Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính hướng đích tế bào ung thư: Luận án Tiến sĩ Hóa học

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG

THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)

BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN

TẾ BÀO UNG THƢ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2016

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG

THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)

BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN

TẾ BÀO UNG THƢ

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số chuyên ngành: 62 44 01 14

Phản biện độc lập 1:

Phản biện độc lập 2:

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS.TS NGUYỄN CỬU KHOA

2. GS.TS NGUYỄN CÔNG HÀO

LỜI CAM ĐOAN

Công trình đƣợc thực hiện tại phòng Hóa dƣợc – Viện Khoa học Vật liệu ứng

dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn

khoa học của PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công Hào. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong luận án này là trung thực, đƣợc hoàn thành dựa trên các kết

quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chƣa đƣợc dùng cho bất kỳ luận văn cùng

cấp nào.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Bích Trâm

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công

Hào đã định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Xin gởi đến Thầy những lời biết ơn chân thành nhất.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của TS. Trần Ngọc Quyển và những anh chị trong Viện

Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Công nghệ Hóa

học trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án.

Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,

giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................... 4

GIỚI THIỆU DENDRIMER ............................................................................. 4

1.1

1.1.1 Khái niệm về dendrimer .............................................................................. 4

1.1.2 Tính chất của dendrimer .............................................................................. 6

1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp ....................................................................... 11

1.1.4 Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ

hƣớng đích ............................................................................................................. 15

BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM ............................................. 19

1.2

1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học .................. 20

1.2.2 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích ............................... 20

NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY ........................................................ 22

1.3

1.3.1 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân alkyl hóa

…………………………………………………………………………...22

1.3.2 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng

đích – acid folic ..................................................................................................... 25

PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA

1.4

DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT ............................................................................... 28

1.4.1 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất dựa vào phổ MALDI-

TOF-MS (WtMALD) ................................................................................................ 28

1.4.2 Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR .................. 30

1.4.3 Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất ....... 30

CHƢƠNG 2 - NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 32

2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 32

iii

2.1.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 32

2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 34

2.2 THỰC NGHIỆM ............................................................................................. 48

2.2.1 Hóa chất..................................................................................................... 48

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 49

2.2.3 Thực nghiệm ............................................................................................. 50

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................. 72

3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0 .......... 72

3.1.1 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR .......... 72

3.1.2 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối

lƣợng MS ............................................................................................................... 79

3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

…………………………………………………………………………...80

3.2 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL ................ 84

3.2.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ............................. 84

3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic .......................... 91

3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ...................................... 95

3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ................................ 99

3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH

– ACID FOLIC ........................................................................................................ 105

3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic

105

3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân

hƣớng đích - acid folic ......................................................................................... 108

3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO ......................................................... 112

3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO .............................................................. 113

3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ

DẪN XUẤT ............................................................................................................ 116

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC ................................. 117

3.7.1 Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil

………………………………………………………………………….117

3.7.2 Khảo sát khả năng nhả thuốc .................................................................. 119

KẾT LUẬN ................................................................................................................. 120

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............ 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................

PHỤ LỤC ..........................................................................................................................

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM và dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77] ....................................................................................................................................... 29 Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98] ................................................................................ 31

Bảng 2.1: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (e), (a) trên phân tử dendrimer (LT)của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 .......................................................................................... 42 Bảng 2.2: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (j), (a) trên phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT) ....................................................................................................................................... 44 Bảng 2.3 Một số thông số vật lý của hóa chất .............................................................. 48

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 ....................................................................................................................................... 78 Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở khối phổ MS .................................................................................................................. 79 Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H- MNR (NMR) của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 .................................. 80 Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở phổ 1H-NMR và MS ...................................................................................................... 82 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian .................................................................... 85 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian ................................................................................................................. 87 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ....................................................................................................................................... 89 Bảng 3.8: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các tác nhân acyl chloride ....................................................................................................................................... 90 Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic ....................................................................................................................................... 92 Bảng 3.10: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acid carboxylic ....... 93 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ....................................................................................................................................... 96 Bảng 3.12: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol ..................... 97 Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine .............................................................. 100 Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine......................................................................................................... 101 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ............................................................................................................. 103

Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ................... 104 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA ......................................... 106 Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ... 110

vii

DANH MỤC CÔNG THỨC

Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa trên phổ 1H-NMR ....................................................................................................................................... 41 Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 thông qua phổ 1H-NMR ................................................................................................. 44

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [2] ...................................................................... 4 Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [4] ................................................................................ 5 Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn ............................. 5 Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ ................. 6 Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [8] .......................................... 7 Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [8] ......... 8 Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [9] ................................................ 9 Hình 1.8: Cấu trúc thành vách tế bào Eukaryotic [15] ................................................. 11 Hình 1.9: Phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài [16] .............................................. 12 Hình 1.10: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong [16] ......................................... 12 Hình 1.11: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc .................................. 13 Hình 1.12: Phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai [16] ............................................ 14 Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp trực giao [16] ......................................................... 14 Hình 1.14: Phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức [16] ....................... 15 Hình 1.15: Nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ứng với phƣơng pháp sử dụng thuốc: Tiêm qua tĩnh mạch (a); Uống trực tiếp (b); Thuốc nhả chậm từ chất mang (c) [33] ................. 16 Hình 1.16: Sự hƣớng đích thụ động theo cơ chế EPR [15] .......................................... 17 Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn các tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [37] ....................................................................................................................................... 18 Hình 1.18: Quá trình nhập bào của chất mang-thuốc vào tế bào [15] ......................... 19 Hình 1.19: Thành phần cấu trúc của acid folic ............................................................. 21 Hình 1.20: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM với nhóm alkyl bề mặt [25] ............. 24 Hình 1.21: Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất: (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b) hydroxyl/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0 [73] ....................................................................................................................................... 25 Hình 1.22: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac [76] ....................................................................................................................................... 25 Hình 1.23: Cấu trúc hóa học của dendrime PAMAM G4.0-FA-PEG4000 [47] .......... 27 Hình 1.24: Sơ đồ phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Ac(96)-FA-PhiPhiLux G1D2 [78] 28

Hình 2.1: Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM G3.0 ............................................... 43 Hình 2. 2: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10 ....................... 46

Hình 3.1: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G-0.5 .............. 73 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.0 ............... 73 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 ............... 74 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.0 ............... 75 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.5 ............... 75 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.0 ............... 76 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.5 ............... 77 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G3.0 ............... 78

Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z ................................... 84 Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10) ....................................................................................................................................... 87 Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z ................................. 91 Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol ................................ 95 Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine .......................... 99 Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA .................................. 105 Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA .................... 106 Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA .............................. 109 Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ................................ 109 Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu ........................ 114 Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 ....................................................................................................... 116 Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA ..................................................................................................................................... 116 Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0..... 118 Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ................................................................................................................. 118

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Kết quả khảo sát thời gian biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride ....................................................................................................................................... 88 Đồ thị 3. 2: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride (G3.0-C2), hexanoyl chloride (G3.0-C6), decanoyl chloride (G3.0-C10), myristoyl chloride (G3.0-C14) ....................................................................................................................................... 91 Đồ thị 3.3 Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid acetic (G3.0-C2-EDC), acid hexanoic (G3.0-C6-EDC), acid decanoic (G3.0-C10-EDC), acid myristic (G3.0-C14-EDC) .. 95 Đồ thị 3.4: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với etanol (G3.0-C2-NPC), hexanol (G3.0-C6-NPC), octanol (G3.0-C8-NPC), dodecanol (G3.0-C12-NPC) ........ 98 Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ ..................................................................................................................................... 102 Đồ thị 3.6: Kết quả biến tính PAMAM G2.5 với alkylamine .................................... 104 Đồ thị 3.7: Kết quả thử độc tế bào của PAMAM G3.0; PAMAM G3.0-C2 và PAMAM G3.0-C14 trên tế bào MCF-7 ...................................................................... 112 Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu hiện lƣợng thuốc đƣợc giải phóng của G3-C6-FA/5FU và 5-FU tự do ..................................................................................................................................... 119

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM lõi etylendiamin từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 ....................................................................................................................................... 35 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ...................... 37 Sơ đồ 2.3: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic .................. 37 Sơ đồ 2.4: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ............................... 38 Sơ đồ 2.5: Các biến đổi không mong muốn của chất hoạt hóa NPC [34] .................... 38 Sơ đồ 2.6: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ......................... 39 Sơ đồ 2.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA ............................. 39 Sơ đồ 2.8: Các sản phẩm không mong muốn của phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic ......................................................................................... 40 Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5........................................... 51 Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 .......................................... 52 Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 .......................................... 53 Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 .......................................... 55 Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 .......................................... 56 Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .............. 57 Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic .......... 60 Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ....................... 62 Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine ......................... 64 Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA .............................. 66 Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA ....................................................................................................................................... 67 Sơ đồ 2.20: Quy trình nang hóa thuốc 5-FU của dendrimer PAMAM ........................ 69 Sơ đồ 2.21: Quy trình nhả thuốc 5-FU của dendrimer-5FU ......................................... 70

xii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Acetyl Ac

Acid Deoxyribonucleic ADN

Butylene Diamine BDA

Phosphate buffer saline PBS

4',6-diamidino-2-phenylindole DAPI

Dicyclohexylcarbodiimide DCC

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMF Dimethyleformamide

DMSO Dimethyl Sulfoxide

EDA Ethylendiamine

EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

EPR Enhanced Permeability And Retention Effect

5-FU 5-Flurouracil

FA Acid folic

FAR Folate Receptor

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

G Thế hệ (Generation)

Gel Permeation Chromatography

GPC 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

H Hiệu suất phản ứng

HER-2 Human Epidermal Growth Factor Receptor

HPLC High-Performance Liquid Chromatography

LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry

MA Methyl acrylate

MPEG Methoxy polyethylen glycol

MS Mass Spectroscopy

MRI Magnetic Resonance Imaging

xiii

NHS N-Hydroxysuccinimide

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NPC p-Nitrophenyl chloroformate

PAMAM Polyamidoamine

PEG Polyethylene Glycol

PEG 4000 Polyethylene glycol 4000

TEA Triethylamine

RGD Arg-Gly-Asp

xiv

MỞ ĐẦU

Ung thƣ là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Sự

tiến bộ của khoa học đã mang đến kết quả ngày một tốt hơn đối với căn bệnh ung thƣ.

Với mục đích điều trị hiệu quả, các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc điều trị

ngay tại các tế bào ung thƣ và giảm thiểu sự nguy hại đối với các tế bào lành của cơ

thể, y học gọi phƣơng pháp này là điều trị hƣớng đích (Targeted Therapy). Phƣơng

pháp điều trị hƣớng đích mở ra một hƣớng mới trong quá trình điều trị ung thƣ.

Phƣơng pháp này liên quan đến việc sử dụng những loại dƣợc phẩm có khả năng tấn

công một cách đặc biệt đối với các tế bào ung thƣ [1-4]. Khả năng phân biệt tế bào ung

thƣ và tế bào bình thƣờng giúp cho phƣơng pháp điều trị hƣớng đích trở thành một

phƣơng pháp điều trị đƣợc lựa chọn ngày nay.

Các dendrimer đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ chất mang thuốc hƣớng đích trong

điều trị ung thƣ. Dendrimer là một loại nano polymer có nhiều đặc điểm nổi bật phù

hợp với vai trò một chất mang với cấu trúc phân tử dạng hình cầu, nhánh bên trong có

nhiều không gian trống, có nhiều nhóm thế hoạt động ở bề mặt. Tuy nhiên, những

nhóm chức hoạt động ở bề mặt dendrimer lại tƣơng tác hóa - sinh học với các tế bào

trong cơ thể do đó chúng gây độc cho tế bào. Nhằm khắc phục những hạn chế trên và

để cải thiện một số tính chất hỗ trợ cho việc mang thuốc đúng nơi và hiệu quả thì bề

mặt dendrimer đƣợc biến tính bằng một trong các tác nhân tƣơng hợp sinh học nhƣ

ankyl, PEG (Polyethylene Glycol), … kết hợp tác nhân hƣớng đích nhƣ acid folic,

peptide RGD (Arg-Gly-Asp), Anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) và kháng

thể Anti-HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), biotin, ... thông qua các

liên kết hóa học [3, 5-12].

Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng

hướng đích đến tế bào ung thư”.

Mục tiêu của luận án

Tổng hợp các thế hệ dendrimer PAMAM và biến tính bề mặt dendrimer

PAMAM bằng các tác nhân alkyl hóa và tác nhân hƣớng đích (acid folic) nhằm mục

đích xây dựng hệ chất nano mang thuốc chống ung thƣ có tính tƣơng hợp sinh học và

phân phối thuốc đến đúng vị trí tế bào ung thƣ.

Để đạt đƣợc những mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau

1. Tổng hợp dendrimer PAMAM (từ thế hệ G-0.5 đến G3.0).

2. Xác định thành phần cấu trúc và khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM

tổng hợp đƣợc.

3. Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alkyl (acyl chloride,

alcohol, acid carboxylic, alkylamine).

4. Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 hay dendrimer PAMAM G3.0-alkyl

với tác nhân hƣớng đích (acid folic).

5. Xác định thành phần cấu trúc, độ chuyển hóa, khối lƣợng phân tử, số nhóm

alkyl chuyển hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính.

6. Khảo sát độc tính tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất của

dendrimer PAMAM G3.0.

7. Khảo sát kích thƣớc nano của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0.

8. Khảo sát khả năng hƣớng đích của hệ chất mang thuốc chống ung thƣ.

9. Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của hệ dendrimer PAMAM G3.0-thuốc.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn sau:

- Đề tài có giá trị trong việc nghiên cứu các hợp chất mang thuốc chống ung thƣ

hƣớng đích, đó là những hợp chất chuyển thuốc chống ung thƣ đến đúng vị trí

tế bào ung thƣ. Đây là vấn đề đang đƣợc xã hội quan tâm hiện nay.

- Phát hiện mới về phổ 1H-NMR trong việc đánh giá khối lƣợng phân tử

dendrimer có ý nghĩa quan trọng trong việc vận dụng, đánh giá quá trình tổng

hợp chuyển hóa các hợp chất, thuốc, ...

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER

1.1.1 Khái niệm về dendrimer

Khái niệm dendrimer đƣợc Donald A. Tomalia và cộng sự [13] đƣa ra đầu tiên

vào năm 1985. Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh

cây. Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính

chất ƣu việt hơn so với polymer mạch thẳng.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [14]

Phân tử dendrimer đƣợc cấu tạo ba phần gồm: lõi (còn gọi là nhân hoặc core), các

nhánh bên trong và các nhóm bề mặt bên ngoài. Các nhánh bên trong đƣợc lặp đi lặp

lại có nhiệm vụ liên kết các nhóm bên ngoài với lõi. Các nhóm bên ngoài còn đƣợc gọi

là các nhóm bề mặt hoạt động (hình 1.1)[14-16].

Dendrimer có các đơn vị nhánh liên tiếp lặp đi lặp lại hƣớng ra ngoài từ điểm nút

khởi đầu. Một dendrimer có hai điểm nút khi đi từ trung tâm đến ngoại vi đƣợc gọi là

dendrimer thế hệ thứ 2 (ký hiệu là G2.0) [14].

Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [14]

Dendrimer polyamidoamine (PAMAM) là một dendrimer điển hình, với lõi là

ammonia (NH3) hoặc alkyldiamine nhƣ: ethylene diamine (EDA), butylene diamine

(BDA), hexane diamine, … Cấu trúc nhánh đƣợc xây dựng bởi sự sắp xếp luân phiên

của các phân tử ethylene diamine và methyl acrylate (MA). Dendrimer PAMAM với

các nhóm bề mặt là các nhóm amine –NH2 ta có PAMAM thế hệ nguyên, còn gọi là

thế hệ chẵn, dendrimer PAMAM với các nhóm bề mặt là các nhóm carboxylate –

COOCH3 ta có dendrimer PAMAM thế hệ bán nguyên, còn gọi là thế hệ lẻ [17-19].

Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn [18]

Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ [18]

1.1.2 Tính chất của dendrimer

1.1.2.1 Dendrimer có hình dạng, kích thước xác định

Kích thƣớc và khối lƣợng phân tử dendrimer có thể điều chỉnh trong suốt quá

trình tổng hợp, thể hiện tính đơn phân tán. Chỉ số phân tán của dendrimer gần nhƣ

bằng 1.

- D: Đƣợc gọi là chỉ số phân tán, đặc trƣng cho độ phân tán của một mẫu

polymer.

- Mn: Khối lƣợng phân tử trung bình số.

- Mw: Khối lƣợng phân tử trung bình khối.

- Mw > Mn: mẫu polymer đa phân tán. Khi D càng lớn thì mẫu polymer

càng phân tán.

Trong dung dịch các dendrimer thƣờng tồn tại ở các dạng sau:

- Dạng monomer, dimer, trimer (hình 1.5a).

- Kết thành chùm có hình dạng méo mó (hình 1.5b).

- Kết thành một chuỗi thẳng dài (hình 1.5c) có kích thƣớc khoảng vài chục đến

vài trăm nanometer.

Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [20]

Trong quá trình hòa tan trong dung môi thì các dendrimer tồn tại dƣới dạng hình

cầu, giống nhƣ một trái banh bị nén chặt nên ít hoặc không bị biến dạng. Điều này làm

cho độ nhớt của dendrimer trong dung dịch giảm rất nhiều so với polymer mạch thẳng.

Khi khối lƣợng phân tử dendrimer tăng, độ nhớt có thể đạt đến mức cực đại ở thế hệ

thứ tƣ và sau đó giảm xuống. Trong khi đó, với các polymer thẳng thì độ nhớt sẽ tăng

tỷ lệ với khối lƣợng phân tử [20].

Ngoài ra, các thế hệ dendrimer có kích thƣớc chuẩn rất phù hợp với các vật chất

trong cơ thể, do đó dendrimer rất đƣợc chú trọng trong y học hiện nay.

Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [20]

1.1.2.2 Khả năng hòa tan của dendrimer

Tính tan của dendrimer do lõi và cả nhóm trên bề mặt quyết định. Dendrimer có

các nhóm bên ngoài và lõi là các nhóm ái nƣớc thì có khả năng tan đƣợc trong nƣớc,

trong khi các dendrimer có các nhóm bên ngoài và lõi là các nhóm kỵ nƣớc thì chúng

không có khả năng tan trong nƣớc mà ngƣợc lại, chúng tan đƣợc trong các dung môi

có tính dầu. Độ dài của lõi liên quan đến hình dạng và tính ái dầu của dendrimer, nếu

số nhóm -CH2- trong phân tử lõi càng nhiều sẽ làm tăng tính ái dầu [20].

1.1.2.3 Tính mang vác

Cấu trúc phân tử cho thấy trong phân tử dendrimer có nhiều khoảng trống nên

chúng đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang. Các chất chúng có thể mang là thuốc trị

bệnh, các đoạn ADN, các enzyme, các hormone, các xúc tác kim loại. Đặc biệt các

dendrimer rất thích hợp cho việc mang thuốc vì chúng có độ chọn lọc và tính bền vững

cao khi kết hợp với thuốc [21].

Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [21]

Một trong những ý tƣởng để giải quyết vấn đề này là đƣa thuốc trực tiếp vào vị

trí cần phát huy tác dụng (cơ quan, tế bào hoặc các thành phần của tế bào), tạo ra một

loại thuốc có tính chọn lọc cao vào một cơ quan nào đó trong cơ thể. Thuốc sẽ phát

huy tác dụng khi đƣợc hấp thu qua màng tế bào. Có nhiều con đƣờng để thuốc hấp thu

qua màng tế bào nhƣ khuếch tán trực tiếp qua lớp lipide, khuếch tán qua các lỗ xuyên

qua lớp lipide, khuếch tán qua màng nhờ chất mang hay sự ẩm bào. Đối với các loại

thuốc gây độc tế bào nhƣ thuốc trị ung thƣ thì đƣợc hấp thu qua màng tế bào nhờ một

hệ vận chuyển thuốc, do đó việc ra đời của chất mang thuốc là một liệu pháp mới

trong điều trị ung thƣ. Các chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một giá đỡ cho thuốc,

giúp thuốc tránh khỏi sự đào thải bởi các các cơ chế bảo vệ của cơ thể (chuyển hóa ở

gan, thải trừ qua thận, phân huỷ bởi các enzyme trong máu, tấn công của bạch cầu và

hệ thống miễn dịch....). Các chất mang còn giúp phân tử thuốc đến đƣợc đích tác dụng

mong muốn. Tiêu chí quan trọng nhất đối với các chất mang đó là tính tƣơng hợp sinh

học. Chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một tiền dƣợc (prodrug) giúp giảm độc tính của

thuốc, thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ

của thuốc và giảm lƣợng thuốc điều trị [5, 21, 22].

1.1.2.4 Tính đa hóa trị

Tính đa hóa trị của dendrimer do các nhóm bên ngoài quyết định, các nhóm bên

ngoài càng nhiều thì hóa trị dendrimer càng tăng. Nhờ vào tính đa hóa trị, các

dendrimer có thể mang đƣợc nhiều nhóm bên ngoài. Dendrimer với nhiều nhóm chức

trên bề mặt có khả năng tƣơng tác với các phối tử đặc trƣng, giúp các nhà nghiên cứu

thiết kế xây dựng các hệ chất mang đa chức năng ứng dụng trong y học [1, 23].

1.1.2.5 Tính tương hợp sinh học

Để có thể ứng dụng dendrimer nhƣ tác nhân sinh học, dendrimer cần phải thỏa

mãn một số yêu cầu sau:

- Không độc.

- Không tạo sự miễn dịch.

- Có khả năng thấm sinh học ở cấp độ tế bào để vƣợt qua đƣợc các rào cản sinh

học.

- Có khả năng lƣu thông trong hệ thống sinh học với thời gian cần thiết (không

bị đào thải quá nhanh, cũng nhƣ tồn tại quá lâu trong cơ thể) để phát huy hoạt

tính lâm sàng mong đợi.

- Có khả năng định hƣớng tới những cấu trúc sinh học đặc biệt.

Các tính chất sinh học của dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào kích thƣớc của

dendrimer và các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer, ít phụ thuộc vào cấu trúc bên

trong của dendrimer. Với các nhóm chức bề mặt, dendrimer có thể đƣợc biến tính để

tạo ra các tính chất sinh học đặc biệt, nhƣ tƣơng hợp tế bào, giảm độc tính, tăng tính

thấm, có khả năng di chuyển đến đúng vị trí cần điều trị, … [23]

1.1.2.6 Độc tính tế bào của dendrimer

Dendrimer ở thế hệ chẵn (với các nhóm amine trên bề mặt) có độc tính với tế bào

cao hơn so với dendrimer thế hệ lẻ (với các nhóm chức ester trên bề mặt). Điều này có

thể giải thích bởi nhóm amine tích điện dƣơng nên có thể tạo liên kết với màng tế bào

(tích điện âm) và gây độc cho tế bào bởi điện tích dƣơng trên bề mặt của chúng. Với

dendrimer thế hệ càng cao khả năng gây độc tế bào càng lớn vì số lƣợng nhóm amine

tăng lên nhiều, VD. G3.0: 32 nhóm amine, G4.0: 64 nhóm amine, G5.0: 128 nhóm

amine [24].

Tế bào của sinh vật có bề mặt là các nhóm chức tích điện âm (ví dụ: nhóm +) tích điện anionic carbonhydrate) (hình 1.8). Dendrimer với nhóm chức amine (-NH3

dƣơng, sẽ tƣơng tác với phần âm trên bề mặt tế bào bởi sự hấp dẫn tĩnh điện tạo thành

các lỗ thủng hay kênh làm cho màng tế bào mất tác dụng ngăn cản và tế bào bị dung

giải, hoặc hình thành hiện tƣợng nhập bào, sẽ cho phép dendrimer thâm nhập qua

màng tế bào vào tế bào và phá vỡ tế bào từ bên trong [25].

Hình 1.8: Cấu trúc thành vách tế bào Eukaryotic [25]

Khi biến tính một phần các nhóm amine bề mặt của dendrimer PAMAM với các

nhóm chức trơ hóa học nhƣ poly (ethylene glycol) (PEG), acid hoặc ester với mạch

carbon dài thì độc tế bào đối với tế bào Caco-2 đã đƣợc giảm đáng kể. (IC50 từ ~

0,13mM đến > 1mM). Tuy nhiên, với số lƣợng lớn các chuỗi lipide tăng thì khả năng

gây độc của hệ thống cho tế bào đƣợc lý giải bởi các tƣơng tác kỵ nƣớc [24].

1.1.2.7 Tính miễn dịch của dendrimer

Dendrimer không biến tính bề mặt có tính miễn dịch thấp. Dendrimer ở thế hệ

cao hơn thì có tính miễn dịch cao hơn. Tính kích thích miễn dịch của dendrimer phụ

thuộc rất nhiều vào các nhóm chức trên bề mặt. Một số nhóm chức đƣợc biến tính trên

bề mặt dendrimer nhƣ PEG, hydroxyl, hay carbohydrate có tác dụng làm cản trở tính

miễn dịch của dendrimer. Vì vậy khi biến tính bề mặt dendrimer bằng tế bào T (T-cell

epitopes) hoặc các peptide kháng nguyên (antigenic peptides) sẽ làm cho dendrimer có

tính kháng nguyên cao, đặc biệt với vaccine hay tá dƣợc [25].

1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp

Dendrimer có thể tổng hợp bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp tổng hợp

từ trong ra ngoài (Divergent), phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong (Convergent),

phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc (Double-stage Convergent),

phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai (Double Exponential), phƣơng pháp tổng hợp

trực giao (Orthogonal), phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức

(Hypermonomer) [8, 14, 17, 20, 26-30].

1.1.3.1 Phương pháp tổng hợp từ trong ra ngoài (Divergent)

Dendrimer đƣợc tổng hợp từ một lõi đa chức ở tâm, các monomer gắn vào lõi

hình thành thế hệ dendrimer đầu tiên. Sau đó các monomer khác sẽ phản ứng với

nhóm bên ngoài và hình thành thế hệ dendrimer kế tiếp. Quy trình này đƣợc lặp lại, và

sau mỗi quy trình sẽ thu đƣợc một thế hệ dendrimer cao hơn.

Ƣu điểm của phƣơng pháp này là có thể tổng hợp đƣợc dendrimer ở thế hệ cao.

Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là thƣờng có nhiều phản ứng phụ, sản

phẩm có nhiều khuyết tật nên khó tinh chế sản phẩm cuối cùng.

Hình 1.9: Phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài [30]

Trong luận án này, dendrimer đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp tổng hợp từ

trong ra ngoài để có thể điều chỉnh kích thƣớc cũng nhƣ khối lƣợng của dendrimer.

Tuy nhiên để hạn chế các khuyết tật xảy ra trong quá trình tổng hợp, lƣợng tác chất

đƣợc sử dụng nhiều hơn gấp nhiều lần so với lƣợng cần thiết (10 – 250 lần).

1.1.3.2 Phương pháp tổng hợp từ ngoài vào trong (Convergent)

Phƣơng pháp này tổng hợp dendrimer từ các nhóm bên ngoài. Ban đầu, các

monomer phản ứng với nhau hình thành các nhánh cơ sở. Sau đó, các monomer này

tiếp tục gắn vào nhánh cơ sở hình thành nhánh lớn hơn. Quy trình này đƣợc lặp lại, khi

các nhánh đạt kích cỡ mong muốn chúng sẽ đƣợc gắn với lõi và hình thành phân tử

dendrimer.

Hình 1.10: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong [30]

Phƣơng pháp này khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của phƣơng pháp tổng hợp từ

trong ra ngoài. Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong có thuận lợi là dễ dàng làm

sạch sản phẩm và khuyết tật của sản phẩm đƣợc giảm tới mức tối thiểu. Tuy nhiên,

việc tổng hợp dendrimer theo phƣơng pháp này đòi hỏi phải sắp xếp tỷ mỉ các nhóm

nguyên tử trong không gian. Khi số nhóm bên ngoài tăng lên sẽ gây cản trở không

gian cho các nhóm tiếp theo. Do đó, phƣơng pháp này chỉ thích hợp để tổng hợp

dendrimer ở thế hệ thấp hoặc phần lõi có kích thƣớc lớn.

1.1.3.3 Phương pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bước (Double-stage

Convergent)

Đây đƣợc là sự kết hợp của hai phƣơng pháp tổng hợp dendrimer từ trong ra

ngoài và tổng hợp từ ngoài vào trong. Một dendron đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp

từ trong ra ngoài có nhóm chức hoạt động F nằm ở tiêu điểm. Một siêu lõi (hypercore)

có nhiều nhóm bề mặt là những nhóm nối nhánh C đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp

từ ngoài vào trong. Sau đó dendron và dendrimer kết nối với nhau bởi F và C sẽ cho ra

sản phẩm dendrimer.

Hình 1.11: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc [30]

So với phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài, phƣơng pháp này nhanh chóng

tạo thành một dendrimer với độ đơn phân tán cao ở thế hệ cao mà không có sự cản trở

lập thể nhờ có sự trợ giúp của lõi đa nhánh.

1.1.3.4 Phương pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai (Double Exponential)

Đây là phƣơng pháp phát triển dendron theo hƣớng tổng hợp từ ngoài vào trong

nhƣng với tốc độ phát triển nhanh theo cấp số nhân. Từ một dendron có hai nhóm nối

nhánh và một nhóm chức đƣợc bảo vệ, ta tiến hành hoạt hoá có chọn lọc các nhóm đó

theo hai hƣớng khác nhau (hƣớng ngoại vi và tiêu điểm của dendron). Sau khi đƣợc

hoạt hoá các dendron sẽ phản ứng với nhau tạo thành dendron thế hệ cao hơn, tiếp tục

lặp đi lặp lại quá trình ta sẽ thu đƣợc một dendron thế hệ cao có hoạt tính giống

dendron ban đầu.

Hình 1.12: Phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai [30]

1.1.3.5 Phương pháp tổng hợp trực giao (Orthogonal)

Phƣơng pháp tổng hợp này sử dụng đơn vị monomer có nhánh khác nhau. Một

trong số đó không có khả năng nối nhánh, nhƣng khi điều kiện phản ứng thích hợp thì

các nhóm không hoạt động sẽ đƣợc hoạt hóa thành các nhóm có khả năng nối nhánh.

Sản phẩm tạo thành ban đầu cũng không có khả năng nối nhánh và khi điều kiện phản

ứng đƣợc đáp ứng thì nó lại đƣợc hoạt hóa thành có khả năng tham gia nối nhánh. Cứ

tiếp tục nhƣ vậy thì dendrimer có thể tổng hợp nhanh và không phải trải qua nhiều giai

đoạn. Tuy nhiên phƣơng pháp này ít đƣợc sử dụng vì rất khó để tìm đƣợc chất phù hợp

với yêu cầu chặt chẽ nhƣ trên.

Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp trực giao [30]

1.1.3.6 Phương pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức (Hypermonomer)

Phƣơng pháp này sử dụng monomer có số nhóm chức nhiều hơn thông thƣờng.

Điều này giúp dendrimer đƣợc tổng hợp có số lƣợng nhánh và nhóm bề mặt tăng

nhanh nhƣng các bƣớc cần thiết để tổng hợp ra một dendrimer vẫn không thay đổi so

với các phƣơng pháp thông thƣờng.

Hình 1.14: Phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức [30]

1.1.4 Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ hƣớng

đích

Mặc dù mới đƣợc nghiên cứu trong những năm gần đây nhƣng dendrimer đã

đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau [16, 18, 28, 29].

Dendrimer sử dụng làm chất mang thuốc [16, 17, 31-34], làm chất vận chuyển gene

[16, 31, 34-36] và đƣợc dùng nhƣ chất tƣơng phản MRI (Magnetic Resonance

Imaging) [31, 37-40]. Và trong một số lĩnh vực khác nhƣ xúc tác, vật liệu composite,

vật liệu polymer [13, 41], đầu dò cảm biến hóa học và sinh học, sợi carbon, phụ gia

polymer, … [13, 15, 23, 28, 42-44]. Đặc biệt trong đề tài này, chúng tôi sử dụng

dendrimer nhƣ một chất mang thuốc hƣớng đích đến tế bào ung thƣ.

Các thuốc điều trị ung thƣ khi sử dụng đơn độc thì chỉ một phần nhỏ lƣợng thuốc

đến đƣợc đích mong muốn, phần còn lại phân bố vào các cơ quan khác hoặc bị đào

thải do bị chuyển hóa qua gan hoặc bài tiết ra ngoài dẫn đến nồng độ thuốc trong máu

và tại cơ quan rất thấp, không phát huy đƣợc tác dụng. Ngoài ra còn có một số cơ quan

trên cơ thể rất khó đƣa thuốc vào nhƣ não. Do vậy để đạt đƣợc nồng độ thuốc có tác

dụng tại đích, nếu theo cách thông thƣờng, chúng ta phải đƣa vào cơ thể một lƣợng

thuốc nhiều hơn, kết quả gây ra các tác dụng phụ và nhiều điều bất lợi khác. Các thuốc

điều trị ung thƣ thƣờng có độc tính rất mạnh nên khi di chuyển qua màng tế bào hay

tiếp xúc với các mô, cơ quan đều có khả năng làm tổn thƣơng hay phá hủy. Do đó,

việc ra đời của chất mang thuốc hƣớng đích là một liệu pháp mới trong điều trị. Công

nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất với kích thƣớc từ vài nanometer tới vài trăm

nanometer đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang với mục tiêu: đúng nơi, đúng lúc và đúng

liều, góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc [45-49].

Hình 1.15: Nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ứng với phƣơng pháp sử dụng thuốc:

Tiêm qua tĩnh mạch (a); Uống trực tiếp (b); Thuốc nhả chậm từ chất mang (c) [46]

Dendrimer, đặc biệt là dendrimer PAMAM với cấu trúc không gian có nhiều

khoảng trống bên trong và các nhóm chức hoạt động amine, ester nằm phía bên ngoài

là nền tảng cho việc hình thành các hệ chất mang thuốc chống ung thƣ đa chức năng

hƣớng đích đến tế bào ung thƣ. Có hai cách mang thuốc hƣớng tới đích: đó là mang

thuốc tới đích thụ động và mang thuốc tới đích chủ động.

1.1.4.1 Dendrimer mang thuốc tới đích thụ động

Sự định hƣớng thụ động xuất phát từ hiện tƣợng tăng tính thấm và tăng hiệu quả

lƣu giữ đặc trƣng ở các mô ung thƣ. Tại hầu hết các mô khoẻ mạnh, kích thƣớc các

khe hở lớp nội mô thành mạch máu thƣờng nhỏ hơn 2nm. Với khe hẹp giữa các lớp

nội mô thành mạch máu, các phân tử thuốc có khối lƣợng phân tử nhỏ cũng có thể lọt

qua, gây độc cho tế bào lành. Tuy nhiên, các khe hở này quá nhỏ so với kích thƣớc của

hầu hết các chất mang nano. Còn tại mô ung thƣ, do sự phát triển của tế bào ung thƣ

đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới đƣợc hình thành tại các mô ung

thƣ và có kích thƣớc lên đến từ 100 đến 800nm. Do đó các phức hợp chất mang thuốc

tồn tại trong tuần hoàn máu có thể vƣợt qua dễ dàng và đi vào mô ung thƣ. Hơn nữa,

sau khi xâm nhập vào, các phức hợp này sẽ tập trung ở dịch gian bào bao quanh các tế

bào ung thƣ. Sự phân bố này có đƣợc là kết quả của 2 yếu tố: không gian và áp suất

thẩm thấu lớn hơn tại các khe giữa các tế bào ung thƣ so với mô bình thƣờng [25].

Đặc điểm hình thái của các tế bào ung thƣ tạo ra khoảng không gian giữa các tế

bào rộng hơn so với các mô bình thƣờng. Các phức hợp chất mang thuốc sau khi đã đi

vào các khe hở tế bào này sẽ bị giữ lại khi các tế bào ung thƣ phát triển. Thêm vào đó,

do không có hệ bạch huyết cần thiết, tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi mô ung

thƣ là rất hạn chế.

Hình 1.16: Sự hƣớng đích thụ động theo cơ chế EPR [25]

Mức độ tích lũy theo hiệu ứng EPR phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích

thƣớc, tính chất bề mặt, thời gian bán thải trong huyết tƣơng của chất mang và mức độ

tăng sinh mạch máu tại vùng mô ung thƣ. Trong đó thời gian lƣu trong tuần hoàn máu

là một yếu tố quan trọng.

1.1.4.2 Dendrimer mang thuốc tới đích chủ động

Chất mang thuốc đƣợc gọi là lí tƣởng nếu nhƣ nó là chất mang thuốc thông minh

mang thuốc hoặc các hoạt chất đến đúng nơi cần chữa trị mà không tới các tế bào bình

thƣờng. Dendrimer mang thuốc tới đích chủ động (active targeting) là hệ dendrimer

mang thuốc đến đúng nơi cần chữa trị.

Dendrimer mang thuốc tới đích thụ động theo cơ chế EPR đã cho thấy ƣu thế hơn

hẳn thuốc không có chất mang, tuy nhiên hiệu ứng EPR là chƣa đủ để bảo đảm hiệu

quả tấn công đặc hiệu vào tế bào ung thƣ. Hiệu ứng EPR chỉ giúp cho các phức hợp

chất mang-thuốc tập trung tại các khe kẽ của vùng mô ung thƣ. Điều trị ung thƣ chỉ

thực sự hiệu quả khi thuốc chống ung thƣ xâm nhập đƣợc vào bên trong tế bào và phát

huy tác dụng. Nếu chất mang không thể xâm nhập đƣợc vào tế bào, cuối cùng thuốc

chống ung thƣ cũng sẽ bị giải phóng bên ngoài tế bào và lại đƣợc hệ tuần hoàn phân

bố đến các vùng mô khác nhau trong cơ thể và cuối cùng là đào thải ra khỏi cơ thể.

Để khắc phục hạn chế này, trên bề mặt của chất mang đƣợc gắn thêm các phần tử

định hƣớng. Các phần tử định hƣớng có thể là các kháng thể, các peptide, các aptamer,

hoặc là các ligand carbohydrate có khả năng liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên và

thụ thể trên bề mặt tế bào ung thƣ. So sánh giữa chất mang có phần tử định hƣớng và

chất mang thông thƣờng, các chỉ số dƣợc động học là không có khác biệt, song hiệu

quả điều trị đặc biệt đƣợc tăng lên [2, 50].

Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn các tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [50]

Khi đƣợc gắn các tác nhân tƣơng tác đặc hiệu với tế bào ung thƣ, chất mang

thuốc sẽ di chuyển đến đúng vị trí tế bào ung thƣ, tại đây có sự tƣơng tác kết hợp giữa

tác nhân hƣớng đích của hệ chất mang thuốc và các thụ thể đặc trƣng của tế bào ung

thƣ [51]. Khi đó, hệ mang thuốc hƣớng đích đƣợc giữ lại trên màng tế bào và bắt đầu

tiến hành nhập bào theo các hình thức nhƣ thông qua ẩm bào, thông qua thụ thể trung

gian hay khuyếch tán thụ động qua khe hở lớp nội mô thành mạch máu. Do điều kiện

sinh hóa trong tế bào ung thƣ khác tế bào thƣờng (pH, nhiệt độ...) làm cho cấu trúc

chất mang thuốc thay đổi và quá trình phóng thích thuốc xảy ra. Lúc này, thuốc chống

ung thƣ mới có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thƣ [52, 53].

Hình 1.18: Quá trình nhập bào của chất mang-thuốc vào tế bào [25]

Đối với các tế bào lành do không có các thụ thể đặc hiệu liên kết với tác nhân

hƣớng đích nên các hệ mang thuốc hƣớng đích không tƣơng tác với màng tế bào. Chất

mang thuốc sẽ không bị giữ lại trên màng tế bào lành mà di chuyển đến tế bào ung thƣ,

nơi có sự hấp dẫn tƣơng tác, tại đây quá trình phóng thích thuốc xảy ra, sau cùng là hệ

chất mang này bị đào thải ra khỏi cơ thể [51, 53].

1.2 BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM

Với các đặc tính nổi bật của một chất mang thuốc, dendrimer PAMAM hứa hẹn

là chất mang thuốc tiềm năng trong y học. Tuy nhiên, các nhóm amine trên bề mặt

dendrimer PAMAM có khả năng tích điện dƣơng và hoạt động hóa học tƣơng đối

mạnh nên có thể tƣơng tác với các thành phần trong tế bào nhƣ màng tế bào, nội bào,

ty thể, protein, hồng cầu… hình thành các lỗ với kích thƣớc nano trên màng, làm màng

mỏng dần, màng bị ăn mòn hoặc gây ra sự tán huyết. Kết quả màng tế bào bị vỡ giải

phóng ra các enzym nội bào làm ly giải tế bào. Nhằm tăng tính tƣơng hợp sinh học và

khả năng hƣớng đích cũng nhƣ giảm độc tính của dendrimer PAMAM với tế bào

nhƣng vẫn giữ đƣợc những đặc tính nổi bật của dendrimer PAMAM với vai trò chất

mang, một trong những giải pháp đƣợc đƣa ra là tiến hành biến tính bề mặt dendrimer

PAMAM thông qua việc tạo liên kết với các cấu tử khác không có khả năng tích điện,

đồng thời cải thiện một số nhƣợc điểm của dendrimer PAMAM nhƣ tính tan, tính

thấm, tƣơng hợp sinh học, hƣớng đích ... [1, 2, 25, 54-56]

1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học

Để tăng tính tƣơng hợp sinh học cũng nhƣ hỗ trợ khả năng mang thuốc của

dendrimer nói chung và dendrimer PAMAM nói riêng, các nhà nghiên cứu đã đề ra

giải pháp biến tính bề mặt dendrimer PAMAM bằng cách gắn các nhóm thế khác lên

bề mặt dendrimer PAMAM thông qua tạo liên kết bền (urethane hay amide, ...) với

nhóm –NH2 tạo ra dạng liên hợp dendrimer PAMAM-nhóm thế bền và có tính tƣơng

hợp sinh học cao. Trong việc lựa chọn tác nhân cho phản ứng biến tính dendrimer

PAMAM các nhà nghiên cứu không chỉ hƣớng đến tăng tính tƣơng hợp sinh học cho

dendrimer PAMAM mà còn muốn tăng khả năng mang thuốc, tăng hiệu quả sử dụng

thuốc, tăng độ tan, … [5, 25, 35, 57-59]

Các nghiên cứu đã cho thấy các dendrimer có các nhóm cationic ở bề mặt có độc

tính với tế bào vì khi đó dendrimer sẽ tƣơng tác với màng tế bào phá vỡ màng tế bào,

với các dendrimer có các nhóm anionic thì ít có độc tính với tế bào tuy nhiên khả năng

thấm qua màng của các dendrimer này lại kém nên không giúp thuốc đi sâu vào bên

trong tế bào [5, 25, 35, 57-59]. Do đó, để cải thiện khả năng thấm qua màng sinh chất,

trong đề tài này, các dendrimer PAMAM đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt những nhóm

alkyl có mạch carbon dài ngắn khác nhau.

1.2.2 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích

1.2.2.1 Sơ lược về tác nhân hướng đích đến tế bào ung thư

Tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ là các phân tử có khả năng nhận diện tế

bào ung thƣ, từ đó giúp chất mang thuốc di chuyển đến đúng vị trí tế bào ung thƣ. Phối

tử đƣợc chọn cho mục tiêu hƣớng đích có khả năng liên kết đặc biệt với thụ thể

(receptor) thể hiện quá mức ở các tế bào khối u hoặc mạch máu khối u mà không thể

hiện hoặc thể hiện rất ít ở các tế bào thƣờng. Đặc tính quan trọng của thụ thể là khả

năng liên kết chọn lọc với những phối tử đặc trƣng. Điều này giúp cho các nhà nghiên

cứu thiết kế loại thuốc phù hợp để tiêu diệt các tế bào ung thƣ và các gene gây ung

thƣ, đồng thời giảm thiểu lƣợng thuốc đƣa vào cơ thể mà vẫn đảm bảo đƣợc hiệu quả

[1-4].

Các tác nhân hƣớng đích đƣợc sử dụng là những tác chất cần thiết cho quá trình

sinh trƣởng và phân chia của tế bào. Hiện nay có nhiều tác nhân hƣớng đích nhƣng

thông dụng nhất là: Acid folic (FA); Arg-Gly-Asp (RGD); anti EGFR (Epidermal

Growth Factor Receptor); và anti HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor

2) [3, 5-12].

Hiện nay, các nhà nghiên cứu quan tâm sử dụng tác nhân hƣớng đích acid folic vì

acid folic là chất cần thiết cho quá trình sinh trƣởng của tế bào. Một lý do khác nữa là

trong phân tử acid folic có nhóm carboxylic (–COOH) dễ dàng phản ứng khi gắn lên

chất mang thuốc dendrimer PAMAM và giá thành lại rẻ hơn nhiều một số tác chất

hƣớng đích khác.

1.2.2.2 Tác nhân hướng đích acid folic

Acid folic (hay vitamin M, folacin, vitamin B9) và folate (dạng anion) là các

dạng hòa tan trong nƣớc. Acid folic là nguồn carbon cho tổng hợp một số chất chuyển

hóa trung gian, quan trọng nhất là tổng hợp nucleotide, tổng hợp ADN và phát triển tế

bào. Acid folic đƣợc đƣa vào trong tế bào hoặc thông qua chất mang folate hoặc thông

qua mối tƣơng tác ái lực cao giữa acid folic và thụ thể folate (folate receptor, FAR).

Đặc biệt là thụ thể folate có mặt ở khắp nơi trong tất cả các tế bào ung thƣ, trong khi

đó chúng không có hoặc xuất hiện rất ít trong các tế bào bình thƣờng.

Các thụ thể folate biểu hiện quá mức ở nhiều loại tế bào ung thƣ nhƣ tế bào ung

thƣ phổi, thận, buồng trứng, nội mạc tử cung, đại trực tràng, vú, tinh hoàn, tế bào máu

tủy, tế bào ung thƣ biểu mô thần kinh nội tiết và di căn não [7, 60, 61].

Do tính ái lực cao giữa acid folic với thụ thể folate, và những đặc trƣng của tế

bào ung thƣ nên các nhà nghiên cứu sử dụng acid folic làm tác nhân hƣớng đích đến tế

bào ung thƣ [25].

Hình 1.19: Thành phần cấu trúc của acid folic

Acid folic liên kết với receptor folate với ái lực cao (Ka = 0.1 – 1nM) và hoàn

toàn không gây hiệu ứng miễn dịch. Nhờ các ƣu điểm trên, Acid folic đƣợc nghiên cứu

ứng dụng rộng rãi làm tác nhân hƣớng đích của các chất có hoạt tính sinh học nhƣ

toxin protein, oligonucleotide, plasmid, thuốc liposome-entrapped, tác nhân

radiopharmaceutical, và tác nhân MRI (Magnetic resonance imaging) [50, 62-64].

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY

Trong những năm gần đây, sự quan tâm đến việc sử dụng dendrimer PAMAM để

cung cấp các hợp chất trị liệu trong y học ngày càng tăng. Tuy nhiên, độc tính của

dendrimer PAMAM do nhóm -NH2 gây ra đã làm hạn chế các ứng dụng lâm sàng của

chúng. Một chiến lƣợc hiệu quả để giảm độc tính dendrimer PAMAM là biến tính bề

mặt của chúng. Trong nhiều báo cáo [2, 32, 35, 57, 65-68] cho thấy biến tính bề mặt

dendrimer PAMAM là một phƣơng pháp sửa đổi bề mặt của dendrimer PAMAM với

các nhóm chức khác để che lấp đi các điện tích dƣơng của dendrimer. Điều này đã

đƣợc thực hiện bằng cách trung hòa điện tích dƣơng trên bề mặt phân tử dendrimer

PAMAM, ví dụ nhƣ PEG hóa, acetyl hóa, folate hóa, carbohydrate hóa và peptide liên

hợp, …

Bên cạnh làm giảm độc tính, việc biến tính bề mặt cũng có thể đáp ứng đƣợc một

số lợi ích khác trong lĩnh vực phân phối thuốc bao gồm cả bao bọc thuốc, hòa tan, bảo

vệ các phân tử sinh học, vận chuyển gene, điều trị hƣớng đích, cải thiện cấu hình ổn

định, cấu trúc sinh học và khả năng chữa trị, … [2, 69-71]

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của PGS. TS Nguyễn Cửu Khoa là nhóm đi tiên

phong nghiên cứu về dendrimer và đã đạt những thành công đáng kể [25, 47, 72], …

Biến tính dendrimer PAMAM với tác nhân alkyl và tác nhân hƣớng đích-acid folic

trong đề tài này cũng là nghiên cứu đƣợc thực hiện đầu tiên ở Việt Nam.

1.3.1 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân alkyl hóa

Năm 2003, Công trình của Rachaneekorn Jevprasesphant và cộng sự [71] đã

cung cấp dữ liệu gắn acyl chloride vào cấu trúc dendrimer PAMAM ở vị trí các nhóm

–NH2 bề mặt. Liên hợp dendrimer PAMAM - lauroyl đƣợc báo cáo có khả năng giảm

gây độc và làm tăng tính thấm tế bào.

Năm 2009, Waite và cộng sự [66] đã trung hòa một phần nhỏ các nhóm amine

bậc 1 của dendrimer PAMAM G5.0 bởi phản ứng acetyl hóa sử dụng acetic anhydride.

Kết quả cho thấy khi acetyl hóa các nhóm amine bề mặt dẫn đến giảm khả năng gây

độc của dendrimer trong các tế bào U87.

Trong một nghiên cứu khác, Rohit B. Kolhatkar và cộng sự [57] đã acetyl hóa

hai thế hệ khác nhau của dendrimer PAMAM, cụ thể là G2.0 và G4.0. Các thử

nghiệm nhƣ khả năng gây độc tế bào, tính thấm và độ hấp thụ vào tế bào biểu mô

Caco-2 đã đƣợc kiểm tra. Kết quả cho thấy khả năng gây độc giảm hơn 10 lần khi

tăng các nhóm acetyl trên bề mặt dendrimer PAMAM, trong khi vẫn duy trì tính

thấm qua lớp đơn bào.

Một loạt các biến tính bề mặt dendrimer PAMAM bằng phản ứng acetyl hóa

nhằm mục đích giảm độc tính tế bào đã đƣợc báo cáo [2, 32, 57, 65-68].

Năm 2009, trong một nghiên cứu của Saovapakhiran và cộng sự [55], dendrimer

PAMAM thế hệ thứ ba (G3.0) đã đƣợc biến đổi chứa hai gốc lauroyl (G3L2), hai gốc

propranolol (G3P2), hoặc hai gốc lauroyl và hai gốc propranolol (G3L2P2) ở bề mặt

dendrimer. Sau khi khảo sát sự hấp thu tế bào của các dendrimer biến tính ở tế bào ung

thƣ tuyến đại tràng loại HT-29 của ngƣời, kết quả chỉ ra rằng việc biến tính dendrimer

PAMAM G3.0 với các gốc lauroyl làm tăng tỷ lệ hấp thu nội bào. Ngoài ra, biến tính

các dendrimer PAMAM với các gốc lauroyl làm giảm độ tích tụ lysosome, cho thấy có

khả năng tiếp xúc ít của các dendrimer liên hợp với môi trƣờng lysosome có tính acid

cao và các enzym thủy phân, một vấn đề khá quan trọng khi xem xét phân phối các

loại thuốc acid không bền hoặc hợp chất thuốc.

Năm 2011, Julia Morales-Sanfrutos và cộng sự [35] đã tổng hợp dẫn xuất

dendrimer alkyl sulfonyl PAMAM G2.0 với chuỗi alkyl 4, 12, 18 carbon sử dụng nhƣ

vector chuyển gene không virus. Dẫn xuất dendrimer PAMAM với một chuỗi alkyl 18 carbon có hiệu quả thâm chuyển gấp 3,1 lần so với Lipofect AMINETM 2000 trong tế

bào CHO-k1. Nhóm nghiên cứu cũng đã cung cấp quy trình gắn acyl chloride vào cấu

trúc dendrimer PAMAM ở vị trí các nhóm –NH2 bề mặt.

Năm 2010, José L. Santos và cộng sự [36] đã tổng hợp vector chuyển gene gồm

dendrimer PAMAM thế hệ 5, với nhóm bề mặt amine liên kết ngẫu nhiên với chuỗi

alkyl kỵ nƣớc khác nhau về chiều dài mạch carbon (chuỗi alkyl 12-16 carbon). Phản

ứng đƣợc thực hiện giữa dendrimer PAMAM G5.0 với acid carboxylic (acid lauric,

acid myristic và acid palmitic) sử dụng chất trung gian DCC

(dicyclohexylcarbodiimide). José L. Santos và cộng sự đã đƣa ra quy trình gắn acid

carboxylic vào cấu trúc dendrimer PAMAM ở vị trí các nhóm –NH2 bề mặt, sử dụng

chất hoạt hóa carbodiimide liên quan đến việc hình thành liên kết amide hiệu quả.

Hình 1.20: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM với nhóm alkyl bề mặt [36]

Ý tƣởng của nghiên cứu này là biến tính các nhóm amine của dendrimer

PAMAM với lipide để giảm độc tính của dendrimer do tƣơng tác giữa nhóm amine với

màng sinh học. Những vector mới cho thấy khả năng hấp thu ADN đáng kể với khả

năng gây độc tối thiểu, hiệu ứng này có tƣơng quan tỉ lệ thuận với nhóm -CH2- trong

chuỗi kỵ nƣớc.

Năm 2002, Masahiro Ito và cộng sự [73] đã biến tính bề mặt thế hệ thứ tƣ (G4.0)

của dendrimer PAMAM với n-hexyl, hydroxyl và N-acetyl-D-glucosamine thu đƣợc

các sản phẩm (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b) hydroxyl/hexyl

dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0, tiến hành

khảo sát sự hình thành và hấp phụ động học của dendrimer với bề mặt kỵ nƣớc trên

các chất nền rắn.

Hình 1.21: Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất: (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b)

hydroxyl/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0 [73]

Tóm lại, có thể kết luận từ các kết quả rằng dendrimer PAMAM biến tính bề mặt

phù hợp đặc biệt với yêu cầu mang thuốc.

1.3.2 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng

đích – acid folic

Chất mang thuốc hƣớng mục tiêu trung gian folate không chỉ đƣợc sử dụng trong

phân phối thuốc mà còn cho việc phân phối các gene, tác nhân hình ảnh và trong chẩn

đoán ... [7]. Tác nhân hƣớng đích acid folic liên hợp dendrimer PAMAM đƣợc nghiên

cứu phát triển để hƣớng đích đến các tế bào ung thƣ [3, 74].

Năm 2001, James R. Baker và cộng sự [75] đã tổng hợp dẫn xuất dendrimer

PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac với 20 phân tử fluorescein, 5 phân tử FA trên bề

mặt dendrimer PAMAM, các nhóm amine còn lại đƣợc biến tính thành các nhóm

acetamide. James R. Baker cung cấp quy trình gắn FITC và quy trình gắn acid folic

vào cấu trúc dendrimer PAMAM sử dụng chất hoạt hóa EDC.

Hình 1.22: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac [75]

Năm 2002, Quintana và cộng sự [74] đã thành công khi cho dendrimer PAMAM

G5.0 liên hợp với FITC (fluorescein isothiocyanate) và folate thông qua chất hoạt hóa

EDC. Thuốc chống ung thƣ Methotrexate đƣợc gắn kết vào dendrimer nhằm giảm độc

tính của thuốc. Để thâm nhập vào các bề mặt khối u, thông qua hệ thống tuần hoàn

máu, hệ mang thuốc này phải ƣa nƣớc và để dễ dàng thâm nhập vào màng tế bào hệ

thống chất mang thuốc này phải có độ hòa tan các lipide cao. Sự xuất hiện đồng thời

của cả hai tính chất trong chất dẫn truyền thuốc đƣợc sửa đổi (2,3-dihydroxy-propyl-

G5-FITC-FA, và acetamide-G5-FITC-FA) giúp chất mang thuốc vƣợt qua những rào

cản của tế bào, cho phép thuốc thâm nhập vào các tế bào ung thƣ của khối u

xenografts. Quintana và cộng sự cũng đã đƣa ra quy trình gắn FITC, acid folic vào cấu

trúc dendrimer PAMAM sử dụng chất hoạt hóa EDC và quá trình acetyl hóa bề mặt

dendrimer PAMAM.

Trong một nghiên cứu [76], dendrimer PAMAM thế hệ thứ tƣ đã đƣợc tổng hợp,

và gắn với acid folic trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua PEG4000 nhƣ vòng đệm. Nói

cách khác, amine bậc một hiện trên bề mặt nhánh đƣợc liên kết thông qua acid folic và

acid folic-PEG-NHS (N-hydroxysuccinimide) liên hợp (hình 1.23). Sau đó, hệ liên hợp

đƣợc khảo sát về khả năng chuyển thuốc chống ung thƣ bằng cách sử dụng 5-FU ở

chuột mang khối u. Kết quả cho thấy rằng folate-PEG-dendrimer liên hợp an toàn và

hiệu quả trong việc xác định vị trí khối u so với dedrimer không gắn PEG. Biến tính

dendrimer qua PEG-FA làm giảm độc tính huyết tán, tạo ra một mô hình dẫn truyền

thuốc bền vững và hoàn toàn tập trung ở khu vực khối u. Singh và cộng sự cho rằng

dendrimer PAMAM G4.0- FA-PEG có thể đƣợc sử dụng phù hợp nhất cho hệ thống

chuyển thuốc chống ung thƣ nhƣ 5-FU đến tế bào ung thƣ đúng mục tiêu.

Hình 1.23: Cấu trúc hóa học của dendrime PAMAM G4.0-FA-PEG4000 [76]

Năm 2008, Singh và cộng sự [3] tổng hợp thành công dendrimer PAMAM

liên hợp với acid folic và PEG. Đánh giá ảnh hƣởng và độc tính của liên hợp ở

những con chuột mang khối u và đƣa ra kết luận dendrimer-folate-PEG là an toàn

với tế bào, giảm độc tính huyết tán, khả năng nhả chậm thuốc và tích lũy tập trung

ở khu vực khối u.

Năm 2010, nhóm nghiên cứu Andrzej Myc và cộng sự [77] đã tổng hợp chất dẫn

truyền nano dendrimer PAMAM G5.0 trong đó acid folic liên hợp nhƣ là các phân tử

hƣớng mục tiêu và fluorescence resonance energy transfer – FRET (PhiPhiLux G1D2)

là tác nhân phát hiện quá trình apoptosis. Thử nghiệm in vitro trên tế bào KB, phát

hiện có một sự gia tăng gấp 5 lần huỳnh quang trong tế bào. Những kết quả cho thấy,

các ứng dụng tiềm năng của một quá trình apoptosis đƣợc đo lƣờng với thiết bị nano

có mục tiêu, kết quả có thể đƣợc sử dụng đồng thời cho việc giám sát khả năng tự hủy

của hệ chuyển giao thuốc.

Hình 1.24: Sơ đồ phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Ac(96)-FA-PhiPhiLux G1D2 [77]

Năm 2012, Hong Zong và cộng sự [78] đã tổng hợp dendrimer PAMAM

G5.0-Triazine-γMTX-αFA, đã có 3,1 phân tử acid folic đƣợc gắn vào dendrimer

PAMAM G5.0.

Nhìn chung trong những năm gần đây, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã

tổng hợp rất nhiều hệ nano dendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thƣ khác nhau

với mục tiêu hƣớng đích sử dụng tác nhân acid folic. Hệ mang thuốc này có tính đa

chức năng, vừa có thể mang thuốc tới đúng vị trí tế bào ung thƣ, vừa tăng tính tƣơng

hợp sinh học, vừa tăng khả năng thâm nhập vào màng tế bào, nhả chậm thuốc của hệ

dẫn thuốc, .... [3, 4, 6, 9, 10, 32, 79-85]

1.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA

DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT

1.4.1 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất dựa vào phổ MALDI-

TOF-MS (WtMALD)

Phổ MALDI-TOF MS là một công cụ hữu hiệu để sàng lọc khối peptide của sự

phân loại men tryptic. Phƣơng pháp này khá hiệu quả bởi vì việc chuẩn bị mẫu tƣơng

đối dễ và khối lƣợng không bị ảnh hƣởng bởi các tác nhân bên ngoài nhƣ dung môi,

pH, muối và chất tẩy rửa. Ngoài ra, MALDI-TOF-MS tạo ra peptide chỉ có 1 điện tích

do đó trên phổ đồ chỉ hiển thị một tín hiệu, tạo điều kiện để giải thích dữ liệu.

Phƣơng pháp MALDI-TOF-MS đã đƣợc sử dụng để đánh giá khối lƣợng của

những phân tử có trọng lƣợng phân tử lớn. Khối lƣợng trung bình đƣợc xác định từ các

tín hiệu của ion phân tử mẹ. Phƣơng pháp MALDI-TOF-MS này hiện nay đã đƣợc áp

dụng để đo khối lƣợng phân tử cho dendrimer trọng lƣợng phân tử lớn và trọng lƣợng

phân tử là không ảnh hƣởng đến loại khối phổ này [57, 86, 87].

MALDI-TOF-MS thƣờng đƣợc sử dụng cho polymer sinh học nhƣ protein

hay peptide. Hiện nay, các nghiên cứu gần đây cũng đã sử dụng phƣơng pháp

phổ MALDI-TOF-MS để xác định khối lƣợng phân tử dendrimer [32, 56, 65-

68].

Rohit B. Kolhatkar và cộng sự [77] đã sử dụng phổ MALDI-TOF-MS xác

định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM (G2.0, G4.0) và dẫn xuất (bảng 1.1).

Hiệu số sai lệch khoảng 0-6 khi so sánh với giá trị khối lƣợng mol tính toán theo

lý thuyết và xác định bằng MALDI-TOF-MS. 0,25 %; 0,37 %; 0,15 %; 6,18 %;

4,99 ; 5,07 . Hiệu số sai lệch so với lý thuyết không đáng kể (0-6 ) cho thấy

MALDI-TOF-MS là một phƣơng pháp phổ hiệu quả để đánh giá trọng lƣợng phân

tử dendrimer PAMAM.

Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM và dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77]

Dendrimer Lý thuyết MALDI Hiệu số sai

PAMAM lệch (%) WtMALDI WtLT

0,06 3256 3258 G2NH2

0,37 3550 3563 G2A7

0,15 3928 3934 G2A16

6,18 14215 13337 G4NH2

4,99 15559 G4A32 14782

5,07 16735 15887 G4A60

Trong báo cáo của Rohit B. Kolhatkar và cộng sự [57] đã thành công khi biến

tính các nhóm bề mặt amine của dendrimer PAMAM (G2.0, G4.0) với nhóm acetyl.

Khối lƣợng phân tử của dendrimer và dẫn xuất đƣợc xác định dựa vào phổ MALDI- TOF-MS cho kết quả phù hợp với các dữ liệu thu đƣợc từ phổ 1H-NMR.

Seungpyo Hong và cộng sự [88] đã sử dụng phổ MALDI-TOF-MS xác định khối

lƣợng phân tử dendrimer PAMAM (G5.0, G7.0) và dẫn xuất, so sánh với giá trị khối

lƣợng mol lý thuyết cho thấy sự tƣơng quan phù hợp.

Hong Zong và cộng sự [78] đã tổng hợp dendrimer PAMAM G5.0-Triazine-

γMTX-αFA, dendrimer PAMAM G5.0-Triazine-γMTX-αFA, khối lƣợng phân tử cũng

đo đƣợc xác định bằng phổ MALDI-TOF-MS (WtMALDI; 16.816; WtMALDI; 34.266) .

1.4.2 Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR

Bên cạnh việc sử dụng phổ 1H-NMR để xác định đặc tính cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ, một số công bố trên các tạp chí quốc tế cho thấy khi sử dụng phổ 1H-

NMR có thể tính một cách hiệu quả độ chuyển hóa sau phản ứng hoặc độ thế của

một số polymer [89-91]. Tuy nhiên chƣa có một công bố chính thức riêng biệt nào về việc sử dụng phổ 1H-NMR trong đánh giá trọng lƣợng phân tử của dendrimer. Sử dụng phổ 1H-NMR để đánh giá khối lƣợng phân tử dendrimer sẽ đƣợc trình bày chi tiết trong luận án này, và đây cũng là điểm phát hiện mới về phổ 1H-NMR cũng

nhƣ về dendrimer.

1.4.3 Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) cũng đã đƣợc sử dụng để xác định trọng lƣợng

phân tử các thế hệ khác nhau của dendrimer, tách và tinh chế dendrimer [86, 87].

Trong đề tài này, với những dendrimer PAMAM có trọng lƣợng phân tử nhỏ (Wt 

2.500), chúng tôi sử dụng khối phổ MS để xác định khối lƣợng phân tử. Những

dendrimer PAMAM có khối lƣợng phân tử lớn (Wt > 2500), chúng tôi dùng phổ cộng

hƣởng từ hạt nhân để đánh giá khối lƣợng phân tử của chúng.

Ngoài ra, với các polymer truyền thống có thể sử dụng GPC (Gel Permeation

Chromatograph) để xác định khối lƣợng phân tử. Tuy nhiên với các dendrimer

PAMAM kích thƣớc nano, do cấu trúc hình cầu với các nhóm chức ở trên bề mặt (đặc

biệt với các nhóm NH2) sẽ xảy ra hiện tƣợng nếp gấp ngƣợc ở các loại dung môi khác

nhau, pH khác nhau (đặc biệt với hệ đệm pH =11) sẽ cho kết quả hoàn toàn trái ngƣợc,

tức là dendrimer thế hệ lớn hơn thì kích thƣớc lại nhỏ hơn [92]. Vì thế không thể sử

dụng GPC để xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM. Tuy nhiên, sau

khi biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với các polymer khác, lúc này khối lƣợng

phân tử của polymer lớn hơn nhiều so với khối lƣợng phân tử của dendrimer nên ta lại

có thể sử dụng đƣợc GPC để xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer. Trong báo

cáo của Tu Uyen Ly và cộng sự , đã sử dụng GPC chứng minh mức độ pegylated hóa

là khoảng 30% trọng lƣợng phân tử dendrimer PAMAM-G3.0-pegylated là 57.800

ứng với 10 nhóm amine đã đƣợc pegylated trong tổng số 32 nhóm amine.

Khối lƣợng phân tử lý thuyết của các dendrimer PAMAM (WtLT) theo báo cáo

của các nhà sản xuất [69].

Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) của các dendrimer

PAMAM từ G-0.5 – G3.0

G-0.5 G0.0 G0.5 G1.0 G1.5 G2.0 G2.5 G3.0 G

518 1204 1430 2830 3256 6045 6909

WtLT 407

2 CHƢƠNG 2

3 NGHIÊN CỨU

2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 từ thế hệ G-0.5 đến G3.0.

- Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với tác nhân alkyl (acyl chloride,

alcohol, acid carboxylic, alkylamine).

- Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 hay dendrimer PAMAM G3.0-

alkyl với tác nhân hƣớng đích - acid folic.

- Thử độc tính tế bào của dendrimer PAMAM và một số dẫn xuất của

dendrimer PAMAM.

- Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của hệ dendrimer PAMAM-thuốc

và dẫn xuất của dendrimer PAMAM-thuốc.

- Xác định kích thƣớc nano của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn

xuất của dendrimer PAMAM G3.0.

- Khảo sát khả năng thâm nhập tế bào

2.1.1.1 Tổng hợp dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 đƣợc tổng hợp từ lõi

ethylenediamine (EDA) đƣợc phát triển nhánh bằng methyl acrylate (MA) và

ethylendiamine trên cơ sở phản ứng ester hóa và phản ứng alkyl hóa theo báo cáo của

Donald Tomalia [13].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của

dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Sử dụng phƣơng pháp phân tích MS xác định khối lƣợng phân tử dendrimer

PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Sử dụng phƣơng pháp TEM xác định hình thái, kích thƣớc dendrimer

PAMAM G3.0

2.1.1.2 Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với tác nhân ankyl (acyl chloride, acid

carboxylic, alcohol và alkylamine)

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 bằng acyl chloride (RCOCl) dựa trên cơ sở

liên kết amide (-NHCO-) đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine bậc một (-

NH2) ở bề mặt của dendrimer PAMAM G3.0 và nhóm cacbonyl (-CO-) của hợp chất

acyl chloride (RCOCl) theo quy trình phản ứng đơn giản theo báo cáo của

Rachaneekorn Jevprasesphant [71].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acyl chloride.

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic dựa trên cơ sở liên kết

amide (-NHCO-) với chất hoạt hóa 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

hydrochloride (EDC) [93]. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của

Quintana [74] và James R. Baker [75].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acid carboxylic.

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol dựa trên nguyên tắc tạo liên kết

urethane giữa dendrimer PAMAM G3.0 và alcohol thông qua chất hoạt hóa p-

nitrophenyl cloroformate (NPC). Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của

Tran Ngoc Quyen [94] và Ly Tu Uyên [47].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol.

 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine tạo liên kết

amide (-CO-NH-) dựa trên cơ sở phản ứng giữa ester và amine [95].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine.

2.1.1.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hướng đích – acid folic

Phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic tƣơng tự nhƣ phản

ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic đƣợc thực hiện theo quy

trình của tác giả Quintana [74] và James R. Baker [75].

2.1.1.4 Thử độc tính tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất alkyl-

dendrimer PAMAM G3.0

Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn

xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc thử nghiệm trên tế bào MCF-7 (Frederick,

MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học Ajou, TP.

Suwon, Hàn Quốc.

2.1.1.5 Khảo sát khả năng mang nhả thuốc chống ung thư 5-fluorouracil (5-FU)

Xác định lƣợng thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil mang và nhả trong phân tử

dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất gián tiếp thông qua HPLC (High-Performance

Liquid Chromatography).

2.1.1.6 Khảo sát khả năng thâm nhập tế bào

Khả năng thâm nhập tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất đƣợc tiến

hành thử nghiệm trên dòng tế bào Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu

(Confocal laser scanning microscopy) tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp tổng hợp

a. Tổng hợp dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 đƣợc tổng hợp từ lõi

ethylenediamine (EDA) đƣợc phát triển nhánh bằng methyl acrylate (MA) và

ethylendiamine trên cơ sở phản ứng ester hóa và phản ứng alkyl hóa theo báo cáo của

Donald Tomalia [13]. Đầu tiên, các sản phẩm G-0.5 ban đầu đƣợc tổng hợp từ lõi

ethylendiamine với methyl acrylate trong 4 ngày. Bƣớc thứ hai là phản ứng amide hoá

của G-0.5 các gốc methyl carboxylate bên ngoài với một lƣợng dƣ của EDA để có

đƣợc thế hệ G0.0. Các quá trình tổng hợp của các thế hệ cao hơn đã đƣợc tiến hành

tƣơng tự. Dendrimer trọng lƣợng phân tử thấp (từ G-0.5 đến G2.0) đƣợc tinh chế qua

việc loại bỏ các phân tử nhỏ bởi bay hơi chân không. Dendrimer trọng lƣợng phân tử

cao hơn (từ G2.5 đến G3.0) đã đƣợc tinh chế thẩm tách qua sử màng Cellulose

MWCO 3.500-5.000D với MeOH trong 48 giờ, sản phẩm đƣợc lƣu giữ trong MeOH.

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM lõi etylendiamin từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Tổng hợp dendrimer PAMAM đƣợc thực hiện bởi phản ứng cộng Michael của

amine bậc một với MA (tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ) và phản ứng amine

hóa tiếp theo của ester và EDA (tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ chẵn).

Khi tiến hành phản ứng tổng hợp các thế hệ chẵn dendrimer PAMAM, lƣợng

EDA sử dụng gấp nhiều lần so lƣợng lý thuyết (từ 10-250 lần) nhằm tránh sinh ra các

phản ứng phụ nhƣ:

- Phân tử ethylenediamine thế chƣa hết.

- Hai nhóm NH2 trên phân tử Dendrimer phản ứng đóng vòng với nhau.

- Hai phân tử Dendrimer tự dimer hóa.

Các sản phẩm dendrimer PAMAM với lõi ethylene diamine từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 đƣợc tổng hợp có dạng dẻo màu vàng nhạt đậm dần từ G-0.5 đến G3.0.

b. Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với tác nhân ankyl (acyl chloride,

acid carboxylic, alcohol và alkylamine)

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Phƣơng pháp biến tính dendrimer PAMAM bằng acyl chloride (RCOCl) dựa trên

cơ sở liên kết amide (-NHCO-) đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine bậc một

(-NH2) ở bề mặt của dendrimer PAMAM và nhóm cacbonyl (-CO-) của hợp chất acyl

chloride (RCOCl).

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Để tăng tốc độ và hiệu suất của phản ứng, cũng nhƣ hạn chế sản phẩm không

mong muốn giữa HCl với các nhóm –NH2 của dendrimer PAMAM, triethylamine

(TEA) đƣợc thêm vào để trung hòa lƣợng HCl tạo ra trong quá trình phản ứng (tỉ lệ

mol TEA : acyl chloride là 1:1) Quy trình phản ứng đơn giản theo báo cáo của

Rachaneekorn Jevprasesphant [71].

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acyl chloride.

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

Phƣơng pháp biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic dựa trên cơ

sở liên kết amide (-NHCO-) với chất hoạt hóa 1-Ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC).

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

EDC là một carbodiimine, dạng liên hợp với chloride, tan tốt trong nƣớc, rất dễ

hút ẩm và đƣợc biết đến nhƣ tác nhân hoạt hóa nhóm carboxyl để kết hợp với nhóm

amine bậc một hình thành nên liên kết amide. EDC hoạt động hiệu quả trong môi

trƣờng pH 4-6. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của Quintana [74] và

James R. Baker [75].

 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Phƣơng pháp tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0-alcohol dựa trên nguyên tắc tạo

liên kết urethane giữa dendrimer PAMAM G3.0 và alcohol thông qua chất hoạt hóa p-

nitrophenyl cloroformate (NPC).

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

NPC là chất có hoạt tính rất mạnh, dễ bị phân hủy trong môi trƣờng nƣớc do đó

phải làm khan tác chất và dung môi trƣớc khi tiến hành phản ứng. Phản ứng đƣợc thực

hiện ở nhiệt độ thấp, khuấy liên tục, trong môi trƣờng khí nitơ nhằm hạn chế các sản

phẩm không mong muốn (sơ đồ 2.5). Phản ứng thực hiện theo báo cáo của Tran Ngoc

Quyen [94] và Ly Tu Uyên [47].

Sơ đồ 2.5: Các biến đổi không mong muốn của chất hoạt hóa NPC

 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

Phản ứng biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine tạo liên kết

amide (CO-NH) dựa trên cơ sở phản ứng giữa ester và amine [95].

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

Methanol đƣợc sử dụng trong phản ứng vừa có vai trò là dung môi hòa tan

dendrimer, bên cạch đó còn là chất thúc đẩy phản ứng xảy ra nhanh hơn do có khả

năng làm tăng độ phân cực của liên kết  trên nối đôi C=O.

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc và khối

lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine.

c. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích – acid folic

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA

Phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic tƣơng tự nhƣ phản

ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic. Tuy nhiên, trong phân tử

acid folic có cả nhóm –COOH và nhóm –NH2 nên phản ứng sẽ có thêm những sản

phẩm không mong muốn. Các sản phẩm không mong muốn đó có thể sinh ra từ phản

ứng của nhóm –COOH và –NH2 hay phản ứng tự polymer hóa của các phân tử acid

folic thông qua liên kết amide. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của

tác giả Quintana [74] và James R. Baker [75].

Phản ứng biến tính dendrimer PAMAM bằng acid folic trải qua hai giai đoạn: tạo

dạng liên hợp EDC - FA và phản ứng tạo liên kết amide giữa dạng liên hợp EDC - FA

và nhóm –NH2 của dendrimer PAMAM G3.0. Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian của giai

đoạn 1 thì sẽ tạo sản phẩm polymer của acid folic, còn nếu quá nhanh thì dạng phức

chƣa kịp hình thành dẫn đến sản phẩm dạng muối (sơ đồ 2.8).

Sơ đồ 2.8: Các sản phẩm không mong muốn của phản ứng biến tính dendrimer

PAMAM G3.0 với acid folic

2.1.2.2 Xác định cấu trúc, hình thái sản phẩm

- Cấu trúc sản phẩm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp phổ hiện đại cộng

hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR.

- Khối lƣợng sản phẩm dendrimer PAMAM (từ thế hệ G-0.5 đến G2.0) đƣợc

xác định bằng phƣơng pháp khối phổ MS.

- Hình thái sản phẩm đƣợc xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM.

1H-NMR

2.1.2.3 Xác định khối lượng phân tử dendrimer PAMAM và dẫn xuất dựa vào phổ

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR cung cấp một phƣơng pháp đơn giản để phân tích cấu trúc phân tử của dendrimer và dẫn xuất, qua phổ 1H-NMR cho thấy

những biến đổi hóa học xảy ra ở các nhóm bề mặt trong quá trình tổng hợp dendrimer. Phổ 1H-NMR cũng có thể đƣợc sử dụng để xác định khiếm khuyết cấu trúc có thể có

trong các dendrimer. Đây là một phƣơng pháp vô cùng hữu hiệu để giám sát độ tinh khiết của dendrimer, ngay cả ở các thế hệ cao [96].

Bên cạnh việc sử dụng phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc phân tử của dendrimer

và dẫn xuất, trong đề tài này, khối lƣợng sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn

xuất dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc chúng tôi xác định gián tiếp dựa trên cơ sở phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR. Đây cũng là điểm mới của luận án thể hiện sự tiện

lợi khi xác định cấu trúc và trọng lƣợng phân tử trong một phép phân tích.

a. Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-

1H-NMR là phổ quan trọng, có độ nhạy cao và dễ thực hiện, đƣợc sử dụng để

NMR

xác định thành phần cấu trúc của phân tử hợp chất hữu cơ. Điều phát hiện thú vị khi phân tích phổ 1H-MNR của các dendrimer PAMAM đó là các tín hiệu proton (a),

(e) luôn xuất hiện rõ và không có sự chồng peak. Khi kết hợp diện tích các tín hiệu proton xuất hiện trên phổ 1H-MNR và số lƣợng các proton có trong phân tử

dendrimer PAMAM ở các vị trí (e) và (a), chúng tôi đã đề xuất ra công thức tính

khối lƣợng phân tử của dendrimer.

So sánh tỉ lệ diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (e), (a) thể hiện trên phổ 1H-

MNR (NMR) và tỉ lệ proton ở 2 vị trí (e), (a) trên phân tử dendrimer PAMAM (LT),

cách tính khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM (WtNMR) đƣợc chúng tôi đề xuất thông qua phổ 1H-NMR nhƣ sau (công thức 2.1):

, : Diện tích các tín hiệu proton ở các vị trí (e) và (a)

xuất hiện trong phổ 1H-NMR.

, : Tổng các proton ở các vị trí (e) và (a) trong công

thức phân tử dendrimer PAMAM.

WtLT: Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM tính dựa vào công thức phân tử.

* Với dendrimer PAMAM G-0.5, tín hiệu các proton (a) và (b) đƣợc sử dụng

để tính khối lƣợng phân tử do tín hiệu (e) chƣa xuất hiện ở thế hệ này.

Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa trên phổ 1H-NMR

Trong công thức trên,

- Diện tích các tín hiệu proton ở các vị trí (e) và (a) xuất hiện trong phổ 1H-

NMR đƣợc xác định dựa vào phổ 1H-NMR (xem hình 2.1).

- Tổng các proton ở các vị trí (e) và (a) trong công thức phân tử dendrimer

PAMAM đƣợc chúng tôi thống kê và lập thành bảng (bảng 2.1) sau:

Bảng 2.1: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (e), (a) trên phân tử dendrimer (LT)của các dendrimer

PAMAM từ G-0.5 đến G3.0

G-0.5 8(H ở vị trí b) 4 2

G0.0 8 4 2

G0.5 8 12 0,6667

G1.0 24 12 2

G1.5 24 28 0,8571

G2.0 56 28 2

G2.5 56 60 0,9333

G3.0 120 60 2

Ví dụ:

Áp dụng với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0, theo công thức trên (công thức 2.1), dựa vào diện tích các tín hiệu các proton (a) và (e) xuất hiện trên phổ 1H-NMR

(hình 2.1) và dữ liệu thống kê bảng 2.1, khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc tính trên cơ sở phổ 1H-MNR nhƣ sau:

Hình 2.1: Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM G3.0

b. Xác định khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0

dựa vào phổ 1H-NMR

Bên cạnh đó, khi nghiên cứu đặc tính cấu trúc các phổ 1H-NMR của dẫn xuất của

dendrimer PAMAM G3.0, chúng tôi nhận thấy các tín hiệu proton ở các vị trí (a) và (j) trên phổ 1H-NMR không có sự chồng peak, tín hiệu (a) không thay đổi trong suốt quá

trình chuyển hóa và tín hiệu (j) liên quan đến sự chuyển hóa của các nhóm phản ứng

nên đƣợc lựa chọn để tính độ chuyển hóa (x ) của các sản phẩm dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0.

Cách xác định độ chuyển hóa của các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc

đề xuất nhƣ sau:

: Diện tích các tín hiệu proton ở các vị trí (j) và (a)

xuất hiện trong phổ 1H-NMR.

, : Tổng các proton ở các vị trí (j) và (a) trong công

thức của dẫn xuất ankyl-dendrimer PAMAM G3.0.

Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 thông qua phổ 1H-NMR

Trong công thức trên,

- Diện tích các tín hiệu proton ở các vị trí (j) và (a) xuất hiện trong phổ 1H-NMR

đƣợc xác định dựa vào phổ 1H-NMR.

- Tổng các proton ở các vị trí (j) và (a) trong công thức phân tử của dẫn xuất

ankyl-dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc thống kê và lập thành bảng (bảng 2.2).

Bảng 2.2: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (j), (a) trên phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT)

Vị trí H (j) Vị trí H (a)

32 nhóm (30 nhóm) - CH3 -CH2CH2N-

32 x 3 30 x 2

Dữ liệu trong bảng 2.2 cho biết tổng số proton ở vị trí (j) và (a) trong công thức

cấu tạo của dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0. Cách thức thống kê trên cơ sở

các nhóm thế đã chuyển hóa hoàn toàn, nghĩa là 32 nhóm amine –NH2 trên phân tử

dendrimer PAMAM G3.0 đã phản ứng hết và gắn 32 nhóm alkyl –NH-CO-

(CH2)nCH3. Nhƣ vậy trong mỗi phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 có

32 nhóm methyl, mỗi nhóm methyl (-CH3) có 3 proton H và 30 nhóm methylen (-

CH2-) ở vị trí (a), mỗi nhóm có 2 proton H.

Trong công thức 2.2 trên,

giá trị: tƣơng đƣơng với độ chuyển hóa x  100%

Độ chuyển hóa x = 100 khi tất cả các nhóm phản ứng đã chuyển hóa hoàn toàn.

Sau khi xác định đƣợc độ chuyển hóa (x ), có thể tính đƣợc số nhóm chuyển hóa z =

x .32 nhóm (vì dendrimer PAMAM G3.0 có 32 nhóm bề mặt tham gia phản ứng), từ

đó tính đƣợc khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 (WtNMR).

Ví dụ:

Áp dụng với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h, Độ chuyển hóa sản

phẩm tính đƣợc trên cơ sở phổ 1H-MNR (hình 2.2) theo công thức trên:

Số nhóm chuyển hóa:

z = x%.32 = 48,56%.32 = 15,5  16 nhóm

Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10 đƣợc tính toán nhƣ

sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.2, bảng 2.3):

WtNMR = Wtlt(dendrimer PAMAM 3.0) + 16. Wtlt(dodecanoyl chloride) – 16. Wtlt(HCl)

= 9825

(với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909, H = 1,00784; Cl = 35,453)

Hình 2. 2: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10

2.1.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hệ số chuyển hóa của phản ứng

- Khảo sát thời gian mà phản ứng cho độ chuyển hóa tốt nhất đối với phản ứng

giữa dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride.

- Khảo sát nhiệt độ mà phản ứng cho độ chuyển hóa tốt nhất đối với phản ứng

giữa dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine.

2.1.2.5 Qui ước và tính toán

a. Hiệu suất phản ứng

Hiệu suất phản ứng của các chất tổng hợp, đƣợc tính theo công thức:

Trong đó:

mtt: khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc thực tế (gam)

mlt: khối lƣợng sản phẩm tính toán theo lý thuyết (gam)

H ( ): hiệu suất của sản phẩm tổng hợp đƣợc (%)

b. Hiệu số sai lệch so với lý thuyết

Hiệu số sai lệch so với lý thuyết, đƣợc tính theo công thức:

Trong đó:

Mtt: khối lƣợng phân tử sản phẩm tính toán thực tế hoặc đo đƣợc

Mlt: khối lƣợng phân tử sản phẩm theo lý thuyết

ζ (%): hiệu số sai lệch so với lý thuyết (%)

2.1.2.6 Thử độc tính tế bào

Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn

xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc thử nghiệm trên các tế bào MCF-7

(Frederick, MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học

Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit cung cấp phƣơng tiện rất thuận tiện và

nhạy cảm nhất để xác định số lƣợng tế bào và khả năng tồn tại. Xét nghiệm này

đƣợc dựa trên sự phân cắt của muối tetrazolium để tạo ra formazan tan trong nƣớc

bằng hệ thống reductase succinate-tetrazolium thuộc chuỗi hô hấp của

mithochondria và chỉ hoạt động trong các tế bào sống. Do đó, lƣợng thuốc nhuộm

formazan là tỷ lệ thuận với số lƣợng các tế bào sống. Các thuốc nhuộm formazan

sản xuất bởi tế bào sống có thể đƣợc định lƣợng bằng quang phổ bằng cách đo độ

hấp thụ của dung dịch thuốc nhuộm ở 450 nm.

2.1.2.7 Khảo sát khả năng mang nhả thuốc chống ung thư 5-fluorouracil (5-FU)

Sử dụng siêu âm để tăng hiệu quả mang thuốc, xác định lƣợng thuốc nang hóa

gián tiếp trong phân tử dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất thông qua HPLC

(High-Performance Liquid Chromatography). Lƣợng 5-FU đƣợc nhả ra đƣợc xác định

bằng phƣơng pháp đo HPLC.

2.1.2.8 Khảo sát khả năng thâm nhập tế bào

Khả năng thâm nhập tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất đƣợc tiến

hành thử nghiệm trên dòng tế bào Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu

(Confocal laser scanning microscopy) tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

2.2 THỰC NGHIỆM

2.2.1 Hóa chất

Bảng 2.3 Một số thông số vật lý của hóa chất

Khối lƣợng riêng Khối lƣợng phân tử Nguồn gốc Hóa chất (g/ml) (g/mol)

191.7 Acros Organics

1-Ethyl-3-(3- dimethylaminoprop yl)carbodiimide hydrochloride (EDC)

5-Flurouracil Sigma-Aldrich 130.08

Acetyl chloride 1.104 Acros Organics 78.50

Acid acetic 1.049 Acros Organics 60.05

Acid decanoic 0.893 Acros Organics 172.26

Acid folic Acros Organics 441.40

Acid hexanoic 0.927 Acros Organics 116.16

Acid myristic Acros Organics 228.37

Butylamine 0.74 Acros Organics 73.14

Decanoyl chloride 0.922 Acros Organics 218.76

Decylamine 0.787 Acros Organics 157.30

0.970 Merck, Đức 75.08 Dimethyl formamide (DMF)

1.10 78.13 Merck, Đức Dimethyl sulfoxide (DMSO)

Dodecanol 0.833 186.33 Acros Organics

Dodecylamine 0.806 185.35 Acros Organics

Ethanol 0.789 46.07 Acros Organics

0.899 60.10 Acros Organics Ethylenediamine (EDA)

Hexanol 0.814 102.17 Acros Organics

Hexanoyl chloride 0.963 134.60 Acros Organics

0.79 32,04 Methanol Merck, Đức

Acrylate 0.956 86.09 Acros Organics Methyl (MA)

Myristoyl chloride 0.908 246.82 Acros Organics

0.827 Octanol 130.23 Acros Organics

0.782 Octylamine 129.24 Acros Organics

201.56 Acros Organics p-Nitrophenyl chloroformate (NPC)

0.87 Toluen 92 Merck, Đức

0.726 101.19 Acros Organics Triethylamine (TEA)

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

- Dụng cụ: Bình cầu cổ nhám hai cổ, bình cầu cổ nhám một cổ, ống nhỏ giọt, pipet,

becher, ống đong, khóa nhám cung cấp nitơ, túi thẩm tách Por 7 Regenerated

Cellulose Membrane, MWCO 3.000D- 5.000D và các dụng cụ khác.

- Micropipet 200μl.

- Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G.

- Máy khuấy từ gia nhiệt C-MAG HS 7 và cá từ.

- Máy cô quay chân không Bũchi Rotavapor R-200, Heating Bath B-490.

- Bể siêu âm hiệu Bransonic, USA, tần số 42kHz, công suất 100W.

- Máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô ở -80oC, tại viện

Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Máy đo khối phổ Agilent 1100 LC-MSD Trap, tại viện Công nghệ Hóa học, Viện

Khoa học và công nghệ Việt Nam, dùng kỹ thuật ESI (Electron Spray Ionization

Mass Spectra).

- Máy cộng hƣởng từ hạt nhân NMR, BRUCKER 500MHz, tại viện Công nghệ Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM 1010 (JEOL, Japan), Đại học Bách

khoa, TP. HCM.

2.2.3 Thực nghiệm

2.2.3.1 Tổng hợp dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

a. Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5 (tổng hợp lõi, thế hệ lẻ)

Cho 37ml (35g; 0,407mol) dung dịch methylacrylate (MA) vào bình cầu hai cổ

500ml, sau đó cho 20ml methanol (MeOH) vào và khuấy đều. Tiếp theo, cho từ từ

từng giọt dung dịch của 5.5ml (5g; 0,083mol) ethylenediamine (EDA) và 20ml MeOH vào hỗn hợp trên. Giữ lạnh hỗn hợp ở 0-4oC trong 1giờ, sau đó ở nhịêt độ phòng trong

48 giờ tiếp theo, khuấy đều và cung cấp khí N2 trong suốt quá trình phản ứng. Tỷ lệ

mol giữa MA và EDA phản ứng là 5:1.

Sau khi phản ứng kết thúc, cô quay loại bỏ tác chất trong 48 giờ, nhịêt độ cô quay luôn giữ thấp hơn 45oC, áp suất chân không 700-760mmHg. Cho MeOH vào

trong lúc cô quay để đuổi hết MA dƣ. Sản phẩm G-0.5 đƣợc bảo quản trong MeOH ở 4-5oC, H=89% (sơ đồ 2.9).

Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5

Phổ 1H-NMR của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (500 MHz,

MeOD, δ ppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -

CH2CH2N< (a) ; -CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CH2CH2NH2 (d, thế hệ

chẵn); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g, thế hệ lẻ ) và -COOCH3 (h, thế

hệ lẻ).

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G-0.5, MeOD, ppm): 2.49 (a), 2.75-2.78 (b),

2.38-2.45 (g) và 3.62-3.70 (h). (hình 3.4)

Phổ MS (dendrimer PAMAM G-0.5): m/z 407 (M+ + H). (phụ lục 1)

b. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 (thế hệ chẵn)

Cho 85ml (75g; 1,248mol) EDA vào bình cầu hai cổ 500ml, sau đó cho 100ml

MeOH vào và khuấy đều. Tiếp theo, cho từ từ từng giọt dung dịch của 5g (0,083mol)

dendrimer PAMAM G-0.5 và 20ml MeOH vào hỗn hợp trên. Giữ lạnh hỗn hợp ở 0- 4oC trong 1giờ, sau đó ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ tiếp theo, khuấy đều và cung cấp

khí N2 trong suốt quá trình phản ứng. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G-

0.5 phản ứng là 50:1.

Sau khi phản ứng kết thúc, cô quay loại bỏ tác chất trong 5 ngày. Do nhiệt độ sôi của EDA là 116oC nên khó có thể tách ở điều kiện nhịêt độ <50oC, áp suất chân không

700-750mmHg, nên phải dùng hỗn hợp Toluen và MeOH với tỷ 9:1 để tạo hỗn hợp

đẳng phí với EDA. Sau khi loại bỏ hết EDA, sử dụng MeOH để loại bỏ toluen [13]. Sản phẩm dendrimer PAMAM G0.0 đƣợc bảo quản trong MeOH ở 4-5oC, H=83 % (sơ

đồ 2.10).

Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0

Phổ 1H NMR (dendrimer PAMAM G0.0, MeOD, ppm): 2.56-2.57 (a), 2.77-2.81

(b), 2.37-2.40 (c), 2.72-2.75 (d) và 3.24-3.33 (e). (hình 3.5).

Phổ MS (dendrimer PAMAM G0.0): m/z 517 (M+ + H). (phụ lục 1)

c. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 (thế hệ lẻ)

Quy trình tổng hợp tƣơng tự nhƣ tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5, sử dụng

30ml (29g; 0,33mol) MA trong 100ml MeOH; 15g dendrimer PAMAM G0.0 trong

20ml MeOH. Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 10:1,

H=88% (sơ đồ 2.11).

Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G0.5, MeOD, ppm): 2.53-2.56 (a), 2.73-2.78

(b), 2.33-2.39 (c), 3.25-3.31 (e), 2.42-2.49 (g) và 3.63-3.67 (h). (hình 3.6).

Phổ MS (dendrimer PAMAM G0.5): m/z 1207 (M+ + H). (phụ lục 1)

d. Tổng hợp dendrimer PAMAM G1.0 (thế hệ chẵn)

Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0, sử dụng 420ml

(378,30g; 6,30mol) EDA trong 100ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G0.5 trong

50ml MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G0.5 phản ứng là

50:1, H=87 %.

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G1.0, MeOD, ppm): 2.58-2.60 (a), 2.80-2.82

(b), 2.37-2.40 (c), 2.73-2.75 (d) và 3.25-3.27 (e). (hình 3.7).

Phổ MS (dendrimer PAMAM G1.0): m/z 1429 (M+ + H). (phụ lục 1)

e. Tổng hợp dendrimer PAMAM G1.5 (thế hệ lẻ)

Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 13ml (12g;

0,14mol) MA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G1.0 trong 50ml MeOH.

Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 10:1, H=83%.

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G1.5, MeOD, ppm): 2.56-2.65 (a), 2.77-2.84

(b), 2.39-2.41 (c), 3.26-3.36 (e), 2.47-2.49 (g) và 3.68 (h). (hình 3.8).

Phổ MS (dendrimer PAMAM G1.5): m/z 2809 (M+ + H). (phụ lục 1)

f. Tổng hợp dendrimer PAMAM G2.0 (thế hệ chẵn)

Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 72,82ml

(65,54g; 1,09mol) EDA trong 100ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G1.5 trong

50ml MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G1.5 phản ứng là

160:1, H=76%.

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G2.0, MeOD, ppm): 2.58-2.60 (a), 2.79-2.82

(b), 2.36-2.39 (c), 2.69-2.74 (d) và 3.25-3.32 (e). (hình 3.9).

Phổ MS (dendrimer PAMAM G2.0): m/z 3260 (M+ + H). (phụ lục 1)

g. Tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 (thế hệ lẻ)

Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 12ml

(10,58g; 0,12mol) MA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G2.0 trong 50ml

MeOH. Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 20:1. Với

dendrimer PAMAM G2.5, sau khi loại MA bằng cô quay chân không, sản phẩm đƣợc

thẩm tách 4 lần bằng MeOH với màng Cellulose MWCO 3.500-5.000D trong 12 giờ

để loại bỏ những tác chất thừa có trọng lƣợng phân tử dƣới 5000D, H=71%. (sơ đồ

2.12).

Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5

Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G2.5, MeOD, ppm): 2.53-2.63 (a), 2.74-2.85

(b), 2.39-2.41 (c), 3.26-3.33 (e), 2.47-2.49 (g) và 3.68-3.68 (h). (hình 3.10).

h. Tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 (thế hệ chẵn)

Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 68ml

(61,4g; 1,02mol) EDA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G2.5 trong 50ml

MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G2.5 phản ứng là 320:1.

Với dendrimer PAMAM G3.0, sau khi loại EDA, toluen bằng cô quay chân không, sản

phẩm đƣợc thẩm tách 4 lần bằng MeOH với màng Cellulose MWCO 3.500-5.000D

trong 12 giờ để loại bỏ những tác chất thừa có trọng lƣợng phân tử dƣới 5000D,

H=67%. (sơ đồ 2.13).

Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0

Phổ 1H NMR (dendrimer PAMAM G3.0, MeOD, ppm): 2.60-2.61 (a), 2.80-2.83

(b), 2.37-2.40 (c), 2.73-2.76 (d) và 3.26-3.33 (e). (hình 3.11).

Ảnh TEM (dendrimer PAMAM G3.0): có cấu trúc hình cầu, kích thƣớc 3-4nm.

2.2.3.2 Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với tác nhân ankyl (acyl chloride, acid

carboxylic, alcohol và alkylamine)

a. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

 Khảo sát thời gian phản ứng

Thí nghiệm đƣợc thực hiện khảo sát với thời gian phản ứng 12 giờ, 24 giờ, 36

giờ, 48 giờ, mỗi khảo sát đƣợc lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu cho hiệu suất

1H-NMR. Quy

cao nhất để đo phổ trình phản ứng đơn giản theo

Rachaneekorn Jevprasesphant [71], đƣợc thực hiện nhƣ sau:

0,332ml decanoyl chloride (1,6 mmol) cho từ từ vào 0,695g dendrimer PAMAM

G3.0 (0,1mmol) hòa tan trong 2ml DMSO, cho tiếp vào 0,223ml TEA (1,6mmol). Hỗn

hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục ở nhiệt độ phòng và khảo sát theo điều kiện

thời gian phản ứng (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ). Sau khi kết thúc phản ứng, tiến

hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với

màng thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm có màu vàng,

dạng dẻo. Với thời gian 12 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-12h, H=52,33%), thời

gian 24 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-24h, H=67.87 ), thời gian 36 giờ (ký hiệu

sản phẩm: G3.0-C10-36h, H=73,53%), thời gian 48 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-

48h, H=68,08%). Thời gian khảo sát phản ứng này cho kết quả chuyển hóa ổn định là

36 giờ (sơ đồ 2.14).

Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc.

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride (500 MHz,

MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -

CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60+z

nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32- z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); và -CH3 (j,

z nhóm). (Hình 3.16).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-12h, MeOD, ppm): 2,53-2,54 (a); 2,73 (b); 2,34 (c);

2,836-2,96 (d); 3,21-3,34 (e) và 0.77 (j). (phụ lục 2).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-24h, MeOD, ppm): 2,68 (a); 2,75-2,77 (b); 2,35-2,44

(c); 2,82-2,89 (d); 3,32-3,46 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 3).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-36h, MeOD, ppm): 2,57 (a); 2,77 (b); 2,37-2,45 (c);

3,01 (d); 3,24-3,40 (e) và 0,80 (j). (phụ lục 4).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-48h, MeOD, ppm): 2,62-2,64 (a); 2,84-2,85 (b); 2,18-

2,21 (c); 3,03 (d); 3,30-3,45 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 5).

Dựa vào độ dịch chuyển các tin hiệu proton có trên phổ 1H-NMR, áp dụng công

thức 2.1, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa và khối lƣợng

phân tử của dân xuất tổng hợp đƣợc.

b. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân acyl chloride khác

(acetyl chloride, hexanoyl chloride, myristoyl chloride)

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acyl chloride khác theo thời gian

phản ứng khảo sát 36 giờ: với acetyl chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C2,

H=70 ), hexanoyl chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6, H=72%), myristoyl

chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C14, H=75 ). Quy trình phản ứng tƣơng tự nhƣ

các phản ứng biến tính sản phẩm G3.0-C10-36 giờ (G3.0-C10). Sản phẩm thu đƣợc

có màu vàng, dạng dẻo.

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc.

Phổ 1H-NMR (G3.0-C2, MeOD, ppm): 2,56-2,57 (a); 2,76 (b); 2,37-2,39 (c);

2,82 (d); 3,24-3,29 (e) và 1,92 (j). (phụ lục 6).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C6, MeOD, ppm): 2,58 (a); 2,78-2,79 (b); 2,39 (c); 2,97 (d);

3,26 (e) và 0,82 (j). (phụ lục 7).

Ảnh TEM (G3.0-C6): có cấu trúc hình cầu, kích thƣớc 4-6nm. (Hình 3.35, 3.36).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C14, MeOD, ppm): 2,59-2,60 (a); 2,81-2,82 (b); 2,40 (c);

2,86-2,87 (d); 3,28-3,36 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 8).

Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton có trên phổ 1H-NMR, áp dụng công

thức 2.1, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa và khối lƣợng

phân tử của dẫn xuất tổng hợp đƣợc.

c. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

Biến tính PAMAM G3.0 bằng acid carboxylic: với acid acetic (ký hiệu sản

phẩm: G3.0-C2-EDC, H=68 ), acid hexanoic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-EDC,

H=70 ), acid decanoic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-EDC, H=74%), acid myristic

(ký hiệu sản phẩm: G3.0-C14-EDC, H= 68 – 75 ). Quy trình phản ứng đơn giản cho

hiệu suất chuyển hóa cao. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của

Quintana [74] và James R. Baker [75] nhƣ sau:

Hòa tan hoàn toàn 0,613g EDC (3,2mmol) trong 2ml nƣớc, sau đó cho vào thêm

1,6 mmol acid carboxylic (acid acetic, acid hexanoic, acid decanoic, acid myristic) và

khuấy đều trong 1 giờ. Nhỏ từng giọt hỗn hợp trên vào dung dịch chứa 0,695g

dendrimer PAMAM G3.0 (0,1mmol) trong 2ml DMSO. Hỗn hợp phản ứng đƣợc

khuấy đều liên tục ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành

thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng

thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0-acid carboxylic (G3.0-C2-EDC, G3.0-C6-EDC, G3.0-C10-

EDC, G3.0-C14-EDC) có màu vàng, dạng dẻo (sơ đồ 2.15).

Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc.

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic (500 MHz,

MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -

CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60+z

nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32- z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); và -CH3 (j,

z nhóm), tƣơng tự nhƣ trong sản phẩm dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acyl

chloride. (Hình 3.16).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C2-EDC, MeOD, ppm): 2,56-2,57 (a); 2,76 (b); 2,37-2,39

(c); 2,82 (d); 3,24-3,29 (e) và 1,92 (j). (phụ lục 9).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C6-EDC, MeOD, ppm): 2,59 (a); 2,78 (b); 2,38-2,47 (c);

3,06 (d); 3,25-3,43 (e) và 0,81 (j). (phụ lục 10).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-EDC, MeOD, ppm): 2,63 (a); 2,83 (b); 2,45 (c); 3,06

(d); 3,31-3,45 (e) và 0,86 (j). (phụ lục 11).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C14-EDC, MeOD, ppm): 2,53 (a); 2,73 (b); 2,34-2,41 (c);

2,84-2,89 (d); 3,21-3,32 (e) và 0,78 (j). (phụ lục 12).

Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H-

NMR

d. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 bằng alcohol mạch thẳng: với etanol (ký hiệu

sản phẩm: G3.0-C2-NPC, H = 68 ), hexanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-NPC, H =

73 ), octanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C8-NPC, H = 78 ), dodecanol (ký hiệu sản

phẩm: G3.0-C12-NPC, H = 79%) theo quy trình phản ứng của Tran Ngoc Quyen [94]

và Ly Tu Uyên [47].

Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện trong hai bƣớc sau:

Bước 1: Hòa tan 0,645g NPC (3,2mmol) trong 2ml CH2Cl2, sau đó cho từ từ từng

giọt alcohol (1,6mmol; etanol, hexanol, octanol, dodecanol). Hỗn hợp đƣợc khuấy đều liên tục 6 giờ trong môi trƣờng khí nitơ ở nhiệt độ 40oC, rồi cho thêm 0,029ml nƣớc

cất (1,6mmol) để phản ứng với lƣợng NPC dƣ trong thời gian 1giờ.

Bước 2: Cho từ từ hỗn hợp phản ứng ở trên vào 0,695g dendrimer PAMAM G3.0

(0,1mmol) hòa tan trong 2ml DMF. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục ở nhiệt

độ phòng trong 12 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất

(4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500-

5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol

(G3.0-C2-NPC, G3.0-C6-NPC, G3.0-C8-NPC, G3.0-C12-NPC) có màu vàng nhạt,

dạng dẻo (sơ đồ 2.16).

Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alcohol (500

MHz, MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -

CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60

nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32-z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); -

NHCOOCH2- (f, z nhóm) và -CH3 (j, z nhóm) (hình 3.23).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C2-NPC, MeOD, ppm): 2,54 (a); 2,73 (b); 2,34 (c); 2,95

(d); 3,15-3,35 (e); 3,98 (f) và 1,13 (j). (phụ lục 13).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C6-NPC, MeOD, ppm): 2,59 (a); 2,79 (b); 2,37-2,42 (c);

3.07 (d); 3,16-3,43 (e); 3,90 (f) và 0,77 (j). (phụ lục 14).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C8-NPC, MeOD, ppm): 2,56 (a); 2,75 (b); 2,34-2,39 (c);

3.03 (d); 3,15-3,40 (e); 3,90-3.95 (f) và 0,77 (j). (phụ lục 15).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C12-NPC, MeOD, ppm): 2,52 (a); 2,62 (b); 2,33 (c); 2,72

(d); 3,21-3,26 (e); 3,89 (f) và 0,78 (j). (phụ lục 16).

Thí nghiệm đƣợc thực hiện khảo sát với thời gian phản ứng 12 giờ, 24 giờ, 36

giờ, 48 giờ, mỗi khảo sát đƣợc lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu cho hiệu suất cao nhất để đo phổ 1H-NMR

NMR

e. Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

 Khảo sát nhiệt độ

Khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ phản ứng (nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC): nhiệt độ phòng (ký hiệu sản phẩm: G2.5- C12-poC, H=65 ), nhiệt độ 60oC (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C12-60o, H=68 C), nhiệt độ 80oC (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C12-80oC, H=68 ). Quy trình phản ứng đơn giản,

đƣợc thực hiện nhƣ sau:

0,368ml dodecylamine (1,6mmol) cho từ từ vào 0,605g dendrimer PAMAM

G2.5 (0,1mmol) đƣợc hòa tan trong 2ml MeOH. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục trong 24 giờ và khảo sát theo điều kiện nhiệt độ (nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC). Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó

bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại

MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-amine (G2.5-C12- poC, G2.5-C12-60oC, G2.5-C12-80oC) có màu vàng nhạt, dạng dẻo. Nhiệt độ khảo sát phản ứng này cho kết quả chuyển hóa ổn định là 80oC (sơ đồ 2.17).

Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc.

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5 với tác nhân alkylamine (500

MHz, MeOD, δppm) với tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -

CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 28+z

nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 28+z nhóm); -CH2CH2COOCH3 (g, 32-z nhóm) -

COOCH3 (h, 32-z nhóm) và -CH3 (j, z nhóm) (hình 3.26).

Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-poC, MeOD, ppm): 2,54-2,59 (a); 2,75-2,81 (b); 2,39-

2,38 (c); 3,24-3,34 (e); 2,44-2,47 (g); 3,66-3,67 (h) và 0,89 (j). (phụ lục 17).

Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-60o, MeOD, ppm): 2,56-2,62 (a); 2,78-2,83 (b); 2,40

(c); 3,26-3,36 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 18).

Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-80o, G2.5-C12, MeOD, ppm): 2,56-2,62 (a); 2,74-2,82

(b); 2,34-2,40 (c); 3,16-3,36 (e); 2,47-2,51 (g); 3,68 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 19).

NMR.

 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine khác (butylamine,

octylamine và decylamine)

Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với các alkylamine khác theo điều kiện nhiệt độ phản ứng 80oC với: butylamine (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C4, H=60%), octylamine

(ký hiệu sản phẩm: G2.5-C8, H=80%), decylamine (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C10,

H=76%). Quy trình phản ứng tƣơng tự nhƣ các phản ứng biến tính sản phẩm G2.5-

C12. Sản phẩm thu đƣợc có màu vàng, dạng dẻo.

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc.

Phổ 1H-NMR (G2.5-C4, MeOD, ppm): 2,63 (a); 2,78-2,83 (b); 2,47-2,49 (c);

3,26-3,36 (e); 2,51-2,59 (g); 3,69 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 20).

Phổ 1H-NMR (G2.5-C8, MeOD, ppm): 2,53-2,63 (a); 2,77-2,83 (b); 2,40 (c);

3,18-3,33 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68-3,71 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 21).

Phổ 1H-NMR (G2.5-C10, MeOD, ppm): 2,541-2,59 (a); 2,46-2,47 (b); 2,37

(c); 3,18-3,33 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68-3,73 (h) và 0,90 (j). (phụ lục 22).

NMR.

2.2.3.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hướng đích - acid folic

a. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic (ký hiệu sản phẩm:

G3.0-FA)

Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của Quintana [74] và James R.

Baker [75]. 0,4mmol FA đã đƣợc hòa tan hoàn toàn trong 10ml DMSO và thêm vào

0,8mmol EDC, khuấy đều trong thời gian 10 phút. Hỗn hợp này sau đó đã đƣợc thêm

từng giọt vào dung dịch của 0,1mmol dendrimer PAMAM G3.0 trong 10ml dung dịch

DMSO. Hỗn hợp dung dịch đƣợc khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau

phản ứng đƣợc thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48

giờ với màng MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH bằng cô quay trong chân không thu

đƣợc sản phẩm. Sản phẩm G3.0-FA thu đƣợc có màu vàng cam, dạng dẻo (H=81 )

(sơ đồ 2.18).

Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc (hình 3. 29, bảng 3.12, phụ lục 23).

Phổ 1H-NMR (G3.0-FA, MeOD, ppm): 2,52 (a); 2,73-2,79 (b); 2,19-2,34 (c, i,

s); 3,08-3,22 (e); 2,62 (d); 8,54 (k); 7,62-7,63 (m); 4,66 (p); 4,50 (q) và 6,73-6,75 (r).

(hình 3. 29, bảng 3.12, phụ lục 23).

NMR.

b. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân

hƣớng đích - acid folic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-FA)

0,4mmol FA đã đƣợc hòa tan hoàn toàn trong 10ml DMSO và thêm vào 0,8mmol

EDC, khuấy đều trong thời gian 10 phút. Hỗn hợp này sau đó đã đƣợc thêm từng giọt

vào dung dịch của 0,1mmol dendrimer PAMAM G3.0 và 1,6mmol hecxanoyl chloride

trong 10ml dung dịch DMSO. Hỗn hợp dung dịch đƣợc khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ

phòng. Dung dịch sau phản ứng đƣợc thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng

MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH bằng cô

quay trong chân không thu đƣợc sản phẩm. Sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C6-

FA có màu vàng sậm, dạng dẻo (H=72 ). Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy

trình của Quintana [74] và James R. Baker [75] (sơ đồ 2.19).

Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA

Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn

xuất tổng hợp đƣợc (hình 3. 32, bảng 3.13, phụ lục 24).

Phổ 1H-NMR (G3.0-C6-FA, MeOD, ppm): 2,52 (a); 2,81 (b); 2,10-2,34 (c, i, s);

2,73 (d); 3,20 (e); 8,54 (k); 7,61-7,63 (m); 4,70 (p); 4,48 (q); 6,71-6,72 (r) và 0,82 (j).

(hình 3. 32, bảng 3.13, phụ lục 24).

NMR.

2.2.3.4 Khảo sát độc tính tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất alkyl-

dendrimer PAMAM G3.0

Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn

xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc thử nghiệm trên các tế bào MCF-7

(Frederick, MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học

Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc. Với quy trình nhƣ sau, cho vào 100 l của dịch treo tế

bào (104 tế bào mỗi giếng) trong đĩa 96 giếng. Ủ các đĩa trong 24 giờ. Thêm 10l các

nồng độ khác nhau của các chất thử nghiệm vào môi trƣờng nuôi cấy trong đĩa. Sau đó

ủ các đĩa trong 6 giờ. Thêm 10l dung dịch Kit vào từng giếng của đĩa (cẩn thận

không để tạo ra các bong bóng ở các giếng). Tiếp theo, ủ các đĩa từ 1-4 giờ trong lồng

ấp. Sau đó, đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 420 ~ 480 nm bằng cách sử dụng một đầu đọc

vi đĩa [97, 98].

2.2.3.5 Khảo sát khả năng mang nhả thuốc chống ung thư 5-fluorouracil (5-FU)

a. Khảo sát mang thuốc chống ung thƣ 5-FU

Hòa tan 200mg dendrimer PAMAM G3.0 (hoặc dẫn xuất dendrimer PAMAM

G3.0) vào 3ml H2O, khuấy đều và tiến hành siêu âm 30 phút hòa tan dendrimer, cho

vào 40mg 5-FU, tiến hành siêu âm thêm 5 phút để tăng hiệu quả mang thuốc rồi khuấy

24 giờ ở nhiệt độ phòng. Thẩm tách dung dịch thu đƣợc 3 lần với túi thẩm tách

MWCO 3.500-5.000D trong 500ml nƣớc cất, mỗi lần 60 phút, để loại 5-FU dƣ không

nang hóa. Dung dịch sau thẩm tách đem đông khô, thu đƣợc sản phẩm dạng bột màu

trắng ngà. Lƣợng 5-FU nang hóa trong cấu trúc dendrimer PAMAM G3.0 (dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0) đƣợc tính toán gián tiếp thông qua nồng độ 5-FU tự do

không nang hóa xác định bằng phƣơng HPLC [47] (sơ đồ 2.20).

Sơ đồ 2.20: Quy trình nang hóa thuốc 5-FU của dendrimer PAMAM

b. Khảo sát nhả thuốc 5-FU in vitro trong môi trƣờng đệm PBS

(Phosphate buﬀered salinetablets)

5-FU đƣợc nhả ra đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo HPLC. Hòa tan 100mg

dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA/5FU trong 3ml nƣớc cất, rồi cho vào 3

màng thẩm tách MWCO 3.000-5.000D mỗi màng 1ml. Tiến hành thẩm tách trong đệm

PBS (12ml). Lấy mẫu nƣớc thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5ml trong 1 giờ,

3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Mỗi lần lấy mẫu

xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài màng vào thêm vào lƣợng dung môi

tƣơng ứng ban đầu là 12ml. Nồng độ 5-FU khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách đƣợc

xác định bằng phƣơng pháp đo HPLC [47]. Quy trình thực nghiệm đƣợc mô tả theo sơ

đồ (sơ đồ 2.21) bên dƣới:

Sơ đồ 2.21: Quy trình nhả thuốc 5-FU của dendrimer-5FU

2.2.3.6 Khảo sát khả năng thâm nhập tế bào

a. Thực nghiệm gắn FITC (Fluorescein isothyocyanate) vào dendrimer

PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0.

Cho mẫu chất (dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6, dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0-C6-FA) đƣợc pha loãng 100 (v/v) trong PBS pH 7,4 vào FITC

(Fluorescein isothyocyanate) đƣợc hòa tan trong acetone (với nồng độ < 5mg/ml); tỷ lệ

mol dendrimer PAMAM G3.0 : FITC = 1:4; khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng, sau đó

thẩm tách bằng MeOH, loại MeOH bằng cô quay chân không thu đƣợc mẫu chất có

gắn FITC (dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC, dẫn xuất dendrimer PAMAM

G3.0-C6-FA-FITC) [99, 100].

b. Thực nghiệm thâm nhập tế bào

Khả năng thâm nhập tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC và

dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC đã đƣợc thử nghiệm trên dòng tế bào

Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Confocal laser scanning microscopy) tại

trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

Tế bào Hela (tế bào ung thƣ cổ tử cung) đƣợc nuôi trong môi trƣờng DMEM

high glucose (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), 2mM L-glutamine, 10% fetal bovine serum, 1 P/S và ủ ở 37oC, 5% CO2.

Tế bào Hela đƣợc gieo cấy trên kính có phủ fibronectin với mật độ phân bố 5 x 105 tế bào/giếng (đĩa/24 giếng). Trƣớc mỗi thí nghiệm, các tế bào đƣợc rửa ba lần với

dung dịch đệm phosphate PBS (pH = 7,4) và xử lý ủ 4 giờ với nồng độ 100M của

mẫu chất. Sau đó tế bào đƣợc nhuộm với DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole), rửa

3 lần với PBS và đem phân tích bằng thiết bị kính hiển vi quét laser đồng tiêu [100,

101].

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0

Cấu trúc của dendrimer PAMAM đƣợc khẳng định nhờ vào phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR. Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM đƣợc xác định trên cơ sở phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, khối phổ MS (phổ MS chỉ xác định đƣợc khối

lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G2.0).

3.1.1 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR

Phổ 1H-NMR của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (500 MHz, MeOD,

δ ppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: -CH2CH2N<

(a); -CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CH2CH2NH2 (d, thế hệ chẵn); -

CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g, thế hệ lẻ ) và -COOCH3 (h, thế hệ lẻ).

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5 (500 MHz, MeOD, ppm): với tín hiệu

proton xuất hiện ở độ dịch chuyển hóa học H=2.49 ppm là dao động của proton ở vị

trí -CH2CH2N< (a); H=2.75-2.78ppm, -CH2CH2CO- (b). Đặc biệt, tín hiệu ở

H=2.38-2.45ppm là dao động của proton ở vị trí -CH2CH2COOCH3 (g) và H=3.62-

3.70ppm là dao động của proton ở vị trí -COOCH3 (h), là các tín hiệu chỉ có ở các

dendrimer PAMAM thế hệ lẻ. Tuy nhiên, với dendrimer PAMAM G-0.5 chƣa xuất

hiện tín hiệu proton ở vị trí -CH2CH2CONH- (c) và -CONHCH2CH2N- (e) (hình 3.1).

Hình 3.1: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G-0.5

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.0 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.56-2.57ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.77-2.81ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.37-

2.40ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.24-3.33ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt, ở

H=2.72-2.75ppm là dao động của proton ở vị trí -CH2CH2NH2 (d), tín hiệu này chỉ

xuất hiện ở các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn (hình 3.2).

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.0

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.53-2.56 ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.73-2.78ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.33-

2.39ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.25-3.31ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt,

xuất hiện tín hiệu chỉ có ở các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ: H=2.42-2.49ppm, -

CH2CH2COOCH3 (g) và H=3.63-3.67ppm, -COOCH3 (h) (hình 3.3).

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.0 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.58-2.60ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.80-2.82ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.37-

2.40ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.25-3.27ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt, ở

H=2.73-2.75ppm là dao động của proton ở vị trí -CH2CH2NH2 (d), tín hiệu này chỉ

xuất hiện ở các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn. Bên cạnh đó, trên phổ không còn

xuất hiện các tín hiệu của proton ở vị trí (h) và (g), cho thấy phản ứng cộng Michael

đã chuyển hóa thành công (hình 3.4).

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.0

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.5 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.56-2.65ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.77-2.84ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.39-

2.41ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.26-3.36ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt,

xuất hiện tín hiệu chỉ có ở các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ: H=2.47-2.49ppm, -

CH2CH2COOCH3 (g) và H=3.68ppm, -COOCH3 (h) (hình 3.5).

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.5

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.0 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.58-2.60ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.79-2.82ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.36-

2.39ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.25-3.32ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt, ở

H=2.69-2.74ppm là dao động của proton ở vị trí -CH2CH2NH2 (d), tín hiệu này chỉ

xuất hiện ở các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn. Bên cạnh đó, trên phổ không còn

xuất hiện các tín hiệu của proton ở vị trí (h) và (g), cho thấy phản ứng cộng Michael

đã chuyển hóa thành công (hình 3.6).

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.0

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.5 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.53-2.63ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.74-2.85ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.39-

2.41ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.26-3.33ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt,

xuất hiện tín hiệu chỉ có ở các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ: H=2.47-2.49ppm, -

CH2CH2COOCH3 (g) và H=3.68ppm, -COOCH3 (h) (hình 3.7).

Hình 3.7: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.5

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0 (500 MHz, MeOD, ppm): xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM: H=2.60-2.61ppm là dao động của

proton ở vị trí -CH2CH2N< (a); H=2.80-2.83ppm, -CH2CH2CO- (b); H=2.37-

2.40ppm, -CH2CH2CONH- (c); H=3.26-3.33ppm, -CONHCH2CH2N- (e). Đặc biệt, ở

H=2.73-2.76ppm là dao động của proton ở vị trí -CH2CH2NH2 (d), tín hiệu này chỉ

xuất hiện ở các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn. Bên cạnh đó, trên phổ không còn

xuất hiện các tín hiệu của proton ở vị trí (h) và (g), cho thấy phản ứng cộng Michael

đã chuyển hóa thành công (hình 3.8).

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G3.0

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 đƣợc thống kê qua bảng 3.1.

Độ dịch chuyển hóa học

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

H của nhóm

(, ppm)

Vị trí H

G-0.5 G0.0 G0.5 G1.0 G1.5 G2.0 G2.5 G3.0

2.56-

2.53-

2.58-

2.56-

2.58-

2.53-

2.60-

2.49

a

-CH2CH2N<

2.57

2.56

2.60

2.65

2.60

2.63

2.61

2.75-

2.77-

2.73-

2.80-

2.77-

2.79-

2.74-

2.80-

b

-CH2CH2CO-

2.78

2.81

2.78

2.82

2.84

2.82

2.85

2.83

2.37-

2.33-

2.37-

2.39-

2.36-

2.39-

2.37-

c

-CH2CH2CONH-

2.40

2.39

2.40

2.41

2.39

2.41

2.40

2.72-

2.73-

2.69-

2.73-

d

-CH2CH2NH2

2.75

2.74

2.76

3.24-

3.25-

3.26-

3.25-

3.26-

e

-CONHCH2CH2N-

3.33

3.31

3.27

3.36

3.32

3.33

2.42-

2.47-

g

-CH2CH2COOCH3 2.38-

2.45

2.49

3.62-

3.63-

3.68-

3.68

h

3.70

3.67

3.68

-COOCH3

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 (bảng 3.1), một lần nữa khẳng định sự lặp đi lặp lại các tính hiệu proton trong

các thế hệ dendrimer PAMAM. Các tín hiệu proton ở vị trí a, b, c, e luôn xuất hiện

trong phân tử dendrimer PAMAM. Tín hiệu proton ở vị trí d chỉ xuất hiện ở thế hệ

chẵn (G0.0, G1.0, G3.0, …) và tín hiệu proton ở vị trí g, h chỉ xuất hiện ở thế hệ lẻ

(G0.5, G1.5, G2.5, …).

Kết quả phân tích phổ 1H-NMR phù hợp với các công bố tổng hợp dendrimer

PAMAM trƣớc đây [12, 13, 29, 33, 79, 86, 102-104].

3.1.2 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối

lƣợng MS

Khi chúng tôi phân tích phổ MS (phụ lục 1), kết quả cho thấy sản phẩm

dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G2.0 có khối lƣợng phân tử phù hợp với khối

lƣợng phân tử theo lý thuyết (bảng 3.2), hiệu số sai lệch 0-0,25% so với lý thuyết.

Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở

khối phổ MS

LT MS

Thế hệ Hiệu số sai WtLT WtMS lệch ( )

G-0.5 407 407 0

G0.0 517 517 0

G0.5 1204 1207 0,25

G1.0 1430 1429 0,14

G1.5 2830 2808 0,14

G2.0 3256 3259 0,09

G2.5 6045 *

(*: không xác định đƣợc khối lƣợng phân tử do có khối lƣợng lớn)

G3.0 6909 *

Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy, khối phổ MS là phƣơng pháp hiệu quả để xác

định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM thế hệ thấp (G ≤ 2.0), có hiệu số sai lệch

so với lý thuyết 0-0,25%. Tuy nhiên với các dendrimer có khối lƣợng phân tử lớn từ

G2.5 (Wt; 6045) trở lên thì chúng tôi không thể xác định khối lƣợng phân tử bằng

khối phổ MS. Đây là điểm hạn chế của khối phổ MS khi khảo sát trên những chất có

trọng lƣợng phân tử lớn.

3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

Các tín hiệu proton ở 2 vị trí (e), (a) luôn xuất hiện và không có sự chồng peak trên phổ 1H-MNR trong mỗi phân tử dendrimer PAMAM (hình 3.1 đến 3.8) nên đƣợc

lựa chọn để tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM.

Diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H-MNR của

các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 đã đƣợc chúng tôi thống kê ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H-

MNR (NMR) của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0

2 8(H ở vị trí b) 4 G-0.5

1,985 3,987 2,000 G0.0

0,6661 G0.5 0,778 1,168

1,8797 G1.0 1,000 0,532

G1.5 0,8527 1,864 2,186

1,8740 G2.0 1,964 1,048

0,8814 G2.5 2,058 2,335

1.8890 G3.0 1,923 1,018

Áp dụng công thức tính khối lƣợng phân tử của dendrimer (WtNMR) đƣợc chúng tôi đề xuất thông qua phổ 1H-NMR (công thức 2.1), sử dụng các dữ liệu ở (bảng 1.1,

bảng 2.1, bảng 3.2). Chúng tôi đã tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ thế

hệ G-0.5 đến G3.0, kết quả thể hiện ở bảng 3.4.

Cụ thể với dendrimer PAMAM G-0.5, chúng tôi sử dụng tín hiệu các proton (a)

và (b) để tính khối lƣợng phân tử do tín hiệu proton (e) chƣa xuất hiện trong công thức

phân tử chất này.

Độ sai lệch của khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 so với lý thuyết

đƣợc tính:

Với các dendrimer PAMAM từ thế hệ G0.0 đến G3.0, chúng tôi sử dụng độ dịch

chuyển của tín hiệu các proton (a) và (e) để tính khối lƣợng phân tử của chúng.

Độ sai lệch của khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM G0.0 so với lý thuyết

đƣợc tính:

Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở phổ 1H-NMR và MS

LT NMR MS

Thế hệ Hiệu số sai Hiệu số sai WtLT WtNMR WtMS lệch ( ) lệch ( )

407 407 G-0.5 0 407 0

G0.0 517 516 0,19 518 0,19

G0.5 1204 1202 0,17 1207 0,25

G1.0 1430 1344 6,01 1429 0,14

G1.5 2830 2815 0,53 2809 0,14

G2.0 3256 3061 5,99 3260 0,09

* G2.5 6045 5720 5,38

(*: không xác định đƣợc khối lƣợng phân tử do có khối lƣợng lớn)

* G3.0 6909 6529 5,50

Nhìn vào kết quả bảng 3.4, khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ thế hệ G- 0.5 đến G3.0 hoàn toàn xác định đƣợc bằng phổ 1H-NMR. Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM tính toán đƣợc dựa vào phổ 1H-MNR không khác biệt nhiều so

với khối lƣợng phân tử lý thuyết (hiệu số sai lệch so với lí thuyết từ 0-6%). Trong khi

đó, phổ MS có hiệu số sai lệch so với lí thuyết bé hơn (từ 0-0,25%), tuy nhiên phƣơng

pháp này chỉ có thể xác định đƣợc dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G2.0. Điều này cho thấy ƣu điểm vƣợt trội của phổ 1H-NMR, vừa xác định đƣợc cấu trúc phân tử

vừa xác định đƣợc khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM mà không bị giới hạn bởi khối lƣợng phân tử lớn. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng phổ 1H-NMR để tính khối lƣợng

phân tử cho những dendrimer PAMAM có khối lƣợng phân tử lớn (từ thế hệ G2.5 trở

đi) trong khi phƣơng pháp đo khối phổ MS không xác định đƣợc.

Bên cạnh đó, khi so sánh các giá trị khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM giữa thực nghiệm phổ 1H-NMR và lí thuyết có hiệu số sai lệch từ 0-6% (bảng 3.3), hiệu số

sai lệch của phƣơng pháp này tƣơng đƣơng với hiệu số sai lệch khi sử dụng phổ

MALDI-TOF-MS [76].

Vì vây, chúng tôi đã đƣa ra kết luận là hoàn toàn có thể tin tƣởng sử dụng phổ 1H-NMR một cách hiệu quả và tiện lợi để xác định đƣợc đặc tính cấu trúc dendrimer PAMAM và dẫn xuất của dendrimer PAMAM. Đặc biệt là sử dụng phổ 1H-NMR để

xác định trọng lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM và dẫn xuất của dendrimer

PAMAM mà không cần phải sử dụng thêm MALDI-TOF-MS hoặc phổ khối lƣợng phân tử nào khác. Đây là phát hiện mới về phổ 1H-NMR khi nghiên cứu về dendrimer

PAMAM.

3.2 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL

3.2.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Sản phẩm dạng sánh dẻo màu vàng nhạt, có công thức cấu tạo chung là G3.0-

(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z (hình 3.9).

Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z

Phổ 1H-NMR của các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acyl chloride xuất hiện

tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của dendrimer PAMAM: -CH2CH2N< (a); -

CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); bên cạnh đó xuất hiện

tín hiệu proton đặc trƣng của nhóm -CH3 (j) và tín hiệu proton -CH2CH2NH2 (d) chƣa

mất đi cho thấy một số nhóm amine (trong tổng số 32 nhóm amine) trên bề mặt

dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc gắn kết chuỗi akyl thông qua liên kết amide.

3.2.1.1 Khảo sát thời gian phản ứng

Khảo sát với thời gian phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc thực

hiện ở 12 giờ (sản phẩm G3.0-C10-12h), 24 giờ (sản phẩm G3.0-C10-24h), 36 giờ (sản

phẩm G3.0-C10-36h) và 48 giờ (sản phẩm G3.0-C10-48h).

Phổ 1H-NMR của các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-12h, G3.0-C10-

24h, G3.0-C10-36h và G3.0-C10-48h xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc

trƣng của dendrimer PAMAM: (a); (b); - -CH2CH2N< -CH2CH2CO-

CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); bên cạnh đó xuất hiện tín hiệu proton

đặc trƣng của nhóm -CH3 (j) và tín hiệu proton -CH2CH2NH2 (d) chƣa mất đi cho

thấy một số nhóm amine (trong tổng số 32 nhóm amine) trên bề mặt dendrimer

PAMAM G3.0 đã đƣợc gắn kết chuỗi akyl thông qua liên kết amide (phụ lục 2

3,4,5). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Julia Morales-Sanfrutos [35], José

L. Santos [36] và một số nghiên cứu acetyl hóa bề mặt dendrimer PAMAM [55, 57,

66, 67, 77, 105].

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0

với decanoyl chloride theo thời gian (phụ lục 2 3,4,5) đƣợc thống kê qua bảng 3.5.

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM

G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

H của nhóm G3.0-C10- G3.0-C10- G3.0-C10- G3.0-C10-

Vị trí H 12h 24h 36h 48h

2, 53-2,54 2,68 2,57 2,62-2,64 a -CH2CH2N- (30 nhóm)

2,73 2,75-2,77 2,77 2,84-2,85 b -CH2CH2CO- (60 nhóm)

2,34 2,35-2,44 2,37-2,45 2,18-2,21 c -CH2CH2CONH- (60+z nhóm)

2,83-2,96 2,82-2,89 3,01 3,03 d -CH2NH2 (32- z nhóm)

3,21-3,34 3,32-3,46 3,24-3,40 3,30-3,45 e -CONHCH2CH2- (60+z nhóm)

0.77 0,91 0,80 0,91 j -CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR đƣợc

thống kê qua bảng 3.5, áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ chuyển

hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR) của các dẫn

xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-12h, G3.0-C10-24h, G3.0-C10-36h và G3.0-C10-

48h (bảng 3.6).

Áp dụng ví dụ với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h. Độ chuyển hóa

sản phẩm tính đƣợc trên cơ sở phổ 1H-MNR (hình 3.10) theo công thức trên:

Số nhóm chuyển hóa:

z = x%.32 = 48,56%.32 = 15,5  16 nhóm

Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h đƣợc tính

toán nhƣ sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.3):

WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + z. WtLT(dodecanoyl chloride) – z. WtLT(HCl)

= 6909 + 16.218,76 – 16.36,46084

= 9826

(với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909, H = 1,00784; Cl = 35,453)

Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10)

Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-12h, G3.0-C10-24h và G3.0-C10-

48h đƣợc tính toán tƣơng tự và lập thành bảng sau (bảng 3.6).

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride

theo thời gian

độ chuyển số nhóm Khối lƣợng Dẫn xuất

hóa chuyển hóa phân tử dendrimer

(x%) (z nhóm) PAMAM G3.0 (WtNMR)

16,89 5 7820 G3.0-C10-12h

24,14 8 8367 G3.0-C10-24h

G3.0-C10-36h 48,56 16 9826 (G3.0-C10)

G3.0-C10-48h 45,06 14 9461

Nhìn vào kết quả bảng 3.6 ta thấy, với thời gian phản ứng đƣợc khảo sát lần

lƣợt là 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ thì độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 36 giờ là cao

nhất. Trong khoảng thời gian từ 12-36 giờ, khả năng phản ứng biến tính giữa

dendrimer PAMAM G3.0 và decanoyl chloride tăng dần. Tuy nhiên, khi chúng tôi tiếp

tục kéo dài thời gian phản ứng đến 48 giờ thì độ chuyển hóa của dẫn xuất không tăng

nữa mà bắt đầu giảm (đồ thị 3.1), do kéo dài thời gian phản ứng thì sản phẩm bị thủy

phân ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển hóa.

Số nhóm chuyển hóa (z)

12h

24h

36h

48h

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-decanoyl chloride

Đồ thị 3.1: Kết quả khảo sát thời gian biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride

Nhƣ vậy, độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 36 giờ là tốt nhất trong dãy thời gian

khảo sát. Dựa vào đây, chúng tôi tiếp tục tiến hành biến tính dendrimer PAMAM G3.0

với các acyl chloride khác ở điều kiện thời gian 36 giờ.

3.2.1.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride (acetyl chloride,

hexanoyl chloride, myristoyl chloride) với thời gian 36 giờ

Phổ 1H-NMR các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10

và G3.0-C14 (500 MHz, MeOD, δppm) (phụ lục 6,7,4,8) xuất hiện tín hiệu proton

các peak đặc trƣng của dendrimer PAMAM: -CH2CH2N< (a); -CH2CH2CO- (b); -

CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e). Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR xuất

hiện tín hiệu proton đặc trƣng của nhóm -CH3 (j) có trong acyl chloride và tín hiệu

proton -CH2CH2NH2 (d) chƣa mất đi của dendrimer PAMAM. Điều này chứng tỏ

một số nhóm amine (trong tổng số 32 nhóm amine) trên bề mặt dendrimer PAMAM

G3.0 đã đƣợc gắn kết chuỗi akyl thông qua liên kết amide. Kết quả này phù hợp với

nghiên cứu của Julia Morales-Sanfrutos [35], José L. Santos [36] và một số nghiên

cứu acetyl hóa bề mặt dendrimer PAMAM [55, 57, 66, 67, 77, 105].

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl

chloride đƣợc thống kê qua bảng 3.7.

Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

H của nhóm Vị trí H G3.0-C2 G3.0-C6 G3.0-C10 G3.0-C14

-CH2CH2N- 2,56-2,57 2,58 2,57 2,59-2,60 a (30 nhóm)

2,76 2,78-2,79 2,77 2,81-2,82 b -CH2CH2CO- (60 nhóm)

2,37-2,39 2,39 2,37-2,45 2,40 c -CH2CH2CONH- (60+z nhóm)

2,82 2,97 3,01 2,86-2,87 d -CH2NH2 (32- z nhóm)

3,24-3,29 3,26 3,24-3,40 3,28-3,36 e -CONHCH2CH2- (60+z nhóm)

1,92 0,82 0,80 0,91 j -CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) (phụ lục 6,7,4,8, hình 3.9) trên phổ 1H-NMR, áp dụng công thức (công thức 2.2) chúng tôi xác định

đƣợc độ chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử

(WtNMR) của các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 và

G3.0-C14. (bảng 3.8)

Bảng 3.8: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các tác nhân acyl chloride

độ chuyển số nhóm Khối lƣợng Dẫn xuất

hóa chuyển hóa phân tử dendrimer

PAMAM G3.0 (x%) (z nhóm) (WtNMR)

30,13 10 7329 G3.0-C2

35,71 11 7989 G3.0-C6

48,56 16 9826 G3.0-C10

33,32 11 9223 G3.0-C14

Các kết quả trong bảng 3.8 cho thấy khi biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với

các acyl chloride (acetyl chloride, hexanoyl chloride, decanoyl chloride và myristoyl

chloride) có mặt bazơ TEA, cho hiệu quả chuyển hóa cao, trong đó độ chuyển hóa của

dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride là cao nhất (x; 48,56 ), số

nhóm đã chuyển hóa là 16 trong tổng 32 nhóm amine bề mặt). Độ chuyển hóa của dẫn

xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride, hexanoyl chloride và myristoyl

chloride thấp hơn so với decanoyl chloride, do acetyl chloride và hexanoyl chloride

tuy không bị cản trở bởi yếu tố không gian nhƣng là các acyl chloride kém bền, khi

tiếp xúc với không khí ẩm sẽ thủy phân thành acid nên rất dễ thất thoát trong quá trình

chuyển hóa; myristoyl chloride do có mạch carbon dài nên yếu tố không gian lập thể

đã ảnh hƣởng đến phản ứng làm giảm hiệu xuất quá trình chuyển hóa.

Số nhóm chuyển hóa (z)

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

G3.0-C2 G3.0-C6 G3.0-C10 G3.0-C14

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acyl chloride

Đồ thị 3. 2: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride (G3.0-C2),

hexanoyl chloride (G3.0-C6), decanoyl chloride (G3.0-C10), myristoyl chloride (G3.0-C14)

3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic

Sản phẩm phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic (acid

acetic, acid hexanoic, acid decanoic và acid myristic) có dạng sệt màu vàng nhạt giống

nhƣ sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acyl chloride, có công thức

cấu tạo chung là G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z. (hình 3.11)

Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z

Trên phổ 1H-NMR của các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2-EDC, G3.0-

C6-EDC, G3.0-C10-EDC và G3.0-C14-EDC (500 MHz, MeOD, δppm) (phụ lục

9,10,11,12) xuất hiện tín hiệu proton các peak đặc trƣng của dendrimer PAMAM: -

CH2CH2N< (a); -CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); bên

cạnh đó xuất hiện tín hiệu proton đặc trƣng của nhóm -CH3 (j) và tín hiệu proton -

CH2CH2NH2 (d) chƣa mất đi của dendrrimer PAMAM G3.0. Điều này chứng tỏ một

số nhóm amine (trong tổng số 32 nhóm amine) trên bề mặt dendrimer PAMAM G3.0

đã đƣợc gắn kết chuỗi akyl thông qua liên kết amide. Kết quả này phù hợp với

nghiên cứu của Julia Morales-Sanfrutos [35], José L. Santos [36] và một số nghiên

cứu alkyl hóa bề mặt dendrimer PAMAM [55, 57, 66, 67, 77, 105].

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid

carboxylic đƣợc thống kê qua bảng 3.9.

Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

H của nhóm G3.0-C2- G3.0-C6- G3.0-C10- G3.0-C14- Vị trí H EDC EDC EDC EDC

2,56-2,57 2,59 2,63 2,53 a -CH2CH2N- (30 nhóm)

2,76 2,78 2,83 2,73 b -CH2CH2CO-(60 nhóm)

2,37-2,39 2,38-2,47 2,45 2,34-2,41 c -CH2CH2CONH- (60+z nhóm)

2,82 3,06 3,06 2,84-2,89 d -CH2NH2 (32- z nhóm)

3,24-3,29 3,25-3,43 3,31-3,45 3,21-3,32 e -CONHCH2CH2- (60+z nhóm)

1,92 0,81 0,86 0,78 j -CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR (phụ

lục 9,10,11,12) và áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ chuyển hóa

(x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR) của các dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0-C2-EDC, G3.0-C6-EDC, G3.0-C10-EDC và G3.0-C14-

EDC. (bảng 3.10).

Áp dụng ví dụ với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-EDC. Độ chuyển hóa

sản phẩm tính đƣợc trên cơ sở phổ 1H-MNR (bảng 3.10) theo công thức 2.2:

Số nhóm chuyển hóa:

z = x%.32 = 46,50%.32 = 14,9  15 nhóm

Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-EDC đƣợc tính

toán nhƣ sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.3):

WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + z. WtLT(acid decanoic) – z. WtLT(nƣớc)

= 6909 + 15. 172,26 – 15. 18,01508

= 9826

(với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909; H = 1,00784; O = 15,9994)

Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2-EDC, G3.0-C6-EDC và G3.0-C14-

EDC đƣợc tính toán tƣơng tự và lập thành bảng sau (bảng 3.10).

Bảng 3.10: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acid carboxylic

Dẫn xuất độ chuyển số nhóm Khối lƣợng

dendrimer hóa chuyển hóa phân tử

PAMAM G3.0 (x%) (z nhóm) (WtNMR)

G3.0-C2-EDC 31,06 10 7329

G3.0-C6-EDC 34,77 11 7989

G3.0-C10-EDC 46,50 15 9826

G3.0-C14-EDC 37,87 12 9433

Các kết quả từ bảng 3.10 cho thấy, khi biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với

acid carboxylic (acid acetic, acid hexanoic, acid decanoic và acid myristic) sử dụng

chất hoạt hóa EDC cho hiệu quả chuyển hóa cao, trong đó độ chuyển hóa của dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0 với acid decanoic là cao nhất (x; 46,50 ), số nhóm đã

chuyển hóa là 15 trong tổng 32 nhóm amine bề mặt). Acid acetic và acid hexanoic tuy

không bị cản trở bởi yếu tố không gian nhƣng là các acid dễ bay hơi, nên thất thoát

trong quá trình thí nghiệm. Acid myristic có mạch carbon dài nên yếu tố không gian

lập thể ảnh hƣởng đến phản ứng làm giảm hiệu xuất chuyển hóa (đồ thị 3.3).

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acid carboxylic

Số nhóm chuyển hóa (z)

Đồ thị 3.3 Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid acetic (G3.0-C2-EDC), acid

hexanoic (G3.0-C6-EDC), acid decanoic (G3.0-C10-EDC), acid myristic (G3.0-C14-EDC)

Phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic cũng là cơ sở

cho phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích acid folic.

3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol tổng hợp đƣợc dạng

dẻo màu vàng nhạt, có công thức cấu tạo nhƣ sau: G3.0-(NH-COO-CH2(CH2)nCH3)z

(hình 3.11).

Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol

Phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alcohol (500

MHz, MeOD, δppm) (phụ lục 13,14,15,16) xuất hiện tín hiệu proton các peak đặc

trƣng của hợp chất: -CH2CH2N< (a); -CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -

CH2CH2NH2 (d); -CONHCH2CH2N- (e); -NHCOOCH2- (f) và -CH3 (j). Kết quả này

phù hợp với nghiên cứu của Morales-Sanfrutos [35], José L. Santos [36], Tu Uyen Ly

[47] và Saovapakhiran [55].

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với

alcohol đƣợc thống kê qua bảng 3.11.

Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

H của nhóm G3.0-C2- G3.0-C6- G3.0-C8- G3.0-C12- Vị trí H NPC NPC NPC NPC

a 2,54 2, 59 2, 56 2, 52 -CH2CH2N- (30 nhóm)

b 2,73 2,79 2,75 2,62 -CH2CH2CO- (60 nhóm)

c 2,34 2,37-2,42 2,34-2,39 2,33 -CH2CH2CONH- (60 nhóm)

d 2,95 3.07 3,03 2,72 -CH2NH2 (32- z nhóm)

e 3,15-3,35 3,16-3,43 3,15-3,40 3,21-3,26 -CONHCH2CH2- (60+z nhóm)

3,98 3,90 3,90-3.95 3,89 f -COO- CH2(CH2)10CH3 (z nhóm)

j 1,13 0,77 0,77 0,78 -CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR (phụ

lục 13,14,15,16) và áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ chuyển hóa

(x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR) của các dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0-C2-NPC, G3.0-C6-NPC, G3.0-C8-NPC và G3.0-C12-NPC

(bảng 3.12).

Áp dụng ví dụ với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-NPC. Độ chuyển hóa

sản phẩm tính đƣợc trên cơ sở phổ 1H-MNR (bảng 3.12) theo công thức trên:

Số nhóm chuyển hóa:

z = x%.32 = 47,27%.32 = 15,1  15 nhóm

Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-NPC

đƣợc tính toán nhƣ sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.3):

WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + z. WtLT(hexanol) – 15. WtLT(-CO-) – 2.z.WtH

= 6909 + 15. 102,17 – 15. 28,0101 – 2. 15. 1,00784

= 8831

(với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909; H = 1,00784; O = 15,9994; C = 12,0107)

Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2-NPC, G3.0-C8-NPC và G3.0-C12-

NPC đƣợc tính toán tƣơng tự và lập thành bảng sau (bảng 3.12).

Bảng 3.12: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol

Dẫn xuất độ chuyển số nhóm Khối lƣợng

dendrimer hóa chuyển hóa phân tử

PAMAM G3.0 (x%) (z nhóm) (WtNMR)

G3.0-C2-NPC 34,96 11 7702

G3.0-C6-NPC 47,27 15 8594

G3.0-C8-NPC 47,75 15 9027

G3.0-C12-NPC 47,77 15 9869

Các kết quả ở bảng 3.12 cho thấy rằng, biến tính dendrimer bằng ancol sử dụng

chất hoạt hóa NPC cho hiệu suất chuyển hóa cao. Quá trình hoạt hóa NPC phụ thuộc

vào mật độ electron trên nguyên tử oxy trong ancol. Các gốc alkyl (-R) gây hiệu ứng

đẩy electron (hiệu ứng cảm ứng dƣơng, +I) làm tăng mật độ electron trên nguyên tử

oxy, do đó làm tăng hiệu suất chuyển hóa.Với etanol, do có mạch carbon ngắn hơn cho

hiệu ứng +I yếu làm mật độ electron trên nguyên tử oxy ít hơn so với những alcohol

còn lại nên quá trình hoạt hóa không cao và nhóm thế ít hơn; bên cạnh đó, etanol có

thể còn lẫn nƣớc nên quá trình hoạt hóa sẽ không hoàn toàn. Yếu tố không gian ảnh

hƣởng không đáng kể trong các biến tính này do mạch cacbon của các ancol này

không quá dài (đồ thị 3.4).

Số nhóm chuyển hóa (z)

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol

Đồ thị 3.4: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với etanol (G3.0-C2-NPC),

hexanol (G3.0-C6-NPC), octanol (G3.0-C8-NPC), dodecanol (G3.0-C12-NPC)

Phản ứng cũng là cơ sở biến tính cho những phản ứng giữa dendrimer PAMAM

với các nhóm amine bề mặt với tác nhân có nhóm hydroxyl (ví dụ

methylpoliethylenglycol - MPEG, ...).

3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

Sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine tổng hợp đƣợc

dạng sệt màu vàng nhạt, có công thức cấu tạo chung G2.5-(CO-NH-CH2(CH2)nCH3)z

(hình 3.13).

Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine (500 MHz, MeOD,

δppm) xuất hiện tín hiệu proton các peak đặc trƣng của hợp chất: -CH2CH2N< (a); -

CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g);

-COOCH3 (h) và -CH3 (j). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Julia Morales-

Sanfrutos [35], José L. Santos [36] và một số nghiên cứu alkyl hóa bề mặt

dendrimer PAMAM [55, 57, 66, 67, 77, 105].

3.2.4.1 Khảo sát biến điều kiện nhiệt độ (nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC)

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC, G2.5-C12-60oC và G2.5-C12-80oC (500 MHz, MeOD, δppm) (phụ lục 17,18,19) xuất hiện tín hiệu

proton các peak đặc trƣng của hợp chất: -CH2CH2N< (a); -CH2CH2CO- (b); -

CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g); -COOCH3 (h)

và -CH3 (j). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Saovapakhiran , José L.

Santos , Julia Morales-Sanfrutos và một số nghiên cứu về dẫn xuất dendrimer

PAMAM.

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM

G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ đƣợc thống kê qua bảng 3.13.

Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính

dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) H của nhóm

G2.5-C12-poC G2.5-C12-60o G2.5-C12-80oC Vị trí H

2,54-2,59 2,56-2,62 2,56-2,62 a -CH2CH2N- (30 nhóm)

2,75-2,81 2,78-2,83 2,74-2,82 b -CH2CH2CO- (60 nhóm)

2,39-2,38 2,40 2,34-2,40 c -CH2CH2CONH- (28+z nhóm)

3,24-3,34 3,26-3,36 3,16-3,36 e -CONHCH2CH2- (28+z nhóm)

2,44-2,47 2,47-2,49 2,47-2,51 g -CH2CH2COO-CH3 (32-z nhóm)

3,66-3,67 3,68 3,68 h -COO-CH3 (32-z nhóm)

0,89 0,92 0,92 j -CO-NH-(CH2)n-CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR (phụ

lục 17,18,19), chúng tôi đã áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ

100

chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR) của

các dẫn xuất PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ phản ứng (bảng 3.14).

Áp dụng ví dụ với dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC. Độ chuyển hóa

sản phẩm tính đƣợc trên cơ sở phổ 1H-MNR (phụ lục17) theo công thức trên:

Số nhóm chuyển hóa:

z = x%.32 = 7,00%.32 = 2,24  2 nhóm

Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC đƣợc tính

toán nhƣ sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.3):

WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 2.5) + z. WtLT(dodecylamine) – z. WtLT(MeOH)

= 6045 + 2. 185,35 – 2. 32,04146

= 6352

(với dendrimer PAMAM G2.5 = 6045; H = 1,00784; O = 15,9994; C = 12,0107)

Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-60o, G2.5-C12-80oC đƣợc tính toán

tƣơng tự và lập thành bảng sau (bảng 3.14).

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5

với dodecylamine

Dẫn xuất độ chuyển số nhóm Khối lƣợng

dendrimer hóa chuyển hóa phân tử

PAMAM G2.5 (x%) (z nhóm) (WtNMR)

G2.5-C12-p0C 7,00 2 6352

101

G2.5-C12-600 16,66 5 6809

G2.5-C12-800 33,50 11 7727

Nhìn vào kết quả bảng 3.14 cho thấy, với nhiệt độ khảo sát lần lƣợt là nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC của phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với tác nhân dodecylamine thì độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 80oC là cao nhất (x ; 33,50 ), số

chuyển hóa (n; 11 nhóm). Điều này đƣợc giải thích do phản ứng của dendrimer

PAMAM G2.5 với dodecylamine là phản ứng thu nhiệt nên cần cung cấp nhiệt độ để

phản ứng xảy ra. Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ bị phân hủy, các tác chất bay

hơi ảnh hƣởng đến khả năng thế cũng nhƣ hiệu suất phản ứng. Nhƣ vậy, độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 80oC là tốt nhất trong dãy nhiệt độ khảo sát (đồ thị 3.5).

Số nhóm chuyển hóa (z)

Nhiệt độ phòng

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-dodecylamine

Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ

3.2.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine (butylamine,

ocylamine, decylamine và dodecylamine )ở nhiệt độ 80oC

Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C4, G2.5-C8, G2.5-C10 (G2.5-C10-80oC ) và G2.5-C12 (500 MHz, MeOD, δppm) (phụ lục 20,21,22,19) xuất

hiện tín hiệu proton các peak đặc trƣng của hợp chất: -CH2CH2N< (a); -

CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3

(g); -COOCH3 (h) và -CH3 (j). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của

102

Saovapakhiran , José L. Santos , Julia Morales-Sanfrutos và một số nghiên cứu về dẫn

xuất dendrimer PAMAM . Sản phẩm tổng hợp đƣợc dạng sệt màu vàng nhạt, có công

thức cấu tạo chung G2.5-(CO-NH-CH2(CH2)nCH3)z (hình 3.13)

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với các

alkylamine đƣợc thống kê qua bảng 3.15.

Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5

với alkylamine

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

H của nhóm Vị trí H G2.5-C4 G2.5-C8 G2.5-C10 G2.5-C12

2,63 2,53-2,63 2,54-2,59 2,56-2,62 a -CH2CH2N- (30 nhóm)

2,78-2,83 2,77-2,83 2,46-2,47 2,74-2,82 b -CH2CH2CO- (60 nhóm)

2,47-2,49 2,40 2,37 2,34-2,40 c -CH2CH2CONH- (28+z nhóm)

3,26-3,36 3,18-3,33 3,18-3,33 3,16-3,36 e -CONHCH2CH2- (28+z nhóm)

2,51-2,59 2,47-2,49 2,47-2,49 2,47-2,51 g -CH2CH2COO-CH3 (32-z nhóm)

3,69 3,68-3,71 3,68-3,73 3,68 h -COO-CH3 (32-z nhóm)

0,92 0,92 0,90 0,92 j -CO-NH-(CH2)n-CH3 (z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR

(phụ lục 20,21,22,19) và áp dụng công thức (công thức 2.2) chúng tôi xác định đƣợc

độ chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR)

của các dẫn xuất PAMAM G2.5 với alkylamine với: butylamine (sản phẩm: G2.5-C4),

ocylamine(sản phẩm: G2.5-C8), decylamine (sản phẩm: G2.5-C10) và dodecylamine

(sản phẩm: G2.5-C12). (bảng 3.16).

103

Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine

độ chuyển số nhóm Khối lƣợng Dẫn xuất

chuyển hóa phân tử hóa dendrimer

PAMAM G2.5 (z nhóm) (x%) (WtNMR)

13,75 4 6208 G2.5-C4

14,38 5 6529 G2.5-C8

18,29 6 6794 G2.5-C10

33,50 11 7727 G2.5-C12

Các kết quả từ bảng 3.16 cho thấy, khả năng phản ứng của các alkylamine tăng

dần theo chiều dài mạch cacbon. Điều này xảy ra do hiệu ứng cảm ứng dƣơng (I+) đẩy

electron về phía nguyên tử N của các gốc hydrocarbon trong alkylamine làm tăng tính

bazơ của amine [95].

Số nhóm chuyển hóa (z)

G2.5-C4 G2.5-C8 G2.5-C10G2.5-C12

Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine

Đồ thị 3.6: Kết quả biến tính PAMAM G2.5 với alkylamine

104

Đây cũng là cơ sở biến tính cho những phản ứng giữa dendrimer PAMAM thế

hệ lẻ có các nhóm –COO-CH3 bề mặt với tác nhân có chứa nhóm amine.

3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN

HƢỚNG ĐÍCH – ACID FOLIC

3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic

Phân tích phổ 1H-NMR chúng tôi đo đƣợc của hợp chất dendrimer PAMAM

G3.0-FA cho thấy bên cạnh sự xuất hiện các tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer

PAMAM G3.0 còn có các tín hiệu proton đặc trƣng của các nhóm nguyên tử trong

phân tử acid folic: k, m, r, p và q, điều này chứng tỏ có sự gắn kết acid folic vào

dendrimer PAMAM G3.0 (hình 3.14, hình 3.15). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu

của Durairaj Chandrasekar [79], Hong Zong [78], Yuanqing Zhang [106], Youngseon

Choi [76] và một số báo cáo [3, 7, 85, 107]. Sản phẩm PAMAM G3.0-FA thu đƣợc

dạng sánh dẻo màu vàng cam.

Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA

105

Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid

folic đƣợc thống kê qua bảng 3.17.

Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA

Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

2,52 a -CH2CH2N-(30 nhóm)

2,73-2,79 b -CH2CH2CO-(60 nhóm)

c -CH2CH2CONH-(60 nhóm)

2,19-2,34 i -CH2CH2CONH-(z nhóm)

s -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm)

2,62 d -CH2NH2 (32- z nhóm)

3,08-3,22 e -CONHCH2CH2- (60+z nhóm)

106

8,54 k

(z nhóm)

7,62-7,63 m

(2z nhóm)

4,66 p

(z nhóm)

4,50 q -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm)

6,73-6,75 r

(2z nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (k) trên phổ 1H-NMR

(hình 3.30), áp dụng công thức xác định đƣợc độ chuyển hóa:

số nhóm chuyển hóa của sản phẩm: z = 8,01%.32  3 nhóm

Khối lƣợng phân tử của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA:

(với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909; C = 12,0107; O = 15,9994; H = 1,00784)

WtNMR = 8179

107

Trong phép tính trên, giá trị:

đƣợc thế ứng với 32 nhóm (-CH=) ở vị trí (k), mỗi nhóm có 1 proton H và 30

nhóm methylen (-CH2-) ở vị trí (a), mỗi nhóm có 2 proton H; ứng trong công thức cấu

tạo của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA, theo độ chuyển hóa sản phẩm của lý

thuyết 100%.

Vậy đã có khoảng 3 nhóm folate đƣợc gắn thành công lên bề mặt dendrimer

PAMAM G3.0, kết luận sản phẩm: G3.0-(FA)3.

Qui trình phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic sử dụng

chất trung gian EDC khá đơn giản. Quá trình tinh chế sản phẩm sử dụng túi thẩm tách

Cellulose MWCO 3.500-5.000D để loại bỏ các phân tử nhỏ. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1H-NMR đã xác định đƣợc độ chuyển hóa (x%; 8,01%), số nhóm chuyển hóa (z; 3

nhóm) và khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer (WNMR; 8179).

3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân

hƣớng đích - acid folic

Phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.17) của hợp chất dendrimer PAMAM G3.0-C6-

FA cho thấy bên cạnh sự xuất hiện các tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer

PAMAM G3.0 còn có các tín hiệu proton của các nhóm đặc trƣng của các nhóm

nguyên tử trong phân tử acid folic (k, m, r, p và q) và các tín hiệu proton của nhóm

alkyl (j) có trong hexanoyl chloride. Điều đó chứng tỏ có sự gắn kết nhóm folate và

nhóm hexanoyl vào dendrimer PAMAM G3.0. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu

của Durairaj Chandrasekar [79], Hong Zong [78], Yuanqing Zhang [106], Youngseon

Choi [76] và một số báo cáo [3, 7, 85, 107]. Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-

FA thu đƣợc có màu vàng cam. Công thức cấu tạo dẫn xuất dendrimer PAMAM G

3.0-C6-FA (hình 3.16).

108

Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA

Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA

109

Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với

hexanoyl chloride và tác nhân hƣớng đích - acid folic đƣợc thống kê qua bảng 3.18. Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA

Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (, ppm)

2,52 a -CH2CH2N-(30 nhóm)

2,81 b -CH2CH2CO-(60 nhóm)

c -CH2CH2CONH-(60+y nhóm)

2,10-2,34 i -CH2CH2CONH-(z nhóm)

s -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm)

2,73 d -CH2NH2 (32- z-ynhóm)

3,20 e -CONHCH2CH2- (60+z+y nhóm)

8,54 k

(z nhóm)

7,61-7,63 m

(2z nhóm)

4,70 p

(z nhóm)

4,48 q -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm)

6,71-6,72 r

110

(2z nhóm)

0,82 j -NHCO-CH2(CH2)3CH3 (y nhóm)

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR, áp

dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ chuyển hóa của nhóm hecxanoyl:

Số nhóm chuyển hóa hecxanoyl: z = 20%.32  6 nhóm

Vậy đã có 6 nhóm hecxanoyl đƣợc gắn lên bề mặt dendrimer PAMAM G3.0.

1H-NMR, áp dụng công thức xác định đƣợc độ chuyển hóa nhóm folat:

Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (k) trên phổ

z = x%.32 = 8,01%.32 = 2,59  3 nhóm

Vậy đã có 3 nhóm folat đƣợc gắn lên bề mặt PAMAM G3.0.

Kết luận sản phẩm là G3.0-(C6)6-(FA)3.

Khối lƣợng phân tử của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA:

WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + 6. WtLT(hexanoyl chloride) – 6. WtLT(HCl) + 3. WtLT(acid folic)

– 3. WtLT(nƣớc)

= 6909 + 6. 134,60 – 6. 36,46084 + 3. 441,40 – 3. 18,01508

= 8768

Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu thuộc viện công nghệ nano Michigan và

trƣờng đại học Michigan họ đã gắn acid folic lên dendrimer PAMAM G5.0 với tỉ lệ

3:1 và mang lại hiệu quả hƣớng đích nhƣ mong đợi [78]. Từ kết quả thí nghiệm, chúng

111

tôi cũng đã gắn đƣợc 3 phân tử acid folic lên bề mặt dendrimer PAMAM G 3.0. Đây là

kết quả khá khả quan cho các nghiên cứu về chất mang thuốc.

Quá trình tinh chế sản phẩm sử dụng túi thẩm tách Cellulose MWCO 3.500- 5.000D để loại bỏ các phân tử nhỏ. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1H- NMR đã xác định

đƣợc độ chuyển hóa (x ; 8,01 ), số nhóm chuyển hóa (z; 3) và khối lƣợng phân tử

của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA (WtNMR; 8768).

3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO

Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn

xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc thử nghiệm trên các tế bào MCF-7

(Frederick, MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học

Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã lựa chọn dendrimer PAMAM 3.0 và 4 dẫn

xuất alkyl của dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon của mạch alkyl tăng

từ 2 đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 và G3.0-C14) để khảo

sát khả năng gây độc tế bào.

Đồ thị 3.7: Kết quả thử độc tế bào của PAMAM G3.0, PAMAM G3.0-C2, PAMAM

G3.0-C6, PAMAM G3.0-C10 và PAMAM G3.0-C14 trên tế bào MCF-7

112

Qua kết quả thử nghiệm thu đƣợc thể hiện trên đồ thị 3.7, chúng tôi đã chứng

minh khi gắn nhóm alkyl lên bề mặt của dendrimer PAMAM 3.0 thì các dẫn chất này

có tác dụng làm giảm khả năng gây độc tế bào so với dendrimer PAMAM G3.0. Bên

cạnh đó, số lƣợng các nhóm alkyl và chiều dài của mạch carbon cũng ảnh hƣởng đến

kết quả độc tính tế bào. Khi so sánh giữa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2 (10

nhóm chuyển hóa) với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14 (11 nhóm chuyển hóa)

thì khả năng gây độc tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14 giảm đáng kể.

Khi số lƣợng các nhóm alkyl càng nhiều càng làm giảm số lƣợng nhóm amine

trên bề mặt phân tử dendrimer PAMAM G3.0. Chuỗi carbon càng dài càng làm giảm

khả năng gây độc tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 do độ che phủ và bao bọc các

nhóm amine bề mặt tăng lên làm hạn chế khả năng tƣơng tác với màng tế bào. Độc

tính của dendrimer gây ra cho sự tƣơng tác giữa bề mặt điện tích dƣơng của dendrimer

PAMAM với màng tế bào tích điện âm, do đó khi làm giảm điện tích dƣơng của bề

mặt dendrimer PAMAM bởi các nhóm alkyl sẽ làm giảm độc tính của các dendrimer

[35, 36, 57, 71]. Rohit B. Kolhatkar và cộng sự [57] đã chứng minh khả năng gây

độc giảm hơn 10 lần khi tăng các nhóm acetyl trên bề mặt dendrimer PAMAM. Báo

cáo của Rachaneekorn Jevprasesphant [71] cũng đã cho thấy, khả năng gây độc tế bào

của dẫn xuất dendrimer PAMAM giảm đáng kể khi chiều dài mạch carbon tăng lên.

3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO

Khả năng thâm nhập tế bào của G3.0-C6-FITC và G3.0-C6-FA-FITC đã đƣợc

thử nghiệm trên dòng tế bào Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Confocal

laser scanning microscopy) tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc.

Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu (confocal laser scanning

microscopy) (hình 3.18).

113

Tế bào đối chứng

Tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC

Tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC

Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu

114

Qua phân tích hình ảnh thâm nhập tế bào bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu

(hình 3.18), chúng tôi nhận thấy các tín hiệu huỳnh quang FITC tích lũy tập trung ở

vùng xung quanh nhân tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-

FITC có gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Điều này thể hiện khả năng tƣơng tác

mạnh với tế bào ung thƣ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC có gắn

tác nhân hƣớng đích acid folic, chứng minh khả năng hƣớng đích chủ động của dẫn

xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC [2, 25].

Khi quan sát tế bào đối chứng và tế bào đã xử lý với dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic, chúng tôi nhận

thấy tín hiệu huỳnh quang FITC không xuất hiện ở tế bào đối chứng nhƣng có xuất

hiện với cƣờng độ thấp ở tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC

không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic, điều này cho thấy khả năng hƣớng đích thụ

động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC.

Qua kết quả khảo sát thâm nhập tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-

C6-FITC và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC, chúng tôi đã chứng

minh đƣợc khả năng hƣớng đích chủ động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-

FA-FITC có tác nhân hƣớng đích acid folic và khả năng hƣớng đích thụ động của dẫn

xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic.

Kết quả trên cũng đã cho thấy khả năng thâm nhập tế bào của dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC có tác nhân hƣớng đích acid folic là tốt hơn so

với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid

folic. Chứng minh khả năng hƣớng đích của acid folic do tƣơng tác giữa folat với

receptor folat chỉ có trên tế bào ung thƣ (khi tế bào tăng sinh mạnh) mà không có ở tế

bào bình thƣờng. Đây là ƣu điểm vƣợt trội của chất mang thuốc hƣớng đích. Các

nghiên cứu của Kukowska-Latallo JF [32], Youngseon Choi [76] và một số báo cáo [3,

4, 6, 35, 78-81, 103] cũng đã chứng minh khả năng hƣớng đích của chất mang thuốc

có gắn tác nhân folate.

Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng của liệu pháp điều trị ung thƣ mới sử

dụng các hệ mang thuốc có gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Các hệ mang thuốc này

sẽ đến đúng vị trí tế bào ung thƣ thông qua các dấu hiệu chọn lọc (receptor folat), góp

phần nâng cao hiệu quả và tính an toàn cho liệu pháp.

115

3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ

MỘT SỐ DẪN XUẤT

Kích thƣớc nano của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất đƣợc xác

định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM 1010 (JEOL, Japan), Đại học

Bách khoa, TP. HCM.

Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0-C6

Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA

Ảnh TEM của dendrimer PAMAM G3.0 (hình 3.19) cho thấy các hạt nano

dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc thành lập có dạng hình cầu và kích thƣớc hạt khác

nhau từ 3 đến 4 nm. Sau khi biến tính với hexanoyl chloride và acid folic cho các sản

116

phẩm biến tính dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6, G3.0-FA, G3.0-C6-FA có kích

thƣớc hạt từ 4 đến 6 nm (hình 3.19-20). Một số ảnh TEM điển hình của dendrimer

G3.0 và các dẫn xuất cho thấy các hợp chất tổng hợp đƣợc có kích thƣớc nano phù hợp

với lý thuyết phân tử.

Với kích thƣớc nano này các dẫn xuất dendrimer có tiềm năng rất lớn trong các

lĩnh vực y - dƣợc, nhƣ mang thuốc, vận chuyển gene, … [17, 32, 87, 102, 108-110].

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC

3.7.1 Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil

Trong khảo sát thực nghiệm này, chúng tôi sử dụng HPLC để xác định hàm

lƣợng thuốc 5-FU tự do không nang hóa bằng phƣơng pháp HPLC, dựa vào diện tích

peak của sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0 (216,39),

dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA (176,02) và đƣờng chuẩn ta tính đƣợc hàm

lƣợng thuốc tự do không nang hóa trong quá trình nhả thuốc, từ đó ta tính đƣợc lƣợng

thuốc nang hóa bằng hiệu lƣợng thuốc ban đầu (40mg) và lƣợng thuốc tự do không

nang hóa dendrimer G3.0 (17,406mg) và dẫn xuất dendrimer G3.0-C6-FA

(13,296mg). Do cấu trúc gốc hexyl xoắn và gốc folate gấp khúc tạo ra các khoảng

trống giữ các phân tử 5-FU nên dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang

thuốc (26,704 mg) nhiều hơn dendrimer PAMAM G3.0 (22,594mg).

Lƣợng 5-FU nang hóa trong cấu trúc dendrimer PAMAM và dẫn xuất đƣợc tính

toán gián tiếp thông qua nồng độ 5-FU tự do không nang hóa bằng phƣơng pháp đo

HPLC. 5-FU đƣợc pha với 6 nồng độ khác nhau từ 0.00125 – 1 (mg/ml), sau đó đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999)

(phụ lục 25).

117

Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0

Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0-C6-FA

Diện tích tín hiệu của các mẫu 5-Fu không nang hóa trong : dendrimer PAMAM

G3.0 là 216,39 và dẫn xuât dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA là 176,02. Tính toán

đƣợc kết quả là 1gam chất mang dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 112.97mg

thuốc 5-FU và 1gam chất mang dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc

133,52mg thuốc 5-FU.

Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng mang thuốc hiệu quả của dendrimer

PAMAM:

118

- 1 gam chất mang dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 112,97mg thuốc 5-FU

tƣơng ứng với 6 phân tử thuốc 5-FU đƣợc mang bên trong 1 cấu trúc phân tử

PAMAM G3.0.

- 1 gam chất mang dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc

133,52mg thuốc 5-FU tƣơng ứng với 9 phân tử thuốc 5-FU đƣợc mang trong 1

cấu trúc phân tử PAMAM G3.0-C6-FA.

3.7.2

Khảo sát khả năng nhả thuốc chống ung thƣ 5-FU đƣợc nhả ra của dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3-C6-FA/5-FU và 5-FU tự do đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

120

100

5-FU %

G3.0-C6-FA/5FU %

12h

24h

đo HPLC.

Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu hiện lƣợng thuốc đƣợc giải phóng của G3-C6-FA/5FU và 5-FU tự do

Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy khả năng phát hành chậm của thuốc từ hệ

thống PAMAM G3-C6-FA/5-FU và nhả chậm hơn so với 5-FU tự do. Đây cũng là một

cải tiến đáng kể trong việc kéo dài sinh khả dụng thuốc, vì chống ung thƣ 5-FU đã

đƣợc báo cáo là có thời gian lƣu thông trong máu rất ngắn [47].

119

KẾT LUẬN

Nhìn lại mục tiêu ban đầu của luận án: “Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang

thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng hƣớng đích đến tế

bào ung thƣ”. Một số kết quả mới của luận án đạt đƣợc có thể tóm tắt nhƣ sau:

1. Đã tổng hợp thành công các thế hệ dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (hiệu

suất phản ứng từ 71-89%), với mục đích thu đƣợc các dendrimer PAMAM

G2.5 và dendrimer PAMAM G3.0 sử dụng cho các biến tính bề mặt của

dendrimer PAMAM.

Xây dựng thành công phƣơng pháp tính toán mới trên cơ sở dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR và khối phổ MS ở các dendrimer PAMAM thế hệ

thấp từ G-0.5 đến G2.0 để tính khối lƣợng phân tử của các dendrimer PAMAM

thế hệ cao (từ thế hệ G3.0 trở đi). Hiệu số sai lệch so với lý thuyết của phƣơng

pháp này khoảng từ 0-6 , tƣơng đƣơng với kết quả sử dụng phƣơng pháp khối

phổ MALDI-TOF-MS.

3. Tổng hợp thành công các hợp chất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính với các

dãy alkyl hóa nhƣ acyl chloride, acid carboxylic, alcohol và dendrimer

PAMAM G2.5 với các alkylamine.

4. Đã xây dựng thành công phƣơng pháp tính toán mới trên cơ sở dữ liệu phổ 1H-

NMR để xác định độ chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm), khối

lƣợng phân tử của các dẫn xuất dendrimer PAMAM-alkyl.

5. Đã khảo sát độc tính tế bào trên tế bào MCF-7 của dendrimer PAMAM G3.0 và

các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon của mạch alkyl

tăng từ 2 đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 và G3.0-

C14). Kết quả cho thấy sau khi đƣợc alkyl hóa, độc tính tế bào của dẫn xuất

dendrimer PAMAM G3.0-alkyl giảm đáng kể so với dendrimer PAMAM G3.0

chƣa biến tính. Mạch alkyl càng dài thì sau khi gắn vào dendrimer PAMAM

càng làm giảm độc tính của dendrimer.

120

6. Đã gắn thành công tác nhân hƣớng đích acid folic lên hệ mang thuốc dendrimer

PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 tạo thành hệ chất

mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-FA và dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA.

7. Bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu đã chứng minh đƣợc khả năng hƣớng

đích chủ động của hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA

8. Đã khảo sát kích thƣớc của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn suất

dendrimer PAMAM G3.0-C6; PAMAM G3.0-FA; PAMAM G3.0-C6-FA bằng

hình ảnh TEM. Kích thƣớc của các hệ chất này nằm trong khoảng 4-6nm.

9. Đã khảo sát thành công khả năng mang và nhả thuốc chống ung thƣ 5-FU của

dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA. Kết

quả phân tử dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 6 phân tử 5-FU, trong khi đó

dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc nhiều hơn (9 phân tử 5-

FU). Và trong môi trƣờng PBS, thuốc 5-FU đƣợc nhả từ hệ mang thuốc

PAMAM G3.0-C6-FA/5FU chậm hơn so với đối chứng 5-FU.

121

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục đề tài này với các thế hệ dendrimer PAMAM cao hơn, để đạt hiệu quả

mang thuốc tốt hơn.

- Nghiên cứu biến tính các dẫn xuất dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng

đích khác nhƣ Arg-Gly-Asp (RGD); epidermal growth factor receptor (EGFR);

và kháng thể HER-2, ...

122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

LUẬN ÁN

1. Nguyễn Thị Bích Trâm, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Cửu Khoa, Ứng dụng phổ

cộng hƣởng từ hạt nhân trong phân tích đánh giá các polyaminoamin dendrimer

và dẫn xuất, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 276-279, 2013.

2. Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Biocompatible

and cellular uptake enhancement of polyamidoamine dendrimer via fatty alkyl

conjugation, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 259-263, 2013.

3. Ngoc Quyen Tran, Ngoc Hoa Nguyen, Thị Bich Tram Nguyen, Nguyen Cuu

Khoa, Positive effect of dendrimers nanocarriers on reducing cytotoxicity of

anticancer drugs, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 270-275, 2013.

4. Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Cytotoxic

behaviors of pamam-based dendrimers loading platinium compounds, Tạp chí

Khoa học và Công nghệ, 51(5A), pp 334-341, 2013.

5. Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Thi Bich Tram Nguyen, Kim Ngoc Phan,

Dendrimer-based nanocarriers demonstrating a high efficiency for loading and

releasing anticancer drugs against cancer cells in vitro and in vivo, Tạp chí Khoa

học và Công nghệ, 51(5A), pp 224-232, 2013.

6. Thi Bich Tram Nguyen, Phuc Thinh Nguyen, Minh Nhật Hồ, Cuu Khoa

Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from alkylated polyamidoamine G3.0, the 7th International Workshop on

Advanced Materials Science and nanotechnology, Hạ Long City, VN, 2014.

7. Nguyen Thi Bich Tram, Phuc Thinh Nguyen, Nguyen Đại Hải, Nguyen Cuu

Khoa, Tran Ngoc Quyen, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from

alkylated polyamidoamine G3.0 dendrimer - folate, Tạp chí Hóa học, 53(4e3),

pp 168-173, 2015.

123

8. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa

Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 1-H NMR Spectroscopy as an Effective Method

for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and Their

Derivatives, International Journal of Polymer Analysis and Characterization,

International Journal of Polymer Anal. Charact., 20: 57–68, 2015.

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jevprasesphant, R., et al., 2003, The influence of surface modification on the

cytotoxicity of PAMAM dendrimers. International Journal of Pharmaceutics.

252(1–2): p. 263-266.

2. Jain, K., et al., 2010, Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. International

Journal of Pharmaceutics. 394(1–2): p. 122-142.

3. Singh, P., et al., 2008, Folate and Folate−PEG−PAMAM Dendrimers:

Synthesis, Characterization, and Targeted Anticancer Drug Delivery Potential

in Tumor Bearing Mice. Bioconjugate Chemistry. 19(11): p. 2239-2252.

4. Chandrasekar, D., et al., 2007, Folate coupled poly (ethyleneglycol) conjugates

of anionic poly (amidoamine) dendrimer for inflammatory tissue specific drug

delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 82(1): p. 92-103.

5. Yang, W., et al., 2009, Targeting cancer cells with biotin–dendrimer

conjugates. European Journal of Medicinal Chemistry. 44(2): p. 862-868.

6. Wang, Y., et al., 2011, Targeted delivery of doxorubicin into cancer cells using

a folic acid–dendrimer conjugate. Polymer Chemistry. 2(8): p. 1754-1760.

7. Wang, S. and P.S. Low, 1998, Folate-mediated targeting of antineoplastic

drugs, imaging agents, and nucleic acids to cancer cells. Journal of Controlled

Release. 53(1–3): p. 39-48.

8. Boas, U., J.B. Christensen, and P.M. Heegaard, 2006. Dendrimers in medicine

and biotechnology: new molecular tools. Royal Society of Chemistry.

9. Thomas, T.P., et al., 2011, Folate‐targeted nanoparticles show efficacy in the

treatment of inflammatory arthritis. Arthritis & Rheumatism. 63(9): p. 2671-

2680.

10. Qi, R., et al., 2015, Folate receptor-targeted dendrimer-methotrexate conjugate

for inflammatory arthritis. Journal of biomedical nanotechnology. 11(8): p.

1431-1441.

11. Dutta, T., M. Garg, and N.K. Jain, 2008, Targeting of efavirenz loaded tuftsin

conjugated poly(propyleneimine) dendrimers to HIV infected macrophages in

vitro. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34(2–3): p. 181-189.

12. Astruc, D., E. Boisselier, and C. Ornelas, 2010, Dendrimers designed for

functions: from physical, photophysical, and supramolecular properties to

applications in sensing, catalysis, molecular electronics, photonics, and

nanomedicine. Chemical Reviews. 110(4): p. 1857-1959.

13. Tomalia, D.A., et al., 1985, A new class of polymers: starburst-dendritic

macromolecules. Polymer Journal. 17(1): p. 117-132.

14. Challa, T., A. Goud.B, and e. al, 2011, Dendrimers: A novel polymer for drug

delivery. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and

Research. Vol. 9(1): p. 88-99.

15. Tomalia, D.A., A.M. Naylor, and W.A. Goddard, 1990, Starburst dendrimers:

molecular‐level control of size, shape, surface chemistry, topology, and

flexibility from atoms to macroscopic matter. Angewandte Chemie

International Edition in English. 29(2): p. 138-175.

16. Prajapati, S.K., et al., 2016, Dendrimers in drug delivery, diagnosis and

therapy: Basics and potential applications. Journal of Drug Delivery and

Therapeutics. 6(1): p. 67-92.

17. Esfand, R. and D.A. Tomalia, 2001, Poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers:

from biomimicry to drug delivery and biomedical applications. Drug Discovery

Today. 6(8): p. 427-436.

18. Kresge, C., M. Leonowicz, and W. Roth, Dendrimers and Dendrons. Concepts,

Syntheses, Applications. 2001, VCH: Weinheim.

19. Klajnert, B., et al., 2003, Interactions between PAMAM dendrimers and bovine

serum albumin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and

Proteomics. 1648(1–2): p. 115-126.

20. Fréchet, J.M., 2003, Dendrimers and other dendritic macromolecules: From

building blocks to functional assemblies in nanoscience and nanotechnology.

Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41(23): p. 3713-3725.

21. Cloninger, M.J., 2002, Biological applications of dendrimers. Current Opinion

in Chemical Biology. 6(6): p. 742-748.

22. Wang, Z., et al., 2003, Mechanism of enhancement effect of dendrimer on

transdermal drug permeation through polyhydroxyalkanoate matrix. Journal of

Bioscience and Bioengineering. 96(6): p. 537-540.

23. Tomalia, D.A., et al., 2000, Dendrimers as reactive modules for the synthesis of

new structure-controlled, higher-complexity megamers. Pure and applied

chemistry. 72(12): p. 2343-2358.

24. Goyal, P., 2008. Development of dendritic and polymeric scaffolds for

biological and catalysis applications. ProQuest.

25. Khoa, N.C., 2015. Dendrimer - tổng hợp và ứng dụng trong y- dược. NXB

Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ.

26. Yoo, H.-S., T. Watanabe, and A. Hirao, 2009, Precise Synthesis of Dendrimer-

Like Star-Branched Polystyrenes and Block Copolymers Composed of

Polystyrene and Poly(methyl methacrylate) Segments by an Iterative

Methodology Using Living Anionic Polymerization. Macromolecules. 42(13):

p. 4558-4570.

27. Boo, W.J., Characterization of thin film properties of melamine based

dendrimer nanoparticles. 2003, Texas A&M University.

28. Klajnert, B. and M. Bryszewska, 2000, Dendrimers: properties and

applications. Acta biochimica polonica. 48(1): p. 199-208.

29. de la Campa, J.G., 2004, Synthetic Methods in Step‐Growth Polymers.

Macromolecular Chemistry and Physics. 205(5): p. 700-700.

30. Vögtle, F., 2003. Dendrimers II: architecture, nanostructure and

supramolecular chemistry. Vol. 210: Springer.

31. Svenson, S. and D.A. Tomalia, 2005, Dendrimers in biomedical applications-

reflections on the field. Advanced Drug Delivery Reviews. Vol. 57(15): p. 2106-

2129.

32. Kukowska-Latallo, J.F., et al., 2005, Nanoparticle targeting of anticancer drug

improves therapeutic response in animal model of human epithelial cancer.

Cancer research. 65(12): p. 5317-5324.

33. Yellepeddi, V.K., K.K. Vangara, and S. Palakurthi, 2013, Poly (amido) amine

(PAMAM) dendrimer–cisplatin complexes for chemotherapy of cisplatin-

resistant ovarian cancer cells. Journal of nanoparticle research. 15(9): p. 1-15.

34. Kalomiraki, M., K. Thermos, and N.A. Chaniotakis, 2016, Dendrimers as

tunable vectors of drug delivery systems and biomedical and ocular

applications. International journal of nanomedicine. 11: p. 1.

35. Morales-Sanfrutos, J., et al., 2011, Alkyl sulfonyl derivatized PAMAM-G2

dendrimers as nonviral gene delivery vectors with improved transfection

efficiencies. Organic & biomolecular chemistry. 9(3): p. 851-864.

36. Santos, J.L., et al., 2010, Functionalization of poly(amidoamine) dendrimers

with hydrophobic chains for improved gene delivery in mesenchymal stem

cells. Journal of Controlled Release. 144(1): p. 55-64.

37. Kobayashi, H., et al., 2001, 3D‐micro‐MR angiography of mice using

macromolecular MR contrast agents with polyamidoamine dendrimer core with

reference to their pharmacokinetic properties. Magnetic resonance in medicine.

45(3): p. 454-460.

38. Wiener, E., et al., 1994, Dendrimer‐based metal chelates: A new class of

magnetic resonance imaging contrast agents. Magnetic resonance in medicine.

31(1): p. 1-8.

39. Deriu, M.A., et al., 2016, Iron oxide/PAMAM nanostructured hybrids:

combined computational and experimental studies. Journal of Materials

Science. 51(4): p. 1996-2007.

40. Campos, B.B., et al., 2016, Carbon dots on based folic acid coated with

PAMAM dendrimer as platform for Pt(IV) detection. Journal of Colloid and

Interface Science. 465: p. 165-173.

41. Palecz, B., et al., 2016, Thermodynamic interaction between PAMAM G4-

NH2, G4-OH, G3. 5-COONa dendrimers and gemcitabine in water sotutions.

International Journal of Secondary Metabolite (IJSM). 3(1).

42. Nikakhtar, A. and A. Nasehzadeh, 2007, Structural effects of DNA on

thermodynamic stability of DNA-dendronized polymer nanoclusters and

nanoclusteration process. Journal of the Iranian Chemical Society. 4(3): p. 310-

317.

43. Wakabayashi, Y., et al., 2000, Infrared Absorption Characteristics of Large-

Sized Spherical Aryl-Ether Dendrimers. Analytical sciences. 16(12): p. 1323-

1326.

44. Emran, S., et al., 2001, Viscoelastic properties and phase behavior of 12‐tert‐

butyl ester dendrimer/poly (methyl methacrylate) blends. Journal of Polymer

Science Part B: Polymer Physics. 39(12): p. 1381-1393.

45. Saad, M., et al., 2008, Receptor targeted polymers, dendrimers, liposomes:

Which nanocarrier is the most efficient for tumor-specific treatment and

imaging? Journal of Controlled Release. 130(2): p. 107-114.

46. Ward, M.A. and T.K. Georgiou, 2011, Thermoresponsive polymers for

biomedical applications. Polymers. 3(3): p. 1215-1242.

47. Ly, T.U., et al., 2013, Pegylated dendrimer and its effect in fluorouracil loading

and release for enhancing antitumor activity. Journal of biomedical

nanotechnology. 9(2): p. 213-220.

48. Angajala, G. and R. Subashini, 2014, Transdermal Nanocarriers: New

Challenges and Prospectives in the Treatment of Diabetes mellitus. Journal of

Chemistry & Applied Biochemistry. 1(2-2014).

49. Xu, X., et al., A novel doxorubicin loaded folic acid conjugated PAMAM

modified with borneol, a nature dual-functional product of reducing PAMAM

toxicity and boosting BBB penetration. European Journal of Pharmaceutical

Sciences.

50. Licata, N.A. and A.V. Tkachenko, 2008, Kinetic limitations of cooperativity-

based drug delivery systems. Physical review letters. 100(15): p. 158102.

51. Chen, J., et al., 2016, Substrate-Triggered Exosite Binding: Synergistic

Dendrimer/Folic Acid Action for Achieving Specific, Tight-Binding to Folate

Binding Protein. Biomacromolecules. 17(3): p. 922-927.

52. Gosk, S., VCAM-directed Immunoliposomes Loaded with Vascular Disrupting

Agents for Selective Targeting and Occlusion of the Tumor Vasculature: As a

Novel Therapeutic Strategy. 2008, Universitäts-und Landesbibliothek Bonn.

53. Daniels, T.R., et al., 2012, The transferrin receptor and the targeted delivery of

therapeutic agents against cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -

General Subjects. 1820(3): p. 291-317.

54. Pourianazar, N.T., P. Mutlu, and U. Gunduz, 2014, Bioapplications of poly

(amidoamine)(PAMAM) dendrimers in nanomedicine. Journal of Nanoparticle

Research. 16(4): p. 1-38.

55. Saovapakhiran, A., et al., 2009, Surface Modification of PAMAM Dendrimers

Modulates the Mechanism of Cellular Internalization. Bioconjugate Chemistry.

20(4): p. 693-701.

56. Kono, K., et al., 2008, Preparation and cytotoxic activity of poly(ethylene

glycol)-modified poly(amidoamine) dendrimers bearing adriamycin.

Biomaterials. 29(11): p. 1664-1675.

57. Kolhatkar, R.B., et al., 2007, Surface Acetylation of Polyamidoamine

(PAMAM) Dendrimers Decreases Cytotoxicity while Maintaining Membrane

Permeability. Bioconjugate Chemistry. 18(6): p. 2054-2060.

58. Bullen, H.A., et al., 2011, Evaluation of biotinylated PAMAM dendrimer

toxicity in models of the blood brain barrier: a biophysical and cellular

approach. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 2(05): p. 485.

59. Wang, W., et al., 2009, The decrease of PAMAM dendrimer-induced

cytotoxicity by PEGylation via attenuation of oxidative stress. Nanotechnology.

20(10): p. 105103.

60. Garin-Chesa, P., et al., 1993, Trophoblast and ovarian cancer antigen LK26.

Sensitivity and specificity in immunopathology and molecular identification as

a folate-binding protein. The American journal of pathology. 142(2): p. 557.

61. Caliceti, P., et al., 2003, Synthesis and Physicochemical Characterization of

Folate−Cyclodextrin Bioconjugate for Active Drug Delivery. Bioconjugate

Chemistry. 14(5): p. 899-908.

62. De Jesus, E., et al., 2015, Comparison of Folate Receptor Targeted Optical

Contrast Agents for Intraoperative Molecular Imaging. International journal of

molecular imaging. 2015.

63. Winkler, J., 2013, Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications.

Therapeutic Delivery. 4(7): p. 791-809.

64. Lo, Y.-L., et al., 2015, Folic Acid Linked Chondroitin Sulfate-

Polyethyleneimine Copolymer Based Gene Delivery System. Journal of

biomedical nanotechnology. 11(8): p. 1385-1400.

65. Zhuo, R.X., B. Du, and Z.R. Lu, 1999, In vitro release of 5-fluorouracil with

cyclic core dendritic polymer. Journal of Controlled Release. 57(3): p. 249-257.

66. Waite, C.L., et al., 2009, Acetylation of PAMAM dendrimers for cellular

delivery of siRNA. BMC Biotechnology. 9(1): p. 1-10.

67. Majoros, I.J., et al., 2003, Acetylation of Poly(amidoamine) Dendrimers.

Macromolecules. 36(15): p. 5526-5529.

68. Majoros, I.J., et al., 2005, Poly (amidoamine) dendrimer-based multifunctional

engineered nanodevice for cancer therapy. Journal of medicinal chemistry.

48(19): p. 5892-5899.

69. Yanez Arteta, M., et al., 2013, Interactions of PAMAM dendrimers with SDS at

the solid–liquid interface. Langmuir. 29(19): p. 5817-5831.

70. Menjoge, A.R., R.M. Kannan, and D.A. Tomalia, 2010, Dendrimer-based drug

and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.

Drug Discovery Today. 15(5–6): p. 171-185.

71. Jevprasesphant, R., et al., 2003, Engineering of dendrimer surfaces to enhance

transepithelial transport and reduce cytotoxicity. Pharmaceutical Research.

20(10): p. 1543-1550.

72. Dung, H.T.K., N.C. Khoa, and N.C. Trực, 2009, Tổng hợp các Dendrime

Polyamidoamin (Pamam).

73. Ito, M., et al., 2002, In Situ Investigation of Adlayer Formation and Adsorption

Kinetics of Amphiphilic Surface-Block Dendrimers on Solid Substrates.

Langmuir. 18(25): p. 9757-9764.

74. Quintana, A., et al., 2002, Design and function of a dendrimer-based

therapeutic nanodevice targeted to tumor cells through the folate receptor.

Pharmaceutical research. 19(9): p. 1310-1316.

75. Baker, J.R., et al., 2001, The synthesis and testing of anti-cancer therapeutic

nanodevices. Biomedical Microdevices. 3(1): p. 61-69.

76. Choi, Y., et al., 2005, Synthesis and Functional Evaluation of DNA-Assembled

Polyamidoamine Dendrimer Clusters for Cancer Cell-Specific Targeting.

Chemistry & Biology. 12(1): p. 35-43.

77. Myc, A., et al., 2007, Dendrimer-Based Targeted Delivery of an Apoptotic

Sensor in Cancer Cells. Biomacromolecules. 8(1): p. 13-18.

78. Zong, H., et al., 2012, Bifunctional PAMAM Dendrimer Conjugates of Folic

Acid and Methotrexate with Defined Ratio. Biomacromolecules. 13(4): p. 982-

991.

79. Chandrasekar, D., et al., 2007, The development of folate-PAMAM dendrimer

conjugates for targeted delivery of anti-arthritic drugs and their

pharmacokinetics and biodistribution in arthritic rats. Biomaterials. 28(3): p.

504-512.

80. Leroueil, P.R., et al., 2015, Characterization of Folic Acid and

Poly(amidoamine) Dendrimer Interactions with Folate Binding Protein: A

Force-Pulling Study. The Journal of Physical Chemistry B. 119(35): p. 11506-

11512.

81. Kesharwani, P., R.K. Tekade, and N.K. Jain, 2015, Generation dependent safety

and efficacy of folic acid conjugated dendrimer based anticancer drug

formulations. Pharmaceutical research. 32(4): p. 1438-1450.

82. Konda, S.D., et al., 2001, Specific targeting of folate–dendrimer MRI contrast

agents to the high affinity folate receptor expressed in ovarian tumor

xenografts. Magnetic resonance materials in physics, Biology and Medicine.

12(2-3): p. 104-113.

83. Karabulut, B., O. Kerimoğlu, and T. Uğurlu, 2015, Dendrimers-drug delivery

systems. Journal of Marmara University Institute of Health Sciences. 5(1): p.

31-40.

84. Majoros, I.J., et al., 2009, Methotrexate delivery via folate targeted dendrimer‐

based nanotherapeutic platform. Wiley Interdisciplinary Reviews:

Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1(5): p. 502-510.

85. Mullen, D.G., et al., 2011, Design, synthesis, and biological functionality of a

dendrimer-based modular drug delivery platform. Bioconjugate chemistry.

22(4): p. 679-689.

86. Caminade, A.-M., R. Laurent, and J.-P. Majoral, 2005, Characterization of

dendrimers. Advanced drug delivery reviews. 57(15): p. 2130-2146.

87. Biricova, V. and A. Laznickova, 2009, Dendrimers: Analytical characterization

and applications. Bioorganic chemistry. 37(6): p. 185-192.

88. Hong, S., et al., 2004, Interaction of poly (amidoamine) dendrimers with

supported lipid bilayers and cells: hole formation and the relation to transport.

Bioconjugate chemistry. 15(4): p. 774-782.

89. Zhao, Y.-F., et al., 2005, Synthesis and characterization of diblock copolymers

based on crystallizable poly(ε-caprolactone) and mesogen-jacketed liquid

crystalline polymer block. Polymer. 46(14): p. 5396-5405.

90. Izunobi, J.U. and C.L. Higginbotham, 2011, Polymer Molecular Weight

Analysis by 1H NMR Spectroscopy. Journal of Chemical Education. 88(8): p.

1098-1104.

91. Dizman, C., et al., 2010, Synthesis, characterization and photoinduced curing of

polysulfones with (meth) acrylate functionalities. Beilstein journal of organic

chemistry. 6(1): p. 56.

92. Ahmed, S.M., et al., 2001, Preparation and characterisation of a chromophore-

bearing dendrimer. Polymer. 42(3): p. 889-896.

93. Marder, O. and F. Albericio, 2003, Industrial application of coupling reagents

in peptides. Chimica oggi. 21(6): p. 35-40.

94. Tran, N.Q., et al., 2011, RGD-conjugated in situ forming hydrogels as cell-

adhesive injectable scaffolds. Macromolecular Research. 19(3): p. 300-306.

95. PGS TS Thái Doãn, T., 2002, Cơ sở Hóa hữu cơ tập 2.

96. Majoros, I. and J.R. Baker Jr, 2008. Dendrimer-based nanomedicine. Pan

Stanford Publishing.

97. Yu, G.S., et al., 2011, Synthesis of PAMAM dendrimer derivatives with

enhanced buffering capacity and remarkable gene transfection efficiency.

Bioconjugate chemistry. 22(6): p. 1046-1055.

98. Yu, G.S., et al., 2011, Sequential Conjugation of 6-Aminohexanoic Acids and

L-Arginines to Poly (amidoamine) Dendrimer to Modify Hydrophobicity and

Flexibility of the Polymeric Gene Carrier. Bull. Korean Chem. Soc. 32(2): p.

651.

99. Oddone, N., et al., 2013, Cell uptake mechanisms of PAMAM G4-FITC

dendrimer in human myometrial cells. Journal of nanoparticle research. 15(7):

p. 1-14.

100. Inapagolla, R., 2007. Dendrimer based delivery of therapeutic agents for

thrombolysis and asthma. ProQuest.

101. Mozafari, M.R., 2007. Nanomaterials and nanosystems for biomedical

applications. Springer Science & Business Media.

102. Kumar, P., et al., 2010, Dendrimer: a novel polymer for drug delivery. JITPS.

1(6): p. 252-269.

103. Wang, Y., et al., 2009, Polyamidoamine Dendrimers with a Modified

Pentaerythritol Core Having High Efficiency and Low Cytotoxicity as Gene

Carriers. Biomacromolecules. 10(3): p. 617-622.

104. Gomez, M.V., et al., 2009, NMR Characterization of Fourth-Generation

PAMAM Dendrimers in the Presence and Absence of Palladium Dendrimer-

Encapsulated Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131(1):

p. 341-350.

105. Majoros, I.n.J. and e. al, 2003, Acetylation of Poly(amidoamine) Dendrimers.

Macromolecules. Vol. 36: p. 5526-5529.

106. Zhang, Y., et al., 2013, Dendrimer–folate–copper conjugates as bioprobes for

synchrotron X-ray fluorescence imaging. Chemical Communications. 49(88): p.

10388-10390.

107. Zhao, Y., et al., 2010, Synthesis and grafting of folate–PEG–PAMAM

conjugates onto quantum dots for selective targeting of folate-receptor-positive

tumor cells. Journal of Colloid and Interface Science. 350(1): p. 44-50.

108. Kesharwani, P., et al., 2015, PAMAM dendrimers as promising nanocarriers for

RNAi therapeutics. Materials Today. 18(10): p. 565-572.

109. Werengowska-Ciećwierz, K., et al., 2015, The chemistry of bioconjugation in

nanoparticles-based drug delivery system. Advances in Condensed Matter

Physics. 2015.

110. Ciolkowski, M., et al., 2012, Surface modification of PAMAM dendrimer

improves its biocompatibility. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and

Medicine. 8(6): p. 815-817.

4 PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0

Phổ MS của dendrimer PAMAM G-0.5

Phổ MS của dendrimer PAMAM G0.0

Phổ MS của dendrimer PAMAM G0.5

P h ổ

H N M R c ủ a d ẫ n x u ấ t d e n d r i

m e r P A M A M G 3 . 0 - F A

P25

P h ụ l ụ c 2 4 : P h ổ

H N M R c ủ a d ẫ n x u ấ t d e n d r i

m e r P A M A M G 3 - C 6 - F A

P26

Phụ lục 25: Xây dựng sơ đồ đƣờng chuẩn của 5-FU

5-FU đƣợc pha với 6 nồng độ khác nhau từ 0.00125 -1 (mg/mL), ở bƣớc sóng 260 nm; tiêm mẫu 5µL; tốc độ dòng 1mL/phút.sau đó đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn.

Bảng P1: Số liệu đƣờng chuẩn

STT Area[ ]

1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch chuẩn C(mg/ml) 0.00125 0.0025 0.005 0.01 0.1 1 29.189 51.429 97.886 201.425 1605.171 14 800.000

Từ đó ta dựng đƣợc đồ thị nhƣ sau:

Hình P1: Đồ thị đƣờng chuẩn của 5-FU.

Từ đồ thị ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999)

P27

Phụ lục 26: Số liệu nhả thuốc của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA

Bảng P2: Số liệu nhả thuốc của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA

5-FU (mg) 5-FU % G3.0-C6/5FU % Thời gian G3.0-C6-FA/5FU (mg)

1 3 7 12 24 1.981 2.111 2.132 2.133 2.163 90,046 95,956 96,955 96,954 98,322 73,6 85,6 87,5 96,5 96,5 1.16 1.88 1.93 2.12 2.12

P28