệt di truyền tương đối

thấp, trong khoảng 0,7 - 10,7%. Sự khác biệt di truyền lớn nhất (10,3 - 10,7%) là

giữa các chủng vi-rút thuộc clade 1.1.2 với các chủng còn lại trong nghiên cứu

thuộc clade 2.3.2.1c (22 chủng) và 2.3.2.1a (1 chủng). Trong khi đó, sự khác biệt

nucleotide của 26 chủng AIV trong nghiên cứu với các chủng tham khảo từ 0,6 -

12,0%. Mặt khác, khi so sánh trình tự nucleotide gien HA của 26 chủng AIV trong

nghiên cứu, thu thập được từ 2013 - 2015, với 2 chủng AIV của Việt Nam thuộc

clade 2.3.2.1c mới công bố năm 2019, kết quả ghi nhận sự khác biệt ở mức thấp,

trong khoảng 2,7 - 3,9%.

Điều đáng lưu ý khác là 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c cùng được sắp xếp

chung một nhóm, và có mối quan hệ gần gũi với chủng A/HongKong/6841/2010 -

gây bệnh trên người năm 2010 tại Hồng Kông, với tỷ lệ sai khác nucleotide từ 2,9%

đến 3,4%. Tỉ lệ này không khác biệt nhiều so với kết quả nghiên cứu của Tiền Ngọc

Tiên và Lý Thị Liên Khai (2017), có tỉ lệ khác biệt về trình tự nucleotide giữa các

chủng từ các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và chủng A/HongKong/6841/2010

thấp nhất là 2,4% và cao nhất là 3,2%.

Khi so sánh sự tương đồng di truyền giữa 26 chủng vi-rút trong nghiên cứu

với 2 chủng vi-rút dùng công cường độc A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 và

A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017, cùng thuộc clade 2.3.2.1c (Hình

3.1), dựa trên gien HA, nghiên cứu ghi nhận sự tương đồng cao, ở mức 89,3% đến

98,9%. Sự khác biệt lớn về trình tự nucleotide chủ yếu liên quan đến 3 chủng vi-rút

Cúm A/H5N1 thuộc clade 1.1.2 (10,3 - 10,7%). Với 22 chủng cùng thuộc clade

2.3.2.1c, tỷ lệ tương đồng nucleotide giữa 2 chủng vi-rút công cường độc

A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 và A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-

17A261/2017 và thực địa ở mức rất cao, trong khoảng 96,1 - 99,1%.

Tuy nhiên, phân tích di truyền và xây dựng cây sinh dòng cho thấy 2 chủng vi-

rút dùng sản xuất vắc-xin Navet-Fluvac 2 không nằm cùng clade với các chủng vi-

rút Cúm A/H5N1 trong nghiên cứu. Chủng AIV vắc-xin

A/reassortant/USCDC_RG30 thuộc clade 2.3.2.1a, chủng AIV vắc-xin

A/reassortant/NIBRG-14 thuộc clade 1.

Các chủng thuộc clade 1.1.2 chỉ tương đồng di truyền ở mức 89,7 - 89,8% với

chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30, nhưng tương đồng cao hơn với

chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 ở mức 93,3 - 93,4%. Điều này cũng dễ

hiểu vì chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30 thuộc clade 2.3.2.1a, còn

chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 thuộc clade 1.

Nhìn chung, dựa trên gien HA, chủng AIV vắc-xin

A/reassortant/USCDC_RG30 tương đồng di truyền cao, từ 95,0 - 96,0%, với phần

lớn (22/26) các chủng thực địa trong nghiên cứu thuộc clade 2.3.2.1c. Trong khi đó

tỷ lệ này dao động trong khoảng 91,3 - 92,2% giữa chủng AIV vắc-xin

A/reassortant/NIBRG-14 và các chủng thực địa trong nghiên cứu (22/26) thuộc

clade 2.3.2.1c.

Mặt khác khi so sánh tương đồng về trình tự axít amin của protein HA giữa 2

chủng vi-rút dùng sản xuất vắc-xin Navet-Fluvac 2 với các chủng vi-rút trong

nghiên cứu (Bảng 3.8), đề tài ghi nhận tỷ lệ tương đồng khá cao ở chủng vắc-xin

A/reassortant/USCDC_RG30 với các chủng thực địa thuộc clade 2.3.2.1c (22

chủng) và 2.3.2.1a (01 chủng), ở mức 91,9 - 97,5%. Trong khi đó, tỷ lệ tương đồng

này đạt thấp hơn một chút ở chủng vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14, chỉ dao động

trong khoảng 92,1 - 96,6%.

Sự khác biệt về tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa 2 chủng vắc-

xin và các chủng vi-rút cúm thực địa, có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của việc

tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên thực tế, tuỳ theo loại vắc-xin sử

dụng và đối tượng được tiêm vắc-xin.

Khả năng bảo hộ của vắc-xin Cúm gia cầm có khác biệt giữa các chủng vi-rút

Cúm gia cầm với đặc điểm di truyền khác nhau. Hiệu quả bảo hộ cao hơn khi chủng

vi-rút vắc-xin tương đồng di truyền cao với chủng vi-rút công cường độc hoặc thực

địa. Criado và ctv. (2020) ghi nhận tỷ lệ sống sót thấp (0 đến 40%) ở gà sau tiêm

vắc-xin Cúm gia cầm, bị công cường độc bởi chủng vi-rút cúm có độ tương đồng di

truyền không cao, 87,2% đến 96,3%. Tuy nhiên tác giả cũng cho rằng, không có

mối liên quan rõ ràng giữa sự khác biệt di truyền và miễn dịch bảo hộ, vì có thể còn

tuỳ vào vị trí khác biệt và sự khác biệt của các axít amin trên protein HA. Nhiều tác

giả cũng cho rằng, việc phân tích di truyền dựa trên nucleotide chưa đủ cơ sở chắc

chắn để dự đoán về hiệu quả miễn dịch bảo hộ Cúm gia cầm ở gà (Abbas và ctv.,

2011; Spackman và ctv., 2014; Wang và ctv., 2016) và ở vịt (Van der Goot, 2008).

Vắc-xin Cúm gia cầm có kháng nguyên tương đồng cao với chủng vi-rút công

cường độc sẽ tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn với hiệu giá kháng thể HI ở mức 7,2

log2 - 8,5log2 và hiệu quả bảo hộ cao hơn rõ (100 % gà sống sau công độc), so với

chủng vi-rút công cường độc có độ tương đồng thấp với hiệu giá kháng thể HI ở

mức 2,3log2 - 3,4log2 và 62,5 - 80% gà sống sau công cường độc (Kang và ctv.,

2020).

Nghiên cứu của Criado và ctv. (2020) cho thấy, sự tương đồng trình tự axít

amin của giữa các chủng vi-rút vắc-xin và vi-rút công cường độc không thể làm cơ

sở dự đoán cho hiệu quả bảo hộ của vắc-xin. Sự khác biệt về hiệu quả miễn dịch

giữa các vắc-xin Cúm gia cầm đối với các chủng công cường độc vi-rút Cúm gia

cầm độc lực cao chủ yếu liên quan đến sự biến đổi các trình diện kháng nguyên ở 5

vùng kháng nguyên A, B, C, D và E của protein HA ở vi-rút Cúm gia cầm thực địa.

Tuy nhiên, vài nghiên cứu khác lại ghi nhận mức tương đồng axít amin của

HA1 giữa chủng vi-rút vắc-xin Cúm gia cầm và chủng công cường độc vi-rút Cúm

gia cầm độc lực cao có liên quan đến hiệu quả làm giảm sự bài thải chủng vi-rút

công cường độc qua dịch hầu họng (Swayne và ctv., 2000), khí quản (Lee và ctv.,

2004), qua phân (Swayne, 1999), hay ngăn chặn hoàn toàn sự lây truyền chủng vi-

rút công cường độc ở gà, cũng như ở vịt (Van der Goot và ctv., 2008, Swayne,

1999).

3.2.3. Kết quả xây dựng cây phả hệ

Đề tài tiến hành giải trình trình tự gien HA (H5) và dựa trên gien này phân tích

cây sinh dòng của các phân lập vi-rút Cúm H5N1 so với các chủng vi-rút Cúm

A/H5N1 trong vắc-xin, các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 sử dụng công cường độc và

so với các chủng rút Cúm A/H5N1 tham khảo trên thế giới.

Trong số 51 chủng vi-rút Cúm A/H5N1, 26 chủng được chọn ngẫu nhiên trong

giai đoạn 2013 - 2015 (số thứ tự 5 đến 30, Bảng 3.8), để phân tích trình tự gien HA

của các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 lưu hành tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

vùng Đông Tây Nam Bộ giai đoạn 2013 - 2015, xây dựng cây sinh dòng với các

chủng tham khảo. Các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tham khảo được phân lập

từ nhiều nguồn vật chủ khác nhau (người, gà, vịt, ngỗng,…) tại Việt Nam, Trung

Quốc, Lào, Hồng Kông, Campuchia,… đã được công bố trên Ngân hàng gien, trong

đó có 2 chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 mới nhất tại Việt Nam, thuộc clade

2.3.2.1c, được công bố trên Ngân hàng gien vào năm 2019: Chủng

A/duck/Vietnam/HU12-1542/2019 (MT200019) và A/duck/Vietnam/HU12-

1572/2019 (MT200027).

Hình 3.12. Cây di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gien HA của các chủng

AIV (Giá trị Bootstrap 1000 lần lặp lại)

Hình 3.13. Sự khác biệt trình tự gien của vi-rút Cúm A/H5N1

3.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm

gia cầm type A/H5N1, clade 2.3.2.1.

3.3.1 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2

Theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8685-9:2014 “Quy trình kiểm nghiệm vắc -

xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1”, để đánh giá tính an toàn của vắc-

xin Cúm gia cầm trên gà phải tiêm vắc-xin cho 10 con gà từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi

con 2 liều vắc-xin ghi trên nhãn. Đối với vịt phải tiêm cho 10 con vịt từ 2 đến 3 tuần

tuổi, mỗi con 2 liều vắc-xin ghi trên nhãn, theo dõi động vật thí nghiệm trong 14

ngày. Nghiên cứu đã đánh giá tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà, vịt

và vịt trời.

Vắc-xin được coi là an toàn nếu tất cả gà, vịt sống khỏe mạnh, phát triển bình

thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân.

Chỉ tiêu tính an toàn của vắc-xin là một trong những chỉ tiêu quan trọng được

quan tâm đầu tiên khi nghiên cứu phát triển mới một loại vắc-xin tiêm phòng cho

gia súc, gia cầm. Tính an toàn của vắc-xin cũng là một tiêu chí quan trọng phải đạt

trong quá trình kiểm nghiệm.

3.3.1.1. Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà

Liều tiêm

Số gà mổ khám

Số lượng gà thí nghiệm

Phản ứng cục bộ vị trí tiêm

Bệnh tích đại thể vị trí tiêm

Trọng lượng 10 con gà trước khi tiêm (kg)

Trọng lượng 10 con gà ở 3 tuần sau tiêm (kg)

Tăng trọng trung bình của gà sau 3 tuần (g/ con)

1 ml

100 con

3,25

5,7

245±138

10 con

Không sưng

Không có bệnh tích,

0,5 ml 100 con

2,85

4,5

165±100

10 con

Không sưng

Không có bệnh tích,

50 con

3,25

4,7

145±89,6

Không tiêm

10 con

Không sưng

Không có bệnh tích

P>0,05

Quan sát sự tồn lưu của vắc-xin tại vị trí tiêm ghi nhận, ở gà được tiêm liều 1

ml/con, chỉ có một lượng rất nhỏ (vết) trên mô tại vị trí tiêm vắc-xin, nhưng đối với

gà được tiêm liều 0,5 ml/con không phát hiện sự tồn lưu của vắc-xin. Thí nghiệm

cho thấy, tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà ở cả 2 liều tiêm, liều chỉ định (0,5 ml)

và liều gấp đôi liều chỉ định (1 ml) đều không ảnh hưởng xấu đến sự tăng trọng của

gà được tiêm vắc-xin trong 3 tuần theo dõi. Tăng trọng trung bình của 10 con gà mổ

khám ở cả 2 lô gà được tiêm vắc-xin đều cao hơn so với lô gà không được tiêm vắc-

xin. Ở lô gà được tiêm 1 ml vắc-xin Navet-Fluvac 2 tăng trọng bình quân là 245

g/gà, lô gà được tiêm 0,5 ml vắc-xin Navet-Fluvac 2 tăng trọng bình quân là 165

g/gà, cao hơn nhiều so với lô đối chứng không tiêm là 145 g/gà. Tuy nhiên, tăng

trọng bình quân của đàn gà thí nghiệm và lô đối chứng không có sự khác biệt có ý

nghĩa về mặt thống kê với P>0,05.

Qua kết quả nghiên cứu cho thấy vắc-xin Navet-Fluvac 2 an toàn trên gà,

không ảnh hưởng đến tăng trưởng của gà được tiêm vắc-xin ngay cả khi được tiêm

với liều gấp 2 lần so với liều chỉ định.

3.3.1.2 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

Liều tiêm

Số vịt mổ khám

Số lượng vịt thí nghiệm

Phản ứng cục bộ vị trí tiêm

Bệnh tích đại thể vị trí tiêm

Trọng lượng 10 vịt trước khi tiêm (kg)

Trọng lượng 10 vịt ở 3 tuần sau tiêm (kg)

Tăng trọng trung bình/ vịt trong 21 ngày sau tiêm (g)

1 ml

50 con

10 con

3,85

9,0

515±181

Không sưng

Không có bệnh tích,

0,5 ml

185 con

10 con

4,15

8,80

465±129

Không sưng

Không có bệnh tích,

50 con

10 con

3,10

8,60

550±168

Không tiêm

Không sưng

Không có bệnh tích

P>0,05

Kết quả theo dõi đàn vịt lô thí nghiệm và lô đối chứng trong 3 tuần đều không

ghi nhận biểu hiện bất thường: đàn vịt ăn uống, vận động và phát triển bình thường,

không phát hiện dấu hiệu sưng tại vị trí tiêm vắc-xin, không có dấu hiệu khó khăn

khi lấy thức ăn, lông tại vị trí tiêm mượt bình thường. Kết quả mổ khám ngẫu nhiên

10 con vịt ở lô thí nghiệm tiêm liều chỉ định (0,5ml) ghi nhận tại vị trí tiêm không

phát hiện tồn lưu của vắc-xin, đối với lô thí nghiệm tiêm gấp đôi liều chỉ định (1

ml) ghi nhận tại vị trí tiêm chỉ còn vài hạt lấm tấm của vắc-xin.

Kết quả so sánh tăng trọng bình quân/ vịt của 10 con vịt được chọn ngẫu nhiên

từ mỗi lô thí nghiệm và lô đối chứng cho thấy, tăng trọng của vịt ở 2 lô tiêm vắc-xin

1 ml/vịt và 0,5 ml/vịt đều thấp hơn so với của vịt ở lô đối chứng, tương ứng là 515

g/vịt và 465 g/vịt so với 550 g/vịt, tuy nhiên, sự khác biệt này không có có ý nghĩa

về mặt thống kê. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy vắc-xin Navet-Fluvac 2 an toàn

trên vịt, ngay cả khi được tiêm với liều gấp 2 lần so với liều chỉ định.

3.3.1.3 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời

Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời

Liều tiêm Kết quả theo dõi Kết luận Nhóm TN Số lượng vịt (con)

20 1 ml/ con Đạt tính an toàn 1 Đàn vịt trời ăn uống bình thường; vị trí tiêm không sưng hoặc có các biểu hiện bất thường

60 0,3 ml/ con Đạt tính an toàn 2 Đàn vịt trời ăn uống bình thường; vị trí tiêm không sưng hoặc có các biểu hiện bất thường

20 Không tiêm vắc-xin Đàn vịt trời ăn uống bình thường; khỏe mạnh Không có nhiễm bệnh tự nhiên 3

Kết quả thí nghiệm kiểm tra mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên

đàn vịt trời được trình bày qua Bảng 3.11. Sau khi tiêm phòng 3 tuần, với liều 0,3

ml/vịt và 1 ml/vịt, đàn vịt trời ở lô thí nghiệm và lô đối chứng đều không ghi nhận

biểu hiện bất thường: đàn vịt trời ăn uống, vận động và phát triển bình thường,

không phát hiện dấu hiệu sưng tại vị trí tiêm vắc-xin.

Hình 3.14. Tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 cho đàn vịt thí nghiệm

Hình 3.15. Đàn vịt trời lô thí nghiệm và lô đối chứng vận động, ăn uống bình

thường sau tiêm phòng

Hình 3.16. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin tại vị trí tiêm trên gà được

tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, liều 0,5ml/con sau 3 tuần

Hình 3.17. Mổ khám ghi nhận còn vài hạt lấm tấm vắc-xin tại vị trí tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 trên gà, liều 1ml/con sau 3 tuần

Hình 3.18. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin trên vịt tại vị trí tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 tiêm phòng liều 0,5ml/con sau 3 tuần

Hình 3.19. Mổ khám ghi nhận vài chấm nhỏ lấm tấm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên

vịt tiêm phòng liều 1ml/con sau 3 tuần

3.3.2. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên gà

Theo tiêu chuẩn Việt Nam, để đánh giá khả năng bảo hộ của một vắc-xin Cúm

gia cầm cần thực hiện bằng phương pháp trọng tài hoặc phương pháp thay thế.

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, việc đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin

Navet-Fluvac 2 được thực hiện bằng cả 2 phương pháp: kiểm tra đáp ứng hiệu giá

kháng thể HI ở gia cầm sau khi tiêm phòng với ngưỡng hiệu giá HI được cho là đạt

yêu cầu khi có giá trị GMT ≥4log2 (TCVN 8685-9:2014) và phương pháp công

cường độc với các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1 lưu hành

chủ yếu tại khu vực phía Nam trong thời gian nghiên cứu.

3.3.2.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trên gà

Kết quả kiểm tra kháng thể mẹ truyền trên đàn gà lô thí nghiệm và lô đối

chứng trước khi tiêm phòng và kháng thể đáp ứng sau tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fluvac 2 được xác định bằng kỹ thuật HI, kết quả được trình bày qua Bảng 3.12.

Bảng 3.12. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng trên gà theo quy trình

tiêm 1 mũi và 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2

GMT (log2)

Lô thí nghiệm

Số gà thí nghiệm

Thời gian lấy mẫu

Số lượng mẫu

100

Số mẫu dương tính - 27

7,0 ±2,2 90%(+)

- 18

Lô TN 1 (Tiêm 1 mũi vắc - xin) Lô TN 2 (Tiêm 2 mũi vắc - xin cách nhau 14 ngày)

4,8 ± 2,6a 60%(+) 7,2 ± 1,8b 90% (+)

Đối chứng

Trước tiêm vắc-xin 3 tuần sau mũi 1 Trước tiêm vắc-xin 2 tuần sau mũi 1 3 tuần sau mũi 2 Trước và sau 3 tuần tiêm vắc-xin

Ghi chú: Trong cùng một cột, số liệu mang chữ cái khác nhau có sai khác thống kê

(P<0,05).

Theo Shaimaa Talat và ctv.(2020); De Vriese và ctv.(2010); Kim và ctv.

(2010), kháng thể mẹ truyền đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm (H5N1) có tác động

ức chế rõ đáp ứng tạo kháng thể ở gà khi được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm. Vì thế,

đàn gà thí nghiệm trước khi được tiêm vắc-xin đều được kiểm tra kháng thể mẹ

truyền để bố trí tiêm vắc-xin, tránh ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền lên đáp ứng

miễn dịch sau tiêm vắc-xin Cúm gia cầm A/H5N1 trên gà thí nghiệm. Kết quả qua

Bảng 3.12 ghi nhận, gà được đưa vào bố trí thí nghiệm có hiệu giá kháng thể HI với

vi-rút Cúm A/H5N1 ở mức âm tính, với điều kiện này, tác động của miễn dịch mẹ

truyền ở gà con đối với đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2

được hạn chế đến mức thấp nhất.

Đối với liệu trình tiêm phòng 1 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, ở thời điểm 3

tuần sau tiêm vắc-xin, kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với vi-rút

Cúm gia cầm A/H5N1 ghi nhận, có 27/30 mẫu phát hiện kháng thể, chiếm tỷ lệ

90%, với GMT là 7,0 log2.

Đối với liệu trình tiêm phòng lặp lại 2 mũi vắc-xin cách nhau 2 tuần, kết quả

kiểm tra hiệu giá kháng thể HI thời điểm 2 tuần sau tiêm phòng mũi 1 cho thấy, số

lượng gà có đáp ứng kháng thể là 18/30 mẫu, chiếm tỷ lệ 60%, với GMT trung bình

là 4,8log2. Ở thời điểm 3 tuần sau tiêm vắc-xin Navet–Fluvac 2 mũi thứ 2, kết quả

kiểm tra hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ghi nhận,

có 27/30 mẫu phát hiện kháng thể, chiếm tỷ lệ 90%, với GMT là 7,2 log2. So sánh

tỷ lệ gà có đáp ứng kháng thể và hiệu giá kháng thể HI ở gà thí nghiệm tại thời điểm

2 tuần sau tiêm phòng mũi 1 và 3 tuần sau tiêm phòng mũi 2 vắc-xin Navet-Fluvac

2 cho thấy có sự khác biệt thống kê với P<0,01.

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 tạo đáp ứng miễn dịch khá sớm, ở thời điểm 2 tuần

sau tiêm phòng 1 mũi vắc-xin, 60% gà được tiêm có kháng thể đạt mức bảo hộ và

mức GMT 4,8log2, điều này có ý nghĩa quan trọng khi cần thiết phải sử dụng vắc-

xin để tiêm phòng bao vây, khống chế ổ dịch Cúm gia cầm. Ở thời điểm 3 tuần sau

tiêm mũi 1, tỷ lệ gia cầm đạt kháng thể bảo hộ và hiệu giá kháng thể HI ở gà được

tiêm vắc-xin cao hơn so với ở thời điểm 2 tuần sau sau tiêm vắc-xin mũi 1 ở thí

nghiệm 1, tương ứng là 90% so với 60% và 7,2log2 so với 4,8log2. Có thể là ở 2

tuần sau tiêm vắc-xin, đáp ứng tạo kháng thể của gia cầm chưa đạt mức cao nhất.

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Guobin và ctv. (2005); Mustafa và ctv.

(2018); hiệu giá kháng thể HI ở gà tăng dần và đạt đỉnh ở thời điểm 6 - 7 tuần sau

khi tiêm vắc-xin Cúm gia cầm. Từ kết quả này cho thấy, để đánh giá hiệu quả bảo

hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 cần thực hiện lấy mẫu sớm nhất ở thời điểm 3 tuần

sau tiêm phòng, khi đó đáp ứng miễn dịch trên đàn gà đã ổn định. Điều này cũng

phù hợp theo khuyến cáo của Shaimaa và ctv. (2020); De Vriese và ctv. (2010).

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI ở thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng vắc-

xin Navet-Fluvac 2 mũi 2 cho thấy, số lượng gà có đáp ứng kháng thể là 27/30,

chiếm tỷ lệ 90%, với GMT trung bình là 7,2log2. So sánh hiệu giá kháng thể HI ở

thời điểm 3 tuần sau khi tiêm phòng trong quy trình tiêm 1 mũi vắc-xin (7log2) và 3

tuần sau khi tiêm mũi 2 trong trong quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin (7,2log2) trên đàn

gà thí nghiệm ghi nhận sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P>0,05. Điều

này có thể khẳng định, tiêm 1 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên đàn gà ở thời điểm 2

tuần tuổi, âm tính với kháng thể đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 mẹ

truyền, hiệu giá kháng thể HI ở 3 tuần sau tiêm vắc-xin mũi 1 (gà đạt 5 tuần tuổi)

tương đương với hiệu giá kháng thể HI ở gà 3 tuần sau tiêm mũi 2 trong quy trình

tiêm 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, với mũi tiêm thứ nhất cũng ở 2 tuần tuổi.

Hiệu giá kháng thể HI trung bình ở gà tại thời điểm 3 tuần sau tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 trong thí nghiệm 1 tương đương khi so sánh với hiệu giá kháng thể

HI cùng thời điểm khi tiêm phòng bằng vắc-xin Cúm A/H5N1, sản xuất từ chủng

A/Chicken/Korea/ES/2003 (H5N1), do Lee và ctv. (2013) công bố với mức trung

bình là 7,5log2; hay trong nghiên cứu của Jang và ctv. (2017), gà 3 tuần tuổi tiêm

phòng vắc-xin di truyền ngược (từ chủng K10-483), 4 tuần sau tiêm vắc-xin có đáp

ứng miễn dịch với hiệu giá HI trung bình là 6log2; phù hợp với nghiên cứu của

Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv. (2020), hiệu giá kháng thể HI trung bình trên gà tiêm

vắc-xin tái tổ hợp từ chủng rg-A/H5N1 clade 1.1 với quy trình tiêm 1 liều, sau 4

tuần là 6,05log2 và tiêm 2 liều là 6,3log2.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trung bình sau 3 tuần tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2 trên gà trong thí nghiệm tương đương với kết quả kiểm nghiệm 55

lô vắc-xin Re-1 nhập khẩu của Trung Quốc trong 2 năm 2006 - 2007, với hiệu giá

kháng thể HI trung bình trên gà từ 6log2 - 8log2 (Vũ Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2008).

Từ các kết quả trên có thể khẳng định, vắc-xin Navet-Fluvac 2 có thể sử dụng

để tiêm phòng Cúm gia cầm với liệu trình tiêm 1 mũi, lúc 14 ngày tuổi trên đàn gà

nuôi thịt như các giống gà trắng và gà Tam hoàng (xuất chuồng khoảng 42 - 48

ngày), không nhất thiết phải tái chủng sau 2 tuần. Đối với gà nuôi lấy trứng, gà ta

nuôi lấy thịt, gà giống có thời gian xuất chuồng dài hơn, có thể áp dụng quy trình

tiêm phòng 2 mũi tiêm cách nhau 2 tuần.

Việc kiểm tra huyết thanh gà đối chứng đều cho kết quả âm tính với kháng thể

đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, cho phép khẳng định đàn gà thí nghiệm

được nuôi trong điều kiện cách ly tốt, không tiếp xúc với mầm bệnh và đáp ứng

kháng thể chính là do tiêm phòng vắc-xin.

3.3.2.2 Kết quả thí nghiệm công cường độc trên gà

Để đánh giá hiệu lực của vắc-xin Navet-Fluvac 2 bằng phương pháp công

cường độc, chọn ngẫu nhiên 15 gà cho mỗi lô thí nghiệm (tiêm phòng quy trình 1

mũi tiêm hoặc 2 mũi tiêm), lô đối chứng chọn 5 con gà chưa được tiêm phòng.

Thời điểm công cường độc là sau 3 tuần kể từ khi gà được tiêm phòng mũi thứ

1 (lô thí nghiệm 1, 2 và 3), 3 tuần sau khi tiêm mũi 2 (lô thí nghiệm 4).

Gà thí nghiệm và đối chứng được lấy mẫu kiểm tra trước khi công cường độc

và 10 ngày sau khi công cường độc, đối với lô đối chứng lấy mẫu khi gà chết. Kết

quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 3.13.

Kết quả kiểm tra ghi nhận, hiệu giá kháng thể HI tại thời điểm 3 tuần sau tiêm

phòng vắc-xin Navet- Fluvac 2, trước khi công cường độc, giữa các lô gà thí

nghiệm tương đối đồng đều, bình quân từ 6,5log2 - 7.5log2 và không có sự khác

biệt có ý nghĩa về thống kê, với P>0,05. Tại thời điểm 10 ngày sau khi công cường

độc, ở tất cả các lô thí nghiệm, gà còn sống đều có hiệu giá kháng thể HI tăng, ở

mức dao động 6,7log2 - 8,1log2. So sánh hiệu giá kháng thể HI trước và 10 ngày

sau khi công cường độc không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, với

P>0,05.

100

Bảng 3.13. Kết quả công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-

xin Navet-Fluvac 2

Kết quả HI (GMT log2)

Kết quả công độc

Lô thí nghiệm

Số lượng (con)

Liều và số lần tiêm

Clade vi- rút Cúm công độc

Bảo hộ (%)

Sống/ tổng số

Trước công độc

Sau công độc

Lô thí nghiệm 1

7,5 ±2,2 8,0 ±1,6

15/15

100

0,5 ml/ 1 lần

2.3.2.1a

Đối chứng 1

0/5

Lô thí nghiệm 2

6,5±1,3 6,7 ±1,3

14/15

93,33

0,5 ml/ 1 lần

2.3.2.1 b

Đối chứng 2

0/5

Lô thí nghiệm 3

7,5 ±1,2 7,9 ±0,9

15/15

100

0,5 ml/ 1 lần

2.3.2.1c

Đối chứng 3

0/5

Lô thí nghiệm 4

7,3 ±1,1 8,1 ±0,9

15/15

100

0,5 ml/ 2 lần

2.3.2.1c

Đối chứng4

0/5

Sau khi công cường độc từ ngày thứ 2, đàn gà lô đối chứng có dấu hiệu điển

hình của bệnh Cúm gia cầm với các biểu hiện: Bỏ ăn, ủ rũ, mồng, tích tím tái, xuất

huyết chân và chết vào ngày thứ ba sau khi công cường độc. Trong khi các lô gà

được tiêm phòng vẫn ăn uống, vận động bình thường.

Thực hiện công cường độc trên gà được tiêm phòng 1 mũi vắc-xin Navet-

Fluvac 2 với các biến chủng vi-rút Cúm A/H5N1 khác nhau thuộc các clade

2.3.2.1a; 2.3.2.1b; 2.3.2.1c, kết quả ghi nhận tỷ lệ bảo hộ của 3 lô thí nghiệm tương

ứng với các clade là 100%, 93,33% và 100%. Đối với lô thí nghiệm 4, gà được tiêm

phòng 2 mũi vắc-xin lặp lại sau 2 tuần, tỷ lệ bảo hộ với vi-rút Cúm gia cầm clade

2.3.2.1c là 100%.

101

Kết quả bảo hộ trên gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fuvac 2 khi công độc

với các biến chủng vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1 ghi nhận được trong

nghiên cứu này tốt hơn so với gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Vifluvac với

kháng nguyên NIBGG-14. Tỷ lệ bảo hộ trên gà được tiêm 1 liều vắc-xin Navet-

Vifluvac là 80% đối với clade 1, 80% đối với clade 2.3.2.1a; không bảo hộ với

clade 2.3.2.1b. Trên gà được tiêm phòng 2 liều vắc-xin Navet-Vifluvac lặp lại sau 2

tuần, tỷ lệ bảo hộ đạt 80% đối với clade 1, 100% đối với clade 2.3.2.1a, 10% đối

với clade 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và ctv., 2012).

So sánh với khả năng bảo hộ của các loại vắc-xin Cúm gia cầm nhập khẩu từ

Trung Quốc như vắc-xin di truyền ngược vô hoạt dạng nhũ dầu Re-1, sử dụng

chủng vi-rút A/Goose/Guangdong/1/96 thuộc clade 1.2 và vắc-xin di truyền ngược

vô hoạt dạng nhũ dầu Re-5, sử dụng chủng vi-rút A/Duck/Anhui/2006, thuộc clade

2.3.4 trong nghiên cứu của (Nguyễn Văn Cảm, 2011), kết quả bảo hộ đối với vi-rút

Cúm gia cầm nhánh 2.3.2.1 của vắc-xin Navet-Fluvac 2 tốt hơn, đặc biệt là tỷ lệ bảo

hộ với vi-rút clade 2.3.2.1b đạt 90% trong khi vắc-xin Re-1 và Re-5 bảo hộ 50%.

Trong các nghiên cứu gần đây, khi thử thách công cường độc với các chủng

vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1c phân lập từ các ổ dịch trên gà tại

Đắc Lắc, 2013; Tiền Giang, 2017; Cần Thơ, 2017; Bắc Ninh, 2017, gà được tiêm

phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 vẫn cho kết quả bảo hộ 100% khi công cường độc.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với đánh giá của Criado và ctv.

(2020), hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Cúm gia cầm liên quan đến sự khác biệt giữa

chủng vi-rút được sử dụng làm kháng nguyên trong vắc-xin và chủng vi-rút được sử

dụng để công độc. Hiệu quả bảo hộ đạt mức 100% ở các trường hợp 2 chủng vi-rút

vắc-xin và công độc là một. Hiệu quả bảo hộ thay đổi ngay giữa các chủng trong

cùng một clade, phần lớn dao động trong khoảng từ 89 - 100% tuỳ theo sự khác biệt

di truyền giữa các chủng. Hiệu quả bảo hộ cao hơn khi chủng vi-rút vắc-xin tương

đồng di truyền cao với chủng vi-rút công độc hoặc thực địa. Tuy nhiên tác giả cũng

cho rằng, không có mối liên quan rõ ràng giữa sự khác biệt di truyền và miễn dịch

102

bảo hộ, vì có thể còn tuỳ vào vị trí khác biệt và sự khác biệt của các axít amin trên

protein HA.

Nhiều tác giả cũng cho rằng, việc phân tích di truyền dựa trên nucleotide chưa

đủ cơ sở chắc chắn để dự đoán về hiệu quả miễn dịch bảo hộ Cúm gia cầm ở gà

(Abbas và ctv., 2011; Spackman và ctv., 2014; Wang và ctv., 2016), và ở vịt (Van

der Goot, 2008).

Vắc-xin Cúm gia cầm có kháng nguyên tương đồng cao với chủng vi-rút công

độc sẽ tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn với hiệu giá kháng thể HI ở mức 7,2log2 -

8,5log2 và hiệu quả bảo hộ cao hơn rõ (100 % gà sống sau công độc), so với chủng

vi-rút công độc có độ tương đồng thấp với hiệu giá kháng thể HI ở mức 2,3log2 -

3,4 log2 và 62,5% - 80% gà sống sau công độc (Kang và ctv., 2020).

Căn cứ quy định của OIE (2018), vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên thực

địa cần đạt được các điều kiện sau đây:

(1) Thời điểm công độc đánh giá hiệu quả bảo hộ là ít nhất 3 tuần sau tiêm

vắc-xin;

(2) Chủng vi-rút Cúm gia cầm sử dụng để công độc phải gây chết ít nhất 90%

gia cầm không được tiêm vắc-xin;

(3) Liều công độc ở mức 106 liều trung bình gây chết phôi gà (EID50 - 50

percent Embryo Infectious Dose);

(4) Tỷ lệ bảo hộ ở gia cầm được tiêm vắc-xin khi bị công độc phải cao hơn

80%;

(5) Gia cầm được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm phải giảm bài thải vi-rút công

độc rõ rệt so với gia cầm không được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm qua xét nghiệm

dịch phết hầu họng hoặc hậu môn;

(6) Hiệu giá kháng thể HI tối thiểu phải đạt ở mức 5log2 ở gà tiêm thực địa và

7log2 ở gà khi công độc thí nghiệm

Căn cứ Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm

vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm, vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt yêu cầu về tính an

toàn và hiệu lực phòng bệnh trên gà đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1.

103

Hình 3.20. Trung tâm Nghiên cứu Thú y, an toàn sinh học cấp độ 3

Hình 3.21. Công cường độc trên gà bằng cách nhỏ mắt, nhỏ mũi

104

Hình 3.22. Lô gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 không có biểu hiện bất

thường sau công cường độc

Hình 3.23. Lô gà đối chứng được không tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 chết 3

ngày sau công cường độc

105

Hình 3.24. Bệnh tích xuất huyết bàn chân trên gà lô đối chứng khi công độc

Hình 3.25. Bệnh tích mồng, tích tím tái trên gà lô đối chứng khi công độc

106

3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên vịt

3.3.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trên vịt

Nhằm đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2

trên vịt, chúng tôi bố trí thí nghiệm với 2 liệu trình: liệu trình 1, đàn vịt được tiêm

phòng 1 mũi vắc-xin ở thời điểm 2 tuần tuổi; liệu trình 2, đàn vịt được tiêm phòng 2

mũi vắc-xin, liều tiêm 0,5ml/con; ở thời điểm đàn vịt đạt 2 tuần tuổi và tái chủng

sau 2 tuần tiêm mũi 1. Kết quả đánh giá đáp ứng kháng thể của vắc-xin Navet-

Fluvac 2 trên vịt được trình bày qua Bảng 3.14.

Bảng 3.14. Đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fluvac 2

GMT (log2)

Lô thí nghiệm

Số vịt thí nghiệm

Thời gian lấy mẫu

Số lượng mẫu xét nghiệm

Số mẫu dương tính -

135

Lô TN 1 (Tiêm 1 mũi vắc xin)

1,3 ±1,7a

Trước tiêm vắc-xin 3 tuần sau mũi 1 5 tuần sau mũi 1 Trước tiêm vắc-xin

2,9 ± 1,8b

3 tuần sau mũi 2

Lô TN 2 (Tiêm 2 mũi vắc xin cách nhau 14 ngày)

Đối chứng (Không tiêm)

Trước và sau 5 tuần tiêm vắc xin

4,5 ± 2,2a

Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc cùng một hàng, số liệu mang chữ cái khác nhau

có sai khác thống kê (P<0,05).

Kết quả kiểm tra kháng thể mẹ truyền trên đàn vịt lô thí nghiệm và lô đối

chứng trước khi tiêm phòng ghi nhận mức GMT âm tính.

Đối với liệu trình tiêm phòng 1 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, kết quả kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI tại thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng cho thấy, số lượng vịt có

đáp ứng kháng thể là thấp, chỉ có 13/35 mẫu phát hiện kháng thể, chiếm tỷ lệ

37,14%, với GMT trung bình là 1,3log2. Ở thời điểm 5 tuần sau tiêm vắc-xin mũi 1,

kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ghi nhận có sự cải thiện về miễn dịch với vi-rút

107

Cúm gia cầm A/H5N1, gia tăng tỷ lệ vịt dương tính, với 19/25 (76%) mẫu phát hiện

kháng thể, với GMT là 2,9log2. Mức hiệu giá kháng thể HI trung bình ở thời điểm 5

tuần sau khi tiêm vắc-xin mũi 1 thấp hơn so với yêu cầu của TCVN số 8685-9:2014

(4log2) trong quy trình kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm.

Điều này cho thấy, vắc-xin Navet-Fluvac 2 có thể không đạt hiệu quả trong tiêm

phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 theo quy trình 1 mũi tiêm lúc vịt 2 tuần tuổi.

Hiệu giá kháng thể HI sau khi tiêm phòng 1 mũi vắc-xin trên vịt thường đạt thấp,

điều này có thể do tính mẫn cảm của vịt với vi-rút Cúm gia cầm. So sánh hiệu giá

kháng thể HI ở thời điểm 3 tuần và 5 tuần sau khi tiêm vắc-xin mũi 1 có khác biệt

có ý nghĩa về thống kê với P<0,01.

Đáp ứng miễn dịch thường được cải thiện rõ rệt trong các quy trình có tiêm

nhắc vắc-xin. Dựa trên cơ sở này, nghiên cứu đã thực hiện đánh giá đáp ứng tạo

kháng thể ở vịt được tiêm phòng 2 mũi với vắc-xin Navet-Fluvac 2, mũi 1 lúc 2

tuần tuổi và mũi 2 được tiêm nhắc ở 2 tuần sau tiêm mũi 1. Kết quả kiểm tra hiệu

giá kháng thể HI thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng mũi 2 cho thấy, số lượng vịt có

đáp ứng kháng thể được cải thiện rõ rệt, với 22/25 vịt dương tính, chiếm tỷ lệ 88%,

với GMT trung bình là 4,5log2. So sánh hiệu giá kháng thể HI sau tiêm phòng vắc-

xin Navet-Fluvac 2 giữa 2 lô vịt thí nghiệm, ở thời điểm sau 5 tuần tiêm 1 mũi và 3

tuần sau khi tiêm mũi 2, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về thống kê với P<0,01.

Đáp ứng tạo kháng thể ở vịt đối với vi-rút Cúm gia cầm thường rất thấp so với

gà, tiêm nhắc vắc-xin mũi 2 ở vịt sẽ có tác dụng kích ứng, gia tăng tạo kháng thể ở

vịt và đảm bảo hiệu quả bảo hộ sau tiêm phòng trên vịt đối với vi-rút Cúm gia cầm

đã được đề cập trong nghiên cứu Swayne (1999); Van der Goot và ctv. (2008).

Hiệu giá kháng thể HI sau khi tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm trên vịt ở mức

thấp hơn so với gà, phù hợp với nghiên cứu của Van der Goot và ctv. (2008). Theo

Van der Goot và ctv. (2008), 1 tuần sau khi vịt được tiêm 1 liều vắc-xin Cúm gia

cầm H5N2, chỉ có 2/20 vịt có hiệu giá kháng thể HI ở mức rất thấp là 1,7 log2 khi

chuẩn độ với kháng nguyên H5N1, 11/20 vịt có hiệu giá kháng thể HI với GMT ở

mức 1,5log2 khi chuẩn độ với kháng nguyên H5N2. Ở vịt được tiêm 2 liều vắc-xin,

108

đáp ứng tạo kháng thể có cải thiện, 2 tuần sau tiêm mũi vắc-xin thứ hai, có 17/19 vịt

có hiệu giá kháng thể HI ở mức 3,1 log2 khi chuẩn độ với kháng nguyên H5N1 và

6,6 log2 khi chuẩn độ với kháng nguyên H5N2.

Kết quả thí nghiệm phù hợp với nghiên cứu của Đậu Huy Tùng và ctv. (2012),

khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Vifluvac ở thời điểm 2 tuần sau mũi 1, chỉ có 50%

mẫu xét nghiệm phát hiện có kháng thể, với GMT trung bình 3,2log 2; sau 3 tuần

tiêm mũi thứ 2 có 90% số mẫu xét nghiệm phát hiện kháng thể, với GMT trung bình

là 4,7log2 .

Đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên vịt

cũng được nghiên cứu bởi Phan Chí Tạo và Trần Ngọc Bích (2016), Huynh HTT và

ctv. (2019). Sau khi tiêm phòng 2 tuần ở mũi tiêm thứ nhất với vắc-xin Navet-

Vifluvac và H5N1 Re-6, tỷ lệ mẫu đạt mức bảo hộ lần lượt là 30% và 40%, tương

ứng với các giá trị GMT là 1,53 log2 và 1,63 log2. Việc tiêm nhắc vắc-xin Cúm gia

cầm ở vịt có tác dụng kích ứng tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn. Ở thời điểm 2 tuần

sau khi tiêm vắc-xin mũi 2, hiệu giá kháng thể HI đã đạt mức 5,97 log2 và 5,4 log2;

duy trì ở mức 4,93 log2 và 4,47 log2 ở thời điểm 90 ngày sau tiêm vắc-xin mũi 2,

tương ứng với vắc-xin Navet-Vifluvac và H5N1 Re-6. Dù vậy, mức hiệu giá kháng

thể khá thấp và tỷ lệ mẫu đạt mức hiệu giá kháng thể HI bảo hộ (≥4log2) chỉ còn

90% và 83,33%, tương ứng với vắc-xin Navet-Vifluvac và H5N1 Re-6, ở 3 tháng

sau tiêm vắc-xin lần 2 (Phan Chí Tạo và Trần Ngọc Bích, 2016).

Trong khi đó, nghiên cứu đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng vắc-xin Cúm

gia cầm Re-6 ở vịt tại Việt Nam của Huynh HTT và ctv.(2019) ghi nhận mức độ

đáp ứng khá cao. Ở thời điểm 3 tuần sau mũi tiêm thứ nhất, hơn 70% vịt có đáp ứng

miễn dịch với hiệu giá kháng thể HI trong khoảng 4log2 - 7log2, thời điểm 3 tuần

sau mũi tiêm thứ hai có 73% vịt có hiệu giá kháng thể HI trong khoảng 6log2 -

9log2. Giá trị GMT cũng khá cao ở đàn vịt sau 3 tuần được tiêm mũi thứ nhất là 5,3

log2 và 6,48 log2 ở thời điểm 21 ngày sau tiêm vắc-xin mũi 2. Tỷ lệ mẫu đạt mức

hiệu giá kháng thể HI ≥ 4log2 tăng từ 68% sau mũi tiêm vắc-xin thứ nhất lên 84,7%

sau mũi tiêm vắc-xin thứ 2.

109

Hiệu giá kháng thể HI trung bình trên vịt tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2

ở thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng mũi 2 thấp hơn kết quả đánh giá hiệu lực vắc-xin

Re-5, sử dụng kháng nguyên vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.4, nhập khẩu của Trung

Quốc do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương khảo nghiệm, với hiệu giá kháng

thể HI trung bình trên vịt ở thời điểm 3 tuần sau khi tiêm vắc-xin Re-5 mũi 2 là

6,1log2. Đối với vắc-xin Re-6, sử dụng kháng nguyên vi-rút Cúm gia cầm clade

2.3.2.1, nhập khẩu của Trung Quốc, mức hiệu giá kháng thể HI trung bình trên vịt ở

thời điểm 3 tuần sau khi tiêm vắc-xin Re-6 mũi 2 là 6,6log2, Công ty cổ phần

Thuốc Thú y Trung ương 1 (2013); hay với vắc-xin tái tổ hợp H5N3, mức hiệu giá

kháng thể HI trung bình trên vịt sau 3 tuần tiêm mũi thứ 2 đạt 7log2 (Webster và

ctv. 2006).

Kết quả nghiên cứu đáp ứng tạo kháng thể ở vịt sau khi tiêm vắc-xin Cúm gia

cầm Navet-Fluvac 2 cho thấy, vịt khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 cần thiết

phải tái chủng mũi 2 ở thời điểm 2 tuần sau mũi đầu tiên để tạo đáp ứng miễn dịch

đạt yêu cầu theo TCVN số 8685-9:2014.

Trong thực tế, đối với các loại vắc-xin Cúm A/H5N1 nhập khẩu từ Trung

Quốc như Re1, Re5, Re 6 đã cấp phép lưu hành trên thị trường, đều khuyến cáo

người chăn nuôi phải tiêm phòng 2 lần, tiêm phòng lần đầu lúc vịt đạt 2 tuần tuổi và

tái chủng sau 3 tuần kể từ khi tiêm phòng mũi 1.

Kết quả kiểm tra huyết thanh của lô vịt đối chứng không tiêm phòng vắc-xin,

nuôi trong cùng một điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng đều cho kết quả âm tính với

vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, chứng tỏ trong quá trình nuôi vịt thí nghiệm không có

sự xâm nhập của mầm bệnh từ bên ngoài, kháng thể được tạo ra do đàn vịt được

tiêm vắc-xin.

3.3.3.2 Kết quả thí nghiệm công cường độc trên vịt

Để đánh giá hiệu lực của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm

nhánh 2.3.2.1a; 2.3.2.1b; 2.3.2.1c bằng phương pháp công cường độc, đề tài đã bố

trí 3 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm có 15 con vịt đã tiêm phòng 2 mũi vắc-xin

110

cách nhau 2 tuần; 3 lô đối chứng mỗi lô có 5 con vịt chưa được tiêm phòng, vịt thí

nghiệm và đối chứng được chọn ngẫu nhiên.

Thời điểm công cường độc được thực hiện sau 3 tuần kể từ khi vịt được tiêm

phòng mũi 2, lô vịt thí nghiệm và đối chứng được lấy mẫu kiểm tra kháng thể trước

khi công cường độc và 10 ngày sau khi công cường độc, hoặc ngày vịt lô đối chứng

chết, kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả công cường độc trên vịt được tiêm và không được tiêm vắc-xin

Navet-Fluvac 2

Kết quả công độc

Lô thí nghiệm Số lượng (con) Clade vi-rút Cúm công độc Trước công độc Hiệu giá kháng thể HI (GMT log2) Sau công độc Sống/ tổng số Bảo hộ (%)

Lô thí nghiệm 1 15 4,6 ±1,5 4,5 ±1,7a 14/15 93,3

2.3.2.1 a Đối chứng 1 5 - - 0/5 0

Lô thí nghiệm 2 15 4,2 ±2,2a 6,7 ±1,8b 14/15 93,3 2.3.2.1c Đối chứng 2 5 - - 0/5 0

Ghi chú: Trong cùng một hàng hoặc cùng một cột, số liệu mang chữ cái khác nhau

Lô thí nghiệm 3 15 4,0±2,0a 6,1±1,3b 15/15 100 2.3.2.1b Đối chứng 3 5 - 1/5 20

có sai khác thống kê (P<0,05).

Sau khi công cường độc, từ ngày thứ 2 trở đi, đàn vịt lô đối chứng có dấu hiệu

điển hình của bệnh Cúm gia cầm với các biểu hiện: bỏ ăn, ủ rũ, mồm tím tái, đục

mắt, xuất huyết và chết vào ngày thứ ba đến ngày thứ 5 sau khi công cường độc.

Trong khi các lô thí nghiệm đàn vịt được tiêm phòng vẫn ăn uống sinh hoạt bình

thường.

Vịt sau 3 tuần được tiêm vắc-xin Navet-Fuvac 2 mũi thứ 2, khi tiến hành

công cường độc với các biến chủng Cúm A/H5N1, có tỷ lệ bảo hộ khá cao, đạt từ

93,3% đối với chủng 2.3.2.1a và 2.3.2.1c, đạt 100% đối với clade 2.3.2.1b.

111

Kết quả bảo hộ khi công cường độc trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fuvac 2 trong nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tốt hơn so với trường hợp sử dụng

vắc-xin Navet-Vifluvac với kháng nguyên NIBGG-14. Tỷ lệ bảo hộ trên vịt tiêm 1

liều vắc-xin Navet-Vifluvac là 90% đối với clade 1, 100% đối với clade 2.3.2.1a;

10% với clade 2.3.2.1b. Đối với vịt tiêm phòng 2 liều vắc-xin Navet-Vifluvac, lặp

lại sau 14 ngày, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% đối với clade 1, 100% đối với clade 2.3.2.1a,

30% đối với clade 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và ctv. 2012).

Kết quả bảo hộ khi công cường độc trên vịt sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-

Fluvac 2 tương đương với kết quả khảo nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y

Trung ương đối với vắc-xin tái tổ hợp Re 6, với kết quả bảo hộ 100% đối với vi-rút

Cúm gia cầm nhánh clade 2.3.2.1a, clade 2.3.2.1b và clade 2.3.2.1c.

Kết quả bảo hộ trên vịt sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-

rút Cúm gia cầm nhánh 2.3.2.1 tốt hơn so với vắc-xin Re-1 và vắc-xin Re-5 nhập

khẩu từ Trung Quốc. Cha và ctv. (2013) đã tiến hành nghiên cứu về hiệu quả của

vắc-xin Cúm gia cầm dựa trên kháng nguyên HA chủng vi-rút H5N1 clade 0 (vắc-

xin Re-1) và clade 2.3.4 (vắc-xin Re-5) trên vịt theo quy trình tiêm 2 mũi (7 ngày

tuổi và 14 hoặc 21 ngày tuổi), công độc vào ngày 30 sau tiêm vắc-xin với các chủng

vi-rút Cúm H5N1 độc lực cao thuộc clades 1.1, 2.3.4.3, 2.3.2.1.a và 2.3.2.1.b phân

lập tại Việt Nam. Kết quả cho thấy, vịt được tiêm vắc-xin Re-1 chỉ bảo hộ hoàn

toàn khi công cường độc với chủng vi-rút clade 1.1 và 2.3.4.3. Vắc-xin Re-1 và Re-

5 bảo hộ 90 - 100% vịt khỏi bệnh lâm sàng khi bị công độc với chủng vi-rút Cúm

A/H5N1 độc lực cao, clade 2.3.2.1a phân lập vào năm 2010, nhưng không ngăn

được bài thải vi-rút sau công cường độc. Tương tự, 2 vắc-xin Re-1 và Re-5 chỉ bảo

vệ được 1 phần vịt được tiêm vắc-xin đối với công cường độc chủng H5N1 độc lực

cao clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b phân lập vào năm 2011. Các kết quả trên cho thấy,

hiệu quả bảo hộ khi tiêm vắc-xin Cúm gia cầm trên vịt có khuynh hướng giảm theo

thời gian và tuỳ thuộc vào chủng vi-rút công độc. Vắc-xin Re-1 và Re-5 chỉ có tác

dụng bảo vệ một phần vịt được tiêm vắc-xin chống lại vi-rút chủng H5N1 độc lực

cao clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b.

112

Zeng và ctv. (2016) đã đánh giá hiệu quả vắc-xin vô hoạt Re-6 dựa trên kháng

nguyên HA và NA chủng vi-rút Cúm A/duck/Guangdong/S1322/10

(DK/GD/S1322/10), H5N1 clade 2.3.2.1; khi công độc bằng các chủng vi-rút Cúm

H5N1 clade 2.3.2.1, 2.3.4.4 và 7.2 đã ghi nhận hiệu quả bảo hộ hoàn toàn đối với

các chủng công độc thuộc clade 2.3.2.1, kém hiệu quả hơn đối với clade 7.2 và hiệu

quả rất kém đối với clade 2.3.4.4.

Kiểm tra hiệu giá kháng thể HI sau khi công cường độc 10 ngày ở vịt cho

thấy, hiệu giá kháng thể HI của vịt đã được tiêm vắc-xin đều có xu hướng tăng,

trước khi công biến động từ 4log2 - 4,6log2 so với 4,5log2 - 6,7log2 ghi nhận sau

khi công, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa về thống kê với P>0,05.

Căn cứ Tiêu chuẩn quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm

vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm, vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt yêu cầu về tính an

toàn và hiệu lực phòng bệnh trên vịt đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1.

Hình 3.26. Công cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi trên vịt

113

Hình 3.27. Vịt tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 khỏe mạnh bình thường

Hình 3.28. Vịt lô đối chứng chết sau 3 ngày công cường độc

114

3.3.4. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời

Vịt trời là loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, trong những năm gần đây vịt

trời đã bắt đầu được nhiều người nuôi trong điều kiện bán hoang dã. Nguy cơ tiềm

ẩn sự lây truyền vi-rút Cúm gia cầm từ loài thủy cầm hoang dã này sang gia cầm

nuôi là cơ sở thực tiễn cho nghiên cứu đánh giá hiệu lực của vắc-xin Navet-Fluvac 2

trong phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 trên vịt trời, qua đó có thêm thông tin khoa

học mới cho công tác phòng chống bệnh Cúm gia cầm A/H5N1.

3.3.4.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trên vịt trời

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trên đàn vịt trời, lô thí nghiệm và lô

đối chứng, trước và sau tiêm phòng theo liệu trình 1 mũi và liệu trình tiêm 2 mũi,

mũi 2 tiêm nhắc sau 2 tuần tiêm mũi 1, liều tiêm 0,5 ml vắc-xin/con; được trình bày

qua Bảng 3.16.

Bảng 3.16. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể trên vịt trời có và không có tiêm vắc-

xin Navet-Fluvac 2

GMT (log2)

Lô thí nghiệm

Số vịt thí nghiệm

Thời gian lấy mẫu

Số lượng mẫu xét nghiệm

Số mẫu dương tính - -

Lô TN 1 (Tiêm 1 mũi vắc xin)

<2,3

Trước tiêm vắc-xin 3 tuần sau mũi 1 5 tuần sau mũi 1 Trước tiêm vắc-xin

5,9±1,7

- 28

3 tuần sau mũi 2

Lô TN 2 (Tiêm 2 mũi vắc xin cách nhau 14 ngày)

Đối chứng (Không tiêm)

Trước và sau 5 tuần tiêm vắc xin

Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc cùng một hàng, số liệu mang chữ cái khác nhau

có sai khác thống kê (P<0,05).

Đối với liệu trình tiêm phòng 1 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, kết quả kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI ở thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng không phát hiện kháng thể.

115

Ở thời điểm 5 tuần sau tiêm vắc-xin, kết quả kiểm tra chỉ phát hiện có 5/20 mẫu có

kháng thể, chiếm tỷ lệ 25%, với GMT bình quân dưới 2,3log2 (Bảng 3.16).

Đối với liệu trình tiêm phòng 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, kết quả kiểm tra

hiệu giá kháng thể HI ở thời điểm 3 tuần sau tiêm phòng mũi 2 cho thấy, số lượng

vịt trời có đáp ứng kháng thể tăng rõ rệt so với tiêm mũi 1, có 28/30 mẫu phát hiện

có đáp ứng kháng thể, chiếm tỷ lệ 93,30%, với GMT trung bình là 5,9log2. So sánh

mức hiệu giá kháng thể HI khi tiêm phòng 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac và tiêm

phòng 1 mũi trên vịt trời cho thấy sự khác biệt rất có ý nghĩa về thống kê với

P<0,01.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac

2 trên vịt trời tương đồng với kết quả đánh giá kháng thể trên vịt, hàm lượng kháng

thể sau khi tiêm mũi 1 đạt thấp, hiệu giá kháng thể HI được cải thiện rõ sau khi tiêm

phòng mũi 2.

Khả năng đáp ứng kháng thể trên vịt trời khi tiêm phòng với quy trình tiêm

một mũi là rất thấp. Để cải thiện tình trạng này cần thiết phải áp dụng qui trình tiêm

2 mũi, mũi 2 sau mũi một 2 tuần. Áp dụng qui trình này có thể có được kết quả

miễn dịch tốt hơn, với hơn 80% số vịt trời được tiêm phòng có huyết thanh dương

tính với mức hiệu giá kháng thể HI trung bình đạt ≥4log2.

3.3.4.2 Kết quả thí nghiệm công cường độc trên vịt trời

Để đánh giá hiệu lực của vắc-xin Navet-Fluvac 2 sau khi tiêm phòng cho vịt

trời bằng phương pháp công cường độc, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 15 con vịt trời ở

lô thí nghiệm được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 và 5 vịt trời ở lô đối

chứng không được tiêm phòng. Thời điểm công cường độc vi-rút Cúm gia cầm độc

lực cao là sau 3 tuần kể từ khi vịt trời được tiêm phòng mũi 2. Lô vịt trời thí nghiệm

và đối chứng được lấy mẫu kiểm tra kháng thể đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm

A/H5N1 ở thời điểm trước khi công cường độc và 10 ngày sau khi công cường độc.

Kết quả được trình bày qua Bảng 3.17.

Sau khi công cường độc 3 ngày, lô vịt trời được tiêm phòng có 14/15 con khỏe

mạnh bình thường, trong khi lô đối chứng có 4/5 con vịt trời chết, có dấu hiệu lâm

116

sàng bệnh Cúm gia cầm.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI ở 10 ngày sau khi công cường độc và

trước khi công cường độc (3 tuần sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 mũi 2) ghi

nhận không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, với P>0,05. Kết quả công

cường độc trên vịt trời được tiêm và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2

tương tự với kết quả đánh giá hiệu lực vắc-xin trên vịt thịt.

Bảng 3.17. Kết quả công cường độc trên vịt trời có và không tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2

Kết quả công độc Hiệu giá kháng thể HI (GMT log2)

Lô thí nghiệm Số lượng (con) Clade vi- rút cúm Sau công độc Bảo hộ (%) Trước công độc Sống/ tổng số

Lô thí nghiệm

5,9±2,1 5,5±2,5 14/15 93,3 15

(Tiêm phòng 2 mũi vắc-xin) 2.3.2.1 c Đối chứng

5 - - 1/5 20

Với kết quả nêu trên có thể nhận xét như sau: Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có độ

(Không tiêm vắc xin)

an toàn và hiệu lực cao khi tiêm phòng cho đàn vịt trời; vịt trời được tiêm phòng

quy trình 2 mũi tiêm có khả năng bảo hộ rất cao (93,3%) với vi-rút Cúm gia cầm

clade 2.3.2.1c.

Căn cứ Tiêu chuẩn quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm

vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm, vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt yêu cầu về tính an

toàn và hiệu lực phòng bệnh trên vịt trời đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1.

Đã có nhiều nghiên cứu về đáp ứng tạo kháng thể với vi-rút Cúm gia cầm trên

gia cầm, tuy nhiên vẫn chưa có công bố chính thức về nghiên cứu tương tự trên vịt

trời trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Đây là những kết quả đầu tiên về đáp ứng

tạo kháng thể với vi-rút Cúm gia cầm trên vịt trời được công bố chính thức.

117

Trong các thí nghiệm công độc trên vịt và vịt trời, nghiên cứu ghi nhận một tỷ

lệ (20%) vịt (Bảng 3.15) và vịt trời (Bảng 3.17) vẫn sống sót sau công độc dù kháng

thể âm tính. Nghiên cứu về vai trò của kháng thể trong việc bảo hộ đối với vi-rút

cúm gia cầm, một số tác giả có đúc kết như sau: Kháng thể không phải là yếu tố duy

nhất bảo vệ gia cầm chống lại vi-rút cúm (Leung và ctv., 2013; Riks Maas và ctv.,

2011). Nghiên cứu của Van Der Goot và ctv., (2008) ghi nhận, những gia cầm đã

được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm sau 1 tuần có khả năng bảo hộ khi công cường độc

liều cao vi-rút cúm H7N7, ngay cả khi không phát hiện được kháng thể.

Criado và ctv., (2020) cho rằng, không có mối tương quan rõ ràng giữa lượng

kháng thể trung hoà vi-rút và khả năng bảo hộ của vắc-xin. Nhiều gia cầm có hiệu

giá kháng thể trung hoà cao (thậm chí ở mức 256) nhưng vẫn bị bệnh và chết, trong

khi một số gia cầm khác không có kháng thể trung hoà vẫn sống sau khi bị công độc

với chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 độc lực cao. Điều tương tự cũng đã được ghi

nhận trong các đánh giá miễn dịch Cúm trên người (Rowe và ctv., 1999). Nhiều gia

cầm có hiệu giá kháng thể HI thấp dưới ngưỡng dự đoán bảo hộ vẫn không có biểu

hiện lâm sàng khi bị công cường độc với chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao.

Ngược lại, một số gia cầm có hiệu giá kháng thể HI cao vẫn bị bệnh khi công cường

độc với chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao. Điều này cho thấy, ngoài miễn dịch

dịch thể có thể xác định bằng phương pháp HI, miễn dịch tế bào cũng giữ vai trò

bảo hộ quan trọng đối với vi-rút Cúm gia cầm (Criado và ctv., 2020).

3.3.5. Đánh giá khả năng bài thải vi-rút sau công độc

Bên cạnh việc theo dõi đánh giá chỉ tiêu về lâm sàng, hiệu giá kháng thể sau

tiêm phòng, tỷ lệ bảo hộ sau khi công cường độc, một chỉ tiêu khác là kiểm tra sự

bài thải vi-rút trên gia cầm sau khi công cường độc (OIE, 2018) cũng cần được theo

dõi nhằm đánh giá sự an toàn và khả năng ngăn chặn sự lưu hành vi-rút Cúm gia

cầm thực địa của vắc-xin Navet-Fluvac 2. Sự bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1

công độc được kiểm tra trên mẫu swab hậu môn gà, vịt được tiêm phòng vắc-xin

Navet-Fluvac 2 và lô đối chứng không tiêm phòng ở 3 ngày sau công độc, bằng kỹ

thuật relatime RT-PCR. Kết quả được trình bày qua bảng 3.18.

118

Kết quả đánh giá bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau 3 ngày công độc, ở

gà và vịt được và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong Bảng 3.18 cho

thấy, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) về tỷ lệ bài thải vi-rút sau khi

công cường độc 3 ngày giữa gia cầm được tiêm phòng và không được tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2. Ở gà được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2, tỷ lệ dương tính

với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 chỉ là 10% so với 100% ở gà không được tiêm

vắc-xin Navet-Fluvac 2 (P<0,05).

Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau khi công

cường độc trên gà, vịt được và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2

Loài động vật Nhóm thí nghiệm Số lượng gia cầm khảo sát Tỷ lệ bài thải vi-rút (%)

Số gia cầm dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1/ tổng số

6/60 60 10,0a Tiêm phòng Gà

20/20 20 100b Đối chứng

9/45 45 20a Tiêm phòng

Vịt

14/15 93,33b Đối chứng 15

Ghi chú: Trong cùng một cột, số liệu mang chữ cái khác nhau có sai khác thống kê

(P<0,05).

Tỷ lệ bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau khi công cường độc 3 ngày,

giữa vịt được tiêm phòng và không tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, tương ứng

là 20% và 93,33%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.

Qua kết quả kiểm tra bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, 3 ngày sau khi

công cường độc ở gia cầm được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2, có thể kết luận vắc-

xin Navet-Fluvac 2 có khả năng làm giảm hiệu quả sự bài thải vi-rút công cường

độc.

119

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nhiều nghiên cứu đánh giá về khả năng

bài thải vi-rút Cúm gia cầm công cường độc ở gia cầm được tiêm vắc-xin Cúm gia

cầm (Đậu Huy Tùng và ctv. 2012; Lee và ctv. 2004). Gà, vịt được tiêm phòng vắc-

xin Navet-Vifluvac có mức bài thải vi-rút công độc (vi-rút clade 1.1 và 2.3.2.1c)

giảm 2-3 lần so với ở gà, vịt không được tiêm vắc-xin (Đậu Huy Tùng và ctv.,

2012). Kết quả giảm mức độ bài thải vi-rút sau khi công cường độc trong nghiên

cứu tương đồng với khảo sát của Lee và ctv. (2004) trên gà được tiêm vắc-xin vô

hoạt H5N2 A/CK/mexico/232/94/CPA; hay của Liu M và cộng sự., 2003 trên gà

được tiêm vắc-xin tái tổ hợp H5N3, A/Goose/HK/437.4/99 (H5N1 và

A/Duck/Germany/1215/73 (H2N3).

Một số nghiên cứu khác cũng đã đánh giá sự liên quan giữa hiệu quả làm giảm

sự bài thải chủng vi-rút công độc với mức tương đồng axít amin của HA1 giữa

chủng vi-rút vắc-xin Cúm gia cầm và chủng công độc vi-rút Cúm gia cầm độc lực

cao (Swayne, D.E. 1999; Swayne và ctv. 2000; Lee và ctv. 2004) ở gà, cũng như ở

vịt (Van Der Goot và ctv. 2008). Các nghiên cứu đã ghi nhận hiệu quả làm giảm sự

bài thải chủng vi-rút công độc qua dịch hầu họng (Swayne và ctv. 2000), khí quản

(Lee và ctv. 2004), qua phân (Swayne và ctv. 1999), hay ngăn chặn hoàn toàn sự

lây truyền chủng vi-rút công độc ở gà, cũng như ở vịt (Van der Goot và ctv. 2008,

Swayne., 1999) có liên quan với mức tương đồng axít amin của HA1, hay tương

quan di truyền giữa chủng vi-rút vắc-xin Cúm gia cầm và chủng công độc vi-rút

Cúm gia cầm (Criado và ctv. 2020).

Việc tiêm vắc-xin Cúm gia cầm giúp kiểm soát lây truyền vi-rút Cúm gia cầm

thực địa ở gà và kể cả ở vịt. Mức độ bài thải vi-rút công độc phụ thuộc vào một số

các yếu tố như: loài gia cầm và tính mẫn cảm của loài với vi-rút cúm; liều công độc;

mức độ phản ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc-xin và chủng vi-rút dùng để sản xuất

vắc-xin. Trong thí nghiệm này, mức độ bài thải vi-rút Cúm gia cầm công độc ở gà

được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 thấp hơn so với trên vịt được tiêm vắc-xin, tuy

nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về thống kê với P>0,05 (Bảng 3.18).

120

3.3.6. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2

3.3.6.1. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà

Đối với cả 2 quy trình tiêm phòng, tiêm 1 mũi hay tiêm 2 mũi vắc-xin, kết quả

kiểm tra hiệu giá kháng thể HI có xu hướng tăng đến tháng thứ 2, ở mức 6,7log2

với gà tiêm phòng 1 mũi vắc-xin và 7,6log2 đối với gà được tiêm phòng 2 mũi vắc-

xin, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về thống kê với P>0,05. Từ tháng

thứ 3 trở đi, kết quả kiểm tra ghi nhận, hiệu giá kháng thể HI có xu hướng giảm

nhưng vẫn duy trì ở mức khá cao, đạt mức 5,7log2 - 6log2 với gà tiêm phòng 1 mũi

vắc-xin và 6,7log2 với gà tiêm phòng 2 mũi vắc-xin (Bảng 3.19).

Bảng 3.19. Đánh giá độ dài miễn dịch trên gà sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2

Tháng khảo sát sau khi tiêm phòng Chỉ số Lô thí kháng nghiệm thể HI 1 2 3 4 5 6

Lô thí Số mẫu 14/15 14/15 14/15 14/15 14/15 13/15 nghiệm 1 dương 93,33% 93,33% 93,33% 93,33% 93,33% 86,67 (Gà tiêm tính/ %

phòng 1 6,7±1,5 6,7±0,8a 5,8±0,6a 5,7±1,0a 5,8±0,9a 6,0±0,9a mũi) GMT

Lô thí Số mẫu 14/15 14/15 14/15 14/15 14/15 14/15 nghiệm 1 dương 93,33% 93,33% 93,33% 93,33% 93,33% 93,33% (Gà tiêm tính/ %

phòng 2 6,8±0,9 7,6±1,3b 7,6±0,5b 7,1±0,4b 6,7±1,2b 6,7±0,4b mũi) GMT

Số mẫu Lô đối - - - - - - dương chứng tính

Ghi chú: Trong cùng một cột, số liệu mang chữ cái khác nhau có sai khác thống kê

Phân tích hiệu giá kháng thể HI và tỷ lệ gà dương tính (hiệu giá kháng thể >4

log2) theo thời gian từ 1 đến 6 tháng sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 cho thấy,

hiệu giá kháng thể HI ở gà được tiêm 1 mũi vắc-xin có khuynh hướng giảm từ tháng

121

thứ 2 sau tiêm vắc-xin. Trong khi đó, ở gà được tiêm 2 mũi vắc-xin, ngược lại, hiệu

giá kháng thể HI có khuynh hướng gia tăng từ tháng thứ 2 sau tiêm vắc-xin và chỉ

giảm từ tháng thứ 5 sau tiêm vắc-xin, nhưng vẫn duy trì ở mức cao với GMT ở mức

6,7, cao hơn nhiều so với GMT ở gà chỉ được tiêm 1 mũi vắc-xin (5,8 – 6,0), và

khác biệt có ý nghĩa với P<0,05.

So sánh thống kê chung hiệu giá kháng thể HI giữa 2 liệu trình tiêm 1 và 2

mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, từ tháng 3 - 6 sau tiêm vắc-xin, cho thấy có sự khác

biệt có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Trong khi đó, lô gà đối chứng cho kết quả

HI âm tính, điều này khẳng định môi trường khu vực nuôi thí nghiệm không nhiễm

mầm bệnh.

Kết quả thí nghiệm phù hợp với nghiên cứu của Guobin và ctv. (2005) trên gà

SPF (Specific Pathogens Free) 3 tuần tuổi, khi được tiêm vắc-xin H5N1 vô hoạt,

kháng thể được phát hiện ở 1 tuần sau tiêm vắc-xin, đạt đỉnh lúc 6 tuần sau tiêm

vắc-xin và giảm dần đến 4log2 ở 43 tuần sau tiêm vắc-xin và có thể bảo vệ gia cầm

khỏi bệnh do công cường độc cho đến 10 tháng sau tiêm vắc-xin. Cũng trong

nghiên cứu này cho thấy, vắc-xin H5N1 vô hoạt nhũ dầu có thể tạo được miễn dịch

bảo hộ công cường độc ở ngỗng đến 34 tuần sau tiêm vắc-xin với quy trình tiêm 3

mũi vắc-xin và 52 tuần ở vịt với quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin.

Thời gian miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 tốt hơn kết quả nghiên cứu về

độ dài miễn dịch trên gà được tiêm phòng bằng vắc-xin tiểu phần H5 với vec-tơ là

baculovirus cho gà 1 tuần tuổi, liệu trình 1 và 2 mũi (8 và 18 ngày tuổi) của

Mustafa Hamad và ctv. (2018). Nghiên cứu đã ghi nhận, đáp ứng tạo kháng thể bảo

hộ cho gà từ 3 tuần sau tiêm vắc-xin và duy trì đến 16 tuần sau tiêm vắc-xin trong

liệu trình tiêm 2 mũi. Liệu trình tiêm 1 mũi vắc-xin chỉ tạo được hiệu giá kháng thể

ở mức bảo hộ cho đến 6 tuần sau tiêm vắc-xin (Mustafa Hamad và ctv. 2018).

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HI trên gà ở thời điểm 6 tháng sau tiêm

phòng cho thấy sự ổn định ở mức cao của hiệu giá kháng thể HI trên cả 2 lô thí

nghiệm (>6log2), đạt yêu cầu so với quy định tại TCVN số 8685-9:2014 về quy

trình kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm.

122

Căn cứ tiêu chuẩn TCVN số 8685-9:2014, theo kết quả kiểm tra hiệu giá

kháng thể HI trên gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 với quy trình 1 mũi

tiêm lúc 2 tuần tuổi và quy trình tiêm 2 mũi vắc-xin lúc gà đạt 2 tuần tuổi và tái

chủng sau 2 tuần, nghiên cứu ghi nhận cả 2 quy trình tiêm 1 mũi và 2 mũi vắc-xin

Navet-Fluvac 2 đều tạo ra đáp ứng miễn dịch ổn định và kéo dài trên 6 tháng.

Với kết quả thu được trong nghiên cứu này, có thể đề xuất trên gà thịt chỉ cần

tiêm 1 liều vắc-xin Navet-Fluvac 2 ở thời điểm đàn gà đạt 2 tuần tuổi. Miễn dịch tạo

thành sau tiêm vắc-xin có thể bảo vệ đàn gà trong thời gian 6 tháng sau tiêm phòng,

mà không nhất thiết phải tiêm phòng lặp lại mũi 2. Đối với gà đẻ trứng, gà giống,

khuyến khích nên tiêm phòng 2 mũi vắc-xin và tái chủng định kỳ mỗi 6 tháng để tạo

miễn dịch tối ưu và tạo kháng thể mẹ truyền qua phôi ổn định.

3.3.6.2. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

Để đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt, chọn ngẫu

nhiên 15 con vịt đã được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin, lúc 2 tuần tuổi và tái chủng sau

đó 2 tuần và 5 con vịt không tiêm phòng để bố trí thí nghiệm theo dõi độ dài miễn

dịch.

Bảng 3.20. Đánh giá độ dài miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt

Tháng sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2

Lô thí nghiệm Chỉ số kháng thể HI 1 2 3 4 5 6

4,9±1,6

5,9±1,5

6,3±1,8

4,4±2,2

4,5±1,9 4,3±2,1

14/15 93,33% 14/15 93,33% 14/15 93,33% 12/14 85,71% 10/14 71,43% 8/14 57,14% Số mẫu dương tính/ %

GMT Lô thí nghiệm (vịt tiêm phòng 2 mũi)

- - - - - - Lô đối chứng Số mẫu dương tính/ %

Xét nghiệm hiệu giá kháng thể HI của thí nghiệm được trình bày trong bảng

3.20 gồm: Vịt không được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 được nuôi chung với

vịt được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong cùng điều kiện chăm sóc, nuôi

123

dưỡng để làm động vật chỉ báo. Ở các thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6 tháng sau khi tiêm

vắc-xin mũi thứ 2, tất cả vịt được tiêm phòng vắc-xin và vịt chỉ báo được lấy máu

kiểm tra kháng thể kháng vi-rút H5N1.

Qua kết quả kiểm tra kháng thể kháng vi-rút H5N1 nhận thấy mức hiệu giá

kháng thể HI ở vịt được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 tăng dần và đạt

cao nhất ở tháng thứ 3 (6,3log2) sau khi tiêm phòng mũi 2 và bắt đầu giảm dần ở

tháng thứ 4. Kết quả kiểm tra kháng thể trên vịt ở tháng thứ 6 sau tiêm phòng vắc-

xin ghi nhận, chỉ có 8/14 vịt có hiệu giá kháng thể >4log2, chiếm tỷ lệ 57,14%, với

GMT bình quân 4,3log2, trong khi đó vịt đối chứng (chỉ báo) vẫn cho kết quả HI

âm tính.

Kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể HI ở lô vịt được tiêm vắc-xin Navet-

Fluvac 2 tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng đạt yêu cầu theo TCVN số 8685-

9:2014, tuy nhiên mức kháng thể giữa các cá thể không đồng đều. Trong nghiên cứu

này, nhằm đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt ở các mức

hiệu giá khác nhau, nghiên cứu đã thực hiện công cường độc vịt ở thời điểm 6 tháng

sau khi tiêm vắc-xin mũi 2. Kết quả công cường độc được trình bày qua Bảng 3.21.

Bảng 3.21. Kết quả công cường độc trên vịt tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng

vắc-xin Navet-Fluvac 2

Lô TN Tỷ lệ bảo hộ Hiệu giá kháng thể HI (log2) Số lượng vịt được công độc Hiệu giá kháng thể HI (GMT log2) Số vịt sống/ tổng số vịt bị công độc

<2,3 1 1/1

2,3 3 3/3 Thí nghiệm 4,3±2,1 13/14 (92,8%) 3,3 2 1/2

≥4,3 8 8/8

0/5 Đối chứng - 0/5 (0%)

124

Kết quả công cường độc đàn vịt thí nghiệm ở thời điểm 6 tháng sau tiêm

phòng mũi 2 ghi nhận, có 13/14 vịt được bảo hộ, đạt tỷ lệ 92,8%, trong khi đó 100%

vịt đối chứng chết. Qua thí nghiệm cho thấy, ở vịt được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin

Navet-Fluvac 2, không chỉ những vịt có mức hiệu giá kháng thể HI ≥4log2 có khả

năng bảo hộ chống lại vi-rút Cúm A/H5N1 độc lực cao, mà cả những vịt có mức

hiệu giá kháng thể HI thấp hơn 4log2 vẫn có khả năng bảo hộ chống lại vi-rút Cúm

gia cầm độc lực cao. Cụ thể có 5/6 vịt có hiệu giá kháng thể thấp hơn 4log2, chiếm

tỷ lệ 83,33% vẫn được bảo hộ sau công độc.

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Criado và ctv. (2020), không có mối

tương quan rõ ràng giữa lượng kháng thể xác định bằng phương pháp HI, cũng như

kháng thể trung hoà vi-rút và khả năng bảo hộ của vắc-xin đối với vi-rút Cúm gia

cầm.

Kết quả công cường độc trên vịt ở thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng vắc-xin

Navet-Fluvac 2 đảm bảo yêu cầu theo Tiêu chuẩn TCVN số 8685-9:2014, có ít nhất

80% vịt ở lô được tiêm phòng còn sống, không có bất kỳ dấu hiệu nào của bệnh

Cúm gia cầm và ít nhất 80% vịt lô đối chứng chết. Từ kết quả nghiên cứu có thể

nhận định, vắc-xin Navet-Fluvac 2 tạo được miễn dịch bảo hộ tối thiểu 6 tháng trên

vịt được tiêm phòng 2 mũi vắc-xin, mũi thứ nhất lúc 2 tuần tuổi và mũi thứ hai cách

mũi thứ nhất 2 tuần. Kết quả này tương đương với khuyến cáo của các loại vắc-xin

phòng bệnh Cúm gia cầm hiện đang lưu hành tại nước ta, bao gồm các loại vắc-xin

tái tổ hợp như Re-1, Re-5, Re-6 do Trung Quốc sản xuất.

125

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

- Không phát hiện trường hợp lưu hành vi-rút Cúm A/H5N1 trên đàn gà từ các

 Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 ở đàn gia cầm

tỉnh nhập vào các cơ sở giết mổ; cũng như đàn gà, vịt khỏe mạnh từ các hộ chăn

- Tỷ lệ nhiễm vi-rút Cúm A/H5N1 ở mức rất cao ở các trường hợp gia cầm có

nuôi trên địa bàn Thành phố trong thời gian khảo sát.

biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm (51/63 trường hợp, tỷ lệ 80,95%).

 Dấu hiệu lâm sàng ở các đàn gà, vịt mắc bệnh Cúm A/H5N1 phù hợp với các

mô tả về bệnh Cúm gia cầm ở gà và vịt. Dấu hiệu thần kinh là điển hình trên vịt,

xuất huyết ở da chân là bệnh tích điển hình trên gà.

- Có sự đa dạng di truyền của các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 được phân tích

 Nghiên cứu và phân tích trình tự gien của vi-rút Cúm A/H5N1

trong nghiên cứu, với 3 clade khác nhau, chiếm đa số là clade 2.3.2.1c (22 chủng),

- Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 phân lập từ thực địa có sự phù hợp di truyền

sau đó là clade 1.1.2 (3 chủng) và clade 2.3.2.1a (1 chủng).

cao với các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 sử dụng trong công cường độc đánh giá hiệu

quả của vắc-xin (96,1 - 99,1%) và sử dụng trong sản xuất vắc-xin (91,3 - 96%).

- Vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt tiêu chuẩn an toàn sau khi tiêm phòng cho đàn

 Hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2

- Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có hiệu quả bảo hộ rất cao đối với vi-rút Cúm gia

gà, vịt và vịt trời.

cầm thuộc clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c trên gà, vịt và vịt trời. Đối với gà chỉ

cần tiêm 1 mũi ở thời điểm 2 tuần tuổi; đối với vịt và vịt trời phải tiêm phòng 2 mũi,

ở thời điểm 2 tuần và tiêm lặp lại sau 2 tuần kể từ ngày tiêm mũi 1.

- Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng làm giảm mạnh sự bài thải chủng vi-rút

126

- Thời gian miễn dịch bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên đàn gà và vịt

Cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao khi công độc.

được tiêm phòng tối thiểu là 6 tháng, không chỉ ở những vịt có hiệu giá kháng thể

trung bình >4log2, mà cả ở những vịt có hiệu giá kháng thể thấp hơn 4log2.

4.2 Đề nghị

- Cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu về sự lưu hành và biến đổi di truyền

của vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 theo thời gian và khu vực chăn nuôi trọng điểm

nhằm dự báo khả năng biến đổi kháng nguyên, làm cơ sở cho các nghiên cứu vắc-

xin.

- Tiếp tục đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 với các chủng

vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, H5N6 lưu hành trên thực địa theo thời gian nhằm

định hướng việc chọn lựa vắc-xin phù hợp.

DANH MỤC

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Trần Xuân Hạnh, Nguyễn Văn Dung, Quách Vô Ngôn, Huỳnh Tấn Phát, 2016.

Sự liên hệ kháng nguyên giữa chủng vi-rút vắc-xin Cúm CDC-RG30 với các

chủng vi-rút Cúm H5N1 clade 1.1, 2.3.21c. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y,

Số 1/2016, trang 11-17.

2. H Huỳnh Tấn Phát, Nguyễn Văn Dung, Đỗ Thanh Thúy, Tô Thị Huệ, Quách Vô

Ngôn, Đặng Minh Hải, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Phạm Quang

Thái, 2017. Khả năng bảo hộ của gà nhận được miễn dịch từ mẹ và miễn dịch

do tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y; số

5/2017, trang 24-33.

3. Huỳnh Tấn Phát, Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Văn Dung, Đỗ Thanh Thúy,

Nguyễn Thiên Thu, Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, 2020. Đánh giá khả

năng phòng bệnh của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời nuôi, chống lại vi-

rút Cúm A/H5N1, clade 2.3.2.1c. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y; số 1/2020,

trang 16-22.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abbas M.A., Spackman E., Fouchier F., Smith D., Ahmed Z., Siddique N., Sarmento L., Naeem K., McKinley K.T., Hameed A., Rehmani S và Swayne D.E., 2011. H7 avian influenza virus vaccines protect chickens against challenge with antigenically diverse isolates. Vaccine 29:7424-7429.

2. Ahlquist P. 2002. RNA-dependent RNA polymerases, virus and RNA silencing. Science 296, 1270-1273.

3. Alexander D.J., 2007. An overview of the epidemiology of avian influenza, Vaccine 25: 5637-5644.

4. Aoki F.Y., Boivin G and Robert N., 2007. Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir, Antiviral therapy, Review, 12(4), pp. 603-616

5. Baigent S.J., MacCauley J.W., 2001. Glycosylation of haemagglutinin and stalk- length of neuraminidase combine to regulate the grow of avian influenza virus in tissue culture. Virus Research 79:177-185.

6. Beard C.W., 1998. Avian Influenza. In Foreign Animal Diseases. Richmond, VA: United States Animal Health Association, 1998; 71-80.

7. Beato M.S., Toffan A., 2007. A conventional, inactivated oil emulsion vaccine suppresses shedding and prevents viral meat colonisation in commercial (Pekin) ducks challenged with HPAI H5N1. Vaccin Vol25 pp:4064-4072.

8. Berkhoff, E.G., de Wit, E., Geelhoed-Mieras, M.M., Boon, A.C., Symons, J., Fouchier, R.A., Osterhaus, A.D. and Rimmelzwaan, G.F., 2005. Functional constraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxic T lymphocytes. J. Virol.79: 11239-11246.

9. Boliar S. and Chambers T.M, 2010. A new strategy of immune evasion by influenza A virus: Inhibition of monocyte differentiation into dendritic cells, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol 136, pp 201-210.

10. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2016), Thông tư số 07/2016/TT- BNN, ngày 31/5/2016, Quy định về phòng chống dịch bệnh động vật trên cạn.

11. Breen M., Nogales A., Baker S.F. and Sorrido L.M, 2016. Replication Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. Acdemic Editor.

12. Bublot M, Pritchard N, Swayne DE, Selleck P, Karaca K, Suarez DL, Audonnet J.C. and Mickle T.R, 2006. Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza. Ann N Y Acad Sci. 2006 Oct;1081:193-201. doi: 10.1196/annals.1373.023. PMID: 17135511.

13. Bùi Quang Anh và Văn Đặng Kỳ, 2004. Bệnh Cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập XI, số 3-2004, trang 69-75.

14. Campell D.J. and Koch M.A., 2011. Phenotypic and functional specialization of FOXP3+ regulatory T, Nat Rev Immunol 11(2): 119-130.

15. Carolien, E., M. Kreijtz and Rimmelzwaan G.F., 2012. Evasion of Influenza A Viruses from Innate and Adaptive, Immune Responses Viruses,4, 1438-1476; doi:10.3390/v4091438.

16. Carragher D.M., Denise A., Moquin A., Hartson L. and Randall T.D., 2008. A Novel Role for Non-Neutralizing Antibodies against Nucleoprotein in Facilitating Resistance to Influenza Virus, J Immunol, 181 (6) 4168-4176.

17. Carrel M.A, Emch M., Tung Nguyen and Wan X.F., 2012. Population- enviroment drivers of H5N1 avian influenza molecular change in Vietnam, Health Place, 18 (5), pp 1122-1131

18. Castrucci M.R. and Kawaoka Y, 1993. Genetic reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs. Virology, 193, 503-506.

19. CDC, 2020. Type A Viruses. Influenza https://www.cdc.gov/flu/avianflu/influenza-a-virus-subtypes.htm

20. Conenello G.M., Tisoncik J.R., Rosenzweig E., Varga Z.T., Palese P., Katze M.G., 2011. A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza Avirus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo. J. Virol., 85:652-662.

21. Conenello GM, Zamarin D., Perrone LA., Tumpey T., Palese P., 2007. A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence. PLoS Pathog 3(10): 1414-1421.

22. Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương 1 (2013). Kết quả khảo nghiệm vắc-xin vô hoạt cúm gia cầm tái tổ hợp phân type H5N1, chủng Re-6. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1), trang 16-21.

23. Creanga A., Diep Thi Nguyen, Hoa Thi Đo, Hoang Dang Nguyen, Vui Thi Dam, Ha T Nguyen, Tung Nguyen, Gerloff N., Jang Y., Thor S., Jone J., Simpson N., Shu B., Berman L., David C.T., Lindstroma S., Klimov A. and Donis R.O, 2013. Emergence of multiple clade 2.3.2.1 influenza A/(H5N1) virus subgroups in Vietnam and detection of novel reassortansts. Virology 444: 12-20.

24. Criado MF, Lee D.H., Spackman E., Wan X.F. and Swayne D.E., 2020. Cross- protection by inactivated H5 prepandemic vaccine seed strains against diverse goose/Guangdong lineage H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Virol 94: e00720-20. https://doi.org/10.1128/JVI .00720-20>.

25. Cục Thú y, 2014. Công văn số 1466/TY- DT, ngày 28/8/2014 thông báo kết quả giải trình tự gienvi-rút Cúm gia cầm và hiệu lực vắc-xin Cúm gia cầm.

26. Cục Thú y, 2014. Quy trình xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm (Phát hiện M, H5, N1) bằng phương pháp Real time RT-PCR.

27. Cục Thú y, 2014.Công văn số 31/TY- DT, ngày 06/01/2014 về lưu hành vi-rút Cúm gia cầm và Lở mồng long móng.

28. Cục Thú y, 2015. Công văn số 371/TY- DT, ngày 06/3/2015 về việc thông báo kết quả giải trình tự gien và khảo sát vi-rút Cúm gia cầm, lưu hành vi-rút LMLM năm 2015.

29. Cục Thú y, 2016. Công văn số 262/TY- DT, ngày 22/2/2016 về việc thông báo lưu hành vi-rút LMLM, Cúm gia cầm, Tai xanh và hướng dẫn sử dụng vắc- xin năm 2016.

30. Cục Thú y, 2017. Công văn số 2904/TY-DT, ngày 28 tháng 12 năm 2017 về thông báo lưu hành vi-rút Cúm gia cầm, tai xanh và hướng dẫn sử dụng vắc - xin năm 2017

31. Cục Thú y, 2020. Công văn số 2116/TY-DT, ngày 1 tháng 12 năm 2020 về Cập nhật thông tin về lưu hành vi-rút Cúm gia cầm, Lở mồm long móng, Tai xanh và khuyến cáo sử dụng vắc-xin. Cha R.M., Smith D., Eric S., Ruben D., Tung N., Hoang D.N., Hoa T.D., Ken Inui, Suarez D.L., Swayne D.E. and Mary Pantin-Jackwood, 2013. Suboptimal protection against H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses from Vietnam in ducks vaccinated with commercial poultry vaccines.

32. Cục Thú y, 2020. Công văn số 37/TY-DT, ngày 10 tháng 1 năm 2020 về Cập nhật thông tin về lưu hành vi-rút Cúm gia cầm, Lở mồm long móng, Tai xanh và khuyến cáo sử dụng vắc-xin.

33. Chen H., 2009. H5N1 avian influenza in China. Science in China. Series C, Life science 52: 419-427.

34. Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P., Zhang L., Liu Z., Webster R.G. and Yu.K., 2004. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:10452-10457.

35. Chen H., Li K. S. and Wang J., 2006. Establish of multipe sublinneages of H5N1 influenza virus in Asia, Implications for pandemic control. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States o America, 103 : 1306-1312.

36. Chen H., Smith G.J., Li K.S.,Wang J., Fan X.H., Rayner J.M., Vijaykrishna D., Zhang J.X., Zhang L.J., Guo C.T., Cheung C.L., Xu K.M., Duan L., Huang K., Qin K., Leung Y.H., WuW.L., Lu H.R., Chen Y., Xia N.S., Naipospos T.S., Yuen K.Y., Hassan S.S., Bahri S., Nguyen T.D., Webster R.G., Peiris J.S., Guan Y., 2006. Establishment of multiple sublineages of

H5N1 influenzavirus in Asia: implications for pandemic control. Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 2845-2850.

37. Chen L.M., Davis C.T., Zhou H., Cox N.J., Donis R.O., 2008. Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses. PLoS Pathog 4(5): e1000072.

38. Chen Y., Wang C.j., S.H. Lin S.Y., Li., Xu F., 2016. Interleukin-35 is upregulated in response to influenza virus infection and secondary bacterial pneumonia. DOI: 10.1016/j.cyto.2016.01.016

39. Chen Z., Matsuo K., Asanuma H., Takahashi H., Iwasaki T., Suzuki Y., Aizawa C., Kurata T and Tamura S., 1999. Enhanced protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with both HA and NA - expressing DNAs. Vaccine 1999;17:653-662

40. De Vriese J., Steensels M, Palya V., Gardin Y., Dorsey K., Lambrecht B. and Van den Berg T., 2010. Passive Protection Afforded by Maternally-Derived Antibodies in Chickens and the Antibodies' Interference with the Protection Elicited by Avian Influenza-Inactivated Vaccines in Progeny. Avian Diseases, 54(1), 246-252.

41. Doherty, P.C., Webby R.G. and Thomas P.G., 2006. Influenza and the challenge for immunology. Nature immunology, Review, 7(3), pp, 449-455.

42. Domselaar R.V., Bovenschen N., 2011. Cell death-independent functions of granzymes: hit viruses where it hurts. Rev Med Virol, 21(5):301-314. DOI: 10.1002/rmv.697

43. Ducatez, M.F., Olinger C.M., Owoade A.A., Tarnagda Z., Tahita M.C, Sow A., De Landtsheer S., Ammerlaan S., Ouedraogo J.B, Osterhaus A.D., Fouchier R.A and Muller C.P., 2007. Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in western Africa. J. Gen. Virol. 88, 2297-2306

44. Farsad A. S., Malekzadeh-Shafaroudi S., Moshtaghi N., Fotouhi F. and Zibaee S,. 2016. Expression of HA1 antigen of H5N1 influenza virus as a potent candidate for vaccine in bacterial system, Iran J Vet Res, 17(4), pp. 237-242.

45. Frace A.M., Klimov A.I., Rowe T., Black R.A. and Katz J.M., 1999. Modi®ed M2 proteins produce heterotypic immunity against Influenza A virus. Vaccine 1999;17:2237±44

46. Gambotto A., Barratt-Boyes S.M, de Jong M.D, Neumann G. and Kawaoka Y., 2008. Human infection with highly pantogenic H5N1 influenza virus. Lanef 371(9622): 1464-1475.

47. Ge J., An Q., Gao D., Liu Y. and Ping W. (2016). Construction of recombinant baculoviruses expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza and research on the immunogenicity, Sci Rep, 6, pp. 24290.

48. GeurtsvanKessel C.H., Bergen I.M., Muskens F. and Boon L., 2009 .Both Conventional and Interferon Killer Dendritic Cells Have Antigen-Presenting Capacity during Influenza Virus Infection, PLoS One, 4(9): e7187.

49. Guan Y., Peiris J.S, Lipatov A.S., Ellis T.M, Dyrting K.C. and Krauss S., 2002. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR, Proc Nal Acad Sci, USA 99: 8950-8955

50. Guobin Tiana, Suhua Zhang, Yanbing Li, Zhigao Bu, Peihong Liu, Jinping Zhou, Chengjun Li, Jianzhong Shi, Kangzhen Yua, Hualan Chena, 2005. Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics.. Virology 341 (2005) 153-162.

51. Hayward A.C., Wang L., Goonetilleke N., Bermingham A., 2015. Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study. Am J Respir Crit Care Med, 191 (12):1422- 1431. doi: 10.1164/rccm.201411-1988OC

52. Horimoto T. and Kawaoka K., 2006. Stratergies for developing vaccines against H5N1 influenza A Viruses, Trends in molecular medicine, Review, 12(11), pp.506-514.

53. Hồ Phước Thành, 2016. Phân tích yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 nhánh 2.3.2.1c và đánh giá kháng thể sau tiêm phòng vắc-xin Re-6 ở các tỉnh miền Đông Nam bộ. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

54. Hồ Thị Việt Thu, 2012. So sánh hiệu quả các loại vắc xin và đường cấp vắc- xin phòng bệnh Newcastle trên gà, Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ.

55. Hussein H. A., Ahmed B. M., Aly S. M., El-Deeb A. H., El-Sanousi A. A., Huynh H.T.T., Truong L.T., Meeyam T., Le H.T. and Punyapornwithaya V, 2019. Individual and flock immunity responses of naïve ducks on smallholder farms after vaccination with H5N1 Avian Influenza vaccine: a study in a province of the Mekong Delta, Vietnam. PeerJ 7:e6268.

56. Jang J. W., Lee C.Y., Kim I.H., Choi J.G., Lee Y.J, Yuk S.S. and Lee J.H., 2017. Optimized clade 2.3.2.1c H5N1 recombinant-vaccine strains against highly pathogenic avian influenza, J Vet Sci, 18(S1):299-306.

57. Johansson B.E., Bucher D.J., Kilbourne E.D., 1989. Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce constrating types of immunity to infection. J Virol (63):1239-1246.

58. Kang Y.M., Cho H.K. and Kim K.M., 2020. Protection of layers and breeders against homologous or heterologous HPAIv by vaccines from Korean national antigen bank. Scientific Reports volume 10, 9436 .

(2005) Characterization of

59. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R.A, the hemagglutinin and Osterhaus AD, neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta Virol 49(4):

60. Kilany W.H., Ali A., El-Deeb A., 2016. A Dose-Response Study of Inactivated Low Pathogenic Avian Influenza H9N2 Virus in Specific- Pathogen-Free and Commercial Broiler Chickens. Avian Diseases 60(1s): 256-261. DOI:10.1637/11143-050815-Reg.

61. Kim J. K., Kayali G, Walker D., Forrest H.L., Griffin Y.S., Rubrum A. and Webster R.G., 2010. Puzzling inefficiency of H5N1 influenza vaccines in Egyptian poultry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(24), 11044-11049.

62. Korteweg C. and Gu J., 2008. Pathology, molecular biology and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) infection in humans. Am J Pathol, 172:1155- 1170.

63. Kreijtz J.H., Fouchier R.M. and Rimmelzwaan G.F., 2011. Immune responses to influenza virus infection, Virus Res, 162(1-2):19-30.

64. Kuchipudi S.V., Tellabati M., Sebastian S., Jansen C., Vervelde L. and Kin- Chow Chang, 2014. Highly pathogenic avian influenza virus infection in chickens but not ducks is associated with elevated host immune and pro- inflammatory responses., Veterinary Research , 45:118.

65. Lee C.W., Senne D.A. and Suarez D.L., 2004. Effect of vaccine use in the evolution of Mexican lineage H5N2 avian influenza virus. J. Virol. 78, 8372- 8381.

66. Lee D.H., Park J.K., Kwon J.H., Yuk S.S. and Jang Y., 2013. Efficacy of single dose of a bivalent vaccine containing inactivated Newcastle disease virus and reassortant highly pathogenic avian influenza H5N1 virus against lethal HPAI and NDV infection in chickens, PLoS One, 8 (3): e58186

67. Lee M.S., Deng M.C., Lin Y.J., Chang C.Y., Shieh H.K., Shiau J.Z. and Huang, C.C., 2007. Characterization of an H5N1 avian influenza virus from Taiwan. Vet. Microbiol. 124, 193-201.

68. Leung Y.H.C., Luk G., Guan Y. and Peiris M., 2013. Experimental challenge of chicken vaccinated with commercially available H5 vaccines reveals loss of protection to some highly pathogenic avian influenza H5N1 strains circulating in Hong Kong/China. Vaccine 31:3536-3542.

69. Lê Thanh Hòa, 2006. Chiến lược nghiên cứu ứng dụng vi-rút vector tái tổ hợp trong sản xuất vắc-xin thế hệ mới; Tạp chí công nghệ sinh học, 4(4), tr.397- 416;

70. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng và ctv, 2008. Vi-rút cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên- miễn dịch-vắc-xin, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6 (4A), tr 529-553.

71. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải, 2006. Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch của vi-rút cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vắc-xin cúm A/H5N1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 291-296.

72. Lê Trần Bình (2007). Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc-xin Cúm A/H5N1 cho gia cầm”, Trung tâm thông tin và Tư liệu Quốc gia, Bộ Khoa học và Công nghệ.

73. Lê Văn Năm (2004). Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sáng và bệnh tích đại thể bệnh Cúm gia cầm tại một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI (1), Trang 86-90.

74. Li J., Hou G., Wang Y., Wang S., Cheng S., Peng C., 2018. Protective efficacy of an inactivated chimeric H5 avian influenza vaccine against H5 highly pathogenic avian influenza virus clades 2.3.4.4 and 2.3.2.1. J Gen Virol 99(12):1600-1607. doi: 10.1099/jgv.0.001140

75. Liu M., Wood J.M., Ellis T.M., Krauss S., 2003. Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics. Virology 314(2):580-590. DOI:10.1016/S0042-6822(03)00458-6

76. Magor K.E., Warr G.W, Bando Y., Middleton D.L. and Higgins D.A., 1998 Secretory immune system of the duck (Anas platyrhynchos). Identification and expression of the genes encoding IgA and IgM heavy chains. Eur J Immunol 1998;28:1063±8

77. McNulty M.S., Allan G.M. and Adair B.M., 1986. Efecacy of avian influenza neuraminidase-specific vaccines in chickens. Avian Pathol 1986;15:107±15.

78. Megan R., Barbera W., Jerry R., Aldridge J.B., Webster R.G. and Katharine E. M.,2010. Association of RIG-I with innate immunity of ducks to influenza. PNAS March 30, 2010 107 (13) 5913-5918.

79. Murphy B.R. and Webster R.G., 1996. Orthomyxoviruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: 1397-1445.

80. Mustafa Hamad,

Ola Hassanin, Omar Amen, Mohamed Mahmoud, Mostafa Saif-Edin, 2018. Effectiveness of different avian influenza (H5) vaccination regimens in layer chickens on the humoral immune response

immune marker. Veterinary Research and interferonalpha signalling Communications 2018.

81. Nomura N., Sakoda Y, Endo M., Yoshida H., Yamamoto N., Okamasu M., Sukarai K., Nam V.H., Long V. N., Huy D.C., Tien N. T. and Kida H., 2012. Characterization of avian influenza viruses isolated from domestic ducks in Vietnam in 2009 and 2010, 2012. Arch Virol 157:247-257.

82. Nguyễn Tiến Dũng, 2008. Vài nét về vi-rút Cúm gia cầm H5N1. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập XV, số 4-2008, trang 80-86.

83. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thế Vinh, Robert G.Webster, Yi Guan, J.S Malik Peiris và Gavin J.D Smith (2008). Sự đa dạng các dòng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam từ 2005-2007. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, (4), trang 9-16.

84. Nguyễn Tùng, 2013. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi-rút Cúm A/H5N1 nhánh 7 phân lập ở Việt Nam. Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Nông Nghiệp 1, Hà Nội.

85. Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012. Xác định các nhóm kháng nguyên 1.1 và 2.3.2.1 của vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện mới tại Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền và phả hệ gene Hemaglutinin (H5) giai đoạn 2004-201. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 02, 2012.

86. Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp, 2006. Nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG -14 tại Viện vắc-xin và sinh phẩm y tế. Tạp chí y học dự phòng, 5 (84),. 5-10.

87. Nguyễn Văn Cảm và Nguyễn Tùng, 2011. Kết quả công cường độc gà, vịt, ngan sau khi dùng vắc-xin cúm gia cầm tái tổ hợp H5N1 Re-5 của Trung Quốc. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 18 (2), trang 8-12.

88. Nguyễn Văn Dung, 2007. Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng vi-rút Cúm gia cầm NIBRG-14 subtyp H5N1. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

89. OIE, 2020. Influenza A Cleavage Sites.

90. OIE. 2018. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, Chapter 3.3.4. Avian influenza, p 821-843. OIE, Paris, France.

91. OIE., 2009. Avian influenza. Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals. Available: http://www.oie.int.

92. Okamasu M., Nishi T., Nomura N., Yamamoto N., Sokoda Y., Sakurai K., Huy D.C., Long P.T., Long V.N., Nam V.H., Tien N.T., Toshida R., Takada A. and Kida H., 2013. The genetic and antigenic diversity of avian influenza viruses isolated from domestic dicks, Muscovy dicks and chickens in northern and southern Vietnam, 2010-2012. Virus Genes (2013) 47:317-329.

93. Palese P., 2007. Orthomyxoviridae chapter 47, in Fields Virology edition 5. D.M. Knipe and P.M. Howly, Lippincott Williams & Wilkins and Wolters Kluwer Health: Philadelphia:1648-1688.

94. Peyre M., Fusheng G. and Roger F., 2009. Avian influenza vaccines: a practical review in relation to their alication in the field with a focus on the Asian experience. Epidemilogy and infectious,137:1-21.

95. Pfeiffer D.U., 2011. Implications of global and regional patterns of highly pathogenic avian influenza virus A/H5N1 clades for risk management. The Veterinary Journal, doi:10.1016/j.tvjl.2010.12.022

96. Pichlmair A., Schulz O., Tan C.P. and Weber F., 2006. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates, Science 10;314(5801):997-1001.

97. Phan Chí Tạo và Trần Ngọc Bích, 2016. Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch đối với 2 loại vaccine cúm gia cầm H5N1 trên vịt tại Hậu Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 44b: 127-131.

98. Qiao C., Tian G. and Yiang Y., 2006. Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China. Annals of the New York Academy of Sciences, 1081:182-192.

99. Rambaut A., Pybus O.G, Nelson M.I., Viboud C., Taubenberger J.K. and Holmes E.C, 2008. The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus, Nature, vol 453, pp 615-609

100. Riks Maas, Sigrid Rosema, and Diana van Zoelen & Sandra Venema, 2011. Maternal immunity against avian influenza H5N1 in chickens: limited protection and interference with vaccine efficacy, Avian Pathology, 40:1, 87- 92, DOI: 10.1080/03079457.2010.541226.

101. Robert van Domselaar and Niels Bovenschen, 2011. Cell death-independent functions of granzymes: hit viruses where it hurts, Rev Med Virol 21(5):301- 314.

102. Rohaim M. A., Arafa A. A. and Gadalla, M. R., 2016. Protective efficacy of a prime-boost protocol using H5-DNA plasmid as prime and inactivated H5N2 vaccine as the booster against the Egyptian avian influenza challenge virus, Acta Virol, 60(3), pp. 307-15.

103. Rowe T, Abernathy R.A, Hu-Primmer J., Lu X., Lim W., Fukuda K., Cox N.J.and Katz J.M., 1999. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol 37:937-943.

104. Russell P.H, 1993. Newcastle Disease virus replication in the Harderian gland stimulates lacrimal IgA the yolk sac provides early lacrimal IgG. Vet Immunol Immunopathol 1993;37:151±63

105. Salzberg S.L, 2007. Genome Analysis Linking Recent European and Afrian Influenza H5N1 Viruses. Emerg Infect Dis, 13:713-718

106. Saranya S., Shaima B., Alison B., Katja H., Walt A., William C., Thomas B. and Wendy B, 2013. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza, Nature medicine,vol 19.

107. Scholtissek C., Stech J., Krauss S. and Webster R.G., 2002. Cooperation between the heamagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses. J Virol, 76:1781-1796.

108. SCIRO, 2010. Sequencing of Avian Influenza. Training workshop Australian Animal Health Laboratory, SCIRO-Australia.

poultry markets. 2516-2525. (6): 75 J 109. Seo S.H., Webster R.G., 2001. Cross-reactive, cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in Hong Kong doi: virol, 10.1128/JVI.75.6.2516-2525.2001

110. Shaimaa Talat, Reham R, Abouelmaatti, Rafa A. and Mohamed M., 2020. Comparison of the Effectiveness of Two Different Vaccination Regimes for Avian Influenza H9N2 in Broiler Chicken. Animals 2020, 10, 1875; doi:10.3390/ani10101875.

111. Sharma K., Tripathi S., Ranjan P., Kumar P., Garten R. and Deyde V., 2011. Influenza A Virus Nucleoprotein Exploits Hsp40 to Inhibit PKR Activation, PLOS. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020215.

112. Simmons C.P., Bernasconi N.L, Suguitan A.L, Mills K., Ward J.M., Chau N.V, Hien T.T, Sallusto F, Farrar J., Lanzavecchia A. and Subbarao K., 2007. Prophylactic and therapeutic efficacy of human monoclonal antibodies against H5N1 influenza. PLoS Med 4(5): e178.

113. Sims L.D., Domenech J., Benigno C., Kahn S., Kamata A., Lubroth J., Martin V. and Roeder P., 2005. Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia. Vet Rec 157(6): 159-164. Review.

protein. 114. Slepushkin, V.A., Katz J.M, Black R.A, Gamble W.C., Rota P.A. and Cox N.J, 1995. Protection of mice against Influenza A virus challenge by vaccination with Vaccine baculovirusexpressed M2 1995;13:1399±402.

115. Spackman E, Swayne D.E, Pantin-Jackwood M.J., Wan X.F., Torchetti M.K., Hassan M. and Suarez D.L., 2014. Variation in protection of four divergent avian influenza virus vaccine seed strains against eight clade 2.2.1 and 2.2.1.1 Egyptian H5N1 high pathogenicity variants in poultry. Influenza Other Respir Viruses 8:654 - 662.https://doi.org/10.1111/irv .12290.

116. Sturm-Ramirez K.M., Hulse-Post D.J., Govorkova D.A, Humberd J., Seiler P., Puthavathana P., Buranathai C., Nguyen T.D, Chaisingh A., Chen H., Guan Y., Peiris J.S. and Webster R.G., 2005. Are ducks contributing to the endemicity of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia. J. Virol. 79 (17), 11269-11279.

117. Suarez D.L. and Schultz-Cherry S., 2000. Immunology of avian influenza virus: a review. Dev Comp Immunol, 24: 269-283.

influenza. Blackwell Publishing Allrights 118. Swayne D.E, 2008. Avian reserverved. USA.611.

119. Swayne D.E. and Pantin-Jackwood M.J., 2006. Pathogenicity of avian influenza viruses in poultry. Dev. Biol. (Basel) 124:61-67.

120. Swayne D.E., J.R. Beck, M/ Garcia, H.D.Stone, 1999. Influence of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines. Avian Pathol. 28, 245-255.

121. Swayne D.E., Lee C.W., Spackman E., 2007. Inactivated North American and European H5N2 avian influenza virus vaccines protect chickens from Asian H5N1 high pathogenicity avian influenza virus. Avian Pathology vol35 pp:141-146. https://doi.org/10.1080/03079450600597956.

122. Swayne, D.E., Garcia M., Beck J.R, Kinney N. and Suarez D.L., 2000. Protection against diverse highly pathogenic H5 avian influenza viruses in chickens immunized with a recombinant fowlpox vaccine containing an H5 avian influenza hemagglutinin gene insert. Vaccine 18, 1088-1095.

Virology 153-162. genetics. 341(1): 123. Tian G., Zhang S., Li Y., Bu Z., Liu P., Zhou J., 2005. Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse doi: 10.1016/j.virol.2005.07.011.

124. Tiền Ngọc Tiên và Lý Thị Liên Khai, 2017. Sự lưu hành và biến đổi di truyền của vi-rút Cúm A/H5N1 ở Việt Nam tại một số tỉnh vùng đồng bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 24 (3), trang 5-13.

125. Tiền Ngọc Tiên, 2020. Khảo sát đặc tính gây bệnh và biến đổi di truyền của vi-rút Cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại đồng bằng sông Cửu Long giai đoạn 2014-2016. Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Cần Thơ.

126. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN số 8400-26:2014 về quy trình chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm H5N1.

127. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN số 8685-9:2014 về quy trình kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm.

128. Tô Long Thành, 2006. Thông tin cập nhật về bệnh Cúm gia cầm và vắc-xin phòng chống. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XIII, (1), trang 66-71.

129. Trần Ngọc Bích, Nguyễn Tấn Rõ, Nguyễn Phúc Khánh và Trần Thị Hồng Liễu, 2014. Tạp chí khoa học kỹ thuật, Trường Đại học Cần Thơ, Nông nghiệp (2014)(2): 128-132.

130. Tumpey T.M., Suarez, D.L., Perkins, L.E., Senne, D.A., Lee, J.G., Lee, Y.J., Mo, I.P., Sung, H.W., Swayne, D.E., 2002. Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat. J. Virol. 76, 6344–6355.

131. Thontiravong A., Kitikoon P., Wannaratana S, Tantilertcharoen S., Tuanudom R., Pakpinyo S., Sasipreeyajan J., Oraveerakul K. and Amonsin A., 2012. Quail as a potential mixing vessel for the gengieneration of new reassortant influenza A viruses. Vet. Microbiol.

132. Throsby M., Alard P., Cox F., Guan Y., Reiris M., Bakler A., 2008. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PLoS One 3 (12): e 3942. doi: 10.1371/journal.pone.0003942. Epub 2008 Dec 16.

133. Trương Văn Dung, 2008. Những nghiên cứu đã đạt được về bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, (4), trang 5-9.

vaccine. Virology 134. Van der Goot J.A., Van Boven M., Stegeman A., Van de Water S.G, de Jong M.C. and Koch G., 2008. Transmission of highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in Pekin ducks is significantly reduced by a genetically distant https://doi.org/10.1016/j.virol 382:91-97. H5N2 .2008.08.037.

135. Van der Goot, J.A., Koch G, De Jong M.C. and Van Boven M., 2005. Quantification of the effect of vaccination on transmission of avian influenza (H7N7) in chickens. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 18141-18146.

136. Wagner R. and Klenk H., 2002. Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Reviews in medical virology, 12:159-166.

137. Wallace, R.G., Hodac, H., Lathrop, R.H., Fitch,W.M., 2007. A statistical phylogeography of influenza A H5N1. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 4473- 4478.

138. Wang X.F., Nguyen T. and Zhao Z., 2008. Evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza virus on Vietnam between 2001-2007. Plos one, 3: 3462.

139. Wang Y., Davidson I., Fouchier R. and Spackman E., 2016. Antigenic cartography of H9 avian influenza virus and its application to vaccine selection. Avian Dis 60:218 -225.https://doi.org/10.1637/11087-041015-Reg

140. Wang Z., Loh L., Kedzierski L., Kedzierska, 2016. Avian Influenza Viruses, Immunol, 7:60. Immunity. Front Inflammation, and CD8+ T Cell doi: 10.3389/fimmu.2016.00060

141. Wasilenko J.L., Lee C.W., Sarmento L., Spackman E., Suarez D.L and Patin- jackwood M.J., 2008. NP, PB1 and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens. J Virol, 82:4544- 4553.

142. Webster R.G., 1998. Influenza: an emerging disease. Emerg Infect Dis, 4:436- 441.

143. Webster R.G., Ebby R.J., Hoffmann E., Rondenberg J. and Kumar M., 2006. The immunogenicity and efficacy against H5N1 challenge of reverse genetics-derived H5N3 influenza vaccine in ducks and chickens, Virology 351 (2006) 303-311

144. Wiley DC., Wilson I.A. and Skehel J.J., 1981. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature 1981;289:373-381

145. Wu W.L., Chen Y., Wang P., 2008. Antigenic profile of avian H5N1 viruses

in Asia from 2002 to 2007. Journal of virology 82: 1798-1807.

146. Xianying Z. A., Guohua D.A., Liling L., Yanbing L., Jianzhong S., Pucheng C. and Hualan C., 2016. Protective Efficacy of the Inactivated H5N1 Influenza Vaccine Re-6 Against Different Clades of H5N1 Viruses Isolated in China and the Democratic People’s Republic of Korea. Avian diseases 60:238-240, 2016.

147. Zeng X., Deng G., Li Y., 2016. Protective Efficacy of the Inactivated H5N1 Influenza Vaccine Re-6 Against Different Clades of H5N1 Viruses Isolated in China and the Democratic People's Republic of Korea. Avian Diseases 60 (1S):238-240. DOI:10.1637/11178-051915-ResNote.

148. Zhao Z.M., Shortridge K.F., Garcia M., Guan Y., Wan X.F., 2008. Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Gen Virol 89(9): 2182-2193.

149. Zhou J.J., Fu J., Fang D.Y., Yan H.J., Tian J., Zhou J.M., Tao J.P., Liang Y., Jiang L.F., 2007. Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza viruses isolated from a human in Guangdong, China. Arch Virol.152(8): 1515-1521.

150. Zhu Q., Yang H., Chen W., Cao W., Zhong G., Jiao P., Deng G., Yu K., Yang C., Bu Z., Kawaoka Y., Chen H (2008) A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens. J Virol 82(1):220-228.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: HƯỚNG DẪN PHÁT HIỆN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL TIME RT - PCR I. Phạm vi áp dụng Qui trình này được áp dụng để phát hiện kháng nguyên cúm gia cầm type A;

PPP

3'

5'

Trình tự

TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG

Cúm A M-4 (CDC)

AAHL H5-11

Cúm A subtype H5

H5-3S (AAHL+Probe HA 2-3)

N1-2 (China)

Cúm A subtype N1

AGACCAGCTACCATGATTGC TGGTCTTGGCCAGACGGTGC TGGACTAGTGGGAGCAGCAT TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC

Cúm A subtype N6

TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC TGAAACCATACCACCCA

subtype H5; N1; H7; N6. II. Khái niệm Mẫu bệnh phẩm được ly trích và tinh sạch thành RNA tinh khiết. RNA này sẽ được sao chép ngược thành cDNA với primer đặc hiệu của virus cúm type A (hay H5, H7; N1; N6). Từ đó, cDNA được khuếch đại nhiều lần và được phát hiện thông qua mật độ quang phát ra từ probe trong các chu kỳ nhiệt. III. KIT - hóa chất - Kit ly trích: Quiagen - Hoá chất pha mix: Quiagen / Invitrogen - Mẫu dò (probe) và primer đặc hiệu cho cúm A, H5, N1, H7, N6 Xét nghiệm

PRIMER / PROBE FAM BHQ1 Probe None None Forward GACCRATCCTGTCACCTCTGAC None None AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA Reverse FAM BHQ1 Probe 1 TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA Probe M1 TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGTG FAM BHQ1 Forward AAACAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATT None None None None Reverse AAAGATAGACCAGCTACCATGATTGC HEX BHQ1 TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA Probe TEX BHQ1 TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA Probe None None Forward ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA None None Reverse FAM BHQ1 Probe None None Forward None None Reverse FAM BHQ1 Probe None None Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None Reverse FAM BHQ1 Probe None None Forward GGATGGGAAGGTYTGGTTGA None None Reverse

CCTCTCCTTGTGMATTTTGATG

Cúm A subtype H7

IV. Sơ đồ chẩn đoán

Mẫu đã được xử lý

Ly trích RNA

Real-time RT-PCR cúm A, H5, N1, H7, N6 (chọn quy trình nhiệt phù hợp với kit sử dụng)

(chquy trình nhiệt phù hợp với kit sử dụng)

Đọc kết quả

Kết quả: Xét nghiệm chỉ có giá trị khi:

+ Đối chứng dương tính: cho giá trị Ct + Mẫu dương tính: Ct ≤ 35

đã biết ( 2) + Mẫu nghi ngờ : Ct > 35

+ Đối chứng âm tính: không có Ct + Mẫu âm tính: không có Ct

V. Các bước tiến hành xét nghiệm

5.1 Chuẩn bị mẫu

Theo hướng dẫn HD 06/XLM

5.2. Ly trích RNA (Thực hiện trong cabinet 2)

Theo hướng dẫn HD 06/LT

5.3 Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (Chuẩn bị trong cabinet 3)

Chuẩn bị primer: Theo hướng dẫn HD 06/HC

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Real Time PCR:

Quiagen one-step RT-PCR kit

Invitrogen superscript 3 qRT- PCR kit

Thành phần

Liều lượng cho 1 phản ứng ((l)

Nước cất 5X buffer MgCl2 (Promega) 25mM dNTP’s (10mM mỗi loại) PPP Enzyme mix Tổng

Liều lượng cho 1 phản ứng ((l) 10.5 5.0 1.2 0.8 1.5 1.0 20.0

Nước cất 2X buffer MgCl2 50mM PPP Enzyme mix Tổng

4,5 12,5 1 1.5 0,5 20.0

Lưu ý: phải chuẩn bị hỗn hợp A trong cabinet số 2 (dùng cho chuẩn bị Master Mix)

+ Chuyển master mix sang cabinet số 3 (dùng cho phân phối ARN)

+ Phân phối hỗn hợp A vào mỗi ống PCR (0.2 ml) dùng cho phản ứng 20l.

+ Thêm 5l ARN đối chứng dương vào ống PCR đối chứng dương và 5l

nước không có Rnase vào đối chứng âm.

+ Thêm 5l sản phẩm RNA đã ly trích vào ống PCR.

+ Chuyển sang phòng PCR.

Lưu ý: phải có 1 pipette dùng riêng cho việc chuyển RNA

5.5 Thực hiện phản ứng PCR:

+ Ly tâm nhanh ống PCR. Đặt ống vào máy PCR

+ Cài đặt chu kỳ nhiệt như sau:

Quiagen one-step RT-PCR kit

Invitrogen superscript 3 qRT-PCR kit

RT

PCR

RT

PCR

1 chu kỳ 500C - 30 phút 950C - 15 phút

40 chu kỳ 950C - 15 giây 600C - 50 giây

1 chu kỳ 500C - 15 phút 950C - 2 phút

40 chu kỳ 950C - 15 giây 600C - 50 giây

VI. Phân tích kết quả:

Xét nghiệm được công nhận khi:

+ Đối chứng dương tính cho giá trị Ct đã biết ( 2)

+ Đối chứng âm tính không có giá trị Ct

+ Mẫu được coi là dương tính khi giá trị Ct ≤ 35

+ Mẫu được coi là nghi ngờ khi giá trị Ct > 35

+ Mẫu được coi là âm tính khi giá trị Ct = 0

Tài liệu tham khảo

- TCVN 8400-26:2014

- Protocol: SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit

Phụ lục 2: HƯỚNG DẪN PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS CÚM

GIA CẦM TYPE A SUBTYPE H5 BẰNG PHẢN ỨNG HA-HI

I. Phạm vi áp dụng

Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu được áp dụng để phát hiện bệnh cúm gia cầm serotype H5 trên gia cầm, thủy cầm chưa tiêm phòng hay xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng trên gia cầm, thủy cầm có tiêm phòng vaccin H5. II. Khái niệm

Bệnh cúm gia cầm do virus cúm gia cầm subtype H5 có kháng nguyên H5 có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà. Khi xâm nhập vào cơ thể sẽ tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên H5. Từ đặc điểm trên sử dụng phản ứng HI (hemaglutination inhibition) dùng kháng thể H5 đặc hiệu để phát hiện kháng thể kháng virus có trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm. III. Phương pháp thực hiện 3.1 Lấy mẫu - xử lý và bảo quản mẫu - Mẫu: Máu gia cầm, thuỷ cầm, chim được tách lấy huyết thanh để kiểm tra. - Cách lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu: theo HD 06/LM và HD 06/XLM 3.2 Thiết bị - Hoá chất Thiết bị - dụng cụ - Tủ an toàn sinh học class II - Tủ lạnh âm (-20oC) đến (-70oC) - Tủ lạnh thường 2oC đến 8oC - Tủ ấm 37oC - Nồi đun cách thủy (water bath) - Máy ly tâm - Máy vortex - Máy li tâm ống nhỏ (microcentrifuge) - Máy lắc đĩa

- Ống eppendorf 1,5 ml - Máng đựng chất phản ứng - Đĩa có đáy chữ V - Micropipette các loại - Đầu tip các cỡ - Đồng hồ đếm thời gian có chuông báo khi kết thúc.

Nguyên liệu, hóa chất - Nước cất - Na2HPO4 - NaH2PO4.H2O - NaCl - HCl - NaOH

- EDTA - Kháng nguyên chuẩn H5N1 (kháng nguyên H5N1 A/Chicken/scot/59) - Men xử lý huyết thanh RDE (Receptor Destroying Enzyme)

- RDE là chất gây biến đổi gen khi khi tiếp xúc qua da, hít hay nuốt phải.

- Hồng cầu gà 3.3 Cảnh báo và lưu ý: IV. Sơ đồ phản ứng Kháng nguyên cần được kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng HA và được pha ở hiệu giá 4HA để dùng trong phản ứng HI. Do đó, để thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, phải thực hiện 2

Phản ứng HA

Phân phối 25 µl PBS các giếng từ cột 1 đến cột 12

Phân phối 25 µl kháng nguyên chuẩn vào giếng

Pha loãng bậc 2 từ giếng 1 đến giếng 11, rút bỏ 25 µl kháng nguyên pha loãng

Thêm vào 25 µl dung dịch PBS / giếng từ cột 1-12

Thêm vào 25 µl dung dịch hồng cầu 1% / giếng từ cột 1- 12

Đọc kết quả và tính lượng kháng nguyên 4 đơn vị HA

Phản ứng HI giai đoạn: tiến hành phản ứng HA; dựa trên kết quả HA để thực hiện phản ứng HI.

Phân phối 25 µl PBS vào tất cả các giếng từ cột 2 -12

Huyết thanh vịt và các loài khác

Phân phối 25 µl huyết thanh cần chẩn đoán đã xử lý vào các giếng cột 1-2 Phân phối 25 µl huyết thanh cần chẩn đoán vào giếng cột 1 -2

Pha loãng bậc 2 từ cột 2 đến cột 11, rút bỏ 25 µl huyết thanh pha loãng

Thêm 25 µl dung dịch KN 4 đơn vị HA vào tất cả các giếng từ cột 1- 11

Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút

Thêm 25 µl dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng

Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút

Đọc kết quả: hiệu giá kháng thể đọc ở giếng huyết thanh có nồng độ pha loãng cuối cùng còn ức chế (ngăn trở) ngưng kết hồng cầu 100%.

Huyết thanh gà V. Các bước tiến hành 5.1 Xử lý huyết thanh bằng RDE (trên các loài không phải gà)

1. Hoàn nguyên RDE bằng PBS vô trùng (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) 2. Pha loãng mẫu huyết thanh bằng dung dịch RDE, một phần mẫu + ba phần RDE (40 µl mẫu + 120 µl RDE) 3. Ủ mẫu ở 37oC qua đêm (18-20 giờ). 4. Đun hỗn hợp mẫu + RDE ở 56oC / 30-60 phút, để nguội. 5. Ủ ở 4o C / 30 phút. Thêm 6 phần PBS, lắc đều. 6. Sau khi xử lý RDE, huyết thanh cần xét nghiệm đã được pha loãng 10 lần. 7. Thêm hồng cầu đặc vào huyết thanh (tỷ lệ 1:20; VD: 25 µl hồng cầu + 500 µl huyết thanh), lắc nhẹ 8. Ủ ở nhiệt độ phòng / 30 phút, ly tâm 1500-2500 vòng/phút trong 2-5 phút 9. Thu lấy huyết thanh đã hấp phụ để xét nghiệm

5.2 Chuẩn bị hồng cầu gà (HC/ RBC) 10% và 1%

1. Chọn 2- 3 con gà khoẻ mạnh 2. Lấy máu 2- 3 con gà trộn lại khoảng 4 - 5 ml, có chất kháng đông (EDTA: 0,1 ml EDTA 10% ~ 1 ml máu)

3. Thêm một lượng tương đương PBS vào máu gà vừa lấy, lắc đều. 4. Ly tâm ở 1500 - 2000 Vòng trong 10 phút. 5. Loại bỏ nước phía trên. 6. Lặp lại 3 lần các bước 3, 4, 5. Sau bước 5 của lần 3, thu hoạch hồng cầu đặc đã được rửa. 7. Pha hồng cầu 1%: 1ml hồng cầu đặc + 99 ml dung dịch PBS (pH 7,2)

5.3 Phản ứng HA

1. Phân phối 25 µl PBS vào các giếng từ cột 1 đến cột 12 2. Phân phối 25µl Kháng nguyên chuẩn vào giếng ở cột 1. 3. Dùng Micropipette trộn đều, hút 25µl chuyển sang cột 2. 4. Lập lại bước 3 đến cột 11, hút bỏ đi 25µl. 5. Giếng ở cột 12 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu. 6. Thêm 25 µl hồng cầu 1% vào các giếng từ cột 1 đến cột 12; lắc nhẹ. 7. Ủ ở nhiệt độ phòng (20-25oC) trong 30 phút 8. Đọc kết quả: Dương tính khi có hạt hồng cầu ngưng kết lấm tấm; âm tính

khi không ngưng kết hồng cầu.

= 1/ 32 Pha 4 HAU/ 25 µl gồm 1 phần kháng nguyên chuẩn và 31 phần PBS

9. Hiệu giá của kháng nguyên (1 HAU - đơn vị ngưng kết hồng cầu) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu ngưng kết (kết quả chỉ được ghi nhận khi hồng cầu ở giếng cột 12 hoàn toàn không ngưng kết ) 5.4 Cách chuẩn bị dung dịch kháng nguyên 4 HAU/25µl cho phản ứng HI. Ví dụ: - Giả sử hiệu giá của kháng nguyên (1 HAU) là 1/ 128 - 4 HAU/ 25 µl = ( 1/ 128 ) x 4 5.5 Phản ứng HI

1. Phân phối 25µl PBS vào các giếng từ cột 2 đến cột 12 2. Phân phối 25µl huyết thanh đã xử lý vào các giếng cột 1 đến cột 2 3. Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách chuyển 25µl huyết thanh từ cột 2 đến cột 11 và bỏ đi 25µl.

4. Phân phối 25µl kháng nguyên 4 HAU vào các giếng từ cột 1 đến cột 11, lắc đều.

5. Ủ ở nhiệt độ phòng (20-25oC) trong 30 phút 6. Thêm 25 µl hồng cầu 1% vào tất cả các giếng 7. Ủ ở nhiệt độ phòng (20-25oC) trong 30 phút 8. Đọc kết quả: Hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh đó có hiện tượng ức chế (ngăn trở) ngưng kết hồng cầu 100%.

9. Kết luận: Mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể kháng virus cúm gia cầm (dương tính) khi có hiệu giá ≥ 1/ 16 (log2 16 =4). Subtype virus dương tính tùy thuộc vào kháng nguyên dùng trong phản ứng HI. Huyết thanh đối chứng âm phải có hiệu giá ≤ 1/4 (log2 4 =2). Cột 11 là cột gồm PBS, kháng nguyên và hồng cầu là đối chứng kháng nguyên phải cho kết quả ngưng kết. Cột 12 là cột gồm PBS và

hồng cầu là đối chứng hồng cầu phải cho kết quả hồng cầu hoàn toàn không bị ngưng kết hồng cầu

Tài liệu tham khảo

- TCVN 8400-26: 2014

Phụ lục 3: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

Using frequencies in TSGA_1 Rows: TC_1 Columns: KQ_1 - + All T1 0 21 21 7,50 13,50 21,00 -7,500 7,500 * -2,739 2,041 * -4,830 4,830 * 7,500 4,167 * T3 15 6 21 7,50 13,50 21,00 7,500 -7,500 * 2,739 -2,041 * 4,830 -4,830 * 7,500 4,167 * All 15 27 42 15,00 27,00 42,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 23,333. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 29,620. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000011 Tabulated statistics: TC_2. KQ_2 Using frequencies in TSGA_2 Rows: TC_2 Columns: KQ_2 - + All T1 0 21 21 8,50 12,50 21,00 -8,500 8,500 *

Bảng 3.5. Tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng trên gà, vịt (+) Cúm A/H5N1 (T1- Ủ rũ, bỏ ăn; T2- Phân xanh trắng; T3- Mào, tích thâm tím; T4- Liệt chân; T5- Xoay vòng, co giật; T6- Xệ cánh; T7- Phù đầu, mặt; T8- Thở khò khè) Tabulated statistics: TC. KQ Using frequencies in TSGA Rows: TC Columns: KQ - + All T1 0 21 21 5,50 15,50 21,00 -5,500 5,500 * -2,345 1,397 * -3,860 3,860 * 5,500 1,952 * T2 11 10 21 5,50 15,50 21,00 5,500 -5,500 * 2,345 -1,397 * 3,860 -3,860 * 5,500 1,952 * All 11 31 42 11,00 31,00 42,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 14,903. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 19,239. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0001648 Tabulated statistics: TC_1. KQ_1

-2,915 2,404 * -5,344 5,344 * 8,500 5,780 * T4 17 4 21 8,50 12,50 21,00 8,500 -8,500 * 2,915 -2,404 * 5,344 -5,344 * 8,500 5,780 * All 17 25 42 17,00 25,00 42,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 28,560. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 36,241. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000 Tabulated statistics: TC_3. KQ_3 Using frequencies in TSGA_3 Rows: TC_3 Columns: KQ_3 - + All T1 0 21 21 8,50 12,50 21,00 -8,500 8,500 * -2,915 2,404 * -5,344 5,344 * 8,500 5,780 * T5 17 4 21 8,50 12,50 21,00 8,500 -8,500 * 2,915 -2,404 * 5,344 -5,344 * 8,500 5,780 * All 17 25 42 17,00 25,00 42,00 * * *

* * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 28,560. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 36,241. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000 Tabulated statistics: TC_4. KQ_4 Using frequencies in TSGA_4 Rows: TC_4 Columns: KQ_4 - + All T1 0 21 21 9 12 21 -9 9 * -3,000 2,598 * -5,612 5,612 * 9,000 6,750 * T6 18 3 21 9 12 21 9 -9 * 3,000 -2,598 * 5,612 -5,612 * 9,000 6,750 * All 18 24 42 18 24 42 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square

Rows: TC_6 Columns: KQ_6 - + All T1 0 21 21 7,50 13,50 21,00 -7,500 7,500 * -2,739 2,041 * -4,830 4,830 * 7,500 4,167 * T8 15 6 21 7,50 13,50 21,00 7,500 -7,500 * 2,739 -2,041 * 4,830 -4,830 * 7,500 4,167 * All 15 27 42 15,00 27,00 42,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 23,333. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 29,620. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000011

Tabulated statistics: TC_2. KQ_2 (TC2=TC Phân xanh trắng; TC 6= Xệ cánh)

Pearson Chi-Square = 31,500. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 40,139. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000 Tabulated statistics: TC_5. KQ_5 Using frequencies in TSGA_5 Rows: TC_5 Columns: KQ_5 - + All T1 0 21 21 8 13 21 -8 8 * -2,828 2,219 * -5,084 5,084 * 8,000 4,923 * T7 16 5 21 8 13 21 8 -8 * 2,828 -2,219 * 5,084 -5,084 * 8,000 4,923 * All 16 26 42 16 26 42 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 25,846. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 32,768. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000002 Tabulated statistics: TC_6. KQ_6 Using frequencies in TSGA_6

Using frequencies in TSGA_2 Rows: TC_2 Columns: KQ_2 - + All T2 11 10 21

14,50 6,50 21,00 -3,500 3,500 * -0,9191 1,3728 * -2,336 2,336 * 0,8448 1,8846 * T6 18 3 21 14,50 6,50 21,00 3,500 -3,500 * 0,9191 -1,3728 * 2,336 -2,336 * 0,8448 1,8846 * All 29 13 42 29,00 13,00 42,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 5,459. DF = 1. P-Value = 0,019 Likelihood Ratio Chi-Square = 5,683. DF = 1. P-Value = 0,017 Fisher's exact test: P-Value = 0,0430710 Tabulated statistics: TC. KQ Using frequencies in TSVIT Rows: TC Columns: KQ - + All T1 0 25 25 6 19 25 -6 6 * -2,449 1,376 * -3,974 3,974 * 6,000 1,895 * T2 12 13 25 6 19 25 6 -6 * 2,449 -1,376 * 3,974 -3,974 * 6,000 1,895 * All 12 38 50

12 38 50 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 15,789. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 20,491. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000857 Tabulated statistics: TC_1. KQ_1 Using frequencies in TSVIT_1 Rows: TC_1 Columns: KQ_1 - + All T1 0 25 25 7,50 17,50 25,00 -7,500 7,500 * -2,739 1,793 * -4,629 4,629 * 7,500 3,214 * T4 15 10 25 7,50 17,50 25,00 7,500 -7,500 * 2,739 -1,793 * 4,629 -4,629 * 7,500 3,214 * All 15 35 50 15,00 35,00 50,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square

Using frequencies in TSVIT_3 Rows: TC_3 Columns: KQ_3 - + All T1 0 25 25 9,50 15,50 25,00 -9,500 9,500 * -3,082 2,413 * -5,536 5,536 * 9,500 5,823 * T6 19 6 25 9,50 15,50 25,00 9,500 -9,500 * 3,082 -2,413 * 5,536 -5,536 * 9,500 5,823 * All 19 31 50 19,00 31,00 50,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 30,645. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 38,852. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000 Tabulated statistics: TC_4. KQ_4 Using frequencies in TSVIT_4 Rows: TC_4 Columns: KQ_4 - + All T1 0 25 25 10 15 25 -10 10 * -3,162 2,582 * -5,774 5,774 *

Pearson Chi-Square = 21,429. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 27,436. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000029 Tabulated statistics: TC_2. KQ_2 Using frequencies in TSVIT_2 Rows: TC_2 Columns: KQ_2 - + All T1 0 25 25 6,50 18,50 25,00 -6,500 6,500 * -2,550 1,511 * -4,191 4,191 * 6,500 2,284 * T5 13 12 25 6,50 18,50 25,00 6,500 -6,500 * 2,550 -1,511 * 4,191 -4,191 * 6,500 2,284 * All 13 37 50 13,00 37,00 50,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 17,568. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 22,688. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000293 Tabulated statistics: TC_3. KQ_3

* * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 30,645. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 38,852. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000

Bảng 3.9. Đánh giá đáp ứng tạo

kháng thể của vắc-xin Navet Fluvac

2 trên gà

Lô TN 2 - SS HG sau tiem mui 1 va sau tiem mui 2 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 30 2,600 6,760 2 30 1,800 3,240 Ratio of standard deviations = 1,444 Ratio of variances = 2,086 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,997. 2,094) (0,993. 4,384) Tests Test

10,000 6,667 * T7 20 5 25 10 15 25 10 -10 * 3,162 -2,582 * 5,774 -5,774 * 10,000 6,667 * All 20 30 50 20 30 50 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 33,333. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 42,281. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000000 Tabulated statistics: TC_5. KQ_5 Using frequencies in TSVIT_5 Rows: TC_5 Columns: KQ_5 - + All T1 0 25 25 9,50 15,50 25,00 -9,500 9,500 * -3,082 2,413 * -5,536 5,536 * 9,500 5,823 * T8 19 6 25 9,50 15,50 25,00 9,500 -9,500 * 3,082 -2,413 * 5,536 -5,536 * 9,500 5,823 * All 19 31 50 19,00 31,00 50,00 * * * * * * * * *

Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 29 29 2,09 0,052 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 30 4,80 2,60 0,47 2 30 7,20 1,80 0,33 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -2,400 95% CI for difference: (-3,559. -1,241) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -4,16 P- Value = 0,000 DF = 51 Bảng 3.11. Đánh giá đáp ứng tạo

kháng thể của vắc-xin Navet Fluvac

2 trên vịt

Sample N Mean StDev SE Mean 1 35 1,30 1,70 0,29 2 25 2,90 1,80 0,36 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -1,600 95% CI for difference: (-2,513. -0,687) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,51 P- Value = 0,001 DF = 58 Both use Pooled StDev = 1,7421 * SS HGKT HI tiem 1 mui sau 3 tuan va tiem 2 mui sau 3 tuan Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 25 1,483 2,200 2 25 1,342 1,800 Ratio of standard deviations = 1,106 Ratio of variances = 1,222 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,734. 1,665) (0,539. 2,774) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 24 24 1,22 0,627 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 25 4,50 2,20 0,44 2 25 2,90 1,80 0,36 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,600 95% CI for difference: (0,457. 2,743)

* SS HGKT HI tiem 1 mui sau khi tiem 2 tuan va 3 tuan sau mui 2 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 35 1,304 1,700 2 25 1,342 1,800 Ratio of standard deviations = 0,972 Ratio of variances = 0,944 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,658. 1,400) (0,433. 1,959) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 34 24 0,94 0,863 Two-Sample T-Test and CI

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,81 P- Value = 0,007 DF = 48 Both use Pooled StDev = 2,0100

Bảng 3.12. Kết quả công cường độc

trên vịt tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2

* SS KQ HI truoc khi cong doc va sau khi cong cuong doc trong cac clade Doi voi clade 2.3.2.1c: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 2,200 4,840 2 15 1,800 3,240 Ratio of standard deviations = 1,222 Ratio of variances = 1,494 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,708. 2,109) (0,502. 4,449) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,49 0,462 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 4,20 2,20 0,57 2 15 6,70 1,80 0,46 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -2,500 95% CI for difference: (-4,003. -0,997)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,41 P- Value = 0,002 DF = 28 Both use Pooled StDev = 2,0100 Doi voi clade 2.3.2.1b: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 2,000 4,000 2 15 1,300 1,690 Ratio of standard deviations = 1,538 Ratio of variances = 2,367 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,891. 2,655) (0,795. 7,050) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 2,37 0,119 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 4,00 2,00 0,52 2 15 6,10 1,30 0,34 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -2,100 95% CI for difference: (-3,362. -0,838) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,41 P- Value = 0,002 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,6867 * SS KQ HI giua cac clade sau khi cong cuong doc Giua clade 2.3.2.1a va clade 2.3.2.1b

Sample N StDev Variance 1 15 1,700 2,890 2 15 1,800 3,240 Ratio of standard deviations = 0,944 Ratio of variances = 0,892 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,547. 1,630) (0,299. 2,657) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,89 0,834 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 4,50 1,70 0,44 2 15 6,70 1,80 0,46 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -2,200 95% CI for difference: (-3,509. -0,891) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,44 P- Value = 0,002 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,7507 Bảng 3.16. Đánh giá độ dài miễn

dịch trên gà sau khi tiêm Navet-

Fluvac 2

* SS KQ KG HI Lo 1 giua cac thang SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 1 va thang 3 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05

Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,700 2,890 2 15 1,300 1,690 Ratio of standard deviations = 1,308 Ratio of variances = 1,710 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,758. 2,257) (0,574. 5,094) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,71 0,327 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 4,50 1,70 0,44 2 15 6,10 1,30 0,34 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -1,600 95% CI for difference: (-2,732. -0,468) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,90 P- Value = 0,007 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,5133 *clade 2.3.2.1a va clade 2.3.2.1c Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics

95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,869. 2,589) (0,755. 6,702) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 2,25 0,141 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,70 1,50 0,39 2 15 5,70 1,00 0,26 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,000 95% CI for difference: (0,047. 1,953) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,15 P- Value = 0,040 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,2748 SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 2 va thang 3 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,800 0,640 2 15 0,600 0,360 Ratio of standard deviations = 1,333 Ratio of variances = 1,778 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,773. 2,301) (0,597. 5,295)

Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,500 2,250 2 15 0,600 0,360 Ratio of standard deviations = 2,500 Ratio of variances = 6,250 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (1,449. 4,315) (2,098. 18,616) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 6,25 0,002 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,70 1,50 0,39 2 15 5,800 0,600 0,15 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,024. 1,776) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,16 P- Value = 0,045 DF = 18 SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 1 va thang 4 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,500 2,250 2 15 1,000 1,000 Ratio of standard deviations = 1,500 Ratio of variances = 2,250

Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,700 0,800 0,21 2 15 5,70 1,00 0,26 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,000 95% CI for difference: (0,323. 1,677) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 3,02 P- Value = 0,005 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,9055 SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 2 va thang 5 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,800 0,640 2 15 0,900 0,810 Ratio of standard deviations = 0,889 Ratio of variances = 0,790 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,515. 1,534) (0,265. 2,353) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,79 0,665 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,700 0,800 0,21 2 15 5,800 0,900 0,23 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,263. 1,537)

Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,78 0,294 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,700 0,800 0,21 2 15 5,800 0,600 0,15 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,371. 1,429) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 3,49 P- Value = 0,002 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,7071 SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 2 va thang 4 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,800 0,640 2 15 1,000 1,000 Ratio of standard deviations = 0,800 Ratio of variances = 0,640 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,464. 1,381) (0,215. 1,906) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,64 0,414 Two-Sample T-Test and CI

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,89 P- Value = 0,007 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,8515 SS KQ KG HI Lo 1 giua thang 2 va thang 6 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,800 0,640 2 15 0,900 0,810 Ratio of standard deviations = 0,889 Ratio of variances = 0,790 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,515. 1,534) (0,265. 2,353) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,79 0,665 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,700 0,800 0,21 2 15 6,000 0,900 0,23 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,700 95% CI for difference: (0,063. 1,337) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,25 P- Value = 0,032 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,8515 * SS KQ KG HI Lo 2 giua cac thang

SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 1 va thang 3 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,900 0,810 2 15 0,500 0,250 Ratio of standard deviations = 1,800 Ratio of variances = 3,240 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (1,043. 3,107) (1,088. 9,651) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 3,24 0,035 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,800 0,900 0,23 2 15 7,600 0,500 0,13 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -0,800 95% CI for difference: (-1,353. -0,247) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,01 P- Value = 0,007 DF = 21 SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 2 va thang 6 Test and CI for Two Variances Method

Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,300 1,690 2 15 0,400 0,160 Ratio of standard deviations = 3,250 Ratio of variances = 10,562 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (1,883. 5,609) (3,546. 31,461) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 10,56 0,000 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,60 1,30 0,34 2 15 6,700 0,400 0,10 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,156. 1,644) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,56 P- Value = 0,021 DF = 16 SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 3 va thang 4 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,500 0,250 2 15 0,400 0,160

Ratio of standard deviations = 1,250 Ratio of variances = 1,562 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,724. 2,157) (0,525. 4,654) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,56 0,414 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,600 0,500 0,13 2 15 7,100 0,400 0,10 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,500 95% CI for difference: (0,161. 0,839) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 3,02 P- Value = 0,005 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,4528 SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 3 va thang 5 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,500 0,250 2 15 1,200 1,440 Ratio of standard deviations = 0,417 Ratio of variances = 0,174 95% Confidence Intervals CI for

Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,241. 0,719) (0,058. 0,517) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,17 0,002 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,600 0,500 0,13 2 15 6,70 1,20 0,31 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,195. 1,605) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,68 P- Value = 0,015 DF = 18 SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 3 va thang 6 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,500 0,250 2 15 0,400 0,160 Ratio of standard deviations = 1,250 Ratio of variances = 1,562 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,724. 2,157) (0,525. 4,654) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,56 0,414

Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,600 0,500 0,13 2 15 6,700 0,400 0,10 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,900 95% CI for difference: (0,561. 1,239) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 5,44 P- Value = 0,000 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,4528 SS KQ KG HI Lo 2 giua thang 4 va thang 5 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,400 0,160 2 15 1,200 1,440 Ratio of standard deviations = 0,333 Ratio of variances = 0,111 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,193. 0,575) (0,037. 0,331) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,11 0,000 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,100 0,400 0,10 2 15 6,70 1,20 0,31

Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,800 0,640 2 15 1,300 1,690 Ratio of standard deviations = 0,615 Ratio of variances = 0,379 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,357. 1,062) (0,127. 1,128) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,38 0,080 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,700 0,800 0,21 2 15 7,60 1,30 0,34 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -0,900 95% CI for difference: (-1,707. -0,093) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,28 P- Value = 0,030 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,0794 Doi voi thang 3 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics

Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,400 95% CI for difference: (-0,289. 1,089) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 1,22 P- Value = 0,237 DF = 17 ĀTest and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,400 0,160 2 15 0,400 0,160 Ratio of standard deviations = 1,000 Ratio of variances = 1,000 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,579. 1,726) (0,336. 2,979) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,00 1,000 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 7,100 0,400 0,10 2 15 6,700 0,400 0,10 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,400 95% CI for difference: (0,101. 0,699) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,74 P- Value = 0,011 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,4000 *SS KQ KG HI Lo 1 va Lo 2 theo cac thang Doi voi thang 2 Test and CI for Two Variances

Sample N StDev Variance 1 15 0,600 0,360 2 15 0,500 0,250 Ratio of standard deviations = 1,200 Ratio of variances = 1,440 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,695. 2,071) (0,483. 4,289) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 1,44 0,504 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,800 0,600 0,15 2 15 7,600 0,500 0,13 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -1,800 95% CI for difference: (-2,213. -1,387) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -8,93 P- Value = 0,000 DF = 28 Both use Pooled StDev = 0,5523 Doi voi thang 4 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,000 1,000 2 15 0,400 0,160 Ratio of standard deviations = 2,500 Ratio of variances = 6,250 95% Confidence Intervals

CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (1,449. 4,315) (2,098. 18,616) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 6,25 0,002 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,70 1,00 0,26 2 15 7,100 0,400 0,10 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -1,400 95% CI for difference: (-1,984. -0,816) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -5,03 P- Value = 0,000 DF = 18 Doi voi thang 5 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,900 0,810 2 15 1,200 1,440 Ratio of standard deviations = 0,750 Ratio of variances = 0,563 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,435. 1,294) (0,189. 1,675) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value

Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -0,700 95% CI for difference: (-1,232. -0,168) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,75 P- Value = 0,013 DF = 19 Bảng 3.17. Kết quả kiểm tra bài thải vi-rút sau khi công cường độc Tabulated statistics: LOAI. KQ Using frequencies in TSGA Rows: LOAI Columns: KQ - + All DOICHUNG 25 25 50 35,91 14,09 50,00 -10,91 10,91 * -1,820 2,906 * -4,643 4,643 * 3,314 8,446 * VACXIN 54 6 60 43,09 16,91 60,00 10,91 -10,91 * 1,662 -2,653 * 4,643 -4,643 * 2,762 7,038 * All 79 31 110 79,00 31,00 110,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 21,560. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 22,501. DF = 1. P-Value = 0,000 Tabulated statistics: LOAI_1. KQ_1 Using frequencies in TSVIT Rows: LOAI_1 Columns: KQ_1

F Test (normal) 14 14 0,56 0,294 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,800 0,900 0,23 2 15 6,70 1,20 0,31 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -0,900 95% CI for difference: (-1,693. -0,107) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,32 P- Value = 0,028 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,0607 Doi voi thang 6 Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 0,900 0,810 2 15 0,400 0,160 Ratio of standard deviations = 2,250 Ratio of variances = 5,062 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (1,304. 3,883) (1,700. 15,079) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 5,06 0,005 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,000 0,900 0,23 2 15 6,700 0,400 0,10

- + All DOICHUNG 1 15 16 8,47 7,53 16,00 -7,471 7,471 * -2,567 2,723 * -4,517 4,517 * 6,589 7,412 * VACXIN 26 9 35 18,53 16,47 35,00 7,471 -7,471 * 1,735 -1,841 * 4,517 -4,517 * 3,012 3,388 * All 27 24 51 27,00 24,00 51,00 * * * * * * * * * * * * Cell Contents: Count Expected count Residual Standardized residual Adjusted residual Contribution to Chi-square Pearson Chi-Square = 20,401. DF = 1. P-Value = 0,000 Likelihood Ratio Chi-Square = 23,140. DF = 1. P-Value = 0,000 Fisher's exact test: P-Value = 0,0000068 Bảng 3.19. Đánh giá dài miễn

dịch trên vịt sau khi tiêm Navet-

Fluvac 2

* SS HG HI giua cac thang trong lo TN tiem 2 lan Giua thang 1 và thang 3: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1

Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,600 2,560 2 15 1,800 3,240 Ratio of standard deviations = 0,889 Ratio of variances = 0,790 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,515. 1,534) (0,265. 2,353) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 14 0,79 0,665 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 4,90 1,60 0,41 2 15 6,30 1,80 0,46 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: -1,400 95% CI for difference: (-2,674. -0,126) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,25 P- Value = 0,032 DF = 28 Both use Pooled StDev = 1,7029 Giua thang 2 và thang 4: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,500 2,250 2 14 2,200 4,840

Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,62 0,391 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,90 1,50 0,39 2 14 4,50 1,90 0,51 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,400 95% CI for difference: (0,100. 2,700) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,21 P- Value = 0,036 DF = 27 Both use Pooled StDev = 1,7044 Giua thang 2 và thang 6: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,500 2,250 2 14 2,100 4,410 Ratio of standard deviations = 0,714 Ratio of variances = 0,510 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,407. 1,240) (0,166. 1,537) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,51 0,225 Two-Sample T-Test and CI

Ratio of standard deviations = 0,682 Ratio of variances = 0,465 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,388. 1,183) (0,151. 1,400) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,46 0,168 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,90 1,50 0,39 2 14 4,40 2,20 0,59 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,500 95% CI for difference: (0,074. 2,926) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,16 P- Value = 0,040 DF = 27 Both use Pooled StDev = 1,8700 Giua thang 2 và thang 5: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,500 2,250 2 14 1,900 3,610 Ratio of standard deviations = 0,789 Ratio of variances = 0,623 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,450. 1,370) (0,202. 1,877)

Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 5,90 1,50 0,39 2 14 4,30 2,10 0,56 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,600 95% CI for difference: (0,217. 2,983) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,37 P- Value = 0,025 DF = 27 Both use Pooled StDev = 1,8138 Giua thang 3 và thang 4: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,800 3,240 2 14 2,200 4,840 Ratio of standard deviations = 0,818 Ratio of variances = 0,669 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,466. 1,420) (0,217. 2,016) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,67 0,466 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,30 1,80 0,46 2 14 4,40 2,20 0,59 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,900 95% CI for difference: (0,373. 3,427)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,55 P- Value = 0,017 DF = 27 Both use Pooled StDev = 2,0026 Giua thang 3 và thang 5: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1 Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,800 3,240 2 14 1,900 3,610 Ratio of standard deviations = 0,947 Ratio of variances = 0,898 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,540. 1,644) (0,291. 2,703) Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,90 0,840 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,30 1,80 0,46 2 14 4,50 1,90 0,51 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 1,800 95% CI for difference: (0,390. 3,210) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,62 P- Value = 0,014 DF = 27 Both use Pooled StDev = 1,8488 Giua thang 3 và thang 6: Test and CI for Two Variances Method Null hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) = 1

Tests Test Method DF1 DF2 Statistic P-Value F Test (normal) 14 13 0,73 0,574 Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 15 6,30 1,80 0,46 2 14 4,30 2,10 0,56 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 2,000 95% CI for difference: (0,513. 3,487) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2,76 P- Value = 0,010 DF = 27 Both use Pooled StDev = 1,9502

Alternative hypothesis Sigma(1) / Sigma(2) not = 1 Significance level Alpha = 0,05 Statistics Sample N StDev Variance 1 15 1,800 3,240 2 14 2,100 4,410 Ratio of standard deviations = 0,857 Ratio of variances = 0,735 95% Confidence Intervals CI for Distribution CI for StDev Variance of Data Ratio Ratio Normal (0,488. 1,488) (0,238. 2,213)