Luận án Tiến sĩ Vật lý: Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano bán dẫn PbS, nano kim loại quý Au, Ag và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_______________________

LƯU MẠNH QUỲNH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO BÁN DẪN PbS,

NANO KIM LOẠI QUÝ Au, Ag

VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC

Chuyên ngành: Vật lý chất rắn

Mã số: 9441030.02

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS. TS. LÊ VĂN VŨ

2. PGS. TS. NGUYỄN NGỌC LONG

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Văn Vũ và

PGS. TS. Nguyễn Ngọc Long đã luôn tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt tôi trong quá trình

nghiên cứu thực hiện luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý,

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi để tôi có thể hoàn thành quá trình học tập nghiên cứu, thực hiện luận án.

Tôi cũng xin cảm ơn Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Viện nghiên cứu tế bào gốc và

công nghệ gen, Bệnh viện Đa khoa Quốc Tế VINMEC đã tận tình giúp đỡ, tạo điều

kiện để tôi thực hiện các nghiên cứu ứng dụng sinh học liên quan đến đề tài.

Xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Quang Hòa, ThS. Vƣơng Văn Hiệp, ThS.

Sái Công Doanh cùng tập thể anh chị em Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận

án.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn tới những ngƣời thân trong gia đình, các

em sinh viên Khoa Vật lý luôn sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên

cứu thực hiện luận án. Cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn động viên, cổ vũ để tôi

hoàn thành luận án này.

Tác giả

i

Lƣu Mạnh Quỳnh.

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoạn đây là công trình nghiên cứu riêng của tác giả dƣới sự

hƣớng dẫn của PGS. TS. Lê Văn Vũ và PGS. TS. Nguyễn Ngọc Long. Các số liệu và

kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc tác giả khác công bố trong bất kỳ

công trình nào.

Hà Nội, tháng 2 năm 2020.

Tác giả

ii

Lƣu Mạnh Quỳnh

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................................... ii MỤC LỤC ..................................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ..................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................................................... 1 2. Mục tiêu luận án .......................................................................................................................... 4 3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................................... 4 4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................................. 5 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .................................................................................. 5 6. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................................ 6 Cấu trúc của luận án ......................................................................................................................... 6 CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN ............................................................................................................ 8 1.1. CẢM BIẾN SINH HỌC ........................................................................................................... 8 1.2. CẢM BIẾN SINH HỌC XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ GLUCOSE .............................................. 11 1.2.1. Cảm biến sinh học điện hóa đo nồng độ glucose ................................................................. 11 1.2.2. Cảm biến sinh học đo nồng độ glucose sử dụng vật liệu nano ............................................ 16 1.2.3. Lựa chọn đối tƣợng vật liệu ................................................................................................. 18 1.3. CẢM BIẾN ĐO ĐẠC NỒNG ĐỘ TẾ BÀO GỐC MÁU ...................................................... 18 1.3.1. Nguyên lý kháng nguyên – kháng thể trong nhận biết tế bào .............................................. 19 1.3.2. Cảm biến sinh học sử dụng phép đo tổng trở trong đo đạc tế bào ....................................... 22 1.3.3. Vật liệu nano trong cảm biến đo đạc tế bào ......................................................................... 25 1.3.4. Lựa chọn đối tƣợng vật liệu ................................................................................................. 27 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO VẬT LIỆU ...................................................................... 28 1.4.1. Vật liệu sulfide kim loại ....................................................................................................... 28 1.4.2. Vật liệu nano kim loại .......................................................................................................... 29 1.4.3. Vật liệu đa chức năng từ tính – kim loại .............................................................................. 31 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC ....................................................................... 32 KẾT LUẬN CHƢƠNG I ............................................................................................................... 36 CHƢƠNG 2: CHẾ TẠO VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................... 37 2.1. CHẾ TẠO VẬT LIỆU ............................................................................................................ 37 2.1.1. Chế tạo vật liệu PbS bằng phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp ủ laser ................................. 37 2.1.2. Chế tạo các hạt nano kim loại bằng phƣơng pháp nuôi mầm .............................................. 38 2.1.3. Chế tạo các hạt nano đa chức năng bằng phƣơng pháp hóa ƣớt .......................................... 39

iii

MỤC LỤC

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..................................................................................... 43 2.2.1.Các phƣơng pháp thực nghiệm ............................................................................................. 43 2.2.2.Phƣơng pháp tính toán lý thuyết ........................................................................................... 54 KẾT LUẬN CHƢƠNG II .............................................................................................................. 55 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU NANO PbS, NANO VÀNG VÀ NANO ĐA CHỨC NĂNG Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag ...................................................................................................................... 57 3.1. VẬT LIỆU NANO PbS .......................................................................................................... 57 3.2. VẬT LIỆU NANO VÀNG ..................................................................................................... 63 3.3. VẬT LIỆU NANO ĐA CHỨC NĂNG Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag ............................................... 72 3.3.1. Vật liệu nano từ tính Fe3O4 .................................................................................................. 72 3.3.2. Vật liệu nano đa chức năng Fe3O4-Au ................................................................................. 74 3.3.3. Vật liệu nano đa chức năng Fe3O4-Ag ................................................................................. 84 KẾT LUẬN CHƢƠNG III ............................................................................................................ 88 CHƢƠNG 4: ỨNG DỤNG VẬT LIỆU NANO TRONG CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ............................................................................................................................................... 90 4.1. CHẾ TẠO CẢM BIẾN GLUCOSE SỬ DỤNG CÁC HẠT NANO PbS .............................. 90 4.1.1. Thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc .......................................................................... 90 4.1.2. Kết quả và thảo luận ............................................................................................................ 93 4.1.3. Tƣơng tác giữa hạt PbS với phân tử 4-ATP ...................................................................... 100 4.2. ỨNG DỤNG CÁC HẠT NANO TỪ TÍNH – KIM LOẠI TRONG PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC MÁU TỪ MẪU TỦY XƢƠNG ............................................................................... 102 4.2.1. Thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc ........................................................................ 103 4.2.2. Kết quả và thảo luận .......................................................................................................... 107 KẾT LUẬN CHƢƠNG IV .......................................................................................................... 123 KẾT LUẬN .................................................................................................................................. 125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ............................................ 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................... 127

iv

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

4-ATP A2P-TRP

ADN ADP ATP APTES CE CNT CPE CTAB CV DFT ĐH BKHN ĐH KHTN ECD

EDC FACS

FAD FADH Fe(cp2) [Fe(CN)6]3-/4- FITC

v

G-6P-D GHD GOx HIV HR-TEM 4-aminothiophenol Phƣơng pháp hai pha nƣớc sử dụng polymer nhạy với nhiệt độ (Aquaeous two-phase system using temperature responsive polymer) A xít Deoxyribose nucleotide Adenosine diphosphate Adenosine triphosphate (3-Aminopropyl)triethoxysilane Điện cực đếm (Counter Electrode) Ống nano các bon (Carbon nanotube) Phần tử pha hằng số (Constant phase element) Cetyltrimethyl ammonium bromide Hiệu điện thế quét vòng (Cyclic voltammetry) Lý thuyết hàm mật độ (Density Funtional Theory) Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chất huỳnh quang hữu cơ, phát ánh sáng đỏ (Phycoerythrin – Texas Red) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Phƣơng pháp lọc phân lập tế bào kích hoạt huỳnh quang (Fluorescence-activated cell sorting) Flavin adenine dinucleotide Dạng khử của FAD khi thêm một nguyên tử hydrogen Ferrocencemonocarbolxylic acid Dung môi Ferrocianide Chất huỳnh quang hữu cơ phát ánh sáng xanh lá cây (Fluorescein isothiocyanate) Enzyme Glucose-6P-dehydrogenase Enzyme Glucose-1-dehydrogenase Enzyme Glucose Oxidase Virus gây suy giảm miễn dịch (Human immunodeficiency virus) Hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (High resolution TEM)

LDA

MACS

MetS NAD+ NADH NADP+ NADPH NAFOSTED PBS PGSTATS PS PVP QDs RE SDS SELEX

SEM SER SERS

TA TAA TEM truyền qua (Transmitted electron tử

TO TOAB UV-vis VSM trên hệ

vi

WE XRD Phƣơng pháp tính toán gần đúng dựa trên hàm mật độ định xứ (Localized Density Approximation). Phƣơng pháp phân lập tế bào kích hoạt từ (magnetic-activated cell sorting) Vật liệu sulfide kim loại Nicotinamide adenine dinucleotide Dạng khử của NAD khi thêm một nguyên tử hydrogen Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Dạng khử của NADP+ khi thêm một nguyên tử hydrogen Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia Đệm phosphate (Phosphate buffer solution) Hệ điện hóa tích hợp (Nhà sản xuất và cung cấp: MetroOhm) Polystyrene Polyvinyl pyrolidone Chấm lƣợng tử (Quantum dots) Điện cực tham chiếu (Reference Electrode) Sodium dodecyl sulphate Phƣơng pháp phát triển hệ thống các phối tử bởi sự làm giàu theo hàm mũ (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) Kính hiển vi điện tử quét Raman tăng cƣờng bề mặt (Surface enhanced Raman) Tín hiệu Raman tăng cƣờng bề mặt (Surface enhanced Raman signal) Dao động âm ngang (transverse aucostic) Thioacetamide Kính hiển vi điện microscope) Dao động quang ngang (transverse optic) Tetraoctyl ammonium bromide Tử ngoại – khả kiến (phổ hấp thụ quang học trong vùng UV-vis) Phép đo từ kế mẫu rung (Vibrating sample measurement) Điện cực làm việc (Working Electrode) Giản đồ nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction)

Danh mục các bảng

Bảng 1.1. Các phần tử có thể đƣợc dùng để chế tạo cảm biến sinh học .............................. 9

Bảng 1.2. Thống kê một số nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano để chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose .................................................................................... 17

Bảng 1.3. Ƣu và nhƣợc điểm một số phƣơng pháp sử dụng cơ chế cảm biến sinh học để lọc tế bào gốc ................................................................................................................. 21

Bảng 1.4. Thống kê nghiên cứu về chế tạo cảm biến sinh học tại một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc ................................................................................................................... 35

Bảng 3.1. So sánh giá trị hằng số mạng và kích thƣớc tinh thể tính toán từ giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt PbS trƣớc và sau khi ủ nhiệt laser ........................... 61

Bảng 4.1. Bảng thống kê các kết quả tính toán lý thuyết và đo đạc vị trí đỉnh đặc trƣng Raman tăng cƣờng bề mặt của phân tử 4-ATP trên bề mặt các hạt nano vàng ...... 109

vii

Bảng 4.2. Bảng các tham số fit đƣợc từ các kết quả đo tổng trở ..................................... 121

Danh mục các hình vẽ

Hình 1.1. Sơ đồ khối của cảm biến sinh học ...................................................................... 10

Hình 1.2. Mô hình các thế hệ cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose. .................... 13

Hình 1.3. Cấu trúc thƣờng thấy của WE trong cảm biến sinh học đo nồng độ glucose .... 15

Hình 1.4. Đồ thị hiệu chỉnh đặc trƣng của cảm biến sinh học sử dụng enzyme GOx ....... 16

Hình 1.5. Mô hình nguyên lý liên kết kháng nguyên - kháng thể trong cảm biến sinh học khảo sát, đo đạc tế bào ................................................................................................. 20

Hình 1.6. Nghiên cứu sử dụng kháng thể cố định trên bề mặt điện cực để đo nồng độ tế bào (ở đây là E. Coli) và sự thay đổi của Rct theo nồng độ tế bào ................................. 22

Hình 1.7. Ứng dụng mô hình đơn giản R//C trong khảo sát tế bào bám trên bề mặt điện cực .............................................................................................................................. 24

Hình 1.8. Một số mô hình điện cực kích thƣớc micromet đƣợc thiết kế để khảo sát tế bào ...................................................................................................................................... 25

Hình 1.9. Mô hình cảm biến sử dụng còi carbon làm điện cực để tăng diện tích tiếp xúc cũng nhƣ độ tƣơng thích sinh học; sau đó các hạt nano vàng đƣợc chức năng hóa, bắt cặp với kháng thể đặc hiệu rồi cố định lên trên bề mặt tế bào để làm tăng tín hiệu điện hóa ...................................................................................................................... 26

Hình 1.10. Thống kê số đề tài NAFOSTED về cảm biến sinh học từ năm 2011 đến năm 2016 ............................................................................................................................ 33

Hình 2.1. Chế tạo các hạt nano PbS bằng phƣơng pháp hóa siêu âm. Hình A mô tả các bƣớc thí nghiệm chế tạo hạt. Hình B là ảnh thực tế quá trình chế tạo hạt. .................. 37

Hình 2.2. Quy trình chế tạo và nghiên cứu sự phát triển của các hạt nano vàng trong dung dịch chứa chất hoạt động bề mặt. .............................................................................. 39

Hình 2.3. Quy trình chế tạo các hạt nano Fe3O4 bằng phƣơng pháp đồng kết tủa ............ 41

Hình 2.4. Mô tả tán xạ của chùm tia X trên bề mặt tinh thể .............................................. 44

Hình 2.5. Cấu trúc và hoạt động của máy đo nhiễu xạ tia X (XRD). Hình A: mô hình hoạt động của một máy XRD. Hình B: Ảnh của máy XRD Siemens D5005 tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học KHTN. ......................................... 45

Hình 2.6. Hình ảnh hệ đo LabRAM HR800, Horiba tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội . ..................................... 46

viii

Hình 2.7. Cấu trúc đơn giản của hệ hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................. 47

Hình 2.8. Hệ đo UV-2450, Shimadzu tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. .......................................................... 48

Hình 2.9. Phƣơng pháp hiệu điện thế quét vòng. Hình A biểu diễn sự phụ thuộc thời gian của điện thế đặt vào WE dạng xung tam giác với chu kỳ 2T. Hình B biểu diễn sự phụ thuộc dòng điện đi qua CE phụ thuộc vào hiệu điện thể đặt vào WE – giản đồ I-V ...................................................................................................................................... 50 Hình 2.10. Mô hình mạch tƣơng đƣơng của dung dịch chứa ion Mn+ (Mô hình của Randles). Hình A là mô hình mạch tƣơng đƣơng. Hình B là giản đồ Nyquist của mạch điện tƣơng đƣơng với các giá trị Rct khác nhau........................................................ 52

Hình 2.11. Hệ đo PGSTAT302N tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. ...................................... 53

Hình 3.1. Ảnh TEM (A) và HRTEM (B) và ảnh chụp nhiễu xạ điện tử (C) của mẫu các hạt nano PbS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp hóa siêu âm ........................................ 57

Hình 3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của quá trình ủ nhiệt laser đến phổ tán xạ Raman của mẫu bột chứa các hạt nano PbS ................................................................................... 58

Hình 3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt nano PbS trƣớc (a) và sau khi (b) ủ nhiệt laser ................................................................................................................... 60

Hình 3.4. Tính toán độ rộng vùng cấm của các hạt nano PbS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp hóa siêu âm từ phổ hấp thụ quang học. Hình trong: phổ hấp thụ quang học đo trên hệ UV245, Shimadzu của mẫu dung dịch chứa các hạt nano PbS ................. 63

Hình 3.5. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt nano Au. Hình A: ảnh TEM của các hạt ngay sau khi chế tạo. Hình B: ảnh TEM của các hạt sau khi ngâm trong 70 mM CTAB 4 tháng. Hình C: phổ phân bố kích thƣớc hạt của hai trƣờng hợp trên ...................................................................................................................................... 65

Hình 3.6. Phổ hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano vàng ngâm trong 70 mM CTAB, đƣợc đo ở các thời gian sau khi ngâm khác nhau lần lƣợt từ 1h đến 720h ........... 66

Hình 3.7. Sự phụ thuộc của vị trí đỉnh phổ hấp thụ UV-vis vào kích thƣớc hạt nano Au. Hình vẽ là kết quả tổng hợp từ các tài liệu tham khảo và các kết quả đo đƣợc từ các hạt nano vàng đã đƣợc chế tạo với các công nghệ khác nhau để có kích thƣớc khác nhau............................................................................................................................ 68

ix

Hình 3.8. Sự phụ thuộc của kích thƣớc hạt nano Au theo thời gian khi đƣợc ngâm trong các môi trƣờng dung môi khác nhau. Kích thƣớc hạt đƣợc tính toán từ lý thuyết Mie ..................................................................................................................................... 70

Hình 3.9. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4 đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa ................................................................................... 72

Hình 3.10. Ảnh TEM và HRTEM của mẫu các hạt Fe3O4 làm bằng phƣơng pháp đồng kết tủa ........................................................................................................................ 73

Hình 3.11. Đƣờng cong từ trễ của mẫu bột chứa các hạt nano Fe3O4 đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa ......................................................................................... 74

Hình 3.12. Đƣờng I-V thế quét vòng của mẫu chứa 1 mM HAuCl4 tại pH 3 ................... 75

- có tổng nồng Hình 3.14. Tổng điện tích điện hóa trong quá trình ion Au(OH)xCl4-x độ là 1 mM bị khử tại các pH khác nhau (hình trái) và phần trăm lƣợng ion bị hấp phụ lên bề mặt hạt nano Fe3O4 sau khi ngâm trong thời gian 30 phút (hình phải) ............ 78

Hình 3.13. Đƣờng phụ thuộc I-V phép đo điện thế quét vòng giới hạn trên đƣờng khử từ 0,1V đến 1,2 V của mẫu chứa dung dịch HAuCl4 1 mM ở các giá trị pH khác nhau ... 77

Hình 3.15. Ảnh TEM các hạt nano Fe3O4-Au dạng phức hợp đƣợc tạo thành từ việc khử dung dịch HAuCl4 bằng NaBH4 sau khi hạt Fe3O4 đƣợc ngâm trong dung dịch HAuCl4 ở pH 3 ................................................................................................................... 79

Hình 3.16. Ảnh TEM các hạt nano Fe3O4 trƣớc và sau khi gắn với các hạt nano Au. Hình A: Ảnh TEM của các hạt nano từ trƣớc khi gắn với các hạt nano Au.Hình B: các hạt nano Fe3O4 dạng phức hợp đƣợc tạo thành từ việc khử dung dịch HAuCl4 bằng NaBH4 sau khi ngâm các hạt Fe3O4 trong dung dịch 30 phút ở pH 8 ....................... 80

Hình 3.17. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nanophức hợp Fe3O4-Au và của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4................................................................................................. 81

Hình 3.18. Phổ hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano vàng tại các thời điểm khác nhau sau khi đặt nam châm bên cạnh cuvette .................................................................... 82

Hình 3.19. So sánh kích thƣớc các hạt nano Fe3O4 và Fe3O4-Ag. Hình A: Ảnh TEM của mẫu hạt Fe3O4. Hình B:Ảnh TEM của mẫu Fe3O4-Ag................................................ 84

Hình 3.20. Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4 và các hạt nano phức hợp Fe3O4-Ag ............................................................................................................ 85

Hình 3.21. Đƣờng cong từ trễ của mẫu bột chứa các hạt nano Fe3O4 (□), Fe3O4- APTES (○) và Fe3O4-Ag (∆). Các đƣờng nét liền là các đƣờng khớp hàm Langevin....... 86

Hình 3.22. Biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ hấp thụ vào nồng độ hạt đa chức năng Fe3O4-Ag ................................................................................................................... 87

x

Hình 3.23. Sự giảm của nồng độ các hạt Fe3O4-Ag trong dung dịch khi sử dụng nam châm để hút ........................................................................................................................ 88

Hình 4.1. Mô tả cấu tạo điện cực làm việc của cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose có sử dụng các hạt nano PbS ................................................................................. 92

Hình 4.2. Vai trò của GOx trong quá trình ô xi hóa của glucose và cảm biến xác định nồng độ glucose bằng điện cực vàng ................................................................................. 93

Hình 4.3. So sánh kết quả đo điện thế quét vòng (CV) của dung dịch chứa 0,2 mM glucose khi sử dụng điện cực chế tạo từ PbS-GOx với kết quả đo CV của mẫu dung dịch chứa GOx ................................................................................................................... 94

Hình 4.4. Kết quả đo CV của dung dịch chứa glucose với nồng độ tăng từ 0,1 M đến 1,3 M trên hệ điện hóa với điện cực WE có PbS-GOx ...................................................... 95

Hình 4.5. So sánh độ nhạy của cảm biến glucose đo trên hệ điện cực PbS với cảm biến glucose đo trên điện cực vàng .................................................................................... 97

Hình 4.6. Tính toán độ nhạy của cảm biến từ đỉnh ô xi hóa tại 1,14 V với điện cực làm việc WE có PbS-GOx .................................................................................................. 98

Hình 4.7. Mô tả phƣơng pháp tính toán phản ứng liên kết giữa phân tử 4-ATP và bề mặt PbS ............................................................................................................................ 100

Hình 4.8. Phụ thuộc tổng năng lƣợng của hệ PbS-4ATP phụ thuộc vào khoảng cách giữa hai nguyên tử tham gia liên kết (A) và giản đồ phân bố mật độ electron tại vị trí có tổng năng lƣợng thấp nhất (B) – liên kết là bền nhất .................................................. 101

Hình 4.9. Cấu hình bền vững của hệ PbS-4ATP sau khi liên kết: mặt phẳng phân tử 4-ATP tạo với mặt phẳng (001) của tinh thể một góc là 23,14o ...................................... 102

Hình 4.14. Cơ chế hoạt động của cảm biến sinh học sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag để phân lập và khảo sát tế bào gốc máu từ tủy xƣơng ..................................................... 103

Hình 4.15. Thiết kế điện cực sử dụng trong cảm biến đo nồng độ tế bào bằng phƣơng pháp điện tổng trở (A) và ảnh SEM của bề mặt điện cực (B) .......................................... 103

Hình 4.16. Ảnh chụp trên kính hiển vi phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm – Diện tích của một buồng nhỏ là 5 μm × 5 μm, chiều cao của buồng là 100 μm ............. 106

Hình 4.17. Mô hình sự có mặt của các tế bào gốc máu trên bề mặt điện cực.................. 107

Hình 4.18. Nghiên cứu phổ tán xạ Raman của các mẫu chứa các hạt nano sau khi gắn kháng thể .......................................................................................................................... 108

xi

Hình 4.19. Sự phụ thuộc của cƣờng độ huỳnh quang tại 610 nm của dung dịch chứa kháng thể ECD-antiCD34 vào nồng độ đƣợc pha loãng trong dung dịch đệm PBS ....... 110

Hình 4.20. Đánh giá hiệu suất gắn kháng thể lên các hạt Fe3O4-Au phụ thuộc vào tỉ lệ thể tích của dung dịch chứa hạt và thể tích dung dịch gốc chứa kháng thể ECD- antiCD34 .......................................................................................................................... 111

Hình 4.21. Kết quả hiển vi huỳnh quang của mẫu tủy xƣơng trƣớc (A, B) và sau (C, D) khi sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag-antibody để tách chiết tế bào gốc. A,C: huỳnh quang chỉ thị tế bào CD45+ và B,B: huỳnh quang chỉ thị tế bào CD34+ ........................ 113

Hình 4.22. Ảnh hiển vi trƣờng sáng (ảnh trên) và trƣờng tối (ảnh dƣới) của mẫu tế bào sau khi lọc và phổ tán xạ Raman tại các vị trí dƣợc đánh dấu trong hình ................ 114

Hình 4.23. Kết quả phép đo tổng trở trên hệ điện cực đã thiết kế với các nồng độ tế bào lần lƣợt là C0/5, C0/10, C0/20 và C0/50...................................................................... 116

Hình 4.24. Mô hình tổng trở của phần thể tích chiếm chỗ của 1 tế bào (ô cơ sở) ........... 117

Hình 4.25. Mô hình mạch tƣơng đƣơng của dung dịch chứa tế bào đƣợc để giữa hai điện cực đối song.............................................................................................................. 118

Hình 4.26. Mô hình mạch tƣơng đƣơng của phần dung dịch chứa tế bào ....................... 119

Hình 4.27. Kết quả khớp số liệu đo tổng trở với mô hình mạch tƣơng đƣơng của mẫu chứa tế bào nồng độ C0/5 ................................................................................................. 120

Hình 4.28. hình biểu diễn kết quả fit hai hàm và vào các

thông số đo đƣợc – khoảng dữ liệu lấy để fit [5:50] kHz ................................................ 121

xii

) ................................... 122 Hình 4.29. Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của các giá trị trở tƣơng đƣơng 1/RC (hình A) và CC (hình B) vào nồng độ tế bào theo chiều dài (

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Cảm biến sinh học chuyển hóa tín hiệu sinh học thành các tín hiệu đọc đƣợc,

đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học; chuyên để theo dõi, đánh giá các đối

tƣợng sinh học [12,16]. Ƣu điểm của cảm biến sinh học là có tính chọn lọc đặc hiệu,

vì vậy đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành khoa học, nhƣ công nghệ môi trƣờng [118]

hay công nghệ thực phẩm [14,44]. Nhờ sự phát triển của công nghệ điện tử, các tín

hiệu điện có thể điều khiển đến mức đủ nhỏ để không phá hủy mẫu sinh học, nhƣng

vẫn đảm bảo các tín hiệu đầu ra có thể đọc đƣợc [132]. Không chỉ vậy, tín hiệu điện

thƣờng dễ xử lý hơn so với các tín hiệu vật lý khác nhƣ tín hiệu quang hay tín hiệu

hóa. Vì thế, những cảm biến sinh học thế hệ đầu tiên là các cảm biến có tín hiệu đầu

ra là tín hiệu điện hóa ở dạng giản đồ thế quét vòng (CV) [44,117,118]. Cùng với

CV, các quá trình điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực của cảm biến điện hóa có thể

đƣợc khảo sát thông qua phƣơng pháp đo tổng trở (total impedance) [57,85,128].

Trong các cảm biến sinh học điện hóa, vật liệu nano thƣờng đƣợc đƣa lên trên

bề mặt điện cực để làm tăng diện tích tiếp xúc giữa đối tƣợng sinh học với điện cực,

nhằm tăng cƣờng tín hiệu đọc đƣợc; dẫn đến tăng độ nhạy của cảm biến [15]. Cảm

biến sinh học điện hóa xác định nồng độ glucose trong dung dịch thƣờng đƣợc sử

dụng để đánh giá vai trò của vật liệu nano trong chế tạo điện cực. Nếu nhƣ trong

những khảo sát ban đầu của D’Costa [23] và của Cass [11] - cảm biến chỉ sử dụng điện cực là các bon - độ nhạy của cảm biến lần lƣợt là 12 µAcm-2mM-1 và 5 µAcm- 2mM-1, thì khi cho thêm các vật liệu nano lên bề mặt điện cực, độ nhạy của cảm biến

tăng lên nhiều lần [1,2,70]. Đặc biệt, năm 2012, nhóm của Yang kết hợp đƣa vật liệu

nano vàng (Au) lên nền điện cực phủ grapheme, giúp cho độ nhạy của cảm biến xác định glucose đạt 711 µAcm-2mM-1[15].

Cùng hƣớng chế tạo cảm biến sinh học điện hóa xác định nồng độ glucose

trong dung dịch, nhiều vật liệu nano đã đƣợc các nhóm nghiên cứu trong nƣớc sử

1

dụng. Nhóm nghiên cứu của TS. Tống Duy Hiển thuộc Đại học Quốc gia TP HCM

sử dụng vật liệu dây Pt xốp đã đƣa đƣợc giới hạn khảo sát xuống 125 µM [60,101].

Nhóm nghiên cứu của PGS. Nguyễn Ngọc Long thuộc Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội sử dụng tín hiệu điện hóa của các dây 4 chân

(tetrapod) ZnO làm tín hiệu chỉ thị để xác định nồng độ glucose trong dung dịch cho độ nhạy 166 µAcm-2mM-1 [70].

Các nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa hầu nhƣ chỉ tập trung vào khai

thác khả năng làm tăng độ nhạy thông qua việc làm tăng diện tích tiếp xúc giữa vật

liệu nano đƣợc cố định trên bề mặt điện cực và đối tƣợng sinh học là các enzyme ô xi

hóa khử nhƣ glucose oxidase (GOx) hay glucose dehydrogenase (GDH). Một số

nghiên cứu tính chất quang của các chấm lƣợng tử đã bƣớc đầu cho thấy sự tƣơng

thích sinh học và khả năng chuyển hóa electron giữa các phân tử GOx với các chấm

lƣợng tử chứa lƣu huỳnh nhƣ ZnS [136] hay PbS [130]. Điều này cho thấy các chấm

lƣợng tử chứa lƣu huỳnh là đối tƣợng vật liệu phù hợp cho các nghiên cứu làm tăng

độ nhạy của cảm biến sinh học điện hóa xác định nồng độ glucose trong dung dịch.

Nghiên cứu chế tạo vật liệu sulfide kim loại là thế mạnh của Trung tâm Khoa học

Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội. Loại vật liệu này là thích hợp để ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học [61].

Tuy vậy, việc nghiên cứu chế tạo vật liệu cho một loại cảm biến với đối tƣợng ứng

dụng cụ thể vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu.

Bên cạnh cảm biến sử dụng tín hiệu điện thế quét vòng, cảm biến tổng trở

cũng thƣờng đƣợc sử dụng để khảo sát các đối tƣợng sinh học, trong đó tế bào là một

trong những đối tƣợng đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm [128]. Ở kích thƣớc

nhỏ chỉ bằng 1/10 đến 1/100 kích thƣớc tế bào, trong cảm biến sinh học khảo sát tế

bào, các hạt nano thƣờng đƣợc điều khiển để bám lên bề mặt của tế bào một cách đặc

hiệu. Sau đó, tín hiệu điện [29,106] hay tín hiệu quang [43,63] có nguồn gốc từ các

hạt nano đƣợc sử dụng nhƣ tín hiệu đầu ra của cảm biến sinh học. Song song với tính

chất điện, quang, tính chất từ của vật liệu cũng đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu ứng

dụng trong tách chiết tế bào [72,97,121]. Việc đƣa các hạt nano từ lên bề mặt tế bào

2

một cách đặc hiệu không chỉ hỗ trợ cho quá trình theo dõi, quan sát tế bào bằng các

phép đo từ [82], mà còn phân lập tế bào ra khỏi môi trƣờng có nhiều cơ chất, hỗ trợ

rất nhiều cho các bƣớc khảo sát, đo đạc tiếp theo. Ý tƣởng tạo ra một loại vật liệu đa

chức năng vừa có từ tính vừa có tính chất quang nhƣ các hạt nano kim loại nhằm

tách chiết chụp ảnh và đo đạc tế bào đƣợc rất nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm

[59,88,121]. Tuy nhiên, toàn bộ các bƣớc chế tạo vật liệu, chức năng hóa để gắn đặc

hiệu lên tế bào, sau đó tách lọc tế bào trƣớc khi khảo sát tính chất điện tổng trở là

một quá trình kéo dài và cần sự kết hợp của nhiều nhóm nghiên cứu.

Trong các đối tƣợng tế bào đƣợc nghiên cứu, tế bào gốc máu đóng vai trò rất

quan trọng trong y học hiện đại. Việc theo dõi số lƣợng tế bào gốc máu có thể sử

dụng để theo dõi tình trạng sức khỏe [32]. Tế bào gốc máu có thể nuôi biệt hóa thành

các loại tế bào khác nhằm ứng dụng trong y học [51,62]. Ít thấy các nghiên cứu kết

hợp tách lọc và đếm tế bào gốc máu [25,97]. Chƣa có nhóm nghiên cứu nào sử dụng

hạt từ đa chức năng vừa tách lọc, vừa theo dõi và đếm tế bào gốc máu từ mẫu phẩm.

Một số nhóm nghiên cứu trong nƣớc đã thành công chế tạo các hạt từ đa chức năng

có đính các hạt nano kim loại nhƣ nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Phạm Thành Huy,

Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội [58] hay

nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Hoàng Nam, Trung tâm Khoa học Vật liệu,

Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội [31].

Trƣớc đó, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Ngọc Long, Trung tâm Khoa học

Vật liệu đã thành công ứng dụng vật liệu nano vàng trong đánh dấu, chụp ảnh tế bào

ung thƣ vú [104]. Có thể thấy việc thực hiện toàn bộ quy trình từ chế tạo vật liệu,

chức năng hóa để gắn lên bề mặt tế bào gốc máu, tách chiết tế bào, chụp ảnh và đo

đạc nồng độ tế bào có tính khả thi rất cao.

Tóm lại, thông qua việc nghiên cứu tài liệu đã đƣợc công bố trong và ngoài

nƣớc, việc nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa tập trung vào các nội dung nhƣ

sau:

- Tín hiệu điện trong các cảm biến sinh học thƣờng là tín hiệu thế quét vòng, tín

3

hiệu điện trở hay tín hiệu điện tổng trở.

- Gắn liền với tín hiệu thế quét vòng là đối tƣợng glucose. Mặc dù là đối tƣợng

đã cũ, nhƣng cảm biến sinh học điện hóa xác định nồng độ glucose vẫn luôn đƣợc

dùng để đánh giá phẩm chất của cảm biến. Thông qua đây, vai trò của vật liệu nano

trong việc hỗ trợ làm tăng độ nhạy của cảm biến thể hiện rõ rệt.

- Một trong những đối tƣợng quan trọng của cảm biến sinh học điện tổng trở là

tế bào. Trong đó, tế bào gốc máu là đối tƣợng mới, có tính ứng dụng trong y học cao

và đang đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm. Tuy nhiên, việc sử dụng vật liệu

nano đa chức năng trong tách lọc tế bào gốc kết hợp với chụp ảnh và đo đạc nồng độ

tế bào vẫn còn nhiều tranh luận.

Từ việc đánh giá tổng quan những ƣu điểm, hạn chế của các nghiên cứu gần

đây; đồng thời kết hợp với việc phân tích tình hình nghiên cứu cũng nhƣ điều kiện

hiện có tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu của luận án

là:

“Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano bán dẫn PbS, nano kim loại quý Au, Ag

và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học”.

2. Mục tiêu luận án

- Chế tạo đƣợc các vật liệu nano PbS, nano Vàng và nano đa chức năng từ tính

– kim loại Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag.

- Ứng dụng vật liệu nano bán dẫn PbS để chế tạo cảm biến sinh học xác định

nồng độ glucose trong dung dịch.

- Ứng dụng vật liệu nano từ tính – kim loại trong phân lập và khảo sát tế bào

gốc máu từ mẫu tủy xƣơng.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu chế tạo các hạt nano chì sulfide (PbS) bằng phƣơng pháp hóa

siêu âm kết hợp ủ nhiệt laser.

- Nghiên cứu chế tạo các hạt nano Au bằng phƣơng pháp nuôi mầm và chế tạo

các hạt nano đa chức năng Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag bằng phƣơng pháp hóa ƣớt.

- Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano PbS để chế tạo cảm biến sinh học xác

4

định nồng độ glucose trong dung dịch sự dụng phƣơng pháp đo thế quét vòng.

- Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano Fe3O4-Ag trong chế tạo cảm biến sinh

học phân lập và đếm tế bào gốc máu sử dụng phƣơng pháp đo tổng trở.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phƣơng pháp nghiên cứu của luận án là thực nghiệm kết hợp với mô phỏng

tính toán. Các vật liệu nano PbS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết

hợp ủ laser. Các hạt nano vàng đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp nuôi mầm trong

dung dịch. Các hạt nano đa chức năng từ tính – kim loại đƣợc chế tạo bằng phƣơng

pháp hóa ƣớt. Sự gắn kết của các phân tử chất hữu cơ trên bề mặt tinh thể PbS đƣợc

nghiên cứu đánh giá thông qua phƣơng pháp tính toán mô phỏng.

Hình thái của vật liệu đƣợc nghiên cứu trên các hệ kính hiển vi điện tử truyền

qua (TEM) và hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HR-TEM). Cấu trúc của vật

liệu đƣợc nghiên cứu thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD). Tính chất quang của

vật liệu đƣợc nghiên cứu thông qua phổ hấp thụ quang học vùng tử ngoại khả kiến

(UV-vis), phổ huỳnh quang (PL) và phổ tán xạ Raman.

Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose trong dung dịch sử dụng enzyme

glucose oxidase (GOx) đƣợc khảo sát thông qua phép đo hiệu điện thể quét vòng.

Tế bào gốc máu đƣợc thu thập từ mẫu tủy xƣơng bằng phƣơng pháp lọc từ sử

dụng các hạt nano từ tính – kim loại. Sau đó, phổ tán xạ Raman tăng cƣờng bề mặt

dùng để khảo sát vị trí của tế bào gốc. Nồng độ tế bào gốc đƣợc đo đạc, tính toán từ

giản đồ Nyquist – phép đo tổng trở.

Các tín hiệu đầu ra của cảm biến là các tín hiệu điện bao gồm giản đồ thế quét

vòng (CV) và tổng trở đƣợc đo trên hệ điện hóa tích hợp (PGSTATS).

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Việc ứng dụng vật liệu nano PbS để chế tạo cảm biến sinh học điện hóa xác

định nồng độ glucose trong dung dịch không những để làm tăng độ nhạy cho cảm

biến, mà còn bƣớc đầu đánh giá ảnh hƣởng của sự tƣơng thích sinh học giữa vật liệu

nano với các phân tử sinh học trong việc làm tăng độ nhạy cảm biến.

Việc phân lập, đồng thời đo đƣợc hàm lƣợng tế bào gốc đóng vai trò rất quan

5

trọng trong việc đánh giá tình trạng sức khỏe. Phƣơng pháp sử dụng hạt nano từ để

phân lập các tế bào gốc từ mẫu tủy xƣơng là phƣơng pháp đơn giản, hiệu quả. Công

nghệ có thể phát triển để phân lập tế bào gốc từ các mẫu khác, thậm chí có thể

chuyển hƣớng sang đối tƣợng là các tế bào khác. Đặc biệt, sau khi đã phân lập các tế

bào một cách đặc hiệu và phân tán lại dung dịch đệm, việc khảo sát nồng độ tế bào

còn loại bỏ đƣợc nhiễu do các cơ chất có thể bị lẫn ở trong mẫu.

6. Những đóng góp mới của luận án

- Đã chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sử dụng vật liệu nano PbS với tín

hiệu đầu ra là giản đồ hiệu điện thế quét vòng. Cảm biến cho độ nhạy cao nhất đạt 546,2 µAcm-2mM-1.

- Sử dụng phƣơng pháp tính toán mô phỏng để khảo sát liên kết giữa các hạt

PbS với các phân tử hữu cơ, từ đó giải thích khả năng chuyển tiếp điện tích giữa các

hạt nano PbS với enzyme Glucose oxidase, làm tăng độ nhạy cảm biến.

- Sử dụng hạt nano đa chức năng từ tính – kim loại Fe3O4-Ag để phân lập tế

bào gốc máu từ mẫu tủy xƣơng; sau đó thiết kế điện cực đo tín hiệu tổng trở để xác định nồng độ tế bào gốc sau khi phân lập. Độ nhạy của phép đo là 1,48 × 10-4 ± 1,4% (Ω-1/tế bào.cm-1).

Cấu trúc của luận án Các kết quả nghiên cứu của luận án đƣợc viết thành 4 chƣơng với nội dung và

bố cục nhƣ sau:

 Chƣơng 1: Tổng quan

Trình bày tổng quan về cảm biến sinh học điện hóa dựa trên hai phƣơng pháp

đo đạc là hiệu điện thế quét vòng và điện tổng trở. Gắn với hai phƣơng pháp đo là hai

đối tƣợng lần lƣợt là nồng độ glucose trong dung dịch và tế bào gốc máu.

Tổng quan về vai trò của vật liệu nano trong hai loại cảm biến điện hóa dựa

trên hai phƣơng pháp đo đạc đã nêu trên. Từ đó, đƣa ra định hƣớng lựa chọn vật liệu

sulfide kim loại – cụ thể là PbS để ứng dụng trong cảm biến xác định nồng độ

glucose và vật liệu nano kim quý, vật liệu nano đa chức năng từ tính – kim loại để

6

ứng dụng trong cảm biến đo nồng độ tế bào.

Đánh giá hiện trạng nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano trong chế tạo cảm biến

sinh học trong nƣớc.

 Chƣơng 2: Chế tạo vật liệu và các phƣơng pháp phân tích

Chƣơng II bao gồm hai phần chính: (i) các phƣơng pháp chế tạo và (ii) khảo

sát tính chất vật liệu nano PbS, vật liệu nano kim loại và vật liệu nano đa chức năng

từ tính kim loại thực hiện bởi nghiên cứu sinh tại Trung tâm Khoa học Vật liệu,

Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

 Chƣơng 3: Vật liệu nano PbS, nano Vàng và nano đa chức năng

Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag

Trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo và khảo sát tính chất của các vật liệu

nano:

(i) Kết quả nghiên cứu hình thái, cấu trúc của vật liệu nano PbS thu đƣợc từ

phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp ủ laser.

(ii) Kết quả nghiên cứu hình thái, cấu trúc và tính chất quang của các hạt nano

vàng trong dung dịch thu đƣợc từ phƣơng pháp nuôi mầm.

(iii) Cấu trúc, hình thái của vật liệu nano đa chức năng từ tính – kim loại.

 Chƣơng 4: Ứng dụng vật liệu nano trong chế tạo cảm biến sinh học

Chƣơng 4 bao gồm 2 nội dung chính:

(i) Ứng dụng các hạt nano PbS để chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ

glucose trong dung dịch.

(ii) Các hạt nano từ tính – kim loại Fe3O4-Ag đƣợc ứng dụng trong phân lập

các tế bào gốc máu từ mẫu tủy xƣơng. Phổ tán xạ Raman tăng cƣờng bề mặt đƣợc

ứng dụng để phân biệt tế bào gốc máu với các vùng không phải tế bào gốc máu. Phép

đo tổng trở đƣợc sử dụng để khảo sát nồng độ tế bào sau khi phân lập.

 Kết luận

7

Khái quát các kết quả đạt đƣợc

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

Từ khi ra đời, công nghệ nano đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác

nhau nhƣ xây dựng, nông nghiệp, thủy sản, y sinh. Trong các ứng dụng y sinh,các

quá trình sinh học thƣờng khó theo dõi một cách trực tiếp; vì vậy cần đƣợc gắn kết

với một đối tƣợng chuyển đổi tín hiệu để có thể đánh giá đƣợc một cách định lƣợng.

Đây cũng là cấu trúc lý thuyết của một cảm biến sinh học. Kích thƣớc nằm ở trong

dải từ 1 nm đến 100 nm, cùng một khoảng kích thƣớc với các phần tử sinh học nhƣ

ADN, protein, enzyme nên vật liệu nano đƣợc lựa chọn ứng dụng rộng rãi trong y

học, sinh học [55,129]. Trong đó, vật liệu nano có thể tham gia đóng vai trò chuyển

tiếp tín hiệu [52,70] hoặc vai trò phát tín hiệu [82,129].

Trong các nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano trong y sinh, các nhóm nghiên

cứu đều bắt đầu từ cấu trúc của cảm biến sinh học để lựa chọn đƣợc phƣơng pháp

nghiên cứu phù hợp nhất với hiện trạng của phòng thí nghiệm nhƣ hệ thống máy đo,

vật liệu hay đối tƣợng nghiên cứu.

Chƣơng 1 tổng quan về cấu trúc của cảm biến sinh học, hƣớng tới việc lựa

chọn tín hiệu nghiên cứu là tín hiệu điện hóa bao gồm các phép đo thế quét vòng và

phép đo tổng trở. Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn hai đối tƣợng nghiên

cứu, bao gồm một đối tƣợng cổ điển gắn liền với phép đo thế quét vòng là glucose và

một đối tƣợng mới là tế bào gốc. Lựa chọn vật liệu nghiên cứu là bƣớc cuối cùng;

dựa vào thế mạnh của nhóm nghiên cứu, cũng nhƣ sự tƣơng thích của vật liệu đối với

đối tƣợng sinh học.

1.1. CẢM BIẾN SINH HỌC

Theo L.C. Clark, một cảm biến sinh học là “một thiết bị phân tích đƣợc tích

hợp bởi một phần tử nhận biết sinh học với phần tử chuyển đổi tín hiệu” [12]. Trong

cuốn sách có tiêu đề “Biosensor: Fundamental and Applications” xuất bản năm 1987,

Antony P. F. Tuner đã đƣa ra một bảng thống kê về các đối tƣợng sinh học cũng nhƣ

các loại phần tử chuyển đổi tín hiệu (bảng 1.1) [118]. Các phần tử đƣợc liệt kê trong

8

bảng 1.1 có thể không phủ hết các đối tƣợng nghiên cứu, nhƣng giúp ích rất nhiều

cho việc nghiên cứu và phát triển các loại cảm biến sinh học khác nhau. Tất nhiên,

việc mở rộng phạm vi hoạt động của cảm biến sinh học còn có thể thông qua việc

đƣa thêm nhiều đối tƣợng nghiên cứu khác nhau, hoặc tăng độ nhạy hay nới rộng tới

hạn khảo sát của cảm biến.

Từ năm 1962 đến nay, trải qua hơn nửa thế kỷ phát triển, cảm biến sinh học

đã dần hoàn thiện hơn cả về đối tƣợng nghiên cứu, cách tiếp cận, cũng nhƣ ứng dụng

các loại khoa học công nghệ mới nhƣ công nghệ nano [16]. Cấu trúc của một cảm

biến sinh học cũng đã thay đổi so với định nghĩa ban đầu của Clark [117].

Bảng 1.1. Các phần tử có thể được dùng để chế tạo cảm biến sinh học [117]

Phần tử sinh học/ Đối tƣợng sinh học Phần tử chuyển đổi/ Tín hiệu đo đƣợc

Hiệu điện thế Dòng điện Độ dẫn Tổng trở Tính chất quang Tính chất nhiệt Tín hiệu âm Tín hiệu cơ Điện tử phân tử (molecular electronic)

Các cơ thể sinh vật Mô Tế bào Bào quan Màng tế bào Enzyme Thành phần cấu tạo nên enzyme Thụ thể sinh học Kháng thể Acid nucleic Phân tử hữu cơ

Cảm biến sinh học bao gồm 3 bộ phận chính nhƣ trong hình 1.1: (i) phần tử

nhận biết sinh học hay đầu thu sinh học (biological recognition element hay

bioreceptor) dùng để phân biệt đối tƣợng cần nhận biết một cách đặc hiệu, (ii) phần

tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) đóng vai trò chuyển đổitín hiệu sinh học thành tín

hiệu đo đƣợc, và (iii) phần tử xử lý tín hiệu (signal processing system) đóng vai trò

biến đổi tín hiệu đo đƣợc thành tín hiệu đọc đƣợc; từ đây đƣa ra thông tin về đối

tƣợng sinh học cần nhận biết [133].

Tƣơng tác giữa đối tƣợng cần nhận biết và phần tử nhận biết sinh học là tƣơng

tác đặc hiệu, nhƣ tƣơng tác kháng nguyên – kháng thể, bắt cặp DNA- DNA hay

9

tƣơng tác giữa đối tƣợng cần nhận biết (analyte) với enzyme. Việc ghép cặp “đầu thu

sinh học – đối tƣợng cần nhận biết” không chỉ giúp việc phân loại cảm biến sinh học

trở nên chi tiết hơn mà còn hƣớng các nghiên cứu tới việc đào sâu hơn về ảnh hƣởng

của quá trình sinh hóa đến tính năng, hiệu suất của cảm biến. Tín hiệu sinh hóa của

quá trình tƣơng tác đặc hiệu này thƣờng là tín hiệu không đọc đƣợc; vì vậy cần đƣợc

chuyển đổi thành tín hiệu đọc đƣợc thông qua phần từ chuyển đổi tín hiệu. Việc phân

loại cảm biến sinh học cũng có thể dựa vào kiểu hình tín hiệu nhận đƣợc sau quá

trình chuyển đổi tín hiệu; có thể là tín hiệu quang, tín hiệu điện, tín hiệu nhiệt hay

các tín hiệu vật lý khác. Sự hiểu biết rõ ràng về quá trình nhận biết sinh học giúp

chúng ta có thể đa dạng hóa kiểu hình cảm biến trên một đối tƣợng thông qua việc

thay đổi tín hiệu đầu ra của quá trình chuyển đổi tín hiệu, từ đó để có những nghiên

cứu tạo ra các cảm biến sinh học có hiệu quả cao hơn.

n 1.1. Sơ đồ khối của cảm biến sinh học

Các nghiên cứu về cảm biến sinh học không dừng lại ở các đối tƣợng là tế bào

hay phần tử sinh học, mà còn đƣợc mở rộng sang các đối tƣợng ở các lĩnh vực khác

nhƣ công nghệ môi trƣờng [119], công nghệ chế biến thực phẩm [116]. Các phƣơng

pháp đo đạc trong các cảm biến sinh học thƣờng tập trung khai thác các tín hiệu

10

huỳnh quang hoặc tín hiệu điện. Nhờ sự phát triển của công nghệ điện tử, các tín hiệu

điện có thể điều khiển đến mức đủ nhỏ để không phá hủy mẫu sinh học, nhƣng vẫn

đảm bảo các tín hiệu đầu ra có thể đọc đƣợc [132]. Không chỉ vậy, các tín hiệu điện

thƣờng dễ dàng xử lý hơn các tín hiệu quang; kèm theo đó là các hệ đo cũng đơn

giản và dễ dàng thiết kế hơn so với các hệ quang học. Vì vậy, phƣơng pháp điện hóa

bao gồm phƣơng pháp đo thế (potentiometric), phƣơng pháp dòng (amperometric) và

tổng trở (impedimetric) đƣợc ƣu tiên sử dụng trong các nghiên cứu chế tạo cảm biến

sinh học [44].

1.2. CẢM BIẾN SINH HỌC XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ GLUCOSE

Cảm biến sinh học xác định nồng độ đƣờng đầu tiên đƣợc đề xuất bởi Clark

năm 1962 từ bệnh viện Nhi Cincinnati [133]. Với số lƣợng ca mắc bệnh tiểu đƣờng

ngày càng tăng, việc nghiên cứu ra những cảm biến sinh học nhận biết nồng độ

đƣờng trở nên cấp thiết trong những năm đầu thế kỷ XXI [20]. Nồng độ đƣờng trong

máu trƣớc khi ăn của một ngƣời bình thƣờng nằm trong khoảng [4,0 – 5,9] mM

(mmol/L), sau khi ăn xong giá trị này khoảng 7,8 mM. Đối với những ngƣời bị bệnh

tiểu đƣờng nhẹ, nồng độ đƣờng đo đƣợc trong máu trƣớc khi ăn trong khoảng [4,0 –

7,0] mM và sau khi ăn tăng lên đến 8,5 mM. Nhƣ vậy, để chuẩn đoán bệnh tiểu

đƣờng, cảm biến sinh học chỉ cần xác định khoảng hoạt động trong khoảng 3 mM

đến 11 mM với độ chính xác chỉ cần 0,1 mM. Khoảng hoạt động cũng nhƣ độ chính

xác này đã không còn là thách thức với các nghiên cứu hiện đại; ngay cả đối với các

nghiên cứu cảm biến sinh học trong nƣớc [70,86]. Mặc dù vậy, cảm biến sinh học

xác định nồng độ đƣờng vẫn đƣợc nhiều nhóm tiếp tục nghiên cứu [20,110]. Các

nghiên cứu này đều hƣớng tới giới hạn dƣới thấp hơn, độ chính xác cao hơn và độ

nhạy tốt hơn; nhằm nghiên cứu các mẫu phẩm có nồng độ glucose thấp; nhƣ nƣớc

bọt hay nƣớc dịch mồ hôi [65].

1.2.1. Cảm biến sinh học điện hóa đo nồng độ glucose

Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose đều dựa trên cơ sở tƣơng tác của

11

glucose với enzyme. Có 3 enzyme đƣợc sử dụng trong các cảm biến sinh học xác

định nồng độ glucose và đều đóng vai trò là các phần tử nhận biết sinh học:

hexokinase, glucose oxidase (GOx) [102] và glucose-1-dehydrogenase (GDH) [23].

Enzyme hexokinase đƣợc sử dụng thành cặp với enzyme Glucose-6P- dehydrogenase (G-6P-D) để có sản phẩm cuối cùng là H+, theo hệ phƣơng trình phản

ứng sau [26]:

(1.1)

Trong đó ATP và ADP là adenosine triphosphate và adenosine diphosphate, NADP+ và NADPH là nicotinamide adenine dinucleotide phosphate và dạng khử của NADP+.

Hai enzyme GOx và GDH là hai enzyme ô xi hóa khử. Khi tƣơng tác với D-

glucose xuất hiện quá trình trao đổi electron để biến D-glucose thành Glucolactone.

GOx cần phải có thêm phối tử (cofactor) là flavine adenine nucleotide (FAD) để

chuyển hóa glucose trong môi trƣờng giàu ô xi (phƣơng trình 1.2), còn GHD khi có phối tử NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide) chuyển hóa glucose mà không bị

ảnh hƣởng bởi ô xi môi trƣờng (phƣơng trình 1.3). Vì vậy GDH đƣợc ƣu tiên sử

dụng cho các cảm biến sinh học đƣợc chế tạo bởi các hãng danh tiếng nhƣ Bayer,

Roche hay Abbott [133]. Tuy nhiên, GDH cần yêu cầu bảo quản và giá thành cao;

nên hầu hết các nghiên cứu nhằm tăng tăng độ nhạy cảm biến lại sử dụng GOx

[70,78,137].

(1.2)

(1.3)

Tín hiệu sinh học có thể là nồng độ của các chất tham gia hoặc sản phẩm của

các phản ứng nhƣ ATP, ADP hay H2O2; cũng có thể là số electron cần thiết để

12

chuyển hóa glucose thành gluconic acid; thƣờng là các tín hiệu không đọc đƣợc.

Phần tử chuyển đổi tín hiệu gắn với các đối tƣợng mang tín hiệu sinh học, để chuyển

đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu đọc đƣợc. Ban đầu, dựa vào các phép đo đã đƣợc

biết trƣớc trong sinh học phân tử, các chất tham gia phản ứng đƣợc sử dụng làm đối

tƣợng gián tiếp để đo đạc nồng độ glucose. Nhóm nghiên cứu Deeg sử dụng phƣơng

pháp đo nồng độ ATP để đƣa ra nhận xét về tốc độc quá trình chuyển hóa glucose

của hexokinase [26]. Nhóm nghiên cứu Ziegenhorn sử dụng peroxidase và chất

nhuộm màu để nhận biết nồng độ H2O2 – sản phẩm của phƣơng trình 1.2 – từ đó đƣa

ra mối liên hệ với nồng độ glucose có trong mẫu dung dịch [142]. Cảm biến sinh học

xác định nồng độ glucose dựa trên các phản ứng thứ cấp nhƣ hai ví dụ kể trên đƣợc

gọi là cảm biến sinh học thế hệ I.

Hình 1.2. Mô hình các thế hệ cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose.

Quá trình chuyển hóa glucose thành glucolactone là quá trình ô xi hóa.

Electron cần cho quá trình này đƣợc chuyển tiếp qua các enzyme đã gắn với các phối

tử. Ở cảm biến thể hệ II, các electron chuyển tiếp một lần nữa qua các dung môi điện

hóa trƣớc khi đi về phía các điện cực. Các loại dung môi điện hóa này có thể là

ferrocence, ferricyanide, quinines hay xanh methylene; bên cạnh hỗ trợ cho quá trình

chuyển tải điện tử, còn giúp làm tăng độ nhạy của cảm biến [14]. Cảm biến thế hệ II

đã loại bỏ đƣợc nhƣợc điểm của thế hệ I bằng cách đơn giản hóa quá trình chuyển

tiếp điện tử tới bề mặt điện cực, nhƣng vẫn cần phải bổ sung thêm dung môi điện hóa

13

trong mỗi một lần đo (hình 1.2). Ở cảm biến thế hệ III, điện tử đƣợc chuyển trực tiếp

tới bề mặt điện cực thông qua tiếp xúc giữa enzyme ô xi hóa khử với vật liệu đƣợc cố

định trên bề mặt điện cực [133].

Nhƣ vậy, phần tử chuyển đối tín hiệu trong cảm biến sinh học thế hệ II là các

dung môi điện hóa; và trong cảm biến sinh học thể hệ III là vật liệu làm điện cực.

Nếu nhƣ việc hòa tan thêm dung môi điện hóa để tăng quá trình chuyển hóa điện tử

đƣợc cho là phức tạp, thì sự có mặt của dung môi cũng làm loãng đi các ion vi lƣợng

có từ mẫu phẩm. Ngƣợc lại, các ion dung môi hữu cơ có tính tƣơng thích tốt với

phân tử enzyme trở thành ƣu điểm của cảm biến thế hệ II so với cảm biến thế hệ III.

Trong khi đó, tƣơng thích sinh học giữa vật liệu điện cực với các enzyme vẫn luôn là

thách thức rất lớn đối với các vật liệu mới nhằm ứng dụng trong chế tạo cảm biến

sinh học thế hệ III. Vì vậy, các nghiên cứu về cảm biến sinh học sử dụng tƣơng tác

của enzyme ô xi hóa khử với cơ chất hiện này vẫn xuất hiện đồng thời cả hai loại

cảm biến thế hệ II và III [20,70].

Cấu trúc thƣờng thấy của một cảm biến sinh học sử dụng enzyme đƣợc mô tả

nhƣ trong hình 1.3A [23], bao gồm 3 phần chính: thân điện cực, bề mặt điện cực và

lớp enzyme đƣợc cố định. Phần thân điện cực là một dây dẫn đƣợc bảo vệ bởi một

lớp cách điện – có thể là thủy tinh hoặc polymer cách điện khác. Dây dẫn đƣợc tiếp

xúc với bề mặt điện cực. Mặt điện cực đƣợc thiết kế riêng để có thể thay đổi kích

thƣớc, thậm chí thay đổi vật liệu. Vật liệu mặt điện cực có thể là kim loại, graphite

hoặc vật liệu dẫn điện khác. Enzyme sau đó đƣợc cố định lên trên bề mặt điện cực

bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau: có thể sử dụng vật liệu kết nối để tạo thành liên

kết cộng hóa trị với bề mặt điện cực [60] và sử dụng polymer dẫn để bọc lại [70].

Hình 1.3B là đƣờng I-V biểu diễn quá trình ô xi hóa khử của dung môi điện

hóa là ferrocencemonocarbolxylic acid (Fecp2) trên bề mặt điện cực có cấu tạo nhƣ

14

trong hình 1.3A khi không có enzyme (a) và có enzyme GOx (b) [11].

Hình 1.3. Cấu trúc thường thấy của WE trong cảm biến sinh học đo nồng độ glucose (A) [23]: a: dây dẫn, b: vỏ thủy tinh, c: lớp nhựa cách điện, d: nhựa dẫn điện, e: keo Araldite – một loại keo dính dẫn điện, f: đĩa graphite, g: dimethylferrocence – cầu nối giữa điện cực và enzyme, h: enzyme. Đường I-V điện thế quét vòng khi dung môi điện hóa là ferrocencemonocarbolxylic acid (Fecp2) (B) [11]: a. khi không có enzyme, b: khi có enzyme.

Khi có sự có mặt của glucose trong dung dịch, enzyme sẽ tƣơng tác với

glucose để làm tăng quá trình chuyển hóa glucose thành glucolactone. Nhƣ vậy,

enzyme không chỉ đóng vai trò là phần tử nhận biết mà còn đóng vai trò tăng cƣờng

tín hiệu điện hóa.Điện tử cần để chuyển hóa glucose thành glucolactone đƣợc chuyển

tiếp đến điện cực thông qua phần tử chuyển tiếp, vì vậy tín hiệu điện hóa nhận đƣợc

là tín hiệu điện hóa của vật liệu chuyển tiếp. Khi nồng độ glucose tăng lên, xác xuất

chuyển hóa glucose thành glucolactone tăng, dẫn tới lƣợng điện tử đƣợc chuyển tải

tới bề mặt điện cực tăng. Cƣờng độ dòng điện điện hóa đo đƣợc tỉ lệ thuận với nồng

độ của glucose (hình 1.4) [11].

Để tăng độ nhạy của cảm biến, một số nghiên cứu thay đổi enzyme từ GOx

thành GDH vì cảm biến sử dụng GOx bị ảnh hƣởng bởi điều kiện ô xi có trong mẫu

dung dịch chứa glucose [11] và GDH đƣợc cho là có hoạt tính mạnh hơn nhiều so

với GOx [23]. Bên cạnh đó, độ nhạy của cảm biến đo nồng độ glucose cũng có thể

tăng lên bằng cách tăng diện tích tiếp xúc giữa điện cực và phần tử chuyển đổi tín

15

hiệu hoặc tăng sự tƣơng thích giữa phần tử chuyển đổi tín hiệu và enzyme.

Hình 1.4. Đồ thị hiệu chỉnh đặc trưng của cảm biến sinh học sử dụng enzyme GOx [11] - sự phụ thuộc của cường độ dòng đo được khi điện thế của WE là 160 mV (gần đỉnh ô xi hóa của dung môi điện hóa ferrocencecarboxylic acid) vào nồng độ glucose trong dung dịch: (*): đo khi dung dịch chứa glucose được xử lý argon, (O): đo khi không xử lý dung dịch chứa glucose, (+): đo khi dung dịch chứa glucose được sục ô xi tới bão hòa.

1.2.2. Cảm biến sinh học đo nồng độ glucose sử dụng vật liệu nano

Vật liệu nano đƣợc nghiên cứu trong các cảm biến sinh học glucose thƣờng là

các oxide kim loại, kim loại hoặc nano polymer dẫn (bảng 1.2). Tại pH 7 gần với

điểm đẳng điện của các enzyme, ô xít kim loại thƣờng là bán dẫn (ZnO, CuO) có

điểm đẳng điện lớn (pH~9,5) nên dễ tạo ra liên kết bền với các enzyme [140]. Liên

kết bền vững này làm tăng cƣờng quá trình trao đổi electron giữa enzyme và vật liệu

hoặc giữa chất điện môi và vật liệu, giúp làm tăng độ nhạy của cảm biến.

Vật liệu nano kim loại thƣờng sử dụng là các nano kim loại quý. Trong quá

trình điện hóa, vật liệu không bị ô xi hóa, vì vậy không làm mất tính dẫn điện của

cảm biến. Không chỉ vậy, kim loại quý thƣờng có độ dẫn điện tốt, nên thƣờng đƣợc

sử dụng trực tiếp làm điện cực. Các điện cực này thƣờng đƣợc thiết kế có cấu trúc

xốp để tổng diện tích tiếp xúc với vật liệu tăng lên. Bên cạnh đó, các hạt nano kim

loại quý thƣờng đƣợc gắn thêm vào vật liệu làm điện cực khác [131] hoặc gắn trực

16

tiếp với enzyme [5] để làm tăng độ nhạy của cảm biến.

Bảng 1.2. Thống kê một số nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano để chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose.

Vật liệu Độ nhạy ( μAcm-2mM-1) Tài liệu tham khảo Giới hạn khảo sát ( μM) Thế hệ cảm biến (II/III)

30 III

trên [49] [113] 0,42 35,6 μAmM-1 9 III

[122] [19] 2 8,9 III III

Au trên 0,4 40 III [131]

46,8 7 II [67]

2,8 III [114]

- 18,85 μAmM-1 13 II [78]

III III [70] [1]

Kim loại Hạt Pt Hoa Pt xốp polyaniline Au trên dây nano Pb 135,5 Hạt Au trên graphene 711,1 Nano ZnO/Cu composite Điện cực nano Au hình cây Nano Au trên MoS2 Au-GOx trong dung dịch Ô xít kim loại Tetrapod ZnO Dây nano ZnO Thanh nano ZnO

[2] III Tỉ số hình dạng 5 Tỉ số hình dạng 30 Tỉ số hình dạng 60

Dây đơn ZnO xốp Dây nano ZnO 166,7 70,2 41,1 77,0 106,6 0,01 mAmM-1 18,7 - 1 1,0 0,3 0,1 - 500 III III [138] [111]

Polymer và vật liệu khác

CdTe trên CTN Dây polypyrrol Carbon xốp Au-Polymer 11,31 1,9 1,73 mAmM-1 63,2 - - 50,7 9,9×10-2 III III II III [68] [94] [17] [5]

Theo bảng 1.2, cảm biến cho độ nhạy cao nhất là của nhóm nghiên cứu Chen

[19] với cấu trúc phức tạp. Vật liệu điện cực đƣợc làm từ graphene, sau đó các hạt

nano vàng đƣợc cố định lên trên graphene bằng phƣơng pháp khử hóa học. Giải pháp

của nhóm Azak [5] khá mới và thú vị khi dùng điện hóa để polymer hóa GOx vào bề

17

mặt điện cực, vì vậy không cần phải có lớp polymer dẫn. Tuy nhiên, các nghiên cứu

kể trên đa phần đều nghiên cứu tăng độ xốp của vật liệu, hoặc đơn giản hơn là dựa

vào việc chế tạo vật liệu, sau đó ứng dụng; mà chƣa đề cập nhiều đến sự tƣơng thích

của enzyme với vật liệu nhằm nâng cao chất lƣợng quá trình trao đổi điện tử từ vật

liệu tới enzyme.

1.2.3. Lựa chọn đối tƣợng vật liệu

Một số nghiên cứu về chức năng hóa bề mặt vật liệu sulfide kim loại (MetS)

hay chấm lƣợng tử lõi CdSe (hoặc CdTe) vỏ CdS (hay ZnS) đều cho thấy vật liệu

MetS có khả năng liên kết rất tốt với các phân tử hữu cơ có nhóm thio (-SH) [37].

Cấu trúc protein có rất nhiều acid amin chứa gốc thiol, hoặc liên kết S-S, vì vậy vật

liệu nano MetS cũng có thể tạo liên kết bền vững với các protein [74]. Trong một số

nghiên cứu, protein cũng trở thành chất hoạt hóa cố định bề mặt để điểu khiển kích

thƣớc các hạt nano [130]. GOx cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất hoạt hóa bề mặt để chế

tạo chấm lƣợng tử ZnS pha tạp Mn (ZnS/Mn). Sản phẩm ZnS/Mn có kích thƣớc khá

đồng đều, phát quang rất tốt. Liên kết giữa vật liệu và enzyme GOx không những

không làm cho hoạt tính của enzyme không mất đi; thậm chí quá trình chuyển tiếp

điện tử giữa enzyme GOx và glucose còn làm giảm cƣờng độ huỳnh quang của vật

liệu. Hiệu ứng này đƣợc ứng dụng để đo đạc nồng độ glucose có trong dung dịch

[135]. Sự trao đổi điện tử trực tiếp giữa MetS và GOx cho thấy vật liệu sulfide kim

loại có thể trở thành một vật liệu ứng dụng làm điện cực cảm biến sinh học xác định

nồng độ glucose.

Vật liệu bán dẫn sulfide kim loại nhƣ ZnS, ZnS pha tạp Mn hay PbS đã đƣợc

các nhóm nghiên cứu của Trung tâm Khoa học Vật liệu quan tâm trong những năm

gần đây [61]. Tuy nhiên, việc ứng dụng các vật liệu này trong chế tạo cảm biến sinh

học điện hóa vẫn còn rất hạn chế, đặc biệt là vật liệu PbS.

1.3. CẢM BIẾN ĐO ĐẠC NỒNG ĐỘ TẾ BÀO GỐC MÁU

Tế bào gốc máu gắn liền với lịch sử phát triển tế bào, khi vào những năm đầu

thể kỷ XX, những bệnh nhân thiếu máu hay bị bệnh bạch cầu đƣợc chăm sóc bằng

18

cách cho ngậm tủy xƣơng. Tại thời điểm này, các nhà khoa học Châu Âu tin rằng tất

cả các tế bào máu đều bắt nguồn từ một loại “tế bào gốc” nằm trong tủy xƣơng [64].

Là tế bào gốc trƣởng thành (somatic/adult stem cell), ban đầu tìm thấy nhiều trong

tủy xƣơng, nên phải đến đầu thế kỷ XXI, khi nhóm nghiên cứu của TS. Phan Toàn

Thắng, Đại học Quốc Gia Singapore đƣa ra phƣơng pháp tách chiết tế bào gốc máu

từ cuống rốn; thì việc sử dụng tế bào gốc máu mới đƣợc sử dụng rộng rãi. Bằng việc

điều khiển môi trƣờng nuôi, tế bào gốc máu có thể biệt hóa thành các dòng tế bào

khác nhau nhƣ tế bào biểu bì, tế bào biểu mô ngực hay tế bào giác mạc, hỗ trợ cho

quá trình trị bỏng, trị ung thƣ vú hay chữa trị khiếm thị do hỏng giác mạc [51]. Sử

dụng phƣơng pháp biến đổi gen, tế bào gốc máu còn có thể ứng dụng để trị các bệnh

hiểm nghèo nhƣ AIDS [62]. Không chỉ vậy, hàm lƣợng tế bào gốc trong máu hay tủy

xƣơng còn đƣợc coi là một trong những chỉ tiêu để đánh giá sức khỏe máu cũng nhƣ

để theo dõi sức khỏe của ngƣời mang bệnh máu [32]. Vì vậy, phân lập để thu hồi

cũng nhƣ chụp ảnh hay xác định hàm lƣợng tế bào gốc máu từ các bệnh phẩm luôn

đƣợc nhiều sự quan tâm.

1.3.1. Nguyên lý kháng nguyên – kháng thể trong nhận biết tế bào

Có nhiều phƣơng pháp đã và đang đƣợc ứng dụng để phân lập tế bào gốc máu

từ các nguồn khác nhau, trong đó có 4 phƣơng pháp chính sử dụng nguyên lý của

cảm biến sinh học: phƣơng pháp lọc phân lập tế bào kích hoạt huỳnh quang

(Fluorescence-activated cell sorting – FACS), phƣơng pháp phát triển hệ thống các

phối tử bởi sự làm giàu theo hàm mũ (systematic evolution of ligands by exponential

enrichment - SELEX), phƣơng pháp hai pha nƣớc sử dụng polymer nhạy với nhiệt độ

(Aquaeous two-phase system using temperature responsive polymer – A2P-TRP) và

phƣơng pháp phân lập tế bào kích hoạt từ (magnetic-activated cell sorting – MACS)

[141].

Các phƣơng pháp phân lập tế bào gốc hầu hết đều áp dụng nguyên lý liên kết

kháng nguyên-kháng thể nhƣ mô tả trong hình 1.5. Kháng nguyên là những chất sau

khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật thì sẽ đƣợc hệ thống miễn dịch của sinh vật nhận

biết và đáp ứng, tức là sinh ra kháng thể tƣơng ứng có đặc tính kết hợp với kháng

19

nguyên đó. Theo định nghĩa kháng nguyên có hai đặc tính cơ bản: tính đặc hiệu và

tính sinh kháng thể. Nếu tính sinh kháng thể là khả năng kích thích hệ thống miễn

dịch sinh ra kháng thể tƣơng ứng thì đặc tính kết hợp với kháng thể là một kháng

nguyên chỉ đƣợc nhận biết bởi kháng thể mà nó tạo ra. Kháng nguyên có nhiều dạng

tốn tại khác nhau, phổ biến là các protein; trong đó có một số là protein màng tế bào.

Trong một số kháng nguyên là protein màng tế bào, kháng nguyên đặc trƣng cho

riêng một loại tế bào có thể đƣợc dùng để phân biệt với các dòng tế bào khác – nhƣ

biểu diễn trong hình 1.5, các kháng nguyên đặc trƣng đó có hình tam giác. Khi hệ

thống miễn dịch đƣợc kích thích để sinh ra kháng thể tƣơng thích với kháng nguyên

đặc trƣng của một dòng tế bào; thì kháng thể đó cũng có thể đƣợc coi là kháng thể

đặc trƣng cho chính dòng tế bào đó. Các tế bào gốc máu cũng có những cặp kháng

nguyên – kháng thể đặc trƣng.

Hình 1.5. Mô hình nguyên lý liên kết kháng nguyên - kháng thể trong cảm biến sinh học khảo sát, đo đạc tế bào – Vẽ lại theo cơ chế tham khảo từ các tài liệu số [104, 121] và [141].

Kháng thể nhận biết đặc hiệu tế bào gốc máu đã đƣợc gắn với tín hiệu đánh

dấu tìm tới bề mặt của tế bào và bắt cặp với kháng nguyên đặc trƣng. Tín hiệu đánh

dấu này thƣờng là tín hiệu quang (FACS, SELEX) quyết định xem tế bào có đƣợc

thu hồi hay loại bỏ [108]. Sau khi loại bỏ các chất hay tế bào không cần thiết, dung

dịch còn lại thu đƣợc chứa tế bào gốc với nồng độ cao hơn. Tƣơng tự vậy, tế bào gốc

đƣợc thu thập trên các đế polymer ở phƣơng pháp A2P-TRP [48] và bằng từ trƣờng ở

20

phƣơng pháp MACS [72] thông qua liên kết giữa kháng nguyên trên bề mặt tế bào

với kháng thể đƣợc cố định trên bề mặt các tấm polymer hay trên các hạt nano từ.

Bảng 1.3 thống kê một số ƣu và nhƣợc điểm của các phƣơng pháp kể trên [141].

Bảng 1.3. Ưu và nhược điểm một số phương pháp sử dụng cơ chế cảm biến sinh học để lọc tế bào gốc [141].

Tên phƣơng pháp Ƣu điểm

FACS Tính chính xác cao, độ nhạy và độ phân giải cao

SELEX Thu thập tế bào mà không cần thông tin, giảm giá thành thử nghiệm in vitro

Nhƣợc điểm Giá thành cao, ngƣời thực hiện phải có chuyên môn tốt, không biệt lập đƣợc lƣợng lớn mẫu. Quá trình sàng lọc sử dụng aptamer (một đoạn ADN hoặc ARN có thể liên kết đặc hiệu với phân tử đích) không hiệu quả do liên kết giữa aptamer và kháng nguyên khá yếu.

A2P-TRP Độ sạch thấp, tỉ lệ thu hồi không cao Đơn giản, có thể thu thập tế bào với lƣợng mẫu tùy ý, kháng thể tái sử dụng

MACS Đơn giản, giá thành thấp Tế bào sau khi thu thập bị dính hạt từ.

Ngành khoa học vật liệu tập trung nghiên cứu trên hai phƣơng pháp A2P-TRP

và MACS. Đối với phƣơng pháp A2P-TRP, hiệu suất thu hồi tế bào tăng lên khi diện

tích tiếp xúc giữa tế bào và bề mặt lớp polymer lớn (có thể thay thế bằng các loại vật

liệu khác và chức năng hóa bề mặt để gắn với kháng thể). Đối với phƣơng pháp

MACS, kích thƣớc hạt từ càng nhỏ càng làm tăng hiệu suất thu thập tế bào [105].

Các nghiên cứu về tế bào gốc thƣờng là chỉ tập trung vào phân lập tế bào gốc,

sau đó tiến hành nuôi biệt hóa với các mục đích khác nhau; hoặc nếu muốn khảo sát

hàm lƣợng tế bào gốc thì lại có những phép đo riêng biệt. Rất hiếm thấy những

nghiên cứu kết hợp việc phân lập tế bào gốc máu rồi xác định làm lƣợng [25,97].

Những nghiên cứu của De Wynter và Paulus cho thấy việc khảo sát hàm lƣợng tế

bào gốc trƣớc và sau khi phân lập dựa trên hai phƣơng pháp chính: đếm tế bào huỳnh

quang trên buồng đếm hoặc là dựa trên kỹ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy

(flow cytometry). Nếu phƣơng pháp đếm bằng buồng đếm mang tính thủ công cao và

21

thƣờng cho sai số khá lớn khi nồng độ tế bào không cao, thì phƣơng pháp đếm bằng

flow cytometry lại rất phức tạp (tƣơng tự nhƣ FACS). Bên cạnh đó, việc kết hợp một

phƣơng pháp đếm tế bào đơn giản – nhƣ phƣơng pháp đo điện tổng trở với quá trình

phân lập tế bào bằng MACS là một hƣớng nghiên cứu đầy hứa hẹn.

Việc đo nồng độ tế bào một cách đặc hiệu – theo cơ chế của cảm biến sinh

học với tín hiệu đầu ra là điện có thể dựa trên tín hiệu thế quét vòng, tín hiệu điện trở

hoặc tín hiệu tổng trở. Tín hiệu đầu ra phụ thuộc vào hai yếu tố vật lý: bản chất tổng

trở của dung dịch chứa tế bào và tổng trở tƣơng đƣơng của tế bào.

1.3.2. Cảm biến sinh học sử dụng phép đo tổng trở trong đo đạc tế bào

Hình 1.6. Nghiên cứu sử dụng kháng thể cố định trên bề mặt điện cực để đo nồng độ tế bào (ở đây là E. Coli) và sự thay đổi của Rct theo nồng độ tế bào[106]. Hình A mô tả các tế bào vi khuẩn E. Coli bám một cách chọn lọc lên bề mặt điện cực đã được gắn với kháng thể đặc hiệu nhận biết E. Coli. Hình B biểu diễn sự thay đổi của Rct khi nồng độ E. Coli thay đổi.

Trong cảm biến khảo sát tế bào, kháng thể đặc trƣng cho tế bào đóng vai trò là

phần tử nhận biết sinh học [124]. Hình 1.6 là một ví dụ của việc sử dụng phép đo

tổng trở để xác định nồng độ của khuẩn E. Coli trong dung dịch [106]. Kháng thể đặc

trƣng nhận biết vi khuẩn E. Coli là O157:H7, đƣợc cố định trên bề mặt điện cực bằng

liên kết cộng hóa trị. Khi trong mẫu có vi khuẩn E. Coli, liên kết kháng nguyên –

kháng thể giữ vi khuẩn tại bề mặt điện cực. Phần tử chuyển đổi tín hiệu là ion dung môi Ferrocianide [Fe(CN)6]3-/4-. Khi nồng độ E. Coli tăng lên, số lƣợng vi khuẩn bám

22

lên bề mặt của điện cực cũng tăng lên, làm ngăn cản quá trình trao đổi ion giữa các

ion [Fe(CN)6]3-/4- và điện cực. Hình 1.6B biểu diễn giá trị Rct phụ thuộc vào nồng độ

vi khuẩn E. Coli có trong dung dịch. Trục hoành biếu diểu theo hàm Logarit của nồng độ E. Coli. Có thể thấy khoảng hoạt động của cảm biến từ 105 đến 108 tế bào

khuẩn E. Coli/ mL.

Thay đổi của Rs hay Cs và tổng trở của tế bào

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp sử dụng kháng thể trên bề mặt điện cực là quá

trình rửa mẫu. Lực liên kết kháng nguyên – kháng thể chỉ bền ở mức độ tế bào. Khi

dòng nƣớc dùng rửa mẫu có tốc độ quá lớn sẽ làm bật tế bào ra, vì vậy thƣờng làm

ảnh hƣởng đến độ lặp lại cũng nhƣ độ nhạy của cảm biến. Không chỉ vậy, do kháng

thể rất dễ mất hoạt tính khi điều kiện bảo quản không phù hợp, nên điện cực chỉ sử

dụng 1 lần; gây ra khá nhiều bất tiện trong ứng dụng thực tế. Giải pháp là sử dụng

các hạt từ đã gắn kháng thể để phân lập tế bào trƣớc (phƣơng pháp MACS) rồi sau

đó đo nồng độ tế bào trên vi điện cực [121]. Quá trình khuếch tán của các ion trên bề

mặt điện cực không thay đổi mà giá trị tổng trở của dung dịch sẽ bị thay đổi theo bản

chất điện của tế bào.

Có nhiều nghiên cứu về tính chất điện của tế bào thông qua cấu trúc [107]. Tế

bào có cấu trúc nhân và tế bào chất có độ dẫn điện khá tốt đƣợc bọc bởi một lớp

màng kép lipid có độ dẫn điện kém hơn vì vậy thƣờng đƣợc mô tả đơn giản là một

điện trở song song với một tụ điện (R//C) [53] hoặc bởi hai hệ trở tụ song song mắc

nối tiếp nhau ((R1//C1)nt(R2//C2)) [128]. Nhƣ vậy, tổng trở dung dịch lúc này không

chỉ còn Rs mà là là một hệ tụ trở mắc song song (hoặc nối tiếp). Các nghiên cứu đều

cho thấy giá trị điện trở này phụ thuộc vào nồng độ của tế bào trong dung dịch [128].

Hình 1.7 là một ví dụ ứng dụng mô hình đơn giản R//C của tế bào trong khảo

sát nồng độ tế bào trong dung dịch. Lớp tế bào tiếp xúc với bề mặt điện cực đƣợc coi

là một hệ điện trở mắc song song với tụ điện (trong hình 1.9A: Rcl//Ccl). Nối tiếp với

lớp tế bào là điện trở dung dịch Rbulk và điện trở khuếch tán bao gồm Rsl và Ze (hình

23

1.7A).

Hình 1.7. Ứng dụng mô hình đơn giản R//C trong khảo sát tế bào bám trên bề mặt điện cực. Hình A mô hình mạch tương được của các lớp tế bào bám trên bề mặt điện cực. Hình B là kết quả đo giá trị tổng trở phụ thuộc tần số khi có và không có tế bào (b) [128].

Khi nồng độ tế bào tăng lên, hệ tụ Rcl//Cclsẽ giống nhƣ rất nhiều tế bào mắc

song song với nhau, vì vậy nên Rcl giảm và Ccl tăng. Hình 1.7B là biểu đồ sự phụ

thuộc của giá trị tổng trở vào lgf khi có và không có lớp tế bào. Ảnh hƣởng của lớp

tế bào đến giá trị tổng trở chỉ thấy rõ rệt trong khoảng tần số f từ 100 Hz đến 50000

Hz. Vì vậy giá trị tổng trở đo đƣợc tại 1000 Hz đƣợc dùng để làm tín hiệu khảo sát

nồng độ tế bào. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, nếu tế bào nằm lơ lửng trong dung

dịch thì các giá trị Rsl và Ze không thay đổi khi nồng độ tế bào thay đổi. Tức là sự có

mặt của tế bào không làm ảnh hƣởng đến quá trình khuếch tán của ion chất điện hóa

24

về phía bề mặt điện cực mà chỉ làm ảnh hƣởng đến giá trị tổng trở của dung dịch.

1.3.3. Vật liệu nano trong cảm biến đo đạc tế bào

Hình 1.8. Một số mô hình điện cực kích thước micromet được thiết kế để khảo sát tế bào. Hình A1, A2 lần lượt là mô hình điện cực được thiết kế có các bẫy để bẫy tế bào và ảnh hiển vi quang học khi tế bào được đưa vào điện cực [52]. Hình B1, B2 ảnh SEM của lớp silicon tiếp xúc tế bào giữa hai điện cực và ảnh thực của mẫu điện cực được thiết kế [24].

Tế bào có kích thƣớc khá lớn, từ một vài μm đến vài chục μm. Với công nghệ

chế tạo điện cực hiện đại, các điện cực có kích cỡ μm đƣợc thiết kế để có thể khảo

sát đến từng đơn tế bào. Bên cạnh đó, tín hiệu điện có thể tăng cƣờng thông qua tăng

diện tích tiếp xúc với tế bào. Hình 1.8 là hai ví dụ về một số điện cực đƣợc thiết kế

nhằm đo đạc tế bào. Hình 1.8A1 và 1.8A2 là thiết kế của nhóm nghiên cứu Kobel

nhằm tạo ra các bẫy có kích cỡ bằng kích cỡ của tế bào để theo dõi tín hiệu điện mỗi

khi tế bào rơi vào bẫy [52]. Hình 1.8B1 và 1.8B2 là điện cực đƣợc thiết kế để lớp

Silicon tiếp xúc với tế bào có cấu trúc xốp. Cấu trúc này cho kết quả tổng trở tốt hơn

rất nhiều so với khi lớp Silicon không xốp [24].

Hiện tại, việc đƣa việc thiết kế các cấu trúc micromet trở thành một bộ phận

không thể thiếu của các phòng sạch nghiên cứu vi mạch đã đơn giản hóa các bƣớc

chế tạo các vi điện cực nhƣ hình 1.8. Thậm chí có những sản phẩm vi điện cực có

25

cấu trúc nanomet cũng đã đƣợc thiết kế. Các điện cực sau khi đƣợc chế tạo, đƣợc

chức năng hóa bề mặt để có thể bắt cặp đặc hiệu tế bào, từ đó nhờ theo dõi sự thay

đổi của tín hiệu điện: điện trở, điện tổng trở để đƣa ra các thông tin vật lý của tế bào

[129].

Vật liệu nano còn đóng vai trò đánh dấu, theo dõi tế bào hoặc làm tăng cƣờng

tín hiệu điện; đặc biệt là đối với các nghiên cứu tế bào có nồng độ thấp trong mẫu.

Các tín hiệu dùng để theo dõi tế bào rất đa dạng; có thể là tín hiệu quang nhƣ Raman

[125], huỳnh quang [36], tán xạ ánh sáng – trƣờng tối, quét ảnh tia X [104]. Vật liệu

nano từ tính cũng thƣờng đƣợc dùng để phân lập tế bào một cách đặc hiệu để các quá

trình khảo sát, đo đạc tiếp theo không bị ảnh hƣởng bởi nhiễu nền [127].

Hình 1.9. Mô hình cảm biến sử dụng còi carbon làm điện cực để tăng diện tích tiếp xúc cũng như độ tương thích sinh học; sau đó các hạt nano vàng được chức năng hóa, bắt cặp với kháng thể đặc hiệu rồi cố định lên trên bề mặt tế bào để làm tăng tín hiệu điện hóa [29].

Đối với cảm biến điện hóa, bên cạnh việc làm điện cực để tăng diện tích tiếp

xúc bề mặt, vật liệu nano còn đóng vai trò hỗ trợ tăng tín hiệu điện hóa. Vật liệu

nano kim loại quý và vật liệu nền carbon (CNT, graphene) do tính dẫn diện tốt và

tính tƣơng thích sinh học, đƣợc chức năng hóa bề mặt, gắn kháng thể và đƣa lên bề

mặt tế bào để tăng độ dẫn, hỗ trợ tăng độ nhạy của cảm biến [135]. Hình 1.9 là một

ví dụ của việc sử dụng cùng lúc còi carbon (carbon nano horn) và hạt nano vàng để

26

làm tăng độ nhạy cảm biến khảo sát tế bào sống [29].

1.3.4. Lựa chọn đối tƣợng vật liệu

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Wang [121], các tế bào vi khuẩn Listeria

monocytogenes có kích thƣớc khoảng 2 μm. Trong khi đó, các hạt nano vàng có kích

thƣớc 30 nm và các hạt nano từ có kích thƣớc 100 nm. Khi các hạt nano đƣợc gắn

với các kháng thể đặc hiệu nhận biết vi khuẩn, chúng bám trên bề mặt của tế bào vi

khuẩn. Các hạt nano từ đƣợc ứng dụng để phân lập các tế bào vi khuẩn ra khỏi mẫu

dung dịch. Các hạt nano vàng bám dày đặc hơn trên màng tế bào, hỗ trợ làm tăng độ

tƣơng phản của ảnh chụp tế bào do khả năng tán xạ ánh sáng.

Vật liệu đa chức năng kết hợp từ tính – kim loại với tính chất từ của vật liệu từ

dùng trong phân lập tế bào và tính chất quang/điện của vật liệu kim loại dùng để

đánh dấu trở thành một ý tƣởng đột phá trong nghiên cứu tế bào, cụ thể là tế bào gốc.

Vật liệu đa chức năng từ tính có nhiều cấu trúc khác nhau: cấu trúc hai vật liệu đính

vào nhau [59], cấu trúc lõi vỏ [93] hoặc cấu trúc hai loại vật liệu đƣợc gói trong một

gói có kích thƣớc lớn hơn [95].

Kích thƣớc của vật liệu từ nhỏ (<15 nm) có tính siêu thuận từ, vì vậy khi bổ

sung thêm lớp kim loại, vật liệu từ tính – kim loại vẫn đảm bảo tính siêu thuận từ.

Khi đặt từ trƣờng ngoài vào, các hạt nano có xu thế bị hút về phía từ trƣờng. Sau khi

tắt từ trƣờng ngoài, các hạt lại phân tán trở lại vào dung dịch. Vì vậy, vật liệu từ tính

– kim loại có thể sử dụng trong các ứng dụng tách chiết sinh học. Không chỉ vậy, lớp

nano kim loại có khả năng hoạt động Raman rất tốt [59]; có thể ứng dụng để đánh

dấu tế bào hay làm cảm biến sinh học [95]. Mặc dù các ứng dụng sử dụng vật liệu

nano từ tính – kim loại trong tách chiết tế bào và khảo sát khả năng đánh dấu thông

qua phổ SERS đã đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu, nhƣng hiếm thấy nhóm nghiên cứu

nào sử dụng vật liệu từ tính – kim loại trong tách chiết, đánh dầu tế bào gốc máu; sau

27

đó dùng phƣơng pháp điện để đo nồng độ tế bào sau khi tách chiết

1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO VẬT LIỆU

1.4.1. Vật liệu sulfide kim loại

Phản ứng tạo sulfide kim loại đã từ muối chứa ion kim loại và thioacetamide

(TAA) đã đƣợc nghiên cứu từ rất sớm bởi Peeters [98]. Theo đó, quá trình hình thành

sản phẩm MS đƣợc mô tả trong phƣơng trình sau (M là kí hiệu cho kim loại):

(1.4)

Dƣới tác dụng xúc tác của muối Acetate, ion chì tạo phức với các phân từ thioacetamide trƣớc khi phân hủy thành PbS và CH3CN ở nhiệt độ 80oC. Nhƣ vậy,

khi không có sự có mặt của muối Acetate, phản ứng tạo sulfide kim loại cần xảy ra

với các điều kiện xúc tác khác nhƣ nhiệt độ, áp suất trong phƣơng pháp thủy nhiệt.

Phƣơng pháp sử dụng sóng siêu âm để tác động lên quá trình phản ứng cũng là một

giải pháp đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt là trong chế tạo vật liệu

nano [8]. Tác dụng cơ học - nhƣ phá hủy bề mặt hay hiện tƣợng nhũ tƣơng hóa - của

sóng âm mạnh hơn tại tần số thấp. Khi sóng âm có tần số lớn (thƣờng là 20 KHz, 40

KHz. Trong một số hệ siêu âm tần số cao, tần số có thể lên tới vài trăm KHz đến

MHz), tác dụng cơ học của sóng giảm đi; các bóng khí hình thành trong dung dịch có

đƣờng kính ban đầu khoảng 20 μm . Qua mỗi một chu kỳ của sóng âm, các bóng khí

này nhận năng lƣợng, nhiệt độ trong bóng kèm theo kích thƣớc của bóng tăng lên.

Dƣới điều kiện phù hợp, kích thƣớc của bóng khí tăng lên khoảng 7-8 lần (đƣờng

kính khoảng 150 μm), nhiệt độ bên trong chúng có thể lên tới 5000 K và áp suất tức

thời lên tới 1000 bar, trƣớc khi vỡ ra [115]. Sau khi vỡ, nhiệt độ của khu vực có bóng khí giảm nhanh, với tốc độ có thể lên đến 1010 Ks-1. Vì thế, so với các phƣơng pháp

chế tạo cổ điển khác, phƣơng pháp sử dụng còi siêu âm tạo điều kiện đặc biệt phù

hợp cho các phản ứng chế tạo vật liệu trong môi trƣờng dung dịch. Bằng việc thay

đổi chất tham gia phản ứng, điều kiện phản ứng mà ta có thể chế tạo ra rất nhiều loại

vật liệu với nhiều hình thái khác nhau. Trong đó, khi thêm chất phản ứng có chứa lƣu

huỳnh nhƣ urea hay thioacetamid, ta có thể tạo ra các tinh thể sulfide kim loại nhƣ

28

ZnS, MoS2, CdS [8].

Hóa siêu âm cũng đƣợc các nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Khoa học Vật

liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên sử dụng để chế tạo các loại

vật liệu nano nhƣ nano từ tính [85], đặc biệt là vật liệu nano PbS [61]. Một điều có

thể nhận thấy là dƣới tác dụng của sự thay đổi nhiệt độ nhanh, các hạt nano đƣợc chế

tạo bằng phƣơng pháp hóa siêu âm vẫn còn chứa một phần pha vô định hình. Vì vậy,

để tạo ra các hạt tinh thể có độ trật tự tốt hơn, các nhóm nghiên cứu tại Trung tâm

Khoa học Vật liệu thƣờng lựa chọn phƣơng pháp ủ nhiệt [85]. Nhƣợc điểm của

phƣơng pháp ủ nhiệt là thƣờng làm cho các hạt nano kết đám lại thành các hạt to

hơn; vì vậy làm giảm khả năng ứng dụng của chúng trong sinh học.

1.4.2. Vật liệu nano kim loại

Quá trình hình thành và phát triển kích thƣớc hạt nano kim loại đƣợc chia làm

3 giai đoạn: tạo mầm, hình thành hạt và phát triển Oswald. Giai đoạn đầu tiên, các

mầm hạt nano vàng hình thành một cách độc lập do sự tƣơng tác ngẫu nhiên giữa

chất khử (NaBH4) và dung dịch chứa ion kim loại (HAuCl4). Sau đó là giai đoạn tạo

hạt, thông qua quá trình phát triển nội (inrtra-particle ripening) hoặc kết hợp ngẫu

nhiên (fast random attachment). Thời gian phát triển của giai đoạn này phụ thuộc vào

bản chất dung môi. Nếu dung môi tạo ra môi trƣờng có chứa các chất hoạt động bề

mặt, các hạt mầm khó gặp nhau hơn, vì vậy quá trình hình thành kéo dài hơn. Giai

đoạn thứ ba, quá trình phát triển Oswald, khi nồng độ các hạt đủ lớn, các hạt có xu

thế tiến lại gần nhau và kết tụ để có kích thƣớc lớn hơn [35]. Từ các mầm là các hạt

nano có kích thƣớc nhỏ, dƣới các điều kiện phản ứng phù hợp – nhiệt độ, môi

trƣờng, pH, vật liệu nano có thể phát triển thành các đơn tinh thể có kích thƣớc lớn

hơn.

Phƣơng pháp nuôi mầm là phƣơng pháp phân lập đƣợc các bƣớc tạo mầm

(nucleation stage) và nuôi (growth state) thành hai bƣớc độc lập [90]; trong từng

bƣớc các hạt mầm hay quá trình nuôi thành cách hạt nano đƣợc điều khiển dựa vào

29

các điều kiện lý hóa nhƣ nhiệt độ, nồng độ chất hay sử dụng chất hoạt động bề mặt.

Trong bƣớc tạo mầm, chất hoạt động bề mặt đóng vai trò ổn định, làm cho tốc

độ phát triển của các hạt mầm chậm lại. Tùy thuộc vào chất hoạt động bề mặt khác

nhau mà kích thƣớc, hình dạng của các hạt mầm khác nhau [126]. Dung dịch tiền

chất chứa muối của kim loại A đƣợc nhỏ vào dung dịch đã có sẵn chất khử, chất hoạt

động bề mặt và mầm kim loại B. Kim loại A sẽ phát triển trên bề mặt của mầm kim

loại B. Vị trí phát triển ƣu tiên là tại các mặt tinh thể có năng lƣợng thấp. Khi này,

vai trò của các chất hoạt động bề mặt bên cạnh làm giảm quá trình phát triển, còn

đóng vai trò thay đổi thế năng bề mặt của kim loại B. Nhƣ vậy, ta có thể sử dụng chất

hoạt động bề mặt trong quá trình nuôi để điều khiển kích thƣớc, hình dạng của các

hạt nano kim loại.

Các hạt kim loại thƣờng có cấu trúc lập phƣơng tâm mặt. Các mặt tinh thể có

năng lƣợng bề mặt thấp thƣờng là các mặt ƣu tiên tiếp xúc với mặt thoáng, lần lƣợt là

{110}, {100} và {111}. Hệ quả là cấu trúc bền của các hạt tinh thể kim loại có cấu

trúc fcc có dạng truncated octahedron (hay dạng Wulff, là dạng tổ hợp của tám mặt

{111} và sáu mặt {100}) – vì vậy các hạt nano kim loại thƣờng có dạng giống nhƣ

hình cầu [126]. Trong quá trình nuôi, các phân tử chất hoạt động bề mặt tiếp xúc với

bề mặt của mầm kim loại, làm thay đổi năng lƣợng bề mặt của chúng; vì thế là thay

đổi hƣớng ƣu tiên phát triển của các hạt nano kim loại. Một số chất hoạt động bề mặt

thƣờng đƣợc các nhóm sử dụng khi chế tạo các hạt nano kim loại là citrate, cetyl

trimethyl ammonium bromide (CTAB), tetraoctyl ammonium bromide (TOAB),

cetylpyridinum chloride (CPC) hay polyvinyl pyrolidone (PVP) [83,90]. Các chất

hoạt động bề mặt này thƣờng làm cho năng lƣợng bề mặt của tinh thể kim loại lớn

lên, vì vậy làm giảm thời gian phát triển của hạt; đồng thời cũng gia cố thêm bề mặt,

giúp cho các hạt nano thành phẩm có kích thƣớc đồng đều hơn. Nếu nhƣ các phân tử

citrate làm cho các hạt nano có xu thế phát triển thành dạng bát diện (hƣớng ƣu tiên

phát triển là {111}), các phân tử PVP giúp cho hạt phát triển theo mặt {100} thành

các hạt lập phƣơng [126]; thì các phân tử CPC và CTAB định hƣớng hạt phát triển

30

thành cách hạt cầu lớn hoặc các thanh [83].

Nhƣ vậy, để tạo ra các hạt nano kim loại có kích thƣớc đồng đều, hoặc làm

cho các hạt vỏ kim loại có dạng cầu và đủ lớn thì phƣơng pháp nuôi mầm trong môi

trƣờng CTAB hay PVP là sự lựa chọn phù hợp.

1.4.3. Vật liệu đa chức năng từ tính – kim loại

Trong các loại vật liệu từ tính – kim loại, vật liệu đa chức năng Fe3O4 – kim

loại quý (Au, Ag) đƣợc nghiên cứu rất nhiều trong và ngoài nƣớc. Quy trình chế tạo

các vật liệu này thƣờng chia làm hai bƣớc: chế tạo vật liệu từ bằng phƣơng pháp

đồng kết tủa hay thủy nhiệt sau đó gắn thêm lớp kim loại. Do sự không tƣơng thích

giữa kim loại và ô xít, nên quá trình gắn một lớp kim loại với các hạt nano từ Fe3O4

thƣờng trải qua một giai đoạn chức năng hóa bằng APTES

(Aminopropyltriethoxysilane) hay bằng một lớp polymer trƣớc khi các ion kim loại

đƣợc hấp phụ lên trên bề mặt để khử thành kim loại [58,95].

Có nhiều phƣơng pháp thƣờng sử dụng để chế tạo các hạt nano Fe3O4 nhƣ

thủy nhiệt, thủy phân, vi nhũ tƣơng và đồng kết tủa. Trong các phƣơng pháp kể trên,

phƣơng pháp đồng kết tủa là phƣơng pháp đơn giản, thƣờng để dùng chế tạo các hạt

nano với lƣợng lớn [3]. Theo nhóm nghiên cứu của Ahn, khi độ pH của dung dịch chứa hỗn hợp hai muối Fe2+ và Fe3+ tăng lên một cách từ từ, thì các tinh thể Fe3O4

đƣợc hình thành thông qua các pha trung gian lần lƣợt là akaganeite (một dạng ô xít

sắt III chứa ion Cl) và goethite (một dạng tinh thể của FeOH(OH)). Ban đầu, khi tỉ lệ ion ba zơ trên tổng số ion muối sắt (Fe2+ và Fe3+) nhỏ hơn 2 – tỉ lệ này gọi là R, các

tinh thể akaganeite hình thành ở dạng thanh có kích thƣớc 2-3 nm. Khi R lớn hơn 2, các tinh thể akaganeite bị tan ra, do các ion Cl- bị thay thế dần bằng các ion OH-; tạo

thành các tinh thể goethite và magnetite bao xung quanh. Khi R đạt đến gia trị 2,5;

các tinh thể goethite bị tan hết, chỉ còn lại các tinh thể magnetite.

Cũng trong nghiên cứu của Ahn, nếu ta đột ngột tăng độ pH của dung dịch chứa hỗn hợp hai muối Fe2+ và Fe3+, cùng một lúc có nhiều quá trình tạo Fe3O4 cùng

xảy ra song song; bao gồm chu trình akaganeite goethite magnetite; hoặc quá

31

trình tạo akaganeite bị bỏ qua; hoặc Fe(OH)2 đƣợc hình thành trƣớc, sau đó các ion

Fe2+ bị thay thế bởi Fe3+. Các quá trình cùng xảy ra đồng loạt là do khi đƣa ba zơ vào

quá nhanh, gây ra chênh lệch pH nội tại trong dung dịch; vì thế có thể dẫn tới việc

khó điều khiển quá trình tạo hạt Fe3O4. Từ đây, cũng có thể thấy, trong các nghiên

cứu chế tạo các hạt nano Fe3O4 trong dung dịch thì chất ba zơ đƣợc nhỏ rất từ từ vào

trong dung dịch chứa các ion sắt. Bên cạnh đó, chất hoạt hóa bề mặt cũng đƣợc sử

dụng để điều chỉnh quá trình hình thành hạt.

Trong các phƣơng pháp gắn lớp kim loại lên bề mặt các hạt nano từ tính,

phƣơng pháp chức năng hóa bề mặt trƣớc khi cho hấp phụ các hạt mầm nano kim

loại đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng [56,80]. Trong đó, các phân tử hoạt hóa

bề mặt có gốc silane nhƣ (3-Aminopropyl)thiethoxysilane (APTES) thƣờng đƣợc

dùng để hoạt hóa bề mặt các hạt nhằm tạo ra lớp vỏ tích điện dƣơng với gốc NH3

[80]. Các hạt nano kim loại nhƣ nano vàng, nano bạc thƣờng tích điện âm, vì vậy dễ

bị hấp phụ lên bề mặt các hạt ô xít sau khi chức năng hóa dựa vào liên kết tĩnh điện.

Sau đó, các hạt nano kim loại bám trên bề mặt các hạt nano ô xít đƣợc tiếp tục nuôi

lớn lên giống nhƣ quy trình nuôi mầm đã bàn ở phần 1.4.2.

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC

Từ những năm đầu thế kỷ XXI, nghiên cứu vật liệu nano ứng dụng trong y

sinh đã đƣợc các nhóm nghiên cứu trong nƣớc quan tâm. Các đề tài nghiên cứu chế

tạo vật liệu nano định hƣớng ứng dụng trong đánh dấu sinh học thƣờng là những đề

tài lớn. Sau đó, từ năm 2011 đến nay, nhờ có sự kết hợp giữa các nhà khoa học vật

liệu và sinh học, các nhóm nghiên cứu ứng dụng vật liệu trong y sinh đã phát triển,

trong đó việc nghiên cứu vật liệu định hƣớng ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh

học cũng là một trong nhƣng hƣớng nghiên cứu rất đƣợc chú ý. Hình 1.10 thống kê

số lƣợng các đề tài liên quan đến chế tạo cảm biến sinh học đƣợc cấp bởi quỹ

NAFOSTED (quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia) từ năm 2011 đến năm

2016. Các đề tài này đều liên quan đến nghiên cứu chế tạo vật liệu định hƣớng ứng

dụng làm cảm biến sinh học nên đều đƣợc cấp cho hai ngành Lý và Hóa; trong đó

32

ngành Vật lý chiếm đại đa số.

Hình 1.10. Thống kê số đề tài NAFOSTED về cảm biến sinh học từ năm 2011 đến năm 2016. Hình A: số lượng đề tài phân bố theo năm. Hình B: số lượng đề tài phân bố theo đơn vị. ĐH BKHN: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, ĐH KHTN: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Trong khoảng thời gian từ năm 2012 đến năm 2016, có 20 đề tài NAFOSTED

đƣợc cấp cho các nghiên cứu về chế tạo cảm biến sinh học. Số đề tài về chế tạo cảm

biến sinh học đƣợc cấp nhiều nhất trong một năm là 9, thuộc về năm 2012 (hình

1.10A). Sau đó, số lƣợng đề tài về nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học giảm nhanh.

Đến năm 2015 thì số lƣợng đề tài lại tăng lên đến 6. Thời gian trung bình từ lúc bắt

đầu đến khi kết thúc một đề tài NAFOSTED thƣờng là 2-3 năm, vì vậy việc lặp lại

đỉnh điểm về số lƣợng đề tài đăng ký tại các năm 2012 và 2015; thể hiện rõ việc

nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên nền vật liệu cấu trúc nano tập trung tại

một số nhóm nghiên cứu cố định. Hình 1.10B mô tả phân bố số đề tài theo đơn vị

nghiên cứu. Số lƣợng đề tài nghiên cứu đƣợc tập trung nhiều tại Trƣờng Đại học

Bách khoa Hà Nội với 50% số đề tài đƣợc cấp. Những năm gần đây – từ 2013, có

một số nhóm nghiên cứu tại các trung tâm nghiên cứu khác cũng bắt đầu tăng cƣờng

nghiên cứu về cảm biến sinh học, cụ thể là Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại

học Quốc gia Hà Nội và Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; mỗi nơi

chiếm 15% số lƣợng đề tài về chế tạo cảm biến sinh học. Ngoài ra, có một số cơ sở

nghiên cứu khác cũng có các nhóm nghiên cứu độc lập về cảm biến sinh học nhƣ

33

Trƣờng Đại học Sƣ phạm kỹ thuật Hƣng Yên, Trƣờng Đại học Quốc tế - Đại học

Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Huế,

Trƣờng Đại học Hoa Lƣ và Trƣờng Đại học Dầu khí).

Nghiên cứu cảm biến sinh học sử dụng vật liệu nano cần có sự kết hợp giữa

kiến thức sinh học và kiến thức về vật liệu bao gồm: phƣơng pháp chế tạo vật liệu và

tính chất vật liệu; vì vậy cần phải có sự gắn kết giữa các nhóm nghiên cứu vật liệu

với các nhóm nghiên cứu y sinh. Nhƣ vậy, những cơ sở nghiên cứu về cảm biến sinh

học không những phải đảm bảo có những nhóm nghiên cứu về vật liệu, sinh học

mạnh mà còn phải có sự hợp tác chặt chẽ giữa các nhóm này với nhau. Chính vì vậy

số nhóm nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học không nhiều và thƣờng tập trung tại

các trung tâm nghiên cứu lớn hoặc đã có lịch sử nghiên cứu vật liệu ứng dụng y sinh

từ trƣớc đó, cụ thể là Trƣờng Đại học Bách Khoa, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại

học Quốc gia TP HCM. Sau đó, theo xu thế phát triển chung, có một số nhóm nghiên

cứu khác bắt đầu chuyển hƣớng sang ứng dụng y sinh; nhƣng vẫn cần phải hợp tác

với các nhóm mạnh kể trên. Bảng 1.4 thống kê tình hình nghiên cứu ứng dụng vật

liệu nano trong chế tạo cảm biến sinh học tại một số cơ sở kể trên.

Từ bảng 1.4 có thể thấy các nhóm nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu chế

tạo vật liệu để tạo ra điện cực xốp; nhằm tăng cƣờng diện tích tiếp xúc giữa điện cực

và đối tƣợng nghiên cứu. Nhóm nghiên cứu của TS. Tống Duy Hiển, Đại học Quốc

gia TP HCM sử dụng dây nano Pt làm tăng diện tích tiếp xúc với enzyme GOx để

nhận biết nồng độ glucose trong dung dịch [101]. Nhóm nghiên cứu của PGS. Mai

Anh Tuấn, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội sử dụng lớp polymer dẫn có độ xốp

cao nhƣ polyaniline [21] hay polypyrrol [75] để tăng sự tiếp xúc và tính tƣơng thích

sinh học của điện cực với các đối tƣợng sinh học. Vật liệu Pt xốp [100] hay ống nano

carbon [85] cũng đƣợc nhóm của PGS. Mai Anh Tuấn sử dụng để tăng diện tích tiếp

xúc bề mặt trong chế tạo cảm biến sinh học. Cùng chung phƣơng pháp, dây

polyalinine đƣợc mọc trên đế graphene đƣợc nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Văn

Chúc, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

34

phát triển để khảo sát nồng độ atrazine trong dung dịch [87]. Nhóm nghiên cứu của

PGS. Nguyễn Ngọc Long sử dụng sự tăng cƣờng diện tích bề mặt của các tetrapods

(que 4 chân) ZnO để làm tăng độ nhạy của cảm biến sinh học điện hóa xác định nồng

độ glucose trong dung dịch [70].

Bảng 1.4. Thống kê nghiên cứu về chế tạo cảm biến sinh học tại một số cơ sở nghiên cứu trong nước

Cơ sở nghiên cứu Vật liệu Đối tƣợng Tín hiệu Tài liệu tham khảo

Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội trở, hóa, cực - DNA - Virus - Glucose, cơ chất Huỳnh - Điện điện tổng trở - quang [30,75,57,85,100]

Huỳnh

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [37,81,84,87,120] - quang - Điện hóa Carbon,

- Điện cực xốp kim loại - Điện polymer - Sản phẩm nano carbon (CNT, grapheme) - Nano bán dẫn - Nano kim loại - Chấm lƣợng tử, chấm lƣợng tử bọc sulfide kim loại - graphene - Bán dẫn - Từ tính - Nano kim loại Trƣờng Đại học KHTN, Đại học QGHN - Điện hóa - Tín hiệu từ - Tán xạ ánh sáng, SERS. [27,70,82,104]

- DNA virus - Thuốc trừ sâu, hóa chất độc hại - Tế bào ung thƣ - Glucose - Tế bào ung thƣ tế - DNA bào gây bệnh, DNA virus - Glucose - DNA Đại học Quốc gia TP HCM - Dây nano Silicon, Pt [99,101] - Điện hóa - Tín hiệu transitor.

Tín hiệu có nguồn gốc từ vật liệu nano cũng đƣợc các nhóm nghiên cứu trong

nƣớc sử dụng làm tín hiệu của cảm biến sinh học. Tín hiệu điện từ các vật liệu khác nhau đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. Tín hiệu ô xi hóa khử ion Zn2+ trong vật liệu ZnO

đƣợc sử dụng để khảo sát nồng độ glucose trong dung dịch [70]. Trong khi đó, sự

35

thay đổi của tín hiệu tổng trở hoặc độ dẫn khi có sự tƣơng tác sinh học đƣợc nhóm

nghiên cứu của PGS. Mai Anh Tuấn sử dụng nhiều hơn [57,75]. Tín hiệu huỳnh

quang của một số vật liệu bán dẫn kích thƣớc nano – chấm lƣợng tử - cũng thƣờng

xuyên đƣợc các nhóm nghiên cứu sử dụng trong khảo sát các đối tƣợng sinh học

khác nhau [81,120]. Các chấm lƣợng tử CdSe, CdTe hay CuInS2 thƣờng đƣợc bọc

thêm một lớp ZnS [37,63], không chỉ làm giảm tính độc hại của các kim loại nặng

xuất hiện trong chấm lƣợng tử mà còn tăng tính tƣơng thích sinh học của vật liệu.

Mặc dù đã có những nghiên cứu thể hiện khả năng tƣơng tác tốt giữa vật liệu sulfide

kim loại với các enzyme ô xi hóa khử, nhƣng chƣa có nghiên cứu nào về cảm biến

sinh học điện hóa dựa trên nền vật liệu sulfide kim loại.

KẾT LUẬN CHƢƠNG I

Trong chƣơng này, chúng tôi đã trình bày một số nội dung sau:

(1) Đƣa ra khái niệm về cấu trúc của một cảm biến sinh học và một số tiêu chí

đánh giá chất lƣợng cảm biến sinh học.

(2) Trên cơ sở khái niệm cấu trúc của cảm biến sinh học, trình bày tổng quan

về cảm biến điện hóa xác định nồng độ glucose và khảo sát tế bào bao gồm: cơ chế

hoạt động, lý thuyết quá trình chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện hóa và

cấu trúc thƣờng gặp của cảm biến.

(3) Trình bày tổng quan về ứng dụng vật liệu nano nhằm làm tăng độ nhạy và

mở rộng giới hạn khảo sát trong cảm biến xác định nồng độ glucose và khảo sát nồng

độ tế bào.

(4) Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về cảm biến sinh

36

học, đặc biệt là cảm biến sinh học điện hóa.

CHƢƠNG 2: CHẾ TẠO VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Chƣơng 2 bao gồm hai phần chính: (i) chế tạo vật liệu và (ii) các phƣơng pháp

khảo sát tính chất vật liệu nano PbS, vật liệu nano kim loại và vật liệu nano đa chức

năng từ tính kim loại thực hiện bởi nghiên cứu sinh tại Trung tâm Khoa học Vật liệu,

Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1. CHẾ TẠO VẬT LIỆU

2.1.1. Chế tạo vật liệu PbS bằng phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp ủ

laser

Quy trình chế tạo vật liệu nano PbS đƣợc chia thành hai bƣớc chính: sử dụng

phƣơng pháp hóa siêu âm để chế tạo vật liệu và sau đó ủ nhiệt laser.

Chế tạo vật liệu PbS bằng phương pháp hóa siêu âm

Hình 2.1. Chế tạo các hạt nano PbS bằng phương pháp hóa siêu âm. Hình A mô tả các bước thí nghiệm chế tạo hạt. Hình B là ảnh thực tế quá trình chế tạo hạt.

Các bƣớc tiến hành thí nghiệm chế tạo hạt nano PbS bằng phƣơng pháp hóa

siêu âm đƣợc mô tả nhƣ hình 2.1A. Dung dịch gốc chứa chì acetate (Pb(Ac)2) 0,25

M, TAA 0,06 M và CTAB 0,06 M đƣợc pha trƣớc. Lần lƣợt 2 mL dung dịch Pb(Ac)2

và 10 mL dung dịch TAA đƣợc cho vào 20 mL dung dịch CTAB, khuấy đều để tạo thành hỗn hợp chứa ion Pb2+ và TAA trong môi trƣờng CTAB. Sau đó, sóng siêu âm

có dạng xung tần số 40 kHz, công suất 390 W đƣợc cung cấp vào dung dịch từ hệ còi

siêu âm Sonic VCX 750 (hình 2.1B). Chế độ xung của sóng siêu âm là 5 s phát – 5 s

37

nghỉ. Sau 2 h siêu âm, dung dịch chuyển sang màu đen đặc trƣng của PbS. Sản phẩm

đƣợc lọc rửa vài lần bằng nƣớc cất hai lần và cồn tuyệt đối, trƣớc khi đƣợc lƣu trữ

trong nƣớc cất hai lần và bảo quản trong điều kiện khô thoáng, tránh ánh sáng mặt

trời.

Ủ nhiệt laser

Việc sử dụng phƣơng pháp ủ nhiệt laser không những có thể hoàn thiện tinh

thể vật liệu mà còn không làm cho các hạt tinh thể PbS bị kết đám với nhau nhƣ các

phƣơng pháp ủ nhiệt truyền thống, nếu chùm laser đƣợc chiếu trực tiếp vào các hạt

PbS.

Nguồn laser sử dụng trong quá trình ủ nhiệt là nguồn laser của hệ máy Raman

LABRAM HR800. Mẫu sau khi sấy khô, đƣợc đƣa vào trong buồng đo LinkCam để

hạn chế ảnh hƣởng của môi trƣờng trong quá trình ủ. Khi chiếu chùm laser lên mẫu,

vật kính laser để ở chế độ Macro và mẫu để ở chế độ quét.

Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt PbS đƣợc khảo sát trên

hệ nhiễu xạ tia X (D5005, Bruker). Phổ tán xạ Raman của mẫu đƣợc đo trên hệ

LabRAM HR800, Horiba. Hình thái của các hạt đƣợc đo bằng hệ hiển vi phân giải

cao (HRTEM) TF20 FEG, Tecnai. Tính chất hấp thụ ánh sáng của mẫu chứa hạt PbS

đƣợc khảo sát trên hệ đo hấp thụ quang học UV2450, Shimadzu

2.1.2. Chế tạo các hạt nano kim loại bằng phƣơng pháp nuôi mầm

Quy trình thí nghiệm đƣợc chia làm hai bƣớc: chế tạo các mầm nano vàng có

kích thƣớc nhỏ, và phân tán vào các môi trƣờng chứa chất hoạt động bề mặt đƣợc mô

tả nhƣ trong hình 2.2. Bƣớc 1, HAuCl4 đƣợc pha vào trong dung dịch chứa CTAB để

thành hỗn hợp chứa 1 mM HAuCl4 và CTAB 0,1 M. Khuấy đều đến khi dung dịch

đồng nhất và có màu vàng nâu. Sau đó dung dịch chứa chất khử NaBH4 có nồng độ

0,1 M đƣợc nhỏ từ từ vào hỗn hợp HAuCl4 và CTAB. Dung dịch chuyển rất nhanh

sang màu nâu sẫm, đây cũng chính là màu đặc trƣng của dung dịch chứa các hạt nano

vàng có kích thƣớc nhỏ - từ 1 đến 5 nm (dung dịch chứa các hạt mầm nano vàng).

Trong bƣớc 2, dung dịch chứa các hạt mầm nano vàng đƣợc cho vào các cốc nghiệm

38

có thể tích giống nhau có chứa CTAB với các nồng độ lần lƣợt là 25 mM, 35 mM và

70 mM (dung dịch nuôi). Trong một ồng nghiệm chứa dung dịch nuôi khác, PVP

đƣợc bổ sung để có nồng độ CTAB và PVP cuối cùng lần lƣợt là 25 mM và 100

mg/L. (Do PVP là polymer nên nồng độ thƣờng để ở dạng khối lƣợng / thể tích). Các

dung dịch trên đƣợc ngâm trong thời gian 4 tháng. Sự tăng trƣởng kích thƣớc hạt

vàng trong các dung dịch đƣợc theo dõi theo thời gian thông qua nghiên cứu phổ hấp

thụ quang học trên hệ UV2450, Shimadzu.

Hình 2.2. Quy trình chế tạo và nghiên cứu sự phát triển của các hạt nano vàng trong dung dịch chứa chất hoạt động bề mặt.

Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt nano vàng đƣợc đo trên hệ nhiễu

xạ tia X (D5005, Bruker). Bên cạnh đó, tại một số thời điểm trong quá trình phát

triển của hạt nano vàng, ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của dung dịch chứa

các hạt đƣợc khảo sát trên hệ JEM-1010, JEOL (viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng).

2.1.3. Chế tạo các hạt nano đa chức năng bằng phƣơng pháp hóa ƣớt

2.1.3.1. Chế tạo các hạt nano Fe3O4

Các hạt nano Fe3O4 đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa. Tiền chất

39

sử dụng là FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O và dung dịch amoni NH4OH. Dung môi là nƣớc

cất hai lần đƣợc xử lý bằng cách sục khí Ar trong thời gian 15 phút để đuổi hết khí ô

xi khuếch tán giữa các phân tử nƣớc. Quy trình chế tạo các hạt nano Fe3O4 đƣợc mô

tả nhƣ trong hình 2.3. Cụ thể, 0,79 g FeCl2.4H2O (4 mmol) và 2,15 g FeCl3.6H2O (8

mmol) đƣợc pha vào nƣớc cất hai lần để tạo thành dung dịch có thể tích 100 mL.

Dùng máy khuấy từ khuấy đều để tạo thành dung dịch đồng nhất. Dung dịch nhận đƣợc trong suốt có màu vàng nâu chứa hai ion Fe2+ và Fe3+. Nâng nhiệt độ của dung dịch lên 60oC bằng cách ngâm cách thủy bình trong hệ cất quay điều nhiệt (Buchi R-

300, Thụy sĩ). Sau đó, 20 mL dung dịch NH4OH 25% đƣợc bổ sung thêm 30 mL nƣớc cất, trộn đều và nhỏ từ từ vào hỗn hợp chứa hai ion Fe2+ và Fe3+, thấy dung dịch

chuyển sang màu đen đặc trƣng của các hạt nano Fe3O4. Tiếp tục khuấy dung dịch trong vòng 30 phút, trong khi nhiệt dộ dung dịch vẫn giữ ở 60oC. Sản phẩm cuối

cùng đƣợc lọc rửa bằng nƣớc cất hai lần và cồn tuyệt đối. Mẫu đƣợc lƣu trữ trong

nƣớc cất hai lần đã xử lý sục Ar, bịt kín để chống ô xi hóa và bảo quản tại nơi khô

thoáng.

Các hạt nano Fe3O4 bảo quản trong nƣớc cất hai lần đƣợc định lƣợng bằng

phƣơng pháp cân. Các ống nhựa ependorf đƣợc rửa sạch, sấy khô đến khối lƣợng

không đổi. Sau đó, 1 mL dung dịch chứa các hạt nano Fe3O4 đƣợc nhỏ vào ống.

Dùng nam châm thu các hạt về phía đáy ống và đổ phần nƣớc bên trên đi. Lặp lại

nhƣ thế 3 lần, ta đƣợc lƣợng Fe3O4 chứa trong ống tƣơng đƣơng với khối lƣợng của Fe3O4 có trong 3 mL dung dịch chứa hạt. Sấy khô các ống ependorf ở nhiệt độ 60oC,

rồi cân khối lƣợng các ống ependorf lần nữa. Hiệu khối lƣợng nhận đƣợc sau khi cho

Fe3O4 và trƣớc khi cho Fe3O4 chính là khối lƣợng của các hạt nano Fe3O4 có trong 3

40

mL dung dịch chứa hạt.

Hình 2.3. Quy trình chế tạo các hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa. Hình A là sơ đồ quy trình chế tạo. Hình B là hình ảnh thực tế hệ máy khuấy và hệ điều nhiệt sử dụng để chế tạo hạt.

Hình thái của các hạt nano Fe3O4 đƣợc khảo sát thông qua ảnh TEM (JEM- 1010, JEOL). Cấu trúc của các hạt đƣợc khảo sát dựa trên giản đồ nhiễu xạ tia X (đo trên hệ D5005, Bruker). Đƣờng cong từ trễ của mẫu chứa các hạt Fe3O4 đƣợc đo trên hệ từ kế mẫu rung (VSM-DMS 880, Digital Measurement Systems).

2.1.3.2. Chế tạo các hạt nano đa chức năng Fe3O4-Au

Các hạt nano từ sau khi đƣợc chế tạovà khảo sát tính chất từ, đƣợc nghiên cứu

để gắn thêm với các hạt nano kim loại. Các hạt kim loại này đóng vai trò vừa tăng độ

bền của vật liệu – chống ô xy hóa đối với Fe3O4, vừa có hoạt tính tốt vì khả năng

chức năng hóa bề mặt bởi nhóm thiol [18]; đồng thời cũng có khả năng hỗ trợ đánh

dấu nhƣ sử dụng phổ Raman tăng cƣờng bề mặt hay khả năng tán xạ ánh sáng dƣới

kính hiển vi trƣờng tối.

Quy trình chế tạo các hạt nano Fe3O4-Au đƣợc chia làm 2 giai đoạn: (i) hấp - lên bề mặt các hạt nano từ và (ii) khử trong môi thụ ion kim loại - ở đây là ion AuCl4

trƣờng có nồng độ chất hoạt hóa cao.

- lên bề mặt các hạt Fe3O4

41

(i) Hấp thụ ion AuCl4

Cho 10 mg hạt Fe3O4 vào 20 mL dung dịch chứa HAuCl4 ở các pH khác nhau

(pH ban đầu của dung dịch chứa HAuCl4 là 3; NaOH đƣợc sử dụng để điều chỉnh pH

của dung dịch tới các giá trị lớn hơn, lần lƣợt là 4, 5, 6, 7 và 8). Các hạt nano Fe3O4

đƣợc ngâm trong dung dịch chứa các hạt Fe3O4 trong thời gian 5 phút trƣớc khi sử

dụng nam châm để tách ra khỏi dung dịch. Phép đo thế quét vòng (Cyclic

voltammetry – CV) của dung dịch chứa HAuCl4 trƣớc và sau khi ngâm Fe3O4 đƣợc

đo trên hệ điện hóa PGSTAT302N.

(ii) Khử các ion kim loai trong môi trường có chất hoạt hóa nồng độ cao

Các hạt nano Fe3O4 sau khi đƣợc ngâm vào trong dung dịch chứa HAuCl4 tại

các pH khác nhau đƣợc phân tán trở lại dung dịch chứa chất hoạt động bề mặt là

CTAB (cũng đƣợc chỉnh pH sao cho bằng pH môi trƣờng dùng để ngâm hạt). Sau - thành kim loại. Sản phẩm đó, NaBH4 đƣợc sử dụng để khử các ion kim loại AuCl4

nhận đƣợc sau quá trình khử đƣợc ký hiệu là Fe3O4-Au.

Giản đồ nhiễu xạ tia X và ảnh TEM lần lƣợt sử dụng để khảo sát tính chất cấu

trúc và hình thái của các hạt nano trƣớc và sau khi gắn với các hạt nano vàng. Do

lƣợng hạt Fe3O4 sử dụng không đủ lớn để đo từ tính trên hệ từ kế mẫu rung (VSM-

DMS 880, Digital Measurement Systems) nên từ tính của các hạt đa chức năng đƣợc

khảo sát dựa vào phép đo hấp thụ kết hợp với nam châm vĩnh cửu. Đặt nam châm

vĩnh cửu bên cạnh cuvette có dung dịch chứa các hạt Fe3O4-Au để hút chúng về một

phía. Phổ hấp thụ quang học của mẫu chứa dung dịch còn lại đƣợc đo trên hệ hấp thụ

quang học UV2450, Shimadzu.

2.1.3.3. Chế tạo các hạt nano đa chức năng Fe3O4-Ag

Dung dịch chứa 100 mg hạt Fe3O4 đƣợc phân tán vào 400 mL cồn tuyệt đối.

Bổ sung 12 mL dung dịch NH4OH 25% vào cốc nghiệm chứa hạt, rồi cho cốc

nghiệm vào bể rung siêu âm để NH4OH khuếch tán đều trong dung dịch. Sau 15

phút, 18 mL dung dịch APTES đƣợc nhỏ một cách từ từ. Tiếp tục rung siêu âm 1,5 h,

sản phẩm nhận đƣợc là các hạt nano Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bởi các phân tử

APTES (Fe3O4-APTES). Trong bƣớc tiếp theo, 20 mg hạt Fe3O4-APTES đƣợc phân

42

tán một lần nữa vào cốc nghiệm chứa 80 mL cồn tuyệt đối. NH4OH 25% đƣợc sử

dụng để điều chỉnh pH dung dịch thành 11, trƣớc khi bổ sung 4 mL dung dịch

AgNO3 20 mM. Sau 30 phút, 4 mL dung dịch NaBH4 20 mM đƣợc sử dụng để khử ion Ag+ thành Ag. Sau 12h, sản phẩm – ký hiệu là Fe3O4-Ag - đƣợc lọc rửa bằng

nam châm vĩnh cửu và bảo quản trong cồn tuyệt đối.

Cấu trúc và hình thái của mẫu Fe3O4-Ag đƣợc khảo sát bằng hệ đo nhiễu xạ

tia X (D5005, Bruker) và kính hiển vi điện tủ truyền qua TEM (JEM1010, JEOL).

Từ tính của mẫu chứa các hạt đa chức năng Fe3O4-Ag đƣợc phân tích trên hệ từ kế

mẫu rung (VSM-DMS 880, Digital Measurement Systems).

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.2.1. Các p ương p áp t ực ng iệm

2.2.1.1. Nhiễu xạ tia X

Cấu trúc tinh thể đƣợc xác định thông qua phƣơng pháp nhiễu xạ tia X. Khi

chùm tia X phản xạ trên bề mặt tinh thể, hình thành hiện tƣợng giao thoa. Cƣờng độ

tia X sau khi giao thoa đạt cực đại khi góc tới của chùm tia X thỏa mãn điều kiện

Bragg (hình 2.4):

(2.1) 2dhklsinθ=nλ

Trong đó:

dhkllà khoảng cách giữa các mặt phẳng nguyên tử có chỉ số mặt tinh thể là

(hkl).

θ là góc tia X tới hợp với mặt phẳng tinh thể đang xét.

λ là bƣớc sóng tia X.

n = 1, 2, 3… đƣợc gọi là bậc phản xạ.

Các cực đại nhiễu xạ có độ bán rộng B tùy thuộc vào độ rộng của khe chắn

Detector, kích thƣớc của các hạt tinh thể và ứng suất trong mẫu đo. Khi sử dụng khe

có độ mở nhỏ, từ độ bán rộng B cho phép xác định đƣợc kích thƣớc tinh thể theo

công thức Scherrer:

43

D = 0,9λ/(Bcosθ) (2.2)

Hình 2.4. Mô tả tán xạ của chùm tia X trên bề mặt tinh thể.

Cấu trúc và hoạt động của một máy nhiễu xạ tia X (XRD) đƣợc trình bày nhƣ

trong hình 2.5. Tia X đƣợc cung cấp bởi một ống phát tia X – trong hình 2.6A ký

hiệu là “nguồn tia X”. Ống phát tia X thƣờng đƣợc giữ cố định. Tia X tới bề mặt của

tinh thể đƣợc đặt trên giá đặt mẫu. Giá để mẫu có thể xoay tự do trong mặt phẳng tạo

bởi tia X và giá để mẫu (Hình 2.5A). Tia nhiễu xạ đƣợc thu nhận bởi một đầu thu ở

phía đối diện.

Nhƣ vậy, khi góc quay 2θ của đầu thu thay đổi, cƣờng độ nhiễu xạ nhận đƣợc

thay đổi và sẽ đạt đƣợc các cực đại ứng với θ thỏa mãn điều kiện Bragg. Giản đồ

nhiễu tạ tia X (XRD) nhận đƣợc là sự phụ thuộc của cƣờng độ tia nhiễu xạ vào góc

quay của đầu thu 2θ.

Các phép đo nhiễu xạ tia X trong luận án này đƣợc thực hiện trên hệ Siemens

D5005, Bruker đặt tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học

44

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (hình 2.5B). Tia X Cu-Kα có bƣớc sóng 1,5406 Ǻ. Dải đo từ 10o đến 70o. Bƣớc đo 0,03o và thời gian tích phân là 1s.

Hình 2.5. Cấu trúc và hoạt động của máy đo nhiễu xạ tia X (XRD). Hình A: mô hình hoạt động của một máy XRD. Hình B: Ảnh của máy XRD Siemens D5005 tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trường Đại học KHTN.

2.2.1.2. Tán xạ Raman

Tán xạ Raman là tán xạ bậc 2 của một sóng điện từ có tần số ν0khi tƣơng tác

với mô men lƣỡng cực gây ra bởi dao động của một liên kết hóa học. Điện trƣờng

của sóng điện từ tƣơng tác với một liên kếtgiữa hai nguyên tử, tạo

nên một moment lƣỡng cực điện có độ lớn phụ thuộc vào toán tử lƣỡng cực

theo công thức sau:

(2.2)

Các phần tử của ma trận lƣỡng cực αij(i,j = x,y,z) có thể khai triển Taylor theo

độ dịch chuyển của phonon và làm tròn đến hàm bậc nhất:

(2.3)

Lúc này giá trị của phối tử i của vector moment lƣỡng cực đƣợc tính theo công

thức:

45

(2.4)

Nếu nhƣ phần tử vi phân bậc một không bằng 0, ứng với việc sóng điện từ gây

ra thay đổi lƣỡng cực, thì phần tử chứa vi phân bậc 1 trong biểu thức số2.4 có thể

tách thành tổng của hai dao động có tần số (ν0– νk) và (ν0+ νk). Hay nói cách khác, sẽ

xuất hiện 2 loại sóng điện từ thứ cấp có bƣớc sóng ứng với các tần số dao động trên.

Hình 2.6.Hình ảnh hệ đo LabRAM HR800, Horiba tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Hình 2.6 là ảnh của hệ đo Raman LabRAM HR800, Horiba đƣợc sử dụng

trong luận án, tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội. Phổ tán xạ Raman biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ ánh sáng tán xạ vào số sóng (cm-1). Mẫu đo đƣợc gắn với bàn để mẫu của một kính

hiển vi. Ánh sáng kích thích là một chùm laser có bƣớc sóng 532nm, sau khi qua

kính hiển vi, hội tụ trên bề mặt của mẫu. Ánh sáng tán xạ trên bề mặt mẫu đi ngƣợc

lại hệ kính hiển vi và đƣợc lọc bớt phần tán xạ đàn hồi (ánh sáng có tần số bằng tần

số của ánh sáng kích thích) bằng một phiến lọc chặn, trƣớc khi đƣợc thu bằng đầu đo

CCD 1024 × 256 pixel.

2.2.1.2.1. Hiển vi điện tử truyền qua – TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua thƣờng đƣợc dùng để khảo sát vật liệu có kích

thƣớc nhỏ nhƣ các hạt nano hay các màng mỏng nano. Về bản chất, kính hiển vi điện

46

tử TEM có nguyên lý hoạt động gần giống nhƣ kính hiển vi quang học; khác biệt là

chùm ánh sáng trong kính hiển vi quang học đƣợc thay thế bởi chùm điện tử. Các hệ

thống kính dùng để điều chỉnh đƣờng đi của chùm tia là thấu kính từ. Chùm điện tử

đi xuyên qua mẫu, bị tán xạ và phóng đại hình ảnh chi tiết của mẫu qua các thấu kính

điện từ và quan sát trên màn huỳnh quang.

Hình 2.7. Cấu trúc đơn giản của hệ hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử thƣờng có hai chế độ chụp ảnh, bao gồm chế độ chụp ảnh

và chế độ chụp nhiễu xạ (hình 2.7). Khi chùm điện tử chiếu vào mẫu, sau vật kính có

hai chế độ tạo ảnh: ảnh hiển vị tại mặt phẳng ảnh và ảnh nhiễu xạ tại mặt phẳng tụ

tiêu.

Các phép đo hiển vi điện tử truyền qua trong luận án đƣợc thực hiện trên hệ

JEOL JEM-1010 đặt tại Viện Vệ sinh dịch tế Trung ƣơng. Chế độ đo trƣờng sáng,

47

với thế gia tốc đặt từ 40kV đến 100kV, độ phóng đại cực đại 500.000 lần.

2.2.1.3. Hệ đo hấp thụ quang học vùng tử ngoại – khả kiến

Nguyên lý của phép đo hấp thụ quang học dựa trên định luật Lambeer-Bert.

Khi chùm sáng có cƣờng độ I0 truyền tới môi trƣờng có bề dày d thì cƣờng độ bị hấp

thụ một phần I. Nếu I0 nhỏ và các hiện tƣợng phản xạ, tán xạ không đáng kể, ta có

với α là hệ số dập tắt (exctinction coefficient)phụ thuộc vào bản

chất của chất tan trong dung dịch, C (mol/l) là nồng độ dung dịch, d (cm) là bề dày

lớp dung dịch. Độ truyền qua T và độ hấp thụ A đƣợc tính bởi công thức:

(2.5)

Hình 2.8. Hệ đo UV-2450, Shimadzu tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Phổ hấp thụ quang học trong vùng tử ngoại khả kiến (phổ hấp thụ UV-vis) là

giản đồ biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ hấp thụ A đƣợc tính theo công thức 2.5.

48

Các phổ hấp thụ UV-vis trong luận án này đƣợc đo đạc trên hệ UV-2450, Shimadzu

tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội (hình 2.8). Nguồn sáng của hệ đƣợc cấp bởi hai đèn: đèn

Deuterium cung cấp ánh sáng trong vùng tử ngoại và đèn Halogen cung cấp ánh sáng

trong vùng nhìn thấy. Ánh sáng đƣợc đơn sắc hóa bởi hệ cách tử phản xạ (hệ đơn sắc

hóa ảnh sáng - monochromator) trƣớc khi đi qua một khe hẹp để hƣớng tới buồng

chứa mẫu. Tại buồng chứa mẫu, chùm sáng đƣợc tách ra thành 2 chùm bởi một

gƣơng bán phản xạ; một chùm sáng đi qua cuvette tham chiếu và một chùm đi qua

cuvette chứa dung dịch mẫu. Đầu thu nhận nhiệm vụ thu thập tín hiệu và so sánh

cƣờng độ của hai tín hiệu sau khi đi qua cuvette tham chiếu (I0) và cuvette chứa mẫu

(I).

Dải quét của máy từ 200 nm đến 900 nm, vị trí chuyển đèn đƣợc đặt tại 315

nm và bƣớc quét (step) là 0,5 nm. Tốc độ đo mẫu để ở chế độ medium, thời gian tích

phân của một lần đo tại một bƣớc sóng là 0,5s.

2.2.1.4. Phép đo hiệu điện thế quét vòng và tổng trở trên hệ

PGSTAT302N

Phép đo hiệu điện thế quét vòng

Tín hiệu nhận đƣợc từ quá trình chuyển đổi tín hiệu là tín hiệu điện hóa. Hệ

đo bao gồm ba điện cực: điện cực làm việc (Working Electrode – WE), điện cực đếm

(Counter Electrode – CE) và điện cực tham chiếu (Reference Electrode – RE). RE có

cấu trúc là một cặp ô xi hóa khử ở trạng thái bão hòa (Ag/AgCl hoặc Hg/HgCl); vì

vậy có điện thế không đổi. Điện thế đặt trên WE đƣợc tham chiếu từ giá trị điện thế

của RE. Quá trình trao đổi điện tử của các phần tử chuyển đổi tín hiệu thƣờng xảy ra

trên bề mặt WE. CE có cấu tạo từ kim loại trơ nhƣ Pt hoặc Au dùng để đo dòng điện

hóa chạy trong dung dịch.

Phƣơng pháp đo thế quét vòng (cyclic voltammetry) là một trong những

phƣơng pháp hữu hiệu để khảo sát quá trình điện hóa của chất trao đổi ion trong

49

dung dịch. Điện áp đặt trên WE có dạng tam giác – có biểu thức nhƣ sau:

(2.6)

Theo công thức 2.6, chu kỳ của một xung tam giác là T; điện thế ban đầu đặt

vào WE là E0 và tốc độ tăng của hiệu điện thế là v – tốc độ quét. Sau nửa chu kỳ,

điện thế đạt Eend = E0+ vT/2, điện thế lại giảm với tốc độ quét v và về đến E0 trƣớc

khi bắt đầu chu kỳ mới (hình 2.9A).

Hình 2.9. Phương pháp hiệu điện thế quét vòng. Hình A biểu diễn sự phụ thuộc thời gian của điện thế đặt vào WE dạng xung tam giác với chu kỳ 2T. Hình B biểu diễn sự phụ thuộc dòng điện đi qua CE phụ thuộc vào hiệu điện thể đặt vào WE – giản đồ I-V.

Trong nửa đầu của chu kỳ quét vòng - , ban đầu điện thế của WE E0

nhỏ hơn điện thế ô xi hóa của dung môi điện hóa, quá trình khử xảy ra tại bề mặt

WE - . Trong đó O và R lần lƣợt là ký hiệu trạng thái ô xi hóa và trạng

thái khử của vật liệu dung môi điện hóa. Khi điện thế của WE tăng dần, lƣợng

electron tham gia quá trình khử tăng dần, dòng điện hóa sẽ tăng lên. Dòng điện hóa

đạt cực đại khi điện thế của WE đạt và giảm xuống khi giá trị điện thế tiếp tục

tăng. Tƣơng tự vậy, ở nửa chu kỳ sau, quá trình ô xi hóa của R thành O xảy ra và giá

trị cƣờng độ dòng điện hóa cũng sẽ đạt cực đại khi điện thế của WE là thế khử (hình

50

2.9B).

Giá trị cƣờng độ dòng điện hóa phụ thuộc vào nồng độ của dung môi điện

hóa, khả năng khuếch tán của các ion R và O về phía bề mặt điện cực, vào điện thế

của điện cực làm việc. Cƣờng độ dòng điện đạt cực đại tại và bằng:

(2.7)

R, T là hằng số khí lý tƣởng và nhiệt độ dung dịch điện hóa, F là hằng số

Faraday, A là diện tích tiếp xúc của dung môi điện hóa với WE, n và C0 là hóa trị và

nồng độ của ion chất ô xi hóa. D0 là hệ số khuếch tán, đặc trƣng cho khả năng

khuếch tán của ion tới bề mặt WE. K là hệ số phụ thuộc vào bản chất của dung môi

điện hóa và sự tƣơng thích giữa dung môi điện hóa với bề mặt điện cực. Phƣơng

trình 2.7 còn đƣợc gọi là phƣơng trình Randles-Sevcik đối với hệ điện hóa thuận

nghịch.

Phép đo tổng trở

Quá trình khuếch tán của các ion trên bề mặt của điện cực đƣợc Warbug lần

đầu tiên mô tả lại thông qua một hệ điện tổng trở. Lƣu lƣợng các hạt mang điện

hƣớng tới bề mặt điện cực tỉ lệ với gradiens nồng độ của chúng ở trên bề mặt điện

cực. Khi đặt điện trƣờng xoay chiều vào, , nghiệm riêng của quá trình

khuếch tán này cũng có dạng tuần hoàn, vì vậy pha của dòng điện đƣợc tính toán

không phụ thuộc vào dòng điện; còn gọi là phần tử Warbug hay phần tử “pha hằng

số” (Constant phase element - CPE). Bên cạnh đó, quá trình trao đổi điện tích trên bề

mặt điện cựctƣơng đƣơng với điện trở trao đổi điện tích – Rct. Song song với hệ CPE

nối tiếp với Rct, hệ tụ điện lớp kép cũng đƣợc đƣa thêm vào – double layer capacitor,

Cdl. Mạch điện này còn gọi là mạch Randles. Mạch Randles hay phần tử

Warbug/CPE đƣợc sử dụng rất nhiều để nghiên cứu quá trình khuếch tán của ion tại

bề mặt điện cực; đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học [7]. Các giá

trị điện trở nhƣ sau:

51

(2.8)

(2.9)

Hình 2.10. Mô hình mạch tương đương của dung dịch chứa ion Mn+ (Mô hình của Randles). Hình A là mô hình mạch tương đương. Hình B là giản đồ Nyquist của mạch điện tương đương với các giá trị Rct khác nhau.

Bên cạnh quá trình trao đổi điện tích tại bề mặt điện cực, dung môi cũng dẫn

điện và có điện trở là Rs. Quá trình tích điện bề mặt của điện cực tạo thành một điện

cực Cdl(điện dung lớp kép – double layer capacitor). Mạch tƣơng đƣơng của một

dung dịch chứa chất điện hóa có thể đƣợc mô tả nhƣ hình 2.10A. Khi thay đổi tần số

góc ω của điện áp đặt lên điện cực, giá trị tổng trở Z của mạch thay đổi. Giản đồ

Nyquyst của mạch điện – giản đồ biểu diễn sự phụ thuộc của phần ảo của tổng trở Im(Z) vào phần thực Re(Z) khi tần số góc ω thay đổi từ 1 Hz đến 106 Hz - đƣợc biểu

diễn nhƣ trong hình 2.10B. Có thể chia đƣờng phụ thuộc Im(Z) vào Re(Z) thành hai

52

phần: phần đƣờng thẳng ứng với các giá trị Im(Z) và Re(Z) thu đƣợc khi tần số góc

ω nhỏ và phần nửa cung tròn ứng với các giá trị Im(Z) và Re(Z) thu đƣợc khi tần số

góc có giá trị lớn.

Từ công thức 2.9, khi tần số ω rất nhỏ, các giá trị Rct hay Cdl, thậm chí điện

trở dung dịch Rs nhỏ hơn giá trị CPE rất nhiều, lúc này giản đồ Nyquist chỉ còn là

một đƣờng thẳng thể hiện Im(Z) phụ thuộc tuyến tính vào Re(Z), với hệ số góc là .

Khi ω lớn, giá trị của CPE nhỏ, lúc này mạch sẽ tƣơng đƣơng với điện trở Rs nối tiếp

với Rct và Cdl mắc song song (Rs nt (Rct // Cdl)). Giản đồ Nyquist có dạng nửa hình

tròn giao với trục hoành tại các vị trí có giá trị Rs và (Rs + Rct).

Các phép đo điện thế quét vòng và tổng trở của luận án đều đƣợc thực hiện

trên hệ PGSTAT302N, Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội (Hình 2.11).

Hình 2.11. Hệ đo PGSTAT302N tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Khi thực hiện phép đo thể quét vòng, tốc độ quét đƣợc cài đặt là 50 mV/s. Cứ

sau 10 mV máy sẽ đọc giá trị cƣờng độ dòng điện hóa một lần (reading step).

53

Khoảng quét (hiệu điện thế đầu và hiệu điện thể cuối) phụ thuộc vào phép đo. Đối

với dung dịch chứa muối vàng, khoảng quét từ 0,1V đến 1,7V. Đối với phép đo trên

hệ cảm biến glucose, khoảng quét từ -0,1V đến 1,5V.

Phép đo tổng trở đƣợc thực hiện trong khoảng tần số từ 1Hz đến 105Hz. Trong

khoảng này, tổng trở của mẫu đƣợc đo tại 200 điểm tần số. Biên độ của hiệu điện thế

xoay chiều đặt trên hệ mẫu là 0,01V. Mỗi một phép đo kéo dài khoảng 40 phút. Sau

mỗi phép đo trên tế bào, hình thái của tế bào đƣợc kiểm tra trên kính hiển vi và

không thấy hiện tƣợng tế bào bị vỡ.

2.2.2. P ương p áp tín toán lý t uyết Năng lƣợng E của một hệ tƣơng tác Coulomb là giá trị riêng của phƣơng trình

Schrödinger: , trong đó và Ψ lần lƣợt là toán tử Hamilton và hàm sóng

của hệ,

, (2.9)

Trong đó các thành phần , , lần lƣợt là

toán tử động năng, thế năng của hệ Coulomb và hàm tƣơng tác giữa các phần tử

trong hệ. Khi số lƣợng hạt của hệ tăng lên, phƣơng trình Schrödinger trở nên phức

tạp hơn và rất khó giải. Trong các phƣơng pháp giải gần đúng, lý thuyết hàm mật độ

thƣờng đƣợc ứng dụng trong việc tìm hiểu hoạt tính của hệ enzyme và zeolite, quá

trình chuyển tải điện tử, thiết kế thuốc và đặc biệt trong thiết kế và tìm hiểu về các

tính chất của vật liệu.

Lý thuyết Kohn-Sham

Theo Kohn-Sham, lý thuyết hàm mật độ thích hợp ứng dụng cho các hệ có

nhiều điện tử; tại đó, các hàm sóng bị giới hạn bởi các vách có cấu trúc hàm mũ

(exponential). Hệ điện tử đƣợc thay thế bởi mật độ điện tử với là

các giá trị hàm sóng giải đƣợc từ phƣơng trình Schrödinger. Khi này năng lƣợng của

54

hệ có thể biểu diễn ở dạng:

(2.10)

Trong đó: là động năng hệ, là thế năng tƣơng tác

nguyên tử - electron, là tƣơng tác electron-electron và

là năng lƣợng trao đổi. Nếu trong hệ có sự tham gia của A nguyên tử có điện

thì ta có tích ZA thì thế điện tƣơng tác nguyên tử - electron

. Công thức gần đúng của năng lƣợng trao đổi thay đổi tùy

theo đối tƣợng, sao cho kết quả tính toán có thể tiếp cận và giải thích đƣợc kết quả

thực nghiệm.

Phương pháp tính toán gần đúng dựa trên hàm mật độ định xứ (LDA)

Phƣơng pháp tính toán gần đúng đƣợc sử dụng nhiều trong tính toán trong

khoa học vật liệu. Theo đó, hệ điện tử đƣợc coi nhƣ là một hệ khí, và tƣơng tác trao

đổi lúc này có dạng: . Từ đây, về mặt lý thuyết ta có thể

giải đƣợc phƣơng trình Schrödinger và tính toán ra năng lƣợng cơ bản của hệ.

KẾT LUẬN CHƢƠNG II

Nhƣ vậy, chƣơng II trình bày về các phƣơng pháp chế tạo và khảo sát tính

chất vật liệu

Phương pháp chế tạo vật liệu

i, Phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp ủ nhiệt laser đƣợc sử dụng để chế tạo các

hạt nano PbS phân tán trong dung dịch.

ii, Phƣơng pháp nuôi mầm đƣợc sử dụng để tạo ra các hạt nano kim loại quý

có độ kết tinh, độ đồng đều cao; do có thể phân tách để điều khiển hai giai đoạn “tạo

mầm” và “hình thành hạt”.

iii, Các ion kim loại đƣợc hấp phụ lên trên bề mặt của các hạt nano ô xít từ

55

tính Fe3O4 trƣớc khi đƣợc khử thành kim loại. Sau đó lớp kim loại này đƣợc tiếp tục

phát triển bằng phƣơng pháp nuôi mầm để tạo ra lớp kim loại bao xung quanh các

hạt nano từ tính.

Các phương pháp nghiên cứu tính chất vật liệu

Hình thái của vật liệu đƣợc nghiên cứu trên hệ hiển vi điện tử truyền qua

TEM, hiển vi điện tử quét (SEM). Cấu trúc của vật liệu đƣợc khảo sát bằng hệ đo

nhiễu xạ tia X (XRD). Tính chất quang của vật liệu đƣợc nghiên cứu thông qua các

phép đo hấp thụ quang học vùng tử ngoại khả kiến (UV-vis), tán xạ Raman.

Phương pháp tính toán lý thuyết

Phƣơng pháp tính toán lý thuyết đƣợc sử dụng trong luận án là phƣơng pháp

sử dụng lý thuyết hàm mật độ (DFT – Density Functional Theory). Các phép tính

đều sử dụng phƣơng pháp tính toán gần đúng dựa trên hàm mật độ định xứ (LDA-

56

Localized Density Approximation).

CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU NANO PbS, NANO VÀNG VÀ NANO ĐA CHỨC NĂNG Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag

Chƣơng 3 trình bày về kết quả chế tạo và nghiên cứu tính chất của các hạt

nano, bao gồm:

i) Kết quả nghiên cứu tính chất của các hạt nano PbS đƣợc chế tạo bằng

phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp ủ laser

ii) Kết quả nghiên cứu tính chất của các hạt nano vàng chế tạo bằng phƣơng

pháp nuôi mầm.

iii) Kết quả nghiên cứu tính chất các hạt nano đa chức năng theo các bƣớc:

a) Tính chất các hạt nano từ tính Fe3O4.

- lên bề mặt các hạt nano Fe3O4.

b) Sự hấp phụ của các ion AuCl4

c) Tính chất các hạt nano đa chức năng Fe3O4@Au và Fe3O4@Ag.

3.1. VẬT LIỆU NANO PbS

Hình 3.1 là ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (A), hiển vi điện tửtruyền

qua phân giải cao (HRTEM) (B) và ảnh nhiễu xạ điện tử (C) của mẫu chứa các hạt

nano PbS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp hóa siêu âm.

Hình 3.1. Ảnh TEM (A) và HRTEM (B) và giản đồ nhiễu xạ điện tử (C) của mẫu các hạt nano PbS được chế tạo bằng phương pháp hóa siêu âm.

Sản phẩm hình thành có hai dạng chính: các hạt nano dạng lập phƣơng, dạng

cầu hoặc bát giác và các thanh nano PbS. Kích thƣớc các hạt nano PbS nhỏ và khá

đồng đều (~ 23 nm); trong khi đó các thanh có bề ngang bằng kích thƣớc các hạt và tỉ

57

số chiều dài / rộng từ 4 đến 5. Kết quả HRTEM cho thấy các hạt nano PbS có kích

thƣớc 23 nm không phải là đơn tinh thể mà là sản phẩm của sự kết đám nhiều tinh

thể PbS rất nhỏ hơn.

Giản đồ nhiễu xạ điện tử (hình 3C) bao gồm các vòng tròn đồng tâm ứng với

nhiễu xạ của chùm tia điện từ trên vật liệu đa tinh thể. Bán kính của các vòng tròn

ứng nhiễu xạ điện tử trên các mặt tinh thể (111), (200), (220), (311) và (222) đặc

trƣng của tinh thể lập phƣơng tâm mặt FCC – nhƣ đánh dấu trong hình. Từ đây, giá

trị của hằng số mạng đƣợc tính toán a 5,98 Ǻ, gần với giá trị công bố của hằng số

mạng tinh thể PbS (JCPDS No 05-0592).

Nhƣ vậy, có thể giả thuyết các hạt nano tinh thể PbS nhỏ đƣợc hình thành

ngay trong giai đoạn đầu của quá trình hóa siêu âm. Sau đó, do tác dụng của áp suất

và nhiệt độ lớn, các hạt có xu thế kết tụ lại với nhau để thành kích thƣớc lớn hơn.

Hiện tƣợng hình thành thanh nano PbS có thể do sự có mặt của chất hoạt hóa bề mặt

với đuôi alkali dài là SDS. Cơ chế của quá trình phát triển thành thanh dài của PbS

chƣa đƣợc giải thích một cách rõ ràng.

Ủ nhiệt laser

Hình 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình ủ nhiệt laser đến phổ tán xạ Raman của mẫu bột chứa các hạt nano PbS.

58

Tác dụng nhiệt của laser lên vật liệu đã đƣợc nghiên cứu sử dụng ngay từ khi

laser đầu tiên ra đời. Ứng dụng này ban đầu đƣợc tập trung nghiên cứu trên vật liệu

năng lƣợng – vật liệu có trữ năng lƣợng hóa học, nhằm phục vụ cho các ứng dụng

kích nổ từ xa cho các ngành công nghiệp khai khoáng hoặc khảo sát địa chất. Cùng

với sự phát triển của các vật liệu năng lƣợng mới, công nghệ phát nhiệt bằng laser

vẫn đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu khai thác [6]. Khi năng lƣợng của chùm laser đủ

mạnh, thậm chí laser có thể phá hủy vật liệu. Tuy nhiên, khi hạ năng lƣợng của chùm

laser xuống, hoặc hƣớng chuyển sang sử dụng laser xung, thì laser còn có thể đƣợc

dùng để làm hoàn thiện tinh thể vật liệu [79] hoặc tiêm vật liệu [77].

Năng lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thụ từ chùm laser một phần chuyển thành

nhiệt và làm tăng nhiệt độ của vật liệu, thậm chí có thể lên tới nhiệt độ nóng chảy

[79]. Cƣờng độ laser giảm theo hàm mũ khi đi vào vật liệu. Tại các bƣớc sóng ánh

sáng vật liệu hấp thụ tốt – hệ số suy hao (absorption coefficient) lớn – cƣờng độ ánh

sáng giảm nhanh khi đi vào trong vật liệu. Khi này, phân bố nhiệt độ theo chiều sâu

của mẫu không đồng đều; dẫn đến sự không đồng đều của các quá trình nhiệt.

Kết quả đo Raman đƣợc trình bày trong hình 3.2. Trong dải từ 100 cm-1 đến 250 cm-1 chỉ xuất hiện một đỉnh tán xạ tại 133 cm-1. Để tìm ra thời gian ủ nhiệt phù

hợp, quá trình chiếu laser lên mẫu và đo Raman đƣợc chia thành các bƣớc nhỏ. Ở

mỗi bƣớc, mẫu đƣợc chiếu laser trong thời gian 30s, sau đó nghỉ 15 phút để mẫu

nguội, rồi tiến hành đo Raman. Các bƣớc “chiếu laser và đo Raman” (ủ nhiệt ngắn

30s bằng laser) nhƣ vậy đƣợc lặp lại cho đến khi cƣờng độ phổ tán xạ Raman của

mẫu không thay đổi.

Từ hình 3.2 có thể nhận thấy, cứ sau một lần ủ nhiệt ngắn bằng laser (kéo dài 30s), cƣờng độ tán xạ Raman tại đỉnh 133 cm-1 tăng lên, kèm theo đó là độ rộng của

vạch phổ cũng thu hẹp lại. Nhƣ phân tích ảnh hiển vi điện tử truyền qua phân giải

cao trong hình 3.1, mẫu PbS có dạng lập phƣơng hoặc thanh là tập hợp của các tinh

thể PbS rất nhỏ, giữa các tinh thể vẫn còn các phần biên chƣa kết tinh. Khi ủ nhiệt

59

bằng laser, tinh thể PbS hoàn thiện hơn, dẫn tới sự tăng cƣờng độ đỉnh và giảm độ rộng phổ tại đỉnh tán xạ 133 cm-1.

Nghiên cứu của Smith cho thấy phổ tán xạ Raman của vật liệu khối PbS xuất hiện các đỉnh tại 104 cm-1, 204 cm-1 và 454 cm-1 [112]. Trong khi đó, các nghiên cứu

của nhóm nghiên cứu của Cao [10] và của Zhao [139] cho thấy khi vật liệu PbS có kích thƣớc nano thì phổ tán xạ Raman có các đỉnh tại 135 cm-1, 174 cm-1 và 433 cm-1 - với đỉnh tán xạ có cƣờng độ cao nhất tại 135 cm-1. Khi đo tán xạ Raman của mẫu

PbS, cƣờng độ của chùm laser tới mẫu đƣợc giảm xuống để tránh hiện tƣợng cháy mẫu, dẫn tới chỉ xuất hiện một đỉnh có cƣờng độ cao nhất tại 133 cm-1 (hình 3.2).

Sau 5 lần ủ nhiệt ngắn 30s bằng laser, vẫn chỉ thấy xuất hiện đỉnh tán xạ tại xung quanh 133 cm-1, chứng tỏ mẫu chứa các hạt PbS, mặc dù đã kết tinh tốt hơn, nhƣng

vẫn có cấu trúc nano. Đỉnh tán xạ này đƣợc gán với sự kết hợp của hai dao động âm

ngang (transverse aucostic – TA) và quang ngang (transverse optic - TO) của tinh thể

PbS.

Sau 5 lần ủ nhiệt ngắn bằng laser, cƣờng độ đỉnh tán xạ và độ rộng phổ tại 133 cm-1 hầu nhƣ không thay đổi, chứng tỏ quá trình kết tinh của các hạt PbS đã

hoàn thành. Hay nói cách khác, nếu ta kéo dài thời gian chiếu xạ laser tới mẫu lên tới

3 phút, thì mẫu sẽ kết tinh hoàn toàn. Từ đây, quy trình ủ nhiệt laser đƣợc tiến hành

nhƣ sau: để vật kính của hệ Raman ở chế độ Macro, dùng chế độ quét để quét bàn

mẫu, tại mỗi vị trí quét dừng lại 3 phút với tổng số điểm quét là 100 điểm.

Hình 3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt nano PbS trước (a) và sau khi (b) ủ nhiệt laser.

60

Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa hạt trƣớc và sau khi ủ nhiệt laser đƣợc

đo đạc và biểu diễn trong hình 3.3. Ở cả hai giản đồ nhiễu xạ của mẫu PbS trƣớc và

sau khi ủ nhiệt, đều thấy xuất hiện các đỉnh tán xạ đặc trƣng ứng với các mặt (111),

(200), (220), (311) và (222) của tinh thể PbS. Hằng số mạng của hai mẫu đƣợc tính

dựa theo định luật tán xạ Bragg. Kích thƣớc tinh thể đƣợc tính toán theo biểu thức

Debye-Scherrer từ đỉnh tán xạ tại (200) - do đỉnh này nằm độc lập so với các đỉnh

khác. Kết quả tính toán hằng số mạng và kích thƣớc tinh thể đƣợc thống kê trong

bảng 3.1.

Từ bảng 3.1 ta có thể thấy trƣớc khi chiếu laser, kích thƣớc tinh thể PbS trong

mẫu chứa hạt là 2,8 nm (sai số 5%). Sau khi ủ nhiệt, kích thƣớc tinh thể tăng lên 3,8

nm.

Bảng 3.1. So sánh giá trị hằng số mạng và kích thước tinh thể tính toán từ giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt PbS trước và sau khi ủ nhiệt laser

Sai số Sai số Hằng số mạng (Å) Kích thƣớc tinh thể (nm)

5,98(4) <1% 2,8 5%

5,96(3) <1% 3,8 1% Trƣớc khi ủ nhiệt laser Sau khi ủ nhiệt laser

Nhƣ vậy, ban đầu các tinh thể PbS chỉ có kích thƣớc nhỏ (2-3 nm) đƣợc bao

bọc bởi một lớp biên vô định hình. Sau khi ủ nhiệt laser, các biên hạt này kết tinh

hoàn toàn, để tạo thành các hạt tinh thể có kích thƣớc 3-4 nm. Hằng số mạng của các

tinh thể PbS cũng đƣợc tính toán từ giản đồ nhiễu xạ tia X. Hằng số mạng tính toán

đƣợc của mẫu PbS trƣớc và sau khi ủ nhiệt lần lƣợt là 5,984 Å và 5,963 Å; đều lớn

hơn hằng số mạng của vật liệu khối (a = 5,936 Å, JCPDS No 05-0592). Theo Qi, khi

kích thƣớc tinh thể của vật liệu giảm, ứng suất bề mặt của vật liệu tăng lên do diện

tích bề mặt của vật liệu tăng [103]; dẫn đến, năng lƣợng tƣơng tác giữa các ion trong

tinh thể giảm đi; khoảng cách giữa các ion tăng lên. Hệ quả là hằng số mạng tinh thể

tăng khi kích thƣớc tinh thể giảm. Kết quả tính toán hằng số mạng của mẫu chứa các

61

hạt PbS từ giản đồ nhiễu xạ tia X trong luận án này phù hợp với nguyên lý trên.

Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến của mẫu chứa các hạt nano PbS

trong khoảng từ 260 nm đến 900 nm giốngnhƣ phổ hấp thụ của dung dịch chứa các

hạt nano PbS có dạng lập phƣơng đƣợc công bố bởi nhóm của Cao (hình 3.4 - hình

trong) [10]. Vật liệu PbS là vật liệu bán dẫn có vùng cấm thẳng, vì vậy sự phụ thuộc

của cƣờng độ hấp thụ vào năng lƣợng ánh sáng tới tuân theo công thức

, trong đó E và Eg lần lƣợt là năng lƣợng của ánh sáng tới và độ rộng

vùng cấm, α là hệ số hấp thụ và A là hằng số tỉ lệ. Hình 3.4 vẽ sự phụ thuộc của

vào năng lƣợng của ánh sáng tới - trong đó h là hằng số Planck, c là vận

tốc ánh sáng trong chân không và λ là bƣớc sóng ánh sáng tới. Tại xung quanh giá trị

phụ thuộc tuyến tính vào . Eg, ta có

Trong một số nghiên cứu, đƣờng khớp tuyến tính đƣợc vẽ trong khoảng năng

lƣợng photon lớn hơn 4,2 eV nên độ rộng vùng cấm khá lớn; trong khoảng từ 4,57

eV đến 5,04 eV [89]. Tuy nhiên, trên đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của vào

, bên cạnh đoạn tuyến tính ứng với giá trị năng lƣợng photon lớn hơn 4,2 eV,

trong khoảng ứng với năng lƣợng photon từ 3,6 eV đến 4,2 eV, giá trị cũng

phụ thuộc tuyến tính vào . Từ khoảng này có thể tính ra đƣợc độ rộng vùng cấm

của vật liệu là 3,12 ± 0,02 eV. Giá trị này phù hợp với giá trị đƣợc công bố bởi nhóm

Mamiyev [76]; lớn hơn rất nhiều so với độ rộng vùng cấm của vật liệu khối (0,41

eV). Kết quả này đƣợc giải thích bởi vật liệu PbS có bán kính tƣơng tác Bohr lớn và

62

khối lƣợng điện tử hiệu dụng nhỏ.

Hình 3.4. Tính toán độ rộng vùng cấm của các hạt nano PbS được chế tạo bằng phương pháp hóa siêu âm từ phổ hấp thụ quang học. Hình trong: phổ hấp thụ quang học đo trên hệ UV245, Shimadzu của mẫu dung dịch chứa các hạt nano PbS.

3.2. VẬT LIỆU NANO VÀNG

Các hạt nano vàng ngay sau khi chế tạo có kích thƣớc trung bình 4 nm. Sau

khi lọc sạch, để phân tán trong môi trƣờng nƣớc cất, các hạt này có xu thế tiến lại

gần và kết tụ với nhau để tạo thành các hạt có kích thƣớc to hơn. Quá trình này còn

đƣợc gọi là quá trình phát triển hạt Oswald (Oswald ripening) [13]. Tốc độ quá trình

phát triển này phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trƣờng, nồng độ chất tham gia phản

ứng và nồng độ hạt nano có trong dung dịch [73]. Khi sử dụng thêm chất hoạt hóa bề

mặt, tốc độphát triển Oswald đƣợc cho là giảm xuống. Ở đây, các chất hoạt hóa bề

mặt tạo thành một lớp vỏ bao bọc xung quanh bề mặt của vật liệu, vì vậy hạn chế quá

trình tiếp xúc đồng chất giữa các hạt nano vật liệu với nhau; hệ quả là hệ số khuếch

tán trong công thức của Lyfshitz cũng giảm xuống đáng kể. Nói cách khác, khi nồng

độ chất bề mặt tăng thì làm cho các hạt nano Au trong dụng dịch ít bị phát triển thành

63

kích thƣớc lớn hơn, giúp chúng ổn định hơn. Một số chất hoạt động bề mặt còn có

thể phản ứng với bề mặt hạt nano Au (nhƣ gốc thiol), kết quả tạo ra liên kết Au-S

khá bền vững. Liên kết này làm cho thế năng bề mặt của vật liệu giảm đi rất nhiều, vì

vậy có thể tồn tại ở trạng thái khá bền ở kích thƣớc nhỏ [46].

Hình 3.5 là ảnh hiển vi điện tử truyền qua của các hạt nano vàng ngay sau khi

chế tạo (A), sau khi đƣợc ngâm trong 75 mM CTAB trong thời gian 6 tháng (B) và

phân bố kích thƣớc hạt trong hai trƣờng hợp trên (C). Phân bố kích thƣớc hạt đều có

dạng log-normal – nghĩa là tần suất xuất hiện hạt có kích thƣớc D phụ thuộc vào D

theo dạng hàm , trong đó σ và μ là phƣơng sai và số trung

vị của phân bố. Kích thƣớc hạt trung bình theo hàm phân bố . Theo đó ta

nhận đƣợc, kích thƣớc trung bình của các hạt nano vàng ngay sau khi chế tạo và sau

khi ngâm trong CTAB 4 tháng lần lƣợt là 4,2 ± 0,5 (12%) nm và 23,6 ± 1,2 (3%) nm.

Sai số tỉ đối của kích thƣớc hạt của mẫu chứa các hạt nano vàng ngay sau khi chế tạo

lớn hơn nhiều so với sau khi ngâm trong CTAB 4 tháng, thể hiện các hạt sau khi

64

ngâm trong CTAB 4 tháng có kích thƣớc đồng đều hơn.

Hình 3.5. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt nano Au. Hình A: ảnh TEM của các hạt ngay sau khi chế tạo. Hình B: ảnh TEM của các hạt sau khi ngâm trong 70 mM CTAB 4 tháng. Hình C: phổ phân bố kích thước hạt của hai trường hợp trên.

Các phân tử CTAB phân ly trong dung dịch thành các ion dƣơng Ctyltrimethyl ammonium (CTA+) và Br-. Các ion CTA+ có một đầu mang điện tích

dƣơng là gốc amin cấp III – cả 3 nguyên tử H trong NH3 bị thay thế bằng các cụm

CH3, sẽ liên kết với bề mặt các hạt nano vàng bằng liên kết tĩnh điện – do điện tích bề mặt của các hạt nano vàng là âm [123]. Đầu còn lại của ion CTA+ là một chuỗi dài

phân tử hữu cơ (C16), vì vậy chúng chỉ có thể tạo liên kết kị nƣớc với các đuôi hữu cơ C16 của các ion CTA+ khác tạo thành một “gói” để bao bọc các hạt nano vàng lại. Chính cấu trúc “gói” này hạn chế quá trình khuếch tán của các hạt Au với nhau; đồng

thời làm cho các hạt sau khi phát triển có kích thƣớc đều hơn.

Để khảo sát kỹ hơn quá trình phát triển của các hạt nano Au trong dung dịch

chứa các chất hoạt hóa bề mặt, kích thƣớc của các hạt nano đƣợc đo gián tiếp thông

65

qua phổ hấp thụ UV-vis tại các điểm thời gian khác nhau. Trong quá trình này,

không đƣợc quyền làm sạch hạt bằng phƣơng pháp quay ly tâm; bởi khi quay li tâm,

các hạt có kích thƣớc lớn thƣờng đƣợc thu thập dễ hơn. Không chỉ vậy, sau khi lọc

sạch, các hạt lại phân tán vào trong dung môi có nồng độ chất hoạt hóa ngày càng

thấp, dẫn tới quá trình phát triển hạt đƣợc thúc đẩy; hệ quả là kích thƣớc đo đƣợc

không còn chuẩn xác nữa.

Hình 3.6 là kết quả đo hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano vàng trong

môi trƣờng có chứa 70 mM CTAB theo thời gian. Có thể thấy, sau 1h đƣa hạt vào

trong môi trƣờng nồng độ CTAB 70 mM vị trí đỉnh phổ hấp thụ dịch đến 517 ± 2

nm, ứng với đó là các hạt nano có kích thƣớc 9,4 ± 4,1 nm. Vị trí của đỉnh hấp thụ

tăng lên theo thời gian lƣu mẫu, lần lƣợt đạt 519 nm sau 4h, 520 nm sau 24h, 521 nm

sau 120h ( 5 ngày), 523 nm sau 720 h (30 ngày).

Hình 3.6. Phổ hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano vàng ngâm trong 70 mM CTAB, được đo ở các thời gian sau khi ngâm khác nhau lần lượt từ 1h đến 720h.

Lý thuyết Mie đƣợc sử dụng để tính toán dạng phổ hấp thụ, vị trí đỉnh hấp thụ

quang học của dung dịch chứa các hạt nano kim loại quý. Hằng số hấp thụ của dung

66

dịch chứa các hạt nano kim loại có kích thƣớc nhỏ hơn 200 nm phụ thuộc vào nồng

độ hạt, hằng số điện môi của dung môi và hằng số điện của vật liệu kim loại tạo ra

hạt:

(3.1)

Trong đó C là nồng độ hạt có trong dung dịch; εm, εr, εi lần lƣợt là hằng số điện

môi của dung môi, phần thực và phần ảo hằng số điện môi của vật liệu kim loại tạo

ra hạt. λ0 là hằng số có đơn vị độ dài.

Theo Drude, nếu chúng ta coi các electron trên bề mặt kim loại là chuyển

động tự do, thì hệ số điện môi ở dạng khối của kim loại đó phụ thuộc vào nồng độ

hạt tải - ở đây là electron và số sóng của ánh sáng tới theo công thức sau:

(3.2)

Trong đó γ là hệ số dập tắt (damping constant) và ωP là tần số plasmon của vật

liệu. Tần số plasmon phụ thuộc vào nồng độ n, khố lƣợng hiệu dụng meff của hạt tải

theo công thức .

Nhƣ vậy, theo công thức trên thì vị trí đỉnh hấp thụ không phụ thuộc vào kích

thƣớc của hạt. Tuy nhiên, khi hạt đạt tới kích thƣớc nano, chỉ có một mod cộng

hƣởng hoạt động - thì hệ số dập tắt tỉ lệ nghịch với kích thƣớc của hạttheo công thức

. Trong đó D là đƣờng kính hạt, là vận tốc Fermi. Công thức này

chỉ đúng khi các hạt nano có kích thƣớc nhỏ hơn 20 nm.

Từ công thức của phổ hấp thụ 3.1, có thể nhận ra đƣợc cƣờng độ hấp thụ đạt

cực đại - ứng với vị trí đỉnh hấp thụ, có tần số thỏa mãn điều kiện . Thay

hệ số dập tắt vào công thức 3.2 của hệ số điện môi vật liệu; từ đó ta có thể tính đƣợc

67

tần số của ánh sáng tại vị trí đỉnh hấp thụ.

(3.3)

(3.4)

Trong biểu thức trên là phụ thuộc trên bậc 2 của D-kích thƣớc hạt. Từ

đây,có thể làm gần đúng λmaxphụ thuộc tuyến tính vào kích thƣớc hạt D với hệ số

tuyến tính là kích thƣớc đủ nhỏ và λ0 là hằng số có đơn vị bƣớc sóng

thỏa mãn và c là vận tốc ánh sáng.

Hình 3.7. Sự phụ thuộc của vị trí đỉnh phổ hấp thụ UV-vis vào kích thước hạt nano Au. Hình vẽ là kết quả tổng hợp từ các tài liệu tham khảo và các kết quả đo được từ các hạt nano vàng đã được chế tạo với các công nghệ khác nhau để có kích thước khác nhau.

68

Đối với D>25 nm, nhóm của Haiss [38] đã đƣa ra sự phụ thuộc của bƣớc sóng

tại đỉnh hấp thụ vào kích thƣớc hạt nano vàng là một hàm mũ. Công thức này là một

công thức thực nghiệm có dạng: với λ0, L1, L2 là các hằng số thực

nghiệm. Ở đây, ta có thể sử dụng các công thức này một lần nữa thông qua việc kết

hợp giữa kết quả đo đƣợc với các kết quả đã công bố trƣớc đó; vừa để kiểm tra chéo

độ chính xác của phép đo UV-vis trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Trung tâm

Khoa học Vật liệu, vừa có thể xây dựng lại hệ dữ liệu để có thể tính toán đƣợc kích

thƣớc hạt dựa vào phổ hấp thụ UV-vis. Hình 3.7 biểu diễn sự phụ thuộc của bƣớc

sóng cộng hƣởng – đỉnh hấp thụ (λmax) vào kích thƣớc hạt nano vàng đo đƣợc bằng

kính hiển vi điện tử truyền qua – kết quả lấy từ các công bố [45,54,66,71,143] và các

dữ liệu đƣợc công bố trên trang web thƣơng mại của Sigma Aldrich.

Hình 3.8 là kết quả tính toán thể tích của các hạt nano Au theo thời gian trong

môi trƣờng dung môi là CTAB có nồng độ 25 mM, 35 mM, 70 mM và CTAB có

nồng độ 25 mM bổ sung 100 mg/L PVP. Khi nồng độ CTAB thay đổi, sự phát triển

của kích thƣớc hạt nano vàng theo thời gian không thay đổi quá nhiều. Nhƣng khi bổ

sung thêm 500 mg PVP vào trong dung dịch thì tốc độ già hóa của các hạt nano vàng

tăng lên; không chỉ thế thể tích hạt nano Au cũng lớn hơn so với thể tích hạt Au khi

chỉ có CTAB. Có thể thấy, quá trình già hóa chia làm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu,

tốc độ phát triển kích thƣớc hạt rất nhanh, đạt đến ổn định sau 10h (hình 3.8– hình

nhỏ). Sau đó, trong giai đoạn sau kích thƣớc hạt phát triển chậm hơn rất nhiều, và chỉ

bắt đầu đạt ổn định sau 30 ngày ngâm trong dung dịch.

Khi các hạt nano Au có kích thƣớc lớn hơn 25 nm, sự phụ thuộc của vị trí

đỉnh hấp thụ vào kích thƣớc hạt tuân theo hàm mũ. Khi kích thƣớc hạt nano nhỏ hơn

25 nm, cũng nhƣ kết quả nhận đƣợc từ báo cáo của Haiss [38], vị trí các điểm thí

nghiệm nằm phía dƣới của đƣờng cong khớp - trong hình 3.7: đƣờng cong màu xanh

lục. Các điểm này nằm trên một đƣờng thẳng; phù hợp với phƣơng trình 3.4. Khớp

các điểm thực nghiệm với phƣơng trình 3.4- , nhận đƣợc các giá

trị tham số: λ0= 512,5 nm ± 0,26%, kAbs= 0,48 ± 4,17% (λ0, kAbslà các hằng số). Bên

69

cạnh đó, ở kích thƣớc tới hạn là 20 nm – khớp tuyến tính vẫn còn đúng – ta có thể

tính đƣợc bƣớc sóng hấp thụ của các hạt nano vàng là = 522,1 ± 2,7 nm. Nhƣ

vậy, khi giá trị của bƣớc sóng tại đỉnh phổ hấp thụ nhỏ hơn 525 nm, kích thƣớc của

hạt nano vàng có thể đƣợc tính toán dựa vào công thức:

Sau giai đoạn hạt phát triển, nếu nồng độ các hạt đủ lớn, các hạt có xu thế tiến

lại gần nhau và kết tụ để có kích thƣớc lớn hơn. Giai đoạn này còn đƣợc biết đến là

giai đoạn phát triển Oswald. Theo Harada [39], quá trình phát triển của kích thƣớc

hạt tuân theo công thức . Trong đó t0 là thời điểm bắt đầu

giai đoạn, K là hằng số phản ứng, x là hằng số phụ thuộc vào quá trình nằm trong

khoảng từ 1 đến 3. Quá trình phát triển Oswald ứng với x =3, và x=1 ứng với quá trình phát triển do phản ứng. Nhƣ vậy, nếu ta vẽ đồ thị sự phụ thuộc của D3 vào thời

gian t, ta sẽ nhận đƣợc đồ thị phụ thuộc tuyến tính và hệ số tuyến tính chính là K, là

đại lƣợng đặc trƣng cho quá trình khuếch tán bề mặt.

Hình 3.8. Sự phụ thuộc của kích thước hạt nano Au theo thời gian khi được ngâm trong các môi trường dung môi khác nhau. Kích thước hạt được tính toán từ lý thuyết Mie.

70

Khớp tuyến tính kết quả đo đƣợc (hình 3.8), giá trịKnhận đƣợc đối với mẫu

chứa các nano vàng ngâm trong CTAB tăng không đáng kể khi nồng độ CTAB tăng và đạt khoảng 10,5 ± 1,0 (h-1). Khi cho thêm PVP, giá trị K là 14,0 ± 0,9 (h-1). Nhƣ

vậy, do sự có mặt của PVP, tốc độ phát triển Oswald của các hạt nano vàng tăng lên.

Điều này có thể do PVP là dạng polymer phân cực tốt (tan tốt trong nƣớc), tạo ra các

khung để tụ tập các hạt nano kim loại lại. Trong khung này, các hạt có xu thế tiến lại

gần nhau dễ hơn vì vậy tốc độ phát triểncủa hạt tăng lên.

Quá trình phát triển Oswald không những có thể dùng để nghiên cứu chế tạo

cũng nhƣ hỗ trợ ổn định bề mặt hạt nano kim loại; mà còn có thể ứng dụng trong việc

bọc kim loại xung quanh bề mặt các hạt từ. Cụ thể, sau khi khử ion kim loại để tạo ra

một lớp kim loại bên ngoài các hạt nano từ, ta có thể tiếp tục ngâm chúng trong môi

trƣờng phản ứng để lớp kim loại bên ngoài tiếp tục phát triển thêm, để tạo thành lớp

vỏ bao bọc xung quanh các hạt nano từ. Tốc độ phát triển kích thƣớc hạt cũng có thể

tăng lên bằng cách tăng nhiệt độ, áp suất ở điều kiện thủy nhiệt. Quá trình này giúp

cho việc kết hợp các hạt nano kích thƣớc nhỏ thành các hạt nano có kích thƣớc lớn

hơn trong thời gian ngắn hơn nhƣng vẫn cho kích thƣớc đều và hình dạng giống nhau

[109]. Không chỉ vậy, ta cũng có thể thay đổi chất hoạt hóa bề mặt CTAB thành một

chất hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trị với bề mặt hạt nano kim loại, làm

hãm quá trình phát triển của hạt; từ đó có thể điều khiển kích thƣớc hạt nano kim loại

71

trong dung dịch.

3.3. VẬT LIỆU NANO ĐA CHỨC NĂNG Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag

3.3.1. Vật liệu nano từ tính Fe3O4

Hình 3.9. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4 được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa.

Hình 3.9 mô tả kết quả đo nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nano

Fe3O4 đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa. Có thể thấy các đỉnh nhiễu xạ xuất hiện tại các vị trí 30,1o, 35,6o, 43,3o, 57,0o và 62,7o lần lƣợt ứng với các góc

phản xạ từ các mặt (200), (311), (400), (511) và (440) của mạng spinnel Fe3O4. Từ

các thông số này có thể tính toán hằng số mạng của tinh thể thông qua công thức

Bragg; nhận đƣợc hằng số mạng của các hạt Fe3O4 là 8,38 ± 0,04Å. Kết quả này rất

phù hợp với công bố chuẩn JCPDS #75-0033. Tỉ lệ cƣờng độ các đỉnh khá phù hợp

với tỉ lệ cƣờng độ chuẩn (JCPDS #75-0033); vì vậy có thể kết luận các tinh thể nano

Fe3O4 phát triển đẳng hƣớng; nói cách khác là có thể có dạng cầu. Sử dụng công thức

Debye-Scherrer để tính toán kích thƣớc tinh thể, ta nhận đƣợc kích thƣớc trung bình

72

của các hạt Fe3O4 là 10,6 ± 0,3 nm

Hình 3.10. Ảnh TEM và HRTEM của mẫu các hạt Fe3O4 làm bằng phương pháp

đồng kết tủa.

Ảnh TEM (hình 3.10) cho thấy kích thƣớc trung bình của các hạt nano Fe3O4

cũng nằm trong khoảng 8-12 nm. Kết hợp với kết quả tính toán kích thƣớc tinh thể từ

giản đồ nhiễu xạ tia X, có thể giả thiết các hạt nano Fe3O4 ở kích thƣớc đủ nhỏ này

đều tồn tại ở dạng đơn tinh thể. Điều này đƣợc kiểm nghiệm thông qua ảnh hiển vi

điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM). Nhận thấy, tất cả các hạt nano Fe3O4

hình thành đều ở dạng đơn tinh thể.Hay nói cách khác, trong quá trình phản ứng tạo

thành từ phƣơng pháp đồng kết tủa, các hạt nano Fe3O4 hình thành từ các tâm phản

ứng độc lập và lớn đến kích thƣớc 10 nm. Tại đây, do sự hạn chế phát triển của các

chất hoạt hóa bề mặt, kích thƣớc của các hạt dừng lại và ổn định

Hình 3.11 là kết quả đo từ tính của mẫu bột chứa các hạt nano Fe3O4. Từ

trƣờng ngoài đặt lên mẫu thay đổi từ -12 kOe đến 12 kOe. Đƣờng cong từ trễ của

mẫu là đƣờng thuận nghịch, đi qua gốc tọa độ và thể hiện các hạt Fe3O4 có tính chất

của vật liệu siêu thuận từ. Khi nhiệt độ của mẫu đủ lớn (T>10Tb, trong đó Tb là nhiệt

độ tới hạn – blocking temperature), thì đƣờng từ trễ của vật liệu siêu thuận từ tuân

theo hàm Lagevin [69,96]; có dạng nhƣ sau:

73

(3.5)

Trong đó m, Ms là từ độ và từ độ bão hòa đo đƣợc của mẫu, đơn vị là emu/g; μ

là mô men từ của một hạt nano Fe3O4, kB là hằng số Boltzmann và T và H là nhiệt độ

đo và từ trƣờng đặt lên mẫu.

Hình 3.11. Đường cong từ trễ của mẫu bột chứa các hạt nano Fe3O4 được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa.

Khớp hàm Lagenvin với số liệu thực nghiệm (chƣơng trình sử dụng là Gnuplot) ta nhận đƣợc các giá trị của Ms = 67,1 ± 1,1 emu/g và μ = 1,57 ± 0,05 ×10- 18 g. Từ đây có thể tính đƣợc kích thƣớc trung bình của một hạt nano Fe3O4 khoảng

8,3 nm. Kich thƣớc này nhỏ hơn so với kích thƣớc tính toán từ công thức Debye-

Scherrer và từ ảnh hiển vi điện tử truyền qua. Các tài liệu tham khảo đều cho thấy,

phƣơng pháp tính toán kích thƣớc hạt từ phép đo từ thƣờng cho kết quả nhỏ hơn so

với kích thƣớc thực của các hạt nano từ. Điều này đƣợc giải thích bởi một lớp “bất

hoạt từ” xuất hiện ở vỏ ngoài hạt trong phép đo từ trễ; làm cho kích thƣớc hiệu dụng

của các hạt từ bị thu nhỏ đi [69].

- lên bề mặt các hạt Fe3O4

74

3.3.2. Vật liệu nano đa chức năng Fe3O4-Au Quá trình hấp phụ của các ion AuCl4

Hình 3.12. Đường I-V thế quét vòng của mẫu chứa 1 mM HAuCl4 tại pH 3.

Hình 3.12 là đồ thị I-V phép đo thể quét vòng của dung dịch chứa 1 mM

HAuCl4 tại pH 3. Có thể thấy xuất hiện một đỉnh ô xi hóa tại 1,27 V và một đỉnh khử

tại 0,8 V. Vị trí này đƣợc cho là đỉnh khử của ion thành theo phƣơng

. Thế điện hóa tại pH gần 0 của dung dịch chứa trình

HAuCl4 là 0,9 V [134]. Khi giá trị pH tăng đến 3 thì vị trí thế điện hóa giảm và đạt

0,8 V.

Dung dịch muối vàng – chloroaurate – có thể tồn tại trong dung dịch ở các

dạng phức với theo công thức với x = 0, 1, 2, 3 hoặc 4. Sự chuyển

hóa của các ion chloroaurate trong dung dịch ở các pH khác nhau tuân theo các

phƣơng trình sau [50,91]:

(3.6)

Khi pH tăng thì tỉ phần của muối phức có giá trị x lớn sẽ tăng lên. Từ các giá

75

trị hằng số cân bằng của các phƣơng trình kể trên và hằng số cân bằng của nƣớc (

), có thể tính đƣợc tỉ phần các ion có trong dung dịch tại các pH

khác nhau. Theo nhóm Ogata khi pH của dung dịch nhỏ hơn 3, trong dung dịch chỉ

có . Khi pH tăng đến giá trị 4 thì nồng độ của ion chỉ còn khoảng

0,4 lần so với gốc. Khi này trong dung dịch đã xuất hiện cả và

. Hàm lƣợng còn lại rất ít tại pH 5, chỉ 0,05 nồng độ gốc, và

tiến đến 0 tại pH lớn hơn 6. Tƣơng tự vậy, hàm lƣợng ion đạt cực đại

tại pH 4,5, sau đó giảm xuống; ứng với đó là sự xuất hiện và tăng dần lên của các ion

có pH cao hơn.

Điều này cũng thể hiện rất rõ ràng ở trong đƣờng I-V biểu diễn trong hình

3.13. Ban đầu tại pH 3, thế ô xi hóa của ion muối vàng tại 0,8 V. Khi pH tăng đến 4,

giá trị của đỉnh điện hóa gắn với phƣơng trình khử của ion cũng giảm nhẹ.

Cƣờng độ dòng điện tại vị trí này cũng giảm xuống,gần bằng 0,45 lần so với tại pH

3; chứng tỏ nồng độ giảm xuống còn 0,45 lần so với tại pH 3, phù hợp với

kết quả tính toán của Ogata. Bên cạnh đó, thấy sự xuất hiện của 2 đỉnh điện hóa mới

lần lƣợt tại 0,62 V và 0,45 V; đƣợc cho là thế điện hóa của và

. Giá trị pH tiếp tục tăng lên, ta lại thấy xuất hiện thêm đỉnh ô xi hóa

thứ 4, tại 0,31 V. Tại pH 8 thì chỉ còn lại đỉnh tại 0,31 V, chứng tỏ đây là đỉnh gắn

với quá trình ô xi hóa của . Giá trị thế điện hóa của ion vàng tại pH 8

cũng đƣợc các nhóm nghiên cứu nhận đƣợc và kết quả cũng rất gần với kết quả nhận

đƣợc trong báo cáo này [15,41]. Các phƣơng trình khử, vì vậy, có thể đƣợc viết

chung nhƣ sau:

76

(3.7)

Hình 3.13. Đường phụ thuộc I-V phép đo điện thế quét vòng giới hạn trên đường khử từ 0,1V đến 1,2 V của mẫu chứa dung dịch HAuCl4 1 mM ở các giá trị pH khác nhau.

Ở đây, là tổ hợp hai ion và với tổng số ion âm là 2.

Hay nói cách khác số electron đƣợc cung cấp cho các ion trong quá trình ô xi hóa

luôn là n = 2. Thay vào phƣơng trình Randles-Sevcik (xem phần 1.1), ta có dòng

điện hóa luôn tỉ lệ thuận với nồng độ của ion điện hóa:

với là nồng độ của ion chloroaurate . Theo Ogata [91], tỉ phần các

ion trong dung dịch tại 1 giá trị pH là không đổi, nên , với

Cx là hằng số tỉ lệ và C0 là tổng nồng độ ion chloroaurate. Thay vào phƣơng trình

dòng điện và lấy tích phân ta có: . Nhƣ vậy tổng điện

tích chuyển qua bề mặt điện cực (sau này gọi là tổng điện tích điện hóa Q) tỉ lệ thuận

với nồng độ của ion chất ô xi hóa. Hằng số tỉ lệ phụ thuộc tuyến tính vào diện tích

77

điện cực và bản chất các quá trình khử của ion. Từ đây, ta có thể tính tổng nồng độ

ion chloroaurate có trong dung dịch thông qua tổng số điện tích điện hóa Q. Điện tích

Q đƣợc tính toán bằng cách lấy tích phân của đòng điện hóa theo thời gian.

- có tổng nồng độ là 1 Hình 3.14. Tổng điện tích điện hóa trong quá trình ion Au(OH)xCl4-x mM bị khử tại các pH khác nhau (hình trái) và phần trăm lượng ion bị hấp phụ lên bề mặt hạt nano Fe3O4 sau khi ngâm trong thời gian 30 phút (hình phải).

Trƣớc khi các hạt nano Fe3O4 đƣợc ngâm trong dung dịch chứa ion

chloroaurate ở các pH khác nhau, tổng nồng độ của các ion chloroaurate

trong dung dịch là 1 mM.Tổng điện tích điện hóalà một hàm phụ

thuộc vào độ pH của dung dịch chứa các ion chloroaurate nhƣ biểu diễn trong hình

3.14 (hình trái). Tổng điện tích này giảm dần khi độ pH tăng lên ứng với lƣợng ion

chloroaurate đƣợc khử ít hơn. Có nhiều nguyên nhân có thể gây ra hiện tƣợng này;

có thể là do quá trình khuếch tán của các ion với các giá trị x lớn kém

hơn so với các giá trị x nhỏ.

Sau khi ngâm các hạt Fe3O4 vào trong dung dịch chứa muối vàng ở các pH

khác nhau, dùng nam châm để thu lại các hạt Fe3O4, phép đo thế quét vòng lại đƣợc

thực hiện một lần nữa để tính tổng lƣợng điện tích điện hóa. Điện tích này tỉ lệ thuận

với tổng nồng độ muối vàng còn lại trong dung dịch. Từ tỉ lệ phần tổng lƣợng điện

tích điện hóa trƣớc và sau khi ngâm Fe3O4, ta tính đƣợc tỉ phần muối vàng bị hấp phụ

trên bề mặt hạt Fe3O4. Có thể nhận thấy tỉ phần muối vàng hấp phụ trên bề mặt các

hạt nano Fe3O4 tăng lên khi pH tăng (hình 3.18 – hình phải). Điều này có thể giải

78

thích bởi khi pH tăng lên, số gốc xuất hiện nhiều hơn trong phức ,

tƣơng thích hơn với bề mặt của ô xít sắt Fe3O4, vì vậy nên có xu thế bị hấp phụ lên

trên bề mặt Fe3O4 nhiều hơn.

Vật liệu nano đa chức năng Fe3O4-Au

Hình 3.15. Ảnh TEM các hạt nano Fe3O4-Au dạng phức hợp được tạo thành từ việc khử dung dịch HAuCl4 bằng NaBH4 sau khi hạt Fe3O4 được ngâm trong dung dịch HAuCl4 ở pH 3.

Trong môi trƣờng có độ pH cao, các ion chuyển dần thành các ion

với giá trị của x trong khoảng từ 1 đến 4 và tăng dần khi độ pH dung

dịch tăng dần; dẫn tới các ion vàng hấp phụ tốt hơn lên bề mặt của các hạt Fe3O4.

Nhƣ vậy, sau khi ngâm các hạt Fe3O4 trong HAuCl4 với pH cao hơn rồi sử dụng chất

khử để khử các ion vàng để tạo ra nhiều Au bám với Fe3O4 hơn.

Sau khi ngâm các hạt nano Fe3O4 trong dung dịch chứa muối vàng trong thời

gian 30 phút, NaBH4 đƣợc sử dụng để khử muối HAuCl4 thành Au. Khi không điều

chỉnh pH (pH của dung dịch là 3), nhận thấy có rất ít các hạt nano vàng bám vào với

các hạt Fe3O4. Hình 3.15 chỉ ra, các hạt nano vàng có kích thƣớc từ 15 nm đến 20 nm

hình thành một cách độc lập với các hạt Fe3O4 có kích thƣớc nhỏ hơn – khoảng 5 nm

79

đến 15 nm. Mặc dù việc sử dụng còi siêu âm công suất lớn trong quá trình lọc rửa

mẫu, nhƣng các hạt nano Au vẫn bám khá chắc với các hạt Fe3O4 và dung dịch vẫn

có màu đỏ đặc trƣng của dung dịch chứa các hạt nano Au. Phổ hấp thụ của dung dịch

cũng cho đỉnh hấp thụ tại 540 nm.

Hình 3.16. Ảnh TEM các hạt nano Fe3O4trước và sau khi gắn với các hạt nano Au. Hình A: Ảnh TEM của các hạt nano từ trước khi gắn với các hạt nano Au.Hình B: các hạt nano Fe3O4 dạng phức hợp được tạo thành từ việc khử dung dịch HAuCl4 bằng NaBH4 sau khi ngâm các hạt Fe3O4 trong dung dịch 30 phút ở pH 8.

Khi nâng độ pH của dung dịch chứa HAuCl4 lên 8 rồi ngâm Fe3O4 trong thời

gian 30 phút trƣớc khi dùng NaBH4 để khử, kết quả cho thấy có nhiều hạt nano vàng

bám vào các hạt Fe3O4 hơn (hình 3.16).Trong hình 3.16B, các hạt nano Au có kích

thƣớc khá lớn – 25-35 nm, có màu đậm hơn chiếm đa phần trong mẫu. Bên cạnh các

hạt nano Au, vẫn còn có các hạt có màu nhạt hơn, kích thƣớc gần bằng với kích

thƣớc của các hạt Fe3O4 ở trong hình 3.16A. Đây là các hạt Fe3O4 chƣa đƣợc “đính”

với các hạt nano Au.

Tƣơng tự nhƣ phần trên, khi lọc rửa còi siêu âm đƣợc dùng để lọc các hóa

chất còn dƣ, các hạt nano Au vẫn tồn tại cùng với các hạt Fe3O4 sau khi đƣợc hút

bằng nam châm. Cơ chế các hạt Au bám vào bề mặt của các hạt Fe3O4 vẫn chƣa

đƣợc làm rõ, nhƣng có thể giả thiết là giữa các hạt Fe3O4 và Au có một lớp hydrôxít

vàng (Au(OH)3) kết nối chúng lại với nhau. Chính sự tƣơng thích giữa lớp hydrôxít

80

này với ô xít Fe3O4 và Au giúp cho liên kết giữa hai vật liệu chặt chẽ hơn.

Hình 3.17. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nanophức hợp Fe3O4-Au và của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4.

Hình 3.17 là giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4

và của mẫu chứa các hạt nano phức hợp Fe3O4-Au. So với giản đồ XRD của mẫu

chứa các hạt nano Fe3O4 – đã phân tích trong phần 3.3.1, thì trên giản đồ XRD của

mẫu chứa các hạt nano phức hợp Fe3O4-Au xuất hiện thêm 3 đỉnh tại các vị trí có góc nhiễu xạ 2θ bằng 38,2o, 44,3o và 64,6o ứng với các mặt phản xạ (111), (200) và (220)

của tinh thể vàng (JCPDS #04-0784). Kích thƣớc tinh thể của các hạt nano vàng đƣợc tính từ công thức Debye-Scherrer, áp dụng cho đỉnh tán xạ tại 38,4o và bằng

13,9 ± 0,4 nm. So sánh với ảnh TEM trong hình 3.20B, kích thƣớc tinh thể tính toán

từ giản đồ XRD có giá trị gần với các hạt Au có kích thƣớc nhỏ nhất. Điều này thể

hiện, các tinh thể vàng sau khi đƣợc khử chỉ tạm thời đính lên trên bề mặt của các hạt

nano Fe3O4. Trong đó, có một số hạt nano vàng có xu thế kết đám lại để thành các

81

hạt có kích thƣớc lớn hơn.

Hình 3.18. Phổ hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano vàng tại các thời điểm khác nhau sau khi đặt nam châm bên cạnh cuvette; (a) phổ hấp thụ của mẫu tại thời điểm ban đầu khi chưa đặt nam châm, (b), (c), (d), (e), (f) lần lượt là phổ hấp thụ lần lượt tại các thời điểm 3 phút, 5 phút, 10 phút, 20 phút và 35 phút sau khi đặt nam châm. Hình trong: biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ tại 540 nm vào thời gian.

Dung dịch chứa các hạt nano Fe3O4-Au có màu đỏ đặc trƣng của dung chứa

các hạt nano vàng. Khi sử dụng nam châm để hút (nam châm đất hiếm NdFeB có

kích thƣớc 100 × 50 × 10 mm, từ trƣờng lớn nhất trên bề mặt 1,5 T, lực kháng từ

10KOe, năng lƣợng từ ~64 MGOe), các hạt nano bị hút về phía của nam châm. Do

lƣợng hạt chế tạo không lớn, không đủ để thực hiện phép đo từ tính trên hệ từ kế mẫu

rung; vì vậy một thí nghiệm đơn giản để kiểm tra từ tính của hệ vật liệu, cũng đồng

thời hƣớng đến ứng dụng của vật liệu trong tách chiết y sinh đƣợc thực hiện. Cụ thể,

các hạt nano phức hợp Fe3O4-Au đƣợc phân tán đều trong dung dịch, đặt nam châm

vĩnh cửu bên cạnh và đo nồng độ của dung dịch theo thời gian thông qua sự giảm

cƣờng độ hấp thụ tại đỉnh 540 nm – đặc trƣng của các hạt nano vàng (hình 3.18). Các

khoảng thời gian đo lần lƣợt là 3 phút, 5 phút, 10 phút, 20 phút, 35 phút và 45 phút

sau khi đặt nam châm vĩnh cửu.

Các hạt nano vàng đính cùng với các hạt nano Fe3O4 tạo thành một thể phức

hợp; vì vậy, bên cạnh tính chất từ, chúng còn biểu hiện tính chất quang đặc trƣng của

82

dung dịch chứa các hạt nano vàng. Phổ hấp thụ quang học trong vùng khả kiến của

dung dịch chứa các hạt Fe3O4-Au xuất hiện đỉnh hấp thụ tại 540 nm – là đỉnh hấp thụ

plasmon của các hạt nano vàng (Hình 3.18). Khi đặt từ trƣờng ngoài, dƣới tác động

của lực từ, các hạt nano phức hợp Fe3O4-Au chuyển động về phía nam châm. Hệ quả

là nồng độ hạt trong dung dịch giảm dần theo thời gian. Theo định luật Lambert-

Beer, cƣờng độ hấp thụ của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Điều này

thể hiện rất rõ trong hình 3.18. Các phổ hấp thụ của dung dịch chứa các hạt nano

phức hợp Fe3O4-Au có cƣờng độ giảm dần theo thời gian. Khảo sát cƣờng độ hấp thụ

tại 540 nm. Ban đầu cƣờng độ hấp thụ là 1,98. Cƣờng độ hấp thụ còn 1,62 tại thời

gian 3 phút và giảm dần xuống 1,48, 1,03, 0,48, 0,25 và 0,13 lần lƣợt tại các thời

gian 5 phút, 10 phút, 20 phút, 35 phút và 45 phút sau khi đặt nam châm (hình 3.18 –

hình trong). Có thể thấy sau 30 phút lọc từ, trong dung dịch chỉ còn lại khoảng 10%

lƣợng hạt so với trƣớc khi lọc; hầu hết các hạt nano Fe3O4-Au đƣợc thu thập về phía

nam châm. Thời gian 30 phút này cũng là thời gian cần thiết cho các bƣớc thí nghiệm

tiếp theo, nhƣ tách lọc hạt từ sau khi chức năng hóa hay thu thập tế bào sau khi đã

đính các hạt từ lên trên.

Mặc dù đã thành công đính các hạt Au với các hạt Fe3O4, nhƣng có thể thấy

không phải tất cả các hạt nano Fe3O4 đều đƣợc gắn với các hạt Au (hình 3.15 và

3.16B). Điều này có thể do sự không tƣơng thích bề mặt giữa kim loại (Au) và ô xít

kim loại (Fe3O4). Nhiều nhóm nghiên cứu đã giải quyết điều này bằng cách tạo ra

thêm một lớp trung gian liên kết hai vật liệu [56,58,80]. Trong các phƣơng pháp đó,

các nano Au thƣờng đƣợc gắn với các hạt Fe3O4 thông qua 2 bƣớc: gắn các hạt mầm

Au lên lớp trung gian, sau đó nuôi thành các tinh thể lớn [56,80]. Nhóm nghiên cứu

của Chu Tiến Dũng, Trung tâm Khoa học Vật liệu đã cải tiến thành quy trình 1 bƣớc,

là cho hấp thụ các ion kim loại Bạc lên bề mặt các hạt Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bởi

APTES và khử trực tiếp [31]. Bên cạnh đó, thực tế đo đạc cho thấy, các hạt nano Ag

có hoạt tính Raman tốt hơn so với các hạt nano vàng; có thể do quá trình tăng cƣờng

bề mặt do trao đổi điện tích giữa các hạt nano vàng và các chất hữu cơ mạnh [92]. Vì

thế, trong nghiên cứu tiếp theo, nhằm cải thiện cấu trúc của các hạt nano từ tính –

83

kim loại cũng làm tăng hiệu quả đánh dấu bằng tán xạ Raman định hƣớng ứng dụng

tách chiết, chụp ảnh và đo nồng độ tế bào, chúng tôi nghiên cứu gắn các hạt Ag lên

các hạt Fe3O4.

3.3.3. Vật liệu nano đa chức năng Fe3O4-Ag Ảnh kính hiển vi điện từ truyền qua (Hình 3.19) cho thấy kích thƣớc của các

hạt Fe3O4-Ag lớn hơn khá nhiều so với các hạt Fe3O4. Ở chế độ trƣờng sáng, vật liệu

Ag tán xạ electron tốt, vì vậy trong ảnh TEM có màu đậm hơn so với các hạt Fe3O4.

Kích thƣớc của các hạt Fe3O4-Ag nằm trong dải từ 30 nm đến 80 nm.

Hình 3.19. So sánh kích thước các hạt nano Fe3O4 và Fe3O4-Ag. Hình A: Ảnh TEM của mẫu hạt Fe3O4. Hình B:Ảnh TEM của mẫu Fe3O4-Ag.

Hình 3.20 là giản đồ XRD của mẫu chứa các hạt Fe3O4 và Fe3O4-Ag.Bên cạnh

các đỉnh đặc trƣng cho cấu trúc spinnel đảo của Fe3O4, xuất hiện thêm các đỉnh tại các vị trí góc tán xạ 2θ là 38,1o, 43,6o và 64,5otrên giản đồ XRD của mẫu Fe3O4-Ag,

tƣơng ứng với các mặt phản xạ (111), (200) và (220) của tinh thể bạc. Trong các đỉnh kể trên, đỉnh ứng với góc tán xạ 38,1o của mặt (111) đứng khá độc lập so với các

đỉnh khác; vì vậy đƣợc sử dụng để tính toán kích thƣớc tinh thể nano Ag. Dựa vào

công thức Debye-Scherrer, kích thƣớc tinh thể của lớp Ag đƣợc tính bằng 18,5 ± 0,5

nm. Kích thƣớc này nhỏ hơn so với kích thƣớc hạt nhìn thấy trong ảnh hiển vi điện

84

tử truyền qua (hình 3.19B). Có thể giả thiết là các hạt nano Ag đƣợc bám dính lên bề

mặt của các hạt Fe3O4 sau khi đã chức năng hóa, sau đó kết tụ lại với nhau thành các

hạt nano có kích thƣớc lớn.

Hình 3.20. Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu chứa các hạt nano Fe3O4 và các hạt nano phức hợp Fe3O4-Ag.

Độ từ hóa trên một đơn vị khối lƣợng của mẫu Fe3O4-Ag cũng giảm đi đáng

kể so với mẫu chỉ chứa hạt Fe3O4. Hình 3.21 biểu diễn kết quả phép đo từ trễ trên hệ

từ kế mẫu rung của các mẫu chứa các hạt nano Fe3O4, các hạt Fe3O4 sau khi đƣợc

chức năng hóa bởi APTES (Fe3O4-APTES) và các hạt Fe3O4-Ag. Tất cả các đƣờng từ

trễ đều thuận nghịch, đối xứng qua gốc tọa độ thể hiện tính chất siêu thuận từ của các

vật liệu Fe3O4, Fe3O4-APTES và của Fe3O4-Ag. Sử dụng hàm Langevin (phƣơng

trình 3.1) để khớp các số liệu thực nghiệm, ta nhận đƣợc các giá trị từ độ bão hòa của

các mẫu. Từ độ báo hòa của các hạt nano Fe3O4-APTES và Fe3O4-Ag lần lƣợt là 53,0

85

± 1,1 emu/g và 39,3 ± 3,3 emu/g.

Hình 3.21. Đường cong từ trễ của mẫu bột chứa các hạt nano Fe3O4 (□), Fe3O4-APTES (○) và Fe3O4-Ag (∆). Các đường nét liền là các đường khớp hàm Langevin.

Từ độ bão hòa đo đƣợc của vật liệu trên các mẫu Fe3O4-APTES và Fe3O4-Ag

khá gần với kết quả đƣợc công bố của nhóm tác giả Chu Tiến Dũng [31]. Theo đó,

có thể nhận định các hạt nano từ tính đa chức năng có cấu trúc ba lớp: lớp lõi là các

hạt Fe3O4, lớp chuyển tiếp là một lớp mỏng SiO2 đƣợc hình thành từ quá trình thủy

phân các phân tử APTES và lớp ngoài cùng là lớp chứa các hạt nano Ag.

Tƣơng tự nhƣ trong phần 3.3.2, quá trình thu thập các hạt Fe3O4-Ag bằng nam

châm vĩnh cữu cũng đƣợc đo đạc thông qua phổ hấp thụ quang học tử ngoại khả kiến

(UV-vis).

Đầu tiên, đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ hấp thụ vào nồng

độ dung dịch chứa Fe3O4-Ag đƣợc xây dựng. Phổ hấp thụ của dung dịch chứa hạt

nano đa chức năng tại các nồng độ khác nhau lần lƣợt là 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30

ppm, 40 ppm, 50 ppm, 72 ppm và 150 ppm đƣợc đo trên hệ đo hấp thụ quang học

UV2450, Shimadzu. Các phổ hấp thụ đều có hình dạng giống nhau và có đỉnh hấp

86

thụ tại 376 nm, khá phù hợp với đỉnh hấp thụ plasmon đặc trƣng của các hạt nano

bạc (hình con trong hình 3.19). Vẽ sự phụ thuộc của cƣờng độ hấp thụ tại đỉnh 376

nm vào nồng độ hạt Fe3O4-Ag, ta nhận đƣợc hình 3.22.

Hình 3.22. Biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ vào nồng độ hạt đa chức năng Fe3O4-Ag.

Nhận thấy, cƣờng độ hấp thụ tại 376 nm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

hạt, phù hợp với định luật Lambert-Beer: , trong đó A, l, ε lần lƣợt là cƣờng

độ hấp thụ, độ dày của cuvette, hệ số dập tắt và C là nồng độ của hạt nano có trong

dung dịch. Khớp tuyến tính (A = a + b×C) các điểm đo đƣợc, ta nhận đƣợc b = εl =

0.015 ± 2% (1/ppm). Sử dụng giá trị này, ta có thể tính toán đƣợc nồng độ của dung

dịch chứa hạt sau khi đo đƣợc cƣờng độ hấp thụ tại 376 nm.

Trong bƣớc tiếp theo, 3 ml dung dịch chứa 50 ppm các hạt Fe3O4-Ag đƣợc đặt

bên cạnh nam châm vĩnh cửu. Cƣờng độ hấp thụ tại 376 nm đƣợc đo liên tục và đƣợc

ghi lại tại các điểm thời gian lần lƣợt là 1 phút, 3 phút, 7 phút, 10 phút, 13 phút, 21

phút, 30 phút, 33 phút và 38 phút. Từ cƣờng độ hấp thụ tại 376 nm, nồng độ của hạt

nano tại các thời gian kể trên đƣợc tính toán và đƣợc vẽ trên đồ thị phụ thuộc thời

87

gian nhƣ hình 3.23. Nhận thấy cần 20 phút để có thể thu thập hầu hết các hạt nano

Fe3O4-Ag. Thời gian này sẽ đƣợc sử dụng trong các thực nghiệm ứng dụng trình bày

trong chƣơng 4.

Hình 3.23. Sự giảm của nồng độ các hạt Fe3O4-Ag trong dung dịch khi sử dụng nam châm để hút.

Từ ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM (hình 3.16 và 3.19) có thể thấy các hạt

nano Fe3O4-Ag phân tán trong dung dịch tốt hơn so với các hạt nano Fe3O4-Au. Bên

cạnh đó, việc có thể chế tạo với lƣợng nhiếu hơn, thời gian thu thập bằng từ trƣờng

ngoài ngắn hơn của các hạt nano Fe3O4-Ag (20 phút) so với các hạt nano Fe3O4-Ag

(30 phút) cũng đóng vai trò rất quan trọng cho các bƣớc ứng dụng trong y sinh. Vì

thế, hạt Fe3O4-Ag đƣợc lựa chọn trong ứng dụng phân lập và đo đạc nồng độ tế bào.

KẾT LUẬN CHƢƠNG III

Trong chƣơng này, một số kết quả nghiên cứu chế tạo vật liệu nano đã đƣợc

trình bày; cụ thể nhƣ sau:

(1) Đã chế tạo đƣợc các hạt nano PbS bằng phƣơng pháp hóa siêu âm kết hợp

ủ nhiệt laser. Các hạt nano PbS có dạng lập phƣơng và dạng thanh với kích thƣớc

chiều ngang khoảng 23 nm, đƣợc cấu tạo từ các hạt đơn tinh thể nhỏ. Kích thƣớc của

các hạt đơn tinh thể nhỏ trƣớc khi ủ nhiệt là 2-3 nm và tăng lên 3-4 nm sau khi ủ

88

nhiệt laser.

(2) Đã chế tạo đƣợc các hạt nano vàng bằng phƣơng pháp nuôi mầm. Các hạt

nano Au đồng đều và có kích thƣớc trung bình khi đƣợc nuôi trong dung dịch chứa

CTAB là 23,6 nm và trong dung dịch chứa CTAB kết hợp PVP là 25,1 nm.

(3) Đã chế tạo đƣợc các hạt nano đa chức năng từ tính – kim loại, Fe3O4-Au

và Fe3O4-Ag bằng phƣơng pháp hóa ƣớt.

Các hạt nano Fe3O4 đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp hóa – đồng kết tủa –

trong giai đoạn (i) có kích thƣớc trung bình 10,6 nm, có tính siêu thuận từ với từ độ

bão hòa là 67,1 emu/g.

Các hạt nano Fe3O4-Au có kích thƣớc nằm trong khoảng 20-25 nm, có đỉnh

hấp thụ plasmon tại 540 nm trên phổ hấp thụ ánh sáng UV-vis. Khi đặt từ trƣờng

ngoài, các hạt nano tiến lại gần phía có từ trƣờng mạnh và cần 30 phút mới có thể thu

thập hầu hết các hạt nano Fe3O4-Au.

Các hạt nano Fe3O4-Ag có kích thƣớc từ 30 đến 80 nm và có tính siêu thuận

từ và phân tán tốt trong dung dịch. Thời gian thu thập các hạt nano Fe3O4-Ag bằng từ

89

trƣờng ngoài là 20 phút.

CHƢƠNG 4: ỨNG DỤNG VẬT LIỆU NANO TRONG CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC

Nhƣ trình bày trong chƣơng 1, nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là

chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu đo đƣợc. Ở cảm biến thể hệ III, vật liệu

nano không chỉ đóng vai trò tăng diện tích tiếp xúc giữa phần tử nhận biết và phần tử

chuyển đổi tín hiệu mà còn trực tiếp trở thành phần tử phát tín hiệu, vì vậy, thƣờng

đƣợc liên kết trực tiếp với phần tử nhận biết. Trên cơ sở đó, quy trình thiết kế cảm

biến sinh học thế hệ III ứng dụng các vật liệu nano thƣờng bao gồm các bƣớc gắn kết

vật liệu nano với phần tử nhận biết, tích hợp phức “vật liệu nano – phần tử nhận biết”

vào trong mô hình cảm biến và nghiên cứu tín hiệu nhận đƣợc từ vật liệu nano nhằm

đƣa ra các thông tin cần biết về đối tƣợng cần nhận biết (quá trình xử lý tín hiệu).

Trong chƣơng này, một số cảm biến sinh học sử dụng các vật liệu nano đã chế

tạo và nghiên cứu tính chất ở chƣơng 2 và chƣơng 3 đƣợc thiết kế và trình bày theo

trình tự: (i) thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc và (ii) kết quả và thảo luận. Các

cảm biến bao gồm:

(1) Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose sử dụng các hạt nano PbS.

(2) Ứng dụng nguyên lý cảm biến sinh học trong tách chiết và nhận biết tế bào

gốc máu từ mẫu tủy xƣơng.

4.1. CHẾ TẠO CẢM BIẾN GLUCOSE SỬ DỤNG CÁC HẠT NANO PbS

4.1.1. Thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc

4.1.1.1. Thiết kế cảm biến

Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học điện hóa sử dụng các hạt nano PbS

trong luận án này là cảm biến sinh học thế hệ III, dựa vào tƣơng tác enzyme – cơ

chất. Đối tƣợng cần nhận biết là glucose, phần tử nhận biết là enzyme glucose

oxidase (GOx) và tín hiệu của cảm biến là tín hiệu I-V thế quét vòng. Glucose bị ô xi

hóa thành glucolactone (phƣơng trình 1.2) nhờ sự xúc tác của enzyme GOx. Điện tử

tham gia vào quá trình ô xi hóa xuất phát từ điện cực, đƣợc trao đổi với các phân tử

90

glucose thông qua vật liệu làm điện cực - ở đây là PbS. Phƣơng pháp đo thể quét

vòng gắn liền với 3 điện cực: điện cực làm việc WE, điện cực đến CE và điện cực

tham chiếu RE. Quy trình chế tạo điện cực làm việc đƣợc mô tả nhƣ trong hình 4.1;

đƣợc chia làm 3 bƣớc: tạo điện cực vàng, tạo hỗn hợp PbS-GOx và nhỏ dung dịch

chứa hỗn hợp PbS-GOx lên điện cực để tạo thành màng không tan trong nƣớc.

Chế tạo điện cực vàng

Điện cực vàng đƣợc thiết kế sao cho có diện tích bề mặt cố định và hơi sâu

xuống so với mặt thoáng 1 mm để có thể giữ đƣợc 1 giọt hỗn hợp chứa PbS-GOx. Cụ

thể, một miếng vàng có dạng trụ đƣờng kính 3 mm, dài 1 mm đƣợc đặt cố định vào

trong một ống Teflon – điện cực vàng. Điện cực vàng đƣợc nối ra ngoài nhờ một lõi

dẫn điện bằng đồng (Cu) chạy suốt dọc ống Teflon. Epoxy đƣợc đổ vào lõi trụ sao

cho liên kết giữa sợi đồng và điện cực vàng cố định, vừa để giúp hệ lõi sợi đồng-điện

cực vàng có thể trƣợt dọc theo ống trụ Teflon. Mỗi lần chuẩn bị mẫu, điện cực vàng

đƣợc trƣợt ra ngoài một chút để mài phẳng; sau đó đẩy lùi lại so với mặt thoáng của

ống Teflon 1 mm.

Tạo hỗn hợp PbS-GOx

Các hạt PbS đƣợc pha vào trong dung dịch muối phosphate (Phosphate Buffer

– PBS) có pH 7 trong đó đã có chứa các phân tử enzyme Glucose oxidase (GOx) nồng độ 0,2 M (Dung dịch PbS+GOx). Để khô ở trong điều kiện thoáng tại 4oC để

cho dung dịch khô hết – lúc này các phân tử GOx có thời gian để hấp phụ lên trên bề

mặt của các hạt PbS. Sau khi dung dịch PbS+GOx khô, nhỏ dung dịch polystyrene

(PS) đƣợc hòa tan trong dichloromethane (CH2Cl2) vào sao cho tổng thể tích của hệ

bằng đúng thể tích của dung dịch PbS+GOx trƣớc khi khô. CH2Cl2không gây độc

tính phá hủy enzyme, là chất hòa tan tốt PS và bay hơi rất nhanh. Hỗn hợp chứa PS,

PbS và GOx tan trong CH2Cl2 đƣợc khuấy đều và nhỏ một giọt lên trên bể mặt điện

91

cực vàng.

Hình 4.1. Mô tả cấu tạo điện cực làm việc của cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose có sử dụng các hạt nano PbS.

Cố định PbS-GOx lên bề mặt điện cực

Điện cực đƣợc mài phẳng và để thụt vào so với mặt thoáng 1 mm. Nhỏ 1 mL

dung dịch chứa hỗn hợp PbS-GOx lên mặt thoáng của điện cực. Sau 10 phút, CH2Cl2

bay hơi hết, trên bề mặt điện cực chỉ còn lại một lớp PbS-GOx đã đƣợc phân tán và

cố định trong polystyrene (PS). Lớp PS này không tan trong nƣớc vì vậy đảm bảo

các hạt nano PbS và GOx không bị phân tán vào dung dịch trong suốt quá trình đo

đạc. Bên cạnh đó, việc phân tán đều PbS-GOx vào trong PS cũng tạo ra sự liên kết

giữa các phân tử GOx cũng nhƣ các hạt PbS với dung dịch và điện cực vàng.

4.1.1.2. Phương pháp đo đạc

Đặc trƣng I-V hiệu thế quét vòng đƣợc đo trên máy PGSTAT302N với hệ 3

điện cực bao gồm điện cực chuẩn RE là điện cực Ag/AgCl bão hòa, điện cực đếm

CE làm bằng Pt và điện cực làm việc WE đƣợc chế tạo nhƣ trong phần 4.1.1.1. Đặt

hiệu điện thế quét vòng lên điện cực làm việc, khoảng làm việc [-0.1, +1,5], tốc độ

quét 50 mV/s. Khoảng cách giữa điện cực làm việc và điện cực đếm đƣợc giữ

nguyên là 1 cm. Bố trí thí nghiệm đƣợc làm lặp lại giống nhƣ trong công bố trƣớc đó

về cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose sử dụng tetrapod ZnO để so sánh kết

92

quả [70].

4.1.2. Kết quả và thảo luận

Phép đo sử dụng hiệu điện thể quét vòng đƣợc thực hiện thêm trên hệ dung

dịch chứa chỉ có glucose, glucose oxidase và hỗn hợp glucose+glucose oxidase trong

PBS pH 7; điện cực sử dụng là điện cực vàng để khảo sát quá trình ô xi hóa khử của

glucose cũng nhƣ vai trò của GOx trong dung dịch (hình 4.2).

Hình 4.2. Vai trò của GOx trong quá trình ô xi hóa của glucose và cảm biến xác định nồng độ glucose bằng điện cực vàng. Hình A là kết quả đo thế quét vòng (CV) của dung dịch chứa 0,2 mM GOx, chứa 0,2 mM glucose và chứa hỗn hợp 0,2 mM glucose và 0,2 mM GOx. Hình B là kết quả đo CV của dụng dịch chứa hỗn hợp của 0,2 mM GOx với glucose với các nồng độ khác nhau.

Khi trong dung dịch chỉ có glucose 0,2 mM pha trong PBS pH 7 nhận thấy

xuất hiện đỉnh khử tại 0,14 V. So sánh với kết quả đƣợc công bố bởi Hsiao [41], thấy

vị trí đỉnh khử này rất trùng với vị trí đỉnh khử của dung dịch chứa sodium

gluconate. Theo Hsiao, sản phẩm của quá trình khử trong giản đồ CV của sodium

gluconate là glucolactone. Nhƣ vậy, có thể giả thiết glucose đƣợc ô xi hóa thành a xít

gluconic (là a xít của muối gluconate) khi điện thể của WE tăng từ -0,1 V đến 1,5 V.

Sau đó, ở chiều ngƣợc lại, khi điện thể của WE giảm từ 1,5 V xuống -0,1 V thì a xít

93

gluconic bị khử thành glucolactone; vị trí đỉnh khử là 0,14 V.

Khi trộn hai dung dịch GOx và glucose lại, nhận thấy có sự dịch đỉnh về phía

giữa của hai đỉnh của mẫu khi chỉ có Glocose hay GOx độc lập. Vị trí đỉnh I-V thu

đƣợc là 0,45 V. Điều này cũng đƣợc nhóm Qing Liu thảo luận và đƣợc cho là có sự

tƣơng tác giữa GOx và glucose trong dung dịch [68]. Trong dung dịch, các phân tử

glucose có kích thƣớc rất nhỏ, trong khi đó các phân tử GOx có 580-585 acid amin

của mình có kích thƣớc lớn hơn rất nhiều với cấu hình 3D đƣợc chia làm 2 domain

(N-terminal và C-terminal) [40]. Các phân từ glucose liên kết vào bên C-terminal và

sẽ chƣa chuyển hóa thành a xít gluconic khi chƣa có phân tử FAD (flavin adenine

dinucleotide) nào liên kết với N-termial. FAD giống nhƣ chất xúc tác, chuyển hóa

thành FADH2 (nhận thêm H từ môi trƣờng, vì vậy tạo ra H2O2 nhƣ là sản phẩm ở

trong dung dịch), kích hoạt GOx thay đổi cấu hình, kích hoạt quá trình chuyển hóa

glucose thành a xít gluconic. Vì vậy, khi nồng độ glucose tăng lên thì cƣờng độ dòng

khử GOx cũng tăng lên nhƣ biểu hiện trong hình 4.2B.

Hình 4.3. So sánh kết quả đo điện thế quét vòng (CV) của dung dịch chứa 0,2 mM glucose khi sử dụng điện cực chế tạo từ PbS-GOx với kết quả đo CV của mẫu dung dịch chứa GOx.

94

Khi dùng hệ điện cực đƣợc chế tạo từ PbS-GOx, xuất hiện hai đỉnh khử tại

0,49 V và 0,14 V. Hai đỉnh này rất gần với vị trí đỉnh khử của GOx và của a xít

gluconic với cƣờng độ tăng lên gần 15 lần (hình 4.3). Nhƣ vậy, trong quá trình khử

sẽ xuất hiện cả sự khử của a xít gluconic thành glucolactone và quá trình kích hoạt

của GOx. Không chỉ vậy, còn thấy xuất hiện thêm một đỉnh rất cao tại đƣờng cong ô

xi hóa – khi điện thể của WE tăng từ -0,1 V đến 1,4 V. Vị trí đỉnh này tại 1,14V.

Theo nghiên cứu của Cuharuc, quá trình ô xi hóa của PbS thành HPbO2 cũng đƣợc

đo trong khoảng này [22]. Nhƣ vậy, quá trình ô xi hóa glucose thành glucolactone

gắn liền với quá trình hoạt hóa GOx và ô xi hóa của PbS trên bề mặt điện cực.

Hình 4.4. Kết quả đo CV của dung dịch chứa glucose với nồng độ tăng từ 0,1 M đến 1,3 M trên hệ điện hóa với điện cực WE có PbS-GOx.

Hình 4.4 là kết quả đo CV của dung dịch chứa glucose với nồng độ tăng dần

từ 0,1 mM đến 1,3 mM – điện cực sử dụng là điện cực có PbS-GOx. Khi nồng độ

glucose tăng lên, số điện tử cần để hoạt hóa GOx cũng tăng lên, dẫn tới cƣờng độ

dòng khử tại đỉnh 0,49 V cũng tăng lên. Tƣơng tự vậy, cƣờng độ dòng ô xi hóa của

95

PbS thành PbSO2 cùng tăng lên, biểu hiện sự tiếp xúc tốt giữa PbS và GOx.

Trong trƣờng hợp lý tƣởng, mỗi một phân tử glucose bám vào một phân tử

GOx sẽ bị ô xi hóa thành glucolactone bằng 2 electron. Hai electron này sẽ chuyển

qua GOx để tới bề mặt điện cực. Glucolactone không bền và chuyển hóa thành a xít

gluconic. Theo định luật Fick, tại trạng thái cân bằng – khi không có các hoạt động

khử, ô xi hóa thì lƣợng glucose hấp phụ trên bề mặt điện cực tỉ lệ thuận với nồng độ

của glucose và diện tích bề mặt điện cực. Vì vậy, cƣờng độ dòng điện điện hóa

chuyển qua trên bề mặt điện cực sẽ tuân theo công thức Randles-Sevcik (công thức

2.7)

Ở đây A không chỉ là diện tích nhìn thấy của điện cực mà là diện tích tiếp xúc

của chất bị khử/ô xi hóa với bề mặt điện cực và D0 ở đây không chỉ còn là hằng số

khuếch tán đơn thuần mà còn là hệ số biểu hiện khả năng khuếch tán/ chuyển tiếp

của electron từ mẫu vào đến điện cực, thậm chí còn phụ thuộc vào thế năng ô xi hóa

khử của đối tƣợng khảo sát. Giá trị

lúc này tỉ lệ với nồng độ của glucose có trong dung dịch (khi lƣợng GOx đã đƣợc cố định). Nhƣ vậy, ta có thể viết lại công thức

2.10 cho phù hợp với cảm biến đã thiết kế:

(4.1)

Trong đó và là diện tích điện cực hiệu dụng và hệ số đặc trƣng cho độ

khuếch tán electron của vật liệu và K là hằng số. Theo nhƣ công thức này thì cƣờng

độ dòng tại đỉnh ô xi hóa khử sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ của glucose trong dung dịch.

Giá trị này cũng sẽ không tăng mãi khi nồng độ glucose tăng lên mà sẽ dần đạt đến

bão hòa khi hàm lƣợng glucose quá lớn, dẫn đến lƣợng glucose bám vào C-domain

của GOx đạt tới hạn. Mặc dù vậy, ta có thể khảo sát đƣợc bản chất quá trình điện hóa

96

dựa vào khoảng tuyến tính của độ thị biểu diễn sự phụ thuộc của iP vào Cglucose.

Hình 4.5. So sánh độ nhạy của cảm biến glucose đo trên hệ điện cực PbS với cảm biến glucose đo trên điện cực vàng. Hình A là kết quả tính toán độ nhạy cảu cảm biến từ đỉnh khử tại 0,45 V với điện cực WE có PbS-GOx. Hình B là kết quả tính toán từ đỉnh khử tại 0,45 V với điện cực vàng.

Xét quá trình khử, tại đỉnh 0,45 V, nhận thấy sự phụ thuộc của cƣờng độ dòng

điện khử tại 0,45 V vào nồng độ của glucose trong dung dịch (Cglucose) đƣợc chia

thành hai khoảng ứng với Cglucose< 0,8 mM và Cglucose> 0,8 mM. Độ dốc của hai đoạn

này khác nhau, và có giá trị nhỏ hơn khi Cglucose < 0,8 mM.

Sử dụng công thức 4.1, ta nhận đƣợc hệ số nghiêng của đồ thị là =

23,2 ± 1,5 μAmM-1 khi Cglucose> 0,8 mM và bằng 5,8 ± 0,5 μAmM-1 khi Cglucose< 0,8

mM. Trong đó và làdiện tích hiệu dụng và hằng số khuếch tán đối với

trƣờng hợp WE đƣợc chế tạo từ PbS-GOx. Diện tích hiệu dụng của điện cực vàng

97

khi chƣa có vật liệu PbS là với R là bán kính của bề mặt điện cực và bằng 3

mm.Từ đóđộ nhạy của cảm biến đƣợc tính và bằng = 82,1 ± 5,3 μAcm-2mM-1 khi

Cglucose> 0,8 mM và = 20,5 ± 1,8 μAcm-2mM-1 khi Cglucose< 0,8 mM. Độ nhạy của

cảm biến xác định nồng độ glucose khi điện cực WE không có PbS-GOx, ta cũng

tính đƣợc và lần lƣợt là diện tích hiệu = 0,275 ± 0,06 μAmM-1. Ở đây

dụng và hằng số khuếch tán đối với trƣờng hợp chỉ có điện cực vàng. Từ đây, độ

nhạy của cảm biến khi chỉ dùng điện cực vàng là = 1,0 ± 0,2 μAcm-2mM-1 (hình

4.5B). Nếu coi hệ số K là không đổi thì độ nhạy của cảm biến tăng lên tới 82 lần, so

với khi dùng điện cực Au.

Hình 4.6. Tính toán độ nhạy của cảm biến từ đỉnh ô xi hóa tại 1,14 V với điện cực làm việc WE có PbS-GOx.

Tƣơng tự vậy, khi khảo sát độ nhạy của cảm biến tại vị trí ô xi hóa của PbS

98

(hình 4.5B), ta nhận đƣợc = 546,2 ± 24,6 μAcm-2mM-1 khi Cglucose> 0,8 mM và

= 322,1 ± 8,6 μAcm-2mM-1 khi Cglucose< 0,8 mM. Ở đây, có thể lƣu ý là diện

tích hiệu dụng đều đƣợc tính là tổng diện tích bề mặt tiếp xúc của PbS, nên giá trị có

thể coi là không đổi. Vì vậy sự khác biệt là do bản chất quá trình ô xi hóa của PbS

thành HPbO2 và quá trình khử của GOx. Mặc dù vậy, sự khác biệt này cũng không

quá nhiều (khoảng 3,9 lần).

So sánh kết quả này với kết quả đã công bố trƣớc đó với điện cực làm từ tetrapod ZnO – độ nhạy khi đó là 166,7 ± 8,3 μAcm-2mM-1[70]; ta nhận đƣợc độ

nhạy của cảm biến tăng lên 3 lần. Kết quả này có thể là do các phân tử GOx khi hấp

phụ trên bề mặt của vật liệu, chúng ƣu tiên liên kết chặt chẽ với các hạt nano PbS

hơn là so với ZnO.Trong cấu trúc 3D của GOx, vị trí liên kết với FAD – hay chính là

nơi liên kết để chuyển tiếp electron, rất gần với amino axit cystein tại vị trí thứ 512 –

là amino acid đặc trƣng có gốc thiol (-SH). Vì vậy, khi hấp phụ lên bề mặt của PbS,

các phân tử GOx có thể chủ động liên kết cộng hóa trị với amino axit này, giúp cho

quá trình chuyển tiếp electron giữa vật liệu và GOx trở nên dễ dàng hơn. Nhƣ vậy,

bằng thiết kế tƣơng tự, khi sử dụng vật liệu nano PbS, cảm biến sinh học nhận biết

nồng độ glucose cho độ nhạy có thể so sánh đƣợc so với các nghiên cứu khác nhƣ nghiên cứu của Wang sử dụng vật liệu nano vàng trên dây nano Pb (135,5 μAcm- 2mM-1) [122], của Ahmad trên thanh ZnO (106,6 μAcm-2mM-1) [2] và của Chen (711,1 μAcm-2mM-1) sử dụng vật liệu nano vàng trên điện cực grapheme [19]. Độ

nhạy lớn nhất theo tìm hiểu của chúng tôi đƣợc công bố bởi nhóm Chen năm 2011 đạt 711,1 μAcm-2mM-1. Dựa vào phƣơng pháp chế tạo điện cực, có thể thấy diện tích

điện cực của nhóm Chen xấp xỉ bằng diện tích điện cực công bố trong luận án này.

Nhƣng quá trình chế tạo điện cực của nhóm Chen đƣợc chia làm 2 bƣớc, lần lƣợt là

(i) cố định một lớp graphene sau đó (ii) phủ một lớp hạt nano vàng lên trên bề mặt

điện cực, trƣớc khi sử dụng điện hóa để gắn các phân từ GOx. Quá trình này phức

tạp hơn rất nhiều so với quá trình chế tạo điện cực trong luận án. Không chỉ vậy, vật

liệu PbS sử dụng trong luận án cũng đơn giản hơn so với vật liệu đƣợc nhóm Chen sử dụng. Ngƣợc lại, độ nhạy cao nhất đo đƣợc trong luận án đạt 546,2 μAcm-2mM-1;

99

không thấp hơn quá nhiều so với độ nhạy đƣợc nhóm Chen công bố.

4.1.3. Tƣơng tác giữa hạt PbS với phân tử 4-ATP

Nhƣ đã bàn luận ở phần trƣớc, luận án đã đề xuất giả thiết về khả năng liên

kết giữa các hạt PbS với các gốc liên kết thiol (-SH) của phân tử GOx. Để đơn giản

hóa, tƣơng tác giữa các hạt PbS và các phân tử hữu cơ có kích thƣớc nhỏ chứa gốc

thiol - ở đây là 4-ATP (4-aminothiophenol) - đƣợc đánh giá thông qua tính toán mô

phỏng. Phƣơng pháp tính toán đƣợc mô tả nhƣ trong hình 4.7. Đầu tiên, phân tử 4-

ATP đƣợc tối ƣu hóa cấu hình 3D bằng phƣơng pháp cực tiểu năng lƣợng (hình

4.7A). Sau đó, phân tử 4-ATP đƣợc dịch chuyển tới gần bề mặt của tinh thể PbS

hƣớng về các nguyên tử Pb (hình 4.7B) và nguyên tử S (hình 4.7C). Khả năng liên

kết giữa các phân tử 4-ATP với bề mặt tinh thể PbS đƣợc đánh giá thông qua tổng

năng lƣợng của hệ và khoảng cách liên kết giữa nguyên tử.

Hình 4.7. Mô tả phương pháp tính toán phản ứng liên kết giữa phân tử 4-ATP và bề mặt PbS.

Hình 4.8A là kết quả tính toán tổng năng lƣợng của hệ PbS và 4-ATP đối với

2 trƣờng hợp: Pb-S là khi nguyên tử S của phân tử 4-ATP tiến lại gần liên kết với

nguyên tử Pb trong tinh thể PbS và S-S là khi nguyên tử S của 4-ATP tiến lại gần

liên kết với nguyên tử S của tinh thể PbS. Tổng năng lƣợng của hệ Pb-S nhỏ hơn so

100

với tổng năng lƣợng của hệ S-S, tƣơng ứng với đó là khoảng cách giữa hai nguyên tử

liên kết trong hai trƣờng hợp lần lƣợt là 2,98 Å đối với Pb-S và 3,40 Å đối với S-S.

Bên cạnh đó, phân bố mật độ electron cho thấy nguyên tử 4-ATP hình thành liên kết

ion với nguyên tố Pb trên bề mặt, đồng thời còn có liên kết với hai nguyên tử S lân

cận của nguyên tử Pb trong tinh thể PbS (hình 4.8B). Điều này chứng tỏ phân tử 4-

ATP ƣu tiên liên kết chặt chẽ với bề mặt tinh thể PbS tại vị trí của nguyên tử chì

(Pb).

Hình 4.8. Phụ thuộc tổng năng lượng của hệ PbS-4ATP phụ thuộc vào khoảng cách giữa hai nguyên tử tham gia liên kết (A) và giản đồ phân bố mật độ electron tại vị trí có tổng năng lượng thấp nhất (B) – liên kết là bền nhất.

Kết quả tính toán cũng chỉ ra, sau khi liên kết mặt phẳng phân tử 4-ATP tạo thành một góc nghiêng 23,14o so với mặt phẳng (001) của tinh thểPbS (hình 4.3).

Không chỉ vậy, vị trí các phân tử Pb hay S trên bề mặt của tinh thể cũng đƣợc xếp

lại, hơi xô lệch một chút so với tinh thể hoàn hảo. Khoảng cách liên kết giữa nguyên

tử S của phân tử 4-ATP và nguyên tử Pb của tinh thể PbS xấp xỉ bằng khoảng cách

giữa hai nguyên tử Pb-S trong tinh thể PbS. Nhƣ vậy, nguyên tử S của 4-ATP đóng

vai trò lặp lại tuần hoàn của bề mặt tinh thể PbS, giúp bề mặt tinh thể hoàn hảo hơn,

giảm khuyết thiếu S (tƣơng tự nhƣ khuyết thiếu oxy). Hệ quả của điều này là sau khi

101

liên kết với các phân tử có nhóm thiol (SH) nhƣ 4-ATP, thioglycolic acid, L-

Cysteine hay thioglycerol huỳnh quang của vật liệu MetS thƣờng đƣợc cải thiện một

cách đáng kể [28].

Hình 4.9. Cấu hình bền vững của hệ PbS-4ATP sau khi liên kết: mặt phẳng phân tử 4-ATP tạo với mặt phẳng (001) của tinh thể một góc là 23,14o.

4.2. ỨNG DỤNG CÁC HẠT NANO TỪ - KIM LOẠI TRONG PHÂN

LẬP TẾ BÀO GỐC MÁU TỪ MẪU TỦY XƢƠNG

Vai trò của ứng dụng vật liệu nano trong công nghệ tế bào gốc đã đƣợc trình

bày trong chƣơng I, trong đó việc sử dụng vật liệu đa chức năng từ tính – kim loại

hứa hẹn đem lại nhiều lợi thế không chỉ trong quá trình phân lập tế bào gốc mà còn

có thể hỗ trợ trong chụp ảnh và khảo sát tế bào. Một lần nữa nguyên lý hoạt động của

cảm biến sinh học đƣợc áp dụng trong thí nghiệm phân lập tế bào gốc từ tủy xƣơng.

Đối tƣợng cần nhận biết là các tế bào gốc máu biểu hiện CD34+, phần tử nhận biết là

kháng thể anti-CD34 và phần tử chuyển tiếp tín hiệu là các hạt nano vàng trong ứng

dụng SER. Bên cạnh đó, tín hiệu tổng trở cũng đƣợc khảo sát để đo đạc nồng độ của

tế bào sau khi phân lập.

Cơ chế hoạt động của cảm biến đƣợc mô tả nhƣ trong hình 4.14. Các hạt nano

Fe3O4-Ag đƣợc chức năng hóa bề mặt và gắn với kháng thể nhận biết đặc hiệu tế bào

gốc CD34+ trƣớc khi đƣợc ngâm trong dung dịch chứa mẫu tủy xƣơng. Ái lực kháng

nguyên – kháng thể sẽ giúp các hạt nano đa chức năng tập trung trên bề mặt của các

102

tế bào gốc. Sử dụng nam châm để hút các hạt từ, theo đó các tế bào gốc cũng đƣợc

thu thập. Rửa sạch các tế bào khác và các cơ chất còn dƣ trong mẫu, ta nhận đƣợc

dung dịch chỉ chứa các tế bào gốc máu có đính các hạt nano Fe3O4-Ag ở trên bề mặt.

Cuối cùng, tín hiệu Raman tăng cƣờng bề mặt (SER) đƣợc sử dụng để phân biệt

những vùng có và không có tế bào. Bên cạnh đó, sử dụng phép đo tổng trở để khảo

sát nồng độ tế bào.

Hình 4.14. Cơ chế hoạt động của cảm biến sinh học sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag để phân lập và khảo sát tế bào gốc máu từ tủy xương.

4.2.1. Thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc

Hình 4.15. Thiết kế điện cực sử dụng trong cảm biến đo nồng độ tế bào bằng phương pháp điện tổng trở (A) và ảnh SEM của bề mặt điện cực (B).

Cảm biến đo nồng độ tế bào là một hệ hai điện cực đƣợc thiết kế nhƣ trong

hình 4.15A. Điện cực làm việc WE có dạng hình tròn đƣờng kính 1 mm (diện tích A = 3,14 mm2). Điện cực đếm CE có dạng khuyên, dày 0,5 mm, bán kính trong 1,5

103

mm, bán kính ngoài 2 mm. Khoảng cách giữa hai điện cực là 1 mm. Từ hai điện cực,

có hai đƣờng thằng có độ dày 0,2 mm cũng làm bằng Pt nối ra chân cắm. Hình 4.15B

là ảnh SEM bề mặt của điện cực độ phóng đại 30 lần. Khi thực hiện phép đo tổng trở

điện cực chuẩn RE đƣợc nối tắt với điện cực đếm CE.

Quá trình đo đạc trên cảm biến đƣợc chia thành 4 bƣớc: (i) chức năng hóa và

gắn các hạt Fe3O4-Ag với kháng thể anti-CD34, (ii) phân lập tế bào gốc từ mẫu tủy

xƣơng, (iii) sử dụng tín hiệu SER để lựa chọn tế bào gốc và (iv) sử dụng phép đo

tổng trở để khảo sát nồng độ tế bào gốc sau khi phân lập; trong đó, bƣớc (iii) và (iv)

là hai bƣớc độc lập trong phần tử xử lý tín hiệu.

4.2.1.1. Chức năng hóa và gắn các hạt Fe3O4-Ag với kháng thể

antiCD34

Các phân tử kháng thể antiCD34 đƣợc cố định trên bề mặt của các hạt nano

Fe3O4-Ag bằng liên kết cộng hóa trị. Đầu tiên, 1,5 mg hạt Fe3O4 đƣợc cho vào dung

dịch chứa 45 mL 25 μM 4-aminothiophenol (4-ATP). Sản phẩm (Fe3O4-Ag-NH2)

đƣợc lọc rửa bằng nam châm vĩnh cửu để loại bỏ các sản phẩm phụ, trƣớc khi phân

tán vào dung dịch đệm phosphate (phosphate buffer solution – PBS). Nồng độ của

các hạt nano Fe3O4-Ag-NH2trong PBS đƣợc điều chỉnh để thành 50 ppm (50 mg/L).

Tiếp theo, 10 μL dung dịch chứa kháng thể antiCD34 đƣợc cho vào ống có chứa 400

μL dung dịch chứa 50 ppm hạt Fe3O4-Ag-NH2. Sau đó, chất xúc tác EDC (1-Ethyl-3-

(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) đƣợc sử dụng để xúc tác phản ứng liên kết

giữa gốc NH2 và các kháng thể. Sau khi lọc rửa các sản phẩm phụ bằng nam châm

vĩnh cửu, sản phẩm nhận đƣợc là các hạt nano đa chức năng đã đƣợc cố định kháng

thể (Fe3O4-Ag-antiCD34).

Phổ tán xạ Raman của các mẫu chứa Fe3O4-Ag-NH2 và Fe3O4-Ag-antiCD34

đƣợc nghiên cứu trên hệ LabRAM HR800, Horiba và so sánh với phổ tán xạ Raman

của dung dịch chứa các phân tử 4-ATP.

4.2.1.2. Tách lọc tế bào

Các hạt nano Fe3O4-Ag sau khi đƣợc chức năng hóa bởi nhóm chức amin và

104

gắn với kháng thể nhận biết tế bào gốc CD34+ (antiCD34) đƣợc sử dụng để tách lọc

tế bào gốc CD34+ từ mẫu tủy xƣơng. Mẫu tủy xƣơng đƣợc lấy từ Viện nghiên cứu tế

bào gốc và công nghệ gen, bệnh viện VINMEC. 20 μL mẫu chứa tủy xƣơng đƣợc cố

định trong 200 μL BSA (bovine serum albumin, nồng độ 0,05 g/mL) tại nhiệt độ 2-8 oC. Thời gian cố định là 30 phút. 10 μL dung dịch Fe3O4-Ag-antiCD34 đƣợc bổ sung

và lƣu trong thời gian 45 phút để các phản ứng liên kết kháng nguyên – kháng thể

xảy ra hoàn toàn. Sau 45 phút, sử dụng từ trƣờng ngoài để hút các hạt nano Fe3O4-

Ag-antiCD34. Do liên kết kháng nguyên-kháng thể, các hạt nano kéo theo các tế bào

CD34+. Dùng PBS lọc rửa mẫu 2 lần rồi phân tán mẫu vào 20 μL PBS.

Ảnh hiển vi huỳnh quang đƣợc dùng để đánh giá hiệu suất phân lập tế bào

gốc. Mẫu chứa tủy xƣơng trƣớc và sau khi xử lý bằng Fe3O4-Ag-antiCD34 đều đƣợc

ngâm trong dung dịch chứa hỗn hợp hai kháng thể antiCD34 và antiCD45. Trong đó

kháng thể antiCD34 đƣợc gắn với chất huỳnh quang ECD (phát ánh sáng màu đỏ) và

kháng thể antiCD45 đƣợc gắn với FITC (huỳnh quang xanh lá cây). Sau đó, cả hai

mẫu đều đƣợc soi trên kính hiển vi huỳnh quang ZEISS 510 ở 2 chế độ đặc trƣng cho

hai chất phát quang ECD và FITC.

4.2.1.3. Sử dụng tín hiệu SER để lựa chọn tế bào gốc sau phân lập

Mẫu chứa tủy xƣơng sau khi lọc đƣợc nhỏ trên đế kính mỏng (larmen) và

khảo sát tính chất tán xạ Raman. Đầu tiên, ảnh hiển vi của mẫu đƣợc chụp ở hai chế

độ - trƣờng sáng và trƣờng tối - để khảo sát các vị trí có tế bào. Sau đó, phổ tán xạ

Raman của các vị trí có tế bào và không có tể bào đƣợc đo đạc và so sánh trên hệ

105

LabRAM HR800, Horiba.

4.2.1.4. Sử dụng phép đo tổng trở để khảo sát nồng độ tế bào gốc sau

phân lập

Hình 4.16. Ảnh chụp trên kính hiển vi phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm – Diện tích của một buồng nhỏ là 5 μm × 5 μm, chiều cao của buồng là 100 μm.

Nồng độ tế bào đƣợc đo bằng buồng đếm. Buồng đếm tế bào có cấu trúc là

một hình khối có chiều cao 100 μm; trên bề mặt của đế có các vạch chia để xác định

diện tích - ở đây các vạnh chia có kích thƣớc 5 μm × 5μm (Hình 4.16). Dung dịch

chứa tế bào nhỏ lên trên bề mặt của buồng đếm, dùng kính phẳng để đậy lên. Nhƣ

vậy, trong một buồng có đánh dấu bằng một hình vuông có thể tích là 20 μm × 20 μm × 100 μm và bằng v0 = 4×10-6μL. Nếu số lƣợng tế bào trung bình đếm đƣợc trong một ô cơ sở có thể tích v0= 4×10-6μL là N, thì nồng độ của tế bào C có thể tính theo

công thức . Bằng phƣơng pháp đã mô tả kể trên,nồng độ tế bào tính đƣợc là

106

C0 = 2,93×105 ± 0,68×105 tế bào/μL (hình 4.15).

Hình 4.17. Mô hình sự có mặt của các tế bào gốc máu trên bề mặt điện cực.

Có thể mô tả sự có mặt của các tế bào trên bề mặt điện cựcmột cách đơn giản

nhƣ trong hình 4.17. Các hạt nano từ tính – kim loại Fe3O4-Ag đƣợc gắn với kháng

thể, hƣớng tới bắt cặp đặc hiệu trên bề mặt của các tế bào gốc máu. Sau khi đƣợc

phân lập khỏi dung dịch mẫu tủy xƣơng bằng từ trƣờng ngoài, đƣợc nhỏ lên trên bề

mặt điện cực và nằm lơ lửng trong dung dịch đệm PBS. Sử dụng hệ PGSTATS302N

để đo tổng trở (điện cực CE nối với điện cực RE). Các nồng độ tế bào khảo sát lần

lƣợt là: C0/5, C0/10, C0/20 và C0/50.

4.2.2. Kết quả và thảo luận

4.2.2.1. Chức năng hóa hạt nano từ - kim loại và liên kết với kháng thể

Các phân tử 4-ATP liên kết với bề mặt của Ag bằng liên kết cộng hóa trị Ag-S

[42], vì vậy khi cho 4-ATP nồng độ 25 μM vào trong dung dịch chứa các hạt nano

Fe3O4-Ag, gốc amine (NH2) của phân tử 4-ATP đƣợc thả tự do để có thể liên kết với

các gốc carboxyl của các phân tử kháng thể. Hình 4.18 mô tả kết quả đo Raman của

các mẫu chứa 1mM 4-ATP đo với thời gian tích phân là 30 phút (hình A), của mẫu

các hạt nano Fe3O4-Ag sau khi chức năng hóa với các phân tử 4-ATP (Fe3O4-Ag-

4ATP) (hình B) và của mẫu chứa các hạt sau khi đã gắn với kháng thể (Fe3O4-Ag-

antiCD34) (hình C) với thời gian tích phân là 30s. Các đỉnh Raman đặc trƣng của

107

phân tử 4-ATP hầu nhƣ đều tìm thấy ở trong phổ của mẫu (Fe4O4-Ag-4ATP) lần lƣợt

tại 1079 cm-1, 1138cm-1, 1175cm-1, 1340cm-1, 1390cm-1, 1425cm-1, 1473cm-1, 1484cm-1 và cm-1. Bên cạnh đó, cƣờng độ tại các đỉnh tán xạ của mẫu Fe3O4-Ag-

4ATP gấp khoảng 1000 lần so với cƣờng độ tán xạ đo đƣợc của mẫu 4-ATP 1 mM,

mặc dù thời gian tích phân khi đo mẫu Fe3O4-Ag-4ATP chỉ bằng 1/60 thời gian tích

phân khi đo mẫu 4-ATP.

Hình 4.18. Nghiên cứu phổ tán xạ Raman của các mẫu chứa các hạt nano sau khi gắn kháng thể. Hình A là phổ tán xạ Raman của mẫu chứa 10-3 M 4-ATP với thời gian tích phân là 30 phút. Hình B là phổ tán xạ Raman của mẫu chứa các hạt Fe3O4-Ag-4ATP, thời gian tích phân là 30 giây.Hình Clà phổ tán xạ Raman của mẫu chứa các hạt Fe3O4-Ag- antiCD34, thời gian tích phân là 30 giây.

Bảng 4.1 thống kê kết quả tính toán lý thuyết và đo đạc vị trí đỉnh đặc trƣng

108

Raman của dung dịch chứa mẫu Au-4ATP và Au-4ATP-antibody. Một số đỉnh SERS đặc trƣng của phân tử 4-ATP xuất hiện tại 1614 cm-1, 1493 cm-1, 1423cm-1, 1382cm- 1, 1170cm-1, 1134cm-1, 1075cm-1 và 1005cm-1, khá trùng với các kết quả đã công bố

trƣớc đó [43,47,92]. Bên cạnh đó, có sự xuất hiện mới của các đỉnh tại vị trí 1449 cm-1 và 1297 cm-1 ứng với dao động của các liên kết peptide (NH-CO-) và của gốc

carboxyl (-COOH).

Bảng 4.1. Bảng thống kê các kết quả tính toán lý thuyết và đo đạc vị trí đỉnh đặc trưng Raman tăng cường bề mặt của phân tử 4-ATP trên bề mặt các hạt nano vàng.

Kết quả theo tham khảo (cm-1) Các dao động tương ứng của các liên kết trong phân tử 4-ATP Mode Raman theo tính toán (cm-1) Khi được gắn với các hạt đa chức năng (cm-1)

1522 1614 1590

1448 1493

- - 1489 -

1395 1423 1427

1348 - 1180 1125 1382 - 1170 1134 1386 - 1179 1141

1104 1075 1081

943 1005 1007 νCC+δCCH+νCN (mạnh) νCC+πNH2+δCCH (yếu) - νCC+πNH2+δCCH (rất yếu) δCCH+νCN (mạnh) - δCCH (trung bình) δCH + πNH (yếu) νCS+δCCH+δCSH (rất mạnh) γCCH + γCCC (yếu)

Sau khi gắn kết với các phân tử kháng thể, nhận thấy cƣờng độ tán xạ Raman

bị giảm đi còn 1/3 so với trƣớc khi gắn kháng thể, có thể do lớp kháng thể hấp thụ

một phần ánh sáng tới tán xạ trên bề mặt hạt. Trên phổ tán xạ của mẫu Fe3O4-Ag- antiCD34 còn thấy một nền cong lên trong khoảng từ 1400 cm-1 đến 1600 cm-1.

Khoảng số sóng này cũng là khoảng số sóng có xuất hiện nhiều đỉnh tán xạ Raman

của các liên kết thuộc các protein [33,34]. Vì vậy, có thể khảng định các kháng thể

đã đƣợc cố định lên trên bề mặt các hạt nano Fe3O4-Ag.

Tính toán hiệu suất gắn kháng thể

Nồng độ của kháng thể đƣợc đo dựa vào phép đo huỳnh quang. Kháng thểđã

có gắn sẵn với chất nhạy quang ECD – Texas Red. Khi đƣợc kích thích bằng ánh

109

sáng có bƣớc sóng 494 nm (đƣợc đo từ phép đo kích thích huỳnh quang), ECD phát

huỳnh quang mạnh tại bƣớc sóng 610 nm. Hình 4.19 biểu diễn sự phụ thuộc của

cƣờng độ huỳnh quang của các mẫu chứa kháng thể gắn ECD ở các nồng độ thấp vào

nồng độ của kháng thể. Các nồng độ đƣợc pha loãng từ nồng độ gốc – là nồng độ của

kháng thể đƣợc xác định bởi nhà sản xuất. Tỉ lệ pha loãng lần lƣợt là 120 lần, 200

lần, 300 lần, 400 lần, 600 lần và 1200 lần.

Hình 4.19. Sự phụ thuộc của cường độ huỳnh quang tại 610 nm của dung dịch chứa kháng thể ECD-antiCD34 vào nồng độ được pha loãng trong dung dịch đệm PBS.

Ở nồng độ đủ thấp, cƣờng độ huỳnh quang này tỉ lệ thuận với nồng độ của

chất nhạy quang. Do chất nhạy quang (ECD) đƣợc gắn liền với kháng thể nên cƣờng

độ huỳnh quang cũng tỉ lệ thuận với nồng độ của kháng thể. Khớp hàm tuyến tính sự

phụ thuộc của đƣờng độ huỳnh quang I vào nồng độ của kháng thể C – ,

ta nhận đƣợc các giá trị của a và b. Các giá trị này đƣợc sử dụng để tính toán nồng độ

của kháng thể.

Để đo đƣợc hiệu suất gắn kháng thể lên trên bề mặt các hạt nano đa chức năng

Fe3O4-Ag, đầu tiên tiền hành đo cƣờng độ huỳnh quang của 600 μL dung dịch chứa

110

kháng thể có gắn chất nhạy quang ECD-antiCD34 trƣớc khi gắn với hạt Fe3O4-Ag

(dung dịch ban đầu). Sau khi gắn với hạt Fe3O4-Ag, các hạt nano từ đƣợc tách khỏi

dung dịch bằng nam châm vĩnh cửu và đƣợc rửa 3 lần bằng dung môi PBS, và đƣợc

phân tán vào 600 μL dung môi PBS. Huỳnh quang của phần dung dịch không chứa

hạt sau lần lọc từ thứ nhất (dung dịch chứa kháng thể còn dƣ) và của hạt sau khi đã

gắn với kháng thể cũng đƣợc đo để so sánh với kết quả đo huỳnh quang của dung

dịch ban đầu. Nhận thấy, tổng cƣờng độ huỳnh quang tại 610 nm của dung dịch chứa

hạt và dung dịch chứa kháng thể còn dƣ bằng với cƣờng độ huỳnh quang tại 610 nm

của dung dịch ban đầu. Điều này lặp lại trong tất cả các phép đo với các nồng độ

kháng thể khác nhau; khẳng định huỳnh quang của chất nhạy quang không bị giảm

trong suốt quá trình làm thí nghiệm và lƣợng kháng thể mất mát trong quá trình lọc

rửa là không đáng kể.

Hình 4.20. Đánh giá hiệu suất gắn kháng thể lên các hạt Fe3O4-Au phụ thuộc vào tỉ lệ thể tích của dung dịch chứa hạt và thể tích dung dịch gốc chứa kháng thể ECD-antiCD34.

Bằng việc tính toán nồng độ của kháng thể từ giá trị khớp hàm trƣớc đó, hiệu

111

suất gắn kháng thể đƣợc định nghĩa theo công thức khi nồng

độ của kháng thể còn dƣ là lớn. Trong đó Cinivà Csup là nồng độ của kháng thể trong

dung dịch ban đầu và trong dung dịch chứa kháng thể còn dƣ. Trong trƣờng hợp,

cƣờng độ huỳnh quang của dung dịch chứa hạt sau khi gắn kháng thể là lớn thì hiệu

suất đƣợc tính theo công thức , trong đó Cconj là nồng độ kháng thể

đo đƣợc trong dung dịch gắn với hạt. Từ đây, ta có thể vẽ đƣợc sự phụ thuộc của

hiệu suất gắn kháng thể vào tỉ lệ thể tích dung dịch chứa hạt Fe3O4-Au và thể tích

dung dịch gốc chứa kháng thể (VNP/VAB) (hình 4.20).

Khi lƣợng hạt rất ít (tại các tỉ lệ thể tích VNP/VAB thấp), sau quá trình gắn

kháng thể lên hạt, kháng thể còn dƣ nhiều, dẫn tới hiệu suất gắn kháng thể thấp. Khi

tỉ lệ VNP/VAB tăng lên, diện tích bề mặt của vật liệu tăng – diện tích bắt cặp kháng thể

tăng, lƣợng kháng thể không bắt cặp với hạt giảm đi, hiệu suất tăng. Khi VNP/VAB đạt

điểm tới hạn, nghĩa là diện tích bề mặt của vật liệu vừa đủ để cho kháng thể bám vào

thì lƣợng kháng thể có trong dung dịch chứa kháng thể dƣ hầu nhƣ không còn. Khi

này giá trị VNP/VAB nằm trong khoảng từ 300 đến 400. Tiếp tục tăng giá trị VNP/VAB

lên, lƣợng hạt đủ nhiều để hầu nhƣ tất cả các kháng thể đều đƣợc gắn với hạt. Hiệu

suất đạt cực đại (~92%). Thậm chí khi tỉ lệ VNP/VAB cao quá cũng có thể dẫn tới có

hạt không có gắn với kháng thể. Vì vậy, tỉ lệ VNP/VAB=300 là tỉ lệ an toàn để đảm

bảo hầu hết các hạt đều có gắn kháng thể. Tỉ lệ này đƣợc sử dụng để gắn hạt với

kháng thể cho tất cả các lần thí nghiệm tiếp theo

4.2.2.2. Tách lọc tế bào gốc từ mẫu tủy xương

Các hạt nano Fe3O4-Ag-antiCD34 có tính siêu thuận từ, vì vậy sau khi gắn đặc

hiệu lên trên bề mặt các tế bào CD34+, sẽ biến các tế bào CD34+ thành những tiểu

112

cầu có từ tính và dễ dàng thu thập đƣợc bằng từ trƣờng ngoài.

Hình 4.21. Kết quả hiển vi huỳnh quang của mẫu tủy xương trước (A, B) và sau (C, D) khi sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag-antibody để tách chiết tế bào gốc. A,C: huỳnh quang chỉ thị tế bào CD45+ và B,B: huỳnh quang chỉ thị tế bào CD34+.

Trƣớc khi cho ngâm với các hạt Fe3O4-Ag-antiCD34 và tách lọc tế bào

CD34+ bằng từ trƣờng, mẫu tủy xƣơng đƣợc nhuộm màu bằng hai chất huỳnh quang

ECD – chất huỳnh quang màu đỏ, đính đặc hiệu với tế bào CD34+ và FITC - chất

huỳnh quang màu xanh lá cây, có đính đặc hiệu với một loại tế bào khác là CD45+.

Vì vậy, trên ảnh hiển vi huỳnh quang đặc trƣng của ECD các tế bào phát quang màu

đỏ là các tế bào CD34+ (hình 4.121A). Tƣơng tự các tế bào phát huỳnh quang màu

xanh trong hình 4.18B là các tế bào CD45+. Có thể thấy trong mẫu tủy xƣơng có rất

nhiều tế bào CD45+, trong khi đó lƣợng CD34+ không nhiều. Theo một số nghiên

cứu trƣớc đó, lƣợng CD45+ trong mẫu tủy xƣơng của ngƣời có sức khỏe bình thƣờng

113

chiếm khoảng 60-70% số tế bào [9]; còn lƣợng CD34+ chiếm khoảng 5-7% [4]. Tỉ lệ

này cũng phù hợp với tỉ lệ số tế bào phát huỳnh quang màu xanh gấp khoảng 7-8 lần

so với các tế bào phát huỳnh quang màu đỏ (hình 4.21 A và B).

Sau khi sử dụng hạt nano từ đã gắn kháng thể Fe3O4-Ag-antiCD34 để phân

lập các tế bào CD34+, mẫu không còn tế bào phát huỳnh quang màu xanh (FITC)

nữa, chứng tỏ không còn dấu hiệu của CD45+ (hình 4.21C). Song song với đó, khi

chụp dƣới điều kiện phát quang của ECD, ta lại thấy tất cả các tế bào phát màu đỏ

(hình 4.21D).Hay nói cách khác, sau phép lọc từ, trong mẫu chỉ còn lại các tế bào

CD34+.

4.2.2.3. Khả năng đánh dấu bằng phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt

Hình 4.22. Ảnh hiển vi trường sáng (ảnh trên) và trường tối (ảnh dưới) của mẫu tế bào sau khi lọc và phổ tán xạ Raman tại các vị trí dược đánh dấu trong hình. Vị trí A: không có tế bào. Vị trí B: Có tế bào.

Nhƣ nghiên cứu ở trong phần 4.1.2, phổ tán xạ Raman tăng cƣờng bề mặt của

các phân tử bám trên bề mặt các hạt nano kim loại có thể đƣợc dùng để kháo sát vị trí

tập trung của các hạt nano kim loại. Bên cạnh đó, một báo cáo trƣớc đó đã đề xuất

114

việc sử dụng kính hiển vi trƣờng tối để khảo sát vị trí của các hạt nano kim loại[104].

Trong luận án này, cả hai phƣơng pháp đƣợc dùng kết hợp; vừa để xác định vị trí của

tế bào, vừa để xác định vị trí của các hạt nano từ - kim loại, đồng thời cùng để khẳng

định khả năng đánh dấu của các hạt nano từ - kim loại (hình 4.22). Ánh sáng khi

chiếu vào mẫu, tán xạ mạnh trên bề mặt các hạt nano kim loại, ngay cả khi không tồn

tại ánh sáng trực tiếp tới vật kính, thì các ánh sáng tán xạ này cũng đủ sáng để theo

theo dõi nơi nào tập trung nhiều hạt kim loại hơn. So sánh hai ảnh hiển vi trƣờng

sáng và trƣờng tối cho thấy các hạt nano từ - kim loại tập trung rất nhiều trên bề mặt

của các tế bào. Rất ít các hạt từ-kim loại đơn lẻ còn tồn tại trong dung dịch. Điều này

một lần nữa khẳng định hiệu suất bắt cặp hạt từ-kim loại với kháng thể: hầu hết các

hạt từ-kim loại đều gắn với kháng thể. Đánh dấu các vị trí không có tế bào (A) và vị

trí có tế bào (B), chùm laser đƣợc tập trung trong thời gian rất ngắn để đo phổ tán xạ

Raman tăng cƣờng bề mặt (thời gian tích phân là 30s). Theo hình 4.20, tại vị trí có tế bào, phổ Raman cho các tán xạ mạnh trong khoảng từ 1000 cm-1 đến 1600 cm-1. Các

đỉnh tán xạ đặc trƣng của các phân tử 4-ATP có trên bề mặt của các hạt nano không

còn thấy rõ, có thể là khi chức năng hóa, lƣợng phân tử 4-ATP chƣa đƣợc gắn nhiều lên trên bề mặt của các hạt Fe3O4-Ag. Tuy nhiên, dải tán xạ Raman từ 1000 cm-1 đến 1600 cm-1 cũng đƣợc dùng để nghiên cứu đặc trƣng của các liên kết hữu cơ có trên

bề mặt tế bào [34]. Cộng hƣởng plasmon tại bề mặt của lớp nano Ag trên các hạt

nano Fe3O4-Ag đã làm tăng cƣờng độ tán xạ của các protein này lên. Với thời gian

đo 30s, ta hoàn toàn có thể phân biệt đƣợc vị trí của các tế bào CD34+ với các vị trí

khác.

4.2.2.4. Đo đạc nồng độ tế bào bằng phương pháp điện

Đồ thị tổng trở - thƣờng đƣợc vẽ ở dạng sự phụ thuộc của phần ảo của tổng

trởIm(Z) vào phần thực của tổng trở Re(Z) (biểu đồ Nyquist)- đƣợc chia làm hai phần

khá rõ rệt. Một phần có dạng một nửa hình tròn nằm phía trên phần tƣ thứ nhất của

không gian Oxy ứng với các giá trị tần số lớn (f > 5 kHz) và tổng trở nhỏ (hình

4.23A). Ở phần thứ hai, các giá trị Im(Z) và Re(Z) lớn hơn ứng với giá tần số nhỏ (f <

4 kHz) có dạng đƣờng thẳng, đƣợc bàn đến gắn liền với quá trình khuếch tán, trao

115

đổi điện tích trên bề mặt điện cực của các ion có trong dung dịch.Nhƣ trong phần

1.2.2.1, khi quá trình khuếch tán xảy ra rất chậm, thì công thức của Randles suy biến

và dạng của biểu đồ Nyquist trở thành đƣờng thẳng tuyến tính – đƣờng “pha hằng

số” hay “constant phase”, CPE. Khi bề mặt điện cực đƣợc cố định, các ion trong

dung dịch cũng không đổi; nồng độ tế bào không ảnh hƣởng gì đến bản chất của

dung môi thì quá trình khuếch tán này không đổi, dẫn tới các đƣờng phụ thuộc tuyến

tính của Im(Z) vào Re(Z) luôn song song với nhau (hình 4.23B). Điều này cũng

chứng tỏ các tế bào vẫn chƣa lắng xuốngtrong suốt quá trình đo, vì vậy, không tƣơng

tác với bề mặt điện cực.

Hình 4.23. Kết quả phép đo tổng trở trên hệ điện cực đã thiết kế với các nồng độ tế bào lần lượt là C0/5, C0/10, C0/20 và C0/50. Hình A kết quảtổng trở đo được tại khoảng tần số cao (f> 4kHz).Hình B là kết quả tổng trở tại tần số thấp (f< 5kHz) – khi quá trình khuếch tán trên bề mặt được biểu hiện rõ.

Để mô hình hóa lại sự phụ thuộc của giá trị tổng trở vào nồng độ tế bào, luận

án đƣa ra mô hình ứng với các tế bào nằm lơ lửng và phân bố đều trong dung dịch.

Thể tích chiếm chỗ của mỗi một tế bào sẽ phụ thuộc vào nồng độ của tế bào và phần

116

chiếm chỗ này có dạng một khối lập phƣơng với 3 cạnh là a. Ta có thể tích chiếm

chỗ của một tế bào là: . Trong khuôn khổ của khối lập phƣơng có 3 cạnh

là a này, do nồng độ tế bào rất thấp nên thể tích của tế bào là không đáng kể. Vì vậy,

ta hoàn toàn có thể áp dụng mô hình đơn giản nhất cho tổng trở của một tế bào đó là

hệ tụ - trở mắc song song [53,128]. Ta gọi một ô này là một ô cơ sở (hình 4.24).

Hình 4.24. Mô hình tổng trở của phần thể tích chiếm chỗ của 1 tế bào (ô cơ sở)

Nhƣ đã mô tả trong hình 4.21, mỗi một ô cơ sở – phần thể tích

chiếm chỗ của một tế bào sẽ có mạch điện tƣơng đƣơng là cs//(rs nt (Ctb//Rtb)). Trong

đó rs, cs là điện trở và điện dung của phần dung dịch có thể tích V0, Rtb, Ctb là điện trở

và điện dung tƣơng đƣơng của một tế bào. Ký hiệu “//” và “nt” là biểu hiện hai phần

tử mắc song song và nối tiếp. Nếu dung dịch đƣợc chứa giữa hai điện cực đối song

và có tổng thể tích là V thì ta có thể chia dung dịch thành m× n phần có thể tích V0

sao cho mỗi thể tích V0 đều chứa một tế bào – với m chia theo diện tích của điện cực

117

(A) và n chia theo khoảng cách giữa hai điện cực (d); V = S × d. Ta có ,

và toàn bộ dung dịch tƣơng đƣờng với m hệ mắc song song, mỗi hệ có n ô cơ sở mắc

nối tiếp (hình 4.25).

Nhận thấy, do vai trò của các cụm ô cơ sở giống nhau, nên dòng điện đi qua

các tụ điện cs có bằng nhau. Tƣơng tự, dòng điện đi qua các rs cũng bằng nhau. Ta có

thể tách tất cả các tụ điện csthành một cụm có giá trị Cs – tƣơng đƣơng với m cụm

mắc song song, mỗi cụm có ncs mắc nối tiếp. Csnày cũng chính là giá trị điện cung

của toàn bộ dung dịch khi không có tế bào.

Hình 4.25. Mô hình mạch tương đương của dung dịch chứa tế bào được để giữa hai điện cực đối song. Tổng thể tích của dung dịch là V được chia thành m × n thể tích V0 – thể tích ô cơ sở chứa một tế bào; với m là số ô chia theo mặt song song với bề mặt điện cực, n là số ô chia dọc theo khoảng cách giữa hai điện cực.

Phần còn lại là một cụm tƣơng đƣơng có tổng trở Z là một hệ gồm có m cụm

mắc song song, mỗi cụm có n hệ z = (rs nt (Ctb//Rtb). Ta sẽ tính toán phần này. Đầu

tiên, giá trị của z đƣợc tính toán dựa vào rs, Ctb và Rtb, nhận đƣợc:

(4.2)

Từ đó, ta có thể tính đƣợc Z(ω):

118

(4.3)

Nếu K là hệ số hiệu chỉnh giữa điện cực dạng tròn sang điện cực dạng đối

song. V lúc này là thể tích của giọt dung dịch nhỏ vào và d là khoảng cách giữa hai

điện cực. Thay và - là điện trở của dung dịch khi không có tế bào

– vào 4.3 ta có:

(4.4)

Đặt và ta có:

(4.5)

Có thể thấy tổng trở Z tƣơng đƣơng với mạch Rs nt (RC//CC), trong đó RC và

CC phụ thuộc vào nồng độ của tế bào. Tổng trở của hệ bao gồm dung dịch chứa tế

bào tƣơng đƣơng với Cs//(Rs nt (RC//CC)) nhƣ mô tả trong hình 4.26.

Hình 4.26. Mô hình mạch tương đương của phần dung dịch chứa tế bào. Rs, Cs là điện trở và điện dung của dung dịch khi không có tế bào. RC, CC là hai điện trở hiệu dụng phụ thuộc vào nồng độ và bản chất của tế bào.

Phương pháp xử lý số liệu

Phƣơng pháp tính toán kể trên đã bỏ qua phần tổng trở gây ra bởi quá trình

khuếch tán ion của dung dịch lên bề mặt điện cực. Nhƣ thảo luận trong phần 4.3.2.4,

khi tần số dòng điện nhỏ (f < 4 kHz), biểu hiện của quá trình ion khuếch tán và trao

đổi điện tử trên bề mặt điện cực là đáng kể - ứng với khu vực giá trị của phần tử “pha

hằng số” – CPE lớn. Thành phần trở kháng này không thay đổi khi nồng độ tế bào

119

thay đổi, chứng tỏ quá trình trao đổi ion trên bề mặt điện cực không bị ảnh hƣởng bới

nồng độ tế bào; vì vậy, ta không khảo sát kỹ phần này mà chỉ khảo sát sự thay đổi

của tổng trở dung dịch chứa tế bào. Dữ liệu đo đƣợc tại các tần số dòng điện lớn (f >

5kHz) đƣợc sử dụng để khớp vào mô hình mạch tƣơng đƣơng Cs//(Rs nt (RC//CC))

(hình 4.23). Chƣơng trình dùng để khớp EIS Spectrum Analyser đƣợc sử dụng miễn

phí từ trang web http://www.abc.chemistry.bsu.by/vi/analyser/.

Hình 4.27. Kết quả khớp số liệu đo tổng trở với mô hình mạch tương đương của mẫu chứa tế bào nồng độ C0/5.

Số liệu cần đƣợc chuyển thành dạng số liệu phù hợp với chƣơng trình bao

gồm: dòng đầu tiên ghi số điểm thí nghiệm; từ dòng thứ hai trở đi là dữ liệu đƣợc

chia thành 3 cột: Re(Z), Im(Z) và f (Giá trị thực, giá trị ảo của trở kháng và tần số).

Mạch tƣơng đƣơng đƣợc thiết kế và tiến hành khớp sao cho khoảng cách giữa các

điểm thực nghiệm và đƣờng khớp là tối thiểu. Hình 4.27 mô tả kết quả khớp số liệu

đo tổng trở trên mẫu C0/5. Đƣờng khớp rất phù hợp với số liệu thực nghiệm, trong đó

điện trở Rs và điện dung của dụng dịch Cs có các giá trị 670,7 Ω ( ± 1,6%) và 223,1

120

pF (± 1,7%) rất phù hợp với kết quả đo đƣợc khi không có tế bào.

Tƣơng tự vậy, ta tiến hành khớp số liệu đo đƣợc trên các nồng độC0/5, C0/10,

C0/20 và C0/50. Bảng 4.2 thống kê lại các tham số RC và CC sau khi khớp, ứng với

đó là nồng độ tế bào tính đƣợc từ phƣơng pháp đếm trên buồng đếm của các mẫu

C0/5, C0/10, C0/20 và C0/50. Hình 4.28 biểu diễn kết quả khớp đối với các mẫu.

Bảng 4.2.Bảng các tham số fit được từ các kết quả đo tổng trở

Nồng độ (tế bào.cm-1)

và

vào các thông

C (103 tế bào/μL) 58,6 29,3 14,7 5,9 38,8 30,8 24,5 18,0 RC (Ω) 168,7 ± 7,5 219,3 ± 6,4 287,1 ± 6,6 364,4 ± 8,5 CC (nF) 4,65 ± 0,20 4,61 ± 0,13 3,21 ± 0,10 2,38 ± 0,07 Tên mẫu C0/5 C0/10 C0/20 C0/50

Hình 4.28. hình biểu diễn kết quả fit hai hàm số đo được – khoảng dữ liệu lấy để fit [5:50] kHz.

121

Hình 4.29 biểu diễn sự phụ thuộc của nghịch đảo điện trở tƣơng đƣơng - ,

ứng với độ dẫn σ của dung dịch (hình A) và cảm kháng tƣơng đƣơng CC vào

(hình B).Ở đây, đơn vị của nồng độ là [tế bào/μL] nên đơn vị tƣơng đƣơng của là

[tế bào/cm hay tế bào.cm-1], là nồng độ tế bào theo chiều dài. Nhận thấy các điểm thí

nghiệm đều có xu thế nằm trên một đƣờng tuyến tính, phù hợp với mô hình đề xuất

trong luận án. Trên hình 4.29B, điểm thực nghiệm ứng với nồng độ tế bào C0/5cho

thấy giá trị CC tƣơng đƣơng nhỏ hơn, có thể là do kích thƣớc của tế bào có gây ảnh

).

hƣởng đến giá trị cảm kháng tƣơng đƣơng khi nồng độ tế bào lớn.

Hình 4.29. Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của các giá trị trở tương đương 1/RC (hình A) và CC (hình B) vào nồng độ tế bào theo chiều dài (

Từ 4.5 ta có và . Khớp các số liệu

thí nghiệm từ hình 4.27A và 4.27B với đƣờng thẳng tuyến tính đi qua gốc tọa độ, ta

nhận đƣợc các hệ số tuyến tính lần lƣợt là và . Ta có k1 =

14,8 × 10-5 ± 0,2 × 10-5 (S/tế bào.cm-1)và k2 = 0,13 ± 0,01 (nF/tế bào.cm-1) – S:

122

Siemens đơn vị độ dẫn. Có thể nhận thấy, trong khoảng đo đạc, việc sử dụng độ dẫn

cho sai số ít hơn – 1,4%. Dựa vào việc khớp mạch tƣơng đƣơng, ta nhận đƣợc sai số trung bình của độ dẫn (∆σ) là 6,4 × 10-5 (S). Sai số này lớn hơn rất nhiều sai số do hệ

đo, đƣợc cấu thành từ các lần làm thí nghiệm độc lập với nhau, cũng biểu hiện tới

hạn có thể phân biệt đƣợc hai mẫu đo. Từ đây, ta có thể tính đƣợc giới hạn phát hiện của phép đo là ∆C = ∆σ/k1 ~0,4 tế bào.cm-1. Nghĩa là trong khoảng đã khảo sát ~ [18,40] tế bào.cm-1 nồng độ theo chiều dài, hệ đo có thể nhận biết đƣợc khi thêm 1 tế

bào theo chiều dài (tƣơng đƣơng với 130 tế bào/µL – nếu ta coi mỗi cạnh còn lại của

buồng chứa có 18 tế bào). Cùng phƣơng pháp thí nghiệm, đó là phân lập tế bào một

cách đặc hiệu, sau đó đo tổng trở, giới hạn phát hiện của nghiên cứu này vẫn còn cao

hơn so với kết quả đƣợc nhóm nghiên cứu của Wang [121] công bố năm 2017 (của Wang là 1,6 × 103 tế bào/mL). Điều này đƣợc giải thích bởi cấu trúc điện cực của

nhóm Wang phức tạp hơn – là một chuỗi các điện cực đồng tâm xen kẽ nhau dạng

răng lƣợc, vì vậy nên diện tích điện cực cũng nhƣ khoảng cách giữa các điện cực nhỏ

hơn rất nhiều so với điện cực đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này. Việc tăng độ nhạy

của phép đo có thể tiếp tục phát triển khi chúng ta thay đổi vi cấu trúc của điện cực.

Tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Wang [121], luận án đã đề xuất ra phƣơng pháp

sử dụng các hạt nano có từ tính để phân lập các tế bào lơ lửng và sử dụng tổng trở để

xác định hàm lƣợng tế bào. Nếu nhƣ nhóm của Wang tiến hành trên các tế bào khuẩn

Listeriasp., thì nghiên cứu này thực hiện trên các tế bào gốc máu. Phƣơng pháp này

đƣợc đánh giá là đơn giản và ít chi phí hơn so với các phƣơng pháp hiện đang đƣợc

sử dụng để xác định hàm lƣợng tế bào gốc máu là phân lập tế bào kích hoạt huỳnh

quang kết hợp dòng chảy (Cytometry FACS). So với nhóm của Wang, luận án đƣa

thêm lớp nano bạc có khả năng cho tín hiệu Raman tăng cƣờng bề mặt; vì thế bổ

sung thêm chức năng theo dõi, chụp ảnh tế bào trong quá trình khảo sát.

KẾT LUẬN CHƢƠNG IV

Nhƣ vậy, chƣơng 4 trình bày các kết quả ứng dụng các vật liệu nano PbS và

123

Fe3O4-Ag để chế tạo các cảm biến sinh học. Hai cơ chế nhận biết đặc hiệu sinh học,

lần lƣợt enzyme – cơ chất và kháng nguyên – kháng thể, đƣợc trình bày trên hai đối

tƣợng khác nhau:

(i) Đối tƣợng đầu tiên là glucose. Phần tử nhận biết sinh học đặc hiệu là

các phân tử enzyme glucose oxidase (GOx). Các hạt nano PbS đƣợc sử dụng để làm

vật liệu chuyển tiếp tín hiệu, gắn kết với các phân tử GOx, dẫn tới tăng cƣờng khả

năng trao đổi điện tử giữa glucose và điện cực trong quá trình ô xi hóa glucose thành

glucolactone. Độ nhạy cao nhất của cảm biến, đƣợc đo bằng tỉ lệ cƣờng độ điện hóa

tại 1,14V ứng với quá trình ô xi hóa của PbS thành PbSO2 với nồng độ glucose, đạt 546,2 ± 24,6 μAcm-2mM-1.

(ii) Đối tƣợng thứ hai là các tế bào gốc máu CD34+. Nguyên lý kháng

nguyên – kháng thể đƣợc áp dụng. Các kháng thể đặc hiệu là các phân tử antiCD34,

sau khi đƣợc cố định lên bề mặt các hạt đa chức năng từ tính – kim loại Fe3O4-Ag,

hƣớng đích các hạt nano bám vào bề mặt tế báo gốc máu CD34+, biến các tế bào

thành các tiểu cầu micro có từ tính. Sau khi sử dụng từ trƣờng ngoài để phân lập các

tế bào CD34+ có đính các hạt Fe3O4, tán xạ Raman đƣợc sử dụng để khảo sát khả

năng phân biệt vị trí có các tế bào với các vị trí không có tế bào. Bên cạnh đó, tín

124

hiệu đo tổng trở đƣợc sử dụng để khảo sát nồng độ tế bào. Độ dẫn của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ tế bào. Độ nhạy của cảm biến đạt14,8×10-5± 0,2×10-5 (S/tế bào.cm-1).

KẾT LUẬN

Luận án tập trung nghiên cứu chế tạo một số vật liệu nano bán dẫn, nano kim

loại, và vật liệu đa chức năng từ tính – kim loại nhằm ứng dụng để chế tạo các cảm

biến sinh học để xác định nồng độ glucose và tế bào.

(i) Chế tạo vật liệu nano PbS, nano Au và vật liệu nano đa chức năng từ

tính kim loại Fe3O4-Au, Fe3O4-Ag

a. Đã chế tạo thành công các hạt nano PbS bằng phƣơng pháp hóa siêu

âm.Các hạt nano PbScó dạng lập phƣơng và dạng thanh với kích thƣớc chiều ngang

khoảng 23 nm; đƣợc cấu thành từ tập hợp các hạt đơn tinh thể nhỏ có kích thƣớc 3-4

nm.

b. Đã chế tạo thành công vật liệu nano Au bằng phƣơng pháp nuôi mầm

trong môi trƣờng nuôi chứa chất hoạt hóa CTAB. Các hạt nano Au đồng đều và có

kích thƣớc trung bình 23,6 ± 1,2 nm.

c. Đã chế tạo thành công các hạt nano đa chức năng từ tính – kim loại

bằng phƣơng pháp hóa trong môi trƣờng ái nƣớc. Các hạt Fe3O4-Au có kích thƣớc

25-35 nm và các hạt Fe3O4-Ag có kích thƣớc 30-80nm.

(ii) Ứng dụng vật liệu PbS và Fe3O4-Ag trong chế tạo cảm biến sinh học

a. Đã sử dụng vật liệu nano PbS trong chế tạo cảm biến sinh học xác định

nồng độ glucose trong dung dịch. Độ nhạy cao nhất của cảm biến đạt 546,2 ± 24,6 μAcm-2mM-1.

Bằng phƣơng pháp tính toán, các hạt nano PbS đƣợc chứng minh là đính

với các gốc chứa lƣu huỳnh của phân tử GOx, làm tăng quá trình trao đổi điện tích

giữa GOx tới bề mặt điện cực, dẫn đến làm tăng độ nhạy của cảm biến.

125

b. Đã sử dụng các hạt nano Fe3O4-Ag trong chế tạo cảm biến sinh học đo nồng độ tế bào gốc máu từ mẫu tủy xƣơng.Độ nhạy của cảm biếnlà 14,8 × 10-5 ± 0,2× 10-5 (S/tế bào.cm-1).

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Luu Manh Quynh, Chu Tien Dung, Bach Thi Mai, Hoang Van Huy, Nguyen

Quang Loc, Nguyen Quang Hoa, Pham Tuan Thach, Bui Viet Anh, Chu Thi

Thao, Nguyen Hoang Nam, Hoang Thi My Nhung, Nguyen Ngoc Long, Le Van

Vu (2018), “Development of Fe3O4/Ag core/shell-based multifunctional

immunomagnetic nanoparticles for isolation and detection of CD34+ stem

cells”Journal of Immunoassay and Immunochemistry 39(3), pp. 308-322.

2. Cong Doanh Sai, Manh Quynh Luu, Van Vu Le, Phuong Mai Nguyen, Nguyen

Hai Pham, Viet Tuyen Nguyen, Xuan Quy Nguyen, Quoc Khoa Doan, Thi Ha

Tran (2017), “Fast Synthesis of PbS Nanoparticles for Fabrication of Glucose

Sensor with Enhanced Sensitivity”, Journal of Electronic Materials 46(6), pp.

3674-3680.

3. Nguyen Thuy Trang, Luu Manh Quynh, Tran Van Nam, Hoang Nam Nhat

(2013), “Charge transfer at organic-inorganic interface of surface-activated PbS

by DFT method”, Surface Science 608, pp 67-73.

4. Luu Manh Quynh, Nguyen Hoang Nam, K. Kong, Nguyen Thi Nhung, I.

Notingher, M. Henini, Nguyen Hoang Luong (2016), “Surface-Enhanced Raman

Spectroscopy Study of 4-ATP on Gold Nanoparticles for Basal Cell Carcinoma

Fingerprint Detection”, Journal of Electronic Materials 45(5), pp. 2563-2568.

5. Luu Manh Quynh, Nguyen Minh Hieu, Nguyen Hoang Nam (2014), “Fast DNA

diagnostic using Fe3O4 magnetic nanoparticles and light emitting ZnS/Mn

nanoparticles”, VNU Journal of Science: Mathematics – Physics 30(3), pp. 1-11.

6. Sai Cong Doanh, Luu Manh Quynh (2015) “Highly sensitive enzyme based

glucose sensor using lead sulfide nanocrystals”, VNU Journal of Science:

126

Mathematics – Physics 31(2), pp. 61-67.

Tài liệu tham khảo

1. Ahmad M., Pan C., Luo Z., Zhu J. (2010), “A Single ZnO Nanofiber-Based Highly Sensitive Amperometric Glucose Biosensor”, The Journal of Physical Chemistry C 114, pp. 9308–9313.

2. Ahmad R., Tripathy N., Kim J. H., Hahn,Y. B. (2012), “Highly selective wide linear- range detecting glucose biosensors based on aspect-ratio controlled ZnO nanorods directly grown on electrodes”, Sensors and Actuators B 174, pp. 195–201.

3. Ahn T., Kim J. H., Yang H. M., Lee J. W., Kim J. D. (2012), “Formation Pathways of Magnetite Nanoparticles by Coprecipitation Method”, The Journal of Physical Chemistry C 116, pp. 6069-6076.

bone marrow”, British Journal of Heamatology 114, pp. 201–210.

generation DTP

conducting

type

new

via

4. Allen J. E., Henshaw D. L. (2001), “An in situ study of CD34+ cells in human fetal

5. Azak H., Kurbanoglu S., Yildiz H. B., Ozkan S. A. (2016), “Electrochemical glucose polymers/gold biosensing nanoparticles/glucose oxidase modified electrodes”, Journal of Electroanalytical Chemistry 770, pp. 90-97.

6. Bachurin, L. V.; Kolesov, V. I.; Konovalov, A. N.; Ul'yanov, V. A.; Yudin, N. V. (2018), “Heating of Energetic Materials by Continuous-Wave Near-IR Laser Irradiation”, Combustion, Explosion, and Shock Waves 54(4), pp. 461-471.

Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology 44, pp. 248-262.

7. Bahadır E. B., Sezginturk M. K. (2016), “A review on impedimetric biosensors”,

Nanostructured Materials”, Materials Views 22, pp. 1039–1059.

8. Bang J. H., Suslick K. S. (2010), “Applications of Ultrasound to the Synthesis of

9. Brooimans R. A., Kraan J., van Putten W., Cornelissen J. J., Lowenberg B., Gratama J. W. (2009), “Flow Cytometric Differential of Leukocyte Populations in Normal Bone Marrow: Influence of Peripheral Blood Contamination”, Cytometry Part B 76B, pp. 18–26.

properties of PbS nanocubes”, Nanotechnology 17, pp. 3280–3287.

10. Cao H., Wang G., Zhang S., Zhang X. (2006), “Growth and photoluminescence

11. Cass A. E., Graham D., Francis G. D., Hill H. A. (1984), “Ferrocene-Mediated Enzyme Electrode for Amperometric Determination of Glucose”, Analytical Chemistry 56, pp. 667-671.

(2002), “Mediated biosensors”, Biosensors and

12. Chambers J. P., Arulanandam B. P., Matta L. L., Weis A., Valdes J. J. (2008), “Biosensor Recognition Elements”, Current Issues in Molecular Biology 10, pp. 1-12. 13. Chang C. C., Wu H. L., Kuo C. H., Huang M. H. (2008), “Hydrothermal Synthesis of Monodispersed Octahedral Gold Nanocrystals with Five Different Size Ranges and Their Self-Assembled Structures”, Chemistry of Materials 20, pp. 7570-7574.

127

14. Chaubey A., Malhotra B. Bioelectronics 17, pp. 441-456.

15. Chen A., Lipkowski J. (1999), “Electrochemical and Spectroscopic Studies of Hydroxide Adsorption at the Au(111) Electrode”, The Journal of Physical Chemistry B 103, pp. 682-691.

Biotechnology Advances 22, pp. 505–518.

16. Chen J., Miao Y., He N., Wu X., Li S. (2004), “Nanotechnology and Biosensors”,

17. Chen J., Zhu R., Huang J., Zhang M., Liu H., Sun M. và những tác giả khác (2015), “A glucose biosensor based on glucose oxidase immobilized on three-dimensional porous carbon electrodes”, Analyst 140, pp. 5578-5584.

18. Chen J., Pang S., He L., Nugen S. R. (2016), “Highly sensitive and selective detection of nitrite ions using Fe3O4@SiO2/Au magnetic nanoparticles by surface-enhanced Raman spectroscopy”, Biosensors and Bioelectronics 85, pp. 726–733.

19. Chen Y., Li Y., Sung D., Tian D., Zhang J., Zhu J. J. (2011), “Fabrication of gold nanoparticles on bilayer graphene for glucose electrochemical biosensing”, Journal of Materials Chemistry 21, pp. 7604-7611.

20. Chi L.B., Pratt M. H. (2018), “Toward the Development of a Glucose Dehydrogenase- Based Saliva Glucose Sensor Without the Need for Sample Preparation”, Journal of Diabetes Science and Technology 12(1), pp. 83-89.

21. Chu V. T., Tran Q. H., Nguyen V. H., Mai A. T., Tran T. (2013), “Polyaniline Nanowires-Based Electrochemical Immunosensor for Label Free Detection of Japanese Encephalitis Virus”, Analytical Letters 46, pp. 1229–1240.

22. Cuharuc A. S., Kulyuk L. L., Lascova R. I., Mitioglu A. A., Dikusar A. I. (2012), “Electrochemical Characterization of PbS Quantum Dots Capped with Oleic Acid and PbS Thin Films – a Comparative Study”, Surface Engineering and Applied Electrochemistry 48, pp. 193–211.

and its application in an amperometric glucose sensor”, Biosensors 2, pp. 71-87.

23. D’Costa E. J., Higgins I. J., Turner A. P. (1986), “Quinoprotein glucose dehydrogenase

24. Das R. D., Mondal N., Das S., RoyChaudhuri C. (2012), “Optimized Electrode Geometry for an Improved Impedance Based Macroporous Silicon Bacteria Detector”, IEEE Sensor Journal 12, pp. 1868-1877.

25. De Wynter E. A., Coutinho L. H., Pei X., Marsh J. C., Hows J., Luft T., và những tác giả khác (1995), “Comparison of purity and enrichment of CD34+ cells from bone marrow, umbilical cord and peripheral blood (primed for apheresis) using five separation systems”, Stem Cells 13, pp. 524-532.

26. Deeg R., Kraemer W., Ziegenhorn J. (1980), “Kinetic Determination of Serum Glucose by Use of the Hexokinase/Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Method”, Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 18, pp. 49-52.

128

27. Devkota J., Wingo J., Mai T. T., Nguyen X. P., Huong N. T., Mukherjee P., và những tác giả khác (2014), “A highly sensitive magnetic biosensor for detection and quantification of anticancer drugs tagged to superparamagnetic nanoparticles”, Journal of Applied Physics 115, pp. 17B503-1-3.

28. Diaz-Diestra D., Thapa B., Beltran-Huarac J., Weiner B. R. (2017), “L-cysteine capped ZnS:Mn quantum dots for room-temperature detection of dopamine with high sensitivity and selectivity”, Biosensors and Bioelectronics 87, pp. 693-700.

29. Ding L., Ji Q., Qian R., Cheng W., Ju H. (2010), “Lectin-based nanoprobes functionalized with enzyme for highly sensitive electrochemical monitoring of dynamic carbohydrate expression on living cells”, Analytical Chemistry 82, pp. 1292–1298. 30. Do T. N., Phi V. T., Nguy P. T., Wagner P., Eersels K., Vestergaard M. C., và những tác giả khác (2017), “Anisotropic In Situ-Coated AuNPs on Screen-Printed Carbon Surface for Enhanced Prostate-Specific Antigen Impedimetric Aptasensor”, Journal of Electronic Materials 46(6), pp. 3542-3552.

31. Dung C. T., Doanh S. C., Quynh L. M., Hong T. T., Truong D. Q., Dong H. K., và các tác giả khác (2017), “Synthesis of Bifunctional Fe3O4@SiO2-Ag Magnetic–Plasmonic Nanoparticles by an Ultrasound Assisted Chemical Method”, Journal of Electronic Materials 46(6), pp. 3646–3653.

immunotherapy: mapping the way”, Nature Medicine 10, pp. 475-480.

32. Figdor C. G., de Vries I. J., Lesterhuis W. J., Melief C. J. (2004), “Dendritic cell

33. Gniadecka M., Philipsen P. A., Sigurdsson S., Wessel S., Nielsen O. F., Christensen D. H., và các tác giả khác (2004), “Melanoma Diagnosis by Raman Spectroscopy and Neural Networks: Structure Alterations in Proteins and Lipids in Intact Cancer Tissue”, Journal of Investigative Dermatology 122, pp. 443 –449.

34. Gniadecka M., Wulf H. C., Nielsen O. F., Christensen D. H., Hercogova J. (1997), “Distinctive Molecular Abnormalities in Benign and Malignant Skin Lesions: Studies by Raman Spectroscopy”, Photochemistry and Photobiology 66(4), pp. 418-423.

35. Gubicza J., Labar J. L., Quynh L. M., Nam N. H., Luong, N. H. (2013), “Evolution of size and shape of gold nanoparticles during long-time aging”, Materials Chemistry and Physics 138, pp. 449-453.

36. Guo S., Chen Y. Q., Lu N. N., Wang X., Xie M., Sui W. P. (2014), “Ultrasonication- assisted one-step self-assembly preparation of biocompatible fluorescent-magnetic nanobeads for rare cancer cell detection”, Nanotechnology 25, pp. 505603.

37. Hai N. N., Chinh V. D., Thuy U. T., Chi T. K., Yen N. H., Cao D. T., và những tác giả khác (2013), “Detection of the pesticide by functionalised quantum dots as fluorescence-based biosensor”, International Journal of Nanotechnology 10, pp. 137- 145.

38. Haiss W., Thanh N. T., Aveyard J., Fernig D. G. (2007), “Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra”, Analytical Chemistry 79, pp. 4215-4221.

129

39. Harada M., Katagiri E. (2010), “Mechanism of Silver Particle Formation during Photoreduction Using In Situ Time-Resolved SAXS Analysis”, Langmuir 26(23), pp. 17896-17905.

40. Hecht H. J., Schomburg D., Kalisz H., Schmid R. D. (1993), “The 3D structure of glucose oxidase from Aspergillus niger. Implications for the use of GOD as a biosensor enzyme”, Biosensors and Bioelectronics 8, pp. 197-203.

41. Hsiao M. W., Adzic R. R., Yeager E. B. (1996), “Electrochemical Oxidation of Glucose on Single Crystal and Polycrystalline Gold Surfaces in Phosphate Buffer”, Journal of the Electrochemical Society 143, pp. 759-767.

42. Huang X., Sayed M. A. (2010), “Gold nanoparticles: Optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy”, Journal of Advanced Research 1, pp. 13-28.

43. HuangY. F., Zhu H. P., Liu G. K., Wu D. Y., Ren B., Tian Z. Q. (2010), “When the Signal Is Not from the Original Molecule To Be Detected: Chemical Transformation of para-Aminothiophenol on Ag during the SERS Measurement”, Journal of the American Chemical Society 132, pp. 9244–9246.

44. Iqbal M. A., Gupta S. G., Hussaini S. S. (2012), “A Review on Electrochemical Biosensors: Principles and Applications”, Advances in Bioresearch 3(4), pp. 158 - 163. 45. Jain P. K., Lee K. S., El-Sayed I. H., El-Sayed M. A. (2006), “Calculated Absorption and Scattering Properties of Gold Nanoparticles of Different Size, Shape, and Composition: Applications in Biological Imaging and Biomedicine”, The Journal of Physical Chemistry B 110, pp. 7238-7248.

46. Jiang Y., Huo S., Mizuhara T., Das R., Lee Y. W., Hou S., và những tác giả khác (2015), “The Interplay of Size and Surface Functionality on the Cellular Uptake of Sub- 10 nm Gold Nanoparticles”, ACS Nano 9(10), pp. 9986-9993.

4-aminothiophenol/Au

monolayer”,

on

derivatization Communications 7, pp. 219-222.

47. Jiao L. S., Niu L., Shen J., You T., Dong S., Ivaska A. (2005), “Simple azo Electrochemistry

Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 106, pp. 173-193.

48. Kamihira M., Kumar A. (2007), “Development of separation technique for stem cells”,

49. Karam P., Xin Y., Jaber S., Halaoui, L. I. (2008), “Active Pt Nanoparticles Stabilized with Glucose Oxidase”, The Journal of Physical Chemistry C 112, pp. 13846–13850. 50. Karoonian F. S., Etesami M., Mohamed N. (2012), “Facile electrogenerative deposition of Au nanoparticles on a reticulated vitreous carbon electrode at various pH values for the electrooxidation of ethanol”, Chemija 4, pp. 269–277.

130

51. Kita K., Gauglitz G. G., Phan T. T., Herndon D. N., Jeschke M. G. (2010), “Isolation and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From the Sub-Amniotic Human Umbilical Cord Lining Membrane”, Stem cells and Development 19, pp. 491-502. 52. Kobel S., Valero A., Latt J., Renaud P., Lutolf M. (2010), “Optimization of microfluidic single cell trapping for long-term on-chip culture”, Lab on a Chip 10, pp. 857–863.

53. Krinke D., Jahnke H. G., Panke O., Robitzki A. A. (2009), “A microelectrode-based sensor for label-free in vitro detection of ischemic effects on cardiomyocytes”, Biosensors and Bioelectronics 24, pp. 2798–2803.

54. Kumar D., Mutreja I., Chitcholtan K., Sykes P. (2017), “Cytotoxicity and cellular uptake of different sized gold nanoparticles in ovarian cancer cells”, Nanotechnology doi: 10.1088/1361-6528/aa935e.

55. Kuzyk A., Schreiber R., Fan Z., Pardatscher G., Roller E. M., Hogele A., và những tác giả khác. (2012), “DNA-based self-assembly of chiral plasmonic nanostructures with tailored optical response”, Nature 483, pp. 311-314.

56. Kwizera E. A., Chaffin E., Shen X., Chen J., Zou Q., Wu Zh., Gai Zh., Bhana S., O'Connor R. T., Adhikari H., Mishra S. R., Wang Y., Huang X. (2016), “Size- and Shape-Controlled Synthesis and Properties of Magnetic-Plasmonic Core-Shell Nanoparticles”, The Journal of Physical Chemistry C 120(19), pp. 10530–10546.

57. Le M. H., Fradetal L., Delabouglise D., Mai A. T., Stambouli V. (2015), “Fluorescence and Label Free Impedimetric DNA Detection on SnO2 nanopillars”, Electroanalysis 27, pp. 1-10.

58. Le T. H., Le T. T., Vu N. P., Tran T., Le M. T., Doan T. N., và những tác giả khác (2016), “Effect of Synthesis Parameters on the Structure and Magnetic Properties of Magnetic Manganese Ferrite/Silver Composite Nanoparticles Synthesized by Wet Chemistry Method”, Journal of Nanoscience and Nanotechnology 16, pp. 7919–7928. 59. Le T. H., Le T. T., Tran V. S., Nguyen D. C., Man H. C., Le K. V., và những tác giả khác (2017), “Photochemical Decoration of Silver Nanocrystals on Magnetic MnFe2O4 Nanoparticles and Their Applications in Antibacterial Agents and SERS-Based Detection”, Journal of Electronic Materials 46(6), pp. 3412–3421.

60. Le T. T., Tran P. D., Pham X. T., Tong D. H., Dang M. C. (2010), “Glucose oxidase immobilization on different modified surfaces of platinum nanowire for application in glucose detection”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 1, pp. 035004 .

61. Le V. V., Sai C. D., Le T. N., Long N. N. (2011), “Properties of PbS Nanocrystals Synthesized by Sonochemical and Sonoelectrochemical Methods”, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology 9, pp. 494-498.

62. Li L., Krymskaya L., Wang J., Henley J., Rao A., Cao L. F., Tran C. A., Coronado M. T., Gardner A., Gonzales N., Kim K. và các tác giả khác (2013), “Genomic Editing of the HIV-1 Coreceptor CCR5 in Adult Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Using Zinc Finger Nucleases”, Molecular Therapy 21, pp. 1259–1269.

63. Li L., Daou T. J., Texier I., Tran T. K., Nguyen Q. L., Reiss, P. (2009), “Highly Luminescent CuInS2/ZnS Core/Shell Nanocrystals: Cadmium-Free Quantum Dots for In Vivo Imaging”, Chemistry of Materials 21, pp. 2422–2429.

and Developmental Biology 21, pp. 605-631.

131

64. Li L., Xie T. (2005), “Stem cell niche: structure and function”, Annual Review of Cell

65. Lin C., Pratt B., Honikel M., Jenish A., Ramesh B., Alkhan A., và những tác giả khác (2017), “Toward the Development of a Glucose Dehydrogenase-Based Saliva Glucose Sensor Without the Need for Sample Preparation”, Journal of Diabetes Science and Technology doi: 10.1177/1932296817712526.

66. Link S., El-Sayed M. A. (1999), “Spectral Properties and Relaxation Dynamics of Surface Plasmon Electronic Oscillations in Gold and Silver Nanodots and Nanorods”, The Journal of Physical Chemistry B 126, pp. 8410-8426.

67. Liu H. C., Tsai C. C., Wang, G. J. (2013), “Glucose biosensors based on a gold nanodendrite modified screen-printed electrode”, Nanotechnology 24, pp. 215101. 68. Liu Q., Lu X., Li J., Yao X., Li J. (2007), “Direct electrochemistry of glucose oxidase and electrochemical biosensing of glucose on quantum dots/carbon nanotubes electrodes”, Biosensors and Bioelectronics 22, pp. 3203–3209.

69. Liu Z. L., Liu Y. J., Yao K. L., Ding Z. H., Tao J., Wang X. (2002), “Synthesis and Magnetic Properties of Fe3O4 Nanoparticles”, Journal of Materials Synthesis and Processing 10(2), pp. 83-87.

70. Loan N. T., Quynh L. M., Dai N. X., Long N. N. (2011), “Electrochemical biosensor for glucose detection using zinc oxide nanotetrapods”, International Journal of Nanotechnology 8, pp. 300-311.

71. Long N. N., Vu L. V., Kiem C. D., Doanh S. C., Nguyet C. T., Hang P. T., và những tác giả khác (2009), “Synthesis and optical properties of colloidal gold nanoparticles”, Journal of Physics: Conference Series 187, pp. 012026.

72. Lv X. J., Zhou G. D., Liu Y., Liu X., Chen J. N., Luo X., và những tác giả khác (2012), “In vitro proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells isolated using anti-CD105 magnetic beads”, International Journal of Molecular Medicine 30, pp. 826-834.

solid solution”, Journal of Physics and Chemistry of Solid 19, pp. 35-50.

73. Lyfshitz I. M., Slyozov V. V. (1961), “The kinetics of precipitation from supersatuated

74. Mahal A., Tandon L., Khullar P., Ahluwalia G. K., Bakshi M. S. (2016), “pH Responsive Bioactive Lead Sulfide Nanomaterials: Protein Induced Morphology Control, Bioapplicability, and Bioextraction of Nanomaterials”, ACS Sustainable Chem. Eng. 5(1), pp. 119–132.

75. Mai A. T., Pham D. T., Chu T. X., Nguyen M. H., Nguyen H. H. (2014), “Highly sensitive DNA sensor based on polypyrrole nanowire”, Applied Surface Science 309, pp. 285-289.

nanoparticles”, Optical Materials46, pp. 522-525.

76. Mamiyev Z. Q., Balayeva N. O. (2015), “Preparation and optical studies of PbS

132

77. Meier M., Harrision M. J., Spalsbury S., McGregor D. S. (2009), “Laser-induced thermomigration of Te precipitates in CdZnTe crystals”, Journal of Crystal Growth 311, pp. 4247-4250.

78. Muthurasu A., Ganesh V. (2016), “Glucose oxidase stabilized fluorescent gold nanoparticles as an ideal sensor matrix for dual mode sensing of glucose”, RSC Advances 6, pp. 7212-7223.

79. Newmann-Spallart M., Lesvy-Clément C., Grabner G. (1994), “Fast annealing of II-IV compounds by pulse laser irradiation”, Journal of Physics D: Applied Physics 27, pp. 407-413.

80. Nghiem, T. H. L.; Le, T. N.; Do, T. H.; Vu, T. T. D.; Do, Q. H.; Tran, H. N. (2013), “Preparation and characterization of silica–gold core–shell nanoparticles”, Journal of Nanoparticles Research 15, pp. 2091.

in

81. Nguyen D. N., Ngo T. T., Nguyen Q. L. (2012), “Highly sensitive fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based nanosensor for rapid detection of clenbuterol”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 3, pp. 035011.

82. Nguyen H. L., Nguyen H. N., Nguyen H. H., Luu M. Q., Nguyen, M. H. (2015), “Nanoparticles: synthesis and applications life science and environmental technology”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 6, pp. 15008.

83. Nguyen, N. L.; Le, V. V.; Chu, D. K.; Sai, C. D.; Cao, T. N.; Pham, T. H.; Nguyen, D. T.; Luu, M. Q. (2009), “Synthesis and optical properties of colloidal gold nanoparticles”, Journal of Physics: Conference Series 187, 012026.

84. Nguyen T. H., Ung T. D., Vu T. H., Trang T. K., Dong V. Q., Dinh D. K., và những tác giả khác (2012), “Fluorescence biosensor based on CdTe quantum dots for specific detection of H5N1 avian influenza virus”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 3, pp. 1-5.

85. Nguyen T. T., Phuong D. T., Mai A. T., Nguyen D. C., Vu V. T. (2013), “Impact parameters investigation of DNA immobilisation process on DNA sensor response”, International Journal of Nanotechnology 10, pp. 146-153.

86. Nguyen V. A., Nguyen L. H., Nguyen T. D., Do P. Q., Tran D. L. (2017), “Electrosynthesized poly(1,5-diaminonaphthalene)/polypyrrole nanowires bilayer as an immunosensor platform for breast cancer biomarker CA 15-3”, Current Applied Physics 17, pp. 1422-1429.

87. Nguyen V. C., Nguyen H. B., Cao T. T., Nguyen V. T., Nguyen L. H., Nguyen T. D., và những tác giả khác (2016), “Electrochemical Immunosensor for Detection of Atrazine Based on Polyaniline/Graphene”, Journal of Materials Science & Technology 32, pp. 539-544.

88. Nguyen V. L., Yong Y., Toshiharu T., Cao M. T., Yanqin C., Masayuki N. (2015), “Biomedical Applications of Advanced Multifunctional Magnetic Nanoparticles”, Journal of Nanoscience and Nanotechnology 15, pp. 10091–10107.

133

89. Niasari M. S., Ghanbari D., Estarki M. R. (2012), “Star-shaped PbS nanocrystals prepared by hydrothermal process in the presence of thioglycolic acid”, Polyhedron 35, pp. 149–153.

90. Niu W. X., Zhang L., Xu G. B. (2012), “Seed-mediated growth method for high- quality noble metal nanocrystals”, Science China Chemistry 55(11), pp. 2311-2317. 91. Ogata T., Nakano Y. (2005), “Mechanisms of gold recoveryfrom aqueous solutions using a novel tannin gel adsorbent synthesized from natural condensed tannin”, Water Research 39, pp. 4281-4286.

92. Osawa M., Matsuda N., Yoshii K., Uchida I. (1994), “Charge transfer resonance Raman process in surface-enhanced Raman scattering from p-aminothiophenol adsorbed on silver: Herzberg-Teller contribution”, Journal of Physical Chemistry 98, pp. 12702–12707.

93. Ouyang L., Zhu L., Jiang J., Tang H. (2014), “A surface-enhanced Raman scattering method for detection of trace glutathione on the basis of immobilized silver nanoparticles and crystal violet probe”, Analytica Chimica Acta 816, pp. 41-49.

94. Palod P. A., Singh V. (2015), “Facile synthesis of high density polypyrrole nanofiber network with controllable diameters by one step template free electropolymerization for biosensing applications”, Sensors and Actuators B 209, pp. 85-93.

95. Pang Y., Wang C., Wang J., Sun Z., Xiao R., Wang S. (2016), “Fe3O4@Ag magnetic nanoparticles for microRNA capture and duplex-specific nuclease signal amplification based SERS detection in cancer cells”, Biosensors and Bioelectronics 79, pp. 574–580. 96. Parvin K., Ma J., Ly J., Sun X. C., Nikles D. E., Sun K., và những tác giả khác. (2004), “Synthesis and magnetic properties of monodisperse Fe3O4 nanoparticles”, Journal of Applied Physics 95(11), pp. 7121-7123.

97. Paulus U., Dreger P., Viehman K., Neuhoff N. V., Schmitz N. (1997), “Purging Peripheral Blood Progenitor Cell Grafts from Lymphoma Cells: Quantitative Comparison of Immunomagnetic CD34+ Selection Systems”, Stem Cells 15, pp. 297- 304.

98. Peeters O. M., Blaton N. M., De Ranter C. J. (1978), “Kinetics and mechanisms of the reaction between thioacetamide and lead(II), cadmium(II), and cobalt(II) ions in acetate buffered solution”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transaction 2 2, pp. 23-26. 99. Pham V. B., Pham X. T., Dang N. T., Le T. T., Tran P. D., Nguyen T. C., và những tác giả khác (2011), “Detection of DNA of genetically modified maize by a silicon nanowire field-effect transistor”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 2, pp. 025010.

100. Pham V. H., Pham D. T., Chu T. X., Nguyen H. H., & Mai A. T. (2017), “Development of a DNA Sensor Based on Nanoporous Pt-Rich Electrodes”, Journal of Electronic Materials46(6), pp. 3491–3498.

101. Phan T. H., Tran P. D., Pham X. T., Dang N. T., NguyenV. L., Tran V. M., và những tác giả khác (2013), “Glucose biosensor based on platinum nanowires: a clinical study”, International Journal of Nanotechnology 10, pp. 166.

and Laboratory Medicine 41, pp. 1213–1219.

134

102. Price C. P. (2003), “Point-of-Care Testing in Diabetes Mellitus”, Clinical Chemistry

metallic nanoparticles”, Journal of Nanoparticle Research 7, pp. 51–57.

103. Qi W. H., Wang M. P. (2005), “Size and shape dependent lattice parameters of

104. Quynh L. M., Tuan T. Q., Luong N. H., Long N. N., Hai N. H., Thoa T. T., và các tác giả khác (2011), “Application of Gold Nanoparticles for Early Detection of Breast Cancer Cells”, e-J. Surf. Sci. Nanotech. 9, pp. 544-547.

105. Richel D. J., Johnsen H. E., Canon J., Guillaume T., Schaafsma M. R., Schenkeveld C., và những tác giả khác (2005), “Highly purified CD34+ cells isolated using magnetically activated cell selection provide rapid engraftment following high-dose chemotherapy in breast cancer patients”, Bone Marrow Transplantation 25, pp. 243– 249.

Escherichia Coli O157:H7 Using Electrochemical Analytical Chemistry 74, pp. 4814-4820.

106. Ruan C., Yang L., Li Y. (2002), “Immunobiosensor Chips for Detection of Impedance Spectroscopy”,

107. Salahuddin S., Porter E., Krewer F., O'Halloran M. (2017), “Optimised analytical models of the dielectric properties of biological tissue”, Medical Engineering and Physics 0, pp. 1-9.

of Chemical Research 41, pp. 130-138.

108. Shamah S. M., Healy J. M., Cload S. T. (2008), “Complex target SELEX”, Account

109. Shen L., Zhou X., Wang A., Yin H., Yin H., Cui W. (2017), “Hydrothermal conversion of high-concentrated glycerol to lactic acid catalyzed by bimetallic CuAux (x = 0.01–0.04) nanoparticles and their reaction kinetics”, RSC Advances 7, pp. 30725- 30739.

110. Shrabani, M.; Rashmi; Prashant, K. S. (2017), “Probing the Shape-Specific Electrochemical Properties of Cobalt Oxide Nanostructures for its Application as Selective and Sensitive Non-Enzymatic Glucose Sensor Non-Enzymatic Glucose Sensor”, Journal of Materials Chemistry C 5, pp. 6497-6506.

111. Shukla M., Pramila Dixit T., Prakash R., Palani A. I., Singh V. (2017), “Influence of aspect ratio and surface defect density on hydrothermally grown ZnO nanorods towards amperometric glucose biosensing applications”, Applied Surface Science 422, pp. 798– 808.

galena PbS”, Journal of Applied Physics 92(8), pp. 4375-4380.

112. Smith G. D., Firth S., Clark R. J. (2002), “First- and second-order Raman spectra of

113. Song M. J., Huang S. W., Whang D. (2009), “Amperometric Glucose Biosensor Based on a Pt-Dispersed Hierarchically Porous Electrode”, Journal of Korean Physical Society 54, pp. 1612-1618.

114. Su S., Sun H., Xu F., Yuwen L., Fan C., Wang L. (2014), “Direct electrochemistry of glucose oxidase and a biosensor for glucose based on a glass carbon electrode modified with MoS2 nanosheets decorated with gold nanoparticles”, Microchim Acta 181, pp. 1497–1503.

135

115. Suslick K. S. (1990), “Sonochemistry”, Science 247, pp. 1439-1445.

Food Science and Technology 50(4), pp. 625–641.

116. Thakur M. S., Ragavan K. V. (2013), “Biosensors in food processing”, Journal of

117. Thévenot R., Toth K., Durst A. R., WilsonS. (1999), “Electrochemical biosensors: recommended deffinitions and classification”, Pure and Applied Chemistry 71(12), pp. 2333-2348.

Oxford University Press.

118. Tuner A. P. (1987), Biosensor: Fundamentals and Applications. New York, USA:

119. Turdean L. G. (2011), “Design and Development of Biosensors for the Detection of Heavy Metal Toxicity”, International Journal of Electrochemistry 2011, ID 343125 pp.1-15.

120. Ung T. D., Tran T. K., Pham T. N., Nguyen D. N., Dinh D. K., Nguyen Q. L. (2012), “CdTe and CdSe quantum dots: synthesis, characterizations and applications in agriculture”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 3, ID 043001 .

121. Wang D., Chen Q., Huo H., Bai S., Cai G., Lai W., và những tác giả khác (2017), “Efficient separation and quantitative detection of Listeria monocytogenes based on screen-printed interdigitated electrode, urease and magnetic nanoparticles”, Food Controll 73, pp. 555-561.

122. Wang H., Wang X., Zhang X., Qin X., Zhao Z., Miao Z., và những tác giả khác (2009), “A novel glucose biosensor based on the immobilization of glucose oxidase onto gold nanoparticles-modified Pb nanowires”, Biosensors and Bioelectronics 25, pp. 142-146.

123. WangW., Ding X., Xu Q., Wang J., Wang L., Lou X. (2016), “Zeta-potential data reliability of gold nanoparticle biomolecular conjugates and its application in sensitive quantification of surface absorbed protein”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 148, pp. 541-548.

System for Rapid Detection of Salmonella Typhimurium”, Sensors 17, pp. 1-15.

124. Wen T., Wang R., Sotero A., Li Y. (2017), “A Portable Impedance Immunosensing

125. Wu X., Luo L., Yang S., Ma X., Li Y., Dong C., và những tác giả khác (2015), “Improved SERSNanoparticles for direct detection of circulating tumor cells in the blood”, ACS Applied Materials and Interfaces 7, pp. 9965–9971.

126. Xia Y., Gilroy K. D., Peng H. C., Xia X. (2017), “Seed-Mediated Growth of Colloidal Metal Nanocrystals, Angewandte Chemie - International Edition 56(1), pp. 60-95.

127. Xu H., Aguilar Z. P., Yang L., Kuang M., Duan H., Xiong Y., và những tác giả khác (2011), “Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood”, Biomaterials 32, pp. 9758–9765.

136

128. Xu Y., Xie X., Duan Y., Wang L., Cheng Z., Cheng J. (2016), “A review of impedance measurements of whole cells”, Biosensors and Bioelectronic 77, pp. 824- 836.

129. Yan W., Xu L., Xu C., Ma W., Kuang H., Wang L., và những tác giả khác (2012), “Self-Assembly of Chiral Nanoparticle Pyramids with Strong R/S Optical Activity”, Journal of American Chemical Society 134, pp. 15114–15121.

130. Yang G., Qin D., Zhang L. (2014), “Controllable synthesis of protein-conjugated lead sulfide nanocubes by using bovine hemoglobin as a capping agent”, Journal of Nanopartical Research 16, pp. 2438.

131. Yang Y., Xu C., Wang X. (2012), “ZnO/Cu Nanocomposite: A Platform for Direct Electrochemistry of Enzymes and Biosensing Applications”, Langmuir 28, pp. 4580−4585.

Practice”, Sensors 10, pp. 4558-4576.

132. Yogeswaran U., Chen S. M. (2008), “A Review on the Electrochemical Sensors and Biosensors Composed of Nanowires as Sensing Material”, Sensors 8, pp. 290-313. 133. Yoo E. H., Lee S. Y. (2010), “Glucose Biosensors: An Overview of Use in Clinical

134. Young J. K., Lewinski N. A., Langsner R. J., Kenedy L. C., Satyanarayan A., Nammalvar V., và những tác giả khác (2011), “Size-controlled synthesis of monodispersed gold nanoparticles via carbon monoxide gas reduction”, Nanoscale Research Letters 6, pp. 428.

135. Zhang J., Lei J., Pan R., Leng C., Hu Z., Ju H. (2011), “In situ assembly of gold nanoparticles on nitrogen-doped carbon nanotubes for sensitive immunosensing of microcystin-LR”, Chemical Communications 47, pp. 668–670.

136. Zhang J., Zhu A., Zhao T., Wu L., Wu P., Hou X. (2015), “Glucose oxidase- directed, instant synthesis of Mn-doped ZnS quantum dots in neutral media with retained enzymatic activity: mechanistic study and biosensing application”, Journal of Materials Chemistry B 3, pp. 5942-5950.

137. Zhao C., Wu X., Zhang X., Li P., Qian X. (2017), “Facile synthesis of layered CuS/RGO/CuS nanocomposite on Cu foam for ultrasensitive nonenzymatic detection of glucose”, Journal of Electroanalytical Chemistry 785, pp. 172-179.

138. Zhao M., Huang J., Zhou Y., Chen Q., Pan X., He H., và những tác giả khác (2013), “A single mesoporous ZnO/Chitosan hybrid nanostructure for a novel free nanoprobe type biosensor”, Biosensors and Bioelectronics 43, pp. 226–230.

139. Zhao N., Qi, L. (2006), “Low-Temperature Synthesis of Star-Shaped PbS Nanocrystals in Aqueous Solutions of Mixed Cationic/Anionic Surfactants”, Advanced Materials 18, pp. 359–362.

140. Zhou S., Feng X., Shi H., Chen J., Zhang F., Song, W. (2013), “Direct growth of vertically aligned arrays of Cu(OH)2 nanotubes for the electrochemical sensing of glucose”, Sensors and Actuators B 177, pp. 445–452.

in Chemical Engineering 2, pp. 3-7.

137

141. Zhu B., Murthy S. K. (2013), “Stem cell separation technologies”, Current Opinion

142. Ziegenhorn J., Neumann U., Hagen A., Bablok W., Stinshoff K. (1977),“Kinetic Enzymatic Method for Automated Determination of Glucose in Blood and Serum”,J. Clin. Chem. Clin. Biochem.15, pp. 13-19.

138

143. Zuber A., Purdey M., Schartner E., Forbes C., van der Hoek B., Giles D., và những tác giả khác (2016),“Detection of gold nanoparticles with different sizes using absorption and fluorescence based method”,Sensors and Actuators B 227, pp. 117-127.