Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học: Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n-hexan của cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh – Rubiaceae được tiến hành với hai mục tiêu sau: Chiết tách phân lập một số hợp chất tinh khiết từ phân đoạn N-Hexan, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
PHÂN ĐOẠN N-HEXAN CỦA CÂY AN ĐIỀN NÓN
HEDYOTIS PILULIFERA (PIT.) T.N.NINH - RUBIACEAE
Để hoàn thành luận văn này em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Dược
Huế đã tạo điều kiện cho em được làm luận văn tốt nghiệp.
Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô và cán bộ trong khoa Dược đã giúp
đỡ, ủng hộ và tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để em có thể tiến
hành các thử nghiệm trong quá trình làm luận văn.
TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật -
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giám định tên khoa
học cho đối tượng nghiên cứu.
Các anh chị, các bạn trong nhóm làm đề tài cũng như các bạn lớp Dược 5
đã giúp đỡ, động viên, trao đổi kiến thức và kinh nghiệm trong suốt quá trình
thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên về tinh
thần và hỗ trợ về vật chất để luận văn này được hoàn thành một cách tốt
nhất.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Khánh
Thùy Linh giảng viên bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Dược
– Trường Đại học Y Dược Huế người đã tận tình hỗ trợ, hướng dẫn và
truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Sinh viên
Lê Thị Thanh Phương
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên
cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả trong
luận văn này là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa
đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác.
Huế, tháng 5 năm 2016
13C-NMR 1H-NMR
: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Ac : Acetyl
Ab : beta-amyloid
ABTS : 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid
AD : Alzheimer’s disease
Alpha-TQ : α-tocopherol quinone
DPHH : 1,1-diphenylpicrylhydrazyl
: The half maximal effective concentration EC50
FTC : Ferricthio cyanate
HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation
HSQC : Heteronuclear single quantum correlation
: The haft maximal Inhibition concentration IC50
IL : Interleukin
MCF-7 : Tế bào ung thƣ biểu mô vú ngƣời
Me : Methy
MIC : Minimal Inhibitory Concentration
ppm : Parts per million
PTP1B : Protein tyrosine phosphatase 1B
SKC : Sắc ký cột
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
TBA : Thiobarbituric acid
TLTK : Tài liệu tham khảo
TNF-α : Tumor necrosis factor alpha
v/v : Thể tích/thể tích
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE) .............................................. 3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHI AN ĐIỀN (HEDYOTIS L.) .......................................... 3
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .................................................................... 3
1.2.2. Thành phần hóa học ................................................................................... 4
1.2.2.1. Lớp chất alkaloid ................................................................................. 4
1.2.2.2. Lớp chất flavonoid ............................................................................... 6
1.2.2.3. Lớp chất anthraquinone ...................................................................... 7
1.2.2.4. Lớp chất triterpenoid và sterol ............................................................ 8
1.2.2.5. Lớp chất iridoid ................................................................................... 9
1.2.2.6. Các hợp chất khác ............................................................................. 10
1.2.3. Tác dụng dƣợc lý và hoạt tính sinh học ................................................... 10
1.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .................................................................... 10
1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan. ........................................... 12
1.2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật ................................................................ 13
1.2.3.4. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm. ....................................................... 14
1.2.3.5. Hoạt tính chống loét .......................................................................... 14
1.2.3.6. Hoạt tính bảo vệ thần kinh ................................................................ 14
1.2.4. Công dụng ................................................................................................ 15
1.3. CÂY AN ĐIỀN NÓN HEDYOTIS PILULIFERA (Pit.) T.N.Ninh ................ 15
1.3.1. Vị trí phân loại ......................................................................................... 15
1.3.2. Đặc điểm thực vật – Phân bố ................................................................... 16
1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ............................................... 16
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 17
2.2. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 18
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................... 18
2.2.2. Máy móc – thiết bị ................................................................................... 18
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 18
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất ............................................................................ 18
2.3.1.1. Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần.............................................. 18
2.3.1.2. Phương pháp chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng ............................... 19
2.3.1.3. Phương pháp chiết pha rắn ............................................................... 19
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập .............................................................................. 19
2.3.2.1. Sắc ký cột hấp phụ ............................................................................. 19
2.3.2.2. Sắc ký lọc qua gel .............................................................................. 20
2.3.2.3. Sắc ký trao đổi ion ............................................................................. 20
2.3.2.4. Phương pháp sắc ký lớp mỏng .......................................................... 20
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc ................................................................ 21
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ......................................... 22
2.3.4.1. Phương pháp ...................................................................................... 22
2.3.4.2. Cách tiến hành ................................................................................... 22
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 23
3.1. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .................. 23
3.1.1. Quá trình chiết xuất .................................................................................. 23
3.1.2. Quá trình phân lập .................................................................................... 24
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC ................ 27
3.2.1. Xác định cấu trúc hợp chất HP1 .............................................................. 27
3.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất HP2 .............................................................. 30
3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ................................................... 32
Chƣơng 4: BÀN LUẬN .......................................................................................... 34
4.1. BÀN LUẬN CHUNG .................................................................................... 34
4.2. QUÁ TRÌNH THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU ............................................... 35
4.3. QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .............................................. 36
4.4. VỀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC ........... 38
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 43
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang
Hình 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis L. ..................... 5
Hình 1.2. Anthraquinone từ chi Hedyotis L. ............................................................. 8
Hình 2.1. Hình ảnh cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh) ........... 17
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây An điền nón ............................... 24
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất HP1 và HP2 từ phân đoạn H34 ...................... 27
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất HP1 ........................................................ 30
Hình 3.4. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP1 ............................................ 30
Hình 3.5. Cấu trúc hoá học của hợp chất HP2 ......................................................... 30
Hình 3.6. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP2 ............................................. 30
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của HP1 ....................................................................... 39
Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của HP2 ....................................................................... 39
Trang
Bảng 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis .......................... 5
Bảng 1.2. Flavonoid từ chi Hedyotis .......................................................................... 6
Bảng 1.3. Anthraquinone từ chi Hedyotis .................................................................. 7
Bảng 1.4. Một số triterpenoid và sterol từ chi Hedyotis ............................................. 8
Bảng 1.5. Những hợp chất iridoid phổ biến từ chi Hedyotis ...................................... 9
Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của chi Hedyotis ............................................... 10
Bảng 1.7. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của chi Hedyotis. ...................... 12
Bảng 1.8. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chi Hedyotis .......................................... 13
Bảng 1.9. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm của chi Hedyotis .................................. 14
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP1 và hợp chất tham khảo .................. 28
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP2 và hợp chất tham khảo .................. 31
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập đƣợc ...... 32
1
Thế kỉ 21 là thế kỉ sinh học và công nghệ sinh học [37]. Dƣợc liệu là tài
nguyên vô cùng quý giá đối với nền y học thế giới. Bên cạnh công tác điều tra,
thống kê các loài cây có tác dụng làm thuốc, các nhà khoa học đã đi sâu tìm hiểu,
nghiên cứu thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học của nó. Do đó, việc
nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính dƣợc học từ thực vật đang trở thành
trọng điểm trong nền y dƣợc học hiện đại của nhiều quốc gia trên thế giới.
Cùng với sự đi lên của nền công nghiệp hóa - hiện đại hóa, thế giới đang
phải đối mặt với nhiều cuộc chiến nhƣ bệnh tật, khủng bố, ô nhiễm môi trƣờng,
thiên tai. Trong đó, cuộc chiến chống nhiễm trùng đã và đang đặt nặng cho nền y tế.
Các bệnh truyền nhiễm là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở cả
trẻ em, thanh thiếu niên và ngƣời lớn, chiếm 16% nguyên nhân các ca tử vong mỗi
năm. Hầu hết các trƣờng hợp tử vong là ở các nƣớc thu nhập thấp và thu nhập trung
bình [73]. Từ năm 1945, với sự ra đời kháng sinh penicillin đầu tiên và tiếp sau đó
là kỷ nguyên của kháng sinh với hàng loạt kháng sinh mới ra đời đã cứu sống hàng
triệu bệnh nhân [62]. Tuy nhiên, một trong những vấn đề nan giải đối với thuốc
kháng sinh tân dƣợc hiện nay là hiện tƣợng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn
do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nƣớc
trên thế giới. Đấy là chƣa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây
ra, có khi dẫn đến tử vong. Chính vì vậy, gần đây, ngƣời ta nhắc nhiều đến kháng
sinh thực vật và có xu hƣớng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh tự
nhiên của cây cỏ.
Trong quá trình tìm kiếm và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của 207 dịch
chiết các cây thuốc ở miền Trung Việt Nam. Kết quả thu đƣợc cho thấy, cây An
điền nón – Hedyotis pilulifera thuộc chi Hedyotis là mẫu có hoạt tính kháng khuẩn
mạnh nhất và theo điều tra loài này đƣợc ngƣời dân ở vùng Bảo tồn Khe Trăn -
Thừa Thiên Huế sử dụng làm thuốc chữa các bệnh về đƣờng tiêu hóa và đau nhức
xƣơng khớp [18]. Ngoài ra, còn đƣợc ngƣời dân đồng bào Dao ở huyện Đồng Hỷ,
2
tỉnh Thái Nguyên dùng trị đái dắt, đái buốt, viêm họng sƣng amidan [8]. Tuy nhiên,
cho đến nay chƣa có nghiên cứu chính thức nào đƣợc công bố về thành phần hóa
học của cây này ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới. Vì thế, chúng tôi lựa chọn cây
An điền nón làm đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này với mong muốn có những
hiểu biết về mặt hóa học của cây Hedyotis pilulifera, làm tăng giá trị ứng dụng của
cây vào thực tế cuộc sống cũng nhƣ góp phần làm phong phú hơn những hiểu biết
về các cây thuộc chi Hedyotis. Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân
đoạn n-hexan của cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh –
Rubiaceae” đƣợc tiến hành với hai mục tiêu sau:
1. Chiết tách phân lập một số hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE)
Họ Cà phê (Rubiaceae) là một họ lớn và đa dạng. Cây gỗ, bụi cây cỏ hoặc
dây leo. Lá đơn, nguyên, mọc đối, có lá kèm, lá kèm có khi dính lại với nhau và lớn
nhƣ phiến lá, trông nhƣ có 4 hoặc 8 lá vòng. Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp thành
xim hay dạng đầu. Hoa đều, lƣỡng tính, mẫu 4-5. Đài 4-5, ít phát triển, dính với
bầu. Tràng 4-5, dính nhau, tiền khai hoa van, lợp hay vặn. Nhị nằm xen kẽ với các
thùy của tràng và dính vào ống hay họng của tràng. Bộ nhụy gồm 2 noãn dính nhau
thành bầu dƣới với 2 hoặc nhiều ô, mỗi ô có 1 đến nhiều noãn. Quả nang, quả mọng
hay quả hạch. Hạt có phôi nhỏ nằm trong nội nhũ [6].
Phân bố: Trên thế giới có 450 chi với 7000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở Việt Nam có trên 90 chi [2], [6].
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHI AN ĐIỀN (HEDYOTIS L.)
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Chi Hedyotis là một chi lớn trong họ Cà phê (Rubiaceae). Trên thế giới chi
này đã đƣợc ghi nhận có khoảng 500 loài, phân bố rộng ở khu vực cận nhiệt đới và
nhiệt đới, chủ yếu ở châu Phi và châu Á, thƣờng mọc ở trong rừng, ven rừng nơi đất
ẩm, từ vùng núi cao đến vùng đất cát ven biển [21]. Các loài thuộc chi Hedyotis
thƣờng có thân thảo hơi vuông, cao từ 30-85 cm. Lá nhỏ, phiến lá hẹp, có gân giữa,
gân phụ không nổi rõ. Hoa màu trắng hay vàng, mọc thành từng cụm ở nách lá hay
đỉnh nhánh [7].
Theo Phạm Hoàng Hộ, chi An điền nƣớc ta có khoảng 70 loài, chia làm 7
thứ, phân bố rải rác khắp cả nƣớc [7]:
H. ovatifolia (An điền lá xoan), H. oligocephala, H. pachycarpa, H.
corymbosa (Cóc mẵn), H. diffusa (An điền lan), H. herbacea (An điền cỏ), H.
heynii (An điền lữ đồng), H. arguta (An điền tinh), H. labialis (An điền môi), H.
biflora (An điền hai hoa), H. precox (An điền sớm), H. contracta (An điền ngắn),
H. valerianelloides, H. crassiflolia (An điền lá dày), H. dichotoma (An điền lƣỡng
4
phân), H. justiciformis (An điền xuân tiết), H. glabra (An điền không lông), H.
lineata (An điền lằn), H. pierrei (An điền pierre), H. chereevensis (An điền cheo-
reo), H. racemose (An điền chúm), H. scandens (An điền leo), H. elegans (An điền
thanh), H. scoparia (An điền chổi), H. chevalierii (An điền Chevalier), H. ternate
(An điền chụm ba), H. tetrangularis (An điền bốn cạnh), H. wallichii (An điền
wallichii), H. havilandii (An điền Haviland), H. effuse (An điền tràn), H. ampliflora
(An điền hoa rộng), H. umbellata (An điền tán), H. capitellata (An điền đầu), H.
macrosepala, H. simplicissima (An điền đơn giản), H. pterita (An điền cánh), H.
hedyotidea, H. krewanhensis (An điền Krewanh), H. lecomtei (An điền Lecomte),
H. petelotii (An điền Pếtlot), H. rudis (An điền nhám), H. brachiate (An điền
nhánh), H. vestita (An điền áo), H. auricularia (An điền tai), H. fraternal, H.
grandis, H. hispida (An điền phún), H. acutangula (An điền cạnh nhọn), H.
hirsutula (An điền phún), H. leptoneura (An điền gân mảnh), H. lindleyana (An
điền lindley), H. capitellata var. mollis (Dạ cẩm), H. nigrescens (An điền đen), H.
philippinensis(An điền Philippin), H. tonkinensis (An điền Bắc bộ), H. pinifolia (An
điền lá thông), H. merguensis (Răm núi), H. microcephala (An điền đầu nhỏ), H.
mouretii (An điền mouret), H. quocensis (An điền Phú Quốc), H. ovata (An điền
trứng), H. pressa (An điền sát), H. symplociformis (An điền dung), H.
multiglomerulata (An điền nhiều chụm), H. equisetiformus, H. trinervia (An điền ba
gân), H. pruinosa, H. bracteata, H. tenelliflora (An điền hoa nhỏ), H. uncinella var.
mekonggensis (An điền Cửu Long).
1.2.2. Thành phần hóa học
Nghiên cứu đầu tiên về chi Hedyotis đƣợc công bố năm 1933 ở Ấn Độ bởi
Dey và Lakshminarayan [51]. Qua các tài liệu thu thập đƣợc cho thấy thành phần
hóa học của chi Hedyotis gồm có các nhóm chất: alkaloid, flavonoid, antraquinone,
saponin và sterol, iridoid và lignan.
1.2.2.1. Lớp chất alkaloid
Một số alkaloid đã đƣợc phân lập từ một số loài Hedyotis nhƣ: H.
auricularia, H. chrysotrica, H. capitellata và H. capitellata var. mollis.
5
Bảng 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis
Alkaloid Loài Bộ phận Hợp chất TLTK
Bis-indole H. auricularia Rễ, thân Auricularine (1) [51]
H. chrysotricha Toàn cây Chrysotricine (2a, 2b) [55]
[59]
H. capitellata Phần trên mặt đất β-carboline Capitelline (3) Cyclocapitelline (4a) Isocyclocapitelline (4b)
[50]
H. capitellata var. mollis Phần trên mặt đất Hedyocapitelline (5) Hedyocapitine (6a, 6b)
Hình 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis
6
1.2.2.2. Lớp chất flavonoid
Flavonoid là một nhóm hợp chất khác đƣợc tìm thấy phong phú trong Họ Cà
phê cũng nhƣ trong một số loài thuộc chi Hedyotis.
Bảng 1.2. Flavonoid từ chi Hedyotis
Loài Flavonoid TLTK
H. diffusa - Kaempferol 3-O(2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D- [51]
glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside [39]
- Kaempferol 3-O(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D- [41]
galactopyranoside
- Quercetin
- Quercetin 3-O-glucopyranoside
- Quercetin 3-O-sambubioside
- Quercetin 3-O-sophorosid
- Quercetin 3-O-rutinoside
- Quercetin 3-O(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-
galactopyranoside
H. herbacea - Kaempferol 3-O-rutinoside [51]
- Kaempferol 3-O-glucoside
- Kaempferol 3-O-arabinopyranoside
- Quercetin 3-O-galactoside
H. dichotoma - Isovitexin [15]
H. verticillata - Kaempferitrin [25]
H. pressa - 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavon [4]
- 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavon-3-O-β-D-glucopyranosid
- Amentoflavon
7
1.2.2.3. Lớp chất anthraquinone
Bốn anthraquinone đầu tiên đã đƣợc phân lập từ H. diffusa từ năm 1986 [26].
Bảng 1.3. Anthraquinone từ chi Hedyotis
Loài Anthraquinone TLTK
H. diffusa - 2-methyl-3-methoxyanthraquinone (7) [51]
[35] - 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone (8)
- 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone (9)
- 2,3-dimethoxy-6-methylanthraquinone (10)
- 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-
methoxyanthraquinone (11)
- 2-hydroxy-7-hydroxymethyl-3-
methoxyanthraquinone (12)
H. dichotoma và - 1,4-dihydroxy-2,3-dimethoxyanthraquinone (13) [58]
H. herbacea - l,4-dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone
(14)
- 2,3-dimethoxy-9-hydroxy-l,4-anthraquinone (15)
- 2-hydroxymethyl-10-hydroxy-l,4-anthraquinone
(16)
H. capitellata - Capitellataquinone A-D (17-20) [16]
8
Hình 1.2. Anthraquinone từ chi Hedyotis
1.2.2.4. Lớp chất triterpenoid và sterol
Hơn 20 triterpenoid pentacyclic đã đƣợc phân lập từ chi Hedyotis, hầu hết
đƣợc phân lập từ H. lawsoniae và H. acutangula [27], [38].
Ba saponin triterpenoid mới, nudicaucin A, -B, -C đã đƣợc phân lập từ H.
nudicaulis cùng với một saponin đã biết, guaiacin D [40].
Bảng 1.4. Một số triterpenoid và sterol từ chi Hedyotis
Loài Tên của triterpenoid TLTK
H. acutangula - Isoarborinol [27]
- Arborinone
- Olean-12-ene-3β,28,29-triol
H. lawsoniae, - Oleanolic acid [38]
H. acutangula, - Ursolic acid [51]
H. corymbosa,
H. auricularia
9
H. lawsoniae - 3β,23-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid [38]
- 3β,24-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid
- 2α,3β,24-Trihydroxyurs-12-en-28-oic acid
H. nudicaulis - Nudicaucin A [40]
- Nudicaucin B
- Nudicaucin C
- Guaiacin D
1.2.2.5. Lớp chất iridoid
Bên cạnh flavonoid, iridoid cũng đƣợc tìm thấy phổ biến trong một số loài
thuộc chi Hedyotis.
Tính đến nay, ngƣời ta đã phân lập đƣợc hơn 30 iridoid từ 5 loài thuộc chi
Hedyotis bao gồm H. diffusa, H. corymbosa, H. tenelliflora, H. chrysotricha và H.
hedyotidea, trong đó có khoảng 25 hợp chất mới tại thời điểm đƣợc phân lập [39],
[41], [54], [56], [71].
Bảng 1.5. Những hợp chất iridoid phổ biến từ chi Hedyotis
Cấu trúc Tên của Iridoid
- Asperuloside R = Ac
- Deacetylasperuloside
R = H
- Asperulosidic acid methyl ester
R1 = Me, R2 = Ac - Asperulosidic acid R1 = H, R2 = Ac
- Scandoside methyl ester
R1 = Me, R2 = H
- Deacetylasperulosidic acid
R1 = R2 = H
10
1.2.2.6. Các hợp chất khác
Các hợp chất lignan chỉ đƣợc tìm thấy trong loài H. lawsonie gồm: Hợp chất
mới sesquilignan có tên là hedyotol A, -B, -C, -D và dẫn xuất acetyl của chúng, (+)-
pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-syringaresinol, (-)-dehydrodiconiferyl alcohol,
cũng nhƣ hợp chất mới dilignan, hedyotisol A, -B, -C [38], [46].
Một số chất chuyển hóa thứ cấp khác cũng đƣợc phân lập từ chi Hedyotis
bao gồm coumarins, scopoletin và fraxin từ H. dichotoma và arbutin, hydroquinone
monoglucoside từ H. herbacea [51].
Nhƣ vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu khoảng 15 loài trong tổng
số 500 loài của chi Hedyotis, chiếm khoảng 3% số loài, qua đó cho thấy còn rất
nhiều loài chƣa đƣợc nghiên cứu. Do đó, chi Hedyotis là nguồn tài nguyên triển
vọng cho công cuộc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới phục vụ cho quá trình
tìm kiếm thuốc mới.
1.2.3. Tác dụng dƣợc lý và hoạt tính sinh học
Qua các nghiên cứu đã báo cáo các loài thuộc chi Hedyotis có hoạt tính sinh
học phong phú và có ý nghĩa quan trọng.
1.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
H. corymbosa [65] - Ức chế sự phát triển của tế bào Dịch chiết ethanol từ lá ung thƣ máu ở ngƣời (k562)
Oldenlandoside - Chống ung thƣ bạch cầu [51]
[65] - Hiệu ứng độc tế bào chống lại Dịch chiết methanol MCF-7 (Tế bào ung thƣ biểu mô toàn cây vú ngƣời) với IC50 là
22,67mg/ml
11
H. diffusa Asperuloside và - Chống ung thƣ bạch cầu [51]
deacetylasperuloside
2-hydroxy-3- - Ức chế sự phát triển của các [64]
methylanthraquinone dòng tế bào ung thƣ SPC-1A,
và methoxy-2- Bcap37 và HepG2.
hydroxyanthraquinone - Thúc đẩy quá trình apoptosis ở [69]
tế bào THP-1 thông qua hoạt hóa
caspase-8 và ở tế bào U937
thông qua hoạt hóa caspase-3, p-
p38MAPK và giảm biểu hiện
của p-ERK1/2.
- Gây ra quá trình apoptosis ở tế [68]
bào MCF-7 bằng cách hoạt hóa Ca2+/calpain/caspase-4.
H. chrysotricha Chrysotricine, (24S)- - Ức chế sự phát triển của tế bào [57]
ergostane-3β,5α,6β- ung thƣ máu HL-60 và ung thƣ
triol gan SK-HEP-1 trên in vitro.
H. verticillata, Dịch chiết methanol - Ức chế dòng tế bào CEM-SS [14]
H. dichotoma, phần trên mặt đất gây bệnh ung thƣ bạch cầu
nguyên bào lympho T với giá trị H. capitellata,
H. nudicaulis, IC50 từ 21-45µg/mL.
H. corymbosa,
H. herbacea và
H. pinifolia
12
1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan.
Bảng 1.7. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
H. verticillata, Dịch chiết - Hoạt tính chống oxy hóa mạnh khi so [14]
H. dichotoma, methanol phần sánh với Vitamin E với tỷ lệ ức chế là 89-
H. capitellata, trên mặt đất 98% trong thử nghiệm FTC (ferricthio
H. nudicaulis, cyanate) và 60-95% trong thử nghiệm
H. corybomsa, TBA (thiobarbituric acid).
H. herbacea,
H. pinifolia.
H. herbacea Dịch chiết [14] - Loại bỏ gốc tự do tốt với IC50 có giá trị
methanol phần 32µg/ml.
trên mặt đất
H. corymbosa Dịch chiết - Hoạt tính chống oxy hóa mạnh trên mô [65]
methanol phần hình DPHH (1,1-diphenylpicrylhydrazyl),
trên mặt đất ABTS (2,2-azinobis-3-
ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid), loại
bỏ gốc tự do OH và NO với các nồng độ
tƣơng ứng là 82, 130, 150 và 170µg/ml.
- Khả năng bảo vệ gan tƣơng đƣơng với [24]
silymarin tại liều 200mg/kg thể trọng
chuột.
H. diffusa Quercetin - Ức chế tốt đối với quá trình peroxide hóa [41]
linoleic trên mô hình FTC và có khả năng [58]
bắt gốc tự do tƣơng đƣơng vitamine C trên
mô hình DPPH.
13
1.2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Bảng 1.8. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
H. capitellata, Thân cây, rễ - Tác dụng yếu đến trung bình trên: [14]
H. dichotoma và lá Bacillus subtilis B28, Bacillus subtilis B29,
Pseudomonas aeruginosa UI 60690 và Tụ
cầu kháng methicillin (MRSA)
H. corymbosa Dịch chiết - Hiệu quả trên cả vi khuẩn gram âm và [28]
methanol toàn gram dƣơng (Bacillus, Klebisella,
cây Escherichia coli, Proteus, Staphylococcus
aureus và Pseudomonas)
- Kháng nấm Candida albicans và [28]
Aspergillus nigar
- Ức chế sự phát triển của ký sinh trùng sốt [47]
rét MRC-pf20 và MRC-pf303 trong thử
nghiệm in vitro và in vivo
H. nudicaulis Nudicaucin A - Tác dụng kháng khuẩn yếu chống lại [40]
Nudicaucin B Bacillus subtilis M45 và H17
Nudicaucin C
14
1.2.3.4. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm.
Bảng 1.9. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
Dịch chiết - Ức chế quá trình viêm khoảng 40% so [43]
methanol từ với chất chuẩn ibuprofen là 45% tại cùng H. umbellata phần trên mặt mức liều 100mg/kg thể trọng chuột trên
đất mô hình gây viêm bằng carrageenan và
histamine.
Dịch chiết - Giảm đau, kháng viêm trên mô hình gây [34]
H. puberula methanol viêm bằng Carrageenan tại liều 400mg/kg
toàn cây thể trọng chuột.
Dịch chiết - Giảm đau tại hai liều uống thử nghiệm là [23] H. corymbosa ethanol 250 và 500mg/kg thể trọng chuột.
H. Dịch chiết - Hoạt tính kháng viêm (khoảng 40%) [14]
nudicaulis, methanol thông qua khả năng ức chế NO tại nồng độ
H. capitellata toàn cây 100 µg/mL.
1.2.3.5. Hoạt tính chống loét
Năm 2013, trên mô hình gây loét chuột bằng aspirin, cho chuột uống dịch
chiết cồn và dịch chiết nƣớc của H. corymbosa tại liều 400mg/kg thể trọng trƣớc khi
dùng aspirin 45 phút. Kết quả cho thấy khả năng ức chế vết loét của dịch chiết cồn
và nƣớc lần lƣợt là 65,7% và 33%, so với điều trị bằng lanzoprazole là 88,89% [13].
1.2.3.6. Hoạt tính bảo vệ thần kinh
Năm 2001, trong một tìm kiếm thử nghiệm sinh học các hợp chất bảo vệ thần
kinh từ cây thuốc, Youngleem Kim và các cộng sự đã tìm ra đƣợc dịch chiết
methanol của cây H. diffusa có năm glycosides flavonol và bốn glycosid iridoid O-
acylated. Chín hợp chất đều biểu hiện đặc tính bảo vệ thần kinh trên tế bào vỏ não
chuột bị tổn thƣơng bởi L-glutamate ở liều 0,1-10 µM [39].
15
1.2.4. Công dụng
Theo y học cổ truyền nước ngoài:
Theo y học cổ truyền Malaysia, thân và lá H. capitellata đƣợc dùng để điều
trị bệnh thận và phục hồi sau khi sinh [51].
Ở Ấn Độ, lá cây H. diffusa đƣợc dùng để chữa bệnh lậu, sốt. Lá và rễ cây H.
umbellata có tác dụng trị hen, viêm khớp, lao phổi, lá còn đƣợc dùng để đắp vào vết
thƣơng do côn trùng cắn. Toàn cây H. herbacea phơi khô, tán thành bột mịn, phối
hợp với mật ong trị sốt do viêm khớp, lá có tác dụng long đờm. Lá cây H. biflora
đƣợc dùng để hạ sốt, điều trị viêm nhiễm dạ dày và trầm cảm. Cây H. corymbosa
dùng để chữa sốt, sốt cách nhật, viêm dạ dày, trầm cảm, lo âu [65].
Ở Trung Quốc, hơn 20 loài thuộc chi này đã đƣợc sử dụng làm thuốc. Phổ
biến nhất là H. diffusa và H. corymbosa, đƣợc xem là thành phần chính có hoạt tính
của một số loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc có tác dụng chữa ung thƣ và nhiều
bệnh khác. H. diffusa cũng đƣợc phối hợp với nhiều dƣợc liệu khác trong các chế
phẩm thảo dƣợc dùng cho bệnh nhân ung thƣ đƣờng tiêu hóa và đƣợc cho là đặc
biệt hiệu quả đối với bệnh ung thƣ trực tràng [51].
Theo Y học cổ truyền nước ta:
Theo Phạm Hoàng Hộ, nhiều loài thuộc chi Hedyotis đã đƣợc sử dụng làm
thuốc ở nƣớc ta. An điền lan (H. diffusa): Chống ung thƣ, trị lậu, sốt, thiếu mật, bao
tử bị ung nhọt, trị bệnh gan, hạch,…An điền cỏ ( H. herbacea): Trị suyển, sốt, tê
thấp, trị nọc cắn. An điền hai hoa (H. biflora): Hạ nhiệt, bổ thần kinh, trị suy nhƣợc
thần kinh, trị ngứa ngáy bao tử. Cóc mẵn (H. corymbosa): Hạ nhiệt, kiện vị, bổ thần
kinh, trị rối loạn thần kinh, trị sốt ở bao tử, trị đau lá lách và sƣng gan, vàng da; lá
trị sốt. Dạ cẩm (H. capitellata var. mollis): Trị lở miệng, lở bao tử, đổ mồ hôi
nhiều. An điền tai (H. auricularia): Trị kiết, hoạt nhuận [7].
1.3. CÂY AN ĐIỀN NÓN HEDYOTIS PILULIFERA (Pit.) T.N.Ninh
1.3.1. Vị trí phân loại
An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh (tên đồng nghĩa:
Oldenlandia pilulifera Pit.) thuộc chi An điền (Hedyotis L.), họ Cà phê (Rubiaceae),
16
bộ Long đởm (Gentianales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) và ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) [7].
1.3.2. Đặc điểm thực vật – Phân bố
Cây thân cỏ, mọc leo, cành to 4mm, lúc non có lông mịn. Lá có phiến thon,
to 2-4×1-1,5cm, nhọn, đáy tù, có lông mịn, gân phụ 3-4 cặp, cuống ngắn, lá bẹ có 5-
6 lông gai. Hoa đầu trên cọng, ở chót nhánh, đài có tai tròn dài, có lông mịn, vành
có ống dài, có lông dày dài ở cổ, tiểu nhụy có chỉ dài 1,5mm. Quả nang 2×1,5mm,
hạt nhiều mỗi buồng, có màu đen [7].
Loài này đƣợc tìm thấy phân bố ở Việt Nam nhƣ Bắc Kạn, Thái Nguyên,
Nghệ An, Hà Tĩnh, Lâm Đồng, Quảng Trị [7]. Ngoài ra, cây An điền nón còn đƣợc
ghi nhận có ở Lào [49].
1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chƣa thấy các công bố nào về đặc điểm
vi học, thành phần hóa học, cũng nhƣ tác dụng sinh học của loài An điền nón ở Việt
Nam và trên thế giới.
17
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây An điền nón, mẫu đƣợc thu
tại huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị vào tháng 8 năm 2014. Tên khoa học đƣợc xác
định là Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh – Họ Cà phê (Rubiaceae). Tiêu bản mẫu
cây (kí hiệu VL-01) hiện đƣợc lƣu giữ tại phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và tài
nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt và tại Khoa Dƣợc −
Trƣờng Đại học Y Dƣợc Huế.
Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 - 60 C, sau đó
xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng.
Hình 2.1. Hình ảnh cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh)
18
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Hóa chất
Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc
Điển Việt Nam IV [3].
Dung môi đƣợc sử dụng bao gồm: methanol, ethanol, n-buthanol, ethyl acetat,
chloroform, n-hexan, aceton, toluen, formic acid, amoniac, dichloromethan, nƣớc
cất, acetic acid,...
Thuốc thử đƣợc sử dụng gồm có: dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong
ethanol tuyệt đối, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Dragendoff...
Chất nhồi sắc ký: silicagel pha thƣờng (silica gel 60 cỡ hạt 0.040-0.063 mm và
0,020-0,040 mm, Merck) và pha đảo (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.),
Sephadex LH-20, Diaion HP-20.
Ngoài ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM) pha thƣờng (Kielselgel 60
F254, Merck) và pha đảo (Rp 18, F254, Merck).
2.2.2. Máy móc – thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, đũa thủy tinh,
bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký,
pipette...
Cân phân tích hiện số Sartorius CPA224S, độ chính xác 0,0001 g.
Micropipette 100, 200, 500 µl (Human), micropipette 50 µl (Exel monopette
8000).
Máy chiết siêu âm Elmasonic S100H, bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay
Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không.
Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất
2.3.1.1. Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần
Phƣơng pháp chiết xuất đƣợc sử dụng là ngâm ở nhiệt độ thƣờng, sử dụng
dung môi methanol tuyệt đối. Quá trình chiết xuất gồm 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1
19
tuần. Trong quá trình ngâm, thỉnh thoảng có khuấy trộn, sau đó rút dịch chiết, thay
dung môi methanol mới và tiến hành đợt chiết tiếp theo.
Gộp dịch chiết thu đƣợc bốc hơi dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cao
toàn phần.
2.3.1.2. Phương pháp chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng
Phƣơng pháp chiết xuất lỏng-lỏng thực hiện bằng bình gạn thủy tinh. Cao
đặc thu đƣợc từ dịch chiết dƣợc liệu đƣợc phân tán vào nƣớc, sau đó lần lƣợt lắc với
các dung môi hữu cơ không tan trong nƣớc với độ phân cực tăng dần để thực hiện
phân tách các nhóm chất theo độ phân cực [5].
2.3.1.3. Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn đƣợc tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có kích cỡ khác nhau
tùy thuộc vào lƣợng mẫu đem chiết. Pha tĩnh hay sử dụng là silica gel pha thƣờng
(silica gel 60 cỡ hạt 0.040-0.063 mm và 0,020-0,040 mm, Merck). Cao đặc của
dƣợc liệu đƣợc tẩm với lƣợng vừa đủ silica gel rồi thực hiện cô loại dung môi thu
đƣợc bột khô tơi. Lƣợng bột khô này đƣợc đƣa lên cột sắc ký , sau đó rửa giải bằng
các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần [11].
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột (SKC) với các cơ chế
chủ yếu là cột hấp thu, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel. SKLM đƣợc sử dụng để
theo dõi quá trình rửa giải.
2.3.2.1. Sắc ký cột hấp phụ
Nguyên tắc: SKC hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử
trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua
còn pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy
mà có thể triển khai liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay
đổi từ yếu đến mạnh [3], [5].
Chất nhồi cột là silica gel pha thƣờng (silicagel 60 cỡ hạt 0.040-0.063 mm và
0,020-0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (Silica gel 30-50 µm, FuJisilisa
Chemical Ltd.).
20
2.3.2.2. Sắc ký lọc qua gel
Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20.
Nguyên tắc: sắc ký lọc qua gel là phƣơng pháp phân tách các phân tử trong
dung dịch dựa trên kích thƣớc của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các
phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó đƣợc pha tĩnh giữ lại
trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thƣớc lỗ của gel xác định khoảng kích thƣớc
phân tử đƣợc phân tách qua quá trình sắc ký [3].
Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt đƣợc sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại SKC
[5].
2.3.2.3. Sắc ký trao đổi ion
Cơ chế: Sắc ký trao đổi ion là phƣơng pháp phân tách các chất dựa trên ái lực
khác nhau của các ion trong dung dịch pha động với các nhóm chức hóa học mang
điện tích trên pha tĩnh. Trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn đƣợc
cấu tạo bởi các hạt polymer hình cầu (các hạt nhựa) mang các nhóm chức hóa học ở
dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. Nhựa trao
đổi anion mang nhóm chức có điện tích dƣơng nên bắt giữ các ion âm của pha
động; ngƣợc lại, nhựa trao đổi cation mang nhóm chức có điện tích âm nên bắt giữ
các ion dƣơng của pha động. Sự bắt giữ xảy ra nhờ lực hút tĩnh điện giữa hai điện
tích ngƣợc dấu. Hợp chất mang nhiều điện tích gắn mạnh vào pha tĩnh, hợp chất nào
mang ít điện tích gắn yếu và không mang điện tích không gắn, và ra khỏi cột trƣớc
[9].
2.3.2.4. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thƣờng (Kielselgel 60 F254,
Merck) và pha đảo (Rp 18, F254, Merck).
Nguyên tắc: SKLM là phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ trong
đó lƣợng chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất
hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình chạy sắc
ký, phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong
chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trị khác nhau [1], [11].
21
Các chất đƣợc phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 366
nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol phun đều
lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu [5].
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Việc xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết đƣợc thực hiện thông qua
phân tích dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) và so sánh với chất tham khảo
trong các nghiên cứu đã đƣợc công bố.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân: Phổ đƣợc đo gồm có NMR một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều
(HSQC, HMBC). Quá trình đo phổ đƣợc thực hiện trên máy Bruker Avance AM500
FT-NMR tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với
chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS). Phƣơng pháp đƣợc dựa trên cơ sở sau:
Cơ sở lý thuyết:
- Hạt nhân trong từ trƣờng:
+ Phổ NMR là một phần của phổ cao tần. Tƣơng tác với hạt nhân đƣợc tạo ra
với sóng radio (108-106 Hz).
+ Hạt nhân gồm proton và neutron đều có xung quay riêng đƣợc gọi là spin.
Spin hạt nhân gắn với một momen từ thông qua tỷ lệ hồi chuyển từ. Hạt nhân có
momen từ khi không có tƣơng tác với từ trƣờng thì mức năng lƣợng của hạt nhân là
nhƣ nhau.
+ Phổ NMR nghiên cứu những bƣớc chuyển của mức năng lƣợng hạt nhân
có từ tính bằng cách tạo ra tƣơng tác giữa hạt nhân với từ trƣờng.
- Quá trình cộng hƣởng:
+ Điều kiện cộng hƣởng: Sự cộng hƣởng giữa trƣờng xoay chiều và hạt nhân
sẽ xảy ra khi hạt nhân đƣợc một điện trƣờng cao tần xoay chiều có tần số ν cung cấp
năng lƣợng phù hợp với khoảng cách giữa hai trạng thái năng lƣợng liền kề nhau.
+ Quá trình hồi phục: Trong quá trình cộng hƣởng, hạt nhân thu năng lƣợng
từ trƣờng. Do sự chênh lệch về số chiếm chỗ giữa hai mức năng lƣợng là quá nhỏ
nên sẽ nhanh chóng bị cân bằng và tín hiệu hấp thụ sẽ biến mất (bão hòa). Mặt
22
khác, hạt nhân cũng mất năng lƣợng trong khi cộng hƣởng. Thông qua trao đổi năng
lƣợng với môi trƣờng xung quanh hoặc giữa môi trƣờng với nhau một cách không
phát xạ. Quá trình hồi phục có tác dụng chống lại sự bão hòa trong khi cộng hƣởng
[12], [10].
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
2.3.4.1. Phương pháp
Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp pha loãng và sử dụng MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide) làm chỉ thị màu.
Các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, Klebsiella
pneumonia, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Các chủng vi khuẩn này
đƣợc lấy từ ngân hàng vi khuẩn của Trung tâm Tài nguyên sinh vật NITE, Nhật
Bản.
Chất đối chứng dƣơng của thử nghiệm là: kanamycin (Nacalai Tesque,
Japan, ứng với vi khuẩn Gram (-)) và ampicillin (Nacalai Tesque, Japan, ứng với vi
khuẩn Gram (+)).
2.3.4.2. Cách tiến hành
Các chủng vi khuẩn đƣợc cấy vào các đĩa thạch YP (1% polypeptone (Nihon
Pharmaceutical, Japan), 0,2% dịch chiết nấm men (Difco, USA), 0,1% MgSO4.7H2O, và 2% agar (Nacalai Tesque, Japan)), sau đó ủ ở 300C trong 12 h.
Các hợp chất phân lập đƣợc hòa tan trong dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide) ở
nồng độ 1 mg/mL, sau đó tiếp tục pha loãng thành các nồng độ khác nhau trong các
đĩa của 1 khay 96 giếng có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm đƣợc nuôi cấy trong các đĩa thạch YP. Các đĩa đƣợc tiếp tục ủ qua đêm ở 370C. Tiếp đến, chỉ thị
màu MTT đƣợc cho vào mỗi giếng và khay đƣợc ủ tiếp 1 giờ trƣớc khi đọc kết quả.
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimal Inhibitory Concentration) đƣợc xác định là
nồng độ thấp nhất ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn.
23
3.1. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP
3.1.1. Quá trình chiết xuất
Sau khi thu mẫu, phần trên mặt đất của cây An điền nón đƣợc rửa sạch, thái
nhỏ, phơi sấy khô và xay thành bột thô có khối lƣợng là 2,4 kg. Bột dƣợc liệu đƣợc
ngâm chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 7 ngày với 10 lít methanol/lần, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, nhiệt độ 50 – 600C thu đƣợc cao
chiết methanol (100,5g). Cao chiết này đƣợc phân tán trong 2 lít nƣớc rồi chiết
phân bố lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lƣợt là n-hexan (2 lít
× 3 lần), chloroform (2 lít × 3 lần), ethyl acetat (2 lít × 3 lần), cất thu hồi dung môi
dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cao chiết phân đoạn n-hexan (HPH, 40,6 g),
chloroform (HPC, 19,2 g), ethyl acetat (HPE, 10,5 g) và nƣớc (HPW, 20,8 g) tƣơng
ứng.
Cao chiết HPH đƣợc hòa tan vào lƣợng methanol tối thiểu, sau đó tẩm với
silica gel pha thƣờng, tỉ lệ khối lƣợng 1:1. Đƣa khối silica gel ẩm này vào bình cô
quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột khô thu đƣợc dùng để chiết pha
rắn trong bƣớc tiếp theo.
Cột sắc ký đƣợc rửa sạch, sấy khô, lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn
trên giá. Thêm silica gel pha thƣờng với chiều cao khoảng 1 cm, đƣa lƣợng chất đã
tẩm silica gel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều. Triển khai cột với hệ dung
môi rửa giải là n-hexan : aceton lần lƣợt với tỷ lệ 100:1, 50:1, 5:1, 1:1 (0,5 L cho
mỗi hệ) và cuối cùng là aceton 100 % (0,5 L). Hứng các phân đoạn, cô quay cất thu
hồi dung môi, thu đƣợc các cắn ký hiệu lần lƣợt từ H1 đến H5. Các phân đoạn này
đƣợc dùng cho việc phân lập hoạt chất tinh khiết trong giai đoạn tiếp theo. Quá
trình chiết xuất các phân đoạn từ An điền nón Hedyotis pilulifera đƣợc trình bày ở
Hình 3.1.
24
Ngâm ở nhiệt độ phòng/ methanol
Bột dƣợc liệu (2,4 kg)
Nhiệt độ, áp suất giảm
Cô quay
Dịch chiết methanol
Phân tán /nƣớc
Dịch nƣớc
Lắc phân đoạn
n-hexan
Chloroform
Ethyl acetat
Nƣớc
Cắn (100,5 g)
Chiết pha rắn
n-hexan:aceton
0:100
100:1
50:1
5:1
1:1
HPE (10,5 g) HPC (19,2 g) HPH (40,6 g) HPW (20,8g)
H2 H5 H1
H3 (16g) H4 (20g)
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây An điền nón
3.1.2. Quá trình phân lập
Qua quá trình khảo sát bằng sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác
nhau nhận thấy trên sắc ký đồ của phân đoạn H3 và H4 có các cụm vết tách nhau
khá rõ, lƣợng cắn hai phân đoạn này thu đƣợc khá nhiều. Hơn nữa các cụm vết trên
sắc ký đồ của hai phân đoạn này có sự giống nhau gần nhƣ hoàn toàn. Do đó cắn
của hai phân đoạn H3 và H4 đƣợc gộp chung (Ký hiệu H34) và tiến hành phân lập
trƣớc.
25
Tiến hành phân lập phân đoạn H34
Cắn phân đoạn H34 đƣợc hòa tan hoàn toàn vào lƣợng n-hexan tối thiểu và
triển khai trên sắc ký cột pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải là n-hexan – aceton
(3:1, v/v).
Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM, các phân đoạn tƣơng tự nhau đƣợc
gộp chung. Sau khi cô quay cất thu hồi dung môi thu đƣợc 2 phân đoạn ký hiệu lần
lƣợt là H34A và H34B. Sau khi khảo sát 2 phân đoạn trên cùng một bản SKLM
nhận thấy sắc ký đồ của phân đoạn H34A có các cụm vết tách khá rõ, do đó phân
đoạn H34A đƣợc ƣu tiên tiến hành phân lập trƣớc.
Phân đoạn H34A (9g) sau khi khảo sát bằng SKLM đƣợc triển khai bằng
SKC pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải là chloroform – methanol (50:1, v/v).
Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM, gom các phân đoạn tƣơng tự với nhau, thu
đƣợc 3 phân đoạn ký hiệu là H34A1, H34A2 và H34A3. Kiểm tra 3 phân đoạn thu
đƣợc bằng SKLM, sắc ký đồ của phân đoạn H34A2 có một cụm vết tách khá rõ nên
lựa chọn để phân lập tiếp.
Phân đoạn H34A2 (5g) đƣợc phân tách bằng cột Sephadex LH-20 với hệ
dung môi giải ly là methanol – nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc 2 phân đoạn ký hiệu là
H34A2A và H34A2B.
Phân đoạn H34A2A (2,3 g) đƣợc ƣu tiên phân tích tiếp theo vì cho vết trên
sắc ký đồ tách tƣơng đối rõ và còn lẫn ít tạp. Triển khai bằng SKC pha đảo với hệ
dung môi rửa giải là methanol – nƣớc (15:1, v/v). Theo dõi quá trình rửa giải bằng
SKLM và gom các phân đoạn tƣơng tự nhau, cô quay cất thu hồi dung môi, thu
đƣợc 2 phân đoạn ký hiệu là H34A2A1 và H34A2A2.
Kiểm tra bằng SKLM cho thấy phân đoạn H34A2A1 (1,9g), có vệt tròn rõ,
còn lẫn rất ít tạp, tiếp tục tinh chế bằng SKC pha thƣờng dùng hệ dung môi rửa giải
là n-hexan – aceton (10:1, v/v) (khoảng 300ml) sau đó đổi thành tỷ lệ (6:1, v/v) cho
đến khi quá trình rửa giải kết thúc. Gộp chung các đoạn tinh khiết, cô quay cất thu
hồi dung môi thu đƣợc hợp chất ký hiệu là HP1 (900mg). Kiểm tra bằng SKLM với
2 hệ dung môi khác nhau là n-hexan – aceton (4:1, v/v), methanol – nƣớc (15:1,
26
v/v), cho thấy vệt sắc ký tròn, rõ nét và hiện màu hồng với thuốc thử H2SO4 10%
trong ethanol.
Tiến hành phân lập phân đoạn H34A1
Cùng với phân đoạn H34A2 thì phân đoạn H34A1 (600mg) cũng có các vết
hiện màu rõ và tách nhau, cùng lƣợng tạp chất nhỏ. Do đó, lựa chọn phân đoạn
H34A1 để tiếp tục phân lập.
Triển khai bằng SKC pha thƣờng với hệ dung môi n-hexan – chloroform –
ethylacetat (5:1:0,1, v/v/v) (khoảng 300ml) sau đó đổi thành tỷ lệ (3:1:0,1, v/v/v)
cho đến khi quá trình rửa giải kết thúc. Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM và
gom các phân đoạn tƣơng tự nhau, cô quay cất thu hồi dung môi, thu đƣợc 2 phân
đoạn ký hiệu là H34A1A và H34A1B. Kiểm tra bằng SKLM cho thấy phân đoạn
H34A1A có một vệt tròn rõ, còn lẫn ít tạp.
Tiếp tục tinh chế phân đoạn H34A1A (52mg) bằng SKC pha đảo với hệ dung
môi rửa giải là methanol – nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc hợp chất ký hiệu là HP2 (8mg).
Kiểm tra bằng SKLM với 2 hệ dung môi khác nhau là n-hexan – chloroform –
ethylacetat (5:1:0,1, v/v/v) và aceton – nƣớc (1:1, v/v), cho thấy vệt sắc ký tròn, rõ
nét và hiện màu hồng với thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol.
27
n-hexan – aceton (3:1)
SKC pha thƣờng
H34 (36g)
SKC pha thƣờng
chloroform – methanol (50:1)
H34A3
H34A2 (5g)
H34A (9g) H34B
H34A1 (600mg)
methanol 50%
SKC pha thƣờng n-hexan – chloroform – ethyl acetat (5:1:0,13:1:0,1)
methanol – nƣớc (15:1)
SKC pha đảo
H34A2A (2,3g) H34A2B
H34A1B H34A1A (52mg)
H34A2A2
SKC pha đảo methanol – nƣớc (1:1)
SKC pha thƣờng
H34A2A1 (1,9g)
n-hexan – aceton (10:16:1)
HP1 (8mg)
HP2 (900mg)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất HP1 và HP2 từ phân đoạn H34
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
3.2.1. Xác định cấu trúc hợp chất HP1
Hợp chất HP1 đƣợc tách ra dƣới dạng bột màu trắng, tan tốt trong
chloroform, Rf = 0,3 (Silica gel, n-hexan – aceton 4:1, v/v), Rf = 0,25 (Rp 18,
methanol – nƣớc 15:1, v/v), hiện màu hồng với acid H2SO4 10% trong ethanol.
28
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP1 và hợp chất tham khảo
HMBC (HC)
Vị trí δC
δH 0,96*, 1,53* 1,89*, 2,05* 3,64 dd (11,5, 3,5) – 1,00* 1,38*, 1,71* 1,38*, 1,62* – 1,84* – 1,96*, 2,08* 5,62 brs – – 1,30*, 2,33 m 2,07*, 3,15 m – 3,07 s δC 39,2 38,8 28,9 28,5 80,7 80,3 43,6 43,2 56,9 56,5 19,7 19,3 34,4 34,0 40,8 40,4 48,3 47,9 37,6 37,2 24,3 24,7 127,9 128,4 140,0 140,4 42,1 29,1 26,5 48,4 54,7 42,5 29,8 26,9 48,8 55,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
9, 11, 14, 18 12, 13, 16, 17, 19, 20, 28 3, 4, 5, 24 3, 4, 23 19 20 21 22 23 24 73,2 42,9 27,4 39,0 24,1 65,1 72,8 42,4 27,0 38,6 23,7 64,6
16,5** 17,5** 25,1
17,2 16,8 24,7 180,8 181,2 27,2 16,1 1, 5, 9 7, 9, 14 13, 14, 15 18, 19, 20 19, 20 25 26 27 28 29 30 27,6 17,3**
#δC được gán lại bằng 2D-NMR
– 1,52* 1,36*, 1,55* 2,08*, 2,19* 1,56 s 4,51 d (10,5) 3,68 d (10,5) 0,90 s 1,09 s 1,74 s – 1,47 s 1,14 d (6,5) của rotungenic acid [36], ađo trong pyridine-d5, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập, **tín hiệu
29
Phổ 1H-NMR của hợp chất HP1 chỉ ra các tín hiệu đặc trƣng của 1 proton
olefin tại δH 5,62, 2 proton của nhóm oxymethylene tại δH 3,68 (d, J = 10,5 Hz),
4,51 (d, J = 10,5 Hz), 1 proton của nhóm carbinol tại δH 3,64 (dd, J = 11,5, 3,5 Hz,
H-3), 6 nhóm methyl tại δH 0,90 (3H, s), 1,09 (3H, s), 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,47
(3H, s), 1,56 (3H, s), 1,74 (3H, s). Hằng số tƣơng tác của H-3 cho phép xác nhận
cấu hình của proton này. Phổ 13C-NMR cho thấy phân tử có 30 nguyên tử carbon
với các tín hiệu đặc trƣng: 1 nhóm carboxylic tại δC 181,2 (C-28), 2 carbon nối đôi
tại δC 128,4 (C-12), 140,4 (C-13), 1 nhóm oxymethine tại δC 80,7 (C-3), 1 nguyên
tử carbon bậc bốn gắn oxy tại δC 73,2 (C-19) và 1 nhóm oxymethylene tại δC 65,1
(Bảng 3.1).
Tƣơng tác HMBC giữa H-23 (δH 1,56) với C-3 (δC 80,7)/C-4 (δC 43,6); giữa
H-25 (δH 0,90) với C-1 (δC 39,2)/C-5 (δC 56,9)/C-9 (δC 48,3); giữa H-26 (δH 1,09)
với C-7 (δC 34,4)/C-9 (δC 48,3)/C-14 (δC 42,5); giữa H-27 (δH 1,74) với C-13 (δC
140,4)/C-14 (δC 42,5)/C-15 (δC 29,8) chứng tỏ 4 nhóm tertiary methyl định vị tại C-
4, C-8, C-10 và C-14. Tƣơng tác HMBC giữa H-29 (δH 1,47)/H-30 (δH 1,14) với C-
19 (δC 73,2), C-20 (δC 42,9) đã chứng tỏ hai nhóm methyl còn lại [C-29, C-30] định
vị lần lƣợt tại C-19 và C-20.
Ngoài ra, tƣơng tác HMBC giữa H-18 (δH 3,07) với C-12 (δC 128,4)/C-13 (δC
140,4)/C-28 (δC 181,2) giúp khẳng định nhóm carboxyl đƣợc thế ở vị trí C-17 và
liên kết đôi tại C-12/C-13. Tƣơng tác HMBC giữa H-24 (δH 3,68, 4,51) với C-3 (δC
80,7)/C-4 (δC 43,6) đề nghị nhóm oxymethylene tại C-4. Cấu hình β của nhóm này
đƣợc thiết lập qua so sánh giá trị δC 65,1 với các giá trị tham khảo [δC 68-71 (C23-
OH), 63-66 (C24-OH)] [72].
Phân tích chi tiết các tƣơng tác trên phổ HSQC, HMBC (Hình 3.4) cho phép
gán ghép giá trị chuyển dịch hóa học cho tất cả vị trí của phân tử. Các kết quả thu
đƣợc cho phép kết luận hợp chất HP1 là rotungenic acid [36] (Hình 3.3).
30
Hình 3.4. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP1 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất HP1
3.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất HP2
Hợp chất HP2 đƣợc tách ra dƣới dạng dầu màu vàng, tan tốt trong methanol,
Rf = 0,5 (Silicagel n-hexan – chloroform – ethyl acetat 5:1:0,1, v/v/v).
Hình 3.5. Cấu trúc hoá học của hợp chất HP2
Hình 3.6. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP2
31
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP2 và hợp chất tham khảo
1, 2, 3 2, 3, 4 4, 5, 6 1, 5, 6, 2
2, 3, 4
6, 7, 8 Vị trí 1 2 2-Me 3 3-Me 4 5 5-Me 6 1 2 3 3-Me 4 5 6 7 7-Me 8 9 10 11
10, 11, 12 12 13 14 15
δH – – 1,98 s – 1,98 s – – 2,01 s – 2,52 m – 1,21 s 0,81* 0,84* 0,83* 14, 15
#C của α-tocopherolquinone [66] , ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz, *tín hiệu chập.
32,87 19,82 37,54 24,60 37,54 32,90 19,87 37,39 24,90 39,47 28,07 22,74 22,83
32
Phổ 1H-NMR của hợp chất HP2 chỉ ra tín hiệu tetra-alkyl benzoquinone. Ba
nhóm methyl singlet trên vòng quinone xuất hiện tại δH 2,01 (3H), 1,98 (6H). Tín
hiệu singlet còn lại tại δH 1,21 thuộc về nhóm methyl ở vị trí germinal với nhóm
hydroxyl. Bốn nhóm methyl bậc hai khác đƣợc ghi nhận tại 0,81 (3H), 0,83 (6H), 0,84 (3H). Phổ 13C-NMR chỉ ra các tín hiệu của vòng quinone thế và mạch aliphatic
loại phytol với 1 nhóm hydroxyl tại C-3 (Bảng 3.2).
Cấu trúc của vòng quinone thế đƣợc xác nhận bằng các tƣơng tác HMBC
giữa 2-Me (δH 1,98) và C-1 (δC 187,33)/C-2 (δC 140,52)/C-3 (δC 140,63); giữa 3-Me
(δH 1,98) và C-2 (δC 140,52)/C-3 (δC 140,63)/C-4 (δC 187,77); giữa 5-Me (δH 2,01)
và C-4 (δC 187,77)/C-5 (δC 140,57)/C-6 (δC 144,57). Mạch nhánh aliphatic tại C-6
đƣợc thiết lập thông qua tƣơng tác giữa H-1 (δH 2,52) và C-1 (δC 187,77)/C-5 (δC
140,57)/C-6 (δC 144,57) (Hình 3.6).
Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất HP2 cho phép xác định hợp chất này là
-tocopherolquinone (2,3,5-trimethyl-6-(3-hydroxy)-phytyl-1,4-benzoquinone)
(Hình 3.5) với các tính chất phổ hoàn toàn phù hợp với các giá trị tham khảo [66].
3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 hợp chất rotungenic acid và α-
tocopherolquinone đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các chất phân lập đƣợc
MIC (µg/mL) Hợp chất
Rotungenic acid α-tocopherolquinone Ampicillin S. aureus 2,5 - 5 B. subtilis 2,5 - 5 M. smegmatis 1,25 - 5
Với giá trị [67]:
MIC < 10 µg/mL: Hoạt tính kháng khuẩn mạnh
10 < MIC ≤ 100 µg/mL: Hoạt tính kháng khuẩn trung bình
MIC > 100 µg/mL: Hoạt tính kháng khuẩn yếu hoặc không có
MIC (-): Không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh
33
Trong thử nghiệm này, rotungenic acid thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh
trên cả 3 chủng S. aureus, B. subtilis, M. smegmatis. Trong khi đó, α-
tocopherolquinone không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
34
4.1. BÀN LUẬN CHUNG
Ƣớc tính có hơn 250.000 loài thực vật bậc cao hiện có trên hành tinh này, và
chỉ có một tỷ lệ rất nhỏ thực vật đã đƣợc nghiên cứu triệt để giá trị tiềm năng của
chúng nhƣ là một nguồn gốc của thuốc [52]. Các sản phẩm tự nhiên không những
ứng dụng trực tiếp làm thuốc mà nhiều hoạt chất khác còn đƣợc sử dụng để thiết kế,
tổng hợp và bán tổng hợp các chất mới để điều trị các bệnh cho con ngƣời.
Bằng chứng là, các sản phẩm tự nhiên (và các dẫn xuất, các chất tƣơng tự
của chúng) vẫn chiếm hơn 50% của tất cả các loại thuốc trong việc chữa bệnh. Tính
đến năm 2014, số lƣợng sản phẩm tự nhiên không thay thế đƣợc là 25-30%. Tất cả
các thuốc mới từ năm 1981-2014 gồm 1562 chất trong đó có 320 chất mới đƣợc
phân lập từ tự nhiên. Trong đó, thuốc chống nhiễm trùng từ nguồn gốc tự nhiên
chiếm 25,5 %. Thuốc chống ung thƣ từ tự nhiên chiếm 62,25 % hợp chất [22].
Nhƣ vậy, không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, với xu hƣớng "Trở về thiên
nhiên" thì việc sử dụng các thuốc từ dƣợc liệu của ngƣời dân ngày càng gia tăng, ít
có những tác động có hại và phù hợp với qui luật sinh lý của cơ thể hơn. Nằm trong
vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu có nhiều nét độc đáo, Việt Nam đƣợc đánh giá là
nƣớc có hệ thực vật vô cùng phong phú với khoảng 12000 loài đã đƣợc ghi nhận [7].
Hơn nữa, Việt Nam còn có một nền y học dân tộc lâu đời với các tri thức sử dụng
các loại dƣợc liệu, các bài thuốc có giá trị dùng để chữa các bệnh thông thƣờng và
nan y. Nền y học cổ truyền độc đáo đó bảo vệ sức khỏe cho dân tộc ta suốt chiều dài
lịch sử với phƣơng châm "Nam dƣợc trị nam nhân . Dùng thế mạnh dƣợc liệu đẩy
mạnh công nghiệp dƣợc trở thành ngành kinh tế k thuật mũi nhọn, làm cho nhân
dân ta có đủ thuốc tốt, khỏe mạnh và giàu có, đất nƣớc ta kinh tế - xã hội phát triển,
tạo nên hình ảnh Việt Nam - một cƣờng quốc về dƣợc liệu.
Với nguồn tài nguyên dƣợc liệu đa dạng, trong đó có nhiều cây thuốc kháng
sinh đƣợc Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thƣờng là những cây cỏ rất
quen thuộc, mọc hoang dại hoặc đƣợc trồng ngay trong vƣờn nhƣ: Hành, tỏi, hẹ,
35
kim ngân, sâm đại hành, lá móng tay,… đƣợc nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc,
tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm
họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc đƣợc nhân
dân ta dùng chữa vết thƣơng có kết quả tốt nhƣ lá vối, lá bòng bong, sắn thuyền, lô
hội, lá trầu không, sài đất… Nhiều cây thuốc đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu
và tìm thấy những chất kháng sinh có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn nhƣ: dùng
nƣớc sắc lá đơn tƣớng quân (tên khoa học là Syzygium sp.) để chữa các chứng lở
loét, mụn nhọt, mẩn ngứa, viêm họng, viêm phế quản… có kết quả tốt; dùng lá Trầu
không chữa bỏng (giã nhỏ, vắt lấy nƣớc bôi vào chỗ bỏng) hoặc dùng nƣớc lá Trầu
không rửa các vết thƣơng thay thuốc sát khuẩn. Đặc biệt, Artemisinin và các dẫn
xuất của nó đƣợc đánh giá cao và mạnh trong điều trị chống sốt rét, đƣợc phát hiện
vào năm 1971 bởi nhà khoa học Trung Quốc Youyou Tử và đƣợc trao giải Nobel
vào năm 2015 [29].
Ƣu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra
những tai biến nguy hiểm, nhiều khi gây chết ngƣời nhƣ thuốc kháng sinh tân dƣợc.
Những tai biến do penicillin, streptomycin, tetracyclin, chloramphenicol… đã đƣợc
y học nói đến nhiều, nhƣng những tai biến do kháng sinh thực vật gây ra chƣa thấy
tài liệu nào nói đến. Giới hạn an toàn về mặt độc chất của những kháng sinh thực
vật lớn hơn kháng sinh tân dƣợc nhiều. Đây cũng chính là mục tiêu thúc đẩy tìm
kiếm kháng sinh thực vật hiện nay.
4.2. QUÁ TRÌNH THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU
Phần trên mặt đất cây An điền nón sau khi thu hái về tiến hành loại bỏ các bộ
phận bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo, ủ dập cũng nhƣ các loài thực vật ký sinh khác. Sau đó rửa sạch thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 500-600C và xay thành bột thô để
tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất.
Làm khô để bảo quản dƣợc liệu khỏi nấm mốc, vi khuẩn, hạn chế tác động
bởi enzyme và các biến đôi hóa học có thể xảy ra trong dƣợc liệu nhƣ phản ứng
thủy phân, oxy hóa, đồng phân hóa, trùng hợp hóa. Nếu không có lò sấy, có thể
phơi khô nhờ ánh nắng, tuy nhiên cần tránh phơi dƣới ánh nắng mặt trời gay gắt vì
36
tia tử ngoại (UV) có trong ánh sáng mặt trời có thể kích thích phản ứng hóa học, tạo
nên những hợp chất giả tạo. Hơn nữa dƣợc liệu khô thì dễ xay nghiền và vận
chuyển thuận lợi hơn. Trong quá trình phơi hay sấy phải thƣờng xuyên đảo để toàn
bộ lƣợng dƣợc liệu khô đều.
Việc xay thành bột mịn làm phá vỡ màng tế bào thực vật và làm tăng diện
tích tiếp xúc giữa dung môi với dƣợc liệu, giúp cho dung môi dễ thấm ƣớt bột dƣợc
liệu, chất tan dễ khuếch tán vào dung môi, do đó sẽ chiết kiệt hoạt chất hơn.
4.3. QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP
An điền nón (Hedyotis pilulifera) đƣợc chiết xuất bằng phƣơng pháp ngâm ở
nhiệt độ thƣờng, tiến hành chiết 3 lần, mỗi lần kéo dài 1 tuần để bảo đảm thời gian
tiếp xúc giữa chất tan và dung môi nhằm chiết đƣợc lƣợng hoạt chất tối đa.
Dung môi đƣợc sử dụng để chiết xuất là methanol do có khả năng thấm qua
màng tế bào thực vật, cũng nhƣ có thể tạo cầu nối liên phân tử với các nhóm phân
cực khác, do đó methanol đƣợc xem nhƣ là dung môi vạn năng, có thể chiết đƣợc
các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu, từ đó giúp chiết kiệt hoạt chất có
trong dƣợc liệu. Hơn nữa, methanol có giá thành rẻ, không quá dễ bay hơi và độ
nhớt thấp [9]. Do vậy, methanol đƣợc lựa chọn làm dung môi chiết xuất. Sau khi chiết, dung môi đƣợc thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-400C thu đƣợc
cao thô ban đầu, cô ở nhiệt độ cao hơn có thể làm hƣ hại môt số hợp chất kém bền
nhiệt.
Việc chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây phức tạp vì không biết đƣợc cây
đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học ra sao. Cây cỏ đều có chứa
nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến phân cực, vì thế nếu muốn
cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay lên trên cao thô ban đầu sẽ rất
khó đạt đƣợc kết quả mong muốn. Vì thế ngƣời ta thƣờng chuẩn bị một loạt các loại
cao chiết có tính phân cực tăng dần, nhƣ thế mỗi loại cao chiết chứa tƣơng đối ít
hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng hơn. Muốn có các
loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác
37
nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau . Nghiên
cứu này thu đƣợc cao của các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat và nƣớc.
Trƣớc khi tiến hành SKC, các phân đoạn đều đƣợc khảo sát bằng SKLM cả
pha thƣờng và pha đảo với nhiều hệ dung môi khác nhau, từ đó chọn ra hệ dung môi
nào có khả năng tách vết tốt nhất để làm dung môi rửa giải khi tiến hành SKC. Mặc
dù đây là công đoạn mất nhiều thời gian và công sức nhất trong quá trình phân lập
nhƣng công đoạn này giúp tiết kiệm lƣợng dung môi sử dụng và rút ngắn thời gian
triển khai cột sắc ký.
Thực tế cho thấy việc phân lập hoạt chất tinh khiết từ cây An điền nón đã
phải trải qua rất nhiều giai đoạn khác nhau và sử dụng phối hợp hầu hết những
phƣơng pháp phân tách thƣờng quy và kinh điển đƣợc sử dụng phổ biến trong
phòng thí nghiệm nhƣ: chiết xuất phân đoạn lỏng-lỏng, chiết xuất pha rắn, SKLM,
SKC Diaion HP-20, SKC với chất hấp phụ là silicagel pha thƣờng và pha đảo, SKC
Sephadex LH-20…Đây cũng là những phƣơng pháp chủ đạo trong quá trình tìm
kiếm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.
SKC Sephadex LH-20 thƣờng đƣợc sử dụng để tinh chế khi hợp chất có lẫn
tạp chất có màu, đó là trƣờng hợp của quá trình phân lập hợp chất HP1.
Việc phối hợp các dung môi rửa giải phụ thuộc nhiều vào độ phân cực của
các chất trong từng phân đoạn, quá trình tìm hệ dung môi rửa giải thích hợp nhất
mất rất nhiều thời gian và phụ thuộc khá lớn vào kinh nghiệm của ngƣời nghiên
cứu. Đôi khi cần phải phối hợp 3 hoặc thậm chí 4, 5 dung môi thay cho những hệ 2
dung môi thông thƣờng mới có thể tạo nên sự phân tách các vết rõ ràng nhất, quá
trình phân lập chất HP2 là một ví dụ trong trƣờng hợp này.
Các hợp chất phân lập đƣợc trƣớc khi tiến hành đo phổ phải đảm bảo độ tinh
khiết cần thiết (≥95%) [9]. Điều đó đƣợc kiểm chứng bằng SKLM pha thƣờng và
pha đảo với các hệ dung môi khác nhau. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% (v/v)
pha trong ethanol và đốt nóng từ từ trên bếp điện, hợp chất tinh khiết thể hiện trên
bản mỏng với vết có màu sắc đồng đều, hình dạng tƣơng dối tròn, các mép viền của
vết khá rõ nét, đồng thời không có vết phụ nào xuất hiện trên hay dƣới vết chính.
38
Sau khi quá trình phân lập, hai hợp chất HP1 và HP2 đƣợc tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc. Phổ sử dụng trong đề tài là phổ NMR một chiều 1H-NMR, 13C-NMR và hai chiều HSQC, HMBC. Hiện nay, đây là một trong những phƣơng
pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc hợp chất tự nhiên, cung cấp
những thông tin chi tiết và chính xác, cho phép xác định cấu trúc phân tử của hợp
chất hữu cơ
Xem xét thông tin thu đƣợc từ kết quả giải phổ NMR một chiều và hai chiều,
kết hợp so sánh đối chiếu với các phổ chuẩn tham khảo đã cho phép xác định danh
pháp của hợp chất HP1 là rotungenic acid và hợp chất HP2 là α-
tocopherolquinone.
4.4. VỀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Sau quá trình phân tích phổ để nhận định cấu trúc, hai hợp chất đã phân lập
đƣợc xác định là:
HP1: 3b,19a,24-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid còn đƣợc gọi là
rotungenic acid. Hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ Ilex rotunda
(Aquifoliaceae) [48], sau đó còn đƣợc tìm thấy trong các loài nhƣ Diospyros kaki,
Morinda citrifolia, Morinda oficinallis, Euscaphis japonica, Ilex litseaefolia [17],
[32], [36], [44], [45].
HP2: 2,3,5-trimethyl-6-(3-hydroxy)-phytyl-1,4-benzoquinone còn đƣợc
gọi là α-tocopherolquinone. Hợp chất này cũng đƣợc phân lập từ loài Solidago
virga-aurea var. gigantea MIQ, Limnophila geoffrayi [61], [66].
Theo tổng quan tài liệu thu thập đƣợc, cho đến nay chƣa có công bố nào về
rotungenic acid và α-tocopherolquinone đƣợc phân lập từ chi Hedyotis cũng nhƣ
cây An điền nón. Nhƣ vậy, đây là lần đầu tiên hai thành phần này đƣợc phân lập từ
cây An điền nón (Hedyotis pilulifera) ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới.
Hai hợp chất này có công thức cấu tạo nhƣ Hình 4.1 và Hình 4.2.
39
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của HP1
Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của HP2
Hợp chất rotungenic acid thuộc nhóm triterpenoid 5 vòng mang khung
ursane. Có hơn 20.000 phân tử hợp chất triterpenoid đã đƣợc công bố. Sự đa dạng
của triterpenoid đƣợc đánh giá cao, kết hợp với nhiều hoạt tính sinh học. Ở các
nƣớc châu Á, triterpenoid có truyền thống đƣợc sử dụng để chống viêm, giảm đau,
bảo vệ gan, điều trị các bệnh tim mạch và dùng làm thuốc an thần. Các nghiên cứu
khác cũng đã chứng minh hoạt tính chống oxy hoá, chống dị ứng, chống ngứa, chất
kháng sinh tiềm năng, hoạt tính chống các tế bào ung thƣ và khả năng gây chết tế
bào apoptosis. Do đó, nhiều triterpenoid hiện đang đƣợc đánh giá trong giai đoạn 1
thử nghiệm lâm sàng [30], [33].
Hơn nữa, dịch chiết methanol của cây An điền nón đƣợc sàng lọc ban đầu có
hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong 207 mẫu dƣợc liệu thu thập đƣợc. Vì vậy,
nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của hai hợp chất phân lập
40
đƣợc trên 6 chủng vi khuẩn. Kết quả thu đƣợc cho thấy rotungenic acid có hoạt tính
ức chế mạnh trên các chủng: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và
Mycobacterium smegmatis với giá trị MIC tƣơng ứng tại 2,5µg/mL, 2,5µg/mL và
1,25µg/mL. Trong đó, Staphylococcus aureus là tác nhân hàng đầu trong nhiễm
khuẩn bệnh viện, gây ra hội chứng sốc nhiễm độc, ngộ độc thực phẩm [70], Bacillus
subtilis có lợi trong sự cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột, khả năng gây bệnh của vi
khuẩn này rất thấp, chỉ đƣợc biết là gây ra bệnh ở những bệnh nhân suy giảm miễn
dịch nặng [53], Mycobacterium smegmatis dùng để đánh giá sự đề kháng của
Mycobacterium tuberculosis, đây là trực khuẩn làm 8,7 triệu ngƣời mắc bệnh lao do
vi khuẩn, 1,3 triệu bệnh nhân tử vong trên thế giới (2012) [70].
Nhƣ vậy, giá trị MIC của rotungenic acid còn thấp hơn cả của chất đối chứng
dƣơng Ampicillin là 5 µg/mL (Bảng 3.3). Ampicillin là một kháng sinh beta-lactam
cần thiết theo danh mục thuốc thiết yếu của WHO, nó có hoạt tính chống cầu khuẩn
gram dƣơng, liên cầu khuẩn kháng thuốc, tụ cầu, các loài vi khuẩn đƣờng ruột và
còn có khả năng chống lại một số vi khuẩn gram âm và xoắn khuẩn. Ampicillin
đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp trên và dƣới, nhiễm
khuẩn da, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu và viêm tai giữa [20].
Hơn nữa, so với một số triterpenoid khác đã đƣợc công bố thì rotungenic
acid thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với giá trị MIC thấp hơn nhiều. Trong đó
có oleanic acid đƣợc chiết xuất từ lá của loài Chamaedorea tepejilote có tỷ lệ ức
chế M. tuberculosis và B. subtilis tƣơng ứng tại 100μg/mL, 8μg/mL. Ursolic acid là
một hợp chất tự nhiên đƣợc đánh giá cao với các nghiên cứu về nhiều hoạt tính có
giá trị; nghiên cứu gần đây nhất của Nascimento và các cộng sự (2013), chất này
cho thấy hoạt tính chống lại 6 chủng vi khuẩn, kết quả tốt nhất là đối với S. aureus
tại MIC = 32µg/mL và ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn lao M. tuberculosis
H37Rv với MIC = 41,9µg/mL [19], [42].
Đặc biệt, các nghiên cứu cũng đã đƣa ra đƣợc mối liên quan giữa cấu trúc
hoạt động của các acid triterpenoid và dẫn xuất của nó, đó là khi cả hai nhóm
hydroxy và carboxy đều có mặt trong triterpenoid thì có ý nghĩa quan trọng đối với
41
hoạt tính kháng khuẩn của triterpenoid đó trong cơ chế chống lại tác nhân gây bệnh
răng miệng. Và cấu trúc của rotungenic acid cũng thể hiện điều này [42].
Nhƣ vậy, đến thời điểm hiện nay, chƣa có công bố nào về hoạt tính kháng
khuẩn của rotungenic acid. Kết quả hi vọng sẽ mở ra hƣớng đi mới về các chất mới
có hoạt tính kháng khuẩn từ đó ứng dụng trong điều trị bệnh nhiễm trùng.
Ngoài ra, rotungenic acid phân lập từ lá của loài Diospyros kaki hay còn gọi
là cây Hồng, là một loại thuốc cổ truyền Trung Quốc đƣợc sử dụng trong điều trị
đột quỵ và dùng làm thuốc hạ huyết áp [31], đƣợc Phƣơng Thiện Thƣơng và cộng
sự chứng minh là có hoạt tính ức chế trên protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B).
Kết quả cho thấy rotungenic acid có hoạt tính ức chế PTP1B tại IC50 10.9±1 µM
(Với IC50>30µM là không có hoạt tính hay hoạt tính yếu). Các chất ức chế PTP1B
đƣợc biết là có tác dụng kích thích hoạt động của insulin từ đó có vai trò trong điều
trị bệnh đái tháo đƣờng [60].
Với hai hợp chất phân lập đƣợc, α-tocopherolquinone (Alpha-TQ) là một
chất chuyển hóa của α-tocopherol (Vitamin E).
Từ phân đoạn n-hexan của loài Solidago virga-aurea var. gigantea MIQ.,
cũng tách đƣợc α- tocopherolquinone. Chất này đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế
bào thử invivo trên 5 dòng A-549 (Ung thƣ phổi ở ngƣời), SK-OV-3 (nhân ung thƣ
tuyến buồng trứng), SK-MEL-2 (melanoma), XF 498 (ung thƣ biểu mô thần kinh
trung ƣơng của con ngƣời), và HCT15 (adenocarcinoma ruột kết). Thu đƣợc kết quả
EC50 (µm) lần lƣợt là 8,7; 22,0; 8,2; 5,9; 6,4 so với chất đối chứng Doxorubicin
tƣơng ứng là 0,8; 0,9; 1,4; 1,43; 2,4 [66].
Alpha-TQ có một vòng trung tâm p-benzoquinone và một chuỗi bên phytyl
với ba trung tâm bất đối trong cấu hình-RRR và có cùng cấu trúc với p-
benzoquinone, 9,10-anthraquinone và Coenzyme Q10. Các nghiên cứu trƣớc đây đã
chứng minh rằng Coenzyme Q10 và benzoquinone có thể ức chế Ab (beta-
amyloid). Anthraquinone ức chế sự tổng hợp protein tau và Ab. Nhƣ vậy, vòng
trung tâm p-benzoquinone có thể đóng một vai trò thiết yếu trong tác dụng ức chế
sự hình thành sợi nhỏ Ab, mục tiêu quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer. Bệnh
42
Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh đa yếu tố. Việc tổng hợp Ab và
lắng đọng vào sợi nhỏ ngoại bào là một dấu hiệu bệnh lý của AD. Các Ab tổng hợp
gây độc thần kinh, phản ứng viêm và stress oxy hóa có liên hệ mạnh mẽ với các
nguyên nhân của AD. Các thuốc hiện có không đủ để điều trị hoàn toàn căn nguyên
AD. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới có thể điều trị nhiều mục tiêu cùng một
lúc đang thu hút chú ý nhiều hơn [63].
Năm 2010, Shi gao Yang và các cộng sự đã chứng minh α-tocopherol
quinone đã nhắm vào nhiều mục tiêu điều trị các yếu tố bệnh sinh AD với cơ chế là:
có tác dụng làm giảm bớt Ab42 - gây độc thần kinh đối với các tế bào
neuroblastoma SH-SY5Y, phân tách các sợi thành trƣớc và cản trở sự hình thành
oligome Ab nội bào tự nhiên. Hơn nữa, Alpha-TQ có thể làm giảm sự hình thành
oxy phản ứng (ROS) và NO, điều chỉnh việc sản xuất các cytokine bằng cách giảm
TNF-α và IL-1β và tăng IL-4 hình thành trong tiểu thần kinh đệm [63].
Nhƣ vậy, từ loài Hedyotis pilulifera, đề tài đã phân lập đƣợc hai hợp chất từ
phân n-hexan là rotungenic acid và α-tocopherolquinone. Dựa trên những tài liệu
tham khảo đã công bố về tác dụng sinh học cũng nhƣ những tính chất vật lý của
hai hợp chất rotungenic acid và α-tocopherolquinone, chúng ta có cơ sở để tiến
hành những nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dƣợc lý của chúng trong thời gian
tiếp theo. Với kết quả đạt đƣợc đã góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng cây
thuốc của ngƣời dân. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học có giá trị của hai
hợp chất cho thấy đây là dƣợc liệu có tiềm năng trong việc tìm kiếm các hợp chất có
hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thƣ và nhiều bệnh nguy hiểm khác. Đặc biệt với
tác dụng kháng khuẩn tốt của rotungenic acid đã mở ra triển vọng mới cho việc
nghiên cứu, tìm kiếm các kháng sinh thực vật từ dƣợc liệu.
43
Qua quá trình thực nghiệm, đề tài đã thu đƣợc những kết quả sau:
1. Về chiết xuất và phân lập một số thành phần hóa học
Đã phân lập đƣợc 02 hợp chất tinh khiết trong phân đoạn n-hexan từ
cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh) - Rubiaceae
2. Về xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc
Bằng phƣơng pháp phân tích dữ liệu phổ, đã xác định hai hợp chất phân lập
đƣợc là:
- Rotungenic acid
- α-tocopherolquinone
44
- Tiếp tục nghiên cứu các thành phần khác có hoạt tính trong
phân đoạn n-hexan.
- Tiến hành thử in vivo tác dụng dƣợc lý của các hợp chất phân
lập đƣợc.
Tài liệu Tiếng Việt:
1. Bộ môn Dƣợc liệu (2006), Thực tập Dược liệu - Phần Hóa học, Trƣờng Đại
học Dƣợc Hà Nội, tr.19.
2. Bộ môn Thực vật (2005), Thực vật học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,
tr.300.
3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam - Lần xuất bản thứ tư, Nxb. Y học, Hà
Nội.
4. Lại Thị Kim Dung (2009), "Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây An
điền sát Hedyotis pressa-Rubiaceae", Tạp chí hóa học, 47(4A), tr. 304-306.
5. Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu (1985), "Phƣơng pháp nghiên cứu
hóa học cây thuốc", Nxb. Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 19-23, 43-52,
58-74, 243-283.
6. Trƣơng Thị Đẹp (2007), Thực vật dược, NXB Y học, tr.272-273.
7. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam Tập III, NXB. Trẻ, tr.106-123.
8. Đinh Thị Lan Hƣơng và Lê Thị Thanh Hƣơng Phân thích dạng sống và
yếu tố địa lý của thực vật làm thuốc ở huyện Đồng Hỷ, tình Thái Nguyên,
Tập 112, Tạp chí khoa học và công nghệ, tr.138.
9. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb.
Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.21.
10. Trần Văn Sung (2002), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân trong hóa hữu cơ,
Nxb. Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.8.
11. Nguyễn Duy Thuần (2006), Chiết xuất dược liệu - Nghiên cứu thuốc từ thảo
dược (Giáo trình sau Đại học), NXb. Khoa học và K thuật, Hà Nội, tr.199-
222.
12. Đào Đình Thức (2007), Một số phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học,
Nxb. Đại học Quốc gia, Hà Nội, tr.177-217, 311-316.
Tài liệu Tiếng Anh:
13. Agrawal S. (2013), "Evaluation of antiulcer activity of Oldenlandia
corymbosa (L.)", International Journal of Research and Development in
Pharmacy and Life Sciences 2(2), pp. 363-367.
14. Ahmad R., Ali A.M., Israf D.A., Ismail N.H., Shaari K. and Lajis N.H.
(2005), "Antioxidant, radical-scavenging, anti-inflammatory, cytotoxic and
antibacterial activities of methanolic extracts of some Hedyotis species", Life
Sciences, 76(17), pp. 1953-1964.
15. Ahmad R., Hamzah A.S., Jasmani H., Baba A.R., Lajis N.H. and
Konishi M. (2001), "Coumarins from Hedyotis dichotoma", Pertanika
Journal of Science and Technology, 9(2), pp. 143-147.
16. Ahmad R., Shaari K., Lajis N.H., Hamzah A.S., Ismail N.H. and
Kitajima M. (2005), "Anthraquinones from Hedyotis capitellata",
Phytochemistry, 66(10), pp. 1141-1147.
17. Ai-Lian Zhang, Qi Ye, Bo-Gang Li, Hua-Yi Qi and Guo-Lin Zhang
(2005), "Phenolic and Triterpene Glycosides from the Stems of Ilex
litseaefolia", Journal Natural Products, 68, pp. 1531-1535.
18. Bossière M., Basuki I., Koponen P., Wan M. and Sheil D. (2006),
"Biodiversity and Local Perceptions on the Edge of a Conservation Area,
Khe Tran Village, Vietnam", Inti Prima Karya, Jakarta, ISBN 979-24-4642-
7.
19. Cantrell C.L., Franzbau S.G. and Fischer N.H. (2001),
"Antimycobacterial plant terpenoids", Planta Medica, 67, pp. 685-694.
20. Castle S. Sharon (2007), "Ampicillin", In xPharm: The Comprehensive
Pharmacology Reference, Elsevier, New York, pp. 1-6.
21. Chen T. and Taylor C.M. (2011), Flora of China, Science Press, Beijing,
and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, 19, pp. 147-174.
22. David J. Newman and Gordon M. Cragg (2014), "Natural Products as
Sources of New Drugs from 1981 to 2014", Journal Natural Products.
23. Fatema U.K. and Hossain M.S. (2014), "Anagesic effect of ethanol extract
of Hedyotis corymbosa L. whole plant", International Research Journal of
Pharmacy, 5(1), pp. 21-24.
24. Gupta R.K., Singh R.K, Swain S.R., Hussain T. and Rao C.V. (2012),
"Anti–hepatotoxic potential of Hedyotis corymbosa against D–
galactosamine–induced hepatopathy in experimental rodents", Asian Pacific
Journal of Tropical Biomedicine, 5, pp. 1542-1547.
25. Hamzah A.S., Lajis N.H. and Sargent M.V. (1994), "Kaempferitrin from
the leaves of Hedyotis verticullata and its biological activity", Planta
Medica, 60, pp. 388-389.
26. Ho T.I., Chen G.P., Lin Y.C., Lin Y.M. and Chen F.C. (1986), "An
anthraquinone from Hedyotis diffusa", Phytochemistry, 25(8)(17), pp. 1988-
1989.
27. Hui W.H. and Li M.M. (1977), "Triterpenoids and sterols from the stems of
Hedyotis acutangula", Phytochemistry, 16(8), pp. 1309-1310.
28. Hussain A.Z. and Kumaresan S. (2013), "Phytochemical and antimicrobial
evaluation of Oldenlandia corymbosa", Asian Journal Plant Science and
Research, 3(4), pp. 155-158.
29. Jerapan Krungkrai and Sudaratana Rochanakij Krungkrai (2016),
"Antimalarial qinghaosu/artemisinin: The therapy worthy of a Nobel Prize",
Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine.
30. Jesus J.A., Lago J.H., Laurenti M.D., Yamamoto E.S. and Passero L.F.
(2015), "Antimicrobial activity of oleanolic and ursolic acids: an update",
Evid Based Complement Alternat Med, 2015(620472).
31. Jie‐Ping Fan and Chao‐Hong He (2006), "Single‐Step Preparative
Separation of Barbinervic Acid and its Epimer (Rotungenic Acid), Along
with Two Other Pentacyclic Triterpene Acids from the Leaves of Diospyros
kaki Using HSCCC", Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies, 29, pp. 815-826.
32. Jing-Jy Cheng, Li-Jie Zhang, Hui-Ling Cheng, Chun-Tang Chiou, I-
Jung Lee and Yao-Haur Kuo (2010), "Cytotoxic Hexacyclic Triterpene
Acids from Euscaphis japonica", Journal Natural Products, 73, pp. 1655-
1658.
33. Jiří Patočka (2003), "Biologically active pentacyclic triterpenes and their
current medicine signification", Journal of Applied Biomedicine 1, pp. 7-12.
34. Joseph J.M., Sowndhararajan K. and Manian S. (2010), "Evaluation of
analgesic and anti-inflammatory potential of Hedyotis puberula (G. Don) R.
Br. ex Arn. in experimental animal models", Food and Chemical Toxicology,
48(7), pp. 1876-1880.
35. Kang X.D., Li X., Zhao C.C. and Mao Y. (2008), "Two new
anthraquinones from Hedyotis diffusa W.", Journal of Asian Natural
Products Research, 10(1), pp. 193-197.
36. Kayoko Amimoto, Kazuko Yoshikawa and Shigenobu Afuhara (1993),
"Triterpenes and Triterpene glycosides from the leaves of Ilex rotunda",
Phytochemistry, 33(6), pp. 1475-1480.
37. Kazuya Watanabe and George Bennett (2009), "Chemical biotechnology:
an expanding discipline that contributes to sustainable development in the
21st century", Current Opinion in Biotechnology, 20, pp. 607-609.
38. Kikuchi T., Matsuda S., Kadota S. and Tai T. (1985), "Studies on the
constituents of medicinal and related plants in Sri Lanka. I. New triterpenes
from Hedyotis lawsoniae", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33(4), pp.
1444-1451.
39. Kim Y., Park E.J., Kim S.R. and Kim Y.Y. (2001), "Neuroprotective
constituents from Hedyotis diffusa", Journal Natural Products, 64(1), pp. 75-
78.
40. Konishi M., Hano Y., Takayama M., Nomura T., Hamzah A.S, Ahmad
R. and Jasmani H. (1998), "Triterpenoid saponins from Hedyotis
nudicaulis", Phytochemistry, 48(3), pp. 525-528.
41. Lu C.M., Yang J., Wang P. and Lin C. (2000), "A new acylated flavonol
glycoside and antioxidant effects of Hedyotis diffusa", Planta Medica, 66,
pp. 374-377.
42. Luis C. Scalon Cunha, Mircio L. Andrade e Silva, Niege A. J. Cardoso
Furtado, Adriana H. C. Vinho´lis, Carlos H. Gomes Martins, Ademar A.
da Silva Filho and Wilson R. Cunha (2007), "Antibacterial Activity of
Triterpene Acids and Semi-Synthetic Derivatives against Oral Pathogens", Z.
Naturforsch C. , 62(9-10), pp. 668-672.
43. Mahibalan S., Gopal N., Pandian P.S. and Jasmine S. (2009), "Anti-
Inflammatory activity of various extracts of Hedyotis Umbellata Linn",
Natural Products: An Indian Journal, 4(3), pp. 184-186.
44. Mani Saminathan and Ram Bahal Rai (2013), "Systematic Review on
Anticancer Potient and other Health Beneficial Pharmacological Activities of
Novel Medicinal Plant Morinda citrifolia (Noni)", International Journal of
Pharmacology, pp. 7.
45. Masayuki Yoshikawa, Shoko Yamaguchi, Hiroko Nishisaka, Johji
Yamahara and Nobutoshi Murakami (1995), "Chemical Constituents of
Chinese Natural Medicine, Morindae Radix, the Dried Roots of Morinda
oficinallis How.: Structures of Morindolide and Morofficinaloside",
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 43, pp. 1462-1465.
46. Matsuda S., Kadota S., Tai T. and Kikuchi T. (1984), "Isolation and
structures of Hedyotisol-A, -B, and -C. Novel dilignans from Hedyotis
lawsoniae", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, pp. 5066-5069.
47. Mishra K., Dash A.P., Swain B.K. and Dey N. (2009), "Anti-malarial
activities of Andrographis paniculata and Hedyotis corymbosa extracts and
their combination with curcumin", Malaria Journal, 8(26), pp. 1-9.
48. Nakatani M., Miyazaki Y., Iwashita T., Naoki H. and Hase T. (1989),
"Triterpenes from Ilex rotunda fruits", Phytochemistry, 28(5), pp. 1479-
1482.
49. Newman M., Ketphanh S., Svengsuksa B., Thomas P., Sengdala K.,
Lamxay V. and Amstrong K. (2007), "A Checklist of the Vascular Plants
of Lao PDR", Royal Botanic Garden Edinburgh, ISBN 978-1-906129-04-0,
pp. 307.
50. Nguyen M.P., Tran V.S., Porzel A., Schmidt J. and Adam G. (1999),
"Two new β-carboline alkaloids from Hedyotis capitellata var.mollis",
Planta Medica, 65(8), pp. 761-762.
51. Nordin H.J.L. and Rohaya A. (2006), "Phytochemical Studies and
Pharmacological Activities of Plants in Genus Hedyotis/Oldenlandia",
Studies in Natural Products Chemistry, 33, pp. 1057-1090.
52. Number of threatened species by major groups of organisms (1996-2010)
(2010), International Union for Conservation of Nature.
53. Oggioni M.R., Pozzi G., Valensin P.E., Galieni P. and Bigazzi C. (1998),
"Recurrent septicemia in an immunocompromised patient due to probiotic
strains of Bacillus subtilis", J. Clin. Microbiol., 36(1), pp. 325-326.
54. Peng J. N, Feng X. Z and Liang X. T (1998), "Iridoids from Hedyotis
hedyotidea", Phytochemistry, 47(8), pp. 1657-1659.
55. Peng J.N., Feng X. Z., Zheng O.T. and Liang X. T. (1997), "A β-carboline
alkaloid from Hedyotis chrysotricha", Phytochemistry, 46(6), pp. 1119-1121.
56. Peng J.N., Feng X.Z., Li G.Y. and Liang X.T. (1997), "Chemical
investigation of genus Hedyotis. II. Isolation and identification of iridoids
from Hedyotis chrysotricha", Acta Pharmaceutica Sinica, 32(12), pp. 908-
913.
57. Peng J.N., Feng X.Z. and Liang X.T. (1999), "Two new iridoids from
Hedyotis chrysotricha", Journal Natural Products, 62, pp. 611-612.
58. Permana D., Lajis N.H., Othman A.G., Ali A.M., Aimi N., Kitajima M.
and Takayama H. (1999), "Anthraquinones from Hedyotis herbacea",
Journal Natural Products, 62, pp. 1430-1431.
59. Phuong N.M., Sung T.V., Porzel A., Schmidt J., Merzweiler K. and
Adam G. (1999), "β-Carboline alkaloids from Hedyotis capitellata",
Phytochemistry, 52(8), pp. 1725-1729.
60. Phuong Thien Thuong, Chul Ho Lee, Trong Tuan Dao, Phi Hung
Nguyen, Wan Gi Kim, Sang Jun Lee and Won Keun Oh (2008),
"Triterpenoids from the Leaves of Diospyros kaki (Persimmon) and Their
Inhibitory Effects on Protein Tyrosine Phosphatase 1B", Journal Natural
Products, 71, pp. 1775-1778.
61. Rajiv Roy, Shyamal K. Jash, Raj K. Singh and Dilip Gorai (2015),
"Limnophila (Scrophulariaceae): Chemical and Pharmacological aspects ",
World Journal of Pharmaceutical Research 4(7), pp. 1269-1300.
62. Rustam I. Aminov (2010), "A Brief History of the Antibiotic Era: Lessons
Learned and Challenges for the Future", Frontiers Microbiology, 1(134).
63. Shi-gao Yang, Wei-yun Wang, Tie-jun Ling, Ying Feng, Xue-ting Du, Xi
Zhang, Xiao-xia Sun, Min Zhao, Di Xue A, Yang Yang and Rui-tian Liu
(2010), "Alpha-tocopherol quinone inhibits beta-amyloid aggregation and
cytotoxicity, disaggregates preformed fibrils and decreases the production of
reactive oxygen species, NO and inflammatory cytokines", Neurochemistry
International, 57(8), pp. 914-922.
64. Shi Y., Wang C.H. and Gong X.G. (2008), "Apoptosis-inducing effects of
two anthraquinones from Hedyotis diffusa Willd", Biological and
Pharmaceutical Bulletin, 31(6), pp. 1075-1078.
65. Sivapraksam S.S.K., Karunakaran K., Subburaya U., Kuppusamy S.
and Subashini T.S. (2014), "A Review on Phytochemical and
Pharmacological Profile of Hedyotis corymbosa Linn", International Journal
of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 26(1), pp. 320-324.
66. Sung J.H., Lee J.O., Son J.K., Park N.S., Kim M.R., Kim J.G. and Moon
D.C. (1999), "Cytotoxic constituents from Solidago virga-aurea var.
gigantea MIQ", Archives of Pharmacal Research, 22, pp. 633-634.
67. Victor Kuete (2010), "Potential of Cameroonian Plants and Derived
Products against Microbial Infections: A Review", Planta Medica, 76, pp.
1479-1491.
68. Wang J.H., Shu L.H., Yang L.L., Zhang M. and He P. (2011), "2-
Hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa Willd Induces
Apoptosis via Alteration of Fas/FasL and Activation of Caspase-8 in Human
Leukemic THP-1 Cells", Archives of Medical Research, 42(7), pp. 577-583.
69. Wang N., Li D.Y., Niu H.Y., Zhang Y., He P. and Wang J.H. (2013), "2-
hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa Willd induces
apoptosis in human leukemic U937 cells through modulation of MAPK
pathways", Archives of Medical Research, 36(6), pp. 752-758.
70. World Health Organization (2014), Antimicrobial resistance: global report
on surveillance: France World.
71. Wu H., Tao X., Chen Q. and Uo X. (1991), "Iridoids from Hedyotis
diffusa", Journal Natural Products, 54(1), pp. 254-256.
72. Ying-Jun Zhang and Chong-Ren Yang (1994), "Two triterpenoid from
Gentiana tibetica", Phytochemistry, 36(4), pp. 997-999.
Tài liệu từ các Website:
73. "Infectious Diseases" Wesite: Smart Global Health.org, địa chỉ URL:
www.smartglobalhealth.org/issues/entry/infectious-diseases (Truy cập lần
cuối ngày 05/05/2016).
Phổ 1H-NMR – HP1
Phổ 13C-NMR – HP1
P h ổ H S Q C – H P 1
P h ổ H M B C – H P 1
Phổ 1H-NMR – HP2
Phổ 13C-NMR – HP2
P h ổ H S Q C – H P 2
P h ổ H M B C – H P 2
%20--%3e%3cdefs%3e%3cstyle%3e%20.st0%20{%20fill:%20%23fff;%20}%20.st1%20{%20fill:%20%237800fa;%20}%20%3c/style%3e%3c/defs%3e%3cpath%20class='st1'%20d='M117.78,12.18H43.11c2.9,3.47,4.65,7.94,4.65,12.82,0,5.6-2.3,10.66-6.01,14.29h76.02l7.22-13.56-7.22-13.56Z'/%3e%3cg%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M53.58,26.17h-.59v-1.46h.59v-4.96h2.83c1.78,0,2.67.94,2.67,2.82v5.76c0,1.87-.89,2.81-2.67,2.81h-2.83v-4.96ZM55.36,21.37v3.34h1.1v1.46h-1.1v3.34h1.01c.61,0,.91-.37.91-1.1v-5.93c0-.74-.3-1.1-.91-1.1h-1.01Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M65.99,31.14h-1.8l-.31-2.07h-2.19l-.31,2.07h-1.64l1.82-11.39h2.62l1.82,11.39ZM65.28,18.04c-.25.46-.51.77-.75.94-.21.15-.47.22-.79.22-.26,0-.57-.07-.92-.22l-.38-.15c-.14-.05-.26-.07-.37-.07-.3,0-.53.18-.71.54l-.91-.68c.25-.46.51-.77.75-.94.21-.14.48-.21.79-.21.26,0,.57.07.92.21l.38.15c.14.05.26.07.37.07.3,0,.53-.18.71-.54l.91.68ZM61.91,27.52h1.73l-.87-5.76-.87,5.76Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M74.53,26.89v1.52c0,1.91-.89,2.86-2.67,2.86s-2.67-.95-2.67-2.86v-5.93c0-1.91.89-2.86,2.67-2.86s2.67.95,2.67,2.86v1.11h-1.69v-1.22c0-.75-.31-1.12-.93-1.12s-.93.37-.93,1.12v6.15c0,.74.31,1.11.93,1.11s.93-.37.93-1.11v-1.63h1.69Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M81.4,31.14h-1.8l-.31-2.07h-2.19l-.31,2.07h-1.64l1.82-11.39h2.62l1.82,11.39ZM75.9,19.2l1.52-1.91h1.71l1.51,1.91h-1.61l-.76-.95-.75.95h-1.61ZM77.32,27.52h1.73l-.87-5.76-.87,5.76ZM83.1,15.99l-1.76,1.91h-1.26l1.17-1.91h1.86Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M84.86,19.75c1.78,0,2.67.94,2.67,2.82v1.48c0,1.87-.89,2.81-2.67,2.81h-.85v4.28h-1.79v-11.39h2.64ZM84.01,21.37v3.86h.85c.58,0,.87-.36.87-1.08v-1.71c0-.71-.29-1.07-.87-1.07h-.85Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M93.51,19.75c1.78,0,2.67.94,2.67,2.82v1.48c0,1.87-.89,2.81-2.67,2.81h-.85v4.28h-1.79v-11.39h2.64ZM92.66,21.37v3.86h.85c.58,0,.87-.36.87-1.08v-1.71c0-.71-.29-1.07-.87-1.07h-.85Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M98.8,31.14h-1.79v-11.39h1.79v4.88h2.03v-4.88h1.83v11.39h-1.83v-4.88h-2.03v4.88Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M105.36,24.55h2.46v1.62h-2.46v3.34h3.09v1.63h-4.88v-11.39h4.88v1.63h-3.09v3.18ZM108.17,17.29l-1.76,1.91h-1.26l1.17-1.91h1.86Z'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M112.2,19.75c1.78,0,2.67.94,2.67,2.82v1.48c0,1.87-.89,2.81-2.67,2.81h-.85v4.28h-1.79v-11.39h2.64ZM111.35,21.37v3.86h.85c.58,0,.87-.36.87-1.08v-1.71c0-.71-.29-1.07-.87-1.07h-.85Z'/%3e%3c/g%3e%3ccircle%20class='st1'%20cx='25'%20cy='25'%20r='20'/%3e%3cpath%20class='st0'%20d='M32.78,19.27c2.92,0,4.43,2.55,5.28,5.33l.71,2.17c.14.38-.33.75-.71.75h-5.61c.19-.33.24-.71.09-1.08l-.75-2.45c-.43-1.32-.99-2.64-1.79-3.77.75-.57,1.65-.94,2.78-.94h0ZM25,18.38c3.25,0,4.9,2.78,5.89,5.89l.76,2.45c.14.42-.33.8-.8.8h-11.69c-.42,0-.94-.38-.8-.8l.75-2.45c.99-3.11,2.64-5.89,5.89-5.89h0ZM25,11.35c1.74,0,3.11,1.37,3.11,3.11s-1.37,3.11-3.11,3.11-3.11-1.41-3.11-3.11,1.41-3.11,3.11-3.11h0ZM17.27,19.27c1.08,0,1.98.38,2.73.94-.8,1.13-1.37,2.45-1.74,3.77l-.8,2.45c-.14.38-.05.75.09,1.08h-5.56c-.42,0-.9-.38-.75-.75l.71-2.17c.9-2.78,2.41-5.33,5.33-5.33h0ZM17.27,12.91c1.51,0,2.78,1.27,2.78,2.83s-1.27,2.83-2.78,2.83-2.83-1.27-2.83-2.83,1.27-2.83,2.83-2.83h0ZM32.78,12.91c1.56,0,2.78,1.27,2.78,2.83s-1.23,2.83-2.78,2.83-2.83-1.27-2.83-2.83,1.27-2.83,2.83-2.83h0ZM27.07,28.56v.09c0,.57-.24,1.08-.61,1.46h0v.05c-.38.33-.9.57-1.46.57s-1.08-.24-1.46-.61h0c-.38-.38-.61-.9-.61-1.46v-.09h1.41v.09c0,.19.05.38.19.47v.05c.09.09.28.19.47.19s.38-.09.47-.19v-.05c.14-.09.24-.28.24-.47t-.05-.09h1.41ZM30.99,28.56v.09c0,1.65-.66,3.16-1.74,4.24-1.08,1.08-2.59,1.79-4.24,1.79s-3.16-.71-4.24-1.79l-.05-.05c-1.04-1.08-1.7-2.55-1.7-4.2v-.09h1.41v.09c0,1.27.47,2.4,1.27,3.25h.05c.85.85,1.98,1.37,3.25,1.37s2.4-.52,3.25-1.37c.85-.8,1.37-1.98,1.37-3.25v-.09h1.37ZM34.99,28.56v.09c0,2.78-1.13,5.28-2.92,7.07-1.79,1.79-4.29,2.92-7.07,2.92s-5.23-1.13-7.07-2.92c-1.79-1.79-2.92-4.29-2.92-7.07v-.09h1.41v.09c0,2.4.94,4.53,2.5,6.08,1.56,1.56,3.72,2.5,6.08,2.5s4.52-.94,6.08-2.5c1.56-1.56,2.5-3.68,2.5-6.08v-.09h1.41Z'/%3e%3c/svg%3e)
