Luận án Tiến sỹ Y học: Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009-2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

--------------------------

NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC

CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH

TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

--------------------------

NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC

CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH

TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013

Chuyên ngành: Vi sinh Y học

Mã số: 62.72.01.15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai

2. PGS.TS. Trần Hải Anh

HÀ NỘI – 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc,

trung thực. Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Kim Phương

iii

Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng

- Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng

- Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108

Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học

LỜI CẢM ƠN

PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai ngƣời Thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt

kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bƣớc đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và

luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi

hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải

Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề

tài cấp nhà nƣớc về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí

nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Tsutomu Kageyama Trung tâm

Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật

ban đầu của nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS. Hoàng Vũ Mai

Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch, ThS. Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp

công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những

bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vƣợt qua mọi khó

khăn trong quá trình nghiên cứu đạt đƣợc thành quả ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 01 năm 2015

NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng ix

Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƢƠNG I – TỔNG QUAN ......................................................................... 3

1.1. Vi rút cúm................................................................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm vi rút học ............................................................................. 3

1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A ................................................. 10

1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 ........................................................................ 13

1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới ................................... 13

1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trƣớc diễn biến của đại dịch A/H1N1/09. . 19

1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam ............................ 20

1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ............................................................. 21

1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN .............. 24

1.3.1. Phân lập vi rút. .................................................................................. 24

1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền ......................................... 26

1.3.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể ..................................................... 30

1.4. Vắc xin ..................................................................................................... 32

1.4.1. Các loại vắc xin cúm ......................................................................... 33

1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm ................................................. 37

1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch ....................... 38

1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin ........................................... 38

CHƢƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 41

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 41

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................... 41

2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 ........................... 41

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: ........................................................................ 41

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:.......................................................................... 41

2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .................................................... 41

2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu .................................................................. 42

2.2.4. Các biến số nghiên cứu ..................................................................... 42

2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm ......................................................... 43

2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. ................................................... 60

2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu ............................................................... 60

CHƢƠNG III – KẾT QUẢ .......................................................................... 61

3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. ............. 61

3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen. ....................... 62

3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) .................................. 63

3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). .................................. 69

3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. ............................ 74

3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ........................ 84

3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. .. 84

3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay

đổi axit amin trong protein HA liên quan. .................................................. 85

3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ

nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. ................................ 86

3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide. ..................... 87

3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hƣởng của đột biến đến

biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ................................. 89

3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ........................ 90

3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) ............ 93

CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN. ....................................................................... 95

4.1. Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013. ......... 95

4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. .......... 96

4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen ............. 97

4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 ................... 98

4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 .. 101

4.5.1 . Protein HA ..................................................................................... 101

4.5.2 . Protein NA. .................................................................................... 106

4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. ............................. 108

4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ...................... 109

4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). ................................ 112

4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ...................... 113

KẾT LUẬN .................................................................................................. 118

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 120

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

vii

A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch

(The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009) ADN ARN CDC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CPE ELISA

FAO GISRS

HA HI IC50 IFA ILI IQR ISIRV

IVAC

MDCK MN NA NAI

NIBSC

Axit Deoxyribonucleic Axit Ribonucleic Centers for Disease Control (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào) Enzyme-linked immunosorbent assays (Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) Global Influenza Surveillance and Response System (Hệ thống giám sát cúm toàn cầu) Haemaglutinin Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu) Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm) Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị) International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases (Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đƣờng hô hấp khác) Institute of Vaccines And Medical Biological (Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang) Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thƣờng trực) Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lƣợng) Neuramindase Neuraminidase Inhibition Assay ( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase) Nationnal Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vƣơng quốc Anh)

viii

NLS NP NS OIE PA PB PCR Polivac RNP RT- PCR

RT-LAMP

SARS

Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân) Nucleoprotein Non-structural World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới) Polymerase acid Polymerase basic Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen) Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội Ribonucleoprotein Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc) Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc) Severe Acute Respiratory Syndrome (Hội chứng hô hấp cấp tính nặng) Phƣơng pháp xác định trình tự gen Sequence VABIOTECH Company for vaccine and biologycal production No1

WHO TCYTTG PTN (Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1) World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới Phòng thí nghiệm

DANH MỤC BẢNG Trang

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm............................ 8

Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của

trƣờng học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico ............................... 14

Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................... 42

Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC50 của vi rút cúm .................................... 56

Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. ……61

Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

bằng phản ứng PCR......................................................................................... 63

Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA ........................... 67

Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA .................................. 68

Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA .......................... 72

Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA .................................. 73

Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1,

NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu................................................ 82

Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein ................... 83

Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013. ............................................................................................. 84

Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian. ........... 85

Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K. ....... 89

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y........... 90

Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tƣơng

đồng về di truyền học trên gen HA và NA. .................................................... 91

Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 nhóm 6C ..............................................................................92

Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn ................. 93

DANH MỤC HÌNH Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm ...................................................................... 5

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm. ............................................ 6

Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase .................................................. 9

Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm. ................................................... 13

Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và Tây nam

Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009 ................................................................... 15

Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) ................... 16

Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hƣởng của đại dịch và sự phân bố các trƣờng

hợp tử vong ..................................................................................................... 18

Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu .................. 19

Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ............................ 22

Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen ............................................................ 29

Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen ................................................................ 47

Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen ......................... 52

Hình 2.3 Kết quả HI xác định hiệu giá vi rút A(H1N1)pdm09 với kháng huyết

thanh chuẩn A/California/07/09. ..................................................................... 59

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi

khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen ........................................................ 62

Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013. ............................................................................................. 65

Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút

cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin A/California/07/09

(Mega 5 sofwave) . .......................................................................................... 66

Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 70

Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút

cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin . ............................. 71

Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 75

Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 77

Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 79

Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 81

Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian ............ 86

Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09. ............................................................................................. 88

Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm0988

Hình 3.13 Kết quả khuếch đại của vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự

tuyển. ............................................................................................................... 94

Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. .. 110

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển ..................................... 40

Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3

năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển

thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21[80], [109]. Theo số liệu thống kê của

TCYTTG, ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và vùng lãnh

thổ, gây tử vong cho 18.449 trƣờng hợp [120], [121]. Tƣơng tự các đại dịch cúm

đã xảy ra ở giai đoạn trƣớc, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lƣu hành cùng

với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm

[109], [119].

Việt Nam là nƣớc thứ 54 trên thế giới thông báo các trƣờng hợp nhiễm vi

rút cúm A(H1N1)pdm09, trƣờng hợp nhiễm đầu tiên đƣợc ghi nhận vào ngày

31/5/2009 [2]. Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và

trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trƣờng hợp

nhiễm cúm đƣợc ghi nhận tại Việt Nam là căn nguyên do cúm A(H1N1)pdm09.

Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trƣờng hợp nhiễm với 53 trƣờng hợp

tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) [4].

Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chƣơng trình giám sát cúm

quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc ghi

nhận với tỷ lệ là 46,6 % trong tổng số các trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm năm

2009 và giảm với tỷ lệ 28 % trong năm 2010 khi có sự đồng lƣu hành của vi rút

cúm A/H3N2. Tại năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ

lệ 74,1% và đạt 30% trong năm 2013. Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm

2009 và tiếp tục trong gây dịch các năm tiếp theo, những phân tích về di truyền

học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu

hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch [8], [22].

Những sự thay đổi đƣợc ghi nhận nhƣ tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể

gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA

(D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm

ĐẶT VẤN ĐỀ

tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đƣờng hô hấp [8], [11]. Các

đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện

tƣợng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng đƣợc ghi nhận

[68], [71]. Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh

hƣởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế

bào chủ. Hơn thế nữa, khả năng tiềm tàng của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp

(reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể

sẽ tăng độc tính hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới [5], [14], [18].

Hiện tại, vắc xin cúm mùa thƣơng mại có khả năng phòng nhiễm vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn đƣợc yêu cầu cập

nhật thƣờng xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của

TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang đƣợc phát triển tại

một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo

của TCYTTG, trong khi đó một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc,

Australia lựa chọn các vi rút cúm lƣu hành tại nƣớc mình để phát triển vắc xin để

đảm bảo sự tƣơng đồng cao về di truyền, đặc tính kháng nguyên nâng cao hiệu

quả cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117].

Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào

chiến lƣợc phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt

Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu:

1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013.

2. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09.

3. Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại

Việt Nam.

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1. Vi rút cúm

Vi rút cúm là một vi rút đặc biệt trong nhóm vi rút gây bệnh đƣờng hô

hấp cho ngƣời liên quan đến sự đa dạng về kháng nguyên, gây bệnh có tính

chất mùa và ảnh hƣởng trên một phạm vi toàn cầu với sự xuất hiện của đại

dịch.

1.1.1. Đặc điểm vi rút học

1.1.1.1 Phân loại

Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút

cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó vi

rút cúm A, B, C gây bệnh cho ngƣời. Vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia

cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa... là căn nguyên gây nên các

đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thƣờng gây bệnh nhẹ thƣờng chỉ gây

nên các vụ dịch vừa và nhỏ, đặc biệt trẻ em. Vi rút cúm C có gây bệnh, ghi

nhận với số lƣợng nhỏ [6], [18], [61], [122], [123].

Vi rút cúm A đƣợc chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng

nguyên bề mặt HA (Haemagglutinin) và NA (Neuramindase). Sử dụng HA để

xác định phân týp của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định đƣợc 17

loại hemagglutinin khác nhau từ H1 đến H17, trong đó H17 đƣợc xác định từ

vi rút phân lập từ dơi [101]. Kháng nguyên NA đƣợc chia thành 9 phân týp

khác nhau từ N1 đến N9. Nhƣ vậy nếu ghép cặp 17 phân týp HA với 9 cặp

phân týp NA thì sẽ đƣợc 153 phân týp cúm A khác nhau [18], [122], [123].

Vi rút cúm A gây bệnh cho ngƣời chủ yếu là vi rút cúm có kháng nguyên

bề mặt là H1, H2, H3 và N1 hoặc N2. Gần đây, một số phân týp cúm mới, có

nguồn gốc từ gia cầm đã gây bệnh cho ngƣời đó là vi rút cúm A/H5N1ghi

nhận tại Hồng Kông 1997 và một loạt các trƣờng hợp nhiễm cúm tại Trung

Quốc, Đài Loan và Hồng Kông đƣợc báo cáo là phân týp vi rút mới A/H7N9

đƣợc ghi nhận năm 2013-2014 [32], [33], [49].

1.1.1.2 Cấu tạo chung

Dƣới kính hiển vi điện tử vi rút cúm có dạng hình cầu, hình trứng hoặc

một số ít có dạng hình sợi đƣờng kính 20nm và dài từ 200-300nm, đƣờng

kính trung bình 80-120nm. Bên trong vi rút có cấu tạo phức tạp gồm protein

capsid và các sợi ARN liên kết với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc

đối xứng xoắn. Vỏ của vi rút đƣợc cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt 2 lớp

vỏ lipid này là khoảng 500 chồi gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút,

mỗi chồi gai có độ dài từ 10-14nm. Các chồi gai này đƣợc cấu tạo bởi các

glycoprotein, là hai loại kháng nguyên quan trọng là Haemagglutinin (HA) và

Neuraminidase (NA). Hai kháng nguyên HA và NA quyết định đến khả năng

gây bệnh của vi rút cúm, có bản chất là glycoprotein (HA) hoặc enzyme (NA)

[6], [116], [122], [123].

Protein HA còn gọi là tố ngƣng kết hồng cầu (NKHC): giúp vi rút bám

vào thụ cảm thể niêm mạc đƣờng hô hấp, phân tách thành protein HA1 và

HA2, trở thành vi rút hoạt động và xâm nhập vào trong tế bào [29].

Hemagglutinin có thể bám vào màng hồng cầu của một số loài động vật (gà

tây, chuột lang…), gây ra hiện tƣợng kết dính hồng cầu, có thể nhìn thấy đƣợc

bằng mắt thƣờng. Kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu (Haemaglutinine Assay) dựa

trên nguyên lý này để phát hiện vi rút cúm. Kháng thể kháng HA có tầm quan

trọng trong cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể. Sự có mặt của kháng thể này làm

bất hoạt protein HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút

không còn khả năng bám vào niêm mạc đƣờng hô hấp, do đó mất khả năng

gây bệnh. Protein NA có bản chất là enzyme, có tác dụng làm loãng chất nhầy

ở đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm

nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho

việc giải phóng các virion trong quá trình nhân lên trong tế bào. Kháng thể

tƣơng ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể nhƣng yếu

hơn kháng thể tƣơng ứng kháng nguyên HA.

Protein M bao gồm M1 nằm dƣới lớp lipit kép và liên kết với RNP của

lõi vi rút, là protein có nhiều nhất trong virion. Protein M1 có vai trò quan

trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho

vi rút nảy chồi. Phần xuyên màng là protein M2 hoạt động nhƣ một kênh ion xuyên màng có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút làm phá

vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1, giải phóng các RNP của

vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm (Hình 1.1). Protein NS2 tạo

thành phức hợp với protein M1 là mối liên hệ cần thiết trong chu trình sống

của vi rút để giải phóng phức hợp RNP từ nhân.

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm

http://www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/flu/images/flu_structure.gif

Bên trong vi rút có cấu tạo gồm các sợi ARN đơn âm, liên kết với các

protein NP và 3 enzyme polymerase PA, PB1, PB2 tạo thành phức hệ

ribonucleoprotein có chức năng sao chép và phiên mã. Nucleoprotein (NP) và

3 enzyme polymerase (PB1, PB2, PA) là thành phần chủ yếu của phức hợp

Ribonucleoprotein (RNP) xoắn ở bên trong của vi rút (Hình 1.2).

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm.

Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Camb

1.1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng

Genome của vi rút A, B là ARN sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn, riêng vi

rút cúm C gồm 7 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb. Hệ gen của vi

rút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 10 protein đã biết. Mỗi phân đoạn

mã hóa cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc

PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc

(Nonstructureral) NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút

cúm B[63], [76].

Protein HA là glycoprotein gồm 562-566 axit amin đƣợc mã hóa bởi

1742-1778 nucleotide, có trọng lƣợng phân tử khoảng 76.000 Dalton.

Haemagglutinin đóng vai trò nhƣ thụ thể bằng cách gắn vào sialic acid (N-

acetyl-neuraminic acid) trên bề mặt tế bào cảm nhiễm và vào bên trong tế bào

bằng quá trình thực bào. Protein HA đƣợc tổng hợp ở dạng tiền thân là chuỗi

polypeptide HA0. Điều kiện pH thấp các enzyme phân tách protein dạng

trysin và fusin, cấu trúc của HA0 thành HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu

nối disulphua. Protein HA2 (gồm 221-222 axit amin) vẫn gắn với màng vi rút

và protein HA1 (gồm 319-326 axit amin) có các khu vực thụ cảm thể

(receptor binding) tạo điều kiện cho màng tế bào cảm nhiễm và màng vi rút

hòa vào nhau, vi rút có thể bám gắn trên bề mặt tế bào cảm nhiễm bắt đầu cho

quá trình thâm nhập vào tế bào [29]. Protein HA là một trong thành phần

kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, những thay đổi trên protein HA gây ra

hiện tƣợng chuyển dịch - trôi kháng nguyên (antigenic drift) là nguyên nhân

gây những vụ dịch cúm theo mùa. Những biến đổi lớn (antigennic shift) ở

protein HA làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A, hệ quả là

giảm hoặc ức chế sự gắn kết với các kháng thể trung hòa đƣợc tạo ra từ các

kháng nguyên trƣớc đó (miễn dịch tự nhiên hoặc vắc xin). Sự trao đổi và tích

hợp các phân đoạn gen xảy ra khi một tế bào bị nhiễm 2 vi rút cúm A khác

nhau, dẫn đến sự hình thành của một loại vi rút mới mà quần thể không có

miễn dịch có thể gây đại dịch trong tƣơng lai.

Protein NA đƣợc mã hóa bởi 1413 nucleotide (453 axit amin) có cấu trúc

tứ đồng phân (tetramer), trọng lƣợng phân tử trung bình 220.000 Dalton. Phần

chính của phân tử NA đều nằm ở mặt ngoài vi rút, neuraminidase hoạt động

giống nhƣ một enzyme, nó cắt axit sialic ra khỏi các phân tử glycoprotein,

glycolipid ở bề mặt tế bào chủ, giúp cho vi rút cúm bám vào tế bảo chủ để

thực hiện quá trình thâm nhiễm. Khi vi rút đƣợc nhân lên trong tế bào chủ,

hoạt động ezyme của Neuraminidase sẽ tác động và axit sialic của

glycoprotein tế bào chủ, giúp giải phóng vi rút. Những thay đổi nhỏ cũng có

thể xảy ra với NA, một số đột biến có liên quan đến hiện tƣợng giảm độ nhạy

hoặc kháng các thuốc kháng vi rút theo cơ chế ức chế Neuramidase. Các đột

biến đã đƣợc xác định gồm: I117V, H274Y, H275Y, I222K, E119V, N294S

(R - arginine; K - lysine; H - histidine; Y- tyrosine; E - glutamic acid; V -

valine) có thể dẫn đến sự kháng không chỉ đối với oseltamivir mà còn đối với

zanamivir và thuốc khác mới [15], [50], [51], [59]. Để xác định ảnh hƣởng

của đột biến này, các thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm nhƣ thử

nghiệm ức chế Neuraminidase (Neuraminidase Inhibition assay - NAI) hoặc

thử nghiệm trên động vật (in vivo) đƣợc áp dụng.

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm [94].

Polypeptide

Chức năng

Phân đoạn

Kích thƣớc (bp)

2341

PB2

Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN thông tin (mARN)

2341

PB1

2233

PA

1778

HA

Đóng vai trò enzyme phiên mã, sao chép, kéo dài, tham gia quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới trong tế bào chủ Là thành phần chủ yếu của phức hợp ribonucleoprotein (RNP), tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vARN) Haemagglutinin: mang tính đặc hiệu týp, kháng nguyên HA gây ngƣng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi rút vào tế bào chủ, dung hợp giải phóng phức hợp ribonucleoprotein, mở đầu quá trình nhân lên của vi rút

1565

NP

Nucleoprotein: là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa 1 trong các kháng nguyên đặc hiệu týp

1413

NA

M1

1027

M2

Neuraminidase: phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi tế bào nhiễm. Matrix protein: là protein nhiều nhất trong virion tạo thành bộ khung, là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn định cấu trúc vi rút Tích màng protein M2 hoạt động nhƣ 1 kênh bơm ion để làm giảm hoặc để duy trì pH của thể nội bào (endosome)

NS1

890

NS2

Là protein không cấu trúc, điều hòa để thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của vi rút trong tế bào bị nhiễm

Protein M2 và M1 đƣợc mã hóa từ phân đoạn gen M, khi vi rút thâm

nhập vào tế bào thông qua thể thực bào, hoạt tính của kênh ion M2 đƣợc gia

tăng để cho các ion tràn vào bên trong, dẫn đến pH thấp tạo điều kiện cho

protein HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào. Các ribonucleoprotein

đƣợc phóng thích vào trong bào tƣơng của tế bào và đƣợc vận chuyển tới

nhân khởi đầu cho sự tổng hợp RNA vi rút. Hoạt tính của protein M2 bị ức

chế bởi amantadine, rimantadine [66].

Protein NS1 có vai trò trong hoạt động của vi rút cúm đƣợc cho là ức chế

sự chuyển ra ngoài nhân phần poly-A, làm cho mRNA ƣu tiên đƣợc chuyển

vận vào ty thể (ribosome) và sau đó dịch mã. NS1 cũng ức chế sự cắt dán tiền

mRNA (pre-mRNA) và ức chế sự đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm

vi rút, làm cho quá trình nhân lên của vi rút đƣợc dễ dàng. NS2 là một phân tử

nhỏ có trọng lƣợng 11.000. Trong hạt vi rút, NS2 có thể gắn kết với protein

M1. Ngƣời ta cho rằng nó có chức năng là giúp đỡ cho sự vận chuyển các

RNP vừa đƣợc tổng hợp từ nhân đi vào bào tƣơng để làm cho vi rút sinh sản

nhanh hơn [123], [127]. Các protein NS1 và NS2 có chức năng điều hòa để

thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của vi rút trong tế bào bị nhiễm.

Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase

Nguồn: http://biology.kenyon.edu/BMB/Jmol2010/RNAP/Image1.jpg

Các protein PB1, PB2 và PA là các polymerase đƣợc mã hoá từ các phân

đoạn gen PB1, PB2, PA chịu trách nhiệm tạo ra các RNA và RNA

polymerase. Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm

vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút (Hình 1.2). Khi

khởi đầu quá trình tổng hợp mRNA của vi rút, PB2 gắn vào đầu 5’ của

mRNA của tế bào chủ, PA endonuclease cắt một đoạn 10 - 15 nucleotide để

sử dụng làm mồi tổng hợp mRNA để sau đó mRNA di chuyển ra tế bào chất

thực hiện quá trình phiên mã (Hình 1.3). Trong quá trình hoạt động của vi rút

cúm, một số đột biến xác định xảy ra trên gen PB2 có liên quan chặt chẽ với

khả năng thích nghi của vi rút, điều này đặc biệt với vi rút cúm gia cầm

H5N1. Vị trí 627 trên vi rút cúm ngƣời là Lysin trong khi trên vi rút cúm gia

cầm là Glutamin, đột biến E627K trên vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng

thích nghi với điều kiện sống của vi rút. Trên gia cầm, vi rút tồn tại và nhân lên ở nhiệt độ tối ƣu là 37oC, khi mang gen đột biến, vi rút cúm gia cầm có

khả năng thích nghi và phát triển đƣợc trên tế bào đƣờng hô hấp trên của ngƣời với nhiệt độ tối ƣu là 33oC, làm tăng khả năng cảm nhiễm của vi rút

cúm gia cầm với vật chủ mới [96]. Ngoài ra, PB2 đƣợc cho là có liên hệ mật

thiết với các thụ cảm thể trên bề mặt nhân của tế bào chủ, tạo điều kiện tốt

cho sự di chuyển của RNA vi rút vào trong nhân tế bào. Riêng với vi rút cúm

A, đoạn RNA số 2 mã hoá cho hai protein: PB1có kích thƣớc 757 axit amin

và một protein có kích thƣớc nhỏ PB1-F2 87 axit amin có chức năng thúc đẩy

quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tƣơng tự trong hệ gen

của vi rút cúm B và C [74], [127].

1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A

Quá trình nhân lên của vi rút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau:

(1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép genome

vi rút, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) quá trình đóng gói, nảy chồi

và giải phóng vi rút thế hệ mới [57], [62], [90].

1.1.2.1 Quá trình gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ

Gai HA của vi rút sẽ phát hiện và bám gắn vào thụ cảm thể tƣơng ứng

của tế bào chủ. Phân tử HA tiền thân, HA0 đƣợc tạo thành từ hai tiểu đơn vị:

HA1, có vùng gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2

liên kết với nhau bằng liên kết disulfua. Thụ cảm thể của vi rút cúm có cấu

trúc axitsialic liên kết với đƣờng galactose của glycoprotein/glycolipid của tế

bào chủ bằng liên kết alpha 2, 3 (vi rút cúm ngƣời) hoặc alpha 2, 6 (vi rút

cúm gia cầm). Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của

liên kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau. Sau quá trình gắn bám vào

màng tế bào chủ, vi rút sẽ xâm nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng. Trong

endosome, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu

trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2. Peptide dung hợp gắn vào màng

endosome khiến cho màng vi rút và màng endosome hoà vào nhau. Môi

trƣờng axit trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2. Ion H+ sẽ đi vào vi rút qua kênh

M2, làm axit hoá lõi vi rút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự

do này đƣợc giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ [28].

Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín

hiệu định vị nhân [81]. Các tín hiệu định vị nhân này của vi rút liên kết với

các thành phần của hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào

nhân tế bào chủ.

1.1.2.2 Quá trình phiên mã vào sao chép ARN vi rút (vRNA)

Khác với nhiều vi rút khác có hệ gen là sợi ARN âm, quá trình phiên mã

ARN vi rút cúm diễn ra trong nhân. Ngƣời ta nhận thấy rằng trong quá trình

phiên mã của vi rút cúm có cơ chế đƣợc gọi là cap-snatching: PB2 của vi rút

có hoạt tính endonuclease sẽ cắt các sợi ARN đã đƣợc gắn mũ (7-

methylguanosine) của tế bào chủ ở một gốc purin cách đầu tận cùng 5’ 10 –

13 nucleotide, đoạn ARN này sẽ đƣợc sử dụng để khởi đầu quá trình phiên

mã. Quá trình khởi đầu, kéo dài, kết thúc và gắn polyA đều đƣợc xúc tác bởi

phức hệ protein PB2, PB1, PA và NP. Các sợi mRNA có chiều dài ngắn hơn

các đoạn vRNA, mRNA sau khi đƣợc tổng hợp trong nhân tế bào sẽ đƣợc vận

chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của vi rút. Các protein màng

HA, NA, M1 và M2 sẽ đƣợc vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong

khi các protein NP, PA, PB1 và PB2 đƣợc chuyển vào trong nhân để cùng với

các vRNA(-) tạo thành các vRNP(-) mới [90].

1.1.2.3 Giải phóng vRNP ra khỏi nhân tế bào

Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) đƣợc vận chuyển qua lỗ màng nhân

ra tế bào chất thông qua con đƣờng vận chuyển phụ thuộc CRM1. Đầu tận

cùng C của protein M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 có một

NLS và liên kết với NS2, NS2 liên kết với CRM1. Phức hệ gồm M1, vRNP(-)

và NS2 sẽ đƣợc vận chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ khả năng liên kết của

NS2 với CRM1.

1.1.2.4 Đóng gói, nảy chồi và giải phóng vi rút thế hệ mới.

Vi rút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt vi

rút hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận.

Quá trình đóng gói vi rút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA,

NA và M2 của vi rút.

Ngƣời ta đƣa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các phân

đoạn ARN vi rút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu.

Theo mô hình đóng gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ đƣợc đóng gói một

cách ngẫu nhiên bên trong virion. Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở

các tín hiệu đóng gói vi rút đƣợc xác định là các vùng mã hoá và không mã

hoá ở đầu 5’ và 3’ trên một số đoạn vRNA và do đó quá trình đóng gói vi rút

là đặc hiệu. Protein M1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và

nảy chồi hạt vi rút. Hạt vi rút chỉ đƣợc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế

bào chủ khi liên kết giữa acid sialic và glycoprotein/glycolipid đƣợc cắt đứt.

Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ neuraminidase trên bề mặt vi rút.

Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm.

Nguồn :http://varuncnmicro.blogspot.com/2012/05/influenza-hush-bush.html

1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09

1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới

1.2.1.1 Nguồn gốc đại dịch

Cuối tháng 3 năm 2009 các nhà khoa học ghi nhận sự tăng đột biến các

trƣờng hợp nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính có liên quan đến cúm tại

Veracruz, Mexico. Đầu tháng 4 năm 2009, Trung tâm kiểm soát bệnh dịch

Hoa Kỳ xác định các ca nói trên đã nhiễm một loại cúm A có nguồn gốc từ

lợn phân týp H1N1 [19].

1.2.1.2 Diễn biến đại dịch cúm

 Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mexico

Từ 17 đến 26 tháng 4, có 1455 trƣờng hợp nghi ngờ nhiễm cúm với các

triệu chứng viêm phổi nặng và 84 trƣờng hợp tử vong đƣợc báo cáo. Sự lƣu

hành của bệnh đƣợc xác nhận trong 24/32 bang thuộc Mexico và tập trung

chủ yếu tại quận Federal, Mexico và bang San Luis de Potosi. Bệnh nhân chủ

yếu là những thanh niên trẻ và khoẻ mạnh, rất ít trƣờng hợp ghi nhận tại trẻ

em dƣới 3 tuổi và trên 60 tuổi. Những báo cáo về các trƣờng hợp nhập viện vì

viêm phổi nặng và tử vong tại Mexico đã cảnh báo cho các cán bộ y tế địa

phƣơng về sự xuất hiện một tỷ lệ bất thƣờng của bệnh viêm đƣờng hô hấp và

tại thời điểm đó đại dịch cúm chƣa đƣợc đề cập [25].

Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động

của trƣờng học tại Mexico [25]

Ngày

Các hoạt động

5/4 - 8/4/2009

Kỳ nghỉ xuân của các học sinh (khoảng 34 triệu học sinh) từ cấp 1 đến đại học)

12/4/2009

Mexico thông báo về dịch bệnh viêm đƣờng hô hấp cấp cho Tổ chức Y tế Thế giới khu vực Mỹ La tinh (Pan-American Heath Organization – PAHO)

17/4/2009

Bộ Y tế cảnh báo dịch

23/4/2009

Cơ quan Y tế công cộng Canada xác nhận trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm mới A/H1N1có nguồn gốc từ lợn (novel swine – origin A/H1N1)

24/4-11/5/2009

Đóng cửa toàn bộ các cấp trƣờng học tại các khu vực đô thị, quận của thành phố Mexico. Rạp chiếu phim, nhà hàng, sân vận động, nhà thờ cũng tạm thời đóng cửa tại khu vực đô thị của thành phố Mexico.

27/4-11/5/2009 Trƣờng học đóng cửa trên toàn quốc

3/7/2009

Bắt đầu kỳ nghỉ hè

Thêm vào đó các hoạt động can thiệp đƣợc bổ sung tại thành phố

Mexico và khu vực xung quanh bao gồm đóng cửa các nhà hàng, rạp chiếu

phim và hủy bỏ các buổi họp công cộng lớn.

Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và

Tây nam Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009

(Nguồn: 10.1371/journal.Pmed.1000436)

Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tiếp diễn tại Mexico đƣợc ghi nhận đến tháng

12/2009 với 3 làn sóng dịch với tổng số mắc đƣợc khẳng định bằng chẩn đoán

PTN là 27.440 trƣờng hợp.

 Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ

Tại San Diego, California, Mỹ, ngày 30/3/2009 xuất hiện một bệnh nhân

nam, 10 tuổi với tiền sử hen nhập viện với triệu chứng sốt, ho, nôn. Ngày

1/4/2009 bệnh nhân đến khám bệnh tại trung tâm y tế thành phố và khỏi bệnh

trong vòng một tuần. Bệnh phẩm thu đƣợc từ bệnh nhân này đƣợc xác định

dƣơng tính với cúm nhƣng không phân týp đƣợc bởi tại trung tâm y tế thành

phố và đƣợc gửi tới PTN chuẩn thức của California, tại đây bệnh phẩm đƣợc

xác định dƣơng tính với vi rút cúm A nhƣng âm tính với phân týp đang lƣu

hành A/H1N1 hoặc A/H3N2 khi sử dụng real-time RT-PCR. Đến ngày

15/4/2009, CDC- Atlanta, Mỹ nhận đƣợc mẫu bệnh phẩm này và xác định vi

rút cúm A/H1N1 mới có nguồn gốc từ lợn là tác nhân gây bệnh cho bệnh

nhân tại California. Ngay lập tức, CDC thông báo tới Cơ quan Y tế công cộng

California và tiến hành điều tra với sự tham gia của chuyên gia thuộc Y tế

công cộng và cơ quan thú y khu vực [19].

Ngày 28/3/2009 tại bang California một bé gái 9 tuổi (không có liên

quan dịch tễ với trƣờng hợp trƣớc) xuất hiện ho, sốt. Hai ngày sau, bé đƣợc

đƣa đến một phòng khám ngoại trú là thành viên của chƣơng trình giám sát

cúm thƣờng xuyên của Mỹ. Bệnh nhân đƣợc điều trị bằng Amoxicillin –

clavulanate và đã phục hồi hoàn toàn. Mẫu bệnh phẩm dịch mũi họng đƣợc

gửi đến Trung tâm nghiên cứu Hải quân tại San Diego cũng đƣợc xác định

dƣơng tính với vi rút cúm A nhƣng không định týp đƣợc. Bệnh phẩm đƣợc

gửi đến CDC-Atlanta, Mỹ ngày 17/4/2009 và đƣợc khẳng định căn nguyên là

vi rút cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn [17], [19].

Ngày 17/4/2009, thông tin về 2 vi rút cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ

lợn gây bệnh cho ngƣời tại Mỹ đƣợc thông báo tới TCYTTG [31].

Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) [31]

(Nguồn: DOI: 10.1056/NEJMoa0903810)

Đến 6/5/2009, có tổng số 1.487 trƣờng hợp đƣợc khẳng định nhiễm vi

rút cúm mới A(H1N1)pdm09 tại 43 bang của Mỹ, trong đó 35 trƣờng hợp

phải nhập viện và 2 trƣờng hợp tử vong. Bệnh nhân mắc bệnh đƣợc ghi nhận

từ 3 tháng tuổi đến 81 tuổi (tuổi trung bình là 15) [31].

 Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại một số nước khác

Từ 26/4 đến 6/5/2009, TCYTTG báo cáo có 309 trƣờng hợp nhiễm cúm

đƣợc khẳng định tại 21 quốc gia trên toàn thế giới ngoài Mỹ và Mexico [111]:

- Trong số 178 trƣờng hợp đƣợc điều tra có 145 (82%) trƣờng hợp có yếu tố

dịch tễ liên quan đến việc qua lại Mexico trong thời gian gần đó.

- Các trƣờng hợp không có yếu tố dịch tễ đến Mexico, có 17 trƣờng hợp

(52%) có tiếp xúc với những ngƣời đi du lịch về từ Mexico.

- Các nƣớc Canada, Đức, Tây Ban Nha, Anh có báo cáo khẳng định về sự lây

nhiễm từ ngƣời - ngƣời chu kỳ thứ 2 (không có tiếp xúc hoặc đi qua vùng

dịch).

Các trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm mới A/H1N1 tại các quốc gia này ở độ

tuổi trung bình là 27 (phân bố từ 2-62 tuổi). Phần lớn các trƣờng hợp nhiễm

cúm A(H1N1)pdm09 tại các quốc gia này không diễn biến phức tạp, không

tử vong, chỉ có 4 trƣờng hợp phải nhập viện [17]. Đến ngày 31/5/2009 có 22

quốc gia của châu Mỹ thông báo có sự xuất hiện của cúm mới

A(H1N1)pdm09 với tổng số mắc là 16.018 ngƣời và 115 trƣờng hợp tử vong

[113].

1.2.1.3 Tỉ lệ mắc và tử vong.

Tính đến ngày 7 tháng 8 năm 2010, đại dịch cúm đã tác động đến 214

quốc gia và gây ít nhất 18.449 trƣờng hợp tử vong [120], [121].

Nhìn chung tỷ lệ chết/mắc do cúm A(H1N1)pdm09 dao động từ 0,0004

đến 1,47% phản ánh sự không nhất quán về việc ghi nhận ca bệnh tại các khu

vực khác nhau [42], [115], [77]. Trên thực tế do số ca bệnh có thể cao hơn

nhiều so với số ca ghi nhận đƣợc nhƣng tỷ lệ chết/mắc do cúm

A(H1N1)pdm09 sẽ không vƣợt quá 0,35% [34].

Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hƣởng của đại dịch và sự phân bố các

trƣờng hợp tử vong [121].

So với các đại dịch cúm trƣớc đây, số tử vong ghi nhận trong đại dịch

cúm A(H1N1)pdm09này ít hơn nhiều. Có nhiều yếu tố dẫn đến sự khác biệt

này là do:

− Những hiểu biết về bệnh cúm và các đại dịch cúm trong thế kỷ XX đã cung

cấp những thông tin khoa học giúp cho việc xây dựng kế hoạch phòng

chống đại dịch cúm hiệu quả hơn.

− Thế giới đã có kinh nghiệm, chuẩn bị kế hoạch đáp ứng với đại dịch cúm

qua dịch SARS và cúm A/H5N1 trong các năm trƣớc đó.

− Các hƣớng dẫn về phòng chống đại dịch cúm đƣợc ban hành kịp thời đã

giúp các quốc gia xây dựng kế hoạch phòng chống đại dịch cúm hiệu quả

hơn.

− Độc lực của vi rút cúm A(H1N1)pdm09: Cho đến nay, vi rút chƣa đột biến

để trở thành dạng có độc lực cao và chƣa có hiện tƣợng kháng oseltamivir

nên các trƣờng hợp bệnh chủ yếu ở thể nhẹ, đáp ứng tốt với thuốc kháng vi

rút.

− Cơ sở hạ tầng, hệ thống y tế và điều kiện kinh tế, văn hóa, xã hội của các

quốc gia đã cải thiện hơn trƣớc giúp cho chất lƣợng các dịch vụ y tế, chất

lƣợng cuộc sống đƣợc cải thiện hơn trƣớc.

1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trước diễn biến dịch cúm A(H1N1)pdm09 có

nguồn gốc từ lợn.

Phối hợp chặt chẽ với CDC-Atlanta (Mỹ), cơ quan Y tế công cộng

Canada (PHAC), Bộ Y tế Mexico, TCYTTG theo dõi chặt chẽ các diễn biến

của dịch cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn và đƣa ra các cảnh báo kịp

thời.

Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu khởi phát Mỹ từ 28/3 - 5/5/2009 [31]

(Nguồn:http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0903810)

Đáp ứng của CDC và TCYTTG theo thời gian (Hình 1.7):

1-15/4: CDC xác nhận trƣờng hợp đầu tiên.

2-17/4: CDC xác nhận bệnh nhân thứ 2, báo cáo Chính phủ và TCYTTG

3- 23/4: CDC đƣa những thông tin đầu tiên liên quan đến dịch

4-25/4: TCYTTG thông báo về nguy cơ bùng phát dịch trên toàn cầu

5-26/4: TCYTTG xác định mức cảnh báo đại dịch tại mức độ 3.

6- 26/4: Mỹ tuyên bố tình trạng khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng

7- 27/4: TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 4

8- 29/4 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 5

Ngày 27 tháng 4 năm 2009, TCYTTG cảnh báo đại dịch cúm ở mức độ 4

vì đã xác định đƣợc dấu hiệu bệnh lây từ ngƣời sang ngƣời [112]. Hai ngày

sau đó, TCYTTG đã nâng mức cảnh báo đại dịch lên cấp độ 5 vì dịch đã xuất

hiện trên một quy mô lớn hơn nhƣng sự lây truyền từ ngƣời sang ngƣời vẫn ở

giới hạn ít nhất hai nƣớc trong một khu vực [110]. Ngày 11 tháng 6 năm

2009, lần đầu tiên sau 41 năm, TCYTTG đã công bố đại dịch cúm ở cấp độ 6

do sự lan truyền đƣợc xác định ở cộng đồng tại Bắc Mỹ, Đông Á và Châu Đại

dƣơng. Đại dịch cũng đƣợc xác định là ở giai đoạn đầu với tính nghiêm trọng

ở mức độ trung bình [114]. Các công tác nỗ lực của TCYTTG trong phòng

chống và hạn chế ảnh hƣởng của đại dịch cúm đƣợc tiến hành với hàng loạt

các hƣớng dẫn trong chẩn đoán sớm, cách ly, giám sát và điều trị nhiễm cúm

A(H1N1)pdm09 đƣợc ấn hành. Vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 cũng đƣợc tiến

hành nghiên cứu và phát triển, chỉ sau 6 tháng kể từ khi xuất hiện đại dịch đến

cuối tháng 9/2009 vắc xin bất hoạt đã đƣợc áp dụng tại một số nƣớc trên thế

giới nhƣ Australia (Panvax H1N1vaccine)

Trong năm 2009- 2010, một số nƣớc đã chứng kiến làn sóng thứ 2 và thứ

3 của đại dịch này trƣớc khi đại dịch thoái lui . Đế n ngà y 10 tháng 8 năm

2010, TCYTTG chính thức công bố đạ i dị ch cú m A(H1N1)pdm09 đã chuyể n

sang giai đoạ n hậ u đạ i dị ch [119].

1.2.3. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam

1.2.3.1 Diễn biến cúm A(H1N1)pdm09

Việt Nam là nƣớc thứ 54 thông báo các trƣờng hợp nhiễm cúm

A(H1N1)pdm09, ca nhiễm đầu tiên tại Việt Nam ngày 31/5/2009, ngƣời bệnh

là một thanh niên 23 tuổi du học tại Mỹ về Việt Nam trên chuyến bay UA869

quá cảnh qua Hồng Kông về cửa khẩu sân bay Tân Sơn Nhất ngày

26/04/2009 [2]. Một tuần sau, cúm A(H1N1)pdm09 xuất hiện ca đầu tiên tại

khu vực miền Bắc là nam giới, 34 tuổi khởi phát ngày 8/6/2009 tại Hà Nội, du

lịch từ Mỹ qua cửa khẩu sân bay Nội Bài ngày 10/6/2009 [1]. Sau đó liên tục

phát hiện các ca bệnh mới nhập cảnh từ Mỹ, Hàn Quốc... có tiền sử tiếp xúc

gần với bệnh nhân trƣớc đó và xuất hiện các chùm ca bệnh trên diện rộng,

ngày 11/06/2009 TCYTTG chính thức thông báo cúm A(H1N1)pdm09 ở cấp

độ 6. Sau 7 tuần khống chế thành công dịch ở các ca bệnh xâm nhập rải rác từ

các nƣớc và vùng có dịch nhập cảnh vào Việt Nam, từ giữa tháng 7/2009 dịch

bắt đầu có dấu hiệu lan ra cộng đồng, tăng số ngƣời mắc tại các nơi tập trung

đông ngƣời nhƣ trƣờng học, cơ quan công sở và nơi công cộng [1]. Tính đến

ngày 7 tháng 8 năm 2009, Việt Nam ghi nhận thêm 35 trƣờng hợp dƣơng tính

với cúm A(H1N1)pdm09 (Miền Nam: 18 ca, miền Bắc: 08 ca, miền Trung: 04

ca, Tây Nguyên: 05 ca) [3].

1.2.3.2 Tỉ lệ mắc và tử vong

Cho đến trung tuần tháng 9 năm 2009, số ca bệnh cúm A(H1N1)pdm09

tăng lên rất nhanh. Ngày 3 tháng 8 năm 2009 Việt Nam ghi nhận ca tử vong

đầu tiên do cúm A(H1N1)pdm09. Đến tháng 6 năm 2011, cả nƣớc ghi nhận

66 trƣờng hợp tử vong có liên quan đến nhiễm cúm A(H1N1)pdm09, tuy

nhiên số ca bệnh ghi nhận đƣợc trên thực tế có thể sẽ cao hơn nhiều lần, tính

từ đầu vụ dịch cho đến trung tuần tháng 9/2009, tỷ lệ chết/mắc do cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam là 0,17%. Vào thời điểm này các ca bệnh đƣợc

giám sát và xét nghiệm chặt chẽ nên số ca bệnh ghi nhận đƣợc phản ánh số

mắc trong cộng đồng [4].

1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09

1.2.4.1 Cấu trúc phân tử

Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 có cấu trúc di truyền hoàn toàn khác so với

các vi rút cúm A đã từng biết. Ngay sau khi xuất hiện và gây dịch tại Mexico

và Mỹ vào tháng 4 năm 2009, các vi rút cúm mới A/H1N1 đƣợc thu thập và

phân tích. Kết quả khi phân tích bộ gen cho thấy vi rút cúm này có hình thái,

cấu trúc bộ gen hoàn toàn mới gồm có: 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, HA,

NP và NS) tƣơng tự với vi rút cúm lƣu hành trên lợn năm 1998 tại Bắc Mỹ.

Phân đoạn gen NA và M rất giống gen của vi rút cúm lƣu hành trên lợn tại

châu Âu-Á (H1N1 và H3N2).

Sự sắp xếp và tích hợp gen của vi rút cúm mới này chƣa từng phát hiện

tại châu Mỹ cũng nhƣ trên toàn thế giới trƣớc đây. Thêm vào đó, bộ gen của

vi rút cúm lợn đã biết lƣu hành tại khu vực bắc Mỹ năm 1998 đƣợc xác định

là trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortment) do nó bao gồm: Các phân

đoạn gen có nguồn gốc từ lợn cổ điển: HA, NA, M, NS. Các phân đoạn gen

có nguồn gốc từ cúm gia cầm dòng Bắc Mỹ: PB2, PA. Phân đoạn gen cúm

ngƣời A/H3N2.

Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 [31].

Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19525932

Kết quả phân tích trên cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 là vi rút cúm có

trao đổi và tích hợp bậc 4. Sự tham gia của các gen M và NA từ các dòng vi

rút cúm lợn Á-Âu đã tạo ra một phân týp vi rút cúm A hoàn toàn mới, thể

hiện sự trao đổi giữa các loài và đã đáp ứng đầy đủ về vi rút học trong cơ chế

gây đại dịch cúm ở ngƣời. Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là

sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch H1N1/1918 [31], [42], [43].

Trong vòng 91 năm kể từ đại dịch 1918, vi rút cúm A/H1N1 luôn luôn

lƣu hành trên gia cầm, lợn và ngƣời. Sự lây truyền chéo giữa các loài đã xảy

ra và kết quả là xảy ra một số vụ dịch nhỏ, lẻ tẻ. Tuy nhiên sự vắng bóng của

vi rút cúm A/H1N1 trên ngƣời năm 1957 cũng đƣợc ghi nhận và có thể lý giải

về sự cạnh tranh của vi rút cúm gây đại dịch H2N2. Đến năm 1977, vi rút này

lại tái nổi trội và không có sự liên quan đến các vi rút cúm A ở các loài khác.

Đến năm 2009, vi rút cúm A/H1N1 mới đã xuất hiện và gây thành đại dịch

cúm đầu tiên trong thế kỷ 21 [43], [80].

1.2.4.2 Chuẩn hóa thuật ngữ của vi rút cúm gây đại dịch năm 2009.

Sau hơn 2 năm sau đại dịch cúm 2009, vi rút căn nguyên của đại dịch có

rất nhiều tên gọi đƣợc sử dụng. Tên thông dụng đƣợc phổ biến trong truyền

thông và phần lớn công chúng là cúm lợn “swine flu”. Sử dụng thuật ngữ đó

đã gây ra sự tức giận của nông dân và không đảm bảo sự đặc hiệu, ngoài ra có

rất nhiều các vi rút cúm lợn khác đang lƣu hành và luôn có khả năng trở thành

vi rút mới gây nguy hiểm tiếp theo. Nếu sử dụng thuật ngữ A/H1N1 đơn giản

sẽ không thể phân biệt đƣợc với các vi rút cúm mùa A/H1N1 trƣớc đó. Thuật

ngữ cúm A/H1N1 mới “novel H1N1” hoặc A/H1N1/09 cũng không đảm bảo

sự rõ ràng hơn khi nói đến vi rút cúm gây đại dịch năm 2009.

Khi TCYTTG thông báo kết thúc đại dịch, vi rút cúm A/H1N1 gây đại

dịch năm 2009 đã trở thành một vi rút cúm mùa tiếp tục lƣu hành cùng các vi

rút cúm mùa khác (A/H3N2 và B). Tuy nhiên, danh pháp của vi rút này vẫn

chƣa đƣợc chuẩn hóa dẫn đến việc sử dụng rất nhiều tên cho cùng một vi rút.

Để giảm thiểu sự lẫn lộn trong khoa học, truyền thông và khẳng định sự khác

biệt với các vi rút cúm mùa A/H1N1 lƣu hành trƣớc đại dịch cúm A/H1N1

năm 2009, ngày 26/9/2011 hội đồng tƣ vấn kỹ thuật cho thành phần vắc xin

Nam bán cầu năm 2012 của TCYTTG đã thống nhất đặt tên cho vi rút cúm

này là A(H1N1)pdm09 [65].

1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán và nghiên cứu nhiễm vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong phòng thí nghiệm.

Ngay sau khi xuất hiện và gây dịch tại Mexico tháng 3/2009, các phƣơng

pháp xét nghiệm khẳng định nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã đƣợc phát

triển dựa trên các phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng phổ biến nhƣ là RT-PCR,

realtime RT-PCR, phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu, phân lập vi rút, giải

trình tự chuỗi nucleotide…

1.3.1. Phân lập vi rút.

Phân lập vi rút đƣợc xác định là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán

nhiễm vi rút cúm. Vi rút phân lập trong vụ dịch đƣợc sử dụng để nghiên cứu

về các đặc điểm sinh học, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên, thông

qua các thông tin đó cho phép dự báo đƣợc sự lƣu hành của vi rút cúm trong

giai đoạn tiếp theo và góp phần để lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng

năm. Đối vi rút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B…) việc phân lập vi rút

đƣợc tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2. Đối với vi rút cúm

gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2…) là vi rút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân

loại của TCYTTG) nên việc phân lập vi rút yêu cầu đƣợc tiến hành trong

phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3. Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập

đƣợc TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà có phôi đạt tiêu chuẩn

(Specific Pathogenic Free – SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thận

chó thƣờng trực (Mardin- Darby Canine Kidney cells – MDCK).

Nguyên lý: Vi rút cúm có thể hồi phục và khuếch đại trên tế bào cảm

nhiễm và trứng gà có phôi, trong điều kiện nuôi cấy phù hợp, vì vậy phải đảm

bảo về yêu cầu an toàn sinh học

* Phân lập vi rút trên trứng: Vi rút cúm đƣợc phân lập đầu tiên trên

trứng gà năm 1936. Sau khi cấy vi rút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng đƣợc ủ ở 330C trong vòng 48h. Dịch niệu hoặc dịch ối thu đƣợc sau khi gặt

trứng đƣợc kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu gà 0,5%

hoặc hồng cầu ngựa 1% [20]. Một số vi rút cúm A có thể phân lập trực tiếp

bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhƣng có những chủng vi rút cúm A

phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà.

Vi rút cúm A/H5N1 thƣờng gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh

phẩm.

* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK [85]: Vi rút cúm có thể nhân lên

trên các dòng tế bào tiên phát nhƣ tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê

hoặc trên dòng tế bào thƣờng trực nhƣ MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào

thích hợp nhất để phân lập vi rút cúm trên ngƣời. Khi phân lập vi rút trên các

dòng tế bào thƣờng trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hƣởng tới sự phân tách

phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập

của vi rút vào tế bào cảm thụ. Tuy nhiên, đối với các dòng tế bào tiên phát thì

protease là yếu tố nội sinh, vì vậy vi rút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà

không cần phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy.

Ưu điểm: Phân lập và nuôi cấy vi rút cho phép đánh giá đƣợc đặc điểm

vi rút học, đặc tính kháng nguyên, khả năng tiềm tàng của sự biến chủng vi

rút. Phân lập vi rút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân

lập đƣợc một số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tùy theo mục đích

nghiên cứu để lựa chọn phƣơng pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa

chọn tối ƣu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng

khuếch đại một lƣợng lớn vi rút với hiệu giá cao và vắc xin cúm hiện tại đang

đƣợc sản xuất trên trứng gà có phôi [48], [86]. Tuy nhiên, việc sản xuất vắc

xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang đƣợc nghiên cứu [13], [64].

Nhược điểm: Tỉ lệ phân lập phụ thuộc nhiều chất lƣợng bệnh phẩm, thời

gian lấy mẫu, bảo quản và môi trƣờng nuôi cấy.

Vi rút sau khi phân lập đƣợc định týp (xác định đặc tính kháng nguyên)

bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu

1.3.2. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền

Quy trình xét nghiệm nhiễm vi rút A(H1N1)pdm09 dựa trên xét nghiệm

phát hiện vật liệu di truyền bằng phƣơng pháp sinh học phân tử là phản ứng

chuỗi polymerase (PCR) hoặc phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực

(realtime RT-PCR). Qui trình xét nghiệm này đƣợc áp dụng cho việc xác định

cúm B, cúm A và các phân týp cúm A trong mẫu bệnh phẩm hoặc dịch nuôi

cấy. Hiện nay, PCR đã trở thành một công cụ đƣợc ứng dụng rộng rãi trong

các lĩnh vực của y sinh học. Các quy trình RT- PCR hoặc realtime RT-PCR

chẩn đoán nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát triển bởi các PTN

chuẩn thức của TCYTTG: CDC, Atlanta; NIID, Nhật bản; VIIRL, Australia

và đƣợc giới thiệu trong “Hƣớng dẫn chẩn đoán nhiễm vi rút cúm

A(H1N1)pdm09” của TCYYTG [16].

1.3.2.1 Phản ứng di truyền phân tử (RT-PCR)

Nguyên lý: Phản ứng sao chép ngƣợc chuỗi polymerase RT-PCR

(Reverse transcriptase - Polymerase Chain Reaction) đã đƣợc áp dụng và phát

triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN. Phƣơng pháp này

có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút, thông qua xác định vật liệu di

truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm

trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Ưu điểm: Là phƣơng pháp nhanh nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác

khi đƣợc kiểm soát tốt.

Nhược điểm: Phƣơng pháp RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm

với giá thành tƣơng đối cao và cần kỹ thuật thực hiện thành thạo, hơn nữa, các

dụng cụ và nơi thực hiện xét nghiệm phải tách biệt theo từng giai đoạn của

phản ứng RT-PCR để tránh nhiễm chéo tạo dƣơng tính giả.

Cho tới nay, RT-PCR vẫn đƣợc coi là phƣơng pháp tối ƣu để phát hiện

vi rút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để

khẳng định các trƣờng hợp nhiễm cúm theo qui định của TCYTTG.

Trong trƣờng hợp kết quả của phƣơng pháp RT-PCR không cho kết quả

rõ ràng hoặc trong trƣờng hợp cần khẳng định chính xác kết quả, PTN sẽ xét

nghiệm bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR.

1.3.2.2 Phương pháp Real time RT-PCR

Nguyên lý: Khác với RT-PCR thông thƣờng, phƣơng pháp này sử dụng

một mẫu dò phát huỳnh quang (probe) có khả năng phát hiện sản phẩm PCR

đặc hiệu trong quá trình tổng hợp sản phẩm. Real time RT-PCR sử dụng cặp

mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang

(SYBR Green I, molecular beacon, hybridization probe và Taqman probe)

cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm

lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [44], [54], [70]. Phƣơng pháp Real

time RT-PCR đƣợc ứng dụng để định lƣợng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút

gây bệnh nhƣ vi rút cúm, viêm gan…[37], [38]. Phƣơng pháp Real time RT-

PCR không cần điện di sản phẩm nhƣ phƣơng pháp RT-PCR thông thƣờng

nên phƣơng pháp Real time RT-PCR đƣợc mô tả nhƣ một hệ thống “đóng”.

Ưu điểm: Phƣơng pháp này rất đặc hiệu và có độ tin cậy cao. Phƣơng

pháp nhanh, nhạy, có độ chính xác giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.

Nhược điểm: Phƣơng pháp Real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và

sinh phẩm với giá thành tƣơng đối cao. Do phƣơng pháp có độ nhạy cao nên

cần có kỹ năng thao tác chuẩn xác, tránh nhiễm chéo trong quá trình thực

hiện.

Nếu trong trƣờng hợp phƣơng pháp Realtime RT- PCR vẫn cho kết quả

không rõ thì mẫu bệnh phẩm này sẽ đƣợc lặp lại từ bƣớc tách chiết mẫu và có

thể chạy song song hai phƣơng pháp RT-PCR và Realtime PCR; hoặc PTN có

thể yêu cầu lấy lại bệnh phẩm và xét nghiệm theo thƣờng quy của phòng từ

bƣớc nhận bệnh phẩm.

1.3.2.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã

ngược (RT-LAMP)

Nguyên lý: Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng

phiên mã ngƣợc RT-LAMP (Reverse transcriptase - Loop - mediated

isothermal amplification) là một phƣơng pháp mới để khuếch đại ADN trong

điều kiện đẳng nhiệt, do đó loại bỏ đƣợc sự thay đổi các chu kỳ nhiệt trong

phƣơng pháp RT-PCR thông thƣờng. Phản ứng khuếch đại ADN thực hiện tại 630C trong 60 phút và cố định sản phẩm tại 800C trong 2 phút trong hệ thống

máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto – Nhật Bản). Vì vậy, thời gian tiến

hành phản ứng sẽ đƣợc rút ngắn [78], [83]. Trong một phản ứng đã sử dụng 6

loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng

độ nhạy của phản ứng.

Ưu điểm: Phƣơng pháp này có thể phát hiện vi rút cúm trong giai đoạn

sớm của bệnh, đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian ngắn (30 phút - 1 giờ)

là có thể có kết quả.

Nhược điểm: Độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp này cần đƣợc

đánh giá thông qua một số lƣợng lớn mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm.

Hiện nay, phƣơng pháp này cũng đang đƣợc phát triển để chẩn đoán

nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do vi rút nhƣ vi rút SARS-CoV, vi rút

viêm gan B, vi rút viêm não Nhật Bản [99].

1.3.2.4 Phương pháp xác định trình tự gen (Sanger sequence)

Hiện nay, các phƣơng pháp xác định trình tự gen đƣợc thực hiện trên

ADN sợi đơn

máy phân tích trình tự chuỗi tự động nhƣ

Thành phần:

ABI PRISM 3100 - Avant, Bechman

DNA polymerase I

Counter (Mỹ).

dATP

dGTP

Nguyên lý: Sự xuất hiện của các

dCTP

dideoxynucleotide (các nucleotide mất

ddATP

ddGTP

gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và đƣợc thay

ddTCP

bằng -H, đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang

đ ddTTP

với các màu khác nhau) trong quá trình

Đoạn ADN lớn

đCTP

tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần

Trình

tự

Trong qua trình điện

giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra

của mẫu

di, đầu đọc laser sẽ

những đoạn ADN có độ dài khác nhau.

ban đầu sẽ

thu đƣợc tín hiệu

là

của các ddNTP

Những đoạn ADN này đƣợc điện di qua

mao quản từ nhỏ đến lớn và các

Đoạn ADN nhỏ

dideoxynucleotide đƣợc phát hiện bởi

đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu

chính là trình tự bổ sung các

Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen dideoxynucleotide đƣợc phát hiện bởi

Hình 1

đầu đọc laser.

Phản ứng dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Sanger có sử dụng các

dideoxynucleotide. Mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng một chất

huỳnh quang có màu khác nhau.

Ưu điểm: Phƣơng pháp xác định trình tự gen xác định đặc điểm di truyền

học, xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của vi rút cúm,

từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến

khả năng tăng độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút cũng

nhƣ phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm

mới và các chủng vi rút cúm đang lƣu hành.

Nhược điểm: Phƣơng pháp xác định trình tự gen (Sequence) yêu cầu

trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành rất cao.

Phƣơng pháp giải trình tự nucleotide cũng đƣợc áp dụng rộng rãi trong

nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã giúp phát hiện sự

thay đổi trong cấu trúc di truyền có thể gây ảnh hƣởng tới khả năng gây bệnh

của vi rút cúm, quy trình cũng đƣợc TCYTTG hƣớng dẫn [108].

1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng thể

Đó là phƣơng pháp phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm trong huyết

thanh bệnh nhân. Có 3 phƣơng pháp cơ bản đƣợc sử dụng là phản ứng ngăn

ngƣng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) và

phản ứng trung hoà vi lƣợng (MN). Kết quả đƣợc xác định dựa vào việc phát

hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động

kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI). Chẩn đoán huyết

thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trƣờng

hợp lâm sàng. Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu nhƣ việc

phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của vi rút không đạt kết quả

do chất lƣợng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác.

1.3.3.1 Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Haemagglutin Inhibition - HI)

Phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) đƣợc Hirst GK phát hiện năm

1942 [52].

Nguyên lý: của phản ứng là kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm

(antiheamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3,

A/H5, B…) có khả năng ức chế ngƣng kết hồng cầu. Hồng cầu chuột lang

0,75% hoặc hồng cầu gà tây 0,5% đƣợc sử dụng trong phản ứng HI để phát

hiện kháng thể kháng vi rút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% đƣợc sử dụng để

phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm A/H5N1 [21].

Ưu điểm: Phản ứng HI tƣơng đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để

phát hiện sự lƣu hành của kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm với một số

lƣợng mẫu lớn. Phần lớn kháng thể kháng HA đều đƣợc phát hiện bằng phản

ứng HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân týp đối với chẩn đoán huyết

thanh học cúm.

Nhược điểm: Phản ứng HI chỉ có giá trị trong chẩn đoán cúm khi có mẫu

huyết thanh kép để xác định đƣợc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần)

giữa 2 mẫu huyết thanh. Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chẩn

đoán. Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ

nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lƣợng [100].

1.3.3.2 Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization Assay - MN).

Phản ứng trung hòa vi lƣợng – ELISA đƣợc Harmon và cộng sự phát

triển năm 1988 [48].

Nguyên lý: Sử dụng kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu nucleoprotein

(NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm vi rút

cúm. Sử dụng phƣơng pháp Reed & Muench để tính giá trị liều gây nhiễm

50% trên tế bào (TCID50) [27].

Ưu điểm: Phản ứng trung hòa vi lƣợng là một phản ứng nhạy và đặc

hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm và kháng thể

kháng các phân týp vi rút cúm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát

hiện đƣợc. Phản ứng này dễ tiến hành vì không cần kháng nguyên tinh khiết.

Nhược điểm: Phƣơng pháp phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo

dài (2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với vi rút sống, đặc biệt là vi rút cúm

A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh

học cấp độ 3.

1.4. Vắc xin

Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam, ngày càng xuất hiện

nhiều bệnh truyền nhiễm mới nổi, tác nhân gây bệnh chƣa đƣợc biết đến trƣớc

đó, gây ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng nhƣ bệnh Viêm đƣờng hô hấp cấp

nguy hiểm (SARS-CoV), 2003; vi rút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1,

2004-2013; bệnh Tay Chân Miệng do vi rút đƣờng ruột EV71; vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 (2009); vi rút Corona mới - MERS - CoV (9/2012) và gần

đây nhất là vi rút cúm A/H7N9 lây từ gia cầm sang ngƣời tại Trung Quốc

(4/2013). Bên cạnh đó, cũng xuất hiện bệnh lây truyền từ động vật sang ngƣời

khác đƣợc xác định do căn nguyên vi rút đƣợc kể đến (zoonosis diseases): vi

rút Nipah, vi rút Hantaan, vi rút dại. Ngoài ra, các bệnh truyền nhiễm đã biết

dƣới ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng, xã hội, kinh tế lại tái nổi trội và

ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe cộng đồng: dịch tả xảy ra tại Hà Nội (2007), dịch

thủy đậu, quai bị có xu hƣớng tăng trong những năm gần đây. Một trong

những bệnh truyền nhiễm diễn biến phức tạp tại Việt Nam trong thập kỷ qua

và đã làm tăng quan ngại về khả năng bùng phát thành những dịch lớn trong

phạm vi toàn quốc và có khả năng lan rộng trên thế giới đó là nhiễm vi rút

cúm gia cầm A/H5N1, A/H7N9.

Vắc xin là biện pháp dự phòng cơ bản và hiệu quả nhất trong phòng

chống bệnh truyền nhiễm, hiệu quả phòng bệnh của vắc xin đã đƣợc chứng

minh đƣợc ghi nhận khi một số bệnh truyền nhiễm đƣợc thanh toán: bệnh đậu

mùa (năm1979 – thanh toán trên phạm vi toàn cầu), bệnh bại liệt (năm 2000 –

tại Việt Nam) hoặc làm giảm đáng kể số mắc bệnh, giảm gánh nặng cho công

tác điều trị. Vắc xin phòng chống cúm là một loại vắc xin thƣờng niên và đặc

hiệu để bảo vệ chống lại tác động của sự biến đổi mạnh vi rút cúm hàng năm.

Trong 16/19 năm nghiên cứu (1988-2007), các chủng vắc xin cúm có khả

năng tạo kháng thể bảo vệ tốt với các chủng đang lƣu hành hoặc vẫn có khả

năng bảo vệ chéo với các chủng lƣu hành không phù hợp với chủng có trong

thành phần vắc xin [102].

1.4.1. Các loại vắc xin cúm

1.4.1.1 Vắc xin cúm bất hoạt (inactivated influenza vi rút vaccine –IVV)

Vắc xin cúm bất hoạt là thế hệ vắc xin cúm đầu tiên sử dụng để bảo vệ

nhiễm vi rút cúm từ những năm 1940 và vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi hiện tại.

Các sản phẩm vắc xin sau đó đƣợc phát triển bao gồm:

 Vắc xin vi rút toàn phần.

Sử dụng hạt vi rút nguyên vẹn đƣợc bất hoạt bằng formadehyde hoặc ß-

propiolactone. Do sử dụng hạt vi rút nguyên vẹn nên các yếu tố gây dị ứng-

phản ứng phụ chƣa đƣợc loại bỏ, hiện tại vắc xin sử dụng hạt vi rút toàn phần

không còn sản xuất.

 Vắc xin hạt vi rút vỡ (split vaccin).

Vi rút sau khi tinh khiết đƣợc sử lý bằng chất tẩy hoặc dung môi nhƣ

diethyl ether, tween 80, triton X100 và ammonium deoxycholate để phá vỡ

màng lipit. Một số quy trình tiếp tục các bƣớc loại bỏ chất bằng cách siêu ly

tâm, phân tách phase, thẩm tích.

 Vắc xin tiểu đơn vị hoặc kháng nguyên bề mặt HA và NA (subunit hoặc

surface vaccin).

Quy trình sản xuất sử dụng chất tẩy nhƣ SDS, triton N10, enzyme

bromelain để phân tách hai thành phần kháng nguyên HA và NA. Vi rút tinh

khiết bằng siêu ly tâm phân vùng trong sucrose đƣợc tiếp tục chạy qua lớp

gradient sucrose khác có chứa triton N101 để phân tách HA và NA. Các sản

phẩm vắc xin tiểu đơn vị đang lƣu hành hiện tại bao gồm Agripal (Novartis),

Influvac (Solvay), Fluad (Novartis), MF59 adjuvanted.

1.4.1.2 Vắc xin cúm sống giảm độc lực (Live attenuated influenza vi rút - LAIV):

Là loại vắc xin sử dụng vi rút cúm sống gây miễn dịch bằng phun sƣơng

“spray” qua đƣờng mũi. Vi rút cúm đƣợc sử dụng trong vắc xin cũng đƣợc

khuếch đại và thu thập trên trứng gà có phôi nhƣ sản xuất vắc xin cúm bất

hoạt. Vi rút cúm đƣợc làm giảm độc lực thông qua cấy truyền nhiều lần trên trứng gà có phôi và nuôi cấy trong điều kiện lạnh (250C). Vắc xin cúm sống

giảm độc lực không có sự đa dạng về sản phẩm, hiện tại chỉ lƣu hành vắc xin

Flumist (MedImmune.Mỹ) trên thị trƣờng Mỹ và Canada, Fluenza trên thị

trƣờng Châu Âu và LAIV của Nga.

1.4.1.3 Các loại vắc xin cúm đang lưu hành trên thị trường

 Vắc xin cúm mùa

Sản phẩm vắc xin cúm mùa đa dạng, phổ biến là vắc xin tam liên trong

đó thành phần vắc xin cúm có 3 loại vi rút (H1N1, H3N2, B/Yamagata hoặc

B/Victoria). Ngoài ra, vắc xin vi rút sống giảm độc lực (LAIV) gồm 4 thành

phần vi rút (H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria) - Quadrivalent

Influenza Vắc xin/QIV với tên thƣơng phẩm FluMist Quadrivalent của công

ty MedImmune, LLC (Hoa Kỳ) là vắc xin gồm 4 chủng vi rút cúm đầu tiên

trên thế giới đã đƣợc Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chấp thuận sử

dụng cho lứa tuổi từ 2-49 tuổi [103]. Hiện nay, các công ty nhƣ Sanofi

Pasteur, GlaxoSmithKline (GSK) và Novartis cũng đang nỗ lực phát triển vắc

xin cúm QIV - bất hoạt. Gần đây nhất, 11/12/2013, vắc xin FluLaval

Quadrivalent của công ty GlaxoSmithKline cũng đã đƣợc Cục Quản lý thuốc

và thực phẩm Hoa Kỳ chấp thuận sử dụng cho nhóm từ 3 tuổi trở lên. Năm

2013, Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC-Nha Trang) bắt đầu nghiên cứu

sản xuất vắc xin cúm với 3 chủng A/H1N1, A/H3N2 và B. Hiện tại vắc xin

cúm mùa đang lƣu hành có thành phần bao gồm các vi rút :

- A(H1N1)pdm09

- A/H3N2

- B (Yamagata hoặc Victoria)

 Vắc xin cúm A/H5N1

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều loại vắc xin cúm A/H5N1 cho ngƣời

của các hãng Sanofi Pasteur – Pháp, Novartis - Thụy Sĩ, GlaxoSmithKline –

Anh, Sinovac – Trung Quốc, Baxter – Mỹ… đã đƣợc cấp giấy phép lƣu hành

[24], [39], [40], [60]. Các loại vắc xin này đều là vắc xin cúm bất hoạt, toàn

bộ hạt vi rút (Sinovac – Trung Quốc, Baxter – Mỹ); bất hoạt, kháng nguyên

bề mặt (Novartis - Thụy Sĩ); bất hoạt, tách rời toàn bộ hạt vi rút

(GlaxoSmithKline - GSK). Vắc xin cúm A/H5N1 sẽ là vắc xin đơn giá, chƣa

có nghiên cứu nào về khả năng phối hợp giữa vắc xin cúm gia cầm (A/H5N1)

và vắc xin cúm mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B). Cùng với việc phát triển vắc

xin cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát (PMKc của Vabiotech), tại

Viện Pasteur Hồ Chí Minh cũng đã nghiên cứu, thích ứng và sản xuất vắc xin

cúm A/H5N1 trên tế bào động vật có vú (Vero cell). Đây cũng là xu hƣớng

chung của các công ty sản xuất vắc xin trên thế giới nhằm cải thiện công nghệ

cũng nhƣ rút ngắn thời gian sản xuất, đáp ứng kịp thời dịch/đại dịch.

 Vắc xin cúm A(H1N1)pdm09

Sự xuất hiện của vi rút cúm A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn, tại khu vực

Bắc Mỹ vào tháng 3/2009 và là nguyên nhân của đại dịch cúm năm 2009 đã

không đƣợc dự đoán trƣớc thông qua các chƣơng trình giám sát cúm thông

thƣờng. Ngay sau khi xuất hiện đại dịch, rất nhiều các công ty sản xuất vắc

xin ở nhiều quốc gia đã tiến hành nghiên cứu và phát triển vắc xin phòng

chống đại dịch. Dịch cúm A(H1N1)pdm09 là đại dịch cúm đầu tiên trong lịch

sử mà biện pháp khống chế dịch bằng vắc xin đƣợc áp dụng ngay trong giai

đoạn đại dịch hay trong làn sóng dịch đầu tiên [67].

Vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 đầu tiên (IDCDC-

RG15) đƣợc TCYTTG thông báo vào ngày 27/5/2009 phát triển tại PTN

chuẩn thức CDC- Atlanta, Mỹ, đó là một vi rút đƣợc tạo bằng công nghệ di

truyền ngƣợc (reverse genetic-RG) từ vi rút A/Texas/5/2009. Tiếp theo đó, rất

nhiều RG vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin A(H1N1)pdm09 đƣợc cung

cấp từ các PTN chuẩn thức của TCYTTG (CDC Atlanta, Mỹ; NIBSC Anh,

NIID, Nhật bản, VIDRL, Australia…) [107].

Sau đó, tháng 10/2009 vi rút cúm A/California/07/09 đƣợc giới thiệu là

vi rút dự tuyển cho sản xuất vắc xin cúm theo công nghệ vắc xin bất hoạt

thông dụng và các sinh phẩm kiểm chuẩn (kháng huyết thanh chuẩn) đƣợc

cung cấp tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG cho các công ty, viện vắc xin

đƣợc sẵn sàng vào tháng 11/2009. Vắc xin phòng chống vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 đầu tiên đƣợc sản xuất là vắc xin bất hoạt, không tá chất,

mảnh vi rút (split vi rút), đơn giá (monovalent vaccine) đƣợc phát triển từ các

vi rút tích hợp (reassortant virus) theo công nghệ di truyền ngƣợc. Công ty đi

đầu trong phát triển vắc xin đơn giá là CSL Biotherapies (Parkwill-Australia)

và đƣợc tiến hành thử nghiệm lâm sàng vào tháng 7/2009 tại Australia trên

240 ngƣời tình nguyện ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy hiệu quả miễn dịch của

vắc xin đạt > 95% trên đối tƣợng ngƣời lớn với liều đơn và các kết quả này đã

gợi ý kế hoạch phát triển vắc xin phòng đại dịch đặc biệt trong giai đọan dịch

lan tràn chƣa rộng [45].

Đến thời điểm ngày 1/10/ 2009 đã có 11 chủng vi rút dự tuyển cho phát

triển vắc xin phòng chống cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc cung cấp bởi mạng lƣới

giám sát cúm toàn cầu của TCYTTG và vi rút cúm A/California/7/09

(H1N1pdm-like) đã đƣợc giới thiệu là vi rút dự tuyển cho thành phần vắc xin

cúm mùa cho khu vực Nam bán cầu năm 2012. Hiện tại vi rút

A/California/07/09 (H1N1pdm-like) vẫn tiếp tục là một thành phần của vắc

xin cúm mùa tam liên (trivalent vaccine) sử dụng rộng rãi trên toàn cầu [65].

 Vắc xin H7N9

Sinovac bắt đầu phát triển vắc xin H7N9 vào đầu năm 2013, khi các

trƣờng hợp nhiễm H7N9 liên tục đƣợc báo cáo ở Trung Quốc. Chủng đƣợc sử

dụng để sản xuất vắc xin là chủng A/H7N9 từ TCYTTG (5/2013). Vắc xin

này hoàn thành giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng. Ngày 29/1/2014 -

Sinovac Biotech Ltd (Nasdaq: SVA) đã đệ trình thử nghiệm lâm sàng vắc xin

cúm A/H7N9 với Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Trung Quốc

(CFDA) để bắt đầu thử nghiệm trên ngƣời cho vắc xin cúm A/H7N9 [92]. Tại

Việt Nam, với quy trình lõi này, IVAC cũng đã sản xuất thành công vắc xin

cúm A/H5N1 (tháng 8/2012), đang tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng. Với

quy trình ổn định, tháng 6/2013, IVAC cũng đã phát triển thử nghiệm vắc xin

cúm A/H7N9 với chủng vi rút chuẩn nhận đƣợc từ TCYTTG.

1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm

Kháng thể kháng vi rút cúm đƣợc xác định bằng thử nghiệm ngăn ngƣng

kết hồng cầu (HI) và kháng thể bảo vệ đƣợc xác định khi hiệu giá kháng thể

HI ≥1:40. Miễn dịch dƣờng nhƣ không kéo dài suốt đời mà nó là kết quả của

một việc nhiễm cúm trên thực tế. Một nghiên cứu năm 2008, đƣợc công bố

trên tạp chí Nature, cho thấy rằng 90 năm sau khi đại dịch năm 1918, những

ngƣời sống sót có các tế bào sản xuất kháng thể có khả năng ngăn chặn khi

thử nghiệm lây nhiễm vi rút cúm năm 1918 ở chuột. Điều này chứng minh

rằng ngay cả chín thập kỷ sau khi bị nhiễm vi rút này, những ngƣời sống từ

giai đoạn đó đến nay vẫn có khả năng miễn dịch đối với vi rút năm 1918 [91].

Đối với khả năng miễn dịch lâu dài của tiêm chủng, một nghiên cứu năm

2010 đã cho thấy đáp ứng miễn dịch với chủng A(H1N1)pdm09 đƣợc tăng lên

một cách đáng kể khi những ngƣời tham gia đã đƣợc tiêm vắc xin cúm tại

dịch cúm lợn hơn 30 năm trƣớc (1976) [75].

1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch

Các phản ứng phụ thông thƣờng đƣợc ghi nhận cho tất cả các loại vắc

xin đó là: biểu hiện giống bệnh cúm (ILI) có tỷ lệ 5% - 10%, hoặc biểu hiện

tác dụng phụ nhẹ: đau đầu, ngạt mũi, sốt nhẹ, đau họng, chuột rút xuất hiện 1

ngày sau khi chủng ngừa và xuất hiện trong một thời gian ngắn (1-3 ngày).

Phần lớn các tác dụng phụ xảy ra ở trẻ em (chƣa đƣợc phơi nhiễm với vi

rút cúm), tuy nhiên cũng gặp ở một số ngƣời lớn. Có một tỷ lệ < 30% biểu

hiện đau, sƣng đỏ tại chỗ sau khi tiêm. Phản ứng dị ứng rất hiếm gặp, đối với

những ngƣời cơ địa dị ứng không nên sử dụng vắc xin loại phun sƣơng mũi

hoặc tiêm bắp, đối tƣợng này nên sử dụng tiêm dƣới da, với lƣợng vắc xin

khoảng 40% thông thƣờng và sử dụng kim tiêm mũi nhỏ.

1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin

Vi rút cúm có nhiều phân týp khác nhau với hệ vật chủ đa dạng: ngƣời,

gia cầm, gia súc, chim hoang dã…, tuy nhiên chỉ có một số phân týp vi rút

cúm đƣợc ghi nhận gây dịch bệnh phổ biến cho ngƣời nhƣ A/H1N1, A/H3N2

và B. Cho dù số phân týp lƣu hành và gây bệnh cho ngƣời rất hạn chế nhƣng

con ngƣời vẫn tiếp tục nhiễm bệnh nhiều lần trong suốt cuộc đời, nguyên

nhân của hiện tƣợng này là do 8 phân đoạn gen trong cấu trúc hệ gen của vi

rút cúm thƣờng xuyên xuất hiện đột biến thông qua cơ chế “trôi” và “trƣợt”

kháng nguyên trong quá trình nhân lên, tiến hóa của vi rút cúm. Do vậy, mỗi

năm vắc xin cúm mùa đều phải cập nhật để thành phần vi rút trong vắc xin

tƣơng thích với vi rút cúm lƣu hành và gây bệnh trên phạm vi toàn cầu. Lý do

chính là do miễn dịch tạo ra do vi rút vắc xin trong năm trƣớc có thể sẽ không

thể bảo vệ chống lại vi rút đang lƣu hành có sự thay đổi trong hệ gen. Ngoài

ra, kháng thể tạo ra do vắc xin trong cơ thể sẽ giảm theo thời gian và mức độ

kháng thể thƣờng thấp sau một năm tiêm chủng [79], [97], [126].

Theo khuyến cáo hàng năm của TCYTTG về chủng vi rút cúm dự tuyển

cho thành phần vắc xin cúm cho mùa dịch sắp tới tại khu vực Bắc bán cầu

hoặc Nam bán cầu, các công ty sản xuất vắc xin sẽ nhận đƣợc các thông tin về

đặc điểm vi rút cúm lƣu hành thu thập từ các giám sát cúm gần nhất và các

thông tin về các sinh phẩm liên quan để đánh giá chất lƣợng vắc xin tại các

PTN chuẩn thức của TCYTTG. Quá trình bắt đầu sản xuất đến khi lƣu hành

vắc xin cúm sẽ đƣợc thực hiện trong 6 tháng (tháng 3 đến tháng 9 hàng năm

cho khu vực Bắc bán cầu, tháng 9 đến tháng 3 năm sau cho khu vực Nam bán

cầu) [9], [79], [125].

Hiện nay, sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng địa lý trong hoạt động giám

sát, sự phát triển của những kỹ thuật hiện đại trong phân tích đặc điểm của vi

rút cúm cũng nhƣ sự xuất hiện của các vi rút cúm gia cầm có khả năng gây

bệnh cho ngƣời (A/H5N1; A/H7N9; A/H9N2; A/H10N8), công tác lựa chọn

vi rút cúm dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm mùa hoặc chuẩn bị vắc xin

đại dịch yêu cầu có sự phát triển và hoàn thiện nhằm đảm bảo các chủng vi

rút cúm dự tuyển sản xuất vắc xin có sự tƣơng đồng cao nhất với các vi rút

cúm sẽ lƣu hành trong các mùa dịch tiếp theo [46], [84], [89], [93]. Đây là

một hoạt động cần có sự phối hợp toàn cầu và các trung tâm cúm quốc gia

(NIC) tại các quốc gia và vùng lãnh thổ là các cơ sở cơ bản. Hai trung tâm

cúm quốc gia của Việt Nam (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng và Viện

Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) là thành viên của mạng lƣới này [82].

Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển

Toàn bộ các quy trình sản xuất, kiểm soát, kiểm định chất lƣợng vắc xin

đều sử dụng quy trình chuẩn (SOP) của TCYTTG và đƣợc cập nhật, đánh giá

hàng năm. Kế thừa kinh nghiệm từ đại dịch cúm A(H1N1)pdm09, sự tiếp tục

gây bệnh và ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng của vi rút cúm A/H5N1 và

các vi rút cúm có nguồn gốc từ động vật khác nhƣ A/H7N9 đã yêu cầu duy trì

giám sát vi rút cúm trên động vật và củng cố các hoạt động giám sát lồng

ghép giữa các cơ quan y tế và thú y. Hiện tại sự phối hợp của TCYTTG, tổ

chức nông lâm thế giới (FAO) và tổ chức thú y thế giới (OIE) đã xây dựng

các bản thỏa thuận hợp tác để có thể cung cấp các thông tin cập nhật về cúm

động vật giúp nâng cao chất lƣợng trong lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển

hàng năm [7].

CHƯƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 thu thập tại Miền Bắc, miền

Trung và Tây Nguyên đƣợc phân lập tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện Vệ

sinh Dịch tễ Trung ƣơng trong giai đoạn 2009-2013 từ các nguồn sau:

- Đề tài cấp nhà nƣớc năm 2009 đến năm 2011: Chủng vi rút phân lập từ các

bệnh nhân có hội chứng cúm (HCC) định nghĩa theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế (sốt trên 380C, ho và/hoặc đau họng).

- Chƣơng trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009-2011và chƣơng trình

giám sát cúm quốc gia phối hợp với Cơ quan phòng chống bệnh tật Mỹ

(CDC-US) giai đoạn 2006-2012 với tiêu chuẩn: Chủng vi rút phân lập từ bệnh nhân có hội chứng cúm (sốt trên 380C, ho và/hoặc đau họng và không

có chẩn đoán nào khác).

2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09

Chủng cúm A(H1N1)pdm09 phân lập đƣợc tại 3 miền Bắc, miền Trung

và Tây Nguyên từ 2009 đến 2013 đạt hiệu giá HA ≥ 8 sau 72-96 giờ khuếch

đại trên tế bào MDCK.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả và tiến cứu.

2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Sự phân bố các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên

cứu

Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm thu thập Số chủng

Năm Miền Bắc Miền Trung Tây Nguyên vi rút

2009 6 4 4 14

2010 14 5 0 19

2011 2 2 3 7

2012 2 1 1 4

2013 24 5 2 31

48 17 10 Tổng 75

2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu

 Cỡ mẫu trong nghiên cứu đƣợc xác định là 75 chủng đƣợc thu thập trong

thời gian nghiên cứu theo tiêu chuẩn lựa chọn chủng.

 Các chủng đƣợc lựa chọn để đảm bảo tính đại diện cho vụ dịch theo địa

điểm và thời gian xảy ra dịch

2.2.4. Các biến số nghiên cứu

 Đặc điểm di truyền học

- Phân lập, khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

- Giải trình tự chuỗi nucleotide của các gen HA, NA, M, PB1, PB2 và NS1

vi rút cúm A(H1N1)pdm09.

- Xác định đột biến trên gen HA, NA, M và PB2 liên quan đến khả năng tăng

độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút.

 Đặc tính kháng nguyên

- Phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI).

 Lựa chọn đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin.

2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm

(Các kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện VSDTTƯ)

Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc sử dụng trong

nghiên cứu đƣợc thu thập theo sơ đồ sau:

Dịch họng/dịch phế quản (+) Dịch họng/dịch phế quản (+) Dịch họng/dịch phế quản (+) Dịch họng/dịch phế quản (+) A(H1N1)pdm09 bằng RT-PCR A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR

Gây nhiễm trên tế bào MDCK Gây nhiễm trên tế bào MDCK Gây nhiễm trên tế bào MDCK Gây nhiễm trên tế bào MDCK

Sau 42 – 72h khuếch đại Sau 42 – 72h khuếch đại Sau 42 – 72h khuếch đại Sau 42 – 72h khuếch đại

Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Hiệu giá NKHC HA ≥ 8

Lựa chọn chủng Lựa chọn chủng Lựa chọn chủng Lựa chọn chủng

vắc xin dự tuyển vắc xin dự tuyển vắc xin dự tuyển vắc xin dự tuyển

Hiệu giá KN Hiệu giá KN Hiệu giá KN Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC (Phản ứng NNKHC (Phản ứng NNKHC (Phản ứng NNKHC - HI) - HI) - HI) - HI)

Thu thập, lựa chọn chủng Thu thập, lựa chọn chủng Thu thập, lựa chọn chủng Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) (75 chủng) (75 chủng) (75 chủng)

Giải trình tự chuỗi Giải trình tự chuỗi Giải trình tự chuỗi Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 Nucleotide của 6 Nucleotide của 6 Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, gen HA, NA, PB1, gen HA, NA, PB1, gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M PB2, NS và M PB2, NS và M PB2, NS và M

Đề xuất chủng vi rút Đề xuất chủng vi rút Đề xuất chủng vi rút Đề xuất chủng vi rút

Xác định đặc tính Xác định đặc tính Xác định đặc tính Xác định đặc tính

dự tuyển cho vắc xin dự tuyển cho vắc xin dự tuyển cho vắc xin dự tuyển cho vắc xin

kháng nguyên của kháng nguyên của kháng nguyên của kháng nguyên của

cúm A(H1N1)pdm09 cúm A(H1N1)pdm09 cúm A(H1N1)pdm09 cúm A(H1N1)pdm09

các chủng vi rút cúm các chủng vi rút cúm các chủng vi rút cúm các chủng vi rút cúm

tại Việt Nam tại Việt Nam tại Việt Nam tại Việt Nam

A(H1N1)pdm09. A(H1N1)pdm09. A(H1N1)pdm09. A(H1N1)pdm09.

Mục tiêu 1: Mục tiêu 1: Mục tiêu 1: Mục tiêu 1: Mục tiêu 3: Mục tiêu 3: Mục tiêu 3: Mục tiêu 3: Mục tiêu 2: Mục tiêu 2: Mục tiêu 2: Mục tiêu 2:

2013. 2013. 2013.

2009 – 2013.

Phân tích đặc điểm di Phân tích đặc điểm di Phân tích đặc điểm di Phân tích đặc điểm di truyền học của các truyền học của các truyền học của các truyền học của các chủng vi rút cúm chủng vi rút cúm chủng vi rút cúm chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 A(H1N1)pdm09 lƣu A(H1N1)pdm09 lƣu A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam lƣu hành tại hành tại Việt Nam hành tại Việt Nam Việt Nam giai đoạn giai đoạn 2009 – giai đoạn 2009 – giai đoạn 2009 –

2.2.5.1 Phân lập, khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

Sau khi xác định bệnh phẩm nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phƣơng

pháp RT-PCR hoặc real time RT-PCR. (Xem phần phụ lục)

 Phân lập vi rút:

 Sinh phẩm cho phƣơng pháp phân lập vi rút

Sinh phẩm Xuất xứ

Tế bào thận chó MDCK CDC (Madin-Darby Canine Kidney)

Chai nuôi cấy tế bào T-25 Corning Cat.No. 430720

Dulbecco’s Modified Eagle GIBCO Cat.No. 11965-092 Medium (D-MEM)

Penicillin-Streptomycin, dạng dung

dịch đặc (10,000 U/ml penicillin G; GIBCO Cat.No. 15140-023

10,000 μg/ml streptomycin sulfate)

Dung dịch Bovine serum albumin GIBCO Cat.No. 15260-011 fraction V, 7.5%

HyClone Laboratories, Inc Fetal bovine serum, 40 nm filtered Cat.No. A-1111-L

Trypsin-EDTA (0.05% trypsin; GIBCO Cat.No. 25300-054 0.53 mM EDTA.4Na)

Trypsin, TPCK Sigma Cat.No. T-8642

Gentamicin reagent dạng dung dịch GIBCO Cat.No 15750-011 (50 mg gentamicin sulfate/ml)

Cồn (96-100%) Merck Cat.No.1.00983.1000

Phân lập đƣợc thực hiện tại PTN ATSH cấp 2.

 Chuẩn bị dụng cụ, vật liệu.

- Lựa chọn tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong chai nuôi cấy tế bào

25 cm2 (Corning Cat.No. 430720).

- Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%,

Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, NaHCO3 và nƣớc cất hai

lần vô trùng.

- Dung dịch môi trƣờng nuôi cấy vi rút gồm: D-MEM x10, Bovine serum

albumine 2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, TPCK-

treated trypsin và nƣớc cất hai lần vô trùng.

- Trypsin treated - TPCK

 Chuẩn bị Trypsin treated - TPCK

- Kháng sinh để xử lý bệnh phẩm: Kanamycin sulfate; Cipro-HCl

- Xử lý mẫu bệnh phẩm lâm sàng

(1). Trộn đều bệnh phẩm bằng máy vortex. Loại bỏ tăm bông ngoáy họng.

(2). Thêm 20 µl kháng sinh xử lý bệnh phẩm.

(3). Để tại nhiệt độ phòng 30-45 phút.

(4). Sử dụng mẫu để phân lập.

- Phân lập trên tế bào MDCK (1). Chọn chai tế bào MDCK 25 cm2 mọc đẹp 1 lớp.

(2). Loại bỏ môi trƣờng phát triển, rửa tế bào 2 lần bằng PBS (-) và 1 lần

bằng môi trƣờng D-MEM chứa 2 µg/ml TPCK trypsin. (3). Gây nhiễm 250 µl bệnh phẩm, ủ 370C/60 phút (4).Thêm 1,5 ml môi trƣờng nuôi cấy vi rút BSA 2%, Trypsin. Ủ 370C/7 ngày

(5). Quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính hiển vi lộn ngƣợc hàng ngày.

 Khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút

1. Các chủng vi rút thu hoạch đƣợc tiến hành khuếch đại trên chai tế bào

MDCK 75 cm3 mọc đẹp 1 lớp.

2. Lựa chọn các chai tế bào có hủy hoại xuất hiện CPE từ 72 đến 96 giờ sau

khi gây nhiễm.

3. Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang

(HA) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới. 4. Thu hoạch và cất giữ tại -800C các chủng vi rút có hiệu giá HA ≥ 8 phục vụ

cho nghiên cứu.

5. Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm phân lập đƣợc năm 2009 - 2010 đại diện cho

3 khu vực miền Bắc – Trung – Tây Nguyên lƣu hành ở các thời điểm khác

nhau để tiến hành giải trình tự chuỗi nucleotide.

2.2.5.2 Giải trình tự chuỗi nucleotide các phân đoạn gen HA, NA, M, NS,

PB1 và PB2.

 Sinh phẩm sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA

Mini Kit, 250 preps, catalog 52904, Qiagen

 Tạo đoạn DNA bổ sung

- Mồi Universal 12 (Invitrogen)

- Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog

18080085).

 Sinh phẩm cho PCR

- PCR kit: + Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602)

+ Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212)

- Hệ thống mồi sử dụng giải trình chuỗi nucleotide 6 gen của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 (Xem phụ lục)

 Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR

- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một băng

đặc hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog

28106

- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một gồm

nhiều băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn)

của hãng Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706

- Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn

dideoxynucleotide của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã

catalog 63206

* Giải trình tự gen

- Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917

- Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759

 Phƣơng pháp giải trình tự gen.

Sử dụng phƣơng pháp giải trinh tự gen truyền thống (Sanger) với máy giải

trình tự nucleotide ABI 3130.

Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen

 Tách chiết ARN: Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAgen (CHLB Đức) để

tách chiết ARN của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 có hiệu giá HA ≥ 8.

Các bƣớc tiến hành: Theo thƣờng qui của bộ sinh phẩm:

1. Trộn đều 140 l mẫu thử (dịch mũi họng, dịch súc họng, dịch nổi nuôi tế

bào…) với 560 l đệm AVL. Để 10 phút.

2. Thêm 560 l ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.

3. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm 2ml sạch. Tách 630 l hỗn dịch vào

cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm. Lặp

lại (3).

4. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500

l đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm.

5. Tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW2, ly tâm 14000

vòng/phút/ 3 phút. Loại bỏ ống ly tâm.

6. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch. Cho 60 l nƣớc cất tinh khiết, ủ

2 phút, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần

dung dịch thu đƣợc trong ống ly tâm chính là ARN của vi rút.

 Tổng hợp sợi ADN bổ trợ (cDNA)

Tạo hỗn hợp 1 Tạo hỗn hợp 2

Thành phần Thành phần 1 phản ứng (l) 1 phản ứng (l)

Mồi Uni12 Đệm x5 5 5

dNTP 1 1 DTT ARN RNase inhibitor 10 1

SuperscriptIII 1

RT enzyme

Ủ 650C/ 5 phút. Giữ lạnh ngay Giữ lạnh

Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2, ủ nhiệt độ 43oC/45 phút, 70oC/15 phút, sau đó lƣu giữ tại -20oC, làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại các phân đoạn gen

HA, NA, M, PB1, PB2 và NS.

 Khuếch đại các phân đoạn gen:

Các phân đoạn gen nghiên cứu đƣợc khuếch đại theo thƣờng quy của

Trung tâm Cúm quốc gia, Viện VSDTTW.

- Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR

Sinh phẩm 1 phản ứng

Đệm 10x 10 µl

Mồi xuôi (100 nM) 0.5 µl

Mồi ngƣợc (100 nM) 0.5 µl

HotStar Taq 2 µl

Nƣớc tinh sạch 29 µl

cDNA 8 µl

Tổng 50 µl

Mồi: Sử dụng hệ thống mồi để giải trình tự gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.

- Chu kỳ nhiệt

Gen Chu kỳ nhiệt

940C 940C 500C 720C 720C 40C HA, PB1, PB2 x 29 chu kỳ

2:00 950C 0:20 940C 0:30 520C 1:00 720C 7:00 720C ∞ 40C NA, NS, M x40 chu kỳ 5:00 1:00 1:00 3:00 7:00 ∞

* Điện di sản phẩm PCR: trên thạch 1%, sử dụng thang trọng lƣợng phân

tử 1kb.

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Mục đích: Loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa, sẽ gây nhiễu trong quá

trình giải trình tự.

Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu:

sử dụng bộ sinh phẩm Purification kit Qiaquick 250 (catalog 28106)

Thành phần Cột Qiaquick 250 chiếc

Đệm PB 150 ml

Đệm PE 55 ml

Đệm EB 15 ml

Týp 2 ml 250 chiếc

Chú ý: Thêm 220 ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trƣớc khi sử dụng

 Các bƣớc tiến hành

1. Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có.

2. Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2 ml.

3. Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm 13.000 vòng/30-

60 giây.

4. Loại bỏ nƣớc ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube.

5. Dùng pipet cho 750 l đệm PE vào cột Qiaquick để rửa ADN, ly tâm

13.000 vòng/30-60 giây.

6. Loại bỏ nƣớc ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube, ly tâm 13.000

vòng/60 giây.

7. Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml.

8. Cho 30 l đệm EB hoặc nƣớc tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cột

Qiaquick để tách lấy ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 13.000 vòng/60 giây. ADN tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC

- Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho nhiều băng, trong đó có băng sản

phẩm cần giải trình tự gen: sử dụng bộ sinh phẩm Gel Extraction kit

QIAEX II (catalog 20051)

Thành phần: Đệm QX1 100 ml

Đệm PE 20 ml

QIAEX II 1 ml

Chú ý: Thêm 80 ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trƣớc khi sử dụng. Chuẩn bị máy ủ nhiệt hoặc nồi cách thủy 50oC

 Các bƣớc tiến hành

1. Cắt băng ADN đặc hiệu trên thạch. Cho thạch vào tube 1.5ml.

2. Xác định trọng lƣợng của miếng thạch. Trộn 3 thể tích đệm QX1 với 1 thể

tích miếng thạch chứa DNA có độ dài từ 100bp - 4kb (VD: 300 ul QX1 với

100 mg thạch)

3. Cho QIAEX II theo bảng sau:

Nồng độ DNA (ug) Thể tích QIAEX II (l)

< 2 10

2-10 30

thêm 10 ug thêm 30 l

Lắc bằng máy khoảng 30 giây. 4. Ủ 50oC trong 10 phút hoà tan thạch, giữ lại DNA. Lắc tube mỗi 2 phút với ADN < 10 kb. Trƣớc khi lấy tube, kiểm tra dung dịch có màu vàng hay không.

5. Ly tâm 13.000 vòng/30 giây, nhẹ nhàng loại bỏ nƣớc nổi bằng pipet. 6. Cho 500 ul đệm QX1 để rửa cặn (chú ý lắc tan cặn khi rửa), ly tâm 13.000

vòng/30 giây

7. Rửa cặn 2 lần với 500 l đệm PE (chú ý lắc tan cặn khi rửa), ly tâm 13.000

vòng/30 giây

8. Để khô trong 10-15 phút cho tới khi cặn có màu trắng.

9. Cho 20 l nƣớc tinh sạch vào tube, lắc cho tan cặn, ủ theo bảng dƣới đây:

Độ dài ADN (kb) Nhiệt độ/ thời gian ủ

< 4 Nhiệt độ phòng/ 5 phút

4-10 50oC/ 5 phút

> 10 50oC/ 10 phút

10. Ly tâm 13.000 vòng/30 giây, cẩn thận và nhẹ nhàng dùng pipet hút nƣớc nổi có chứa ADN tinh sạch sang tube sạch. ADN tinh sạch giữ ở -200C đến -800C.

 Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle

Sequencing).

 Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

Sinh phẩm Thể tích

Terminator Ready Reaction Mix

Mẫu

Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngƣợc Nƣớc tinh sạch Tổng 8 µl Tuỳ theo chất lƣợng mà lấy thể tích khác nhau 1 µl X µl 20 µl

* Xác định hàm lƣợng DNA trong mẫu * Lƣợng DNA đƣợc tính theo

bảng theo thang DNA chuẩn sau:

Kích thƣớc mẫu (bp) Trọng lƣợng (ng)

100-200 200-500 500-1000 >1000 1-3 3-10 10-40 20-50

Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen

Chu kỳ 1

Nhiệt độ 96oC 96 oC 50 oC 60 oC 4 oC

Thời gian (phút:giây) 1:00 0:10 0:05 4:00 Giữ cho tới bƣớc tinh sạch tiếp theo

 Chu trình nhiệt

Sinh phẩm đƣợc trộn trong từng tube 0.2 ul riêng rẽ, ly tâm ngắn trƣớc

khi cho vào máy.

 Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

 Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm dƣ thừa, tránh

nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen.

 Các bƣớc tiến hành

- Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin, nới lỏng nắp cột.

- Loại bỏ phần dƣới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào týp 2 ml.

- Ly tâm 8000 vòng /2- 3 phút.

- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang týp 1.5 ml sạch.

- Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel.

- Ly tâm 8000 vòng /1 phút.

- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin

- Làm khô và chuẩn bị đƣa vào máy giải trình tự gen. Trong trƣờng hợp không đƣa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khô ở -20oC không quá

24h.

 Điện di qua mao quản và đọc trình tự chuỗi nucleotide bằng đầu đọc

laser

 Chuẩn bị mẫu điện di

- Cho 10 µl HiDi Formamide vào tube 1,5 ml chứa DNA sau khi tinh sạch ở

bƣớc 2 (khi cho vào trộn nhẹ nhàng bằng pipet)

 Chuyển mẫu vào máy:

- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho máy ABI

3130)

- Ủ tại 96oC/5 phút. Sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh.

Chuyển đĩa 96 giếng vào máy giải trình tự ABI 3130.

 Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi nucleotide .

 Sử dụng phần mềm DNA star v.8.0 để sắp xếp và thu thập phân đoạn gen

HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.

 Sử dụng phần mềm DNA star v.8.0 – CLUSTAL X để dịch mã, so sánh sự

khác biệt axit amin của protein HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.

 Sử dụng phần mềm MEGA 5 để tạo cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và

PB2 bằng phƣơng pháp Maximum likehood.

 Sử dụng phần mềm Bioedit 7.2.3 xác định độ tƣơng đồng trình tự

nucleotide của các phân đoạn gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.

 Phương pháp xác định mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09.

Phƣơng pháp xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir bao gồm 2

bƣớc: xác định mức độ hoạt động của enzyme neuraminidase và xác định độ

nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir bằng phản ứng ức chế enzyme

neuraminidase (NA). Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý hoạt động của NA.

Dƣới tác dụng của NA, axit sialic phân tách với nhóm đƣờng liền giải phóng

vi rút cúm khỏi bề mặt tế bào cảm nhiễm. Do vậy, ức chế sự phân tách này sẽ

cản trở quá trình giải phóng vi rút cúm, ngăn chặn sự phát tán của vi rút trong

cơ thể. MUNANA (2-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid

sodium salt hydrate) là chất nền huỳnh quang đƣợc sử dụng trong thử nghiệm

xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir và mức độ hoạt động của enzyme

neuraminidase của vi rút cúm. Trong phản ứng này, MUNANA sẽ bị phân

tách bởi NA giải phóng phân tử phát huỳnh quang 4-Methylumbelliferyl (4-

MU) và đƣợc đọc bởi máy Fluostar Reader.

 Sinh phẩm và hóa chất

- 2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid (catalog M8639)

- 2-(N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES) (free acid) (catalog M8250)

- 1M Calcium Chloride (Ca Cl2) (APS AJAX Fineham catalog 127-500G)

- Absolute Ethanol (APS AJAX Fineham catalog 214-2.5L GL)

- Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) (Pierce catalog 28324)

- 0.824 M Sodium Hydroxide (APS AJAX Fineham catalog 482-2.5)

- Neuraminidase Inhibitors: oseltamivir carboxylate, đƣợc cung cấp bởi

PTN Hoffmann-La Roch (Thụy sỹ)

 Vi rút chuẩn

Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 chuẩn đƣợc cung cấp bởi PTN tham chiếu

của TCYTTG tại Melbourne – Australia.

Vi rút Phân týp Giá trị IC50(nM)

A/ Perth/265/2009 A(H1N1)pdm09 0,6

A/ Perth/261/2009 A(H1N1)pdm09 2179 (có đột biến H275Y trên protein NA)

 Phương pháp tiến hành

- Xác định mức độ hoạt động của NA

Đây là bƣớc xác định mức độ hoạt động của NA mà qua đó có thể xác

định đƣợc mức phát quang chuẩn có thể dựa vào để xác định độ pha loãng của

vi rút trong phản ứng ức chế NA tiếp theo. Chất nền MUNANA đƣợc đƣa vào

dung dịch chứa vi rút đã đƣợc pha loãng bậc 2 bằng dung dịch đệm. Ủ hỗn hợp tại 370C/60 phút, thêm chất dừng phản ứng, đọc bằng máy Fluostar

Reader. Dung dịch vi rút đƣợc pha loãng bậc hai 3 lần và đƣợc làm cùng một

thời điểm để hạn chế sai số.

- Phản ứng ức chế enzyme neuraminidase

Độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir đƣợc xác định bởi gái trị

IC50 của vi rút. Oseltamivir đƣợc pha loãng theo các nồng độ từ 25000 nM

đến 0.0128 nM rồi cho vào dung dịch vi rút đã pha loãng dựa trên các giá trị thu đƣợc từ phản ứng MUNANA nói trên, ủ 370C/30 phút trong tủ ấm lắc. Sau đó cho MUNANA vào hỗn dịch, ủ 370C/60 phút trong tủ ấm lắc. Đọc tín

hiệu huỳnh quang trên máy Fluostar Reader trong vòng 20 phút sau khi dừng

phản ứng.

- Nhận định kết quả

Kết quả đƣợc nhận định theo tiêu chuẩn của hiệp hội giám sát kháng

thuốc (AVG) thế giới [30]

Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC50 của vi rút cúm

Cúm A Cúm B Kết quả IC50 (nM)

So sánh với ngƣỡng ức chế NA bình thƣờng

Đáp ứng tốt với thuốc <10 lần < 5 lần

Giảm hiệu quả ức chế 10-100 lần 5-50 lần

Giảm hiệu quả mạnh (kháng) >100 lần >50 lần

2.2.5.3 Xác định đặc tính kháng nguyên: Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

(HI). Sử dụng bộ sinh phẩm HI cung cấp bởi TCYYTG - CDC, Atlanta, Mỹ.

 Bộ sinh phẩm phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu

Thành phần gồm có các kháng huyết thanh chồn sƣơng (ferret antisera)

hoặc cừu (sheep antisera) của từng phân týp vi rút :

- A/H1 Reference Antiserum (Ferret antisera)

- A(H1N1)pdm 09: Influenza A(H1N1)pdm Control Sheep Antiserum

- A/H3: Influenza/H3 Reference Sheep antiserum

- B/Br: Influenza B Reference Sheep Antiserum (B/Brisbane/60/2008)-

Victoria lineage

- B/F: Influenza B Reference Ferret Antiserum (B/Florida/4/2006) -

Yamagata lineage

 Các bƣớc tiến hành

- Xử lý kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera): để loại bỏ những chất

ức chế không đặc hiệu trong kháng huyết thanh chuẩn:

+ 1 thể tích kháng huyết thanh kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE (enzyme

phá hủy các thụ thể - Recepter Destroying Enzyme). Ủ 370C qua đêm.

+ Bất hoạt ở 560C trong vòng 30 phút.

+ Bổ sung 6 thể tích nƣớc muối sinh lý NaCl 0,85%. Nhƣ vậy, kháng huyết

thanh chuẩn đã đƣợc pha loãng 1/10.

- Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu

(HA): Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy tròn

(hồng cầu gà) hoặc phiến nhựa 96 giếng đáy hình chữ V (hồng cầu chuột

lang).

+ Cho 50 l đệm PBS vào các giếng từ hàng thứ 2 đến 12.

+ Cho 100 l hỗn dịch nuôi cấy tế bào vào giếng đầu tiên. Chuyển 50 l hỗn

dịch này sang giếng thứ 2, pha loãng bậc hai hỗn dịch nuôi cấy vi rút từ

hàng thứ 2 đến hàng thứ 12, loại bỏ 50 l ở hàng cuối cùng.

+ Cho 50 l hồng cầu gà 0,5%, hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu

ngựa 1%, kể cả hàng chứng hồng cầu. Lắc đều, để 30 phút (hồng cầu gà)

hoặc 60 phút (hồng cầu chuột lang, ngựa) ở nhiệt độ phòng.

 Nhận định kết quả: hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của

kháng nguyên gây ngƣng kết hồng cầu hoàn toàn. Đó chính là một đơn vị

ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên, 50 l kháng nguyên 8 đơn vị hay

25 l kháng nguyên 4 đơn vị.

 Chuẩn độ lại kháng nguyên 8 đơn vị/50 l hay 4 đơn vị /25 l.

 Qui trình tiến hành phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

(1) Cho 25 l đệm PBS vào các giếng từ hàng C đến hàng H (trừ cột 6 và

cột 12) của tấm nhựa 96 giếng. Cho 50 l đệm PBS cào cột 6 và cột 12.

(2) Thêm 50 l từng kháng huyết thanh chuẩn đã đƣợc xử lý bằng RDE (1/10)

vào các giếng hàng A và B (trừ A6, A12, B6 và B12).

(3) Chuyển 25 l kháng huyết thanh chuẩn từ hàng B sang hàng C và tiến

hành pha loãng bậc 2 đến hàng H, loại bỏ 25 l ở hàng cuối cùng.

(4) Thêm 25 l kháng nguyên 4 đơn vị HA thích hợp (hỗn dịch nuôi cấy tế

bào và chứng dƣơng) vào các giếng tƣơng ứng.

(5) Lắc nhẹ tấm bằng máy lắc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.

(6) Thêm 50 l hồng cầu gà, chuột lang hoặc ngựa vào tất cả các giếng trong

phiến 96 giếng.

(7) Đậy tấm bằng nắp. Lắc nhẹ tấm bằng máy lắc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong

1giờ.

 Nhận định kết quả: Phản ứng đọc đƣợc khi:

 Kháng huyết thanh chuẩn: ngăn ngƣng kết hoàn toàn

 Chứng hồng cầu: ngăn ngƣng kết hoàn toàn.

 Hiệu giá ức chế ngƣng kết hồng cầu của chủng vi rút: là giá trị tại độ pha

loãng cao nhất của chủng vi rút gây hiện tƣợng ngăn ngƣng kết hồng cầu.

 Phân týp của vi rút đƣợc xác đinh tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu giá

ngăn ngƣng kết hồng cầu cao nhất.

 Xác định đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09

bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI).

Hình 2.3 Kết quả HI xác định hiệu giá vi rút A(H1N1)pdm09 với

kháng huyết thanh chuẩn A/California/07/09.

Số 1 đến 11: vi rút A(H1N1)pdm09 thử nghiệm.

Số 12 : vi rút vắc xin A/California/07/09

2.2.5.4 Phương pháp lựa chọn vi rút dự tuyển phát triển vắc xin.

Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển cho sản xuất vắc xin đƣợc tiến hành sau

khi xem xét sự tƣơng đồng về vi rút học, dịch tễ học giữa các chủng vi rút

đang lƣu hành và dự kiến sẽ lƣu hành trong mùa dịch sau. Chủng vi rút đƣợc

lựa chọn tiến hành thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu, để đánh giá khả năng

khuếch đại của vi rút trên hệ thống tế bào nuôi MDCK, thông qua hiệu giá

HA sau 5 lần cấy chuyển với xuất phát điểm HA ≥ 128 và kiểm tra đặc tính

kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) với kháng huyết

thanh chuẩn của A/California/07/09. Tiêu chuẩn trong lựa chọn vi rút dự

tuyển vắc xin với mục đích đảm bảo tốt nhất khả năng tạo miễn dịch trong

quần thể (là vi rút đại diện cho phần lớn các vi rút đang lƣu hành), tạo điều

kiện thuận lợi cho các đơn vị sản xuất vắc xin có thể giảm giá thành (do có

khả năng khuếch đại tốt), thuận lợi trong quá trình đánh giá chất lƣợng vắc

xin (tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên). Nhƣ vậy các vi rút

đƣợc lựa chọn đảm bảo là vi rút thế hệ mới nhất (phân lập năm 2013) và đảm

bảo cho sự tiến triển (tiến hóa) cao về di truyền, vì vậy sẽ có biểu hiện kháng

nguyên mới nhất, cập nhật nhất trong thời điểm hiện tại trong quần thể vi rút

lƣu hành tại Việt Nam. Chủng đƣợc lựa chọn cho phép xác định liều gây

nhiễm cho sản xuất vắc xin, đồng thời lƣợng giá đƣợc hàm lƣợng protein HA

thu đƣợc trong quá trình sản xuất và kiểm soát ADN tế bào dƣ trong thành

phần hỗn hợp vi rút góp phần phát triển và hoàn thiện quy trình sản xuất vắc

xin trên tế bào.

2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. - Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 2 - Tủ an toàn sinh học cấp 2 Bioquell – Anh - Máy khuếch đại gen Biorad – Mỹ - Máy giải trình tự gen ABI 3130 Applied Biosystems, Mỹ - Máy đọc tín hiệu huỳnh quang Perkin Elmer – Mỹ - Máy ly tâm Beckman Coulter – Mỹ - Votex IKA – Malaysia  Dụng cụ tiêu hao - Pipet vi lƣợng 10µl - 1000µl - Đầu côn có lọc vô trùng 10µl - 1000µl - Chai nuôi cấy tế bào 25cm2, 75 cm2 - Phiến 96 giếng màu đen đáy phẳng - Týp eppendoff 1,5ml – 2ml

2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu là một nhánh của đề tài nghiên cứu cấp nhà nƣớc (Mã số

ĐTĐL 2009G/55) và chƣơng trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009-

2011 tại khu vực miền Bắc Việt Nam, phối hợp với Cơ quan phòng chống

bệnh tật Mỹ (CDC-US) giai đoạn 2006-2012. Vì vậy, Y đức trong nghiên cứu

đã đƣợc phê duyệt bởi Hội đồng Y đức - Bộ Y tế và Trung tâm kiểm soát và

phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US).

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ

3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên

cứu.

Trong thời gian nghiên cứu vi rút cúm đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh

phẩm dịch họng thu thập tại miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên trên bệnh

nhân đƣợc xác định nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phƣơng pháp

RT-PCR hoặc Realtime PCR tại các điểm giám sát trong chƣơng trình giám

sát cúm quốc gia. Sử dụng dòng tế bào thận chó thƣờng trực (MDCK) để

phân lập và khuếch đại vi rút cúm A(H1N1)pdm09, vi rút cúm thu thập sau

72-96 giờ sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK đƣợc xác định nồng độ vi

rút bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (HA), toàn bộ các vi rút có hiệu

giá HA ≥ 8 đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu.

Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu.

Số vi rút (n) Tỷ lệ (%) Năm

2009 18,7 14

2010 25,3 19

2011 9,3 7

2012 5,3 4

2013 41,4 31

Tổng 100 75

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc thu thập

trong nghiên cứu đều đại diện trong các năm, nhiều nhất năm 2013 (31 vi rút),

tiếp đến năm 2010 (19 vi rút), 2009 (14 vi rút), các năm 2011 và 2012 là các

năm có số lƣợng vi rút đƣợc lựa chọn thấp: 7 vi rút (2011) và 4 vi rút (2012).

Các vi rút sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập từ năm 2009 - 2013 tại

một số tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây nguyên.

3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen để phân tích

trình tự chuỗi nucleotide.

Do cấu trúc hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn với kích cỡ và cấu

trúc khác nhau nên khả năng thành công khi tổng hợp từng phân đoạn bằng

phản ứng PCR sẽ thay đổi. Sử dụng các cặp mồi thiết kế cho phân tách (tách

biệt) các phân đoạn gen độc lập của vi rút cúm A kết hợp với DNA

polymerase Hifi có khả năng khuếch đại và hiệu chuẩn sản phẩm PCR với

kích cỡ lớn, các phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phân

tách và khuếch đại với độ đặc hiệu, chính xác cao.

1 2 3 4 M

1778 bp 1413 bp

bpbp bpbp

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi

khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen

M : Thang trọng lƣợng phân tử 1kb

Mẫu 1-4 : Các vi rút A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu

Dựa trên kết quả PCR, 6 phân đoạn gen đƣợc tổng hợp bao gồm: HA, NA, M,

NS, PB1 và PB2, các phân đoạn gen của cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc lựa chọn

để tiến hành phân tích trình tự chuỗi nucleotide.

Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR

Phân Số vi rút (n) Độ dài thu Tổng Tỷ lệ đoạn đƣợc (bp) (n) (%) 2009 2010 2011 2012 2013 gen

HA 1778 14 19 7 4 31 75 100

NA 1413 6 16 4 2 24 52 69,3

M 1027 12 18 3 4 13 50 66,7

NS 890 8 18 3 4 14 47 62,7

PB1 2299 3 14 3 4 12 36 48

PB2 2185 7 18 3 4 13 45 60

Kết quả bảng 3.2 cho thấy tổng số 75 chủng vi rút cúm phân lập đạt hiệu

giá HA≥ 8 đều thành công trong việc phân tách và khuếch đại phân đoạn gen

HA đạt tỷ lệ 100%, trong khi phân đoạn gen NA thu đƣợc 52/75 vi rút (đạt

69,3%), các phân đoạn gen M thu đƣợc 50/75 (đạt 66,7%), NS 47/75 (đạt

62,7)% và PB2 45/75 (đạt 60%) và phân đoạn gen PB1 thu đƣợc từ 36/75 (đạt

48%).

3.2.1. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA

3.2.1.1 Cây gia hệ phân đoạn gen HA.

Cây gia hệ phân đoạn gen HA đƣợc xây dựng với vi rút gốc là

A/California/07/09 và 75 chủng vi rút với phân đoạn gen HA có độ dài 1778

nucleotide sử dụng trong nghiên cứu cùng với các vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại các nƣớc láng giềng trong cùng giai đoạn (Thái Lan, Trung

Quốc…). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: các vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 kể từ khi xuất hiện (3/2009) và lƣu hành đến hiện tại trên thế

giới đƣợc nhóm thành 7 nhóm chính (nhóm 1 đến 7), trong đó nhóm 6 đƣợc

tách thành các phân nhóm 6A; 6B và 6C [35].

Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam sử dụng trong nghiên

cứu cũng tập hợp 7 nhóm chính (Hình 3.2). Kết hợp với phân tích sự tƣơng

đồng trên các vi rút lƣu hành trong khu vực và trên thế giới, các vi rút sử dụng

trong nghiên cứu đƣợc tập hợp trong nhóm/ phân nhóm của cây gia hệ cụ thể

nhƣ sau:

- Nhóm 1: gồm 01 vi rút phân lập năm 2009 và cùng nhóm với vi rút gốc

A/California/07/09 cũng nhƣ các vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc

trong cùng năm 2009.

- Nhóm 2: gồm 02 vi rút phân lập năm 2009, 02 vi rút phân lập năm 2010 và

một số vi rút lƣu hành năm 2009 tại Thái Lan, Trung Quốc.

- Nhóm 3: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 08 vi rút phân lập năm 2010

cùng với một số vi rút lƣu hành năm 2009-2010 tại Thái Lan, Trung Quốc.

- Nhóm 4: gồm 08 vi rút còn lại phân lập năm 2009 và tập hợp cùng một số

vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc năm 2009-2010.

- Nhóm 5: 09 vi rút còn lại phân lập năm 2010 và một số lƣu hành tại Mỹ,

Thái Lan, Trung Quốc năm 2010-2012.

- Phân nhóm 6A: gồm 07 vi rút phân lập năm 2013, cùng với vi rút lƣu hành

tại Iran. Không có vi rút nào xuất hiện phân nhóm 6B

- Phân nhóm 6C: là phân nhóm lớn gồm 23 vi rút phân lập năm 2013 và 01vi

rút phân lập năm 2011 cùng với một số vi rút phân lập tại Mỹ, Iran, Trung

Quốc, Ấn độ năm 2012-2013.

- Nhóm 7: là tập hợp của 06 vi rút phân lập năm 2011, 04 vi rút phân lập

năm 2012 và 01 vi rút phân lập năm 2013 cùng một số vi rút lƣu hành tại

Mỹ, Nga, Thái Lan năm 2010-2013.

2013

2012

2011

2010

0 2009

Nhóm 1: VN/2009

Nhóm 2: VN/2009-VN/2010

Nhóm 3: VN/2009-VN/2010

Nhóm 4: VN/2009-VN/2010

Nhóm 5: VN/2010

Nhóm 6A/6C: VN/2013

Nhóm 7: VN/2011-2012

Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013.

Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm

vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin

A/California/07/09 (MEGA 5) .

Các vi rút tập trung trong từng nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tƣơng

đồng về trình tự nucleotide của gen HA từ 99,7% (nhóm) hoặc 99,9% (phân

nhóm) với độ lặp lại (boostrap) 1000 lần trong quá trình so sánh trình tự giữa

các vi rút. Kết quả hình 3.3 cho thấy sự thay đổi nucleotide của gen HA của vi

rút A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu dao động trung bình từ 5 nucleotide

(nhóm 1 đến 5) đến 13 nucleotide (phân nhóm 6C) với vi rút vắc xin

A/California/07/09. Kết quả trên cho phép xác định độ tƣơng đồng nucleotide

của các nhóm/phân nhóm của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với vi rút vắc xin

A/California/07/09 đạt từ 99,3% (phân nhóm 6C) đến 99,7% (nhóm 1-5)

3.2.1.2 Protein HA.

Toàn bộ 75 phân đoạn gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng

trong nghiên cứu đƣợc dịch mã axit amin và so sánh với protein HA của vi rút

vắc xin (vi rút gốc A/California/07/09).

Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA

Nhóm Axit amin thay đổi so với vi rút /Phân 2009 2010 2011 2012 2013 A/ California/07/09 nhóm

1 1 P83S, I321V

2 2 2 P83S, I321V, S203T

P83S, I321V, S203T, S84N, 3 3 8 I116M

4 8 P83S, I321V, S203T, R223Q.

P83S, I321V, S203T, R259K, 5 9 E347K

P83S, I321V, S203T, R223Q,

6A 7 D97N, N38D, H138R, S185T ,

V249L, E374K, S451N

P83S, I321V, S203T, R223Q,

D97N, G155E, N156K, S185T, 6C 23 1 I216M, D222N, V234I, T241I,

K283E, E374K, S451N, E499K

P83S, I321V, S203T, R223Q,

7 1 D97N, S143G, S185T, A197T, 6 4

N260D, E374K, S451N, E499K

7 4 Tổng 14 19 31 75 chủng vi rút

Kết quả phân tích protein HA của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

trong nghiên cứu cho thấy sự thay đổi của axit amin của từng nhóm, phân

nhóm so với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.3) bao gồm :

 Nhóm 1: vi rút cúm lƣu hành tại Việt Nam đƣợc xác định có 2 axit amin

thay đổi đó là P83S, I321V.

 Nhóm 2: Số axit amin thay đổi là 3: P83S, I321V và S203T.

 Nhóm 3 và 5 có 5 axit amin thay đổi

 Nhóm 4: có 4 axit amin thay đổi.

 Phân nhóm 6A: số axit amin thay đổi đƣợc xác định là 11.

 Phân nhóm 6C: số axit amin thay đổi đƣợc xác định là 16.

 Nhóm 7: axit amin thay đổi đƣợc xác định là 12.

Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA

Axit amin thay đổi trên protein HA so với vi rút Nhóm/ A/California/07/09 phân Pro-Ser Ile-Val Ser-Tyr Glu-Lys Arg-Gln Asp-Asn nhóm (P83S) (I321V) (S203T) (E374K) (R223Q) (D97N)

√ √ 1

√ √ √ 2

√ √ √ 3

√ √ √ √ 4

√ √ √ √ 5

√ √ √ √ √ √ 6A

√ √ √ √ √ √ 6C

√ √ √ √ √ √ 7

Tần xuất thay đổi (đột biến) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại

Việt Nam so với vi rút gốc A/California/07/09 đƣợc ghi nhận tại một số vị trí

axit amin số 83 thay đổi từ Proline thành Serine (P83S) và Isoleucine thành

Valine tại axit amin số 321(I321V) xuất hiện trong toàn bộ 75 chủng vi rút sử

dụng trong nghiên cứu, tần suất thay đổi là 100%. Tiếp theo thay đổi S203T

đƣợc xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7 với tần suất 87,5%,

các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% và D97N,

S451N đƣợc xác định trong 3 nhóm/phân nhóm (37,5%). Các thay đổi (đột

biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm (bảng 3.4).

3.2.2. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen NA

3.2.2.1 Cây gia hệ phân đoạn gen NA.

Cây gia hệ phân đoạn gen NA đƣợc xây dựng trên 52 chủng vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và một số vi rút lƣu hành cùng thời gian

trên một số nƣớc trên thế giới: Thái Lan, Hồng Kông, Mỹ, Canada. Tƣơng tự

cây gia hệ gen HA, cây gia hệ NA cũng sử dụng vi rút cúm

A/California/07/09 làm gốc. Kết quả phân tích cây gia hệ cho thấy gen NA

của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sau 4 năm lƣu hành (2009-2013) tập hợp

trong 7 nhóm đƣợc phân tách thành 10 phân nhóm: 1; 2; 3; 4; 5; 6A; 6B; 6C;

7A và 7B đƣợc (hình 3.4):

 Nhóm 2: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 04 vi rút phân lập năm 2010.

 Nhóm 3: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 12 vi rút phân lập năm 2010.

 Nhóm 5: gồm 05 vi rút phân lập năm 2013.

 Phân nhóm 6B: gồm 05 vi rút phân lập năm 2013.

 Phân nhóm 6C: gồm 10 vi rút phân lập năm 2013.

 Phân nhóm 7A: gồm 03 vi rút phân lập năm 2011; 01 vi rút phân lập năm

2012 và 01 vi rút phân lập năm 2013.

 Phân nhóm 7B: 01 vi rút phân lập năm 2011; 01 vi rút phân lập năm 2012

và 03 vi rút phân lâp năm 2013.

2013

2012

2011

2010

0 2009

Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013

Kết quả phân tích cây gia hệ cũng cho thấy:

- Các vi rút phân lập năm 2009-2010 có độ tƣơng đồng cao và tập trung

trong nhóm 2 và 3.

- Các vi rút cúm phân lập năm 2013 phân tách nhiều thể hiện trong sự có mặt

của những vi rút này tại các nhóm/phân nhóm 5; 6B, 6C, 7A và 7B (hình

3.4)

Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm

vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin

A/California/07/09 (Mega 5 sofwave) .

Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của 52 chủng vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu với độ dài 1413 nucleotide và so sánh với

vi rút vắc xin A/California/07/09 chỉ phát hiện sự thay đổi 1 nucleotide trong

nhóm 2; 7 nucleotide trong nhóm 5. Kết quả trên cho phép xác định độ tƣơng

đồng nucleotide của các nhóm/phân nhóm trên gen NA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 với vi rút vắc xin A/California/07/09 đạt từ 99,3% - 99,9%

(Hình 3.5).

3.2.2.2 Protein NA

Dịch mã trình tự nucleotide phân đoạn gen NA của 52 chủng

A(H1N1)pdm09, sử dụng xây dựng cây gia hệ NA và tiến hành so sánh giữa

các vi rút trong nhóm/phân nhóm, phát hiện sự thay đổi (đột biến) axit amin

của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và vi rút vắc xin

A/California/07/09, kết quả cho thấy:

 Các vi rút tập trung trong các nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tƣơng đồng

về axit amin từ 99,3% đến 99,9% (nhóm/phân nhóm).

 Có một số đột biến đƣợc phát hiện khi so sánh protein NA với vi rút vắc

xin A/California/07/09.

Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein NA

Axit amin thay đổi trong

Nhóm/

Phân

protein NA so với vi rút

2009 2010 2011 2012 2013

vắcxin A/California/07/09

nhóm

N248D 3 4 2

N248D, K84R, G87D, S95N, 3 12 3 V106I, V234I

N248D, V83L,V106I,

5 I122V,V241I, I321V, 5

N369K, N386S, D416N

N248D, N44S, 5 6B N200S,V241I, N369K

N248D, N44S, V83A, 10 6C N200S,V241I, N369K

N248D, G41R, N44S,

3 1 1 V106I, V241I, N369K, 7A

Q313R

N248D, N44S, V241I, 1 1 3 7B N369K

Tổng 6 16 52 chủng vi rút 4 2 24

Các vi rút lƣu hành tại Việt Nam có sự thay đổi (đột biến) so với vi rút vắc

xin A/California/07/09 từ 1 axit amin (nhóm 2) đến 9 axit amin (nhóm 5)

(Bảng 3.5). Tần suất thay đổi của một số axit amin đƣợc xác định thông qua

số lần xuất hiện đột biến tại các nhóm khác nhau.

Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA

Axit amin thay đổi trên protein NA so với vi rút A/California/07/09

Nhóm/

Phân

Asn-Asp

Val-Ile

Asn-Lys

Asn-Ser

Val-Ile

Val-Leu

Val-Ala

His-Tyr

N248D

V241I

N369K

N44S

V106I

V83L

V83A

H275Y

nhóm

√

Kết quả bảng 3.6 cho thấy: Sự thay đổi từ Asparagine (N) thành

Aspartic (D) tại vị trí 248 trên protein NA đƣợc ghi nhận tại toàn bộ các

nhóm/phân nhóm trên cây gia hệ và đạt tần suất xuất hiện của sự thay đổi này

là 100%. Tiếp theo là sự thay đổi từ Valine (V) thành Isoleusine (I) tại vị trí

241 đƣợc ghi nhận tại 6/7 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ (tần suất thay đổi

đạt 85,7%), các sự thay đổi của N369K, N44S hoặc V106I xuất hiện trên 3

đến 5 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ với tần suất thay đổi ghi nhận từ

42,8% - 71,4%. Ngoài ra sự đa dạng thay đổi tại một vị trí cũng đƣợc ghi

nhận tại vị trí 83 trên protein NA khi sự thay đổi V83L, H275Y (nhóm 5) và

V83A (phân nhóm 6C) (Bảng 3.5 và 3.6)

3.2.3. Đặc điểm di truyền các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2.

3.2.3.1 Cây gia hệ phân đoạn gen M

Cây gia hệ phân đoạn gen M đƣợc xây dựng bởi 50 chủng vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong tổng số 75 chủng vi rút trong nghiên cứu và một số vi

rút lƣu hành trên thế giới trong cùng thời gian, sử dụng chủng gốc vi rút vắc

xinA/ California/07/09. Kết quả phân tích cây gia hệ cho thấy gen M của vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc chia thành 6 nhóm trong đó các vi rút trong

nghiên cứu đƣợc chia 4 nhóm trên cây gia hệ:

- Nhóm 2: bao gồm toàn bộ 12 vi rút phân lập trong năm 2009 và hầu hết

các vi rút phân lập năm 2010 (16/18 vi rút) cùng với một số vi rút lƣu hành

tại Thái Lan, Trung Quốc năm 2009-2010 và tại Braxin, Mỹ năm 2011-

2013.

- Nhóm 4: gồm 02 vi rút lƣu hành năm 2010; 03 vi rút lƣu hành năm 2011;

01 vi rút lƣu hành năm 2012 và 03 vi rút lƣu hành năm 2013 cùng với một

số vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Singapore, Nga, Hy Lạp, Ấn Độ … năm

2010 - 2013.

- Nhóm 5: gồm 03 vi rút lƣu hành năm 2012 cùng các vi rút có mặt tại Thái

Lan, Mỹ năm 2009 - 2011.

- Nhóm 6: gồm 10 vi rút lƣu hành năm 2013 và một số vi rút tại Phần Lan,

Nga năm 2012 - 2013.

Không thấy sự xuất hiện của vi rút trong nghiên cứu tại nhóm 1 và nhóm 3

(Hình 3.6).

2013

2012

2011

2010

0 2009

Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013

3.2.3.2 Cây gia hệ phân đoạn gen NS

Tổng số 47 chủng vi rút trong nghiên cứu đƣợc tiến hành phân tích đặc

điểm di truyền thông qua cây gia hệ phân đoạn gen NS. Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi cho thấy cây gia hệ gen NS bắt đầu phát triến từ vi rút gốc

A/California/07/09 có thể phân tách thành 7 nhóm/phân nhóm, trong đó các vi

rút sử dụng trong nghiên cứu đƣợc tập trung trong 5 nhóm/phân nhóm (hình

3.7):

- Nhóm 2: bao gồm toàn bộ 08 vi rút phân lập trong năm 2009 và 16 vi rút

phân lập năm 2010. Nhóm này còn có sự hiện diện của một số vi rút lƣu

hành tại Mỹ, Thái Lan, Braxin năm 2009-2011.

- Nhóm 3: là một nhóm nhỏ với sự tập hợp của 02 vi rút phân lập năm 2010

và 01 vi rút phân lập tại Trung Quốc năm 2009.

- Nhóm 4: bao gồm 03 vi rút phân lập năm 2013 cùng với một số vi rút phân

lập tại Hy Lạp, Pháp và Thái Lan năm 2010-2011.

- Phân nhóm 6A: Bao gồm toàn bộ 07 vi rút phân lập năm 2011 và 2012 tập

hợp cùng các vi rút lƣu hành tại Ấn độ, Mỹ, Singapore, Thái Lan… năm

2010-2013.

- Phân nhóm 6B: là nhóm có 11 vi rút còn lại phân lập năm 2013, tập hợp

cùng các vi rút phân lập tại Phần Lan, Ấn độ, Singapore … năm 2011-

2013.

Các vi rút trong nghiên cứu không xuất hiện trong nhóm 1 và nhóm 5.

2013

2012

2011

2010

0 2009

Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013

3.2.3.3 Cây gia hệ phân đoạn gen PB1

Sau khi giải trình tự chuỗi nucleotide của 36 chủng vi rút phân lập trong

nghiên cứu và một số vi rút lƣu hành trên thế giới trong cùng giai đoạn đã

đƣợc sử dụng để xây dựng cây gia hệ phân đoạn gen PB1. Có 5 nhóm đƣợc

hình thành khi phân tích cây gia hệ PB1, trong đó các vi rút lƣu hành tại Việt

Nam sử dụng trong nghiên cứu đƣợc tập trung trong 4 nhóm (hình 3.8):

- Nhóm 1: là nhóm đƣợc bắt đầu từ vi rút gốc A/California/07/09, có 01 vi

rút phân lập năm 2009 và 01 vi rút năm 2010 trong nghiên cứu cùng các vi

rút từ Trung Quốc, Đài Loan lƣu hành năm 2009.

- Nhóm 2: bao gồm 13 vi rút phân lập năm 2010 và 2 vi rút phân lập năm

2009 cùng nhóm với các vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc năm

2009-2010.

- Nhóm 4: bao gồm 4 vi rút phân lập năm 2013 cùng các vi rút lƣu hành tại

Ấn Độ, Mỹ, Nga trong các năm 2011-2013.

- Nhóm 5: là nhóm tập hợp của 3 vi rút phân lập năm 2011, 4 vi rút phân lập

năm 2012 và 8 vi rút phân lập năm 2013 cùng các vi rút phân lập tại Nga,

Đan Mạch, Singapore, Đài Loan trong các năm 2011-2013

Các vi rút trong nghiên cứu không thấy xuất hiện trong nhóm 3.

2013

2012

2011

2010

0 2009

Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013

3.2.3.4 Cây gia hệ phân đoạn gen PB2

Cây gia hệ phân đoạn gen PB2 đƣợc xây dựng sau khi giải trình tự chuỗi

nucleotide của 45 chủng vi rút phân lập trong nghiên cứu. Phân tích cây gia

hệ cho thấy các gen PB2 của các vi rút tƣơng đồng lƣu hành trong cùng thời

gian trên thế giới. Tổng số 8 nhóm/phân nhóm gen PB2 đƣợc quan sát khi

phân tích cây gia hệ trong đó các vi rút lƣu hành tại Việt Nam trong nghiên

cứu đƣợc tập hợp trong 5 nhóm/phân nhóm (Hình 3.9):

 Nhóm 1: bao gồm 2 vi rút phân lập năm 2010 tập hợp cùng với vi rút gốc

A/California/07/09 và một số vi rút lƣu hành năm 2009-2010 tại Thái Lan,

Trung Quốc.

 Nhóm 3: bao gồm toàn bộ 7 vi rút phân lập năm 2009 và số còn lại của 16

vi rút phân lập năm 2010.

 Phân nhóm 6A: bao gồm toàn bộ 7 vi rút phân lập năm 2011 và 2012 cùng

với một số vi rút phân lập năm 2010-2012 tại Thái Lan, Nga, Đài Loan và

Ấn Độ.

 Phân nhóm 6B: bao gồm 9 vi rút phân lập năm 2013 tập hợp cùng các vi

rút lƣu hành năm 2011-2013 tại Phần lan, Singapore, Thái Lan…

 Nhóm 6C: bao gồm 4 vi rút phân lập năm 2013 cùng các vi rút lƣu hành

Thái Lan, Nga, Đài Loan và Ấn độ… năm 2011-2013.

Các vi rút trong nghiên cứu không đƣợc tập hợp trong nhóm 2, nhóm 4 và

nhóm 5.

2013

2012

2011

2010

0 2009

Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013

3.2.3.5 Các protein M, NS, PB1 và PB2

Toàn bộ trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút trong nghiên cứu sử

dụng xây các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 đều đƣợc dịch mã sang các

protein tƣơng ứng M1, M2, NS1, NS2, PB1 và PB2. Xác định độ tƣơng đồng

và phát hiện sự đột biến axit amin so với vi rút gốc A/California/07/09 (vi rút

vắc xin).

Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2,

NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu

Kết quả so sánh với vi rút cúm A/California/07/2009

Số vi rút

Protein

Độ tƣơng đồng trong

(n)

Các axit amin thay đổi thƣờng gặp

từng phân nhóm (%)

99.6

V80I, M192V, K230R

99.9

D21G

99.2

L59I, L90I, I123V, N205S

NS1

99.7

T48A

NS2

G154D, I164V, I397M, I435V,

99.8

PB1

I435T

R54K, M66I, D195N, R251K,

99.7

PB2

R293K, V344M, I354L

Kết quả bảng 3.7 cho thấy, sự tƣơng đồng về axit amin của các protein

M1; M2; NS1; NS2; PB1; PB2 so với vi rút vắc xinA/California/07/09 đạt từ

99,2% (protein NS1) đến 99,9% (protein M2). Số axit amin thay đổi đƣợc xác

định nhiều nhất tại protein PB2 (7 axit amin), tiếp theo là các protein PB1 (5

axit amin), protein NS1 (4 axit amin), protein M1 (3 axit amin). Các protein

M2 và NS2 chỉ xác định có sự thay đổi thƣờng gặp là 1 axit amin.

Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein

M1,M2,NS1,NS2,PB1 và PB2.

Số vi rút Axit amin và vị Số vi rút có sự Protein Tỷ lệ (n/N%) phân tích trí thay đổi thay đổi (n)

(N)

50 M2

NS1 47

NS2

PB1 36

PB2 45

V80I M192V K230R D21G L59I L90I I123V N205S T48A G154D I164V I397M I435V I435T R54K M66I D195N R251K R293K V344M I354L 19 10 10 10 10 18 47 11 11 8 7 13 10 13 13 9 9 17 13 20 20 38.0 20.0 20.0 20.0 21.3 38.3 100 23.4 23.4 22.2 19.4 36.1 27.8 36.1 28. 9 20.0 20.0 37. 8 28. 9 44.4 44.4

Kết quả bảng 3.8 cho thấy: tần suất thay đổi của Isoleusine (I) thành

Valine (V) tại vị trí 123 trên protein NS1 đạt 100%, ngoài ra tần suất thay đổi

axit amin thƣờng gặp chỉ dao động từ 19,4% (I397M trên protein PB1) đến

44,4 % (V344M và I354L trên protein PB2).

3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại

Việt Nam, 2009-2013.

Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm đƣợc đánh giá thông qua khả

năng gây hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu một số loài gia cầm (gà, gà tây),

động vật có vú (ngựa, ngƣời nhóm máu O, chuột lang...), hoặc khả năng

tƣơng tác với kháng huyết thanh (antisera) tạo ra từ một vi rút cúm chuẩn (vi

rút dự tuyển vắc xin, phân týp các vi rút gốc...). Trong nghiên cứu này, đặc

tính kháng nguyên của vi rút cúm đƣợc đánh giá thông qua khả năng tƣơng

tác với kháng huyết thanh cừu (reference anti-sheep) đƣợc tạo ra từ phân týp

vi rút A(H1N1)pdm09 gốc (A/California/07/09) bằng phƣơng pháp ngăn

ngƣng kết hồng cầu. Đặc tính kháng nguyên thay đổi đƣợc nhận định khi hiệu

giá HI của vi rút lƣu hành thấp hơn hiệu giá của kháng nguyên chuẩn ≥ 4 bậc

(theo TCYTTG).

3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu.

Sử dụng vi rút vắc xin A/California/07/09 làm kháng nguyên chứng (chủng chuẩn) trên tổng số 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu đƣợc tiến hành phân tích đặc điểm kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI).

Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013.

Hiệu giá HI theo nhóm/ phân nhóm cây gia hệ Vi rút Hiệu giá HI Tổng số (n) Tỷ lệ % (n/N)

A/California/07/09

Vi rút nghiên cứu

1280 1280 640 320 1 2 3 4 5 6A 6C 7 1 4 9 4 5 3 17 8 2 3 5 2 4 4 4 51 19 5 68 25.3 6.7

n: Số lƣợng vi rút với các hiệu giá khác nhau

N: Số lƣợng vi rút trong nghiên cứu (N=75)

Kết quả bảng 3.9 cho thấy: số vi rút trong nghiên cứu có hiệu giá ngƣng

kết hồng cầu (HI) tƣơng đƣơng với kháng nguyên chứng (A/California/07/09)

(HI=1280) đƣợc xác định là 51 vi rút (chiếm 68%), số vi rút có hiệu giá HI

thấp hơn 2 bậc (HI=640) là 19 vi rút (chiếm 25,3%) và số vi rút có hiệu giá

HI thấp hơn 4 bậc (HI=320) là 05 vi rút (6,7%). Nhƣ vậy, có 6,7% vi rút trong

nghiên cứu có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên khi tƣơng tác yếu với kháng

huyết thanh chuẩn.

Kết quả bảng 3.9 cũng cho thấy: các vi rút có hiệu giá HI bằng hoặc thấp

hơn 2 lần kháng nguyên chứng phân bố tại tất cả các nhóm/phân nhóm trong

cây gia hệ, trong khi 05 vi rút có hiệu giá HI thấp hơn 4 bậc đều tập hợp trong

nhóm 6C (Hình 3.2).

3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các

thay đổi axit amin trong protein HA liên quan.

Hiệu giá HI là chỉ số để đánh giá sự thay đổi đặc tính kháng nguyên và

gắn liền với sự thay đổi trong gen HA, phân tích theo thời gian và sự thay đổi

axit amin tại mỗi nhóm hiệu giá HI khác nhau cho thấy:

Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian.

Hiệu

Số vi rút

Số vi rút tại các năm nghiên cứu (n) Số trung bình axit

giá HI

(N)

amin thay đổi

2009 2010 2011 2012 2013

51 10 13 6 2 20 2,3 1280

19 4 6 2 7 7,6 640

5 4 1 15,8 320

75 14 19 4 31 7 Tổng

Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian

Kết quả bảng 3.10, hình 3.10 cho thấy số vi rút đạt hiệu giá HI = 1280

hoặc HI = 640 chiếm ƣu thế và ghi nhận trong toàn bộ thời gian nghiên cứu

2009-2013. Số vi rút có hiệu giá thấp hơn 4 bậc (HI=320) đƣợc cho là có sự

thay đổi đặc tính kháng nguyên chỉ xuất hiện với số lƣợng nhỏ (5 vi rút) trong

2 năm 2011 và 2013. Số axit amin trung bình thay đổi tại 51 vi rút có hiệu giá

HI=1280 là 2,3 axit amin, 19 vi rút có hiệu giá HI=640 là 7,6 axit amin và

HI=320 là 15,8 axit amin (bảng 3.10), nhƣ vậy số axit amin thay đổi trong

protein HA tƣơng đồng với sự giảm hiệu giá HI trong vi rút nghiên cứu.

3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc

giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir.

Sự thay đổi axit amin trên các protein của hệ gen vi rút cúm theo thời

gian là đặc điểm chung của vi rút cúm, tuy nhiên có một số thay đổi liên quan

đến thay đổi cách biểu hiện kiểu hình nhƣ: tăng khả năng gây nhiễm, thay đổi

đặc tính kháng nguyên, giảm độ nhạy cảm với thuốc kháng vi rút ... đã đƣợc

ghi nhận trong các nghiên cứu về đặc điểm di truyền của vi rút cúm và các sự

thay đổi đó đƣợc gọi là đột biến [11], [23]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

tập trung tìm các đột biến trên protein HA và NA liên quan đến:

 Thay đổi đặc tính kháng nguyên HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09: tại

các vị trí axit amin từ 155 đến 157.

 Tăng biểu hiện nặng khi nhiễm bệnh: protein HA tại vị trí axit amin 222

(D222G; D222N; D222E).

 Kháng thuốc oseltamivir: tại vị trí axit amin I117V, H275Y, N295S trên

protein NA

3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide.

Sử dụng kết quả phân tích trình tự chuỗi nucleotide và dịch mã protein

gen HA và NA trong nghiên cứu, kết quả phân tích protein HA (bảng 3.3) đã

phát hiện:

- Có 05 vi rút xuất hiện đột biến từ Glycine (G) thành Glutamic (E) tại vị trí

155 (G155E) và Asparagine (N) thành Lysine (K) tại vị trí 156 (N156K)

trên protein HA có liên quan đến giảm khả năng tƣơng tác của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 với kháng huyết thanh chuẩn liên quan đến sự thay đổi

đặc tính kháng nguyên (hình 3.11) gồm 1 vi rút có đột biến phân lập năm

2011 và 4 vi rút có đột biến phân lập năm 2013.

- Có 1 vi rút có xuất hiện đột biến Aspartic (D) thành Asparagine (N) tại vị

trí 222 (D222N) trên protein HA liên quan đến sự khả năng tiến triển nặng

của bệnh nhân nhiễm vi rút (hình 3.11) đƣợc phân lập trong năm 2013.

Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút

cúm A(H1N1)pdm09.

- Có 01 vi rút có đột biến từ Histidine (H) thành Tyrosine (Y) tại vị trí 275

(H275Y) trên protein NA, có liên quan đến giảm nhạy cảm của vi rút với

Oseltamivir (Taminflu) đƣợc phân lập trong năm 2013 (hình 3.12).

Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09.

3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến

biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09.

3.4.2.1 Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) đánh giá khả năng thay đổi

đặc tính kháng nguyên.

Phân tích cụ thể kết quả bảng 3.9, bảng 3.10 trong nghiên cứu kết hợp

thu đƣợc từ phân tích protein HA cho thấy:

Bảng 3.11: Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K.

Năm

Đột biến trên

Nhóm/phân nhóm

Hiệu

Vi rút

phân lập

protein HA

cây gia hệ HA

giá HI

A/California/07/09 2009 Không 1 1280

A/ICD44 2011 320

A/KX3937 2013 320 G155E, A/ISO213089 2013 6C 320 N156K A/0713035 2013 320

A/TB5501 2013 320

Kết quả bảng 3.11 cho thấy: toàn bộ các vi rút mang đột biến G155E và

N156K trên protein HA đều có biểu hiện giảm khả năng tƣơng tác với kháng

huyết thanh chuẩn 4 bậc và đƣợc nhận định đã có sự thay đổi về đặc tính

kháng nguyên.

3.4.2.2 Xác định vi rút A(H1N1)pdm09 kháng thuốc trong nghiên cứu.

Trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen NA, chúng tôi đã xác định

đƣợc chủng A/Vietnam/IS0213167/2013 mang đột biến H275Y có liên quan

đến kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm. Sử dụng kết quả thực hiện thử

nghiệm ức chế neuraminidase đánh giá khả năng ức chế 50% số vi rút cúm

của oseltamivir đã đƣợc thực hiện năm 2013 tại PTN Trung tâm Cúm Quốc

gia - Viện Vệ sinh Dịch tễ TƢ, vi rút cúm A/Vietnam/IS0213167/2013 mang

giá trị IC50 125,02 thể hiện sự giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với

oseltamivir (số liệu PTN Cúm cung cấp).

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y

Đột biến trên Giảm độ nhạy Giá trị IC50 Vi rút protein NA (nM)±SD với Oseltamivir

A/Perth/265/2009s không Không 0,5

A/Perth/265/2009r H275Y 382 lần 191,3

A/IS0213167/2013 H275Y 250 lần. 125,02

So sánh với vi rút chứng không mang đột biến (A/Perth/265/2009s), vi

rút cúm A/IS0213167/2013 có giá trị IC50 cao hơn 250 lần và tƣơng tự vi rút

chứng mang H275Y (A/Perth/265/2009r), vi rút nghiên cứu đƣợc nhận định là

giảm khả năng tƣơng tác với oseltamivir (giảm độ nhạy) hoặc có biểu hiện

kháng oseltamivir.

3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin phòng cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.

Chúng tôi đã tiến hành phân tích 75 chủng vi rút trong nghiên cứu trên

cơ sở các kết quả phân tích về vật liệu di truyền (cây gia hệ HA và NA), đặc

tính kháng nguyên (hiệu giá HI) và khả năng khuếch đại trên tế bào MDCK

(hiệu giá HA) để lựa chọn vi rút A(H1N1)pdm09 có khả năng sử dụng để phát

triển vắc xin tại Việt Nam.

 Kết quả lựa chọn bằng phân tích đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA

và NA.

Kết quả cây gia hệ HA (hình 3.2) cho thấy phân nhóm 6C là nhóm tập

trung chủ yếu các vi rút phân lập vào năm gần đây nhất (năm 2013), với 24 vi

rút trên tổng số 75 vi rút nghiên cứu chiếm 32% (bảng 3.3). Về di truyền gen

HA của 24 vi rút ở phân nhóm 6C cũng có độ tƣơng đồng cao khi phân tích di

truyền gen NA (13/24 vi rút), đều tập trung trong phân nhóm 6B và 6C của

cây gia hệ NA (hình 3.4).

Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ

tƣơng đồng về di truyền học trên gen HA và NA.

Nhóm/ phân Nhóm/ phân

Số TT Vi rút nhóm cây gia nhóm cây gia

hệ HA hệ NA

A/Vietnam/HN36944/2013 1

A/Vietnam/HN36947/2013 2

A/Vietnam/HN36942/2013 3 6B A/Vietnam/HN36946/2013 4

A/Vietnam/HN36945/2013 5

A/Vietnam/37043/2013 6

A/Vietnam/NH13284/2013 6C 7

A/Vietnam/NH13111/2013 8

A/Vietnam/36978/2013 9 6C 10 A/Vietnam/37047/2013

11 A/Vietnam/37223/2013

12 A/Vietnam/IS0913135/2013

13 A/Vietnam/37047/2013

Tổng số 13 vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phân lập năm 2013 có đặc điểm

di truyền HA và NA tƣơng đồng đƣợc lựa chọn để tiến hành thử nghiệm xác

định khả năng khuếch đại vi rút trên hệ thống tế bào nuôi MDCK.

Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nhóm 6C (Bioedit 7.0.1)

ID Seq HA Group 6C-> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 No

1 A/Vietnam/IS0213085/2013 ID 0.996 0.995 0.995 0.995 0.994 0.996 0.995 0.995 0.995

2 A/Vietnam/NH13049/2013 0.996 ID 0.997 0.997 0.996 0.996 0.999 0.998 0.995 0.998

3 A/Vietnam/DK13120/2013 0.995 0.997 ID 0.996 0.995 0.995 0.998 0.996 0.993 0.996

4 A/Vietnam/NH13284/2013 0.995 0.997 0.996 ID 0.995 0.995 0.998 0.996 0.993 0.996

5 A/Vietnam/36947/2013 0.995 0.996 0.995 0.995 ID 0.996 0.996 0.996 0.993 0.996

6 A/Vietnam/37043/2013 0.994 0.996 0.995 0.995 0.996 ID 0.997 0.998 0.993 0.998

7 A/Vietnam/NH13111/2013 0.996 0.999 0.998 0.998 0.996 0.997 ID 0.998 0.995 0.998

8 A/Vietnam/HN36944/2013 0.995 0.998 0.996 0.996 0.996 0.998 0.998 ID 0.994 1

9 A/Vietnam/HN36979/2013 0.995 0.995 0.993 0.993 0.993 0.993 0.995 0.994 ID 0.994

10 A/Vietnam/HN36942/2013 0.995 0.998 0.996 0.996 0.996 0.998 0.998 1 0.994 ID

Kết quả bảng 3.14 cho thấy độ tƣơng đồng của các vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong nhóm 6C có độ tƣơng đồng từ 99,9% đến 100% trên

protein HA.

3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA)

Toàn bộ 13 chủng vi rút đƣợc lựa chọn (bảng 3.14) tiến hành thử

nghiệm ngƣng kết hồng cầu, để đánh giá khả năng khuếch đại của vi rút trên

hệ thống tế bào nuôi MDCK, thông qua hiệu giá HA sau 5 lần cấy chuyển với

xuất phát điểm HA ≥ 128 và kiểm tra đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng

ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) với kháng huyết thanh chuẩn (sheep antisera

A/California/07/09).

Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm

lựa chọn vắc xin dự tuyển.

Vi rút

HA gốc

M1

M4 M5

M2

Hiệu giá HA sau 5 lần cấy chuyển M3 Không thực hiện

Kết quả HI

Số TT 1

HN 36945

HN 36946

128

256

128

1280

HN 36947

128

256

512 >512

1280

HN 36942

128

1280

HN 36944

128

1280

37043

Không thực hiện

NH 13284

128

256 1280

256

NH 13111

128

640

36947

128

256

1280

36978

128

256

128

256 1280

37223

128

512

128

1280

37047

128

640

IS0913135

128

320

Hình 3.13 Kết quả khuếch đại vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự tuyển.

Kết quả bảng 3.15 cho thấy: có 11/13 vi rút có hiệu giá HA = 128 trƣớc

khi cấy chuyển và sau 5 lần cấy chuyển chỉ có 3/11 vi rút có sự tăng hiệu giá

HA ≥ 256 (HN36947; NH13284 và 36978), đƣợc xác định có khả năng

khuếch đại tốt trên hệ thống tế bào nuôi. Kết quả HI sau 5 lần cấy chuyển

cũng cho thấy đa số các vi rút (8/11 vi rút) ổn định về hiệu giá ngƣng kết

hồng cầu (HA) cho phép nghĩ đến sự tƣơng đồng cao về đặc tính kháng

nguyên sau quá trình cấy chuyển khi đạt hiệu tƣơng đƣơng với hiệu giá HI

của vi rút vắc xin chuẩn HI=1280 (Bảng 3.14).

Với kết quả phân tích trên, có 03 vi rút: A/Vietnam/HN36947;

A/Vietnam/NH13284 và A/Vietnam/36978/2013 có khả năng khuếch đại với

hiệu giá cao và ổn định về đặc tính kháng nguyên, tuy nhiên vi rút

A/Vietnam/36978/2013 trong quá trình khuếch đại, hiệu giá HA không duy trì

sự ổn định khi đã đạt ngƣỡng (HA giảm tại M4 và tăng lại tại M5) (bảng

3.14, hình 3.12). Nhƣ vậy có 2 vi rút A/Vietnam/HN36947 và

A/Vietnam/NH13284 trong nghiên cứu có khả năng sử dụng là vi rút dự

tuyển cho phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.

CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN.

4.1. Sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -

2013.

Sau 40 năm, kể từ đại dịch cúm châu Á (A/H3N2) xuất hiện tại Hồng

Kông năm 1967-1968, một lần nữa thế giới lại ghi nhận sự xuất hiện và gây

thành đại dịch trên toàn cầu của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 vào tháng 3 năm

2009 [109]. Đến tháng 5 năm 2009 xuất hiện tại Việt Nam là nƣớc thứ 54 trên

thế giới thông báo về sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Sự lan

rộng của vi rút tại các quốc gia, vùng lãnh thổ khác trên thế giới kể cả các

nƣớc ở Nam bán cầu, nơi mùa đông (mùa cúm) bắt đầu, ngày 11/6/2009 Tổ

chức Y tế Thế giới đã chính thức công bố một đại dịch mới cúm đầu tiên

trong thế kỷ XXI vi rút cúm A(H1N1)pdm09 [114]. Cũng giống nhƣ vi rút

cúm gây đại dịch ở thế kỷ trƣớc, sau khi gây bệnh và lan truyền với tốc độ

nhanh, cao trào trên toàn thế giới, đến ngày 10/8/2009 TCYTTG đã tuyên bố

chấm dứt giai đoạn biểu hiện đại dịch của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và vi

rút này tiếp tục lƣu hành nhƣ các vi rút cúm mùa A/H3N2 và B [109], [119].

Theo số liệu chƣơng trình Giám sát Cúm Quốc gia (NISS), sự xuất hiện

và lan rộng các chùm ca bệnh trong cộng đồng đã duy trì sự lan truyền của vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu cũng nhƣ tại Việt Nam, trong khoảng

thời gian từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2010, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã

lƣu hành chiếm ƣu thế. Sự tiếp tục lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

cũng là sự chấm dứt xuất hiện của vi rút cúm mùa A/H1N1, kết quả giám sát

của chúng tôi tƣơng tự với báo cáo của của hệ thống giám sát cúm toàn cầu

(GISRS). Sự thay thế và lƣu hành trong các năm tiếp sau đại dịch từ năm

2011 đến năm 2013 đã cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 hoàn toàn chuyển

đổi phƣơng thức lây truyền của vi rút cúm gây đại dịch thành vi rút cúm mùa

và các đặc điểm vi rút học cũng sẽ tiến hóa theo kiểu vi rút cúm mùa.

Với sự lƣu hành và gây dịch có tính chất theo mùa, việc theo dõi, giám

sát sự thay đổi về đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên và một số biểu

hiện gây bệnh liên quan của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ là một nhiệm vụ

trong giám sát cúm tại Việt Nam và của hệ thống giám sát cúm toàn cầu. Kết

quả nghiên cứu của chúng tôi đã đáp ứng các yêu cầu trong giám sát vi rút

học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam trong giai đoạn 2009-2013.

4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu.

Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi đƣợc xác định là toàn bộ chủng vi

rút cúm A(H1N1)pdm09, thu thập sau 72-96 giờ sau khi khuếch đại trên tế

bào MDCK đƣợc xác định nồng độ vi rút bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng

cầu gà (HA), có hiệu giá HA ≥ 8 đƣợc lựa chọn.

Mục đích phân tích trình tự 6 phân đoạn gen và protein tƣơng ứng (HA;

NA; M; NP; PB1 và PB2). Vì vậy lựa chọn vi rút trong nghiên cứu phải đảm

bảo đƣợc:

+ Đại diện theo thời gian lƣu hành

+ Đảm bảo tính đại diện theo khu vực (phân lập từ các điểm giám sát trong

hệ thống giám sát)

+ Đảm bảo chất lƣợng chủng vi rút.

Kết quả bảng 3.1 cho thấy tổng số 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

phân lập sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập trong giai đoạn 2009 –

2013, số lƣợng vi rút lựa chọn khác nhau phụ thuộc vào cƣờng độ lƣu hành

của vi rút tại các năm, vì vậy số lƣợng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong

nghiên cứu của chúng tôi thu thập với số lƣợng hạn chế 7 vi rút năm 2011 và

4 vi rút năm 2012. Số lƣợng vi rút đƣợc lựa chọn từ năm 2009 (14 vi rút) và

2010 (19 vi rút) cũng tƣơng đồng với cƣờng độ dịch tại các năm đó. Một yêu

cầu quan trọng trong nghiên cứu đó là chất lƣợng vi rút, với mục đích đảm

bảo sự thành công trong khuếch đại và tách các phân đoạn gen với các kích cỡ

khác nhau, chúng tôi lựa chọn các vi rút có nồng độ tƣơng đƣơng 8 đơn vị

ngƣng kết hồng cầu (HA ≥ 8), nên có thể thấy sự không tƣơng đồng về số

lƣợng vi rút sử dụng trong các năm 2009 - 2013. Điều này có thể giải thích, vi

rút phân lập tại năm 2009 và 2010 là những năm đầu của nghiên cứu có thể

bị tác động trong quá trình bảo quản, vì vậy khi tiến hành lựa chọn vi rút

bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (HA), số lƣợng vi rút đảm bảo tiêu

chuẩn sẽ bị hạn chế, điều này thể hiện rõ khi năm 2013 số lƣợng vi rút đƣợc

sử dụng là 31 (chiếm 41,4%) tổng số vi rút (bảng 3.1). Tuy nhiên, nghiên cứu

cũng đã đảm bảo một số lƣợng vi rút cần thiết đại diện cho toàn bộ giai đoạn

nghiên cứu.

4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen của

vi rút cúm A(H1N1)pdm09.

Vật liệu di truyền của vi rút cúm A bao gồm 8 phân đoạn gen, tuy nhiên

trong nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào 6 phân đoạn gen: HA, NA, M,

NS, PB1 và PB2. Dựa trên vai trò, chức năng của từng phân đoạn gen và

protein tƣơng ứng trong hoạt động chức năng của vi rút cúm A, chúng tôi lựa

chọn 6 phân đoạn gen tƣơng đƣơng 8 protein nghiên cứu với mục đích:

- Tìm hiểu sự thay đổi của kháng nguyên bề mặt (HA1, HA2, NA) liên quan

đến sự tiến hóa của vi rút cúm.

- Tìm hiểu sự thay đổi của một số axit amin liên quan đến khả năng làm

giảm sự cảm nhiễm (độ nhạy) của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir

trên protein NA.

- So sánh trình tự axit amin phát hiện các “dấu ấn” tại các vị trí đặc biệt trên

protein PB1, PB2, M1, M2 và NS để phân biệt giữa vi rút cúm ngƣời và vi

rút cúm gia cầm hoặc động vật khác đƣợc ghi nhận là các dấu hiệu của hiện

tƣợng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, căn nguyên tiềm tàng cho sự

xuất hiện một vi rút cúm mới có khả năng gây dịch hoặc đại dịch.

Kết quả chúng tôi đã tiến hành phân tích đƣợc trình tự gen của 75

protein HA, 52 protein NA và 50 protein M, 47 protein NS, 36 protein PB1 và

45 protein PB2 từ 75 chủng vi rút sử dụng trong nghiên cứu. Sự thành công

trong việc phân tách, khuếch đại và giải trình tự các phân đoạn gen của vi rút

cúm bằng phƣơng pháp RT- PCR phụ thuộc vào độ dài, tính ổn định, bản chất

protein của từng phân đoạn gen và điều kiện thực hiện kỹ thuật. Tuy số lƣợng

các phân đoạn gen đƣợc phân tích trong nghiên cứu khác nhau, nhƣng cũng

đảm bảo chất lƣợng của nghiên cứu khi kết quả phân tích của từng phân đoạn

gen đều có đại diện vi rút lƣu hành trong các năm nghiên cứu (Bảng 3.2).

4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 của vi rút

cúm A(H1N1)pdm09.

Phân tích cây gia hệ đƣợc tiến hành trên 6 phân đoạn gen của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 (hình 3.3 - hình 3.9) trong nghiên cứu cho thấy các vi rút lƣu

hành tại Việt Nam thƣờng tập trung thành nhóm theo năm: phân nhóm 6A;

6C của cây gia hệ HA là các vi rút lƣu hành năm 2013 (hình 3.3); nhóm 3 cây

gia hệ NA hoặc nhóm 2 cây gia hệ M, NS đƣợc tập trung các vi rút lƣu hành

năm 2009 - 2010 (hình 3.4; hình 3.6; hình 3.7)…. Kết quả trên cho thấy sự

tƣơng đồng về di truyền theo thời gian trong sự tiến hóa của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09. Trong 6 cây gia hệ đƣợc phân tích, sự phân tách thành nhiều

nhóm đƣợc quan sát tại cây gia hệ HA và NA (9 nhóm/phân nhóm), trong khi

các cây gia hệ khác chỉ phân tách thành 5-6 nhóm/phân nhóm (M, NS, PB1 và

PB2).

Kết quả trên cho thấy sự tiến hóa của các phân đoạn gen trong hệ gen

của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 không đồng đều, sự tiến hóa nhanh hơn của

phân đoạn gen HA và NA có thể giải thích do 2 phân đoạn gen này đƣợc biểu

hiện với chức năng kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm. Vì vậy sẽ chịu tƣơng

tác nhiều từ kháng thể kháng vi rút cúm tồn lƣu từ các vật chủ và sự thay đổi

nucleotide trong phân đoạn gen trong quá trình nhân lên trong vật chủ là kết

quả của quá trình gây nhiễm.

Sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu, kể từ khi xuất

hiện (3/2009) đến hiện tại đã đƣợc ghi nhận có sự tiến hóa nhanh thành 7

nhóm chính (từ nhóm 1 đến 7) qua phân tích gia hệ toàn hệ gen HA [8]. Kết

quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, sự tiến hóa và tách nhóm/phân

nhóm của gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam cũng tƣơng đồng với sự tiến hóa của vi rút này trên thế giới. Theo dõi tại

Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh châu Âu (ECDC) cho thấy: trong

thời gian lƣu hành 2009-2013, gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã

phân tách thành 7 nhóm từ vi rút gốc A/California/07/09 và các vi rút lƣu

hành trong năm 2013 tại châu Âu tập trung trong nhóm 6 và 7, các thông báo

khác tại Tunisia và Đài Loan cũng cho kết quả tƣơng tự [26], [35], [36]. Nhƣ

vậy vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có sự tƣơng đồng về gen

HA không chỉ với các vi rút lƣu hành tại các nƣớc láng giềng: Thái Lan,

Trung Quốc… mà còn tƣơng đồng với các vi rút lƣu hành trên thế giới trong

cùng thời gian.

Tƣơng tự, các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 đều thể hiện sự tƣơng

đồng cao về trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành

tại Việt Nam và các nƣớc láng giềng và trên thế giới trong thời gian nghiên

cứu. Ngoài ra, sự tƣơng đồng cao giữa các vi rút lƣu hành trong năm 2009-

2010 hoặc 2013 đƣợc ghi nhận rõ nét khi những vi rút này tập trung vào một

nhóm: nhóm 2 là vi rút lƣu hành 2009-2010; nhóm 6 là các vi rút lƣu hành

năm 2013. Kết quả quan sát đƣợc trên tất cả các cây gia hệ M, NS, PB1 và

PB2 trong nghiên cứu khẳng định chƣa xuất hiện sự trao đổi và tích hợp của

các phân đoạn gen này trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam, cho thấy sự ổn

100

định về di truyền học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 từ khi xuất hiện đến

hiện tại.

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đƣợc thực hiện chủ động, toàn

diện trong khuôn khổ hệ thống giám sát cúm quốc gia. Tuy phạm vi phân tích

mới chỉ tập trung đƣợc tại khu vực Bắc, Trung và Tây nguyên của Việt Nam,

nhƣng thông tin về sự tiến hóa di truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong

nghiên cứu cũng cho phép nhận định chung cho toàn Việt Nam khi các vi rút

sử dụng trong nghiên cứu có độ tƣơng đồng di truyền cao với các nƣớc láng

giềng và trên toàn cầu (hình 3.2 đến hình 3.9).

Các phƣơng pháp tiến hành và phần mềm phân tích số liệu trong nghiên

cứu đều đảm bảo cập nhật và tiêu chuẩn và đƣợc áp dụng hợp lý nên đảm bảo

tính chính xác, độ tin cậy của kết quả nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng thuật

toán Maximum likelihood trong xây dựng cây gia hệ các phân đoạn gen trong

nghiên cứu để có thể xác định xác suất tạo ra cây (tree) hoặc chiều dài của

nhánh (branch lengths) để có thể đƣa ra một mô hình cụ thể của quá trình tiến

hóa phân tử trên cơ sở các dữ liệu trình tự thu thập đƣợc.

Chúng tôi phân tích 6 cây gia hệ của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong

nghiên cứu đều sử dụng vi rút vắc xin A/California/07/09 làm gốc và các

nhóm trên cây đƣợc hình thành trên cơ sở giá trị boostrap >70 với sự lặp lại

của boostrap là 1000. Kết quả của chúng tôi cho thấy trên 3 cây gia hệ NA, M

và NS, các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 bắt đầu

xuất hiện trong nhóm 2, trong khi các cây gia hệ HA, PB1 và PB2 xuất hiện

các vi rút lƣu hành tại Việt Nam trong nhóm 1 cùng nhóm với vi rút vắc xin.

Thêm vào đó, các phân đoạn gen của một vi rút đơn lẻ cũng không thể hiện sự

tƣơng đồng khi phân đoạn gen HA có thể trong nhóm 6C trong khi phân đoạn

gen NA lại nằm trong nhóm 6B (bảng 3.15) có thể gợi ý sự tiến hoá không

đồng đều giữa các phân đoạn gen của một vi rút A(H1N1)pdm09.

101

Do cỡ mẫu phân tích thực tế trong một năm nghiên cứu không nhiều,

dao động từ 4 chủng vi rút năm 2011 đến 31 chủng vi rút năm 2013 nên phân

tích sự tiến hoá trong từng năm thông qua phân tích cây gia hệ không thể thực

hiện đƣợc, tuy nhiên tổng thể của 75 chủng vi rút trong giai đoạn nghiên cứu

cũng đủ thông tin về sự tiến triển của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại một quốc

gia và có góp phần hoàn thiện hệ thống giám sát cúm toàn cầu khi Trung tâm

cúm Quốc gia của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng là thành viên của hệ

thống giám sát.

4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2

của vi rút cúm A(H1N1)pdm09.

4.5.1. Protein HA

Protein HA và NA là các kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm có chức

năng quyết định các hoạt động lây nhiễm của vi rút cúm A tới vật chủ cũng

nhƣ kích hoạt cơ chế miễn dịch bảo vệ của cơ thể khi bị nhiễm vi rút cúm.

Protein HA đã đƣợc ghi nhận liên quan đến hoạt động dính bám vào thụ cảm

thể trong quá trình tiếp cận với tế bào chủ, quyết định độc lực của vi rút cúm

gia cầm hoặc ảnh hƣởng tới sự tiến triển nặng của bệnh cúm trên ngƣời.

Kháng thể tạo ra từ protein HA (kháng nguyên HA) có tầm quan trọng trong

cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể. Sự có mặt của kháng thể này làm bất hoạt

kháng nguyên HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút không

còn khả năng bám vào niêm mạc đƣờng hô hấp, do đó mất khả năng gây

bệnh. Sự thay đổi các axit amin trong protetin HA (đột biến) trong quá trình

tiến triển của vi rút cúm A sẽ ảnh hƣởng tới các hoạt động chức năng của vi

rút cúm [71], [126], [98], [105], [106]. Kết quả phân tích protein HA của vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự thay đổi

axit amin liên quan đến sự hình thành các nhóm (hình 3.2; bảng 3.3) khi sử

dụng vi rút A/California/07/09 làm gốc cây gia hệ. Các nhóm hình thành

102

trong cây gia hệ ngoài sự tƣơng đồng cao về nucleotide còn có sự tƣơng đồng

về thay đổi một số axit amin so với vi rút gốc và các axit amin này đƣợc coi là

axit amin chỉ điểm của nhóm/phân nhóm trong cây gia hệ (bảng 3.4). Ví dụ:

- Nhóm 1: P83S, I321V

- Nhóm 2: P83S, S203T, I321V

- Nhóm 3: P83S, S84N,S203T,I116M,I321V…

Nhƣ vậy S203T có thể gợi ý là axit amin chỉ điểm cho các vi rút thuộc

nhóm 2 hoặc S84N, I116M là axit amin chỉ điểm cho các vi rút

A(H1N1)pdm09 thuộc nhóm 3. Các dấu hiệu chỉ điểm này sẽ giúp cho các

nghiên cứu tiếp theo dịch tễ học phân tử của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại

Việt Nam, phân nhóm và định dạng đƣợc cấu trúc gia hệ phân đoạn gen HA

một cách nhanh chóng.

Tần suất về sự thay đổi axit amin trong protein HA của 75 chủng vi rút

cúm A(H1N1)pdm09 cũng có sự khác nhau, một số thay đổi đƣợc ghi nhận

trong toàn bộ vi rút nghiên cứu P83S và I321V (100%). Đột biến S203T đƣợc

xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7, với tần suất 87,5% (7/8

nhóm/phân nhóm), các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất

đạt 50% (4/8 nhóm/phân nhóm) và D97N, S451N đƣợc xác định 37,5% (3/8

nhóm/phân nhóm), trong khi một số axit amin thay đổi (đột biến) khác xuất

hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm vi rút (bảng 3.4). Kết quả trên cho thấy

một số đột biến đƣợc duy trì trong quá trình nhân lên và tái tạo các thế hệ vi

rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong các năm tiếp theo (ví dụ:

P83S và I321V) và cũng tƣơng đồng với sự thay đổi của các chủng

A(H1N1)pdm09 trong khu vực và trên thế giới. Ngoài ra đột biến có thể sẽ

làm thay đổi kiểu hình (chức năng) của vi rút nhƣ G155E, N156K, D222N đã

xuất hiện trên các chủng cúm trong nghiên cứu.

103

Protein HA của vi rút cúm thực hiện các hoạt động chức năng thông qua

5 khu vực kháng nguyên miễn dịch chính: Sa, Sb, Ca1, Ca2 và Cb, có vai trò

trong đáp ứng miễn dịch của vật chủ, khởi động sự sản xuất kháng thể bảo vệ

kháng vi rút cúm. Sự thay đổi (đột biến) tại các khu vực kháng nguyên hoặc

trên bề mặt protein HA có thể gây ảnh hƣởng quan trọng tới sự nhận dạng

kháng thể, cho phép vi rút trốn khỏi ảnh hƣởng của đáp ứng miễn dịch [8],

[22], [95]. Tuy nhiên, hiện tại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phân chia

thành nhiều nhóm gen nhƣng đều có biểu hiện một số thay đổi axit amin trên

protein HA tại các khu vực kháng nguyên Sa (N125D, K163T và S162H), Sb

(S185T và A186T), Ca1 (S203T và R205K) và Ca2 (A141S), những thay đổi

này không tạo sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên của vi rút so với vi rút

gốc (vắc xin) A/California/07/09 trong phản ứng HI khi sử dụng kháng huyết

thanh chồn sƣơng [118], [124]. Trong kết quả nghiên cứu này, các thay đổi

axit amin trên protein HA có tần suất xuất hiện cao (50% - 100%) đƣợc ghi

nhận trong các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 là P83S, I321V, S203T, D97N,

R223Q và E374K (bảng 3.4), các thay đổi nằm ngoài khu vực kháng nguyên

(trừ S203T), vì vậy không ảnh hƣởng tới khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với

vật chủ.

Trong nghiên cứu, chúng tôi phát hiện sự thay đổi tại vị trí 155, 156 trên

protein HA (G155E, N156K) trên 04 vi rút phân lập năm 2013 và 01 vi rút

phân lập năm 2011 khi phân tích trình tự axit amin protein HA của 75 chủng

vi rút. Các đột biến này nằm giữa các axit amin trong khu vực kháng nguyên

Sa (N125D, K163T và S162H), tuy không gây sự thay đổi về đặc tính kháng

nguyên của vi rút mang đột biến nhƣng theo các tài liệu của Mỹ, Nhật những

thay đổi này có thể làm giảm làm giảm khả năng tƣơng tác với kháng huyết

thanh chồn sƣơng trong phản ứng HI (HI = 320) thấp hơn 4 bậc khi so sánh

với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.9) [23], [36], [47]. Ngoài ra, đột

104

biến tại vị trí D222N trên protein HA cũng đƣợc phát hiện một chủng vi rút

phân lập năm 2013, đột biến này liên quan đến sự tăng tiến triển nặng của

bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 [8], [11]. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09

cũng giống các vi rút cúm mùa A/H3N2 hoặc B thông thƣờng gây bệnh nhẹ

tại đƣờng hô hấp trên và đƣợc xác định “xu hƣớng” gắn vào thụ cảm thể tế

bào chủ thông qua cầu axit sialic gắn liên kết với galactose bởi liên kết α2,6

(SAα2,6) có nhiều trong tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên, trong khi phần lớn

vi rút cúm gia cầm có “xu hƣớng” gắn bám theo kiểu SAα2,3 và thụ cảm thể

của tế bào đƣờng hô hấp dƣới tƣơng thích với kiểu gắn bám này.

Độc lực của vi rút cúm phụ thuộc vào khả năng gây bệnh thông qua các

protein vi rút và đáp ứng miễn dịch của vật chủ bao gồm cả miễn dịch bẩm

sinh, miễn dịch thu đƣợc trong quá trình sống. Trong một số nghiên cứu đặc

biệt là nghiên cứu trên vi rút cúm gia cầm A/H5N1, A/H7N9..., độc lực của vi

rút đƣợc xác định bởi một số các axit amin dƣ tại khu vực phân tách protein

HA1 và HA2 hoặc một số axit amin đặc biệt tại protein PB2, NS1.... Tuy

nhiên không giống các vi rút cúm gia cầm, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 chƣa

đƣợc ghi nhận các “dấu ấn” cụ thể liên quan đến độc lực của vi rút. Với vi rút

cúm ngƣời, vị trí biểu hiện độ đặc hiệu và ái tính của protein HA (Receptor

binding site –RBS) với thụ cảm thể vật chủ là một trong những yếu tố quyết

định sự tiếp nhận và lan truyền của vi rút cúm, có thể đánh giá là biểu hiện

độc lực của vi rút.

Sự thay đổi axit amin tại vị trí gắn thụ cảm thể của vi rút cúm là dấu hiệu

cảnh báo sự thay đổi tƣơng thích của vi rút cúm và tế bào chủ. Đột biến

D222G/N/E trên protein HA đã đƣợc ghi nhận tại Mỹ và Nauy, là “dấu hiệu”

độc lực tiềm tàng của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 liên quan đến các biểu hiện

nặng trên lâm sàng [8], [11]. Đột biến này đƣợc chứng minh là nguyên nhân

của sự giảm ái lực gắn bám của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với thụ cảm thể

105

SAα2,6 và tăng khả năng gắn bám với thụ cảm thể SAα2,3. Sự hiện diện của

các thụ cảm thể SAα2,3 tại phế nang của phổi có thể giải thích cho tiến triển

viêm phổi nặng do vi rút cúm sẽ dễ dàng tiếp cận và nhân lên tại khu vực

đƣờng hô hấp dƣới, các biểu hiện lâm sàng đƣợc ghi nhận giống nhƣ các

trƣờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 từng biết. Các đột biến khác D222E và

D222N trên protein HA cũng đƣợc ghi nhận trên vi rút cúm A(H1N1)pdm09

và cũng liên quan đến tiến triển nặng của bệnh nhƣ đột biến D222G, tuy nhiên

đột biến D222E không đƣợc ghi nhận là đột biến đặc hiệu liên quan đến tiến

triển nặng, khi đột biến này có thể phát hiện trong cả trƣờng hợp biểu hiện

nhẹ [12], [69], [72], [73], [87], [104], [105].

Kết quả điều tra hồi cứu bệnh nhân mang vi rút đột biến D222N trong

nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: bệnh nhân vào viện 24/11/2013 có biểu

hiện viêm phổi nặng đã đƣợc điều trị thuốc kháng vi rút oseltamivir và kháng

sinh đặc hiệu tại khoa điều trị tích cực, Bệnh viện Bạch Mai - Hà Nội nhƣng

bệnh nhân vẫn tiến triển nặng và tử vong sau 7 ngày nhập viện với biểu hiện

suy đa tạng. Đây là trƣờng hợp đầu tiên phát hiện đột biến D222N liên quan

đến tiến triển nặng và tử vong của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 tại

Việt Nam, tuy nhiên số tử vong do nhiễm vi rút cúm này ghi nhận không ít

(66 trƣờng hợp) từ 7/2009-7/2011. Vì vậy việc giám sát vi rút học cúm

A(H1N1)pdm09 đặc biệt các đột biến axit amin tại vị trí D222G/N/E, G155E,

N156K là rất cần thiết.

Kết quả giám sát có thể cung cấp các thông tin cảnh báo đến các bác sỹ

lâm sàng, giúp định hƣớng phác đồ điều trị hiệu quả và đặc biệt giám sát sự

lan truyền của các đột biến nguy hiểm này trong quần thể vi rút cúm

A(H1N1)pdm09, từ đó đánh giá nguy cơ tăng độc lực của vi rút và phát triển

các biện pháp điều trị, dự phòng hiệu quả.

106

4.5.2. Protein NA.

Cũng nhƣ protein HA, protein NA cũng là một kháng nguyên bề mặt của

vi rút cúm, với bản chất là enzyme có vai trò trong việc làm loãng chất nhầy ở

đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm

nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho

việc phá vỡ liên kết giữa vi rút đƣợc nhân lên và tế bào chủ giải phóng các vi

rút ra khỏi tế bào nhiễm. Dựa vào các hoạt động chức năng của protein NA,

thuốc kháng vi rút oseltamivir, zanamivir đƣợc phát triển với tác dụng ức chế

enzyme neuraminidase để hạn chế việc giải phóng vi rút cúm ra khỏi tế bào

nhiễm, giảm phát tán vi rút trong cơ thể. Kết quả phân tích protein NA trên 52

vi rút sử dụng trong nghiên cứu cho thấy các vi rút lƣu hành tại Việt Nam có

sự thay đổi (đột biến) so với vi rút vắc xin A/California/07/09 từ 1 - 9 axit

amin (bảng 3.5). Tần suất thay đổi axit amin tại các nhóm /phân nhóm trên

cây gia hệ NA khác nhau, sự thay đổi N248D đƣợc xác định trên toàn bộ các

vi rút nghiên cứu (100%), trong khi một số sự thay đổi khác xuất hiện với tần

suất thấp hơn: V241I; N369K (71,4%) (bảng 3.6)

Ngoài ra, sự đa dạng thay đổi tại một vị trí cũng đƣợc ghi nhận, ở vị trí

axit amin 83 trên protein NA khi sự thay đổi V83L (nhóm 5) và V83A (phân

nhóm 6C) (Bảng 3.5- 3.6). Kết quả trên cho thấy các thay đổi axit amin có tần

suất thay đổi từ 42,8% đến 100% đều tại các vị trí không ảnh hƣởng đến hoạt

động chức năng của neuraminidase và không gây hiện tƣợng kháng

oseltamivir (Tamiflu) của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch. Tuy vậy, trong

nghiên cứu này, vị trí đột biến H275Y cũng đƣợc phát hiện trên 01 vi rút

phân lập năm 2013. Hiện tƣợng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 với đột biến tại H275Y đƣợc ghi nhận lần đầu tại

Việt Nam vào tháng 7/2009 và tiếp tục xuất hiện trong một số vi rút lƣu hành

vào các năm 2009-2012 [53], [68]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi bổ sung

107

thêm dữ liệu về đột biến H275Y của vi rút A(H1N1)pdm09 trong năm 2013

dẫn đến tình trạng biến chuyển chống lại ảnh hƣởng của oseltamivir với vi rút

cúm A nói chung và vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nói riêng tại Việt Nam và thế

giới. Trong nghiên cứu này, hiện trạng sử dụng oseltamivir trong điều trị cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam chƣa đƣợc đề cập, vì vậy các thông tin về các

yếu tố dịch tễ liên quan, nguy cơ tiềm tàng của hiện tƣợng kháng oseltamivir

trong cộng đồng là hạn chế của nghiên cứu này. Ngoài đột biến H275Y, một

số đột biến khác cũng gây hiện tƣợng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir

hoặc zanamivir trên protein NA là N295S; I117V; D119G; I223/K/R/V và

S247N nhƣng không đƣợc phát hiện trong kết quả nghiên cứu 52 protein NA

vi rút cúm A(H1N1)pdm09 của chúng tôi.

Các thay đổi V241I; N369K trong nghiên cứu đƣợc xác định trên 5

nhóm/phân nhóm của cây gia hệ NA, các đột biến này cũng đƣợc báo cáo

trong một nghiên cứu tại Austrailia năm 2011 và ghi nhận trên các trình tự

NA trên ngân hàng gen. Để đánh giá vai trò của các đột biến tiềm tàng có khả

năng đóng vai trò bù đắp lại ảnh hƣởng khi vi rút mang đột biến H275Y gây

mất ổn định hoạt động chức năng của neuraminidase. Kết quả phân tích cho

thấy các thay đổi V241I và N369K xuất hiện năm 2010 và hiện tại duy trì trên

80% các vi rút đang lƣu hành trên thế giới và hồi phục lại 50% độ bền vững

(ổn định) của protein NA của vi rút bị mất bởi đột biến H275Y [55].

Trong nghiên cứu có đột biến axit amin tại V241I và N369K đƣợc ghi

nhận trong các vi rút phân lập trong giai đoạn 2011-2013 (nhóm/phân nhóm

5; 6B; 6C; 7A; 7B) trên protein NA (hình 3.4; bảng 3.5), tuy nhiên đánh giá

về độ tƣơng tác giữa V241I; N369K và H275Y trong duy trì sự ổn định chức

năng của neuramindase chƣa đƣợc thực hiện trong nghiên cứu này và sẽ gợi ý

cho định hƣớng cho các nghiên cứu tiếp theo trong giám sát vi rút học vi rút

cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.

108

4.5.3. Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2.

Các protein M1, M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 đƣợc dịch mã từ các trình

tự nucleotide của các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2 trong nghiên cứu.

Tiến hành so sánh với trình tự chuỗi axit amin của vi rút vắc xin

A/California/07/09 cho thấy sự tƣơng đồng về axit amin của các protein M1;

M2; NS1; NS2; PB1; PB2 đạt từ 99,2% (protein NS1) đến 99,9% (protein

M2). Số axit amin thay đổi đƣợc xác định nhiều nhất tại protein PB2 (7 axit

amin), tiếp theo là các protein PB1 (5 axit amin), protein NS1(4 axit amin),

protein M1(3 axit amin). Các protein M2 và NS2 chỉ xác định có sự thay đổi

thƣờng gặp là 1 axit amin (bảng 3.7). Một số thay đổi xuất hiện với tần suất

cao: I123V trên protein NS1 (100%), V344M và I354L trên protein PB2

(44,4%) trong khi các thay đổi khác đều duy trì tần suất thấp (bảng 3.8). Sự

xuất hiện các thay đổi trong 6 protein mã hóa từ 3 phân đoạn gen M, NS và

PB1 thƣờng liên quan đến sự tiến hóa của vi rút cúm trên vật chủ khác nhau

và từ các tƣơng tác chức năng của các protein này. Protein M2 gắn liền với

hoạt động thâm nhập vào tế bào chủ, lắp ráp và nảy chồi vi rút mới và đƣợc

chứng mình là có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch chéo giữa các phân týp khác

nhau của vi rút cúm A, ngoài ra protein M2 cũng là đích tác động của thuốc

kháng vi rút thế hệ đầu tiên – amatadine. Các đột biến trên protein này có liên

quan đến kháng amatadine đƣợc ghi nhận là L26F, V27A, A30V, A30T,

S31N và G34E. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến kháng amatadine

S31N, ngoài ra một đột biến khác L43T liên quan đến khả năng khóa kênh

vận chuyển ion tại vị trí gắn kết của rimantadine, đột biến này có nguồn gốc

từ vi rút cúm lợn và đƣợc cấu trúc vào protein M2 của cúm A(H1N1)pdm09

thông qua hiện tƣợng trao đổi và tích hợp (reassortment). Hoàn toàn giống vi

rút cúm vắc xin, A(H1N1)pdm09 có các đột biến kháng thuốc S31N và L43T

trên protein M2 đƣợc hiện diện trên toàn bộ các vi rút nghiên cứu. Các thay

109

đổi khác trên protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 so với vi rút vắc xin

A/California/07/09 đều không ghi nhận có ảnh hƣởng đến hoạt động kích hoạt

đáp ứng miễn dịch (NS1); độc lực của vi rút (PB1-F2); khả năng nhân lên và

lây truyền của vi rút (PB2) (bảng 3.8). Với kết quả thu đƣợc từ phân tích

protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 của chúng tôi cho phép nhận định ảnh

hƣởng của vật chủ (ngƣời) chƣa tác động nhiều đến sự tiến hóa của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam 2009-2013.

4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại

Việt Nam, 2009-2013.

Chúng tôi sử dụng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) và kháng

huyết thanh cừu A/California/07/09 (reference anti-sheep A/California/07/09)

để đánh giá đặc tính kháng nguyên của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

trong nghiên cứu. Với kết quả có 70 chủng vi rút (chiếm 93,3%) có khả năng

tƣơng tác tốt với kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá tƣơng đƣơng với vi rút

vắc xin A/California/07/09 (HI = 640-1280) cho phép nhận định rằng chƣa có

sự thay đổi đặc tính kháng nguyên trong hầu hết các vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2009-2013. Nhƣ vậy,

khả năng bảo vệ của vắc xin cúm mùa vẫn đảm bảo trong phòng nhiễm cúm

A(H1N1)pdm09. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận 05 vi rút

(6,7%) có khả năng tƣơng tác thấp (HI=320) với kháng huyết thanh chuẩn,

kết quả đã ghi nhận sự bắt đầu thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam và cũng phù hợp với báo cáo gần đây của

TCYYTG và một số nƣớc láng giềng. Kết quả phân tích protein HA của 05

chủng vi rút có tƣơng tác thấp với kháng huyết thanh chuẩn đều cho thấy xuất

hiện đột biến axit amin tại vị trí G155E, N156K, kết quả phù hợp với một số

nghiên cứu của Austrailia và Singapore [10], [23]. Trên cấu trúc tinh thể

protein HA, vị trí 155, 156 không nằm trong khu vực thụ cảm thể, tuy nhiên

110

thay đổi tại các vị trí này sẽ ảnh hƣởng đến khả năng kết bám, độ đặc hiệu, độ

bền vững của HA với tế bào chủ, giả thuyết này đã đƣợc chứng minh qua các

thử nghiệm in vitro, in vivo và phân tích qua máy tính [47]. Đặc biệt, đột biến

N156K đã làm thay đổi sự đặc hiệu của thụ cảm thể, làm mất khả năng ngƣng

kết hồng cầu đa dạng của vi rút cúm hoặc làm tăng tiềm năng ion hóa của

protein HA, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác của HA với kháng thể hoặc các gốc

carbonhydrate xuất phát từ cấu trúc của thụ cảm thể tế bào chủ. Với lý do đó,

các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến G155E, N156K sẽ có tƣơng tác

kém với kháng huyết thanh chuẩn.

Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

Nguồn: Colin Russell và Derek Smith, Đại học Cambrigde, Anh.

Với tỷ lệ thấp (6,7%) các chủng vi rút có mang đột biến G155E, N156K

và có biểu hiện thay đổi đặc tính kháng nguyên ghi nhận đƣợc trong nghiên

cứu này và đƣợc báo cáo tại một số nƣớc trên thế giới [47], [95], tính đến thời

111

điểm hiện tại đặc tính kháng nguyên của cúm A(H1N1)pdm09 vẫn ổn định.

Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát triển

bởi D.Smith trên cơ sở giá trị hiệu giá HI cũng cho thấy, phần lớn các vi rút

cúm A(H1N1)pdm09 duy trì đặc tính kháng nguyên tƣơng tự vi rút vắc xin

A/California/07/09 và tập trung với mật độ cao. Bên cạnh đó cũng có một

nhóm có đặc tính kháng nguyên thay đổi khi hiệu giá HI < 2 bậc pha loãng so

với vi rút vắc xin đều có đột biến xung quanh các vị trí từ 153 đến 157 trên

protein HA (hình 3.13). Kết quả này đã nhấn mạnh sự tiến triển tƣơng đồng

của vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và trên thế giới và tƣơng tự

với các vỉ rút cúm mùa khác A/H1N1 giai đoạn trƣớc đây hoặc A/H3N2.

Tuy không xác định đƣợc vị trí địa lý nhập/xuất của các vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, nhƣng kết quả trên cùng với các kết quả phân

tích gia hệ trong nghiên cứu cũng khẳng định sự khác biệt của vi rút cúm mùa

và vi rút cúm gia cầm A/H5N1 khi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm

A/H5N1 dƣờng nhƣ khác biệt giữa các vùng địa lý hoặc giữa các quốc gia.

Kết quả giám sát cúm gia cầm năm A/H5N1 tại Việt Nam cho thấy clade 1

chỉ xuất hiện tại miền Nam Việt Nam và Campuchia trong khi miền Bắc Việt

Nam và Trung Quốc kháng nguyên của vi rút A/H5N1 đƣợc xác định là clade

2.3.4 hoặc 2.3.2.1 hiện tại [41].

Gần đây, một số nghiên cứu trên chồn sƣơng hoặc gây nhiễm trên tế bào

cảm thụ (MDCK-SIAT1) các vi rút mang đột biến N156K kết quả cho thấy

đột biến này đƣợc duy trì và lan truyền trong các thế hệ sau, gợi ý khả năng

thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút, giảm hiệu quả bảo vệ vắc xin với

vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ xảy ra trong tƣơng lai [47]. Ngoài ra, trong quá

trình cấy chuyển trên động vật hoặc tế bào dƣới áp lực của đáp ứng miễn dịch

lựa chọn, cũng cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 mang N156K thế hệ mới sẽ

rất dễ đƣợc bổ sung thêm các đột biến khác xung quanh (N156K với G155E

112

hoặc N156K với K153E); hoặc tại khu vực đầu hình cầu của protein HA [95].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, toàn bộ 05 vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang

đột biến N156K đều đi kèm đột biến G155E (hình 3.11) và phù hợp với kết

quả HI với hiệu giá HI thấp hơn so với vi rút vắc xin A/California/07/09

(bảng 3.9).

Tiếp tục phân tích các vi rút mang đột biến sẽ bổ sung thêm các thông tin

để có thể định hƣớng vắc xin trong tƣơng lai và đề xuất các vi rút dự tuyển

vắc xin phù hợp cho thành phần vắc xin cúm mùa hàng năm.

4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI).

Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tƣơng tác của oseltamivir với vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến H275Y (A/Vietnam/IS0213167/2013)

đƣợc phát hiện trên phân đoạn gen NA trong nghiên cứu. Sử dụng kết quả của

Trung tâm cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng về thử nghiệm

ức chế neuraminidase (NAI) ức chế 50% số vi rút cúm bằng oseltamivir cho

phép đánh giá khả năng tƣơng tác của vi rút với thuốc kháng vi rút. Thử

nghiệm đƣợc thực hiện với các vi rút chứng (có hoặc không có đột biến

H275Y), kết quả cho thấy: vi rút mang đột biến H275Y trong nghiên cứu yêu

cầu một lƣợng oseltamivir cao hơn 250 lần so với vi rút chứng (không mang

H257Y) để ức chế đƣợc 50% hoạt động của oseltamivir. Nhƣ vậy vi rút này

đƣợc đánh giá theo TCYTTG là giảm mạnh khả năng tƣơng tác với

oseltamivir hoặc có biểu hiện kháng oseltamivir (giảm hiệu quả ức chế vi rút

>100 lần) (Bảng 3.12).

Giá trị độ nhạy với oseltamivir của vi rút trong nghiên cứu đƣợc xác định

là giảm 250 lần, tuy nhiên một số nghiên cứu giai đoạn trƣớc tại Việt Nam đã

phát hiện các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có mang

H275Y có giá trị giảm độ nhạy dao động từ 356 đến 2944 lần so với giá trị

ngƣỡng [53], [68]. Nhƣ vậy tuy cùng xuất hiện đột biến đặc hiệu kháng

113

oseltamivir (H275Y) nhƣng biểu hiện giảm độ nhạy của các vi rút khác nhau.

Biểu hiện sinh học (kiểu hình) là kết quả của cấu trúc di truyền (kiểu gen) và

thƣờng bị ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau (môi trƣờng, vật chủ...) sẽ

tạo ra sự đa dạng sinh học trong tự nhiên.

Nghiên cứu năm 2010 tại Pháp, về hiện tƣợng kháng oseltamivir của vi

rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến đặc hiệu H275Y cho thấy: mức độ

kháng oseltamivir sẽ tăng nếu vi rút có thêm đột biến I223R (giảm độ nhạy

6195 lần) và vi rút mang H275Y và I223R cũng sẽ kháng cả zanamivir (giảm

độ nhạy 16,5 lần) ở mức độ cao [71]. Ngoài ra, đột biến kép H275Y và

S247N cũng làm tăng biểu hiện kháng oseltamivir (giảm độ nhạy 5880 lần)

và zanamivir (giảm độ nhạy 5 lần) cũng đƣợc phát hiện tại Austrailia và

Singapore, 2009-2010 [56].

Trong nghiên cứu này của chúng tôi, vi rút A(H1N1)pdm09 chỉ mang

đột biến duy nhất H275Y liên quan đến kháng oseltamivir, vì vậy mức độ

biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir là 250 lần là phù hợp. Sử dụng

oseltamivir nhƣ thuốc đặc trị cho nhiễm vi rút cúm A, đặc biệt là nhiễm cúm

A/H5N1 tại Việt Nam đang đƣợc phổ biến rộng rãi, vì vậy khả năng tăng và

lan rộng các vi rút có biểu hiện kháng thuốc là có thể trong tƣơng lai. Để kiểm

soát đƣợc tình trạng kháng oseltamivir của vi rút cúm việc duy trì, tăng cƣờng

giám sát vi rút học sự lƣu hành vi rút cúm tại Việt Nam, đồng thời nâng cao

khả năng phát hiện hiện tƣợng kháng thuốc và xây dựng phác đồ điều trị phối

hợp thuốc hợp lý sẽ là các phƣơng pháp tích cực cần đƣợc quan tâm.

4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin phòng cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.

Vắc xin đƣợc xác định là công cụ hiệu quả nhất trong phòng chống

nhiễm vi rút cúm và đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới từ những năm 1960.

Hiện tại, vắc xin cúm lƣu hành thƣơng mại có thành phần gồm 3 loại vi rút

114

(A/H1N1pdm; A/H3N2 và B-Victoria hoặc B -Yamagata) hoặc 4 loại vi rút

(A/H1N1pdm; A/H3N2, B-Victoria và B-Yamagata), các vi rút thành phần

của vắc xin đƣợc lựa chọn hàng năm thông qua hệ thống giám sát cúm toàn

cầu của TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin cúm đã đƣợc thử nghiệm phát triển

tại một số công ty nhƣ: VABIOTECH (vắc xin cúm A/H5N1 hoặc

A(H1N1)pdm09), IVAC (vắc xin cúm A(H1N1)pdm09), POLYVAC.... Với

các công nghệ phát triển khác nhau: tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH),

tế bào MDCK (POLIVAC) hoặc trứng gà có phôi (IVAC), nhƣng đều sử

dụng các vi rút vắc xin từ TCYTTG là A/California/07/09. Tuy nhiên, sự lƣu

hành của vi rút cúm khác nhau về thời gian, phân týp vi rút cũng nhƣ sự nổi

trội của các phân týp khác nhau.... Chính vì vậy, việc tự lựa chọn cho mình vi

rút dự tuyển vắc xin và sản xuất vắc xin cúm từ vi rút dự tuyển đó là chiến

lƣợc phòng bệnh của một số nƣớc : Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Cuba,

Nga.... Việc sử dụng vắc xin trong nƣớc sản xuất, sử dụng vi rút lựa chọn từ

giám sát vi rút học trong nƣớc sẽ giúp cho hiệu quả phòng bệnh sẽ cao vì phù

hợp về thời gian (mùa), tƣơng đồng cao về đặc tính kháng nguyên đảm bảo

khả năng đáp ứng miễn dịch tốt.

Để góp phần vào việc phát triển một vắc xin phòng chống cúm

A(H1N1)pdm09 có hiệu quả tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của chúng tôi

đã giới thiệu 02 vi rút có khả năng sử dụng để phát triển vắc xin:

A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284. Hai vi rút này đƣợc lựa chọn

theo tiêu chí của TCYTTG áp dụng vào điều kiện Việt Nam là :

 Đại diện cho đa phần các chủng lƣu hành tại Việt Nam về di truyền cũng

nhƣ đặc tính kháng nguyên.

 Có khả năng khuếch đại tốt trên các hệ thống nuôi (tế bào hoặc trứng).

 Có tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên.

115

Trong lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin với mục đích đảm bảo tốt nhất

khả năng tạo miễn dịch trong quần thể (là vi rút đại diện cho phần lớn các vi

rút đang lƣu hành), tạo điều kiện thuận lợi cho các đơn vị sản xuất vắc xin có

thể giảm giá thành (do có khả năng khuếch đại tốt), thuận lợi trong quá trình

đánh giá chất lƣợng vắc xin (tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng

nguyên). Hai vi rút đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu đều ở phân nhóm 6C của

cây gia hệ HA hoặc 6A hoặc 6B của cây gia hệ NA, đây là nhóm tập trung

32% (24/75 vi rút - cây HA) của toàn bộ nghiên cứu và đƣợc phân lập trong

năm gần nhất của nghiên cứu 2013 (hình 3.2, hình 3.4; bảng 3.13).

Nhƣ vậy các vi rút đƣợc lựa chọn đảm bảo là vi rút thế hệ mới nhất

(phân lập năm 2013) và đảm bảo cho sự tiến triển (tiến hóa) cao về di truyền,

vì vậy sẽ có biểu hiện kháng nguyên mới nhất, cập nhật nhất trong thời điểm

hiện tại trong quần thể vi rút lƣu hành tại Việt Nam. Kết quả đánh giá khả

năng khuếch đại của vi rút cũng cho thấy, 2 vi rút dự tuyển vắc xin đều có khả

năng nhân lên và đạt hiệu giá ngƣng kết hồng cầu (HA) cao và ổn định sau 5

lần cấy truyền (bảng 3.14).

Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng tế bào MDCK và thực hiện 5 lần

cấy chuyển với mục đích hạn chế các thay đổi (đột biến) trong quá trình nhân

lên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và đảm bảo có hiệu giá khuếch đại tốt

nhất. Mỗi loại vi rút cúm có hệ thống nuôi cảm nhiễm khác nhau, các nghiên

cứu cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 dễ dàng nhân lên và khuếch đại trên

tế bào có nguồn gốc động vật (MDCK, Vero), trong khi vi rút cúm A/H3N2

lại ghi nhận có hiệu quả tốt khi sử dụng trứng gà có phôi [88]. Ngoài ra

nghiên cứu tại Nga cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả nhân lên và

khuếch đại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên tế bào MDCK và NHBE (human

bronchial epithelium cell – tế bào biểu mô phế quản ngƣời) đã gợi ý việc sử

dụng vi rút dự tuyển vắc xin có nguồn gốc từ tế bào MDCK sẽ có hiệu quả

116

cao trong phát triển vắc xin cúm giảm độc lực (innactivated vaccine) [58].

Thêm vào đó, việc ổn định đặc điểm di truyền của các vi rút vắc xin là rất

quan trọng, vì vậy việc sử dụng dòng tế bào MDCK sẽ hạn chế đƣợc sự thay

đổi (đột biến) của vi rút cúm trong quá trình nhân lên và khuếch đại so với sử

dụng trứng gà có phôi [88].

Sự ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên cũng đƣợc đánh giá

thông qua kết quả nhân lên của vi rút trong quá trình cấy chuyển 5 lần, kết

quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 02 chủng vi rút dự tuyển vắc xin lựa

chọn đều ổn định về đặc tính kháng nguyên trong quá trình cấy chuyển (hình

3.13). Khi vi rút duy trì ổn định đƣợc khả năng nhân lên trong các lần cấy

chuyển, sẽ cho phép xác định liều gây nhiễm cho sản xuất vắc xin đồng thời

lƣợng giá đƣợc hàm lƣợng protein HA thu đƣợc trong quá trình sản xuất và

kiểm soát DNA tế bào dƣ trong thành phần hỗn hợp vi rút, góp phần phát

triển và hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin trên tế bào.

Tổ chức Y tế Thế giới chỉ đề cử 1 chủng vi rút dự tuyển cho mỗi phân

týp trong thành phần vắc xin, trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu 2

chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt

Nam, nhằm tạo điều kiện cho các nhà sản xuất có sự lựa chọn cho các quy

trình sản xuất của mình khi việc sử dụng nguyên vật liệu nền, tại các cơ sở

sản xuất vắc xin tại Việt Nam khác nhau: sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát

(VABIOTECH), trứng gà có phôi (IVAC) hoặc tế bào Vero (POLIVAC)....

Việc tƣơng thích vi rút vắc xin vào hệ thống nuôi để đạt hiệu quả khuếch đại

cao và ổn định cần có một sự so sánh nhất là trong giai đoạn đầu của phát

triển vắc xin tại Việt Nam, khi các quy trình sản xuất đang từng bƣớc hoàn

thiện.

Sau 4 năm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 xuất hiện và lƣu hành tại Việt

Nam cũng nhƣ trên thế giới, các nghiên cứu giám sát sự tiến hóa của vi rút,

117

phát triển vắc xin và đánh giá ảnh hƣởng của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã

đƣợc thực hiện và có nhiều kết quả có ý nghĩa khoa học. Nghiên cứu của

chúng tôi, lần đầu tiên có cơ hội tiến hành một cách hệ thống, theo dõi đƣợc

sự tiến triển về di truyền học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam từ

khi xuất hiện đến hiện tại. Tất cả các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này

sẽ có ý nghĩa khoa học lớn hơn khi công tác giám sát vi rút học tiếp tục đƣợc

duy trì và mở rộng trong những năm tiếp theo, những thông tin cập nhật của

vi rút cúm sẽ góp phần không nhỏ trong công tác phòng chống bệnh và đảm

bảo sức khỏe cho cộng đồng Việt Nam.

118

KẾT LUẬN

1. Đặc điểm di truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt

Nam 2009 - 2013.

- Các phân đoạn gen đƣợc phân tách thành nhiều nhóm/phân nhóm khác

nhau trên cây gia hệ: 9 nhóm/phân nhóm trên phân đoạn gen HA và NA

hoặc 5-6 nhóm/phân nhóm tại các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2.

- Sự tiến hóa của các phân đoạn gen trong nghiên cứu không đồng đều: phân

đoạn gen HA và NA tiến hóa nhanh hơn các phân đoạn khác.

- Các vi rút lƣu hành trong cùng thời gian (năm) tại Việt Nam có sự tƣơng

đồng cao về di truyền và cũng tƣơng đồng với các vi rút lƣu hành tại các

nƣớc láng giềng hoặc trên thế giới trong giai đoạn nghiên cứu.

- Chƣa phát hiện sự trao đổi và tích hợp giữa các phân đoạn gen nghiên cứu

của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác lƣu hành trên

ngƣời và động vật.

- Một số đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình đƣợc ghi nhận: làm tăng

tiến triển nặng của bệnh (đột biến vị trí D222N), giảm tƣơng tác ngƣng kết

hồng cầu (đột biến vị trí G155E, N156K) trên protein HA và giảm độ nhạy

với oseltamivir (H275Y) trên protein NA phát hiện trên một số vi rút

A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu lƣu hành tại Việt Nam.

2. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09

- Phần lớn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu có đặc tính kháng

nguyên tƣơng tự với vi rút vắc xin A/California/07/09 (70 chủng vi rút chiếm

93,3%), 5 chủng vi rút (1 chủng vi rút phân lập năm 2011 và 4 chủng vi rút

phân lập năm 2013) có biểu hiện thay đổi đặc tính kháng nguyên (chiếm

6,7%) đều xuất hiện đột biến tại vị trí G155E, N156K trên protein HA, gợi ý

giảm hiệu quả bảo vệ vắc xin với vi rút cúm, dịch sẽ xảy ra trong tƣơng lai.

119

- Các đột biến khác tại vị trí D222N trên protein HA hoặc H275Y trên

protein NA đều không ảnh hƣởng đến đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu.

3. Lựa chọn và đề xuất vi rút dự tuyển phát triển vắc xin cúm

A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam

Đã lựa chọn 2 chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm tại Việt

Nam (A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284) đáp ứng đầy đủ 3 tiêu

chí của TCYTTG:

− Đại diện cho đa phần các vi rút cúm lƣu hành tại Việt Nam trong thời

điểm hiện tại về di truyền và đặc tính kháng nguyên.

− Có khả năng khuếch đại tốt trên hệ thống tế bào nuôi (trên trứng hoặc

tế bào MDCK)

− Có tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên.

120

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị:

1. Tiếp tục duy trì và mở rộng giám sát vi rút học vi rút cúm A(H1N1)pdm09

tại Việt Nam để phát triển các nghiên cứu tiến hóa của vi rút và phát triển

vắc xin phòng bệnh cho ngƣời dân Việt Nam.

2. Hoàn thiện phân tích di truyền của 2 phân đoạn gen còn lại NP và PA để

thu thập đầy đủ các thông số di truyền học, xác định và kiểm soát sự tiến

hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.

3. Phối hợp với các đơn vị sản xuất vắc xin tại Việt Nam, phát triển quy trình

sản xuất vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 trong quy mô phòng thí nghiệm.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Hoang Vu Mai Phuong, Nguyen Co Thach, Nguyen Le Khanh Hang, Nguyen Thi Kim Phuong and Le Quynh Mai (2013), “Oseltamivir

resistance among influenza viruses: surveillance in northern Viet Nam,

2009–2012”, Western Pacific Surveillance and Response Journal,

2013, 4(2), pp. 25–29.

2. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Lê Thị Quỳnh Mai (2014), “Vắc xin phòng

chống cúm: Lịch sử phát triển công nghệ hiện tại và tƣơng lai”, Tạp chí Y

học Dự phòng, 3(151), tr. 9-19

3. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Lê Thị Thanh, Ngô Hƣơng Giang, Nguyễn

Vũ Sơn, Phạm Thị Thu Hằng, Hoàng Vũ Mai Phƣơng, Trần Hải Anh

(2014), “Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm

A/H1N1pdm09 tại Việt Nam”, Tạp chí Y dược Lâm sàng 108, 9 (3), tr.118

-125.

4. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Trần Hải Anh, Nguyễn Vũ Sơn, Trần Thu

Hƣơng, Vƣơng Đức Cƣờng, Phạm Thị Hiền, Ngô Hƣơng Giang, Hoàng

Thu Hƣơng, Lê Thị Quỳnh Mai (2014), “ Sự phân tách gen HA của vi rút

cúm A/H1N1pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, năm 2009 – 2013” , Tạp chí

Y học Dự phòng, 8(157), tr. 8-15.

5. Nguyen Le Khanh Hang, Nguyen Thi Kim Phuong, Nguyen Co Thach,

Hoang Vu Mai Phuong, Le Thi Thanh, Vuong Duc Cuong, Nguyen

Phuong Anh, Tran Thi Thanh Loan, Nguyen Gia Binh, Le Quynh Mai

(2015), “Viological characterzation of influenza H1N1pdm09 in

Vietnam, 2010 – 2013”, Influenza and Other Respiratory Viruses, has

been accepted on April 30, 2015.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Y tế (2009), Thông báo /TB-DPMT, ngày 25/7/2009 của Bộ Y tế về tình

hình dịch cúm A(H1N1), Bộ Y tế.

2. Bộ Y tế (2009), Thông báo số 470/TB-BYT ngày 31/5/2009 về trường hợp

bệnh nhân cúm A(H1N1) đầu tiên tại Việt Nam, Bộ Y tế.

3. Nguyễn Trần Hiển (2011), Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề

tài Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng và vi rút học cúm A/H1N1/09

đại dịch tại khu vực miền Bắc, Trung và Tây Nguyên 2009 - 2010, đề xuất các

giải pháp phòng chống dịch Hà Nội.

4. Nguyễn Trần Hiển (2012), Cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, Nhà xuất

bản Y học, tr. 27 - 58.

5. Lê Văn Hiệp (2009), Bệnh cúm và vắc xin, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

6. Lê Thị Oanh (2011), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 298-

311.

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

7. Ampofo WK, Al Busaidy S, and Cox NJ (2013), "Strengthening the influenza

vaccine virus selection and development process: outcome of the 2nd WHO

Informal Consultation for Improving Influenza Vaccine Virus Selection held

at the Centre International de Conférences (CICG) Geneva, Switzerland, 7 to 9

December 2011", Vaccine, 31(32), pp. 3209-21.

8. Antón A, Pozo F, Niubó J, Casas I, and Pumarola T (2012), "Influenza

A(H1N1)pdm09 virus: viral characteristics and genetic evolution", Enferm

Infecc Microbiol Clin, 30(4), pp. 10 -17.

9. Baras B, S.K, Simon JH, Thoolen RJMM, Mossman SP, Pistoor FHM, et al

(2008 ), "Cross-protection against lethal H5N1 challenge in ferrets with an

adjuvanted pandemic

influenza vaccine", PLoS One 3(1), pp. DOI:

10.1371/journal.pone.0001401.

10. Barr IG, L Cui, N Komadina, R T Lee, et al (2010), "A new pandemic

influenza A(H1N1) genetic variant predominated in the winter 2010 influenza

season in Australia, New Zealand and Singapore", Eurosurveillance, 15(42).

11. Belser JA, Jayaraman A, Raman R, et al (2011), "Effect of D222G Mutation in

the Hemagglutinin Protein on Receptor Binding, Pathogenesis and

Transmissibility of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus", PLoS ONE,

6(9), pp. 25091.

12. Brand JM, Stittelaar KJ, and Amerongen G, (2010), "Severity of pneumonia

due to new H1N1 influenza virus in ferrets is intermediate between that due to

seasonal H1N1 virus and highly pathogenic avian influenza H5N1 virus", J

Infect Dis, 201(7), pp. 993-9.

13. Brands R, Visser J, Medema J, Palache AM, and Van Scharrenburg GJ,

(1999), "Influvac: a safe Madin Darby canine kidney (MDCK) cell culture-

based influenza vaccine", Dev Biol Stand, 98, pp. 93 -100.

14. Buonagurio DA, Nakada S, and Parvin JD (1986), "Evolution of human

influenza A viruses over 50 years: rapid, uniform rate of change in NS gene",

Science, 232, pp. 980–982.

15. Carr J, Ives J, and Kelly L (2002), "Influenza virus carrying neuraminidase

with reduced sensitivity to oseltamivir carboxylate has altered properties in

vitro and is compromised for infectivity and replicative ability in vivo",

Antiviral Res, 54, pp. 79-88.

16. CDC, (2009), "Influenza & Concern. Guidance to Influenza Laboratories.

17. CDC, (2009), "Pandemic H1N1/09 virus", Atlanta Journal, Available from

http://en.wikipedia.org/wiki/Pandemic_H1N1/09_virus.

18. CDC, (2009), "Type of Seasonal Influenza: September, 12, 2009. Available

from http://www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm

19. CDC, (2009 ), "Swine Influenza A (H1N1) Infection in Two Children

Southern California, March--April 2009", Weekly, 58(15), pp. 400-402.

20.

Centers for Disease Control and Prevention, (2003): Laboratory Techniques

for Influenza Diagnosis, Surveillance Coordinator’s Conference Atlanta,

Georgia, US.

21. Centers for Disease Control and Prevention, (2005): Laboratory Techniques

for Avian Influenza Diagnosis, Atlanta, Georgia, US.

22. Chen J and Deng YM, (2009), "Influenza virus antigenic variation, host

antibody production and new approach to control epidemics", Virol J, 6, pp.

30.

23. Cheng VC, To KK, Tse H, et al, (2012), "Two years after pandemic influenza

A/2009/H1N1 what have we learned?", Clin Microbiol Rev, 25(2), pp. 223-63.

24. China State Food and Drug Administration (SFDA), (2008), "Sinovac

Receives China State Food and Drug Administration (SFDA) Approval for

Pandemic Influenza H5N1 Vaccine", Available from

http://www.sinovac.com/Investors/2008/4/c7r8015ko7.htm.

25. Chowell G, Echevarría-Zuno S, Viboud C, et al, (2011), "Characterizing the

Epidemiology of the 2009 Influenza A/H1N1 Pandemic in Mexico", PLoS

Med, 8(5).

26. Chuang J-H, Huang AS, Huang W-T, et al, (2012), "Nationwide Surveillance

of Influenza during the Pandemic (2009–10) and Post-Pandemic (2010–11)

Periods in Taiwan", PLoS ONE, 7(4), pp. 36120.

27. Clements ML, Subbarao EK, and Fries LF, (1992), "Use of single-gene

reassortant viruses to study the role of avian influenza A virus genes in

attenuation of wild-type human influenza A virus for squirrel monkeys and

adult human volunteers", J Clin Microbiol, 30, pp. 655-662.

28. Cross, K.J et al, (2001), "Mechanisms of cell entry by influenza virus", Expert

reviews in molecµlar medicine, 3(21), pp. 1-18.

29. DA. Steinhauer1, (1999), "Role of Hemagglutinin Cleavage for

the

Pathogenicity of Influenza Virus", Virology, 258(1), pp. 1-20.

30. Darby M and Caledonia N, (2014), "Panel of Influenza A and B Viruses for

Assessment of Neuraminidase Inhibitor Susceptibility", Isirv, 275, pp. 1-4.

31. Dawood F.S, Jain S., Finelli L., et al, (2009), "Emergence of a novel swine-

origin influenza A (H1N1) virus in humans", N Engl J Med, 360(25), pp.

2605-15.

32. De Jong, M.D, et al, (2005), "Oseltamivir resistance during treatment of

influenza A(H5N1) infection", N.Engl.J.Med, 353, pp. 2667-2672.

33. Di Liu, Weifeng Shi, Yi Shi, et al, (2013), "Origin and diversity of novel avian

influenza A H7N9 viruses causing human infection: phylogenetic, structural,

and coalescent analyses", The Lancet, 381(9881), pp. 1928-1932.

34. ECDC, (2009), "Planning Assumptions for the First Wave of Pandemic

A(H1N1) 2009 in Europe", Available from

http://www.ecdc.europa.eu/en/healthtopics/Documents/091111_Pandemic_(H

1N1)_2009_Planning_Assumptions_for_EU_EEA_countries.pdf

35. European Centre for Disease Prevention and Control, (2014), "Influenza virus

characterisation, summary Europe, April 2014, ECDC", surveillance report

Stockholm, Available from

http://www.ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/ERLI-Net-report-

Mar-2014.pdf.

36.

El Moussi A, Ben Hadj Kacem MA, Pozo F, Ledesma J, et al, (2013),

"Genetic diversity of HA1 domain of heammaglutinin gene of influenza

A(H1N1)pdm09 in Tunisia", Virology Journal, 10(1), pp. 150.

37. Ellis JS, Smith JW, and Braham S, (2007), "Design and validation of an H5

Taqman real-time one-step reverse transcription-PCR and confirmatory assays

for diagnosis and verification of influenza A virus H5 infections in human", J

Clin Microbiol, 45, pp. 1535-1543.

38. Enders KO Ng, Peter KC Cheng, and Antia YY Ng, (2005), "Influenza A

H5N1 detection", Emerg Inf Dis, 11, pp. 1303-1305.

39. European Medicines Agency (EMEA), (2008), EMEA recommends

authorisation of first pre-pandemic influenza vaccine, Available from

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Press_release/2009/

11/WC500015258.pdf.

40. European Union (EU), (May 8, 2007), Focetria®, the Novartis pandemic

influenza vaccine, receives European Union approval, Available from

http://cws.huginonline.com/N/134323/PR/200705/1124782_5_2.html

41. FAO, WHO, OIE, (2014), "Revised and updated nomenclature for highly

pathogenic avian influenza A (H5N1) viruses", Influenza and Other

Respiratory Viruses, 8(3), pp. 384–388.

42. Fraser C , Donnelly C.A., Cauchemez S., et al , (2009), "Pandemic potential of

a strain of influenza A (H1N1): early findings", Science, 324(5934), pp. 1557-

61.

43. Garten R.J, Davis C.T., Russell C.A., et al, (2009), "Antigenic and genetic

characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in

humans", Science, 325(5937), pp. 197-201.

44. Gibson UE, Heid CA, and Williams PM., (1996), "A novel method for real

time quantitative RT-PCR", Genome Res, 6(10), pp. 995-1001.

45. Greenberg ME, Lai MH, Hartel GF, et al, (2009), "Response after One Dose

of a Monovalent Influenza A (H1N1) 2009 Vaccine -- Preliminary Report",

New England Journal of Medicine, 361(25), pp. 2405–13.

46. Greg Dunn, (2014 ), "The Father of the Influenza Immunization Flu Shot "

Living Healthy 360. [Internet], Available from

http://www.livinghealthy360.com/index.php/the-father-of-the-influenza-

immunization-flu-shot-26134/.

47. Guarnaccia T, Carolan LA, Maurer-Stroh S, et al, (2013), "Antigenic Drift of

the Pandemic 2009 A(H1N1) Influenza Virus in a Ferret Model", PLoS

Pathogen, 9(5), pp. 1003354.

48. Harmon MW, P.A Rota, and HH Walls, (1988), "Antibody response in

humans to influenza virus type B host cell-derived variants after vaccination

with standard (egg-derived) vaccine or natural infection", J Clin. Microbiol,

26, pp. 333-337.

49. Hatta, M, P Gao, and P Halfmann, (2001), "Molecular basis for high virulence

of Hongkong influenza A viruses", Science, 293, pp. 1840-1842.

50. Herlocher ML, Ives J Carr J, Elias S, Truscon S, Roberts N, and Monto A S,

(2002), "Influenza virus carrying an R292K mutation in the neuraminidase

gene is not transmitted in ferrets", Antiviral Res, 54, pp. 99-111.

51.

Herlocher ML, Truscon R, Elias S, Yen HL, Roberts NA, Ohmit SE, and

Monto AS, (2004), "Influenza viruses resistant to the antiviral drug

oseltamivir: transmission studies in ferrets", J Infect Dis, 190, pp. 1627-1630.

52. Hirst GK (1942), "The quantitative determination of influenza virus and

antibodies by means of red cell agglutination", J. Exp. Med, 75, pp. 47-64.

53. Hoang Vu MP et al, (2013), "Oseltamivir resistance among influenza viruses:

surveillance in northern Viet Nam, 2009–2012", Western Pacific Surveillance

and Response Journal, 4(2), pp. 25–29.

54. Holland PM, Abramson RD, Watson R, and Gelfand DH, (1991), "Detection

of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3'

exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase", Proc Natl Acad

Sci U S A, 88, pp. 7276- 7280.

55. Hurt AC, Hardie K, Wilson NJ, et al, (2012), "Characteristics of a widespread

community cluster of H275Y oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza

in Australia", J Infect Dis, 206(2), pp. 148-57.

56. Hurt AC, Lee RT, Leang SK, Cui L, et al, (2011), "Increased detection in

Australia and Singapore of a novel influenza A(H1N1)2009 variant with

reduced oseltamivir and zanamivir sensitivity due to a S247N neuraminidase

mutation", Euro Surveill, 16(23), pp. 19884.

57. Hutchinson EC, Kirchbach JC, Gog JR, and Digard P, (2010), "Genome

packaging in influenza A virus", Journal of General Virology, 91(Pt2), pp.

313-28.

58.

Ilyushina NA, Ikizler MR, Kawaoka Y, and Rudenko LG, (2012),

"Comparative study of influenza virus replication in MDCK cells and in

primary cells derived from adenoids and airway epithelium", J Virol, 86(21),

pp. 11725-34.

59.

Ivves JA, Carr JA, Mende DB, and Tai CY, (2002), "The H274Y mutation in

the

influenza A/H1N1neuraminidase active site following oseltamivir

phosphate treatment leave virus severely compromised both in vitro and in

vivo", Antiviral Res, 55(2), pp. 307 - 317.

60. Jefferson T, Di Pietrantonj C, Rivetti A, Bawazeer GA, Al-Ansary LA, and

Ferroni E, (2010), "Vaccines for preventing influenza in healthy adults",

Cochrane Database Syst Rev, (7), p. CD001269.

doi:10.1002/14651858.CD001269.pub4. PMID 20614424.

61. Kamps B.S, Hoffmann C, and Preiser W, Influenza report 2006, 2006, Flying

Publisher: Wuppertal, Germany, pp. 24-27.

62. Karl G. Nicholson, Robert G. Webster, and A.J.H., (1998), "Virus Structure

and Replication: Textbook of Influenza, pp.29–108.

63. Kingsbury DW, "Orthmyxoviridae and thier replication: In: Fields Virology.

Raven Press; 2nd Ed, 1990, pp.1075-89.

64. Kistner O, Barett PN, Mundt W, Reiter M, Schober-Bendixen S, and Dorner

F, (1998), "Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate

influenza virus vaccine", Vaccine, 16, pp. 960-968.

65. Klimov, R. Garten, Russel, et al, (2012), "WHO recommendations for the

viruses to be used in the 2012 Southern Hemisphere Influenza Vaccine:

epidemiology,

antigenic

and

genetic

characteristics

influenza

A(H1N1)pdm09, A(H3N2) and B influenza viruses collected from February to

September 2011", Vaccine, 30(45), pp. 6461–71.

66. Lamb RA, Zebedee SL, and Richardson CD, (1985), "Influenza virus M2

protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell

surface", Cell Press, 40(3), pp. 627-633.

67. Lambert LC and F.A, (2010 ), "Influenza vaccines for the future," N. Engl. J.

Med, 363(21), pp. 2036–44, Available from

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21083388.

68. Le Q. M., W.H.F.L., Tran N.D., van Doorn H. R., Nguyen T.H., and Horby P.,

(2010), "A Community Cluster of Oseltamivir-Resistant Cases of 2009 H1N1

Influenza", The new England journal of medicine, 362(1), pp. 86-87.

69. Ledesma J, Pozo F, Pérez Ruiz M, Navarro JM, et al, (2011), "Substitutions in

position 222 of haemagglutinin of pandemic influenza A (H1N1) 2009 viruses

in Spain", J Clin Virol, 51(1), pp. 75-8.

70. Lee LG, CR Connell, and W Bloch, (1993), "Allelic discrimination by nick-

translation PCR with fluorogenic probes", Nucleic Acids Res, 21(16), pp.

3761–3766.

71. LeGoff J, Rousset D, Abou-Jaoudé G, et al, (2012), "I223R Mutation in

Influenza A(H1N1)pdm09 Neuraminidase Confers Reduced Susceptibility to

Oseltamivir and Zanamivir and Enhanced Resistance with H275Y", PLoS

ONE, 7(8), pp. 37095.

72. Liu Y, Childs R, Matrosovich T, Wharton S, et al, (2010), "Altered receptor

specificity and cell tropism of D222G hemagglutinin mutants isolated from

fatal cases of pandemic A(H1N1) 2009 influenza virus", J. Virol, 84(22), pp.

12069–74.

73. Matrosovich M, Matrosovich T, Carr J, et al, (2003), "Overexpression of the

alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity

to neuraminidase inhibitors", J Virol, 77(15), pp. 8418-25.

74.

J W McCauley and B W Mahy, (1983), "Structure and function of the

influenza virus genome", Biochem J, 211(2), pp. 281–294.

75.

McCullers JA , Van De Velde LA, Allison KJ, Branum KC, Webby RJ, and

Flynn PM, (2010), "Recipients of vaccine against the 1976 "swine flu" have

enhanced neutralization responses to the 2009 novel H1N1 influenza virus",

Clin. Infect, 50(11), pp. 1487-92. doi: 10.1086/652441.

76.

Murphy BR and Webster RG, (1990), "Orthomyxovirus: In: Fields Virology",

Raven Press, 2, pp. 1091-1152.

77. N Wilson and M G Baker, (2009), "The emerging influenza pandemic:

estimating the case fatality ratio", Euro Surveill, 14(26), pp. 19255.

78. Nagamine K, T Hase, and T Notomi, (2002), "Accelerated reaction by loop

mediated isothermal amplification using loop primers", Mol Cell, 16, pp. 223-

229.

79. Nasreen S, U.K.S, Azziz-Baumgartner E, Hancock K, Veguilla V, Wang D, et

al, (2013 ), "Seroprevalence of Antibodies against Highly Pathogenic Avian

Influenza A (H5N1) Virus among Poultry Workers in Bangladesh, 2009",

PLoS One 8(9), Available from

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3764173&tool=p

mcentrez&rendertype=abstract.

80. Neumann G, Noda T, and Kawaoka Y, (2009), "Emergence and pandemic

potential of swine-origin H1N1 influenza virus", Nature, 459(7249), pp. 931-

81. Neumann G , M R Castrucci, and Y Kawaoka, (1997), "Nuclear import and

export of influenza virus nucleoprotein", Journal of Virology, 71(12), pp.

9690-9700.

82.

Nguyen HT, D.N, Le MTQ, et al, (2009 ), "National influenza surveillance in

Vietnam, 2006-2007", Vaccine, 28(2), pp. 398–402.

83. Notomi T, H Okayama, and H Masubuchi, (2000), "Loop – mediated

isothermal amplification on DNA", Nucleic Acid Res, 28, E63.

84. Okomo-Adhiambo M, N.H, Sleeman K, Sheu TG, Deyde VM, Garten RJ,et al,

(2010 ), "Host cell selection of influenza neuraminidase variants: implications

for drug resistance monitoring in A(H1N1) viruses", Antiviral Res, 85(2), pp.

381–8.

85. Palmer JC and Dowdle WR, (1975), "Advanced Laboratory Techniques for

Influenza Diagnosis, Atlanta, Ga: Centers for Disease Control and Prevention,

U.S. Department of Health, Education and Welfare, Immunology Series No. 6,

Procedure Guide.

86. Powers DC, Smith GE, and Anderson EL, (1995), "Influenza A virus vaccines

containing purified recombinant H3 hemagglutinin are well-tolerated and

induce protective immune responses in healthy adult", J Infect Dis, 171, pp.

1595-1599.

87. Qu Y, Zhang R, Cui P, et al, (2011), "Evolutionary genomics of the pandemic

2009 H1N1 influenza viruses (pH1N 1v)", Virol J, 8, pp. 250.

88. Rocha EP1, Xu X, Hall HE, et al, (1993), "Comparison of 10 influenza A

(H1N1 and H3N2) haemagglutinin sequences obtained directly from clinical

specimens to those of MDCK cell- and egg-grown viruses", J Gen Viro,

74(11), pp. 2513-8.

89. Russell CA, Jones TC, Barr IG, Cox NJ, Garten RJ, Gregory V, et al, ( 2008),

"The global circulation of seasonal influenza A (H3N2) viruses", Science,

320(5874), pp. 340–6.

90. Samji Tasleem, (2009), "Influenza A: Understanding the Viral Life Cycle", J

Biol Med, 82(4), pp. 153–159.

91. Science News, (2008), "Survivors of 1918 flu pandemic protected with a

lifetime immunity to virus".

92. Sinovac Files Clinical Trial Application with CFDA for its Proprietary

Vaccine against Avian Influenza A(H7N9) Virus, (2014), "Preclinical

development completed for H7N9 vaccine candidates

that addresses

significant unmet medical need".

93. Smith DJ, L.A, and Jong JC De, (2004), " Mapping the Antigenic and

Genetic", Science, 305 (5682), pp. 371–6.

94. Steinhaer DA and Skehel JJ, (2002), "Gennetic of Influenza viruses", Ann Rev

Genet, 36, pp. 305-332

95. Strengell M, Ikonen N, Ziegler T, et al, (2011), "Minor Changes in the

Hemagglutinin of Influenza A(H1N1)2009 Virus Alter Its Antigenic

Properties", PLoS ONE, 6(10), pp. e25848.

96. Subbarao, E.K, W. London, and B.R Murphy, (1993), "A single amino acid

in the PB2 gene od influenza A viruses is determinant of host range", J.Virol,

67, pp. 1761-1764.

97. Sun Y, B.C., Xu K, Hu W, et al, (2010), "Immune protection induced on day

10 following administration of the 2009 A/H1N1 pandemic influenza

vaccine", PLoS One, 5(12), pp. e14270. doi: 10.1371/journal.pone.0014270.

98. Suzuki Y, Ito T, Suzuki T, et al, (2000), "Sialic acid species as a determinant

of the host range of influenza A viruses", J Virol, 74(24), pp. 11825-31.

99. Thai H.T.C, Le M.Q, Vuong CD, Parida M, Minekawa H, Notomi T, Hasebe

F, and Kouichi Morita, (2004), "Development and Evaluation of a novel Loop

– mediated isothermal amplification method of rapid detection of severe acute

respiratory syndrome coronavirus", J. Clin Microbiol, 42, pp. 1956-1961.

100. Thomas Rowe, Robert A Abernathy, Jean Hu-Primmer, William W

Thompson, Xiuhua Lu, Wilina Lim, Keiji Fukuda, Nancy J Cox, and JM Katz,

(1999), "Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human

serum by using a combination of serologic assays", 37 (4), pp. 937-943.

101. Tong S , Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, et al, (2012), "A distinct

lineage of influenza A virus from bats", Proc Natl Acad Sci U S A, 109(11),

pp. 4269-74.

102. Traynor K, (2012), " First quadrivalent flu vaccine approved", Am J

Health Syst Pharm, 69(7), pp. 538.

103. Treanor JJ, Kotloff K., Betts RF., et al, (1999), "Evaluation of trivalent, live,

cold-adapted (CAIV-T) and inactivated (TIV) influenza vaccines in prevention

of virus infection and illness following challenge of adults with wild-type

influenza A (H1N1), A (H3N2), and B viruses", Vaccine, 18 (9-10), pp. 899-

906. doi:10.1016/S0264-410X(99)00334-5. PMID 10580204.

104. Valli MB, Selleri M, Meschi S, et al, (2011), "Hemagglutinin 222 variants in

pandemic (H1N1) 2009 virus", Emerg Infect Dis, 17(4), pp. 749-51.

105. Vazquez-Perez JA, Isa P, Kobasa D, et al, (2013), "A (H1N1) pdm09 HA

D222 variants associated with severity and mortality in patients during a

second wave in Mexico", Virol J, 10, pp. 41.

106. Watanabe Y, Ibrahim MS, Ellakany HF3, et al, (2011), "Acquisition of

Human-Type Receptor Binding Specificity by New H5N1 Influenza Virus

Sublineages during Their Emergence in Birds in Egypt", PLoS Pathog, 7(5),

pp. 19.

107. WHO, (2009), "Availability of a candidate reassortant vaccine virus for the

novel influenza A (H1N1) vaccine development: IDCDC-RG15", Available

from www.who.int/csr/resources/.../swineflu/2009_05_27IDCDCRG15a.pdf.

108. WHO, (2009), "CDC protocol of Realtime RT PCR for swine influenzae

A(H1N1)", CDC, Atlanta, US.

109. WHO, (2009), "Evolution of a pandemic A(H1N1) 2009", Available from

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/78414/1/9789241503051_eng.pdf?ua

110. WHO, (2009), "Influenza A(H1N1)", WHO, April 29, 2009, Available from

http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_20090429/en/in

dex.html.

111. WHO, (2009), "Influenza A(H1N1) - update 18", WHO,

http://www.who.int/csr/don/2009_05_06d/en/.

112. WHO, (2009), "Swine influenza", WHO, April 27, 2009, Available from

http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_20090427/en/in

dex.html.

113. WHO, (2009), "Update. Influenza A (H1N1) Regional Report (31 May 2009)"

http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_frontpage&Itemid=1&lang=e

114. WHO, (2009), "World now at the start of 2009 influenza pandemic" WHO,

Available from

http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase

6_20090611/en/index.htm

115. WHO, (2010), "Clinical Aspects of Pandemic 2009 Influenza A (H1N1) Virus

Infection", N Engl J Med, 362(18), pp. 1708-1900.

116. WHO, (2010), "Influenza", WHO, June 30, 2010, Available from

http://www.who.int/topics/influenza/en/

117. WHO, (2014), "Influenza vaccine viruses and reagents", WHO,

http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/en/.

118. WHO, (2014), "Recommended composition of influenza virus vaccines for

use in the 2014-2015 northern hemisphere influenza season", Wkly Epidemiol

Rec, 89(10), pp. 93-104.

119. WHO (2010), "H1N1 in post-pandemic period", WHO, Available from

http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2010/h1n1_vpc_20100810/e

n/index.html.

120. WHO (2010), "Pandemic (H1N1)2009 - Update 112", WHO, Available from

http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/index.html.

121. WHO (2010), "Pandemic (H1N1)2009 - update 115", WHO, Available from

http://www.who.int/csr/don/2010_08_27/en/index.html.

122. Wilschut J.C, McElhaney J.E, and Palache A.M, (2006), "Influenza", 2nd

Edition, Mosby Elsevier, Philadelphia, PA, USA

123. Wright P.V.F, Neumann G, and Kawaoka Y, (2007), "Orthomyxoviruses. In:

Fields Virology, 5th Edition, (Eds. Knipe D.M., and Howley P.M.), Lippincott

Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, pp. 1691- 1740

124. Xie H, J.X, Li X, et al (2011), "Immunogenicity and cross-reactivity of 2009-

2010 inactivated seasonal influenza vaccine in US adults and elderly", PLoS

One, 6(1), pp. 16650 DOI: 10.1371/journal.pone.0016650.

125. Yen T. Nguyen , Samuel B. Graitcer, Tuan H. Nguyen, Duong N. Tran, Tho

D. Pham, Mai T.Q. Le, et al (2013), "National surveillance for inﬂuenza

and inﬂuenza-like illness in Vietnam, 2006 −2010", Vaccines, 31(40), pp.

4368-4374.

126. Yu-Chieh Liao, Hsin-Hung Lin, and Chieh-Hua Lin, (2013), "Monitoring the

antigenic evolution of human influenza A viruses to understand how and when

viruses escape from existing immunity", BioMed Centre, 6, pp. 227.

127. Zambon, M. and C. W. Potter, (2009), Influenza, in Principles and Practice of

Clinical Virology, Sixth Edition John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK, pp.

373–408.

PHỤ LỤC 1

1. Phƣơng pháp RT-PCR.

+ Bệnh phẩm: Bệnh phẩm dịch họng hoặc dịch phế quản đƣợc lấy ở những

bệnh nhân HCC theo định nghĩa ca bệnh của chƣơng trình giám sát cúm quốc gia, đƣợc bảo quản 2-80C trong khi vận chuyển tới phòng thí nghiệm theo quy định và cất giữ -800C cho đến khi sử dụng.

+ Sinh phẩm :

- Hệ thống mồi (Primer): sử dụng hệ thống mồi theo thiết kế của Viện

nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm quốc gia (NIID), Nhật bản.

Sản phẩm

Týp/

Mồi

Trình tự ( 5’-3’ )

khuyếch đại

Phân týp

(bp)

M30F2/08

ATG AGY CTT YTA ACC GAG GTC GAA ACG

244

(xuôi)

M264R3/08

TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGC AG

(ngƣợc)

H1 Conv-F1

TGC ATT TGG GTA AAT GTA ACA TTG

349

( xuôi)

A/H1N1/09

đại dịch

H1 Conv-R1

AAT GTA GGA TTT RCT GAK CTT TGG

( ngƣợc)

- Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps,

catalog 52904, Qiagen

- Bộ sinh phẩm dụng cho phản ứng RT - PCR: Qiagen Onestep RT- PCR

kit, catalog 210212.

 Đệm Qiagen Onestep RT- PCR, 5 x

 Dung dịch Q, 5 x

 Hỗn hợp dNTP (bao gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10mM cho mỗi

thành phần).

 Hỗn hợp enzyme Qiagen One-step RT-PCR (Omniscript TM, Sensiscript

TM and HotStarTaq DNA polymeraza)

 Nƣớc cất tinh khiết.

 RNase inhibitor (40U/µ) – Invitrogen.

 Chứng dƣơng: ARN virus cúm H1N1/09 đại dịch (do CDC cung cấp)

 Chứng âm:

Chứng âm tách chiết (Negative Extraction Control – NEC)

Chứng âm (No Template Control - NTC)

 Tiến hành

 Tách chiết vật liệu di truyền ARN từ mẫu bệnh phẩm: thực hiện theo

thƣờng quy của Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini

Kit, 250 preps, catalog 52904, Qiagen.

 Phản ứng RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction )

ARN tổng số đƣợc tách từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm cúm

A/H1N1 mới (Swine-like Influenza virus). Sau đó, ARN đƣợc cho vào hỗn

hợp RT-PCR với mồi đặc hiệu cúm A/H1N1 mới đƣợc thiết kế trên gen

M2 protein (Inf A) và cặp mồi đặc hiệu trên gene HA (Inf H1N1pdm09).

Sinh phẩm

Số lƣợng phản ứng (N)

Thể tích (l)

Đệm Q 5x

4xN

Đệm PCR 5x

4xN

dNTPs (kit)

0.8

0.8xN

3.6

3.6xN

Mồi xuôi (5 M)

3.6

3.6xN

Mồi ngƣợc (5 M)

Enzyme mix (kit)

0.8

0.8xN

0.1

0.1xN

RNase Inhibitor (40U/l)

Nƣớc cất tinh sạch

0.1

0.1xN

ARN mẫu

Tổng số

 Chu kỳ nhiệt.

Nhiệt độ 500C 950C 940C 720C 40C Chu kỳ nhiệt 500C 720C x40chu kỳ Thời gian 30:00 15:00 0:30 0:30 0:40 7:00 ∞

 Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose

 Chuẩn bị gel 2%:

o Đổ khuôn gel bằng khay điện di có cài sẵn răng lƣợc.

o Cho 2 g Agarose bột và 100 ml TBE vào cốc đong thuỷ tinh. Hoà tan

Agarose bằng lò vi sóng trong khoảng 3-4 phút, cho Agarose tan hoàn toàn. o Để nguội xuống khoảng 500C rồi cho 10 μl Ethidium bromide lắc đều, đổ

dung dịch Agarose này vào khay điện di có cài sẵn răng lƣợc. Sau khoảng

60 phút ở nhiệt độ phòng, khi gel đã đông, gỡ nhẹ nhàng răng lƣợc ra. Bảo quản gel ở 40C.

 Tra mẫu vào gel:

- Đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều dòng điện từ âm sang dƣơng rồi cho

TBE 1X ngập bản gel sao cho dung dich đệm cách mặt gel từ 1-2 mm.

- Cho 2 µl đệm đặt mẫu X 6 ( Loading Dye X 6) vào từng giếng của đĩa

microtitre hoặc trên giấy parafilm với số lƣợng tƣơng ứng với số mẫu cần

phân tích. Đệm Loading chứa 50% Glycerol vì vậy có tác dụng kéo ADN

xuống dƣới đáy của giếng điện di và còn chứa Bromophenol Blue có tác

dụng đánh dấu ADN trong quá trình chạy.

- Trộn 10 µl mỗi sản phẩm PCR với 2 µl đệm đặt mẫu X 6.

- Trộn 1 µl thang chuẩn ADN 100 bp hoặc 1000 bp với 9 µl TBE x1.

- Chuyển dung dịch đã đƣợc trộn với nhau vào trong các giếng của bản gel.

- Đóng nắp của bể điện di, chọn dòng điện 110V và thời gian 30 phút.

- Tắt máy chạy gel, chuyển gel sang máy đọc

 Soi và chụp ảnh gel:

- Rửa gel dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 giây.

- Cho bản gel ngay ngắn trên máy đọc gel, bật đèn tím để đọc gel.

- Chụp ảnh

 Nhận định kết quả

Kết quả đƣợc chấp nhận đƣợc khi:

o Chứng dƣơng có band tƣơng đƣơng với kích thƣớc theo thiết kế của cặp

mồi ( 244bp với cún A và 349 bp cho A/H1N1/09 đại dịch).

o Chứng âm phản ứng (NTC), chứng âm tách chiết (NEC) đều không xuất

hiện band

- Kết quả âm tính: sự xuất hiện sản phẩm PCR ở các vị trí không đặc hiệu

hoặc không có sự hiện diện của sản phẩm PCR.

- Dƣơng tính: sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài bằng độ dài chứng dƣơng.

2. Phƣơng pháp real time RT-PCR.

 Hệ thống mồi và probes: theo thiết kế của CDC- Mỹ.

Mồi và probe

Trình tự 5’-3’ GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG

Nồng độ 40uM 40uM 10uM 40uM 40uM 10uM 40uM 40uM 10uM 40uM 40uM 10uM

Flu A xuôi Flu A ngƣợc Flu A probe SW Inf A xuôi SW Inf A ngƣợc GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC SW Inf A probe CYA CTG CAA GCC CA”T” ACA CAC AAG CAG GCA GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA SW H1 xuôi CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC SW H1 ngược CA GAA TAT ACA “T”CC RGT CAC AAT TGG ARA A SW H1 probe AGA TTT GGA CCT GCG AGC G RNP xuôi GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT RNP ngƣợc TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG RNP probe

 Bộ sinh phẩm SuperScrip III Platium One-Step Quantitative RT-PCR

System (Invitrogen) catalog 11732-088.

 Chứng dƣơng: ARN virus cúm H1N1/09 đại dịch (do CDC cung cấp)

 Chứng âm:

Chứng âm tách chiết ( Negative Extraction Control – NEC)

Chứng âm (No Template Control - NTC)

 Tiến hành

- Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng

STT

Thành phần

Thể tích (ul)/ 1 pƣ Số lƣợng phản ứng (N)

2x PCR master mix

12.5

12.5xN

SuperScripIII

0.5

0.5xN

RT/Platium Taq Mix

4 Mồi xuôi

0.5

0.5xN

5 Mồi ngƣợc

0.5

0.5xN

Probe

0.5

0.5xN

7 Nƣớc tinh sạch

5.5

5.5xN

Tổng số

20 20xN

- Chia hỗn dịch phản ứng vào phiến nhựa 96 giếng theo sơ đồ:

1 Inf

2 Inf

3 Inf

4 Inf

5 Inf

6 Inf

7 Inf

8 Inf

9 Inf

10 Inf

11 Inf

12 Inf

A Sw Inf

A Sw

D RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP

Inf

A Sw

Inf A Sw H1

H RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP

- Cho ARN mẫu bệnh phẩm (S1-Sn) theo sơ đồ sau:

 Cài đặt chƣơng trình vào máy real time PCR

Tăng nhiệt trƣớc phản ứng

RT Bƣớc 1

Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2

Bƣớc 3

60oC trong 5 phút 50oC trong 30 phút 95oC trong 02 phút 95oC trong 15 giây 55oC trong 30 giây Bƣớc 4 PCR

44 chu kỳ Bƣớc 5

Bƣớc 6

Thu nhận tín hiệu huỳnh quang 72oC trong 30 giây Giữ ở 20oC Bƣớc 7

 Nhận định kết quả:

- Chứng âm sẽ không có tín hiệu huỳnh quang. Nếu có tín hiệu huỳnh quang

tại các giếng chứng âm chứng tỏ các phản ứng đã bị nhiễm. Khi đó nên làm

lại từ đầu theo dúng hƣớng dẫn.

- Dựa vào chứng RP để đánh giá chất lƣợng RNA (chỉ đánh giá đƣợc RNA

tách chiết từ mẫu bệnh phẩm của ngƣời): tất cả các bệnh phẩm có tín hiệu

huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc hoặc tại chu kỳ thứ 37 của phản ứng

đƣợc coi là đủ lƣợng RNA cho phản ứng.

- Mẫu đƣợc coi là dƣơng tính khi tín hiệu huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc

hoặc tại chu kỳ thứ 40 của phản ứng.

LỰA CHỌN CHỦNG VI RÚT DỰ TUYỂN

Vi rút A/H3N2

Vi rút Cúm B

Nam Bán Cầu

Bắc Bán Cầu

Vi rút A/H1N1

A/Moscow/10/9

9-like virus

B/Hong Kong/330/2001

2003-2004

2004

-like virus (dòng Victoria)

A/Fujian/411/20 02 - like virus

2004-2005

A/New

B/Shanghai/361/2002

2005

A/Wellington/1/

-like virus

2004-like virus

Caledonia/20/9 9-like virus

(dòng Yamagata)

2005-2006

A/California/7/2 004-like virus

2006

B/Malaysia/2506/2004

2006-2007

-like virus

A/Wisconsin/67

2007

(dòng Victoria)

/2005-like virus

2007-2008 A/Solomon Islands/3/2006

2008

B/Florida/4/2006

-like virus

A/Brisbane/10/2

2008-2009 A/Brisbane/59/

(dòng Yamagata)

007-like virus

2009

2007 -like virus

2009-2010

2010

B/Brisbane/60/2008

2010-2011

-like virus

A/Perth/16/2009

2011

(dòng Victoria)

-like virus

2011-2012

2012

A/California/7/

B/Wisconsin/1/2010

2012-2013

A/Victoria/361/

2009 -like

2011-like virus

2013

virus

-like virus (dòng Yamagata)

A/Victoria/361/

2013-2014

2011-like virus*

B/Massachusetts/2/201 2-like virus B/Brisbane/60/2008- like virus (quidrivalent)

QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN

PHỤ LỤC 2

Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013

Mã chủng STT Năm

Năm 2009

Năm 2010

A/Vietnam/HN-32043/2009 A/Vietnam/HN-32067/2009 A/Vietnam/KH-848/2009 A/Vietnam/TN-255/2009 A/Vietnam/TN-385/2009 A/Vietnam/HN-32060/2009 A/Vietnam/HU-730/2009 A/Vietnam/DN-1029/2009 A/Vietnam/HN-NN07/2009 A/Vietnam/HN-31916/2009 A/Vietnam/TN-374/2009 A/Vietnam/HU-727/2009 A/Vietnam/TN-364/2009 A/Vietnam/HN-33419/2009 A/Vietnam/HN-NN12/2010 A/Vietnam/HN-NN44/2010 A/Vietnam/HN-NN46/2010 A/Vietnam/HN-NN100/2010 A/Vietnam/HN-NN142/2010 A/Vietnam/HN-NN125/2010 A/Vietnam/HN-NN18/2010 A/Vietnam/HN-NN23/2010 A/Vietnam/HN-NN115/2010 A/Vietnam/HN-NN116/2010 A/Vietnam/HN-NN139/2010 A/Vietnam/HN-NN144/2010 A/Vietnam/HN-NN45/2010 A/Vietnam/HN-NN17/2010 A/Vietnam/HN-NN70/2010 A/Vietnam/HN-NN133/2010 A/Vietnam/HN-NN63/2010 A/Vietnam/HN-NN56/2010 A/Vietnam/HN-NN49/2010 Hiệu giá HA 16 16 16 16 32 16 32 32 32 16 16 16 32 32 32 32 64 64 32 64 64 64 64 64 64 32 16 32 32 32 64 32 32 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013

Năm 2011

Năm 2012

Năm 2013

A/Vietnam/HN-36484/2011 A/Vietnam/ICD-44/2011 A/Vietnam/IVP26/2011 A/Vietnam/SS0611135/2011 A/Vietnam/SS0611253/2011 A/Vietnam/HN36530/2011 A/Vietnam/2095/2011 A/Vietnam/IS0612067/2012 A/Vietnam/IS0212158/2012 A/Vietnam/IS0212364/2012 A/Vietnam/SS5512003/2012 A/Vietnam/IS0213085/2013 A/Vietnam/NH13049/2013 A/Vietnam/DK13120/2013 A/Vietnam/NH13284/2013 A/Vietnam/36947/2013 A/Vietnam/37043/2013 A/Vietnam/NH13111/2013 A/Vietnam/HN36944/2013 A/Vietnam/HN36979/2013 A/Vietnam/IS0913135/2013 A/Vietnam/HN36942/2013 A/Vietnam/HN36947/2013 A/Vietnam/HN36945/2013 A/Vietnam/HN36946/2013 A/Vietnam/2013369/2013 A/Vietnam/HN20216/2013 A/Vietnam/36978/2013 A/Vietnam/37047/2013 A/Vietnam/NH13246/2013 A/Vietnam/36955/2013 A/Vietnam/IS0213167/2013 A/Vietnam/36992/2013 A/Vietnam/IS0713070/2013 32 32 16 32 32 16 16 32 32 16 32 64 64 64 128 128 32 128 128 64 128 128 128 64 128 32 32 128 128 32 64 64 32 34 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67

Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013

Năm 2013

A/Vietnam/HN36983/2013 A/Vietnam/HN36955/2013 A/Vietnam/HN36954/2013 A/Vietnam/37223/2013 A/Vietnam/KX13037/3013 A/Vietnam/IS0213089/2013 A/Vietnam/0713035/2013 A/Vietnam/TB05501/2013 32 32 64 128 64 64 32 32 68 69 70 71 72 73 74 75

Xác nhận của cơ quan lấy mẫu nghiên cứu