Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN QUANG VUI

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Ng êi

Hà Nội - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN QUANG VUI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 62 50 10

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ 2. TS. NGUYỄN BÁ HIÊN

Hà Nội - 2012

I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân do chính tôi

thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng

được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây. Mọi sự giúp đỡ đã

được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Nghiên cứu sinh

Trần Quang Vui

II

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- PGS.TS. Lê Thanh Hòa và TS. Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đã

dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi

hoàn thành luận án này.

- Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái

Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đã

hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam) đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình

thực hiện đề tài.

- Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học,

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình

nghiên cứu.

- Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho

phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án.

- Th.S. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện

Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ về kỹ thuật

trong quá trình nghiên cứu.

Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu

- đã động viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đình đ ể tôi dành thời gian cho

nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Nghiên cứu sinh

Trần Quang Vui

III

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA . VI

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................... VIII

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................... XI

MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1

4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................

4 1.1. Đại cương về bệnh cúm gia cầm ...........................................................

1.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm ............................................................. 4

1.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới ...................... 5

1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam ........................ 7

1.1.4. Nguyên nhân gây bệnh ................................................................... 9

1.1.5. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................ 13

1.1.6. Triệu chứng lâm sàng ..................................................................... 15

1.1.7. Bệnh tích ........................................................................................ 16

1.1.8. Chẩn đoán bệnh.............................................................................. 18

1.1.9. Phòng chống bệnh cúm gia cầm .................................................... 20

1.2. Sinh học phân tử virus cúm A ........................................................................ 24

1.2.1. Hệ gen của virus cúm A.................................................................. 24

1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng ...................................... 26

1.2.3. Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36

1.2.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A ........... 38

1.3. Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 ..................................................... 42

1.3.1. Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 .............................................. 42

1.3.2. Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1

vào Việt Nam............................................................................... 44

1.3.3. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm

47 kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam...........

IV

1.4. Phản ứng RT-PCR trong nghiên cứu virus cúm A ............................ 49

1.5. Một số nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 tại Việt

Nam ...................................................................................................................... 50

1.6. Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus cúm A/H5N1 .............. 54

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ........................................................................................ 56

56 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................

56 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................

2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 56

2.3.1. Giải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)

phân lập từ gà Hậu Giang ............................................................ 56

2.3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả

hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ........ 56

2.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 56

2.4.1. Nguyên liệu ................................................................................... 56

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 57

2.4.3. Hóa chất ......................................................................................... 57

2.4.4. Các dung dịch và môi trường ........................................................ 57

58 2.5. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................

2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ........................................... 58

2.5.2. Phương pháp RT-PCR ................................................................... 59

2.5.3. Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR ....................................... 63

2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR ................................... 63

2.5.5. Phương pháp dòng hóa................................................................... 64

2.5.6. Phương pháp giải trình tự ............................................................... 67

2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................. 69

70 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................

3.1. Kết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5 N1 chủng CkHG4 ............... 70

3.1.1. Kết quả tách RNA tổng số ............................................................. 70

V

3.1.2. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5)

và NA (N1) ................................................................................... 71

71 3.1.2.1. Giải trình tự gen H5 (HA) ........................................................

73 3.1.2.2. Giải trình tự gen N1 (NA) ........................................................

75 3.1.3. Kết quả giải trình tự các gen polymerase ...................................

75 3.1.3.1. Giải trình tự gen PB2 ..............................................................

76 3.1.3.2. Giải trình tự gen PB1 ...............................................................

77 3.1.3.3. Giải trình tự gen PA .................................................................

79 3.1.4. Kết quả giải trình tự các gen NP, M và NS .................................

79 3.1.4.1. Giải trình tự gen NP .................................................................

79 3.1.4.2. Giải trình tự gen M...................................................................

80 3.1.4.3. Giải trình tự gen NS .................................................................

3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của

chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ............................... 83

84 3.2.1. Phân tích gen H5 ............................................................................

93 3.2.2. Phân tích gen N1 ............................................................................

3.2.3. Phân tích gen PB2 .......................................................................... 102

3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2........................................................ 106

3.2.5. Phân tích gen PA............................................................................ 112

3.2.6. Phân tích gen NP ........................................................................... 117

3.2.7. Phân tích gen M ............................................................................. 120

3.2.8. Phân tích gen NS............................................................................ 124

3.3. Thảo luận chung .................................................................................... 131

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 136

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

138 LUẬN ÁN...............................................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 139

PHỤ LỤC

VI

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA

Ký hiệu Tiếng Anh Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa tiếng Việt Aa Amino acid Axit amin

Bp Base pair Cặp bazơ

Ck Chicken Gà

CkHG4 A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân

lập từ gà Hậu Giang năm 2005

Đơn vị tính trọng lượng phân tử Da Dalton

protein

Duck Dk Vịt

DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic

dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR

ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng giải

trình tự

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch đánh dấu

Assay enzym

FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới

Goose Gs Ngỗng

HA Haemagglutinin Ngưng kết hồng cầu

HI Hemagglutination Inhibition Ngăn trở ngưng kết hồng cầu

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao

Kilo bazơ Kilo base Kb

Luria-Bertani LB Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy

vi khuẩn

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp

M Matrix Protein đệm

MDk Muscovy duck Ngan

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Chương trình phân tích tiến hóa

VII

Analysis gen

Neuraminidase Enzym phân giải sialic NA

Nuclear Export Protein Protein vận chuyển NEP

Nucleoprotein Protein nhân NP

Non structural protein Protein không cấu trúc NS

Office International des Epizooties Tổ chức Thú y thế giới OIE

Polymerase acidic protein Enzym polymerase có tính axit PA

Enzym polymerase có tính bazơ 1 Polymerase basic protein 1 PB1

Enzym polymerase có tính bazơ 2 Polymerase basic protein 2 PB2

Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR PCR

Axit ribonucleic RNA Ribonucleic Acid

Tổ hợp protein liên kết ribonucleic RNP Ribonucleoprotein

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Phản ứng PCR ngược

Chain Reaction

SPF Specific Pathogen Free Không chứa mầm bệnh (siêu sạch)

(-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic ARN sợi đơn âm

Acid

TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA

TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố α gây hoại tử khối u

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

VIII

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang TT

1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo

6 cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 6/7/2012

2.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 59

2.2 Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus

60 cúm A/H5N1

2.3 Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm 61

2.4 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự 68

3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và

85 mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.2 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen H5 chủng CkHG4 với

86 26 chủng virus cúm khác

3.3 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5

87 giữa 27 chủng virus cúm

3.4 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương

90 đồng về amino acid (dưới đường chéo) gen H5 giữa các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

3.5 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen

94 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.6 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen N1 chủng CkHG4 với

95 26 chủng virus cúm khác

3.7 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1

giữa 27 chủng virus cúm 96

3.8 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương

đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen N1 giữa các

100 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

IX

3.9 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần

gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 102

3.10 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB2 chủng CkHG4

với 26 chủng virus cúm khác 103

3.11 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2

104 giữa 27 chủng virus cúm

3.12 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh

107 thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.13 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4

với 26 chủng virus cúm khác 109

3.14 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB1

giữa 27 chủng virus cúm 110

3.15 So sánh vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen PB1 -F2

111 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác

3.16 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần

113 gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.17 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với

26 chủng virus cúm khác 115

3.18 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA

giữa 27 chủng virus cúm 116

3.19 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần

117 gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.20 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NP chủng

119 CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác

X

3.21 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen

121 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.22 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen M1 và M2

chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 122

3.23 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen NS trong phân tích so sánh thành phần

125 gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

3.24 Vị trí sai khác nucleotide của gen NS1 chủng CkHG4 so với 26

chủng virus cúm khác 126

3.25 Vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide NS1 giữa 27

127 chủng so sánh

3.26 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid gen NS2 chủng

128 CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác

XI

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT Tên hình Trang

Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A 1.1 10

Ảnh chụp kính hiển vi điện tử, mô hình và phức hợp 1.2

11 ribonucleoprotein RNP của virus cúm A

1.3 Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở người 14

1.4 Triệu chứng lâm sàng ở gà m ắc bệnh cúm gia cầm 15

1.5 Bệnh tích ở gà mắc bệnh cúm gia cầm 17

1.6 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin 27

1.7 Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA1 và HA2 (điểm cắt của

protease) quy định độc lực của virus cúm A 29

1.8 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế

37 bào chủ

Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng 1.9

nguyên” 39

Sơ đồ minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng 1.10

nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A 40

1.11 Sự xâm nhập của virus cúm A/H5N1 độc lực cao vào Việt Nam

45 giai đoạn 2001-2007

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát để thu nhận các chuỗi gen 2.1 58

Sơ đồ bố trí các mồi để thu nhận các phân đoạn gen của virus 2.2

2.3 cúm A/H5N1 Cấu trúc vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen) 64

3.1 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số, sản phẩm RT-PCR và

70 DNA plasmid tái tổ hợp gen H5 trên thạch agarose 1%

3.2 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen

H5 (HA) chủng CkHG4 72

3.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid

73 tái tổ hợp

XII

3.4 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen

N1 (NA) chủng CkHG4 74

3.5 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 1 (gen PB2) 76

3.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 2 (gen PB1) 77

3.7 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 3 (gen PA) 78

3.8 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 5 (gen NP) 79

3.9 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 7 (gen M) 80

3.10 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen M 81

3.11 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp

phân đoạn 8 (gen NS) 82

3.12 Phân tích diễn giải thành phần nucleoti de và amino acid của gen

82 NS

3.13 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen

kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid bằng

chương trình MEGA4.0 92

3.14 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen

N1 về thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình

101 MEGA4.0

1

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan

nhanh, với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân týp (subtype)

của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh

gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có

khả năng lây nhiễm từ động vật sang người.

Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam

năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. Trong một thời

gian rất ngắn, bệnh cúm gia cầm đã lây lan trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia

cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân ; và từ đó đến

nay bệnh xảy ra liên tục trở thành một vấn đề dịch tễ phức tạp cầ n giải quyết tại

nước ta.

Virus cúm A là loại virus có hệ gen RNA sợi đơn âm, bao gồm 8 phân đoạn

gen riêng biệt mang tên từ 1 -8 (hay được gọi theo tên p rotein mà chúng mã hoá

tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA,

HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 (Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan

và cs, 2006) [126], được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng

nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008)

[55].

H5N1 là một phân týp thuộc nhóm virus cúm A, loại hình phân týp kháng

nguyên bề mặt HA là H5 và NA là N1, có độc lực cao gây nhiễm và gây bệnh nặng

nề ở gia cầm và cả trên người (Murphy và Webster, 1996) [113].

Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến đổi, tái tổ hợp biến chủng và thay

đổi cấu trúc kháng nguyên để thích ứng gây bệnh (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7].

Trình tự nucleotide hệ gen là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của

các biến chủng virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung

cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những

2

biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.

Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và

amino acid có thể xác định những vùng gen thường biến đổi, vùng gen ổn định làm

cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm

đầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng

chống dịch cúm gia cầm.

Để có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ đó

làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 và

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng trong chẩn đoán và

phòng bệnh, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1

phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang.

Mục tiêu của đề tài

(1) Giải mã được toàn bộ hệ gen gồm 8 phân đoạn của một chủng virus cúm

A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang.

(2) Phân tích được một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu

được thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine phòng bệnh hiệu quả.

Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Đây là luận án nghiên cứu khá đầy đủ, có hệ thống về sinh học phân tử hệ

gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang.

- Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa

học về virus cúm A/H5N1.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hiểu biết thêm về tính đa dạng của virus

cúm. Trên cơ sở đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán và lựa chọn vaccine

phòng bệnh phù hợp.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ

nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm đầu tiên dịch

xuất hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.

3

Những đóng góp mới của đề tài

(1) Giải trình tự và n ghiên cứu hoàn chỉnh, có hệ thống hệ gen của một chủng

virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm

2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong đợt dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện ồ

ạt ở Việt Nam.

(2) Đã phân tích đặc điểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm

trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, đồng nhất/tương đồng ; so sánh với các

chủng trong vùng và thế giới.

(3) Đã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen

của virus cúm A/H5N1 cường độc dòn g Quảng Đông (chủng CkHG4), góp phần

hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và đóng góp dữ liệu cho đối chiếu

với các vaccine sử dụng tại Việt Nam.

(4) Đã khảo sát và xác định được các cặp mồi sử dụng có hiệu quả để thu

nhận và giải trình tự hệ gen củ a virus cúm A/H5N1 thuộc những phân dòng lần đầu

tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam .

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm (avian influenza) đúng hơn là cúm loài chim, là bệnh truyền

nhiễm cấp tính của loài chim, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae

gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân

týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus

(de Wit và Fouchier, 2008) [55]. Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 đến

H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11],

(Horimoto và Kawaoka, 2005) [78]. Sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân týp

HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân týp khác nhau về độc tính và khả

năng gây bệnh.

Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể độc lực cao xuất hiện

ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 và đã lan ra hơn 60 nước trên thế giới

ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Duan và cs, 2008) [59], gây nhiều thiệt hại kinh tế

do gia cầm bị chết hoặc tiêu huỷ nhằm kiểm soát dịch, được chứng minh là có khả

năng lây nhiễm từ động vật sang người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Lê

Thanh Hòa và cs, 2004) [7]. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại

Việt Nam vào cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục, đang là vấn đề

dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải

giải quyết tại nước ta (Nguyen và cs, 2008) [116], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

Virus cúm A/H5N1 đang lưu hành ở nhiều nước, thường xuyên gây bệnh cho gia

cầm và người, là nguy cơ gây đại dịch trên toàn thế giới.

1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gà (avian influenza) còn có tên là dịch hạch gà (Fowl Plague) lần

đầu tiên được phát hiện ở Ita lia vào năm 1878. Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác

định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới

năm 1955 mới xác định được chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus

5

cúm týp A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 (Lê Văn Năm, 2004)

[18].

Đại dịch giống như cúm được xác nhận lần đầu tiên vào năm 1580. Từ đó

trở đi, trên toàn thế giới đã có 31 đại dịch được ghi nhận (Nguyễn Văn Thanh và cs,

2007) [24], (Bùi Quý Huy, 2007) [12]. Trong thế kỷ XX đã xảy ra các đạ i dịch cúm

trên người như dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 – 1919 do virus cúm A/H1N1,

dịch cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm Hồng Kông

năm 1968 – 1969 do virus cúm A/H3N2, và dịch cúm Nga năm 1977 do virus cúm

A/H1N1 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) [9].

Ở Việt Nam bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 được phát hiện năm

2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3].

1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới

Cúm A/H5N1 là một loại virus có độc lực cao và gây bệnh trên n gười trong

các đợt dịch cúm gia cầm những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm

A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ

năm 2003 cho đến nay (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Chủng virus cúm A/H5N1

được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có

thể gọi chủng virus này là virus cúm A/H5N1 cổ điển. Từ đó đến nay, cấu trúc

thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch của H5 và N1 đã có nhiều thay đổi

(Horimoto và Kawaoka, 2006) [79]. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1

xuất hiện tại Quảng Đông (1996), Hồng Kông (1997) với những biến đổi sâu sắc,

không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Có thể coi

dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện

(de Jong và Hien, 2006) [54]. Đặc biệt từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1

gây ra dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục

quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Lê Thanh Hòa và cs, 2008)

[11], (Duan và cs, 2008) [59]. Virus cúm A/H5N1 giai đoạn 2003-2008, cơ bản về

cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính

kháng nguyên-miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác

6

với nhiều biến chủng H5N1 trước đây (Subbarao và Luke, 2007) [140], (Zhao và cs,

2008) [164]. Từ đầu năm 1997 đến tháng 5 năm 2005, virus cúm A/H5N1 chỉ giới

hạn ở vùng Đông Nam Á (Chen và cs, 2005) [45]. Từ cuối 2005, cúm A/H5N1 sau

khi lây nhiễm cho chim hoang dã ở vùng hồ Thanh Hải (Qinghai Lake), Trung

Quốc bắt đầu lan truyền sang phía Tây, lan sang một số nước vùng Trung Á, trong

đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao

gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc - Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và Nigiêria là các nước

chịu thiệt hại nhiều nhất (Salzberg và cs, 2007) [129].

Tính đến 2008, tổng số có trên 60 nước và vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm

gia cầm, hàng trăm triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho

ngành chăn nuôi và kinh tế (Duan và cs, 2008) [59], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008)

[11].

Bảng 1.1: Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 6/7/2012

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

Tổng

Quốc gia

Azerbaizan

Bangladesh

Cambodia

Trung Quốc

Djibouti

Ai Cập

113

168

Indonesia

190

158

Iraq

Lào

Myanmar

Nigeria

Pakistan

Thái Lan

Thổ Nhĩ Kỳ

Việt Nam

123

607

358

115

Tổng số

chức Y

thế giới

tháng

tế

(tính đến

– WHO

Ghi chú: N: số người nhiễm; C: số người chết; Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong. WHO chỉ ghi nhận những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức. Nguồn: Tổ 7/2012) http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_ar chives/en/index.html.

7

Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 mỗi năm một cao hơn,

theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người nhiễm cúm gia c ầm H5N1

giai đoạn 2003-7/2012 là 607 trường hợp, trong đó, 358 trường hợp đã tử vong

chiếm tới 58,97%. Indonesia, Ai Cập và Việt Nam là 3 quốc gia có số người nhiễm

và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất thế giới (Bảng 1.1). Trong số 15 nước có

người nhiễm cúm gia cầm, Indonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia

“điểm nóng”, có thể có các điều kiện thuận lợi để virus cúm A/H5N1 tiến hoá thích

nghi lây nhiễm và trở thành virus của người (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

1.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên bùng phát tại Việt Nam vào cuối

tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, chỉ trong một thời gian ngắn dịch đã nhanh

chóng lây lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị

tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân (Lê Thanh Hòa và cs, 2008)

[11]. Hàng năm, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát tại nhiều địa phương trong

cả nước. Có thể phân chia dịch cúm gia cầm ở Việt Nam thành các đợt dịch lớn như sau:

- Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các

tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai

tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gà và thuỷ cầm mắc

bệnh, chết và thiêu huỷ hơn 4 3,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Đặc biệt,

có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt

dịch này (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh,

thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ

còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này

là 84.078 con. Số người mắc bệnh do virus cúm A/H5N1 trong đợt dịch này là 27

người, trong đó có 9 trường hợp tử vong (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gia

cầm xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y

thống kê là 1,846 triệu con. Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy

8

ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng

12/2005 (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các

đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt,

dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm

gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu,

Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và

được khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái

phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước. Theo Báo

cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đến ngày 10/06/2007

dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007.

- Trong năm 2008, dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc

vào tháng 3/2008, sau đó lan sang 21 tỉnh thành phố trong cả nước (Lê Thanh Hòa

và cs, 2008) [11]. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 60.090 con, trong

đó có 23.498 gà và 36.592 con thủy cầm (Văn Đăng Kỳ, 2008) [14]. Các ổ dịch

thường xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam và trên cả 3 vùng: Vùng núi, trung

du và đồng bằng, chủ yếu xảy ra trên đàn gia cầm không tiêm phòng vaccine và ở

loại hình trang trại gia đình hoặc hộ chăn nuôi nhỏ lẻ. Ở loại hình chăn nuôi hỗn

hợp, các ổ dịch thường phát ra trên đàn thủy cầm trướ c, sau đó lây nhiễm cho gà.

- Từ năm 2009 đến nay, dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 vẫn thường xuyên tái

phát tại nước ta. Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở các tỉnh: Bắc Kạn, Thái

Nguyên, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng, Bắc

Ninh, Phú Thọ, Nghệ An, Quảng Trị, Đắk Lắk, Quảng Ngãi, Bình Định, Tiền

Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Long An, Cà Mau và một số địa phương khác. Kết

quả phân tích mẫu virus từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám sát virus cúm

cho thấy clade virus mới (clade 2.3.2) lưu hành ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc,

duyên hải miền Trung và Tây Nguyên. Riêng clade virus cũ (clade 1) vẫn lưu hành

ở một số tỉnh phía Nam (từ thành phố Hồ Chí Minh đến Cà Mau) (Nguyễn Ngọc

9

Tiến và cs, 2011) [29].

- Từ đầu năm đến hết tháng 5 năm 2012, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 61

xã/phường của 42 quận/huyện thuộc 14 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh,

chết và tiêu hủy là 74.811 con (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].

Như vậy, dịch cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam hiện nay đã có sự xuất hiện

của nhiều clade virus mới làm cho tình hình dịch tễ và định hướng phòng chống

dịch trở nên phức tạp hơn.

1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh

1.1.4.1 Phân loại và danh pháp của virus cúm

1.1.4.1.1 Phân loại

Virus cúm được phân loại chủ yếu dựa theo đặc tính kháng nguyên của virus.

Virus cúm A gây bệnh cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống

(Basic Taxomomy) (Murphy và Webster, 1996) [113]. Họ phân loại

Orthomyxoviridae được phân thành các nhóm virus cúm A (influenza A virus),

virus cúm B (influenza B virus), virus cúm C (influenza C virus) và nhóm

Thogotovirus dựa vào sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên trong nucleoprotein

(NP) và matrix (M1) protein của chúng. Virus cúm B và C không phân loại thành

các phân týp (subtype). Tất cả virus cúm gia cầm (avian influenza virus) được xếp

vào týp A. Virus týp A được chia ra các phân týp dựa vào tính kháng nguyên của

glycoprotein bề mặt ở hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Cho đến nay,

tổng số phân týp chia theo cấu trúc chuỗi nucleotide (HA) là 16 (HA1-16) và theo

protein NA là 9 (N1-9). Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong các phân týp là

kết quả tái tổ hợp của 16 HA và 9 NA. Vì vậy, virus cúm A được đặt tên là HxNy

(x có giá trị từ 1 đến 16 và y có giá trị từ 1 đến 9) (Murphy và Webster, 1996)

[113], (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5].

1.1.4.1.1 Danh pháp

Tổ chức Y tế thế giới quy định thống nhất danh pháp lưu trữ hệ gen của các

chủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ

10

liệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), theo thứ tự ký hiệu: Tên

týp virus (serotype)/Loài động vật bị nhiễm/Vùng địa lý phân lập/Số hiệu đăng ký

chủng virus/Thời gian phân lập/Loại hình phân týp (HA(H) và NA(N)). Ví dụ:

A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) (Hình 1.1A). Đối với các virus được phân lập

trên người bệnh, thì bỏ qua phần động vật bị nhiễm trong danh pháp (WHO, 2008)

[159]. Ví dụ: A/Vietnam/1203/04(H5N1) (Hình 1.1B).

A

A/Ck/VN/HG4/05(H5N1)

Tên Serotype

Phân type HA và NA

Loài nhiễm

Vùng địa lí phân lập

Số hiệu chủng

Năm phân lập

Hình 1.1: Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm (WHO, 2008) [159]

(A: Phân lập ở các loài động vật; B: Phân lập trên người)

1.1.4.2 Hình thái và cấu trúc của virus cúm A

Hạt virus cúm A (virion) có hình cầu, đường kính 80 -120 nanomet (nm), đôi

khi có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da lton (Da). Hạt virus có

cấu tạo đơn giản gồm: màng bao ngoài (envelope), vỏ (capsid) và lõi là RNA sợi

đơn âm (negative single strand) (Murphy và Webster, 1996) [113] (Hình 1.2).

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,

bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng nguyên sinh chất của tế

bào nhiễm được đặc hiệu hoá gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có

khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 -14

nm có đường kính 4-6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu

tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA ( matrix antigen) và các dấu ấn khác của

virus (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Zhou và cs, 2007) [165]. Có sự phân bố

không đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỷ lệ khoảng 4HA/1NA), đây là hai

protein kháng nguyên vỏ có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và lây

nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996) [113], (Wagner và

11

cs, 2002) [151].

Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cú m A là RNA sợi đơn âm

(viết tắt là ( -) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M

và NS), mã hoá cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hoá

cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hoá cho 2 protein là NS1 và NS2

(còn gọi là NEP), phân đoạn PB1 mã hoá cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 (Murphy

và Webster, 1996) [113], (Conenello và cs, 2007) [50].

Nucleocapsid bao bọc lấy nhân của virus là tập hợp của nhiều protein phân

đoạn, có cấu trúc đối xứng xoắn, độ dài 130-150nm, tạo vòm (loop) ở giới hạn cuối

của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau qua cầu nối ở các peptid tạo vòm không

gian đó (Murphy và Webster, 1996) [113].

neuraminidase neuraminidase

(B) (B)

heagglutinin heagglutinin

(C) (C)

(B) (B)

(A) (A)

Hình 1.2: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA , Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Thành phần hoá học của virus cúm A bao gồm: RNA chiếm 0,8-1,1%,

protein 70-75%, lipid 20-24% và 5-8% carbohydrate. Lipid tập trung ở màng virus,

chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glycolipid. Carbohydrate

12

gồm các loại men galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamine. Thành phần

protein chủ yếu của virus là glycoprotein (Murphy và Webster, 1996) [113].

1.1.4.3 Độc lực, khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus cúm A

1.1.4.3.1 Độc lực của virus

Dựa vào các tiêu chuẩn di truyền phân tử và sinh bệnh học cụ thể virus cúm

A được chia làm hai loại: loại độc lực thấp (LPAI) và loại độc lực cao (HPAI), cả

hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên (Kelly và cs, 2008) [88].

- LPAI: là loại virus cúm A khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây

bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ.

Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus

cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm

trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm (Webster, 1998)

[156].

- HPAI: là loại virus có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng

trong cơ thể nhiễm, chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng

48 giờ sau nhiễm. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận

chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại

cho cộng đồng (Webster, 1998) [156].

1.1.4.3.2 Khả năng gây bệnh của virus cúm A

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây

bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ

quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus

hướng đa phủ tạng (Webster, 1998) [156], (Nicholson và cs, 2003) [118]. Khả năng

gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng

chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở

đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc

(H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể,

gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của

13

chúng (Suzuki, 2005) [143]). Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong

phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân týp H5,

H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được

nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột

Hamster, chồn đất (de Wit và Fouchier, 2008) [55].

1.1.4.3.3 Sức đề kháng

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lý hay hoá học. Virus

tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả

năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh (Fang và cs, 2008) [61]. Lớp vỏ ngoài của

virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy

bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: phenol,

formaldehyde, β-propiolacton, natri hypoclorid, acid loãng và hydroxylamine. Virus

bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày dưới ánh sáng

thường. Tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100 oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40 oC), virus tồn tại 25-30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7-8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37 oC). Trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30 oC (Murphy và Webster, 1996) [113],

(Webster, 1998) [156].

1.1.5. Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus cúm tiếp cận tế bào đích (chủ yếu là tế

bào biểu mô đường hô hấp) và bắt đầu quá trình nhân lên. Kết quả là số lượng virus

tăng lên nhanh, tải lượng virus cao làm cho tế bào nhiễm bị phá hủy hàng loạt do bị

dung giải trực tiếp hoặc mất trạng thái cân bằng vốn có của chúng, gây tổn thương

không chỉ đường hô hấp trên mà còn gây tổn thương sâu ở các phế nang và phế

quản nhỏ dẫn đến suy giảm hô hấp khiến sức đề kháng của cơ thể giảm sút rõ rệt,

làm kế phát các bệnh vi khuẩn, virus khác, từ đó có thể gây tử vong nhanh (Cinatl

14

và cs, 2007a) [48], (Korteweg và Gu, 2008) [90], (de Jong và cs, 2005a) [52]. Sinh

bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở động vật được quyết định bởi khả năng nhân lên

nhanh của virus và khả năng tác động đến nhiều loại mô bào của vật chủ (Maines và

cs, 2005) [106], (Govorkova và cs, 2005) [69]. Sinh bệnh học của virus cúm ở

người phụ thuộc chủ yếu vào các yếu tố như: sự tương tác của virus với các hàng

rào sinh học, loại tế bào đích, quá trình viêm và sự rối loạn điều hòa miễn dịch

(Cinatl và cs, 2007a) [48].

Có nhiều yếu tố liên quan đến sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1

(Korteweg và Gu, 2008) [90]. Sự kết hợp giữa các yếu tố đó sẽ quyết định mức độ

tổn thương mô bào và sự trầm trọng của bệnh, và rối loạn điều hòa cytokine và

chemokine có thể là một trong những cơ chế chủ yếu trong sinh bệnh học của virus

cúm A/H5N1. Cơ chế sinh bệnh của virus cúm A/H5N1 được tóm lược và trình bày

ở Hình 1.3.

Hình 1.3: Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở người. Sơ đồ mô tả các cơ chế sinh bệnh chủ yếu, các gen và sản phẩm của gen tham gia vào sự gây nhiễm của virus cúm A/H5N1 (Nguồn: Korteweg và Gu, 2008 [90])

15

1.1.6 Triệu chứng lâm sàng

Khi gia cầm bị phơi nhiễm virus, tùy thuộc vào độc lực của chủng virus cảm

nhiễm mà chúng có thể không mắc bệnh, bị bệnh nhẹ hoặc rất trầm trọng. Triệu

chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm thay đổi và bị chi phối bởi độc lực của virus,

loài vật cảm nhiễm, tuổi, thời gian tác động, kế phát do vi khuẩn và điều kiện môi

trường (Beard, 1998) [40].

Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 21 ngày, có trường hợp kéo dài đến 28

ngày. Gia cầm bệnh sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và

mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ (Hình 1.4).

A B

Hình 1.4: Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cúm gia cầm. Ghi chú: A: Xuất huyết da chân; B: Mào, tích sưng, xuất huyết. Nguồn: Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương

Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hoá, hô

hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức

ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, mệt lả, rối loạn thần kinh,

ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường. Những

triệu chứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ (Tô Long Thành, 2004)

[25]. Trong trường hợp quá cấp tính, gây chết đột ngột, như các vụ dịch năm 2004 –

2005 tại Việt Nam, triệu chứng lâm sàng đã không biểu hiện và gia cầm chết chỉ sau

vài giờ khi có sự tác động của mầm bệnh. Toàn bộ các ca bệnh cấp tính hoặc quá

cấp tính đều bị chết, có khi lên đến gần 100%. Trường hợp cấp tính gia cầm chết

16

xuất hiện chỉ 24 giờ sau khi có triệu chứng đầu tiên và thường kéo dài trong khoảng

48 giờ. Trứng đẻ ra sau khi gia cầm nhiễm bệnh thường không có vỏ cứng phía

ngoài. Một số gà mái đẻ có thể khỏi bệnh nhưng rất hiếm khi đẻ trứng bình thường

trở lại.

Đối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày trung bình là khoảng 3 ngày. Lúc đầu bệnh nhân sốt cao 39oC và kéo dài từ 1 đến 3 ngày, bệnh

nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho sổ mũi, nhức đầu, có thể tiến tới khó

thở rồi ngạt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác. Đặc biệt, chủng

virus cúm A/H5N1 gây tỷ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người, người có

thể nhiễm cả đường hô hấp trên và dưới (Hui, 2008) [81]. Trong trường hợp không

xảy ra những biến chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục

hồi trong vòng một tuần. Tuy nhiên, nếu trường h ợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể

trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong, đó là trường hợp bị biến chứng

đi kèm viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai (Bauer và cs, 2006) [39],

(Gambotto và cs, 2008) [65].

1.1.7 Bệnh tích

1.1.7.1 Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đại thể ở các loài khác nhau có biểu hiện khác nhau (Hình 1.5).

Đối với gà bệnh tích thường gặp gồm mào, tích sưng to, phù quanh mí mắt. Thể nhẹ

bệnh tích ở các xoang trong cơ thể đặc trưng bởi viêm cata, lắng đọng fibrin, có mủ

hoặc hình thành casein. Có thể phù ở niêm mạc khí quản với dịch thẩm xuất khác

nhau từ thanh dịch đến casein. Viêm xoang bụng cata hoặc fibrin, có thể viêm dính

buồng trứng với xoang bụng. Ống dẫn trứng ở gà mái đẻ thường xuất huyết nặng.

Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ. Xuất huyết

điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng. Xuất huyết hầu hết toàn bộ

đường tiêu hoá, đặc biệt thấy rõ ở manh tràng, dạ dày tuyến. Tụy thường sưng to, có

những vạch vàng hoặc đỏ sẫm theo chiề u dọc. Túi Fabricius ở gà xung huyết và

xuất huyết. Bệnh tích này rất giống với bệnh tích của bệnh Newcastle (Lê Văn

Năm, 2004) [18], (Alexander, 1999) [35]. Các biến đổi bệnh lý đại thể của bệnh

17

cúm gia cầm trên ngan và vịt về cơ bản cũng giống như trên g à. Tuy nhiên tần suất

biến đổi tập trung chủ yếu ở phổi, túi khí, tim, buồng trứng, xương lồng ngực, cơ

quan sinh sản và đường ruột (Lê Văn Năm, 2004) [18].

Ở người, virus xâm nhập niêm mạc phế nang phế quản, nhân lên gây huỷ

hoại biểu mô túi khí, gây xung huyết, xuất huyết và tràn dịch phổi ở bệnh nhân. Mặt

khác, virus có khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não, và có thể xuyên qua nhau

thai xâm nhập bào thai. Mất cân bằng điều hoà miễn dịch do hiện tượng tăng

cytokine không kiềm chế gọi là “bão cytokine” (cytokine storm) thường xảy ra dẫn

đến cơ thể bị suy sụp và tử vong (Korteweg và Gu, 2008) [90].

A B

C D

Hình 1.5: Bệnh tích ở gà mắc bệnh cúm gia cầm. Ghi chú: A: Niêm mạc khí quản chứa dịch thẩm xuất, xuất huyết, B: Buồng trứng xuất huyết, C: Xuất huyết ở dạ dày tuyến, D: Xuất huyết ở ruột. Nguồn: Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương

1.1.7.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể chủ yếu là xung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu ở

18

não và một số cơ quan khác. Mạch quản của các cơ quan như mào, tích, lách, gan,

phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não và một số cơ quan khác bị giãn rộng và thâm nhiễm

tế bào xung quanh mạch quản (Beard, 1998) [40] .

1.1.8 Chẩn đoán bệnh

1.1.8.1 Chẩn đoán dựa vào các yếu tố dịch tễ

Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ như bệnh lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao lên tới

100% số gia cầm mắc bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa

được tiêm phòng vaccine c úm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn

dịch, hoặc đã tiêm phòng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt ở

mức thấp.

1.1.8.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích

Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và biểu hiện bệnh tích để chẩ n đoán,

lưu ý tới một số đặc điểm chính như gia cầm mắc bệnh c hảy nhiều nước mắt, viêm

xoang mũi, mào, tích và chân tái xanh, phù đầu và mí mắt, lông cổ dựng ngược, ỉa

chảy và có triệu chứng thần kinh.

Căn cứ vào những bệnh tích điển hình như phổi, gan, th ận, lách sưng to, hoại

tử màu vàng hoặc màu xám. Xuất huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata và xuất huyết.

Ở gà mái đẻ ống dẫn trứng viêm, vỡ trứng non. Xuất huyết dạ dày cơ, đôi khi xuất

huyết dạ dày tuyến giống với bệnh Newcastle, xuất huyết điểm ở ruột, sưng hạch

ruột. Túi Fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết. Xuất huyết và hoại tử

tuyến tụy, tuyến tụy chuyển sang màu vàng, có các vệt sẫm màu. Phù keo nhầy và

xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối), da chân xung huyết đỏ sẫm. Chảy máu lỗ

chân lông, máu không đông hoặc khó đông (Alexander, 1999) [35], (Beard, 1998)

[40]. Trong trường hợp gia cầm chết do bệnh ở thể quá cấp tính thì biểu hiện bệnh

tích thường không điển hình.

1.1.8.3 Chẩn đoán phi lâm sàng

Bệnh cúm gia cầm có triệu chứng rất đa dạng, nếu chỉ dựa trên các đặc điểm

lâm sàng thì chẩn đoán không thỏa đáng, trừ trường hợp trong giai đoạn xảy ra dịch.

19

Muốn chẩn đoán chính xác bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm ở người cần phải thực

hiện chẩn đoán phòng thí nghiệm. Các xét nghiệm phát hiện sự hiện diện của virus

cúm trong cơ thể bệnh, đó là các phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu ( HI), test

chẩn đoán nhanh (ví dụ, Capillia Flu A/B test), hoặc các chẩn đoán xác định dựa

vào các xét nghiệm huyết thanh học và phân lập virus (Nicholson và cs, 2003)

[118], (OIE, 2005) [169].

Có thể sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng

ELISA để tìm kháng thể trong máu gia cầm. Tuy nhiên, trong điều kiện thực tế hiện

nay, sử dụng các phản ứng này để chẩn đoán là không còn phù hợp, vì khi xác định

được trong huyết thanh chẩn đoán có kháng thể kháng virus cúm gia cầm nhưng có

thể do gia cầm đã đáp ứng miễn dịch với vaccine hoặc đã có sự xâm nhập của mầm

bệnh vào cơ thể gây đáp ứng miễn dịch nhưng mầm bệnh đã bị đào thải khỏi cơ thể

(FAO, 2004) [62]. Vì vậy, để xác định bệnh một cách chắc chắn cần phải xác định

sự có mặt của căn nguyên gây bệnh cúm gia cầm. Phương pháp chẩn đoán bệnh

cúm gia cầm rất hiệu quả và có độ chính xác cao là phân lập virus. Nhưng trở ngại

đối với phương pháp này là đòi hỏi kỹ thu ật tương đối nghiêm ngặt: phôi gà từ gà

mái chưa có miễn dịch, thường là gà nuôi ở trạng thái cô lập bệnh đặc hiệu (gà SPF)

(FAO, 2004) [62] nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện

được.

Các phương pháp Real-time PCR và reverse transcription-PCR (RT-PCR),

kể cả PCR đa gen (multiplex-PCR), trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A

và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm, gần đây đã được đưa vào ứng dụng, cho phép

chẩn đoán xác định và phân biệt sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh,

có độ chính xác và tin cậy cao chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm (OIE, 2005)

[169], (Wu và cs, 2008a) [160]. Đây là những phương pháp phát hiện virus phổ biến

nhất hiện nay và rất nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam đã có khả năng thực hiện.

20

1.1.8. Phòng chống bệnh cúm gia cầm

1.1.8.1 Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm

Đối với bệnh truyền nhiễm, sử dụng vaccine để phòng bệnh được coi là biện

pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao

và Luke, 2007) [140]. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm

trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được

bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này

sang người (OIE, 2005) [169], (Subbarao và Luke, 2007) [140]). Kháng thể đặc

hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, đó là

các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm,

góp phần vô hiệu hoá virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào (Lê Thanh

Hòa và cs, 2008) [11], (Nayak và cs, 2010) [114]. Có nhiều loại kháng thể, nhưng

trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá

trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa

trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Subbarao và

Luke, 2007) [140], (Capua và Alexander, 2008) [41].

Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.

- Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine) là các loại vaccine

được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gia cầm giống chủng gây bệnh

trên thực địa (Swayne và Suarez, 2000) [144].

- Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các

chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thự c địa, nhưng có kháng

nguyên NA dị chủng.

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản

xuất nhờ sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ các vùng “gen độc”. Các loại vaccine này

hoặc đang được nghiên cứu hoặc đã đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

- Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: Loại vaccine này sử

dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp hai gen H5 và N1 phòng chống virus

týp H5N1 và H7N1 (Qiao và cs, 2006) [125]. Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất

21

vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2),

sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.

- Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách

chiết làm vaccine (Peyre và cs, 2008) [123], (Prel và cs, 2008) [124].

- Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc

Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng

nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vaccine phòng

chống virus cúm A/H5N1 (Gao và cs, 2006) [66], (Römer-Oberdörfer và cs, 2008)

[127], (Hu và cs, 2011) [80].

- Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP,

M2 đơn lẻ hoặc đa gen (Keawcharoen và cs, 2005) [87], (Patel và cs, 2009) [120].

- Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di

truyền ngược, virus cúm nhân tạo được lắp ghép chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các

gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Tian và

cs, 2005) [147], (Suguitan và cs, 2009) [141]. Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y

tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản

xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG -14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg

(SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp

gen H5 và nguồn N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hoặc

A/Vietnam/1203/2004(H5N1) (Nicolson và cs, 2005) [119]. Trung Quốc cũng là

nước sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y

Cáp-Nhĩ-Tân đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô hoạt n hũ dầu đơn

chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A /Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại

phân týp H5N2 có độc lực yếu; hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy

nguồn gen H5 và N1 từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực

yếu (Tian và cs, 2005) [147], (Qiao và cs, 2006) [125]. Các loại vaccine này đã

được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến nay.

Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống virus

vaccine nhược độc thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xoá gen bằn g công

22

nghệ gen, được lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –

based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà (Marsh và

Tannock, 2005) [107]. Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng

virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG -14

được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto

Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, M, NS

làm nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm

độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam cường

(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) (Tian và cs, 2005) [147]. Bằng thao tác kỹ thuật

gen, gen H5 đã bị đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột

biến điểm ở các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3 amino acid tại

vùng gây độc. Mặc dù virus được xử lý làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ

nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã

lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt

loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên (Peyre và cs, 2008) [123], (Doherty và cs,

2006) [57].

1.1.8.2 Hóa dược liệu sử dụng phòng chống bệnh cúm gia cầm

Một số loại hóa dược sử dụng trong các thuốc ức chế virus không đặ c hiệu

có tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm (ức chế NA),

hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói của virus do ức chế kênh vận

chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhân lên của virus trong tế bào

nhiễm (Basler, 2007) [38]. Các loại hóa dược sử dụng phổ biến trong phòng chống

virus cúm A bao gồm:

Hóa dược ức chế kênh vận chuyển ion M2

Nhóm Adamatane gồm có Amantadine và Rimantadine là những loại hóa

dược chống virus cúm được cấp phép đầu tiên (Hayden, 2006) [75]. Cả hai loại

thuốc này đều có tác dụng ở mức liều thấp chống lại các phân týp virus cúm A khác

nhau nhưng không có tác dụng đối với virus cúm B. Adamatane hướng đến vùng

xuyên màng (transmembrane domain) trong protein M2 của virus cúm A, ức chế sự

23

xâm nhập của dòng proton vào trong virus, và sau đó là ức chế sự giải phóng RNP

khỏi M1 (quá trình “cởi áo”) - là quá trình cần thiết để vận chuyển RNP vào trong

nhân. Adamantane còn có tác động chống virus ở các giai đoạn sau của quá trình

nhân lên của virus, khi tế bào nhiễm chủng virus cúm gia cầm H5 và H7, do tương

tác với hoạt động chuyển vận ion của M2 trong quá trình vận chuyển ngoại bào

(Cinatl và cs, 2007b) [49].

Tuy nhiên, hiện nay virus cúm A đã đề kháng với Amantadine và

Rimantadine. Đột biến thay thế serin bằng asparagin ở vị trí 31 trong protein M2 đã

làm cho virus cúm A/H5N1 kháng với Amantadine (Tosh và cs, 2011) [148]. Sự

kháng thuốc xuất hiện nhanh sau khi điều trị bệnh nhân nhiễm virus cúm A bằng

Amantadine. Virus kháng Amantadine có đầy đủ độc lực và khả năng lây truyền

(Cinatl và cs, 2007b) [49].

Hóa dược ức chế NA

Các thuốc ức chế NA đã xuất hiện trong khoảng hơn 6 thập kỷ qua (Hayden,

2006) [75]. Chúng được đưa vào sử dụng trong thực tiễn lâm sàng năm 1999 và

Oseltamivir (một loại thuốc uống) đã nhanh chóng trở thành loại thuốc được lựa

chọn chủ yếu trong điều trị bệnh cúm và dự phòng cho các đại dịch (Moscona,

2005) [111].

NA của virus thủy phân acid sialic của sialoglycan, thúc đẩy giải phóng virus

vừa được tạo thành ra khỏi tế bào nhiễm bằng cách phá hủy thụ thể trên tế bào chủ

và của chính virus, tiếp đến là chu trình nhân lên của virus trong tế bào. Các thuốc

ức chế NA tương tác với quá trình này và ức chế sự giải phóng virus cúm mới hình

thành khỏi tế bào nhiễm. Sử dụng các thuố c ức chế NA trong điều trị có thể ức chế

hiệu quả các bước khởi đầu trong quá trình nhân lên của virus cúm. Do vậy, để có

hiệu quả điều trị cao, việc sử dụng sớm thuốc ức chế NA cho bệnh nhân mắc bệnh

cúm là rất cần thiết (Cinatl và cs, 2007b) [49].

Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza) là hai loại thuốc ức chế NA

chính được sử dụng trong lâm sàng. Oseltamivir là dạng thuốc uống, trong khi

Zanamivir là thuốc bột dùng để ngửi nhờ một thiết bị hỗ trợ thở. Cả hai loại thuốc

24

đều có hiệu quả đối với tất cả các phân týp NA nên được sử dụng để điều trị tất cả

các chủng virus cúm (Moscona, 2005) [111]. Do virus cúm nhân lên trong đường

hô hấp đạt đỉnh trong khoảng 24-72 giờ sau khi xuất hiện bệnh nên các thuốc ức chế

NA cần được sử dụng càng sớm càng tốt (Moscona, 2005) [111]. Lợi thế chủ yếu

của các thuốc ức chế NA so với các thuốc ức chế kênh chuyển vận ion M2 là khó

tạo ra các chủng virus cúm kháng thuốc (Monto, 2006) [110]. Các nghiên cứu gần

đây cho thấy đột biến H252Y trong NA làm cho virus có tính kháng Oseltamivir

cao (Shu và cs, 2011) [135].

Có thể sử dụng Oseltamivir để dự phòng trong vòng 48 giờ sau tiếp xúc với

mầm bệnh và là loại thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/H5N1, tuy nhiên

thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghi nhận nh ư gây rối loạn tâm

thần và có thể gây độc sau khi điều trị liều cao (Aoki và cs, 2007) [36].

Điều trị cúm A/H5N1 có thể đạt kết quả tối ưu khi sử dụng phối hợp hai

thuốc ức chế NA với nhau, hoặc một thuốc ức chế NA với một thuốc nhóm

Adamantane (nếu kiểu gen của loại virus cúm đang lưu hành mẫn cảm với

Adamantane), hoặc một thuốc ức chế NA kết hợp với Ribavirin (Cinatl và cs,

2007b) [49]. Các nghiên cứu cho thấy, phối hợp Adamatane với thuốc ức chế NA

trong điều trị có thể làm giảm sự xuất hiện các biến chủng virus cúm kháng thuốc

(Ilyushina và cs, 2006) [83].

1.2. SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A

1.2.1 Hệ gen của virus cúm A

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt

mang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử (hay được gọi theo tên

protein mà chúng mã hoá tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus

gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2)

(Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan và cs, 2006) [126] (Hình 1.3B). Mỗi

phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50-100 nm,

đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) - bản chất là lipoprotein,

tạo thành cấu trúc RNP. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase (PA,

25

PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus

(Hình 1.3C). Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối

peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một

sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000 -15.000 bp (tùy theo từng chủng virus

cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kilobase thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α

(α-helix) bên trong vỏ virus. Hai đầu 5’- và 3’- sợi RNA hệ gen virus có gắn thêm

tính bảo tồn cao giữa các phân týp chuỗi nucleotide có là: 5’-

AGUAGAACAAGG… và 3’-UCG(U/C)UUUCGUCC (Murphy và Webster, 1996)

[113].

Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hoá tổng hợp các enzym

trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có

tính bảo tồn cao (Murphy và Webster, 1996) [113], bao gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hoá tổng hợp protein enzym PB2, có kích thước

2341 bp.

- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2341 bp, mã hoá tổng hợp

enzym PB1.

- Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hoá tổng hợp

protein enzym PA, có kích thước 2233 bp.

Các phân đoạn 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của

virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng vir us cúm A

(ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp).

Đây là gen chịu trách nhiệm mã hoá tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt

của virus cúm.

- Phân đoạn 6 (gen NA) là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên

bề mặt capsid của virus, có chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở

A/H1N1 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Các nghiên

cứu gần đây cho thấy gen NA của các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn

1996-2003 có hiện tượng đột biến xóa đi 57 nucleotide, còn ở các chủng phân lập

26

sau 2003 số nucleotide bị xóa do đột biến là 60. Điều này ắt hẳn có liên quan đến

tính gây bệnh rất cao của các chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành trong giai đoạn

này (Keawcharoen và cs, 2005) [87].

Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng

khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, bao

gồm:

- Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), kích thước

khoảng 1565 bp.

- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hoá cho protein

đệm (matrix protein) gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạo ra bởi những khung

đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA.

- Phân đoạn 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cấu trúc, có độ dài ổn

định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hoá tổng

hợp hai protein là NS1 và NS2. Gen NS có liên quan đến độc lực của virus cúm

A/H5N1 (Webster, 1998) [156], trong tự nhiên, việc đột biến xoá đi một phần gen

NS có thể làm giảm độc lực của virus (Zhu và cs, 2008) [166].

Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen được cấu trúc từ 8

phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện

thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua

quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các

chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc

tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới (Doherty và cs, 2006) [57],

(Suarez và Schultz-Cherry, 2000) [139].

1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng

Protein của virus cúm A bao gồm: HA, NA, các protein polymerase (PB2,

PB1, PA), NP, các protein đệm M1 và M2, và các protein không cấu trúc (NS1 và

NS2).

Hai protein HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trưng cho bản

chất của từng chủng virus cúm A (Murphy và Webster, 1996) [113], (Keawcharoen

27

và cs, 2005) [87], có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và quyết

định tính gây bệnh của virus cúm A. HA và NA có cấu trúc từ glycoprotein, là

những gai mấu nhô trên bề mặt của hạt virus, dài 10 -14 nm, đường kính 4-6 nm (Lê

Thanh Hoà và cs, 2004) [7]. Mỗi hạt virus có khoảng 500 gai nhô ra khỏi lớp vỏ

lipid, 80% các gai này là protein HA, 20% là protein NA.

Protein HA

Protein HA là kháng nguyên bề mặt của virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2, có khối lượng phân tử khoảng 63x103 Da (nếu không được glycosyl hoá) và 77x103 Da (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA 1 là 48x103 Da và HA2 là 29x103

Da) (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Keawcharoen và cs, 2005) [87]. Protein HA

là một glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết

hồng cầu gà trong ống nghiệm ( in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong

toả sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Có 16

phân týp HA đã được phát hiện (H1 -H16, phân týp H16 được tìm thấy ở virus gây

bệnh cho hải âu đầu đen - Thụy Điển năm 1999 (Lê Thanh Hòa, 2006) [10], ba

phân týp H1, H2 và H3 thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại

dịch cúm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996) [113].

HA1

HA2

Màng bao lipid kép

Hình 1.6: Mô hình cấu trúc Hemagglutinin (Wagner và cs, 2002) [151] (Lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép; 4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính; Receptor site: vị trí gắn với receptor)

28

Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của hạt virus, có vai trò quan

trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus

vào tế bào chủ (Wagner và cs, 2002) [151]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài

khoảng 130 Å, cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer) ( Hình 1.6), mỗi đơn phân

(monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA 1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp, được

glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA 2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA 1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp

của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Wagner và cs, 2002) [151].

Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình motif riêng biệt,

đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng. Chuỗi

oligopeptide này chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc

hiệu theo từng loại hình phân týp H, là điểm cắt của enzym protease và cũng chính

là vùng quyết định độc lực của virus (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Horimoto và

Kawaoka, 2005) [78], (Gambotto và cs, 2008) [65]. Sự biến đổi thành phần của

chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới. Nếu ở điểm cắt

của enzym protease càng có nhiều amino acid kiềm thì khả năng HA được phân cắt

càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm

A (Webster, 1998) [156]. Đối với các chủng chứa gen HA (H5) cường độc (ví dụ,

phân týp H5N1) cấu trúc của chuỗi nối là TPQRERRRKKR (Hình 1.7), trong đó

RRRKK quyết định tính gây bệnh của H5N1.

Đối với phân týp H5N2 chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR. Đối với

các phân týp H vô độc (hoặc nhược độc) như H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và

H11N1, motif của chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR (Horimoto và Kawaoka,

2001) [77].

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa acid sialic) trên

bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trê n vật chủ giúp cho

virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên

ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình

29

không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ t hể này

trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các

loài vật chủ khác nhau (Webster, 1998) [156], (Wagner và cs, 2002) [151], (Jiang

và cs, 2010) [85].

Chủng virus

Thành phần chuỗi nối HA1 và HA2

TPQRE RRRKK R

H5N1 [HPAI] (Độc lực cao)

VPQRK RKT R

H5N2 [HPAI] (Độc lực cao)

VPQRE T R

H5N1, H5N2, H5N3 H4N6, và H11N1 [LPAI] (Độc lực thấp)

Hình 1.7: Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA1 và HA2 (điểm cắt của protease) quy định độc lực của virus cúm A (Lê Thanh Hòa, 2006) [10]

Vị trí amino acid 226 của dưới đơn vị HA 1 được xác định là vị trí quyết định

phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu

hành trong tự nhiên vị trí này là glycin, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid

(chứa acid sialic liên kết với nhóm hydroxyl (4 -OH) của galactose ở góc quay α-

2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của

virus cúm A). Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 vị trí này trên

protein HA là Leucin, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid có mặt ở tế bào

biểu mô đường hô hấp dưới của người (Vines, 1998) [150]. Các tế bào cảm thụ với

virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung

gian tạo điều kiện để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người (Vines,

1998) [150].

Hiện tượng glycosyl hóa thường xảy ra trong protein HA. Các vị trí glycosyl

hóa liên quan đến khả năng gắn kết với kháng thể do protein HA kích thích sinh ra

dẫn đến phong tỏa miễn dịch (Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008) [13], do đó ảnh

hưởng đến khả năng gây bệnh của virus. Nghiên cứu của Gao và cộng sự (2009)

30

[67] cho thấy, sự biến đổi một amino acid trong protein HA ở vị trí 160 (T160A) đã

làm mất glycosyl hóa ở vị trí 158-160, là vị trí gắn kết của HA với sialic glycan cần

thiết để virus H5N1 truyền lây bệnh trên chuột lang.

Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamin 222, glycin 224, hay cấu

trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với

thụ thể chứa acid sialic bề mặt màng tế bào chủ (Keawcharoen và cs, 2005) [87].

Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể

xâm nhiễm trên người khi chú ng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc

trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) (Webster, 1998) [156], (Bauer và

cs, 2006) [39], (Hui, 2008) [81].

Trình tự mã hóa chuỗi nối, thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như

các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là

các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Keawcharoen

và cs, 2005) [87]. Protein HA chứa các epitope trung hòa chủ yếu, là kháng nguyên

bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch

dịch thể đặc hiệu với từng phân týp HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus,

được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của

virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở

cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Matrosovich và cs,

1999) [108], (Keawcharoen và cs, 2005) [87], (Horimoto và Kawaoka, 2006) [79],

(Jiang và cs, 2010) [85], (Nayak và cs, 2010) [114].

Protein NA

Protein NA là một protein enzym có bản chất là glycoprotein được gắn trên

bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân

týp NA (Baigent và Cauley, 2001) [37], (Wagner và cs, 2002) [151]. Có 9 phân týp

(từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân týp N1 và N2

được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử

(Webster, 1998) [156]. Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề

mặt capsid hạt virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng

31

hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và

phần kỵ nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci và Kawaoka, 1993) [42], (Wagner và cs,

2002) [151]. Các nghiên cứu phân tử cho thấy phần đầu gen N1 (đầu 5') của virus

cúm A/H5N1 có mức độ biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus, liên quan

đến quá trình thích ứng và gây bệnh của chúng trên nhiều đối tượng vật chủ khác

nhau (Matrosovich và cs, 1999) [108], (Keawcharoen và cs, 2005) [87].

Protein NA có vai trò là một enzym cắt đứt liên kết giữa gốc acid sialic của

màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus

ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ

và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham

gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “ hòa màng”, đẩy nhanh quá trình “cởi

áo” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá

trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Wagner và cs, 2002) [151]. Ngoài ra,

NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng acid neuraminic làm tan loãng

màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp

cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các ch ất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò

của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng

độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của

các thuốc, hoá dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir

(biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới

khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Castrucci và Kawaoka, 1993) [42], (Aoki và cs,

2007) [36]. Một số nghiên cứu cho thấy, các đột biến khác nhau trong gen NA có

ảnh hưởng đến tính mẫn cảm của virus đối với Oseltamivir, Zanamivir và Peramivir

(một loại hóa dược mới được FDA cấp phép sử dụng chống cúm A/H1N1 theo

đường tĩnh mạch) (Abed và cs, 2002) [33]. Sự thay đổi một amino acid ở vị trí 274

(H274Y) (de Jong và cs, 2005b) [53] hoặc vị trí 294 (N294S) (Kiso và cs, 2011) [89]

trong protein NA có thể làm gia tăng tính kháng Oseltamivir và ảnh hưởng đáng kể

đến tính gây bệnh của virus cúm A/H5N1 ở người.

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt c ủa virus, tham gia kích

32

thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng

nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA

(Doherty và cs, 2006) [57]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA

của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm

A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm,

nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người (Suarez và

Schultz-Cherry, 2000) [139], Wu và cs, 2008b.

Protein PB2, PB1, PA là các enzym cấu thành phức hợp polymerase (RNA

transcriptase) của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,

bao gồm:

Protein PB2 của H5N1 gồm có 759 amino acid, là tiểu đơn vị thành phần

trong phức hợp enzym polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus; có trọng lượng phân tử theo tính toán khoảng 84x103 Da (trên thực tế là 87x103 Da) (Murphy và Webster, 1996) [113]. Protein PB2 góp phần làm tăng độc

lực của virus cúm A/H5N1 ở trên gà (Tada và cs, 2011) [145]. Vị trí amino acid 627

ở protein PB2 được cho là có liên quan đến tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật

chủ và độc lực của virus. Ở virus cúm gia cầm vị trí này là E, còn ở virus thích nghi

trên người là K (Horimoto và Kawaoka, 2005) [78], (Wasilenko và cs, 2008) [155].

Ở chủng virus cúm A/H5N1 độc lực thấp vị trí này là glutamic acid còn ở chủng

độc lực cao là lysin (Hatta và cs, 2001) [73]. Sự có mặt của lysin làm cho virus nhân

lên mãnh liệt hơn, lấn át các cơ chế bảo vệ của tế bào chủ, và do đó gây tỷ lệ chết cao

(Shinya và cs, 2004) [134]. Chủng virus H5N1 chứa lysin ở vị trí 627 trong PB2 có

khả năng nhân lên trong nhiều loại tế bào (bao gồm cả tế bào đường hô hấp trên)

cao hơn và ở giới hạn nhiệt độ thấp hơn so với các phân lập virus chứa glutamic

acid ở vị trí này (Hatta và cs, 2007) [74]. Thay thế K bằng E ở vị trí 627 sẽ làm giảm

sự kết hợp giữa PB2 và NP, kết quả là làm giảm quá trình phiên mã, sao mã, và giảm

số lượng virus trong các tế bào của động v ật linh trưởng (Mehle và Doudna, 2008)

[109]. Tuy nhiên, đột biến E627K của PB2 không phải là yếu tố không thể thiếu để

virus H5N1 thích nghi gây bệnh ở động vật có vú (Li và cs, 2009) [96]. Ngoài ra,

33

amino acid asparagin ở vị trí 701 trong PB2 cũng liên quan đến tính gây bệnh của

virus cúm A/H5N1 (Li và cs, 2005) [98], (Gabriel và cs, 2008) [64]. Asparagin ở vị

trí 701 là điều kiện tiên quyết để virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở chuột lang (Gao và

cs, 2009) [67]. Ở các chủng virus H5N1 độc lực cao trong thành phần của protein

PB2 phát hiện có lysin ở vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (Li và cs, 2010) [100].

Lysin ở vị trí 627 của PB2 (627K) là yếu tố quyết định độc lực chính ở virus H5N1

thuộc nhóm kháng nguyên (clade) 2.3.4, trong khi asparagin ở vị trí 701 của P B2 và

các yếu tố độc lực chưa được biết khác liên quan đến độc lực của virus H5N1 thuộc

nhóm kháng nguyên 1 ở động vật có vú (Le và cs, 2010) [94].

Protein PB1 bao gồm 757 amino acid, mã hoá tổng hợp enzym PB1 - tiểu

đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA

virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996) [113]. Gần đây,

người ta đã phát hiện thêm một protein (PB1 -F2), bao gồm 90 amino acid được mã

hóa bởi một khung đọc mở khác của gen PB1, có vai trò gây chết tế bào theo

chương trình (apoptosis) (Uiprasertkul và cs, 2007) [149]. PB1-F2 làm cho tế bào

nhiễm nhạy cảm với các tác nhân kích thích như TNF-α thông qua phức hợp lỗ

thấm của ty thể (Zamarin và cs, 2005) [163]. PB1-F2 còn gây chết tế bào miễn dịch

theo chương trình, kết quả là làm giảm trình diện kháng nguyên dẫn đến đáp ứng

miễn dịch thích nghi không đầy đủ (Conenello và cs, 2007) [50]. Các nghiên cứu

gần đây cho thấy một đột biến trong protein PB1-F2, serin (S) thay cho asparagin

(N) ở vị trí 66, đã làm tăng tính gây bệnh của virus cúm A/H5N1 (Korteweg và Gu,

2008) [90].

Protein PA là một protein enzym, bao gồm 716 amino acid, khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83x103 Da (trên thực tế là 96x10 3 Da). PA là một tiểu đơn

vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng

hợp RNA của virus. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, c ác đột biến T515A trong PA

và Y436H trong PB1 đã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (Hulse-Post và cs,

2007) [82], nhưng chỉ đột biến riêng lẻ ở các amin o acid này thì không ảnh hưởng

đến độc lực của virus. Mặt khác, hai đột biến S224P và N383D trong PA cũng góp

34

phần làm gia tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 trên vịt. Điều này chứng tỏ protein

PA cũng là một yếu tố độc lực của virus cúm A/H5N1 (Song và cs, 2011) [138].

Như vậy, phức hợp polymerase được cấu thành từ 3 protein polymerase

(PB1, PB2 và PA) tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của virus. Cùng với NP,

các protein polymerase tạo nên ribonucleoprotein (Horimoto và Kawaoka, 2001)

[77]. Các phân đoạn gen được NP bao bọc tạo điều kiện cho phức hợp polymerase

nhận diện chúng (Horimoto và Kawaoka, 2001) [77]. Phức hợp gen polymerase là

yếu tố phân tử quan trọng quyết định độc lực của virus cúm A (Hatta và cs, 2001)

[73], (Salomon và cs, 2006) [128].

NP, MA và NS là các protein chức năng khác nhau của virus cúm A, bao

gồm:

Protein NP có độ dài khoảng 498 amino acid, tương đối ổn định giữa các

chủng virus cúm A. NP là thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

chuyển RNA giữa nhân và bào tương t ế bào chủ. NP là một protein được glycosyl

hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus

ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56x10 3 Da (trên thực tế là 50 -60x103 Da) (Murphy và Webster, 1996) [113],

(Salzberg và cs, 2007) [129]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy NP góp phần làm

gia tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 và amino acid valin ở vị trí 105 có thể là

một trong những yếu tố quyết định khả năng thích nghi gây bệnh của virus trên gà

(Tada và cs, 2011) [145].

Protein MA là protein đệm (matrix protein) của virus, gồm hai tiểu phần là

M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn

RNA. Cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MA trên bề mặt cap sid của

virus cúm A và có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek và

cs, 2002) [130]. Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có

chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “ nảy

chồi” của virus (Murphy và Webster, 1996) [113], (Basler, 2007) [38], đóng vai trò

thiết yếu trong quá trình lắp ráp virus, ức chế quá trình phiên mã (transcription) và

35

kiểm soát việc xuất nhập RNP của nhân tế bào (Fan và cs, 2009) [60]. Protein M1

cũng là yếu tố góp phần quyết định độc lực của virus H5N1 ở động vật có vú.

Amino acid D ở vị trí 30 và A ở vị trí 215 trong protein M1 là cần thiết để virus

H5N1 gây chết chuột (Fan và cs, 2009) [60]. Mức độ biến đổi ở đầu N và vùng giữa

(middle domain) của protein M1 cũng liên quan đến sự nhân lên của virus một cách

hiệu quả trong phổi chuột. . Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11x103 Da (trên thực tế là 15x10 3 Da), là protein chuyển màng – kênh ion H+ cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm kiểm soát

pH trong quá trình “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong

quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek và cs, 2002) [130], (Korteweg và Gu,

2008) [90]. Có 4 vị trí chủ yếu trong protein M2 liên quan đến tính kháng

amantadine của virus. Chỉ cần thay thế một amino acid ở các vị trí 26 (L→F), 27

(V→A hoặc T), 30 (A→T hoặc V) và 31 (S→N hoặc R) trong vùng xuyên màng

của protein M2 có thể làm cho virus có khả năng kháng thuốc (Suzuki và cs, 2003)

[142].

Protein NS là protein không cấu trúc (non structural protein), gồm hai

protein NS1 và NS2 (NS2 còn gọi là NEP - nuclear export protein), có vai trò quan

trọng trong quá trình nhân lên của virus (Horimoto và Kawaoka, 2001) [77] và bảo

vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy và

Webster, 1996) [113], (Sekellick và cs, 2000) [131]. NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27x103 Da (trên thực tế là 25x10 3 Da), là protein chịu trách nhiệm

vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động

lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ.

Protein NS1 rất cần cho virus để trốn thoát đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ

nhờ ức chế khả năng kháng virus của interferon týp I (Garcia-Sastre và cs, 1998)

[68]. Glutamic acid ở vị trí 92 (92E) trong protein NS1 được cho là yếu tố tiên

quyết để virus kháng lại cytokine (Seo và cs, 2002) [132]. Trường hợp protein NS1

bị xóa 5 amino acid ở các vị trí 80-84 sẽ dẫn đến đột biến D92E làm tăng độc lực

của virus cúm A/H5N1 ở gà và chuột (Long và cs, 2008) [102]. Các amino acid S42

36

(Jiao và cs, 2008) [86]), R38, K41 (Wang và cs, 1999) [153] và A149 (Li và cs,

2006) [99] trong protein NS1 cũng liên quan đến khả năng của virus ức c hế tế bào

sản xuất interferon và kháng lại đáp ứng của chúng. Mặt khác, các đột biến F103L

và M106I trong NS1 cũng làm gia tăng độc lực và khả năng nhân lên của virus cúm

A (Dankar và cs, 2011) [51]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, các chủng virus

cúm A/H5N1 phân lập trong vụ dịch 1997 có chứa motif EPEV ở đầu C của protein

NS1, còn ở các chủng phân lập giai đoạn 2003-2004 thì motif này là ESEV, và

chúng được cho là các yếu tố tiềm năng quyết định độc lực của virus (Jackson và cs,

2008) [84]. Tuy nhiên, một số chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao phân lập gần

đây lại không có motif này (Korteweg và Gu, 2008) [90]. Vì vậy, sự hiện diện các

motif EPEV hoặc ESEV ở đầu C của protein NS1 có vẻ như không nhất thiết là yếu

tố tiên quyết quyết định độc lực của virus cúm A/H5N1 (Krug, 2006) [91]. Các

nghiên cứu gần đây cho thấy motif ESEV trong protein NS1 có vai trò điều chỉnh

tính gây bệnh (pathogenicity) của virus cúm A/H5N1 tùy thuộc vào loài vật chủ

(Zielecki và cs, 2010) [167], nhưng cũng có khả năng làm giảm qu á trình chết theo

chương trình của tế bào nhiễm (Liu và cs, 2010) [101].

NS2 hay NEP là protein được mã hóa bởi gen NS2 (hình thành từ hai đoạn gen 30 bp và 336 bp), có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14x103 Da (trên thực tế là 12x103 Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế

bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick và cs, 2000) [131];

(Zhu và cs, 2008) [166].

1.2.3. Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A

Virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của

virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể

nhiễm (Murphy và Webster, 1996) [113], (Nicholson và cs, 2003) [118].

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA

và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt tế bào chủ, tiến hành nhập bào tạo endosom,

dung hợp giữa vỏ ngoài của virus với màng endosom (quá trình này thực hiện được

nhờ HA trồi lên khi pH trong endosom thấp), giải phóng hệ gen của virus vào trong

37

bào tương của tế bào nhiễm, nhân lên trong tế bào nhiễm, và cuối cùng là giải

phóng các hạt virus trưởng thành (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11], (Phạm Văn Ty,

2007) [31] (Hình 1.8).

Quá trình nhân lên của virus cúm A trong tế bào vật chủ có những đặc điểm

cơ bản sau:

- RNA của virus cúm A chỉ nhân lên trong nhân tế bào, đây là đặc điểm khác

biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối

cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzym

neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới

của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ).

Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế

bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo

chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Webster, 1998)

[156], (Uiprasertkul và cs, 2007) [149].

Hình 1.8: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bà o chủ

38

- Sau khi giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử

dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận

chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phức hợp protein –

RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào (Basler, 2007) [38].

- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương

từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA

hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi nà y không được Adenine hóa

(gắn thêm các Adenine) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo

thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào

tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống

enzym ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzym PB2 gắn thêm 10 -12

nucleotide Adenine ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại

lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus ( Hình 1.8).

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp nhờ bộ máy Golgi được

vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm, gọi là hiện tượng “ nảy chồi”

của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với

RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng

“nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết

giữa HA với thụ thể chứa acid sialic. Các NA phân cắt các liên kết này và giải

phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy và

Webster, 1996) [113], (Nayak và cs, 2004) [115].

1.2.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Đặc điểm cơ bản của virus cúm A là hệ gen luôn biến đổi, thay đổi kháng

nguyên theo thời gian giúp cho virus lưu hành rộng rãi trong tự n hiên ở nhiều loài

vật chủ khác nhau (Murphy và Webster, 1996) [113]. Có ba phương thức chủ yếu

làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A là: i) lệch kháng nguyên; ii) trộn kháng

nguyên và iii) glycosyl hóa (Wu và cs, 2008b) [161].

39

1.2.4.1 Hiện tượng lệch kh áng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra

trong các phân đoạn gen/hệ gen của virus. Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt

buộc, không có cơ chế “ đọc và sửa bản sao – proof reading” trong quá trình phiên

mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các

enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi

hoặc thay thế (đột biến trượt-xoá) (Lê Thanh Hòa và cs, 2005) [8] một hay nhiều

nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus

(Murphy và Webster, 1996) [113], (Conenello và cs, 2007) [50]. Tuỳ thuộc vị trí

xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino

acid trong trình tự của protein được mã hóa bi ểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính

của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm).

Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ

dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleot ide sai khác (Webster, 1998)

[156], (Rabadan và cs, 2006) [126]. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh

ra đều chứa một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được tích

lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân týp virus mới có những đặc

tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình 1.9).

ĐỘT BIẾN ĐIỂM

Không có cơ chế đọc-sửa bản sao

Quá trình sao chép nhân lên dưới xúc tác của RNA polymerase

Sao chép trong tế bào chủ

Dịch mã

Protein đột biến

Hình 1.9: Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift)

40

Hiện tượng lệch kháng nguyên thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng

nguyên HA và NA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay

đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl

hoá rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus

mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Webster, 1998)

[156], (Macken và cs, 2006) [105], (Chen và cs, 2008) [47].

1.2.4.2 Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên

(antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số virus RNA gây bệnh gia cầm

khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen

riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm

trong một tế bào trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao

đổi (swap) các phân đoạn gen của hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại

RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới

từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu.

TRỘN KHÁNG NGUYÊN

8 phân đoạn gen

Màng tế bào

TẾ BÀO

Chủng virus mới được tạo ra do hòa trộn các phân đoạn gen

Hình 1.10: Sơ đồ minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A

41

Kết quả là tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi

giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây

bệnh (Murphy và Webster, 1996) [113], (Hilleman, 2002) [76], (Macken và cs,

2006) [105], (Chen và cs, 2008) [47] (Hình 1.10).

1.2.4.3 Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hoá (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate

(oligosaccharide) vào với amino acid asparagin (N) ở một số vị trí nhất định trong

chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông

thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagin; X =

amino acid bất kỳ, trừ Prolin; S/T = Serin hoặc Threonin) (Baigent và Cauley,

2001) [37]. Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể

sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch

kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagin, tạo tiền đề cho

hiện tượng glycosyl hoá xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm

thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi

tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus

(Baigent và Cauley, 2001) [37].

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời

gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của

virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau.

Đây chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này

chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh

cho người, và rất có thể vir us cúm A/H5N1 tái tổ hợp gen HA hay NA, hoặc cả hai

gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người, để tạo ra một biến chủng

virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch

cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòn g chống (Hilleman, 2002) [76],

(Guan và cs, 2004) [72], (Li và cs, 2004) [97], (Korteweg và Gu, 2008) [90].

42

1.3 TIẾN HÓA HỆ GEN VIRUS CÚM A/H5N1

1.3.1 Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 được phân lập lần đầu tiên ở gà bệnh tại Scotland năm

1959 (A/Ck/Scotland/1959(H5N1)), và các công trình nghiên cứu hệ gen cho thấy

chủng A/H5N1 có nguồn gốc từ A/H6N2 trao đổi gen với A/H9N2 trên lợn, thuộc

nhóm HPAI (Murphy và Webster, 1996) [113].

Virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm có nguồn gốc từ châu Á được đặt

tên đầy đủ là “virus H5N1 dòng châu Á” (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5], được phân

lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) năm 1996 và chủng này

(A/Gs/GD/1/96) được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus gây bệnh

cúm gia cầm trong những năm qua (Xu và cs, 1999) [162]. Chủng virus nguyên

thuỷ A/Gs/GD/1/96 cung cấp nguồn gen HA(H5) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên

các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997, còn

nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được thu nhận từ virus

cúm A có ở chim cút (Guan và cs, 1999) [70]. Riêng nguồn gen NA (N1) còn chưa

biết được lấy từ đâu, nhưng cấu trúc của gen có hiện tượng xoá đi 57 nucleotide mã

hoá cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein NA, và đ ột biến “xoá gen” này

của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên

cạn và người (Matrosovich và cs, 1999) [108]. Đối với gen HA (H5) đột biến giãn

nở chuỗi nối giữa HA 1 và HA2 mã hoá cho các amino acid kiềm (arginin và lysin)

có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực, và ở các chủng thuộc phân dòng

Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông thường là -

RRRKK- (Matrosovich và cs, 1999) [108]. Sau một năm gây bệnh tại Hồng Kông,

do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thuỷ gốc Quảng

Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, người ta tưởng chúng đã biến mất,

nhưng thực tế chủng nguyên thuỷ này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam

Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới (Webster và

cs, 2002) [157]. Tuy nhiên các chủng virus cúm A/H5N1 hiện nay chỉ mang phân

đoạn HA của dòng virus gốc Quảng Đông nói trên (Duan và cs, 2007) [58], còn bảy

43

phân đoạn khác thu nhận từ các chủng virus cúm gia cầm khác thông qua sự tái tổ

hợp di truyền (Zhao và cs, 2008) [164].

Do biến đổi di truyền liên tục nên protein HA của virus cúm A/H5N1 dòng

châu Á có tính kháng nguyên thay đổi. Khi hiệu giá kháng thể HI giữa các chủng

virus A/H5N1 dòng châu Á lệch nhau 2log trở lên thì chúng sẽ thuộc các nhóm

kháng nguyên khác nhau. Gen HA của dòng A/Gs/GD/1/96 đã tiến hoá nhiều năm

qua, tạo nên nhiều nhánh (clade) hay còn gọi là nhóm kháng nguyên, hiện đã có 9

nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ 0-9 (WHO, 2008) [159], (Nguyễn Tiến Dũng,

2008) [5]. Riêng nhóm 2 được chia thành 5 nhóm phụ, đánh số từ 2.1 đến 2.5

(Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5].

Trong các năm 1997-2002, nhiều biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều

đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân týp H5 được hình thành tạo nên nhóm

kháng nguyên (clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi bị đào

thải trong những năm 2001-2002 (Guan và cs, 2002) [71], (Li và cs, 2004) [97].

Tiếp tục, trong năm 2002-2003, phân đoạn HA (H5) có những đột biến mới do hậu

quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift), để rồi tạo nên biến chủng

có tính gây bệnh rất cao, đặc biệt đối với vịt, và lây sang người (Guan và cs, 2004)

[72]. Đặc tính thích ứng gây bệnh trên người ngày càng cao dần, cùng với độc lực

tăng cường đối với nhiều vật chủ bao gồm gà, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, chim

hoang dã và người, để hình thành nhiều biến chủng xâm nhập các nước phía Nam

châu Á trong đó có Việt Nam và Thái Lan (Guan và cs, 2004) [72], (Peiris và cs,

2004) [121].

Có thể nói, sau giai đoạn 1997-2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ

hoàn thiện về đặc tính gây bệnh và thích ứng đa vật chủ, trở nên mối nguy cơ gây

bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004 -2005 (Li và cs, 2004)

[97], (Smith và cs, 2006) [137]. Tuy nhiên, xét về di truyền học và tính kháng

nguyên, các chủng H5N1 giai đoạn 1997-2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng

nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/GD/1/96 của Quảng Đông (Chen và cs,

2004) [44], và bắt đầu phân hoá ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003-2005

44

(de Jong và Hien, 2006) [54]. Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh ác liệt

trong giai đoạn này ở các nước Đông Nam Á là bằng chứng của sự đột biến “ lệch

kháng nguyên” của cúm A/H5N1 (Li và cs, 2004) [97], (Wu và cs, 2008b) [161].

Cuối năm 2005, có nhiều phân dòng của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình

thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like

sublineage, clade 2.2) (Salzberg và cs, 2007) [129], (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5]

và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage, clade 2.3.4), tràn ngập

châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia (Li và

cs, 2004) [97], (Smith và cs, 2006) [137], tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi

có tính gây bệnh cao đối với người (Skeik và Jabr, 2007) [136], (Peiris và cs, 2007)

[122], (Zhao và cs, 2008) [164].

Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến có cấu trúc gen NA (N1) không thay

đổi nhiều, nhưng gen HA (H5) có motif amino acid ở vùng nối của điểm cắt

protease là -RRRK-, giảm mất một lysin (K) so với các chủng phân dòng Quảng

Đông (Smith và cs, 2006) [137], và do vậy kể từ 2006 đến 2008, nhiều chủng/dòng

virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong đó có các chủng ở Việt Nam

(Nguyen và cs, 2008) [116]. Trong các năm 2006-2008, tuy bình diện dịch cúm gia

cầm không ác liệt như những năm 2003-2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng

virus cúm A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học cúm

A/H5N1 có thể đã trở nên phức tạp hơn (Zhao và cs, 2008) [164], (Gambotto và cs,

2008) [65].

1.3.2 Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 vào Việt Nam

từ khi cúm A/H5N1 hiện đại xuất hiện tại Quảng Đông Kể

(A/Gs/GD/1/96(H5N1) (Xu và cs, 1999) [162], có tất cả 12 genotype, bao gồm GD, A, B, C, D, E, X (X0-X3), V, Y, W, Z (Z+) và G đã được phát hiện, trong đó các chủng H5N1 của Việt Nam là loại mới biến đổi, hầu hết thuộc genotype Z, G và V

(Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Nguyen và cs, 2008) [116]. Từ năm 2002 trở

lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn tại

(đó là các genotype A, C, D, E), nhưng lại tiến hoá xuất hiện 8 genotype của H5N1

45

(V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) (Li và cs, 2004) [97], (Macken và cs, 2006) [105].

Dựa vào gen HA, sáu clade khác nhau đã được Tổ chức Y tế thế giới xác

định và sắp xếp theo hệ thống dan h pháp dành cho virus H5N1 thể độc lực cao, bao

gồm: clade 0, HK97-like (HK/483/97); clade 1 (HK821-like, Dk/HK821/02); clade

2.3.2 (E319-like, Dk/China/E319-2/03); clade 2.3.4 (Fj584-like, Ck/Fujian/584/05);

clade 3 (GX22-like, Dk/GX/22/01); clade 5 (F1-like, swine/Fujian/F1/01) (WHO,

2008) [159]. Sáu clade HA này cùng nhóm với các virus tiền thân đã được phân lập

trước đó ở Trung Quốc và Hồng Kông. Các virus tiền thân này có thể là thủy tổ của

các dòng virus ở Việt Nam (Wan và cs, 2008) [152] (Hình 1.11).

Nghiên cứu của Wan và cộng sự (2008) [152] cho thấy, virus cúm gia cầm

A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2001-2007 bao gồm 9 genotype (từ VN1

đến VN9) tương ứng với 6 kiểu hình kháng nguyên ( clade 0, clade 1, clade 2.3.2,

clade 2.3.4, clade 3, clade 5). Genotype VN1 xuất hiện năm 2001 (thuộc clade 3),

VN2: năm 2003 (clade 5), VN3: các năm 2003-2007 (clade 1), VN4: từ năm 2005

(clade 2.3.2), VN5: năm 2005 (clade 0), VN6: từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7: từ

năm 2007 (clade 2.3.4), VN8: từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9: từ năm 2007 (clade

2.3.4).

Hình 1.11: Sự xâm nhập của virus cúm A/H5N1 độc lực cao vào Việt Nam giai đoạn 2001-2007. Nguồn: (Wan và cs, 2008) [152]

46

Chủng virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4 xâm nhập vào miền Bắc Việt Nam

năm 2007, tái tổ hợp với các chủng virus thuộc clade 1 tồn tại trước đó, dẫn đến

xuất hiện các genotype mới với nguồn gen NA và/hoặc nguồn gen khung lấy từ

chủng virus thuộc clade 1 (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyen và cs, 2008) [116].

Đầu năm 2008 chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 được phát hiện trên gà nhập

lậu tại cửa khẩu Lạng Sơn (Nguyen và cs, 2009) [117]. Năm 2011 FAO và WHO

xác nhận virus cúm A/H5N1 thuộc 2 clade 2.3.2.1 và 1.1 cũng đã xuất hiện tại Việt

Nam (FAOAIDEnews, 2011) [168], (WHO, 2011) [170].

Phân tích động thái lây nhiễm virus H5N1 cho thấy đa số các chủng virus có

chứa các gen mới đều được phát hiện đầu tiên ở miền Bắc Việt Nam, tiếp đó lan

truyền tới miền Nam sau khi đã tái tổ hợp với các chủng virus tồn tại trước đó ở

miền Bắc (Wan và cs, 2008) [152].

Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam trong những năm 2004-2006, thuộc

phân dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z (Smith và cs, 2006) [137],

(Nguyen và cs, 2008) [116]. Genotype Z được xác định lần đầu tiên tại Trung Quốc

năm 2002 (Wan và cs, 2008) [152]. Mặc dù đường xâm nhập của virus genotype này

vào Việt Nam còn chưa xác định, các chủng virus phân lập tại Việt Nam có quan hệ

phả hệ gần gũi với các phân lập virus của Trung Quốc, chứng tỏ có sự lan truyền

trực tiếp virus H5N1 giữa Việt Nam và Trung Quốc (Wang và cs, 2008) [154]. Virus

genotype Z lưu hành cả ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam từ khi chúng xâm nhập,

xen lẫn với những genotype phát hiện trước đó vào đầu năm 2003, tiếp tục tồn tại ít

nhất là đến đầu năm 2007 (Wan và cs, 2008) [152], và được phân thành 2 nhóm:

nhóm N (North) phổ biến ở Bắc Việt Nam và nhóm S (South) phân bố ở miền Nam;

gần đây xuất hiện thêm genotype G (Smith và cs, 2006) [137], (Nguyen và cs, 2008)

[116]. Sự xuất hiện của genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W

và genotype Z (Chen và cs, 2006) [46]. Năm 2007, ngoài các chủng và genotype

thuộc phân dòng Quảng Đông gây dịch cúm gia cầm, còn có một phân dòng khác đã

được phân lập và xác định bằng sinh học phân tử phân tích gen H5 và N1, đó là

phân dòng Phúc Kiến (Nguyen và cs, 2008) [116]. Tiến hoá chủng/týp và dòng tái tổ

47

hợp mới thường định hình và xuất phát từ các tỉnh ở Nam Trung Quốc (Smith và cs,

2006) [137], (Wang và cs, 2008) [154].

Mặc dù đường xâm nhập và lan truyền H5N1 ở Việt Nam còn mang tính suy

đoán, việc tăng cường kiểm soát nhập khẩu gia cầm và nỗ lực điều tra nghiên cứu

về virus có thể giúp hạn chế sự xâm nhập và lan truyền các gen mới của virus cúm

gia cầm độc lực cao ở Việt Nam (Nguyen và cs, 2009) [117].

1.3.3 Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng

nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng

nguyên, hình thành các nhánh virus khác nhau, ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của

gia cầm khi đượ c tiêm phòng vaccine. Từ năm 2001 đến 2007 đã có 6 clade virus

cúm gia cầm H5N1 lưu hành tại Việt Nam, bao gồm: clade 0, clade 1, clade 2.3.2,

clade 2.3.4, clade 3, clade 5 (Wan và cs, 2008) [152]. Đầu năm 2008, chủng virus

cúm A/H5N1 thuộc clade 7 đã được phát hiện trên gà nhập lậu qua đường Lạng Sơn

(Nguyen và cs, 2009) [117]. Năm 2011, Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ

chức Y tế thế giới (WHO) thông báo đã phát hiện các phân nhánh virus cúm

A/H5N1 thể độc lực cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 tại Việt Nam (FAOAIDEnews,

2011) [168], (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012)

[20]. Các phân nhánh này không phải mới xuất hiện mà được hình thành trong quá

trình tiến hoá tự nhiên. Phân nhánh 1.1 có nguồn gốc từ clade 1. Phân nhánh 2.3.2. 1

được tiến hóa từ clade 2.3.2 (WHO, 2011) [170].

Kết quả nghiên cứu của Long và cộng sự (2011) [103] trên 15 mẫu gia cầm

mắc bệnh thu nhận từ các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Khánh Hòa và Bến Tre trong

giai đoạn từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 cho thấy, gen HA của các chủng virus

cúm A/H5N1 đã tạo nên một phân nhánh mới so với các chủng virus cúm A/H5N1

thuộc clade 1. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm

A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cho thấy đã có sự hình thành

clade 1.1. Từ cuối năm 2010, clade 1.1 được phát hiện ở gia cầm tại các tỉnh phía

Nam của Việt Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia (WHO, 2011) [170].

48

Tại các tỉnh phía Nam clade 1 lưu hành suốt từ năm 2003 đến nay; trong khi

ở các tỉnh phía Bắc, duyên hải miền Trung và Tây Nguyên luôn có sự thay thế của

các clade virus cúm A/H5N1 mới, cụ thể năm 2007 clade 2.3.4 thay thế clade 1,

năm 2010 clade 2.3.2 thay thế clade 2.3.4 và tiếp tục lưu hành cho đến nay (Văn

Đăng Kỳ, 2012) [15].

Hiện nay, clade 2.3.2 đã biến đổ i và phát triển thành 2 clade phụ (clade

2.3.2.1a và clade 2.3.2.1b) có sự khác biệt lớn về kháng nguyên. Clade phụ 2.3.2.1a

lưu hành rộng rãi ở hầu khắp các tỉnh Bắc Giang, Bắc Kạn, Bắc Ninh, Thái Nguyên,

Lạng Sơn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà N ội, Hà Nam, Nam Định,

Ninh Bình, Thanh Hóa, Hải Phòng, Bình Định, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị,

Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Tây Ninh; trong khi đó clade phụ

2.3.2.1b chỉ phát hiện tại Nam Định, Thái Bình, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn và

Nghệ An (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].

. Thí nghiệm của Cục Thú y đánh giá độc lực của virus clade 2.3.2 cho thấy,

sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòn g 3 ngày và 20% vịt chết trong

vòng 7 ngày. Như vậy, clade virus mới này rất độc đối với gà và ít độc hơn với vịt

(clade 1 và clade 2.3.4 có thể gây chết 60-70% vịt) (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].

Vaccine H5N1 Re-1 vẫn có hiệu quả đối với virus clade 1 và clade 2.3.4, đối với

clade 2.3.2.1a hiệu quả bảo hộ chỉ đạt khoảng 80% nếu tiêm 1 mũi, còn đối với

clade 2.3.2.1b kể cả khi tiêm 2 mũi thì tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt 50%. Vaccine H5N1 Re -

5 nếu tiêm 1 mũi thì tỷ lệ bảo hộ đạt 70% với clade 2.3.2.1a và không bảo hộ với

clade 2.3.2.1b.

Hiện nay, tại Việt Nam chưa phát hiện virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở

người. Tuy nhiên, do chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1

nên gia cầm hoàn toàn không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm

A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ gây bệnh trên

người (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20].

Do đó, giám sát virus cúm ở gia cầm, áp dụng các biện pháp phòng chống dịch

thích hợp là việc làm cần thiết nhằm ngăn chặn sự truyền lây dịch ở gia cầm và từ

49

gia cầm sang người.

1.4 PHẢN ỨNG RT-PCR TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A

Hệ gen của virus cúm A là một tập hợp các chuỗi nucleotide phân bố trong

các phân đoạn dài ngắn khác nhau. Phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản

ứng RT-PCR và real-time PCR trong chẩn đoán, giám định, phân loại, giải trình

trình tự các phân đoạn và toàn bộ hệ gen, di truyền quần thể, xem xét tiến hóa và

nguồn gốc các biến chủng được cho là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu virus

cúm A gây bệnh ở động vật và người (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7]. RT-PCR có

thể sử dụng nhân các gen ”độc” HA và NA, cũng như các gen khung (backbone

genes) của virus cúm A để giải trình tự, đối chiếu so sánh thành phần nucleotide của

các subtype H và N; phân biệt chủng độc lực cao (HPAI) và chủng độc lực thấp

(LPAI) qua phân tích chuỗi nối giữa HA1 và HA2; tìm nguồn gốc tiến hóa của gen

HA và biến thể gen của virus cúm A/H5N1 (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7].

Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn

RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ

nhất là chuyển đổi RNA một sợi làm khuôn thành DNA (2 sợi) gọi là chuyển đổi

cDNA và giai đoạn thứ hai là dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực

hiện phản ứng PCR.

RNA có cấu trúc một sợi bao gồm các nucleotide liên kết với nhau, trong đó

có Adenine (A), Guanine (G), Cytosine (C), nhưng Thymine (T) (trong cấu trúc

DNA) được thay thế bằng Uracil (U). Chuỗi nucleotide này phải được chuyển đổi

thành DNA hai sợi, trong đó thành phần Uracil được thay thế bằng Thymine. Phản

ứng này làm biến đổi RNA hệ gen thành DNA phải nhờ đến vai trò của enzym sao

chép ngược (Reverse - Transcriptase enzyme), do vậy giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển ngược, được thực hiện ở 42 -45oC hoặc 50-550C. Khi đã có DNA

hai sợi làm khuôn chuyển đổi từ RNA ban đầu, phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Toàn

bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai đoạn nói trên, được

gọi là phản ứng RT -PCR hay phản ứng PCR ngược.

Tùy theo mục đích của việc thực hiện các phản ứng RT-PCR, có thể sử dụng

50

RT-PCR một bước hoặc RT-PCR hai bước. Trong chẩn đoán và xác định virus cúm

A hiện nay phương pháp RT-PCR một bước (one -step RT-PCR) được đánh giá là

phương pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp với các kết quả phân

lập virus RNA gây bệnh.

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚ M A/H5N1

TẠI VIỆT NAM

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện tại Việt Nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn

Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu về

virus và bệnh cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu về dịch

tễ bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn đoán, nghiên cứu

ứng dụng vaccine, xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng, điều tra mức độ

nhiễm bệnh và hướng phòng chống, giám định phân tử và phân nhóm phả hệ virus

gây bệnh; và nghiên cứu sản xuất, thử nghiệm vaccine.

Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử (định týp, biến đổi di truyền và gen học

tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của

Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm c uối

năm 2003 (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Các chuỗi gen giúp xác định phân týp

H5, phân týp N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh,

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn đoán

thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Le Thanh

Hoa và cs, 2006) [95], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê

Thanh Hòa, 2012) [20]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1,

các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người

tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến

Dũng và cs, 2004) [4], (Le Thanh Hoa và cs, 2006) [95], (Muramoto và cs, 2006)

[112], (Wan và cs, 2008) [152]. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc

phân lập những năm 1997-2001 và Hàn Quốc, Đài Loan phân lập năm 2003 đều có

nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông, đó

là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4] ,

51

(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm

và người tại Việt Nam là cúm H5N1 týp A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi về gen

H5 và gen N1, nhưng vẫn cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung

Quốc và Hồng Kông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Nguyen và cs, 2008)

[116], (Li và cs, 2004) [97], (Smith và cs, 2006) [137]. Sự xâm nhập và tiến hóa của

các biến chủng virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam cũng đã được nhiều tác giả nghiên

cứu (Nguyen và cs, 2008) [116], (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyen và cs, 2009)

[117], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Tại Việt Nam, ngoài

sự lưu hành của các chủng phân dòng Quảng Đông, năm 2007 xuất hiện thêm biến

chủng H5N1 phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) (Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008)

[13], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Wan và cs, 2008) [152], (Le và cs, 2008) [93] và

đến nay xuất hiện clade 2.3.2.1 (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012)

[20], (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15] đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học

và quan hệ kháng nguyên - miễn dịch.

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Pasteur

thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Viện Thú y trung

ương đã tiến hành thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên

gà, vịt, ngan của Việt Nam, so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các

chủng cường độc đương nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới để nghiên cứu

về gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch (Lê Thanh Hoà và cs,

2004) [7], (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Le Thanh Hoa và cs, 2006) [95],

(Lê Trần Bình, 2007) [1], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Le và cs, 2008) [93],

(Nguyễn Thị Bích Nga và cs, 2011) [19], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa,

2012) [20]. Phân tích các chuỗi gen thu nhận từ nhiều vùng miền khác nhau trong

cả nước, nhiều nghiên cứu khẳng định đã có sự hỗn hợp virus gây bệnh và phân hoá

kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam (Nguyen và cs, 2008) [116], (Le

và cs, 2008) [93], (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyễn Tùng và cs, 2011) [30],

(Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20], (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].

Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới xây

52

dựng các phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh virus gây bệnh, phân biệt cúm A

với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA

và NA. Các phương pháp phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác

bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng đã

được xây dựng (Chan và cs, 2007) [43], (Wu và cs, 2008b) [161]. Nhiều nghiên cứu

khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm H5N1 (Dương Thị Thanh Thảo và Lý

Thị Liên Khai, 2011) [27], (Lưu Hữu Mãnh và cs, 2011) [17], (Văn Đăng Kỳ, 2012)

[15]) và đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm sau tiêm phòng vaccine tại các địa

phương khác nhau của Việt Nam (Tô Long Thành và Đào Yến Khanh, 2009) [26],

(Nguyễn Hoàng Đăng và Tô Long Thành, 2009) [6], (Trịnh Thị Quý và cs, 2010 )

[23], (Lê Đình Nghi và cs, 2010) [21], (Nguyễn Văn Cảm và cs, 2011 ) [2] cũng đã

được tiến hành. Các nhà khoa học Việt Nam đã có những đóng góp nhất định trong

lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch. Những chế phẩm kháng nguyên, vaccine

di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam

cũng đã đượ c tạo ra (Gao và cs, 2006) [66], (Lu và cs, 2006) [104], (Lê Trần Bình,

2007) [1].

Trong lĩnh vực sản xuất vaccine, các đề tài cấp nhà nước của Viện Công

nghệ Sinh học “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho

gia cầm”, và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm

tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” đã được thực hiện (Lê Trần Bình, 2007) [1].

Kết quả là đã sản xuất được vaccine từ chủng NIBRG -14; xây dựng được các qui

trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm

A/H5N1 và miễn dịch của vaccine đạt chất lượng khi kiểm nghiệm bằng phương

pháp huyết thanh học và công cường độc (Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn

Hiệp, 2006) [22], (Lê Trần Bình, 2007) [1] . Ngoài ra, một số đề tài nhà nước khác

nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền gen kháng

nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus, chuyển gen vào thực vật cũng được

tiến hành (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật/công nghệ cao (di truyền ngược, tái tổ hợp vector) sử dụng nguồn gen H5N1

53

của Việt Nam, công nghệ tái tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực

vật và tế bào, cũng đang được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Thú y,

Viện Di truyền Nông nghiệp và một số cơ sở nghiên cứu khác (Lê Thanh Hòa,

2006) [10], (Lê Trần Bình, 2007) [1], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Ngoài

những nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm, các cơ sở y tế như bệnh viện, viện

nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ư ơng, Viện

Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện vaccine Nha Trang) đều có triển khai các lĩnh

vực nghiên cứu liên quan đến cúm A/H5N1 trên người (Le và cs, 2005) [92],

(Nguyễn Thị Kim Tiến, 2005) [28], (Cao Thị Bảo Vân và cs, 2005) [32], (Dinh và

cs, 2006) [56], (Chan và cs, 2007) [43], (Hatta và cs, 2007) [74], (Lê Quỳnh Mai,

2011) [16].

Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên nền

virus cúm A/H5N1 của Việt Nam đã và đang làm sáng tỏ thêm về mối quan hệ tiến

triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá và genotype, và

kháng nguyên-miễn dịch-vaccine của cúm gia cầm tại Việt Nam (Lê Thanh Hòa và

cs, 2008) [11]. Tuy nhiên, trong những năm đầu tiên khi dịch cúm gia cầm mới

bùng phát, do tập trung đối phó với dịch nên phần lớn các công trình nghiên cứu về

virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam còn thiếu sự gắn kết giữa nghiên cứu về gen với

nghiên cứu dịch tễ học; những năm sau đó, các nghiên cứu dần dần có tính hệ thống

hơn. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là về virus cúm A/H5N 1, tập trung trong

lĩnh vực dịch tễ học và khả năng kháng thuốc của virus, chưa quan tâm nhiều đến

các phân týp virus cúm A khác nên rất khó dự đoán khả năng trao đổi chéo, tái tổ

hợp gen giữa các phân týp virus cúm A. Số lượng các công trình nghiên cứu về sinh

học phân tử virus cúm A/H5N1 đảm bảo được tính hệ thống, liên tục từ nghiên cứu

hệ gen đến biểu hiện protein, tạo kháng nguyên làm nguyên liệu sản xuất vaccine

còn rất hạn chế. Những nghiên cứu về khả năng tạo miễn dịch của các loại vaccine

sử dụng đã được thực hiện tại một số địa phương. Tuy nhiên, do số liệu khảo sát về

đáp ứng miễn dịch của gia cầm trên toàn quốc và những nghiên cứu về tương quan

kháng nguyên - miễn dịch của các chủng virus cúm A/H5N1 hiện hành còn chưa

54

đầy đủ, mặt khác, do sự đa dạng kháng nguyên của các chủng virus cúm A/H5N1

lưu hành tại Việt Nam nên việc nghiên cứu sản xuất vac cine còn hạn chế. Gần đây,

Viện Công nghệ Sinh học trên cơ sở đề tài cấp nhà nước đã hoàn thiện quy trình sản

xuất vaccine NIBRG-14 (clade 1) và đã chuyển giao cho công ty thuốc thú y trung

ương II (NAVETCO). Hiện nay, NAVETCO đã được cấp phép sản xuất loại

vaccine này. Tuy nhiên, do sự xuất hiện của clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b nên việc

nghiên cứu và cập nhật các loại vaccine mới cần được tiếp tục.

1.6 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS CÚM

A/H5N1

Một trong những đặc điểm quan trọng của virus cúm A/H5N1 là hệ gen luôn

biến đổi để thích ứng gây bệnh. Do đó việc giải mã hệ gen, theo dõi thông tin di

truyền của virus là hết sức cần thiết. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung

cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những

biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.

Trình tự nucleotide của 8 phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ

gia cầm là cơ sở để xá c lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các chủng virus

cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới theo thời gian. Trình tự nucleotide

của các chủng virus phân lập ở các vùng miền khác nhau còn có vai trò quan trọng

trong việc xác định các chủng virus đó là đồng chủng hay dị chủng giữa các địa

phương, các vùng địa lý và các quốc gia khác nhau, từ đó có thể biết được dịch tễ

học của bệnh cúm gia cầm ở mức độ sinh học phân tử.

Đột biến trong các gen kháng nguyên (HA và NA) và trong các gen khung

khác (PB2, PB1, PB1-F2, NP, M và NS) của virus cúm A/H5N1 có thể làm thay đổi

độc lực, tính gây bệnh và khả năng thích nghi của virus trên các loài vật chủ khác

nhau. Do đó việc giải mã hệ gen là cơ sở quan trọng để phát hiện những biến chủng

virus mới có khả năng gây bệnh trên người.

Mặt khác, do virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi kháng nguyên cao nên

thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và amino acid

của các chủng virus phân lập có thể xác định những vùng gen thường biến đổi và

55

vùng gen ổn định, từ đó lựa chọn loại vaccine thích hợp cho công tác phòng chống

dịch, đồng thời tìm ra những chủng virus thích hợp để sản xuất vaccine, đặc biệt là

vaccine thế hệ mới.

Ngoài ra, các dữ liệu gen học có được từ việc giải mã hệ gen còn là cơ s ở để

xây dựng các bộ kit chẩn đoán, giúp phát hiện nhanh và chính xác dịch cúm gia cầm

ở gia cầm và dịch cúm A/H5N1 ở người.

56

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đ ề tài là virus cúm A/H5N1 từ gà mắc bệnh cúm

gia cầm nuôi tại tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, phân lập năm 2005.

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện tại Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học

(Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2005 đến tháng 10/2009.

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4) phân lập

từ gà Hậu Giang

- Giải trình tự gen kháng nguyên HA và NA

- Giải trình tự gen polymerase PB2, PB1 và PA

- Giải trình tự các gen NP, M và NS

2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng

CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới

- Phân tích thành phần nucleotide và amino acid.

- Phân tích đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid.

- Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.

2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.4.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là dịch khí quản - phế quản chứa virus cường độc

cúm A/H5N1 được chọn nghiên cứu từ số mẫu thu nhận từ từng cá thể gà bị bệnh

tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), viết tắt CkHG4). Bệnh phẩm đã được vô hoạt ở nhiệt độ 100 oC trong 30 giây, đảm bảo an toàn sinh học, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng để tách RNA tổng số.

57

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị

- Thiết bị: + Tủ lạnh thường (0 -4oC), tủ lạnh -80oC, tủ ấm 37oC.

+ Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh.

+ Máy PCR (PTC-100 thermal cycler) của MJ. Research Inc.

+ Bộ điện di DNA kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Bio-Rad.

+ Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, USA).

+ Máy Vortex, máy ổn nhiệt, máy nuôi lắc tế bào.

+ Buồng cấy vô trùng.

+ Máy giải trình tự tự động ABI Avant Genetic Analyzer 3100.

+ Máy tính và các phần mềm sinh - tin học.

- Dụng cụ: Bộ pipetman (10(cid:61549)l, 20(cid:61549)l, 100(cid:61549)l, 200(cid:61549)l, 1000(cid:61549)l và 5000(cid:61549)l), các

loại đầu côn, các loại ống Eppendorf, chai lọ đựng môi trường, ống nuôi cấy vi

khuẩn, đĩa Petri, que cấy, đèn cồn, hộp đựng đá, găng tay, dao, kéo, panh, kẹp.

2.4.3 Hóa chất

- Bộ kit tách chiết RNA tổng số là QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc,

USA) và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.

- Bộ kit dùng cho phản ứng RT -PCR do hãng Invitrogen cung cấp.

- Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng QIAGEN.

- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp.

- Kháng sinh Kanamycin, Ampicillin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối.

- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp là QIAprep Spin Miniprep Kit do hãng

QIAGEN cung cấp.

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự.

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự.

2.4.4 Các dung dịch và môi trường

- Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100ml): Tris-kiềm: 24,2%; Axit axetic: 5,71

ml; EDTA 0,5M (pH=8,0): 10 ml.

58

- Dung dịch đệm TAE 1X: pha loãng từ TAE 50X.

- Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol

FF: 0,25%; Glycerol: 30%.

- Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (EtBr): 0,5 mg/ml.

- Dung dịch SOC: Trypton: 20g/l; dịch chiết nấm men: 5g/l; NaCl: 10mM;

KCl: 2,5mM; MgCl2: 10mM; MgSO4: 10mM; glucose: 20mM.

- Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% Trypton; 0,5% cao nấm men; 1%

NaCl.

- Môi trường chọn lọc (môi trường LB đặc): thành phần như môi trường LB

nhưng bổ sung thêm 1,5% agar , Kanamycin hoặc Ampicillin 50 μg/ml, 40 μl X-gal

(20mg/ml).

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thu nhận các chuỗi gen của chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 chúng tôi sử

dụng quy trình nghiên cứu tổng quát trình bày ở Hình 2.1.

TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ

PHẢN ỨNG RT-PCR

DÒNG HÓA DNA SẢN PHẨM RT-PCR VÀO VECTOR pCR®2.1-TOPO

TÁCH CHIẾT DNA CỦA PLASMID

GIẢI TRÌNH TỰ

THU NHẬN CHUỖI DNA (ĐÃ XỬ LÝ)

SO SÁNH, PHÂN TÍCH CHUỖI DNA (BIỂU THỊ, PHÂN TÍCH, SO SÁNH THÀNH PHẦN

NUCLEOTIDE, THÀNH PHẦN AMINO ACID, XÁC ĐỊNH

PHẢ HỆ, NGUỒN GỐC)

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát để thu nhận các chuỗi gen

2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Mẫu bệnh phẩm là dịch khí quản-phế quản được pha với nước cất vô trùng

59

theo tỷ lệ 1:1, đông tan 3 lần giữa -20oC và nhiệt độ phòng (25oC), nhằm giải phóng

virus khỏi tế bào. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi phía trên có

chứa virus.

Bộ sinh phẩm sử dụng để tách RNA tổng số là QIAamp Viral Mini Kit

(QIAGEN), tóm tắt các bước như sau: lấy 560 (cid:61549)l dung dịch đệm AVL cho vào ống

Eppendorf, cho thêm 140 (cid:61549)l huyễn dịch mẫu bệnh phẩm, tiếp tục thêm 560 (cid:61549)l

Ethanol (96-100%). Một nửa thể tích huyễn dịch được chuyển sang cột lọc

(QIAamp spin column) và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch ly tâm được

loại bỏ và lặp lại như trên với thể tích huyễn dịch còn lại. Sau đó, cho 500 (cid:61549)l dung

dịch đệm AW1 để rửa cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ dịch bên

dưới có trong ống ly tâm. Lặp lại bước trên với dung dịch đệm rửa AW2 nhưn g ly

tâm 2 lần 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang ống Eppendorf sạch,

cho lên màng lọc của cột lọc 60 (cid:61549)l dung dịch AVE, để nhiệt độ phòng 1 phút, ly

tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch thôi ra trong ống ly tâm chính là RNA tổng số, trong đó có RNA hệ gen virus cúm gia cầm, được bảo quản ở - 20oC.

2.5.2 Phương pháp RT-PCR

Trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng

phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN). Thành phần phản ứng và các chu trình

nhiệt lần lượt được trình bày ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2.

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT -PCR

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

QIAGEN-onestep RT-PCR 5X 10

dNTP mix (10mMol/µl) 2

Enzym mix Mồi xuôi (10pMol/µl) 2

Mồi ngược (10pMol/µl) 2

RNA tổng số 2

Nước tinh khiết 30

Tổng thể tích 50

60

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1

Chu trình nhiệt

Phân đoạn gen

PB2

PB1

61

Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR và sơ đồ bố trí mồi để thu

nhận các phân đoạn gen được trình bày ở Bảng 2.3 và Hình 2.2.

Bảng 2.3: Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm

TT

Tên mồi

Mô tả

Ghi chú

Trình tự mồi (5’(cid:61664)3’)

Thu nhận gen PB2

PB2F

CAGGTCAAATATATTCAATATGGAG

Mồi xuôi

Thu nhận gen PB2

PB2R1

CCICCAAAISTGAAGGATGA

Mồi ngược

Thu nhận gen PB2

PB2F3

5'- AAAGCAGCAATGGGTCTG -3'

Mồi xuôi

Thu nhận gen PB2

PB2R

CTAATTGATGGCCATCCG

Mồi ngược

Thu nhận gen PB1

PB1F1

TTGAATGGATGTCAATCCGA

Mồi xuôi

Thu nhận gen PB1

PB1R2

CATCGGTATGTGTATCTGTAGTCC

Mồi ngược

Thu nhận gen PB1

PB1F3

TGAGCATTGGTGTTACAGTG

Mồi xuôi

Thu nhận gen PB1

PB1R3

AGTAGAAACAAGGCATTTTTT

Mồi ngược

Thu nhận gen PA

PAF

AAGAWTTTGTGCGACAATGCT

Mồi xuôi

Thu nhận gen PA

PAR

GACATTTGAGAAAGCTTGCC

Mồi ngược

Thu nhận gen PA

PAF2

TTGTCTCTTCGCCTCTCTCG

Mồi xuôi

Thu nhận gen PA

PAR2

GATTGAAGAAGGCATCGC

Mồi ngược

Thu nhận gen PA

PAF3

ACCAAAGAAGGAAGACGG

Mồi xuôi

Thu nhận gen PA

PB1R3

AGTAGAAACAAGGCATTTTTT

Mồi ngược

Mồi xuôi, có điểm

CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAA

15 H5BAMF

Thu nhận gen H5

cắt của enzym

AATAGTGCTT

BamHI GGATCC

Mồi ngược, có điểm

ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATG

16 H5NOTR

Thu nhận gen H5

cắt của enzym NotI

CAAATTCTGCATTGTAACGA

GCGGCCGC

17 NPF

ATGGCGTCTCAAGGCACC

Thu nhận gen NP

18 NPR

TTAATTGTCATACTCCTCTGC

Mồi xuôi Mồi ngược

Thu nhận gen NP

CCGGAATTCAAAATGAATCCAAATCA

19 N1ECOF

Mồi xuôi

Thu nhận gen N1

GAAGATAATAACCATT

ATAAGAATGCGGCCGCTCACTACTTG

20 N1NOTR

Mồi ngược

Thu nhận gen N1

TCAATGGTGAATGGCAA

21 MAF

ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC

Mồi xuôi

Thu nhận gen M

22 MAR

GAAACAAGGTAGTTTTTTACTCC

Mồi ngược

Thu nhận gen M

23 NSF1

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA

Thu nhận gen NS

24 NSR1

AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT

Mồi xuôi Mồi ngược

Thu nhận gen NS

62 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí các mồi để thu nhận các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1

63

2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR

Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên thạch agarose 1%.

Chỉ thị DNA sử dụng trong nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có

kích thước 43 kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII. DNA của thực khuẩn

thể Lamda được HindIII cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5

kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb và 0,125 kb. Độ dài của đoạn sản phẩm RT -

PCR có thể xác định được khi đối chiếu với chỉ thị phân tử.

Kiểm tra sản phẩm RT-PCR được thực hiện ở các bước sau:

- Chuẩn bị thạch agarose 1%.

- Dìm ngập khay có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần.

- Tra mẫu: lấy 5 µl sản phẩm trộn với chỉ thị màu (loading dye - thường là

xanh Bromophenol và Glycerol) và tra vào từng giếng trong thạch.

- Tra chỉ thị phân tử: lấy 10 µl (0,5 µg) chỉ thị phân tử (DNA marker) cho vào 1

giếng riêng biệt khác.

- Thực hiện điện di ở 100-120V, 400 mA trong 25-30 phút.

- Rửa thạch bằng nước cất, soi qua tia cực tím và chụp ảnh.

2.5.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Sản phẩm RT-PCR được tinh sạch bằng bộ QIAquick PCR purification kit

(QIAGEN), như sau:

- Thêm 200 µl PB vào 40 µl sản phẩm, trộn đều.

- Chuyển cột, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.

- Thêm 750 µl PE, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.

- Ly tâm tiếp 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới.

- Thêm 30 µl EB, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút. Thu nhận sản

phẩm PCR tinh sạch, ký hiệu mẫu và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.

64

2.5.5 Phương pháp dòng hóa

2.5.5.1 Nối sản phẩm RT-PCR vào plasmid vector

Do sản phẩm PCR/RT-PCR (sử dụng enzym Taq DNA polymerase xúc tác

tổng hợp) thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3’, nên khi nối với vector có

đầu lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai

nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzym nối T4-DNA ligase hoặc

enzym topoisomerase.

Các vector thường được sử dụng để nối ghép (ligation) sản phẩm PCR/RT -

PCR vào vector là pCR2.1 hay pCR2.1TOPO (Invitrogen) (Hình 2.3).

pCR®2.1-TOPO® 3931 nucleotides

Hình 2.3: Cấu trúc vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen)

65

Thành phần phản ứng:

Vector pCR2.1TOPO: 1 µl

Nước tinh khiết: 2 µl

Sản phẩm PCR: 2 µl

Dung dịch muối: 1 µl

Tổng số: 6 µl

Giữ ở nhiệt độ 25oC trong 10 phút. Chuyển nạp và nuôi cấy trên môi trường

thạch LB có chứa kháng sinh và X-gal.

Các bước tiến hành:

- Lấy 3 µl sản phẩm của phản ứng nối-ghép, chuyển vào ống chứa 50 µl tế

bào khả biến.

- Ủ trên đá trong 45 phút, xử lý nhiệt (heat -shock) ở 420C trong 45 giây,

ngay lập tức chuyển vào trong đá và để 2 phút.

- Thêm 150 µl SOC (dung dịch giàu dinh dưỡng), lắc 200 vòng/phút ở 37 0C

trong 1 giờ 30 phút.

- Toàn bộ hỗn hợp được dàn trên mặt thạch LB 1,5% có chứa kháng sinh

Kanamycin (hoặc Ampicillin) và X-gal, ủ ở tủ ấm 370C trong 18-20 giờ.

- Sau khi ủ 18 - 20 giờ, nếu có khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch, thì đưa đĩa thạch vào ngăn lạnh (10 oC) trong tủ lạnh để X-gal phân giải hoàn toàn, giúp

nhận biết dễ dàng khuẩn lạc trắng và xanh trong quá trình chọn lọc khuẩn lạc.

2.5.5.2 Chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng

- Khuẩn lạc màu trắng (tốt nhất là màu trắng ngà) trên môi trường thạch LB

được lựa chọn để nuôi cấy trong môi trường LB lỏng.

- Bổ sung 10 µl Kanamycin (50mg/ml) để chọn lọc dòng vi khuẩn có mang

gen kháng kháng sinh.

- Bổ sung thêm 7 µ l X-gal (40mg/ml) vào môi trường để phân biệt ống môi

trường có vi khuẩn tái tổ hợp phát triển (không có màu xanh) với ống có vi khuẩn

không tái tổ hợp (có màu xanh) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn

lọc khuẩn lạc có nhân khuẩn lạc màu hơi xanh chưa phân biệt được.

66

- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc với tần số 220 lần/phút

trong 16-20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.

2.5.5.3 Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp

Quá trình tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit QIAprep Spin

Miniprep của hãng QIAGEN được thực hiện theo các bước như sau:

- Lấy 1,5 ml dung dịch tế bào vi khuẩn tái tổ hợp đã được nuôi cấy qua đêm

cho vào ống Eppendorf (trước khi lấy cần lắc nhẹ ống nuôi cấy vi khuẩn cho đều).

- Ly tâm 10.000 - 13.000 vòng/phút trong 4-5 phút để thu lấy tế bào, bỏ môi

trường bên trên, giữ lại cặn tế bào bên dưới.

- Thêm 250 µl dung dịch P1 vào ống có chứa cặn tế bào để hòa tan cặn, dùng

pipet hút nhẹ nhàng lên xuống vài lần cho đều phần cặn trong dung dịch.

- Bổ sung 250 µl dung dịch P2 vào ống Eppendorf chứa tế bào trên để ly giải

tế bào, lắc ống vài lần, để ở nhiệt độ phòng trong 3 -4 phút (không quá 5 phút).

- Thêm 350 µl dung dịch N3, trộn toàn bộ ống bằng cách lắc xuôi-ngược ống

vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. D NA của plasmid tái tổ hợp có trong

phần dịch ở trên. Lớp cặn kết tủa màu trắng bám dọc theo thành ống gồm các thành

phần hữu hình tế bào, các loại muối vô cơ và nhiều thành phần khác.

- Chuyển toàn bộ phần dịch bên trên (khoảng 800 µl) lên bề mặt màng của

cột lọc đặt trong 1 ống hứng (collection tube). Khi chuyển không được động đến

cặn tủa màu trắng bám dọc theo thành ống.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. DNA của plasmid

tái tổ hợp mang điện tích âm được giữ lại trong màng lọc the o cơ chế liên kết tích

điện.

- Thêm 500 µl dung dịch PB lên trên màng lọc để rửa màng lọc có DNA của

plasmid.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.

- Thêm 750 µl dung dịch PE lên trên màng lọc để tiếp tục rửa màng lọc.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.

- Ly tâm tiếp 13.000 vòng/phút trong 1 phút cho màng chứa DNA của

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide gen HA (H5)

và gen NA (N1) chủng CkHG4

A. Gen HA (H5)

% so sánh

Chủng virus có độ đồng nhất

Điểm

Tổng số

Số đăng ký

Giá trị E

% đồng nhất

B. Gen NA (N1)

% so sánh

Chủng virus có độ đồng nhất

Điểm

Tổng số

Số đăng ký

Giá trị E

% đồng nhất

Phụ lục 2: Minh họa bản quyền đăng ký Ngân hàng gen của gen HA và NA chủng CkHG4

A. Gen HA GenBank

EF051513

LOCUS EF051513 1733 bp DNA linear SYN 19-NOV-2006 DEFINITION Synthetic construct hemagglutinin gene, complete cds. ACCESSION EF051513 VERSION EF051513.1 GI:117958996 KEYWORDS . SOURCE synthetic construct ORGANISM synthetic construct other sequences; artificial sequences. REFERENCE 1 (bases 1 to 1733) AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.T., Le,T.H., Nguyen,B.N., Nong,V.H., Dinh,D.K., Phan,V.C., Le,T.B. and Nguyen,B.H. TITLE Molecular characterization of H5N1 isolates in Vietnam for evolution/pathogenicity/antigenic compatibility using H5 sequences as markers JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1733) AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.T. and Le,T.H. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (08-OCT-2006) Immunology Department, Institute of Biotechnology, Hoang Quoc Viet Rd, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1..1733 /organism="synthetic construct" /mol_type="other DNA" /db_xref="taxon:32630" /PCR_primers="fwd_name: H5BAMF, fwd_seq: ccgggatcctctgtcaaaatggagaaaatagtgctt, rev_name: H5NOTR, rev_seq: ataagaatgcggccgctcattaaatgcaaattctgca" /note="derived from Influenza A virus

(A/chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1))"

CDS 16..1722 /codon_start=1 /transl_table=11 /product="hemagglutinin" /protein_id="ABK58581.1" /db_xref="GI:117958997" /translation="MEKIVLLFAIFSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPV NDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF RNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGT STLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRIEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKRG DSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSTRLVLATGLR NSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAID GVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQY SEEVRLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI CI" ORIGIN 1 ggatcctctg tcaaaatgga gaaaatagtg cttctttttg cgatattcag tcttgttaaa 61 agtgatcaga tttgcattgg ttaccatgca aacaactcaa cagagcaggt tgacacaata 121 atggaaaaga acgttactgt tacacatgcc caagacatac tggaaaagac acacaacggg 181 aagctctgcg atctagatgg agtgaagcct ctaattttga gagattgtag tgtagctgga 241 tggctcctcg gaaacccaat gtgtgacgag ttcatcaatg tgccggaatg gtcttacata 301 gtggagaagg ccaatccagt caatgacctc tgttacccag gggatttcaa tgactatgaa 361 gaattgaaac acctattgag cagaataaac cattttgaga aaattcagat catccccaaa 421 agttcttggt ccagtcatga agcctcgtta ggagtgagct cagcatgtcc ataccaggga 481 aagtcctcct ttttcagaaa tgtggtatgg cttatcaaaa agaacagtac atacccaaca 541 ataaagagga gctacaataa taccaaccaa gaagatcttt tggtaatgtg ggggattcac 601 catcctaatg atgcggcaga gcagacaaag ctctatcaaa acccaaccac ctatatttcc 661 gttgggacat caacactaaa ccagagattg gtacccagaa tagctactag atccaaagta 721 aacgggcaaa gtgggaggat agagttcttc tggacaattt taaaaccgaa tgatgcaatc 781 aacttcgaga gtaatggaaa tttcattgct ccagaatatg catacaaaat tgtcaagaga 841 ggggactcaa caattatgaa aagtgaattg gaatatggta actgcaacac caagtgtcaa 901 actccaatag gggcgataaa ctctagtatg ccattccaca atatacaccc tctcaccatc 961 ggggagtgcc ccaaatatgt gaaatcaacc agattagtcc ttgcgactgg gctcagaaat 1021 agccctcaaa gagagagaag aagaaaaaag agaggattat ttggagctat agcaggtttt 1081 atagaaggag gatggcaggg aatggtagat ggttggtatg ggtaccacca tagcaatgag 1141 caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc 1201 aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacactcagt ttgaggccgt tggaagggaa 1261 tttaacaact tagaaaggag aatagagaat ttaaacaaga agatggaaga cgggttccta 1321 gatgtctgga cttataatgc tgaacttctg gttctcatgg aaaatgagag aactctagac 1381 tttcatgact caaatgtcaa gaacctttac gacaaggtcc gactacagct tagggataat 1441 gcaaaggagc tgggtaacgg ttgtttcgag ttctatcata aatgtgataa tgaatgtatg 1501 gaaagtgtaa gaaacggaac gtatgactac ccgcagtatt cagaagaagt aagattaaaa 1561 agagaggaaa taagtggagt aaaattggaa tcaataggaa tttaccaaat actgtcaatt 1621 tattctacag tggcgagttc cctagcactg gcaatcatgg tagctggtct atccttatgg 1681 atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga atttgcattt aatgagcggc cgc //

EF057803

B. Gen NA GenBank LOCUS EF057803 1370 bp RNA linear SYN 18-NOV-2006 DEFINITION Synthetic construct neuraminidase (NA) gene, complete cds. ACCESSION EF057803 VERSION EF057803.1 GI:117938335 KEYWORDS . SOURCE synthetic construct ORGANISM synthetic construct other sequences; artificial sequences. REFERENCE 1 (bases 1 to 1370) AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.N., Le,T.B., Nong,V.H. and Le,T.H. TITLE Molecular characterization of H5N1 isolates in Vietnam for evolution/pathogenicity/antigenic compatibility using N1 sequences as markers JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1370) AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.N., Le,T.B., Nong,V.H. and Le,T.H. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (11-OCT-2006) Immunology Department, Institute of Biotechnology, Hoang Quoc Viet Rd, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1..1370 /organism="synthetic construct" /mol_type="other RNA" /db_xref="taxon:32630" /PCR_primers="fwd_name: N1ECOF, fwd_seq: ccggaattcaaaatgaatccaaatcagaagataataacc, rev_name: N1NOTR, rev_seq: ataagaatgcggccgctcactacttgtcaatggtgaatgg" /note="derived from Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1)) isolate HG4 (Hau Giang)"

primer_bind <1..36 gene 10..1359

/gene="NA"

CDS 10..1359

/gene="NA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="neuraminidase" /protein_id="ABK58128.1" /db_xref="GI:117938336" /translation="MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQH QAEPISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFI SCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWS ASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSC FTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELNAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNW HGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAYGVKGFSFKYG NGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPEL TGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK"

primer_bind complement(1339..>1370)

ORIGIN 1 gaattcaaaa tgaatccaaa tcagaagata ataaccattg gatcaatctg tatggtaact 61 ggaatagtta gcttaatgtt acaagttggg aacatgatct caatatgggt cagtcattca 121 attcacacag ggaatcaaca ccaagctgaa ccaatcagca atactaattt tcttaatgag 181 aaagctgtgg cttcagtaaa attagcgggc aattcatctc tttgccccat taacggatgg 241 gctgtataca gtaaggacaa cagtataagg atcggttcca agggggatgt gtttgttata 301 agagagccgt tcatctcatg ctcccacttg gaatgcagaa ctttcttttt gactcaggga 361 gccttgctga atgacaaaca ctccaatggg actgtcaaag acagaagccc tcacagaaca 421 ttaatgagtt gtcctgtggg tgaggctccc tccccatata actcaaggtt tgagtctgtt 481 gcttggtcag caagtgcttg ccatgatggc accagttggt tgacaattgg aatttctggc 541 ccagacaatg gggctgtggc tgtattgaaa tacaatggca taataacaga cactatcaag 601 agttggagga acaacatact gagaactcaa gagtctgaat gtgcatgtgt aaatggctct 661 tgctttactg taatgactga cggaccaagt aatggtcagg catcacataa gatcttcaaa 721 atggaaaaag ggaaagtggt taaatcagtc gaattgaatg ctcctaatta tcactatgag 781 gaatgctcct gttatcctga tgccggcgaa atcacatgtg tgtgcaggga taattggcat 841 ggctcaaatc ggccatgggt atctttcaat caaaacttgg agtatcaaat aggatatata 901 tgcagtggag ttttcggaga caatccacgc cccaatgatg gaacaggtag ttgtggtccg 961 gtgtcctcta acggggcata tggggtaaaa gggttttcat ttaaatacgg caatggtgtc 1021 tggatcggga gaaccaaaag cactaattcc aggagcggct ttgaaatgat ttgggatcca 1081 aatgggtgga ctgaaacgga cagtagcttt tcagtgaaac aagacatcgt agcaataact 1141 gattggtcag gatatagcgg gagttttgtc cagcatccag aactgacagg actagattgc 1201 ataagacctt gtttctgggt tgagttgatc agagggcggc ccaaagagag caccatttgg 1261 actagtggga gcagcatatc tttttgtggt gtaaatagtg acactgtggg ttggtcttgg

1321 ccagacggtg ctgagttgcc attcaccatt gacaagtagt gagcggccgc //

(Dòng trên là thành phần nucleotide, dòng dưới là amino acid tương ứng biểu thị bằng chữ cái (1 chữ cái) ký hiệu của chúng)

Phụ lục 3: TRÌNH BÀY TRÌNH TỰ GEN PB2, PB1, PA VÀ NP CỦA CHỦNG CKHG4

A. Gen PB2

3 0 6 0 9 0 1 2 0 A T G G A G A G A A T A A A A G A A T T A C G A G A T C T A A T G T C A C A G T C C C G C A C T C G C G A G A T A C T A A C A A A A A C C A C T G T G G A C C A T A T G G C C A T A A T C A A G A A A T A C A C A T C A G G A A G A C A A G A G M E R I K E L R D L M S Q S R T R E I L T K T T V D H M A I I K K Y T S G R Q E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 5 0 1 8 0 2 1 0 2 4 0 A A G A A C C C T G C T C T C A G A A T G A A A T G G A T G A T G G C A A T G A A A T A T C C A A T C A C A G C G G A C A A G A G A A T A A T A G A G A T G A T T C C T G A A A G G A A T G A A C A A G G G C A G A C G C T C T G G A G C A A G K N P A L R M K W M M A M K Y P I T A D K R I I E M I P E R N E Q G Q T L W S K > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

2 7 0 3 0 0 3 3 0 3 6 0 A C A A A T G A T G C T G G A T C G G A C A G G G T G A T G G T G T C T C C C C T A G C T G T A A C T T G G T G G A A T A G G A A T G G G C C G G C A A C A A G T G C A G T T C A T T A T C C A A A G G T T T A C A A A A C A T A C T T T G A G T N D A G S D R V M V S P L A V T W W N R N G P A T S A V H Y P K V Y K T Y F E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

3 9 0 4 2 0 4 5 0 4 8 0 A A G G C T G A A A G G T T A A A A C A T G G A A C C T T C G G T C C C G T C C A T T T C C G A A A C C A A G T T A A A A T A C G C C G C C G A G T G G A T A T A A A C C C T G G C C A T G C A G A T C T C A G T G C T A A A G A A G C A C A A K A E R L K H G T F G P V H F R N Q V K I R R R V D I N P G H A D L S A K E A Q > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

6 0 0 5 1 0 5 4 0 5 7 0 G A T G T C A T C A T G G A G G T C G T T T T C C C A A A T G A A G T G G G A G C T A G A A T A T T G A C A T C A G A G T C G C A A T T G A C A A T A A C G A A A G A G A A G A A A G A A G A G C T C A A A G A T T G T A A G A T T G C T C C C D V I M E V V F P N E V G A R I L T S E S Q L T I T K E K K E E L K D C K I A P > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

6 3 0 6 6 0 6 9 0 7 2 0 T T A A T G G T T G C A T A C A T G T T G G A A A G G G A A C T G G T C C G C A A A A C C A G A T T C C T A C C G G T A G C A G G C G G A A C A A G C A G T G T G T A C A T T G A G G T A T T G C A T T T G A C T C A A G G G A C C T G C T G G L M V A Y M L E R E L V R K T R F L P V A G G T S S V Y I E V L H L T Q G T C W > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

7 5 0 7 8 0 8 1 0 8 4 0 G A A C A G A T G T A C A C T C C A G G C G G A G A A G T G A G A A A T G A C G A T G T T G A C C A G A G T T T G A T C A T C G C T G C C A G A A A C A T T G T T A G G A G A G C A A C G G T A T C A G C G G A T C C A C T G G C A T C A C T G E Q M Y T P G G E V R N D D V D Q S L I I A A R N I V R R A T V S A D P L A S L > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

8 7 0 9 0 0 9 3 0 9 6 0 C T G G A G A T G T G T C A C A G C A C A C A A A T T G G T G G G A T A A G G A T G G T G G A C A T C C T T A G G C A A A A T C C A A C T G A G G A A C A A G C T G T G G A T A T A T G C A A A G C A G C A A T G G G T C T G A G G A T C A G T L E M C H S T Q I G G I R M V D I L R Q N P T E E Q A V D I C K A A M G L R I S > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

9 9 0 1 0 2 0 1 0 5 0 1 0 8 0 T C T T C C T T T A G C T T T G G A G G C T T C A C T T T C A A A A G A A C A A G T G G A T C A T C C G T C A A G A A G G A A G A G G A A G T G C T T A C A G G C A A C C T C C A A A C A T T G A A A A T A A G A G T A C A T G A G G G G T A T S S F S F G G F T F K R T S G S S V K K E E E V L T G N L Q T L K I R V H E G Y > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 1 1 0 1 1 4 0 1 1 7 0 1 2 0 0 G A G G A A T T C A C A A T G G T T G G G C G G A G G G C A A C A G C T A T C C T G A G G A A A G C A A C T A G A A G G C T G A T T C A G T T G A T A G T A A G T G G A A G A G A C G A A C A A T C A A T C G C T G A G G C A A T C A T T G T A E E F T M V G R R A T A I L R K A T R R L I Q L I V S G R D E Q S I A E A I I V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 2 3 0 1 2 6 0 1 2 9 0 1 3 2 0 G C A A T G G T G T T C T C A C A G G A G G A T T G C A T G A T A A A G G C A G T C C G A G G C G A T C T G A A T T T C G T A A A C A G A G C A A A C C A A A G A T T A A A C A C C A T G C A T C A A C T C C T G A G A C A T T T T C A A A A G A M V F S Q E D C M I K A V R G D L N F V N R A N Q R L N T M H Q L L R H F Q K > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 3 5 0 1 3 8 0 1 4 1 0 1 4 4 0 G A T G C A A A A G T G T T A T T T C A G A A T T G G G G A A T T G A A C C C A T T G A T A A T G T C A T G G G G A T G A T C G G A A T A T T A C C T G A C A T G A C T C C C A G C A C A G A A A T G T C A C T G A G A G G A G T A A G A G T T D A K V L F Q N W G I E P I D N V M G M I G I L P D M T P S T E M S L R G V R V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 4 7 0 1 5 0 0 1 5 3 0 1 5 6 0 A G T A A A A T G G G A G T G G A T G A A T A T T C C A G C A C T G A G A G A G T A G T T G T A A G C A T T G A C C G T T T C T T A A G G G T T C G A G A T C A G C G G G G G A A C G T A C T C T T A T C T C C C G A A G A G G T C A G C G A A S K M G V D E Y S S T E R V V V S I D R F L R V R D Q R G N V L L S P E E V S E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 5 9 0 1 6 2 0 1 6 5 0 1 6 8 0 A C C C A G G G A A C A G A G A A A T T G A C A A T A A C A T A T T C A T C A T C A A T G A T G T G G G A A A T C A A C G G T C C T G A G T C A G T G C T T G T T A A C A C C T A T C A G T G G A T C A T C A G A A A C T G G G A G A C T G T G T Q G T E K L T I T Y S S S M M W E I N G P E S V L V N T Y Q W I I R N W E T V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 7 1 0 1 7 4 0 1 7 7 0 1 8 0 0 A A G A T T C A A T G G T C T C A A G A C C C C A C G A T G C T G T A C A A T A A G A T G G A G T T T G A A C C G T T C C A A T C C T T G G T A C C C A A A G C T G C C A G A G G T C A A T A C A G T G G A T T T G T G A G A A C A T T A T T C K I Q W S Q D P T M L Y N K M E F E P F Q S L V P K A A R G Q Y S G F V R T L F > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 8 3 0 1 8 6 0 1 8 9 0 1 9 2 0 C A A C A A A T G C G T G A C G T A C T G G G G A C A T T T G A T A C T G T C C A G A T A A T A A A G C T G C T A C C A T T T G C A G C A G C C C C A C C G G A G C A G A G C A G A A T G C A G T T T T C T T C T C T A A C T G T G A A T G T G Q Q M R D V L G T F D T V Q I I K L L P F A A A P P E Q S R M Q F S S L T V N V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

1 9 5 0 1 9 8 0 2 0 1 0 2 0 4 0 A G A G G C T C A G G A A T G A G A A T A C T C G T A A G G G G C A A T T C C C C T G T G T T C A A C T A C A A T A A G G C A A C C A A A A G G C T T A C C G T T C T T G G A A A G G A C G C A G G T G C A T T A A C A G A G G A T C C A G A T R G S G M R I L V R G N S P V F N Y N K A T K R L T V L G K D A G A L T E D P D > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

2 0 7 0 2 1 0 0 2 1 3 0 2 1 6 0 G A G G G G A C A G C C G G A G T G G A A T C T G C A G T A C T G A G G G G A C T C T T A A T T C T A G G C A A G G A G G A C A A A A G G T A T G G A C C A G C A T T G A G C A T C A A T G A A C T G A G C A A T C T T G C G A A G G G G G A G E G T A G V E S A V L R G L L I L G K E D K R Y G P A L S I N E L S N L A K G E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

2 1 9 0 2 2 2 0 2 2 5 0 2 2 8 0 A A A G C T A A T G T G C T G A T A G G G C A A G G A G A C G T G G T G T T G G T A A T G A A A C G A A A A C G G G A C T C T A G C A T A C T T A C T G A C A G C C A G A C A G C G A C C A A A A G A A T T C G G A T G G C C A T C A A T T A G K A N V L I G Q G D V V L V M K R K R D S S I L T D S Q T A T K R I R M A I N * > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >

B. Gen PB1

(Dòng trên là trình tự nucleotide, dòng dưới là trình tự amino acid, phần gạch dưới là gen PB1-F2)

60 90

120 ATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTACCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACATTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGGACAGGATACACCATG T T F P Y T G D P P Y S H G T G T G Y T M> M D V N P T L L F L K V P V Q N A I S W

M E Q G Q D T P

|----CkHG4 PB1-F2(273bp)--> _CKHG4-PB1(2274bp)______>

150 180

210 240 GACACAGTCAACAGAACACACCAATATTCAGAAAAGGGGAAGTGGACAACAAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAACCCGATTGATGGACCACTACCTGAAGATAATGAGCCCAGT L P E D N E P S> D T V N R T H Q Y S E K G K W T T N T E T G A P Q L N P I D G P T Q S T E H T N I Q K R G S G Q Q T Q R L E H P N S T R L M D H Y L K I M S P V ------------------------------------------------------------------------- CKHG4 PB1-F2(273bp)-------------------------- > _CKHG4-PB1(2274bp)______> 270 300 330 360 GGGTATGCACAAACAGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCCCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTTGAAACGATGGAAATTGTTCAACAAACAAGAGTGGAT G Y A Q T D C V L E A M A F L E E S H P G I F E N S C L E T M E I V Q Q T R V D> Q I V Y W K Q W L S L K N P T Q G S L K T R V L K R W K L F N K Q E W I

G M H K

-------------------------------------------------------------------------- CKHG4 PB1-F2(273bp)------------------------- > _CKHG4-PB1(2274bp)______>

390 420 450 480 AAACTGACCCAAGGTCGCCAGACCTATGACTGGACATTGAATAGAAACCAACCGGCTGCAACTGCTTTGGCCAACACTATAGAAATCTTCAGATCGAACGGTCTAACAGCCAATGAATCG K L T Q G R Q T Y D W T L N R N Q P A A T A L A N T I E I F R S N G L T A N E S>

N *>

_________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 510 540 570 600 GGACGGCTAATAGATTTCCTCAAGGATGTGATGGAATCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATAACAACACACTTCCAGAGAAAGAGAAGGGTGAGGGACAACATGACCAAGAAAATGGTC G R L I D F L K D V M E S M D K E E M E I T T H F Q R K R R V R D N M T K K M V> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 630 660 690 720 ACACAAAGAACAATAAGGAAGAAAAAACAAAGGCTGAACAAAAAGAGCTACCTGATAAGAGCACTGACACTGAACACAATGACAAAAGATGCAGAAAGAGGCAAATTGAAGAGGCGAGCG T Q R T I R K K K Q R L N K K S Y L I R A L T L N T M T K D A E R G K L K R R A> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 750 780 810 840 ATTGCAACACCCGGAATGCAAATCAGAGGATTCGTCTACTTTGTTGAAACACTAGCGAGGAGTATCTGTGAGAAACTTGAGCAATCTGGACTCCCAGTCGGAGGGAATGAGAAGAAGGCT I A T P G M Q I R G F V Y F V E T L A R S I C E K L E Q S G L P V G G N E K K A> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 870 900 930 960 AAATTGGCAAACGTCGTGAGGAAGATGATGACTAACTCACAAGATACTGAACTATCCTTTACAATTACTGGAGACAGTACCAAATGGAATGAGAATCAGAATCCTAGGATGTTTCTGGCA K L A N V V R K M M T N S Q D T E L S F T I T G D S T K W N E N Q N P R M F L A> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________>

990 1020 1050 1080 ATGATAATGTACATCACAAGGAACCAGCCAGAATGGTTTAGGAATGTCTTAAGCATTGCTCCTATAATGTTCTCAAACAAAATGGCGAGACTAGGAAAAGGATACATGTTCGAAAGCAAG M I M Y I T R N Q P E W F R N V L S I A P I M F S N K M A R L G K G Y M F E S K> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1110 1140 1170 1200 AGCATGAAGTTACGAACACAAATACCAGCAGAAATGCTTGCAAACATTGATCTTAAATACTTCAATGAATTAACGAAAAAGAAAATTGAGAAAATAAGGCCTCTATTAATAGATGGTACA S M K L R T Q I P A E M L A N I D L K Y F N E L T K K K I E K I R P L L I D G T> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1230 1260 1290 1320 GCCTCATTGAGCCCTGGAATGATGATGGGCATGTTCAACATGCTGAGTACAGTCCTAGGAGTTTCAATCCTGAATCTTGGACAGAAAAGGTACACCAAAACCACATATTGGTGGGACGGA A S L S P G M M M G M F N M L S T V L G V S I L N L G Q K R Y T K T T Y W W D G> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1350 1380 1410 1440 CTCCAATCCTCTGATGATTTCGCTCTCATCGTAAATGCACCGAATCATGAGGGAATACAAGCAGGAGTGGATAGGTTTTATAGGACTTGTAAACTAGTTGGAATCAATATGAGCAAGAAG L Q S S D D F A L I V N A P N H E G I Q A G V D R F Y R T C K L V G I N M S K K> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1470 1500 1530 1560 AAGTCTTACATAAATCGGACAGGGACATTTGAATTCACAAGCTTTTTCTACCGCTATGGATTTGTAGCCAATTTCAGTATGGAGCTGCCCAGTTTTGGAGTGTCTGGAATTAATGAATCG K S Y I N R T G T F E F T S F F Y R Y G F V A N F S M E L P S F G V S G I N E S> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1590 1620 1650 1680 GCCGACATGAGCATTGGTGTTACAGTGATAAAAAACAATATGATAAACAACGACCTTGGGCCAGCAACAGCTCAGATGGCTCTTCAGTTATTCATCAAGGACTACAGATACACATACCGA A D M S I G V T V I K N N M I N N D L G P A T A Q M A L Q L F I K D Y R Y T Y R> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1710 1740 1770 1800 TGCCACAGAGGGGATACACAAATCCAAACAAGGAGATCATTCGAGCTGAAGAAGCTGTGGGAGCAAACCCGTTCAAAGGCAGGACTGTTGGTTTCAGATGGAGGACCAAATCTATACAAT C H R G D T Q I Q T R R S F E L K K L W E Q T R S K A G L L V S D G G P N L Y N> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1830 1860 1890 1920 ATCCGAAACCTCCATATTCCTGAAGTCTGCTTAAAATGGGAATTGATGGATGAAGATTACCAGGGCAGACTGTGTAATCCTCTGAATCCACTCGTCAGCCATAAGGAAATTGAATCTGTC I R N L H I P E V C L K W E L M D E D Y Q G R L C N P L N P L V S H K E I E S V> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 1950 1980 2010 2040 AACAATGCTGTAGTAATGCCAGCTCATGGCCCGGCCAAGAGTATGGAATATGATGCCGTTGCAACTACACATTCATGGATTCCTAAAAGGAACCGTTCCATTCTCAATACGAGTCAAAGG N N A V V M P A H G P A K S M E Y D A V A T T H S W I P K R N R S I L N T S Q R> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________>

2220 2250

2070 2100 2130 2160 GGAATTCTTGAGGATGAACAGATGTACCAGAAGTGCTGCAATCTATTCGAGAAATTCTTCCCCAGCAGTTCATATCGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCT G I L E D E Q M Y Q K C C N L F E K F F P S S S Y R R P V G I S S M V E A M V S> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________> 2190 AGGGCCCGAATTGACGCACGAATTGACTTCGAGTCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTTGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAACTCAGACGGCAAAAATAG R A R I D A R I D F E S G R I K K E E F A E I M K I C S T I E E L R R Q K *> _________________________________________________CKHG4-PB1(2274bp)______________________________________________________>

C. Gen PA

30 60 90 120 ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATTGTCGAGCTTGCAGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCG AAACGAACAAGTTTGCTGCAATATGCACA M E D F V R Q C F N P M I V E L A E K A M K E Y G E D P K I E T N K F A A I C T> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

150 180 210 240 CACTTGGAGGTCTGTTTCATGTATTCGGATTTTCACTTTATTGATGAACGGAGTGAATCAATAATTGTAGAATCTGGAGATCTGTATGCATTATTGAAACACCGATTTGAAATAATT GAA H L E V C F M Y S D F H F I D E R S E S I I V E S G D L Y A L L K H R F E I I E> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

270 300 330 360 GGAAGAGACCGAACGATGGCCTGGACAGTGGTGAATAGTATCTGCAACACCACAGGAGTTGAGAAACCTAAATTTCTCCCAGACTTGTATGACTACAAAGAGAACCGATTCATCGAAATT G R D R T M A W T V V N S I C N T T G V E K P K F L P D L Y D Y K E N R F I E I> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

390 420 450 480 GGAGTGACACGGAGGGAAGTTCATACATACTATCTGGAGAAAGCCAACAAGATAAAATCCGAGAAGACACATATTCACATATTTTCATTCACAGGGGAGGAAATGGCCACCAAAGCGGAC G V T R R E V H T Y Y L E K A N K I K S E K T H I H I F S F T G E E M A T K A D> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

510 540 570 600 TACACCCTTGATGAAGAGAGCAGGGCAAGAATTAAAACCAGGCTGTTCACCATAAGGCAGGAAATGGCCAGTAGGGGTCTATGGGATTCCTTTCGTCAATCCGAGAGAGGCGAAGAGACA Y T L D E E S R A R I K T R L F T I R Q E M A S R G L W D S F R Q S E R G E E T> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

630 660 690 720 ATTGAAGAAAAATTTGAAATCACTGGAACCATGCGCAGACTTGCAGACCAAAGTCTCCCACCGAACTTCTCCAGCCTTGAAAACTTTAGAGCTTATGTGGATGGATTCGAACCGAACGGC I E E K F E I T G T M R R L A D Q S L P P N F S S L E N F R A Y V D G F E P N G> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

750 780 810 840 TGCATTGAGGGCAAGCTTTCTCAAATGTCAAAAGAAGTGAATGCTAGAATTGAGCCATTTTTGAAGACAACGCCACGCCCTCTCAGACTACCTGATGGGCCTCCTTGCTCTCAGCGGTCG C I E G K L S Q M S K E V N A R I E P F L K T T P R P L R L P D G P P C S Q R S> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

870 900 930 960 AAGTTCTTGCTGATGGATGCCCTTAAATTAAGCATCGAAGACCCGAGTCATGAGGGGGAGGGGATACCACTATACGATGCAATCAAATGCATGAAGACATTTTTCGGCTGGAAAGAACCC K F L L M D A L K L S I E D P S H E G E G I P L Y D A I K C M K T F F G W K E P> TRANSLATION OF CKHG4-PA(2151BP).TXT [A]_>

990 1020 1050 1080 AACATCGTGAAACCACATGAAAAAGGTATAAACCCCAATTACCTCCTGGCTTGGAAGCAAGTGCTGGCAGAACTCCAAGATATTGAAAATGAGGAGAAGATCCCAAAAACAAAGAACATG N I V K P H E K G I N P N Y L L A W K Q V L A E L Q D I E N E E K I P K T K N M> TRANSLATION OF CK HG4-PA(2151BP).TXT [A]_>

1110 1140 1170 1200 AAAAAAACAAGCCAGTTGAAGTGGACACTCGGTGAGAACATGGCACCAGAGAAAGTAGACTTTGAGGAC TGCAAAGATGTTAGCGATCTAAGACAGTATGACAGTGATGAACCAGAGTCT K K T S Q L K W T L G E N M A P E K V D F E D C K D V S D L R Q Y D S D E P E S> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1230 1260 1290 1320 AGATCACTAGCAAGCTGGATTCAGAGTGAATTCAACAAGGCATGTGAATTGACAGATTCGAGTTGGATTGAACTTGATGAGATAGGAGAAGACGT AGCTCCAATTGAGCACATTGCAAGT R S L A S W I Q S E F N K A C E L T D S S W I E L D E I G E D V A P I E H I A S> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1350 1380 1410 1440 ATGAGAAGGAATTATTTTACAGCGGAAGTATCCCATTGCAGGGCCACTGAATACATAATGAAGGGAGTGTACATAAACACAGCCCTGTTGAATGCATCCTGTGCAGCCATGGATGACTTT M R R N Y F T A E V S H C R A T E Y I M K G V Y I N T A L L N A S C A A M D D F> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1470 1500 1530 1560 CAACTGATTCCAATGATAAGCAAATGCAGAACCAAAGAAGGAAGACGGAAAACTAATCTGTATGGATTCATTATAAAAGGGAGATCCCACTTGAGGAATGATACCGATGTGGTAAATTTT Q L I P M I S K C R T K E G R R K T N L Y G F I I K G R S H L R N D T D V V N F> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1590 1620 1650 1680 GTGAGTATGGAATTCTCTCTTACTGATCCGAGGCTGGAGCCACACAAGTGGGAAAAGTACTGTGTCCTCGAGATAGGAGACATGCTCCTCCGGACTGCAGTAGGCCAAGTTTCAAGGCCC V S M E F S L T D P R L E P H K W E K Y C V L E I G D M L L R T A V G Q V S R P> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1710 1740 1770 1800 ATGTTCCTGTATGTAAGAACCAATGGAACCTCCAAGATCAAAATGAAATGGGGCATGGAAATGAGGCGATGCCTTCTTCAATCCCTTCAACAAATTGAAAGCATGATTGAAGCCGAGTCT M F L Y V R T N G T S K I K M K W G M E M R R C L L Q S L Q Q I E S M I E A E S> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

1830 1860 1890 1920 TCTGTCAAAGAGAAGGACATGACCAAAGAATTCTTTGAAAACAAATCAGAAACATGGCCGATTGGAGAGTCCCCCAAGGGAGTGGAGGAAGGCTCCATCGGAAAGGTGTGCAGAACCTTG S V K E K D M T K E F F E N K S E T W P I G E S P K G V E E G S I G K V C R T L> TRANSLATION OF CKHG4 -PA(2151BP).TXT [A]_>

2040 1950 1980 2010 CTGGCGAAGTCTGTGTTCAACAGTTTATATGCATCTCCACAACTCGAGGGGTTTTCAGCTGAATCAAGAAAATTGCTTCTCATTGCTCAGGCACTTAGGGACAACCTGGAACCTGGGACC L A K S V F N S L Y A S P Q L E G F S A E S R K L L L I A Q A L R D N L E P G T> TRANSLATION OF CKHG4-PA(2151BP).TXT [A]_>

2070 2100 2130 TTCGATCTTGGAAGGCTATTTGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAACGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCGTCTTGGTTCAACTCCTTCCTCGCACATGCACTGAAATAG F D L G R L F E A I E E C L I N D P W V L L N A S W F N S F L A H A L K *>

D. Gen NP

30 60 90 120 ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCTTATGAACAAATGGAAACTGGTGGGGAACGCCAGAATGCTACTGAGATCAGGGCATCTGTTGGAAGAATGGTTAGTGGAATTGGGAGGTTCTAC M A S Q G T K R S Y E Q M E T G G E R Q N A T E I R A S V G R M V S G I G R F Y> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

150 180 210 240 ATACAGATGTGCACAGAGCTCAAACTCAGTGACTATGAAGGGAGGCTGATCCAGAACAGCATAACAATAGAGAGAATGGTACTCTCTGCATTTGATGAAAGAAGGAACAGATACCTGGAA I Q M C T E L K L S D Y E G R L I Q N S I T I E R M V L S A F D E R R N R Y L E> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

270 300 330 360 GAACACCCCAGTGCGGGAAAGGACCCGAAGAAGACTGGAGGTCCAATTTATCGGAGGAGAGACGGAAAATGGGTGAGAGAGCTAATTCTGTACGACAAAGAGGAGATCAGGAGGATTTGG E H P S A G K D P K K T G G P I Y R R R D G K W V R E L I L Y D K E E I R R I W> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

480 390 420 450 CGTCAAGCGAACAATGGAGAGGACGCAACTGCTGGTCTTACCCACCTGATGATATGGCATTCCAATCTAAATGATGCCACATATCAGAGAACGAGAGCTCTCGTGCGTACTGGAATGGAC R Q A N N G E D A T A G L T H L M I W H S N L N D A T Y Q R T R A L V R T G M D> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

510 540 570 600 CCAAGGATGTGCTCTCTGATGCAAGGGTCAACTCTCCCGAGGAGATCTGGAGCTGCTGGTGCAGCAGTAAAGGGGGTAGGGACAATGGTGATGGAGCTGATTCGGATGATAAAACGAGGG P R M C S L M Q G S T L P R R S G A A G A A V K G V G T M V M E L I R M I K R G> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

630 660 690 720 ATCAATGACCGGAATTTCTGGAGAGGCGAAAATGGAAGAAGAACAAGGATTGCATATGAGAGAATGTGCAACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCAGCACAAAGAGCAATGATGGAT I N D R N F W R G E N G R R T R I A Y E R M C N I L K G K F Q T A A Q R A M M D> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

750 780 810 840 CAAGTGCGAGAGAGCAGAAATCCTGGGAATGCTGAAATTGAAGATCTCATTTTTCTGGCACGGTCTGCACTCATGCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGTCCTGCTTGCCTGCTTGTGTG Q V R E S R N P G N A E I E D L I F L A R S A L M L R G S V A H K S C L P A C V> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

870 900 930 960 TACGGACTTGCAGTGGCCAGTGGATATGACTTTGAGAGAGAAGGGTACTCTCTGGTTGGAATAGATCCTTTCCGCCTGCTTCAAAACAGCCAGGTCTTTAGTCTCATTAGACCAAATGAG Y G L A V A S G Y D F E R E G Y S L V G I D P F R L L Q N S Q V F S L I R P N E> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

990 1020 1050 1080 AATCCAGCACATAAGAGTCAATTAGTGTGGATGGCATGCCACTCTGCAGCATTTGAGGACCTTAGAGTCTCAAGTTTCATCAGAGGGACAAGAGTGGTCCCAAGAGGACAGCTATCCACC N P A H K S Q L V W M A C H S A A F E D L R V S S F I R G T R V V P R G Q L S T> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

1110 1140 1170 1200 AGAGGGGTTCAAATTGCTTCAAATGAGAACATGGAGGCAATGGACTCCAACACTCTTGAACTGAGAAGCAGATATTGGGCTATAAGAACCAGAAGCGGAGGAAACACCAACCAGCAGAGG R G V Q I A S N E N M E A M D S N T L E L R S R Y W A I R T R S G G N T N Q Q R> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

1260 1290 1320 1230 GCATCTGCAGGACAGATCAGCGTTCAGCCCACTTTCTCGGTACAGAGAAACCTTCCCTTCGAAAGAGCAACCATTATGGCAGCATTTACAGGAAATACTGAGGGCAGAACGTCTGACATG A S A G Q I S V Q P T F S V Q R N L P F E R A T I M A A F T G N T E G R T S D M> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

1350 1380 1410 1440 AGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGAC R T E I I R M M E S A R P E D V S F Q G R G V F E L S D E K A T N P I V P S F D> ________________________________________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]_________________________________________>

1470 ATGAATAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAATTAA M N N E G S Y F F G D N A E E Y D N *> ________TRANSLATION OF CKHG4-NP(1497BP).TXT [A]__________>

* 100 *

Phụ lục 4: SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID GEN H5 GIỮA CHỦNG CKHG4 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI (Dấu (.) biểu thị giống với nucleotide/amino acid của chủng CkHG4; sai khác của các chủng so với chủng CkHG4 biểu thị bằng chính ký hiệu nuleotide/chữ cái (1 chữ cái) của chúng)

a. Nucleotide (rút gọn) * 20 * 40 * 60 * 80 Ck-VN-HG4- : ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCGATATTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCAACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACG : 118 Dk-VN-1771 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-29-0 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Dk-VN-HG68 : ..............................G....................................................G............................G..... : 118 Dk-HG-07-1 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-5-03 : ..........................A...G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-Ncvd : .....................C....A...G....................................................G..............T.................T. : 118 Ck-VN-27-0 : ..........................A...G....................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-36-0 : ..............................G..................................C.....C...........G.................................. : 118 Ck-VN-TG-0 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Dk-VN-1231 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-LA63 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Dk-VN-CaMa : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Dk-VN-BL-0 : ..............................G....................................................G.................................. : 118 Ck-VN-NCVD : .....................C....A...A..G..........................G......................G.................................A : 118 Ck-India-N : .....................C....A...AC..A................................................G.................................. : 118 Ck-Banglad : .....................C....A...A...A................................................G.................................. : 118 Ck-Fujian- : .....................C.G..A...G....C...............................................G.................................. : 118 Dk-VN-HaiP : .....................C....A...G....C...............................................G.................................. : 118 MDk-VN-145 : .....................A....A...G....C.........G.C...................................G.................................. : 118 Dk-PhuTho- : .....................C....A...A....C...............................................G.................................. : 118 Dk-VN-50-0 : .....................C....A...A....C...............................................G.................................. : 118 Ck-Guangxi : .....................C....A...G....C...............................................G...A.............................. : 118 Ck-Hunan-8 : ..........................A...G....C...........C.....T.............................G.................................. : 118 Dk-TL-KU-5 : .....................C....A...G....C...............................................G.................................. : 118 Ck-Laos-1- : .....................C....A...G....C..........................C....................G.................................. : 118

Trình tự mã hóa chuỗi nối HA1 và HA2

* 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 Ck-VN-HG4- : CGGGGAGTGCCCCAAATATGTGAAATCAACCAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGT : 1062 Dk-VN-1771 : T.....A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-29-0 : T.....A......................A..............................................G...................G..................... : 1062 Dk-VN-HG68 : T.....A......................A........................................................................................ : 1062 Dk-HG-07-1 : T.....A......................A..............................................G...................G..................... : 1062 Ck-VN-5-03 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-Ncvd : ......A........G.............A..................A........G...................T...................C...................C : 1062 Ck-VN-27-0 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-DT-1 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-36-0 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-TG-0 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Dk-VN-1231 : ......A......................A........................................................................................ : 1062 Ck-VN-LA63 : T.....A......................A.........................................T.............................................. : 1062 Dk-VN-CaMa : T.....A......................A..............................................G......................................... : 1062 Dk-VN-BL-0 : T.....A......................A..............................................G......................................... : 1062 Ck-VN-NCVD : ......A......................A............C........A.........GC........T....G.........G...A......C..........C........G : 1062 Ck-India-N : A.....A......................A..A....A................................G.T..............G.........C.................... : 1062 Ck-Banglad : A.....A...........C..........A.....................A..................G..........................C.................... : 1062 Ck-Fujian- : ......A......................A..A..............................T....T......A.............---.....C.................... : 1059 Dk-VN-HaiP : ......A......................A..A........................G.....T....T......A.............---.....C.................... : 1059 MDk-VN-145 : T.....A..T...................A..A........................................................---.....C.................... : 1059 Dk-PhuTho- : ......A......................A..A..............................T....T......A.............---.....C.................... : 1059 Dk-VN-50-0 : ......A......................A..A..............................T....T......A.............---.....C.................... : 1059 Ck-Guangxi : ......A..T...................A..A..................T.....................................---.....C.................... : 1059 Ck-Hunan-8 : ...A..A..T...................A..A..............................T.........................---.....C.................... : 1059 Dk-TL-KU-5 : ......A......................AT.A..............................T....T......A.............---.....C.................... : 1059 Ck-Laos-1- : ......A......................A..A............T.................T....T......A.............---.....C...................G : 1059 1660 * 1680 * 1700 Ck-VN-HG4- : TCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA : 1707 Dk-VN-1771 : ...............---------------------------------------- : 1667 Ck-VN-29-0 : ....................................................... : 1707 Dk-VN-HG68 : ....................................................... : 1707 Dk-HG-07-1 : ....................................................... : 1707 Ck-VN-5-03 : ...............................C...........------------ : 1695 Ck-VN-Ncvd : ......T....................A........................... : 1707 Ck-VN-27-0 : ..............................................--------- : 1698 Ck-VN-DT-1 : ....................................................... : 1707 Ck-VN-36-0 : .............................................---------- : 1697 Ck-VN-TG-0 : ....................................................... : 1707 Dk-VN-1231 : ...............---------------------------------------- : 1667 Ck-VN-LA63 : ....................................................... : 1707 Dk-VN-CaMa : ....................................................... : 1707 Dk-VN-BL-0 : ....................................................... : 1707 Ck-VN-NCVD : ......T....................A.........................G. : 1707 Ck-India-N : ......T....................A..........................G : 1707 Ck-Banglad : ......T....................A........................... : 1707 Ck-Fujian- : ......T.......................................--------- : 1695 Dk-VN-HaiP : ......T................................................ : 1704 MDk-VN-145 : ......T..G.....---------------------------------------- : 1664 Dk-PhuTho- : ......T................................................ : 1704 Dk-VN-50-0 : ......T................................................ : 1704 Ck-Guangxi : ......T...........T...........................--------- : 1695 Ck-Hunan-8 : ......T...........T..T..C..........................C... : 1704 Dk-TL-KU-5 : ......T.............................................A.. : 1704 Ck-Laos-1- : ......T..G............................................. : 1704

b. Amino acid (rút gọn)

* 20

* 100 *

I * 40II * 60 * 80

Ck-VN-HG4- : MEKIVLLFAIFSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK : 118 Dk-VN-1771 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-29-0 : ..........V........................................................................................................... : 118 Dk-VN-HG68 : ..........V..........................R................................................................................ : 118 Dk-HG-07-1 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-5-03 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-Ncvd : .......L..V........................................................................................S.A................ : 118 Ck-VN-27-0 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ..........V........................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ..........V........................................................................................................... : 118 Dk-VN-1231 : ..........V...................................................................E....................................... : 118 Ck-VN-LA63 : ..........V........................................................................................................... : 118 Dk-VN-CaMa : ..........V.................................................N................................................V........ : 118 Dk-VN-BL-0 : ..........V..................................................................................................V........ : 118 Ck-VN-NCVD : .......L..IG........V..................I..................N.N.......K.................L..S.........S.A.G.............. : 118 Ck-India-N : .......L..TN..........................................................................L...........ID.A.......N........ : 118 Ck-Banglad : .......L..IN..........................................................................L...........I..A.......N........ : 118 Ck-Fujian- : .......L..V.........................................................................K.L..............A.......NL....... : 118 Dk-VN-HaiP : .......L..V..........................................................................................A.......N........ : 118 MDk-VN-145 : .......I..V....G.....................................................................................A.G.....N........ : 118 Dk-PhuTho- : .......L..I..........................................................................................A.......N........ : 118 Dk-VN-50-0 : .......L..I..........................................................................................A.......N........ : 118 Ck-Guangxi : .......L..V..................K.......................................................................A.......N........ : 118 Ck-Hunan-8 : ..........V......H.....................................R....N.......K................................A.......N........ : 118 Dk-TL-KU-5 : .......L..V..........................................................................................A.......N........ : 118 Ck-Laos-1- : .......L..V..........................................................................................A.......N........ : 118

* 140 * 160

*III

180 IV * 200 * 220 *

Ck-VN-HG4- : HLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVN : 236 Dk-VN-1771 : ..............................A............................................................................T.......... : 236 Ck-VN-29-0 : ....................P.........A............................................................................T.......... : 236 Dk-VN-HG68 : ....................P.........A.................V.................H.........................I......................... : 236 Dk-HG-07-1 : ....................P.........A............................................................................T.......... : 236 Ck-VN-5-03 : ........................................................................L............................................. : 236 Ck-VN-Ncvd : .....................N....S..........RP...........R..A..................L....................................K........ : 236 Ck-VN-27-0 : ........................................................................L......................V...................... : 236 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 236 Dk-VN-1231 : ..............................A....................................................................................... : 236 Ck-VN-LA63 : ..............................A............................................................................T.......... : 236 Dk-VN-CaMa : ....................P.........A.........................................I..................................T.......... : 236 Dk-VN-BL-0 : ....................P.........A............................................................................T.......... : 236 Ck-VN-NCVD : ............K.....Y..N..T........S.LENP.........T...N...P..VN.T.A..K....L.......NE...KMI...LN..V.............K........ : 236 Ck-India-N : .....................E...............R..............DA.....I............L.............R.................L....K........ : 236 Ck-Banglad : .....................D....S..........R..............DA.....I............L...............................L....K........ : 236 Ck-Fujian- : ..................Y..D....S..........TP.............N..................IL.....S..E...KR......................K........ : 236 Dk-VN-HaiP : .....................D....S..........TP.............N..................IL.....S......I.......................K........ : 236 MDk-VN-145 : .....................D...............S..............NA..................L........E....R........V.I...........K........ : 236 Dk-PhuTho- : .....................D....S..........VP.............N..................IL.....S..............................K........ : 236 Dk-VN-50-0 : .....................D....S..........VP.............N..................IL.....S..............................K........ : 236 Ck-Guangxi : .....................D...............S.............DNA..................L........E....R......................K........ : 236 Ck-Hunan-8 : .................D...D...............N.......I.....DNA.....K............L........E....R..........I...........K........ : 236 Dk-TL-KU-5 : .....................D....S..........TP.............N..................IL.....S..............................K........ : 236 Ck-Laos-1- : .....................D....S..........TP.............N...............N..IL.....S......I.......................K........ : 236

HA1

HA2

240 * 260 * 280 * 300 V * 320 * 340 * Ck-VN-HG4- : GQSGRIEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKRGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSTRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAG : 354 Dk-VN-1771 : .....M..Y.............................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-29-0 : .....M................................K......................M..........................N...............G............. : 354 Dk-VN-HG68 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Dk-HG-07-1 : .....M................................K......................M..........................N...............G............. : 354 Ck-VN-5-03 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-Ncvd : .....M................................K...A..................M..........................N...............I............. : 354 Ck-VN-27-0 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-DT-1 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-36-0 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-TG-0 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Dk-VN-1231 : .....M................................K......................M..........................N............................. : 354 Ck-VN-LA63 : .....M................................K......................M..........................N.............I............... : 354 Dk-VN-CaMa : .....M................................K......................M..........................N...............G............. : 354 Dk-VN-BL-0 : .....M................................K......................V..........................N...............G............. : 354 Ck-VN-NCVD : .....MD..........T...D................K...A.............................................N..........A..I.G..R.......... : 354 Ck-India-N : .....M.........................N......K.................................................NK.I..........G............... : 354 Ck-Banglad : .....M...........T.............N......K.............D........V..........................N.............G............... : 354 Ck-Fujian- : .....MD...............................K...A.....V...D...................................NK...........L......-......... : 353 Dk-VN-HaiP : .....MD...............................K...A.....V.......................................NK...........L......-......... : 353 MDk-VN-145 : .....MD...............................K...A.....V............M..........................NK..................-......... : 353 Dk-PhuTho- : .....MD...............................K...A.....V.......................................NK...........L......-......... : 353 Dk-VN-50-0 : .....MD...............................K...A.....V.......................................NK...........L......-......... : 353 Ck-Guangxi : .....MD...............................K...A.....V............M..........................NK..................-......... : 353 Ck-Hunan-8 : ......D...............................K.........V.......R....M..........................NK..................-......... : 353 Dk-TL-KU-5 : .....MD....M..........................K...A.....V.......................................NK...........L......-......... : 353 Ck-Laos-1- : .....MD...............................E...A.....V.......................................NK...........L......-......... : 353

480 * 500VI * 520 * 540 * 560VII Ck-VN-HG4- : RDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEVRLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI* : 568 Dk-VN-1771 : .......................................A...........................................-------------- : 555 Ck-VN-29-0 : .......................................A........................................................- : 568 Dk-VN-HG68 : .......................................A...............................T........................- : 568 Dk-HG-07-1 : .......................................A........................................................- : 568 Ck-VN-5-03 : .......................................A.....................................................---- : 565 Ck-VN-Ncvd : .......................................A................T.......................................- : 568 Ck-VN-27-0 : .......................................A......................................................--- : 566 Ck-VN-DT-1 : .......................................A........................................................- : 568 Ck-VN-36-0 : .......................................A.....................................................---- : 565 Ck-VN-TG-0 : .......................................A........................................................- : 568 Dk-VN-1231 : .......................................A...........................................-------------- : 555 Ck-VN-LA63 : .......................................A........................................................- : 568 Dk-VN-CaMa : .......................................A........................................................- : 568 Dk-VN-BL-0 : .......................................A........................................................- : 568 Ck-VN-NCVD : ..........................K............A..N............VT.......................................- : 568 Ck-India-N : ................R......................S................T...................M...................- : 568 Ck-Banglad : ................R......................S................T.......................................- : 568 Ck-Fujian- : ......................I................A................T.....................................--- : 565 Dk-VN-HaiP : .......................................A................T.......................................- : 567 MDk-VN-145 : .......................................A................T..........................-------------- : 554 Dk-PhuTho- : .......................................A................T.......................................- : 567 Dk-VN-50-0 : .......................................A................T.......................................- : 567 Ck-Guangxi : .......................................A................T.....................................--- : 565 Ck-Hunan-8 : .......................................A................T..............V....M...................- : 567 Dk-TL-KU-5 : .......................................A................T.........A.............................K : 568 Ck-Laos-1- : .......................................A.......N........T.......................................- : 567

Phụ lục 5: SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID GEN N1 GIỮA CHỦNG CKHG4 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI (Dấu (.) biểu thị giống với nucleotide/amino acid của chủng CkHG4; sai khác của các chủng với chủng CkHG4 biểu thị bằng chính ký hiệu nuleotide/chữ cái (1 chữ cái) của chúng)

a. Nucleotide (rút gọn)

100 *

* 20 * 40 * 60 * 80 * Ck-VN-HG4- : ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAACTGGAATAGTTAGCTTAATGTTACAAGTTGGGAACATGATCTCAATATGGGTCAGTCATTCAATTCACA : 118 Ck-VN-29-0 : .............................C.............................C.......................................................... : 118 VN-HG-207- : .............................C........................................................................................ : 118 VN-HG-178- : .............................C........................................................................................ : 118 Ck-VN-CT-0 : .............................C...............................A........................................................ : 118 Ck-VN-TG-0 : .............................C...............................A........................................................ : 118 Ck-VN-DT-1 : .............................C.............................................C.......................................... : 118 Ck-VN-30-0 : .............................C....................A................................................................... : 118 Ck-VN-5-03 : .............................C.............................................A.......................................... : 118 Dk-VN-11-0 : .............................C.............................................A.......................................... : 118 Ck-VN-NCVD : .............................C........................................................................................ : 118 VN-CL2009- : .............................C....................C...............................................................A... : 118 MDk-VN-145 : ................................G................T.........................A.......................A................G. : 118 Dk-VN-HaiP : .................................................T........................GA........................................A. : 118 Dk-VN-50-0 : ..............A.................G................T.....................G...A........................................G. : 118 Dk-VN-BL-0 : .............................C........................................................................................ : 118 Dk-VN-17A- : .............................C..............................................................G......................... : 118 Ck-VN-NCVD : .............................C............G......T.........................A........................................G. : 118 Ck-Indo-BL : .................................................T.............G...........A........................................G. : 118 Ck-Thailan : .............................C..........................G..................A........T................................. : 118 Ck-TL-CK-1 : ........G...A................C..........................G..................A.C......T.....................G........... : 118 Ck-TL-NP-1 : ................................G................T........................GA........................................A. : 118 Dk-TL-KU-5 : ................................................GT........................GA........................................A. : 118 Ck-Guangxi : ..............A.................G................T..................................................................G. : 118 Ck-Hunan-8 : ....................................G.....G..A...T........................GA........................................A. : 118 Dk-Hubei-4 : .............G...............C...................T...............G.........A..........A.............................G. : 118 Ck-India-N : ..........................T..C...................T.........................A....A...G..........................G....G. : 118 360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * Ck-VN-HG4- : TTGCTGAATGACAAACACTCCAATGGGACTGTCAAAGACAGAAGCCCTCACAGAACATTAATGAGTTGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCCCCATATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTTG : 472 Ck-VN-29-0 : ...............................C...................................................................................... : 472 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 472 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-30-0 : ..............G....................................................................................................... : 472 Ck-VN-5-03 : ..............G....................................................................................................... : 472 Dk-VN-11-0 : ..............G....................................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 472 VN-CL2009- : .........................................................C............................................................ : 472 MDk-VN-145 : ..............G........C..................................................T.....A..................................... : 472 Dk-VN-HaiP : ..A...........G........C.................................C............................................................ : 472 Dk-VN-50-0 : ..............G........C.............................................................................................. : 472 Dk-VN-BL-0 : ...........T.......................................................................................................... : 472 Dk-VN-17A- : ...........T................................................................................G......................... : 472 Ck-VN-NCVD : ..............G..........................................................................T............................ : 472 Ck-Indo-BL : ..............G........C...................................G...................................C...................... : 472 Ck-Thailan : ............G.G....................................................................................................... : 472 Ck-TL-CK-1 : ..............G..........................G............................................................................ : 472 Ck-TL-NP-1 : ..A...........G........C..A..............................C............................................................ : 472 Dk-TL-KU-5 : ..A...........G........C.................................C...............................T............................ : 472 Ck-Guangxi : ..............G........C.............................................................................................. : 472 Ck-Hunan-8 : ..A...........G........C.................G...........................................................G................ : 472 Dk-Hubei-4 : ..............G..............C.............................G.......................................................... : 472 Ck-India-N : ...........T..G...................................A.................C................................................. : 472

* 1320 * 1340 *

Ck-VN-HG4- : GGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGAC-AAGTAG : 1350 Ck-VN-29-0 : ..............................................-...... : 1350 VN-HG-207- : .................................G............-...... : 1350 VN-HG-178- : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-CT-0 : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-TG-0 : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-DT-1 : ..............................................-...--- : 1347 Ck-VN-30-0 : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-5-03 : ..............................................-...... : 1350 Dk-VN-11-0 : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-NCVD : ..............................................-...... : 1350 VN-CL2009- : ..................................------------------- : 1332 MDk-VN-145 : .A............................................C...--- : 1348 Dk-VN-HaiP : .A............................................-.....A : 1350 Dk-VN-50-0 : .A............................................-.....A : 1350 Dk-VN-BL-0 : ..............................................-...... : 1350 Dk-VN-17A- : ..............................................-...... : 1350 Ck-VN-NCVD : ............................G.................-.....- : 1349 Ck-Indo-BL : .A............................................-...... : 1350 Ck-Thailan : ..............................................-...... : 1350 Ck-TL-CK-1 : .................................C............-..---- : 1346 Ck-TL-NP-1 : .A......................................------------- : 1338 Dk-TL-KU-5 : .A............................................-...... : 1350 Ck-Guangxi : .A............................................-.....A : 1350 Ck-Hunan-8 : .A............................................-...... : 1350 Dk-Hubei-4 : ..............................................-...... : 1350 Ck-India-N : TA.........................A..................-...... : 1350

b. Amino acid (rút gọn)

* 20

* 40 * 60

I* 80 * 100

Ck-VN-HG4- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEPISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGA : 118 Ck-VN-29-0 : .....................................................L.T........IV.................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : .......................................................T.............................................................. : 118 Ck-VN-CT-0 : ....................N..................................T.............................................................. : 118 Ck-VN-TG-0 : ....................N..................................T.............................................................. : 118 Ck-VN-DT-1 : .........................L.............................T.........T.................................................... : 118 Ck-VN-30-0 : .......................................................I.............................................................. : 118 Ck-VN-5-03 : .........................I.............................T.............................................................. : 118 Dk-VN-11-0 : .........................I.............................T.............................................................. : 118 Ck-VN-NCVD : .......................................................T.............................................................. : 118 VN-CL2009- : ......................................N............A...T.............................................................. : 118 MDk-VN-145 : ................I........I.......I....Q......V.........T.......T..........R....H...................................... : 118 Dk-VN-HaiP : ................I........I............Q..........R.....T.N.....T..........R....H...................................... : 118 Dk-VN-50-0 : ................I........I............Q....N.V...I.....T......IT..........R...IH...................................... : 118 Dk-VN-BL-0 : .......................................................T.............................................................. : 118 Dk-VN-17A- : ......................................................PT......A....................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ..............V.I........I............Q.E..C...S....K..T.......T.M........S....H...................................... : 118 Ck-Indo-BL : ................I....V...I............Q........S.....P.T.......T..........R....H...................................... : 118 Ck-Thailan : ..................M......I..L...............K..........T.............................................................. : 118 Ck-TL-CK-1 : ....K.............M......I..L......R.......QK..........T......A......................................................S : 118 Ck-TL-NP-1 : ................I........I............Q..........R.....T.N.....T..........R....H...................................... : 118 Dk-TL-KU-5 : ................V........I............Q..........R...S.T.N.....T..........R....H...................................... : 118 Ck-Guangxi : ................I.....................Q...LN.V.........T.......T..........R...IH...................................... : 118 Ck-Hunan-8 : ............V.VII........I............Q..........R.....T.S.....T..........R....H.........................QM........... : 118 Dk-Hubei-4 : ....R...........I........I..I.........Q.E..............T.E.....T..........S....H....G................................. : 118 Ck-India-N : ................I........I..V........VQ.M..R......SSK.HA.......T..........S...............R........................... : 118

II * 140 * 160 * 180 * 200 *

III220 *

Ck-VN-HG4- : LLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIF : 236 Ck-VN-29-0 : ..........A......................................................................K.................................... : 236 VN-HG-207- : ........................................................................L............................................. : 236 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-30-0 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-5-03 : ...................................................................................................................... : 236 Dk-VN-11-0 : ....................................................................................T................................. : 236 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 236 VN-CL2009- : ...................................................................................................................... : 236 MDk-VN-145 : ..................................................................................S...............................Y... : 236 Dk-VN-HaiP : ..................................................................................................................Y... : 236 Dk-VN-50-0 : ..................................................................................................................Y... : 236 Dk-VN-BL-0 : ...................................................................................................................... : 236 Dk-VN-17A- : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-NCVD : ..................................................................................................................Y... : 236 Ck-Indo-BL : ..................................................................................................................Y... : 236 Ck-Thailan : ....E........................................................S........................................................ : 236 Ck-TL-CK-1 : .............................................................S........................................................ : 236 Ck-TL-NP-1 : ..................................................................................................................Y... : 236 Dk-TL-KU-5 : ..................................................................................................................Y... : 236 Ck-Guangxi : ..................................................................................................................Y... : 236 Ck-Hunan-8 : ........................................................................V.....R...................................Y... : 236 Dk-Hubei-4 : ......................................................................D.V.........................................Y... : 236 Ck-India-N : ................Q.....................................................................................I...........Y... : 236

360 * 380 * 400 * 420 * 440 * Ck-VN-HG4- : WDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK- : 449 Ck-VN-29-0 : ...........R..............................................................S....................- : 449 VN-HG-207- : ...............................................................................................- : 449 VN-HG-178- : ......I...................................................................S....................- : 449 Ck-VN-CT-0 : ...............................................................................................- : 449 Ck-VN-TG-0 : ...............................................................................................- : 449 Ck-VN-DT-1 : ...............................................................................................- : 449 Ck-VN-30-0 : ......S........................................................................................- : 449 Ck-VN-5-03 : ..............................................................................G................- : 449 Dk-VN-11-0 : ...............................................................................................- : 449 Ck-VN-NCVD : ...............................................................................................- : 449 VN-CL2009- : ..........................................................................................------ : 444 MDk-VN-145 : ..........................................................................D....S..............Q- : 449 Dk-VN-HaiP : ...........N.............................N.....................................S...............- : 449 Dk-VN-50-0 : ......S......................................................V.................S...............- : 449 Dk-VN-BL-0 : ...........................................................G...............G...................- : 449 Dk-VN-17A- : ...........................................................G..............SG...................- : 449 Ck-VN-NCVD : .......G............................................V...................................V......- : 449 Ck-Indo-BL : .......G.......................................................................S...............- : 449 Ck-Thailan : .G.............................................................................................- : 449 Ck-TL-CK-1 : .........................................N....................................................-- : 448 Ck-TL-NP-1 : .......G...N..M................................................................S............---- : 446 Dk-TL-KU-5 : .......G...N..M................................................................S...............- : 449 Ck-Guangxi : ......S........................................................................S...............- : 449 Ck-Hunan-8 : ...........E...................................................A...............S...............- : 449 Dk-Hubei-4 : .......G.......................................................................................- : 449 Ck-India-N : ......AG...............................................Q.......................S...............- : 449

(8 chủng trên cùng phân lập trước năm 2003; 6 chủng tiếp theo (đóng khung) phân lập ở Hồng Kông năm 1997; 27 chủng bên dưới phân lập trong các năm 2003-2009, trong đó có chủng CkHG4 (in đậm))

Phụ lục 6: Đột biến trượt-xóa nucleotide (A) và amino acid (B) của gen N1 theo thời gian tiến hóa (chỉ minh họa vùng đột biến)

A. ĐỘT BIẾN TRƯỢT-XÓA NUCLEOTIDE TRONG GEN N1 A. ĐỘT BIẾN TRƯỢT-XÓA NUCLEOTIDE TRONG GEN N1

200 * 220 200 * 220

3 3 0 0 0 0 2 2

g g n n ủ ủ h h c c

c c á á C C

c c ớ ớ ư ư r r t t

Các chủng Hồng Kông (1997) Các chủng Hồng Kông (1997)

9 9 0 0 0 0 2 2 - - 3 3 0 0 0 0 2 2 g g n n ủ ủ h h c c

c c á á C C

120 * 140 * 160 * 180 * 120 * 140 * 160 * 180 * Ck-Scotlan : AATTCAGACTGGAAATCAAAACCAACCTGAAATATGCAATCAAAGCATCATTACTTACGAGAACAACACTTGGGTGAATCAAACATATGTTAACATCAGCAATACTAACT : 220 Ck-Scotlan : AATTCAGACTGGAAATCAAAACCAACCTGAAATATGCAATCAAAGCATCATTACTTACGAGAACAACACTTGGGTGAATCAAACATATGTTAACATCAGCAATACTAACT : 220 Gs-GD-1-96 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAAACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Gs-GD-1-96 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAAACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Ck-Hubei-w : ATTTCAGACAGGGAATCAACACCAGGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Ck-Hubei-w : ATTTCAGACAGGGAATCAACACCAGGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-Guangxi : AATTCAGACAAGGAACCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATCATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-Guangxi : AATTCAGACAAGGAACCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATCATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-HK-2986 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-HK-2986 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-GD-07-2 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCGGCAATACCAATT : 220 Dk-GD-07-2 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCGGCAATACCAATT : 220 Ck-HK-YU56 : AATTCAGAAAATGAACCAACACCAAACTGAACCATGCAATCAAAGCATCATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Ck-HK-YU56 : AATTCAGAAAATGAACCAACACCAAACTGAACCATGCAATCAAAGCATCATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-Fujian- : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAACTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Dk-Fujian- : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAACTGAACCATGCAATCAAAGCATTATTACTTATGAAAACAACACCTGGGTAAATCAGACATATGTCAACATCAGCAATACCAATT : 220 Ck-HK-220- : AATTCAAACTTGGCATCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 Ck-HK-220- : AATTCAAACTTGGCATCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-486-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAACCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-486-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAACCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-482-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-482-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-538-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAAACAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-538-97A : AATTAAAACTTGGCACCCAAACCAGCCTGAACCATGCAAACAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-491-97A : AATTCAAGCTTGGCATCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-491-97A : AATTCAAGCTTGGCATCCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-503-97A : AATTCAAGCTTGGCATTCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 HK-503-97A : AATTCAAGCTTGGCATTCAAACCAGCCTGAACCATGCAATCAAAGC---------------------------------------------------------ATCAATT : 163 Ck-VN-HG4- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-HG4- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-29-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATC : 160 Ck-VN-29-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATC : 160 VN-HG-207- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 VN-HG-207- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 VN-HG-178- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 VN-HG-178- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-CT-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-CT-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-TG-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-TG-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-DT-1 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-DT-1 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-30-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-30-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-5-03 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-5-03 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-11-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-11-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-NCVD : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-NCVD : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 VN-CL2009- : AATTAACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATGCTAATT : 160 VN-CL2009- : AATTAACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATGCTAATT : 160 MDk-VN-145 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGTTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 MDk-VN-145 : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGTTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-HaiP : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Dk-VN-HaiP : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Dk-VN-50-0 : AATTCAGACAGGGAATCAAAACCAAGTTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCATCAATACTAATT : 160 Dk-VN-50-0 : AATTCAGACAGGGAATCAAAACCAAGTTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCATCAATACTAATT : 160 Dk-VN-BL-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-BL-0 : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-17A- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Dk-VN-17A- : AATTCACACAGGGAATCAACACCAAGCTGAGCCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-VN-NCVD : AATTCAGACAGAGAATCAATGCCAAGCTGAATCG------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAAAT : 160 Ck-VN-NCVD : AATTCAGACAGAGAATCAATGCCAAGCTGAATCG------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAAAT : 160 Ck-Indo-BL : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAATCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAACC : 160 Ck-Indo-BL : AATTCAGACAGGGAATCAACACCAAGCTGAATCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAACC : 160 Ck-Thailan : AATTCACACAGGGAATCAACACAAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-Thailan : AATTCACACAGGGAATCAACACAAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-TL-CK-1 : AATTCACACAGGGAATCAACAGAAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-TL-CK-1 : AATTCACACAGGGAATCAACAGAAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-Guangxi : AATTCAGACAGGGAATCTAAACCAAGTTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-Guangxi : AATTCAGACAGGGAATCTAAACCAAGTTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACTAATT : 160 Ck-TL-NP-1 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Ck-TL-NP-1 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Dk-TL-KU-5 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Dk-TL-KU-5 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Ck-Hunan-8 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Ck-Hunan-8 : AATTCAAACAGGGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGAAATACTAATT : 160 Dk-Hubei-4 : AATTCAGACAGAGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACCAATT : 160 Dk-Hubei-4 : AATTCAGACAGAGAATCAACACCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAATACCAATT : 160 Ck-India-N : AGTTCAGACAATGAATCAACGCCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAGTAGCAAAT : 160 Ck-India-N : AGTTCAGACAATGAATCAACGCCAAGCTGAACCA------------------------------------------------------------ATCAGCAGTAGCAAAT : 160

B. ĐỘT BIẾN TRƯỢT-XÓA AMINO ACID TRONG CHUỖI POLYPEPTIDE CỦA N1 B. ĐỘT BIẾN TRƯỢT-XÓA AMINO ACID TRONG CHUỖI POLYPEPTIDE CỦA N1 B. ĐỘT BIẾN TRƯỢT-XÓA AMINO ACID TRONG CHUỖI POLYPEPTIDE CỦA N1

3 3 3 0 0 0 0 0 0 2 2 2

g g g n n n ủ ủ ủ h h h c c c

c c c á á á C C C

c c c ớ ớ ớ ư ư ư r r r t t t

Các chủng Các chủng Các chủng Hồng Kông Hồng Kông Hồng Kông (1997) (1997) (1997)

9 9 9 0 0 0 0 0 0 2 2 2 - - - 3 3 3 0 0 0 0 0 0 2 2 2 g g g n n n ủ ủ ủ h h h c c c

c c c á á á C C C

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * Ck-Scotlan : MNPNQKIITIGSICMIVGIISLILQIGNIISIWVSHSIQTGNQNQPEICNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFVTEQALAPVALAGNSSLCPISGWAIYSKDNGIRIGS : 110 Ck-Scotlan : MNPNQKIITIGSICMIVGIISLILQIGNIISIWVSHSIQTGNQNQPEICNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFVTEQALAPVALAGNSSLCPISGWAIYSKDNGIRIGS : 110 Ck-Scotlan : MNPNQKIITIGSICMIVGIISLILQIGNIISIWVSHSIQTGNQNQPEICNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFVTEQALAPVALAGNSSLCPISGWAIYSKDNGIRIGS : 110 Gs-GD-1-96 : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 110 Gs-GD-1-96 : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 110 Gs-GD-1-96 : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 110 Ck-Hubei-w : MNPNQKITTIGSICMVLGIVSLMLQMGNIISIWVSHSFQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-Hubei-w : MNPNQKITTIGSICMVLGIVSLMLQMGNIISIWVSHSFQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-Hubei-w : MNPNQKITTIGSICMVLGIVSLMLQMGNIISIWVSHSFQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGMVSLVLQIGNMISIWASHSIQTRNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASITLSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGMVSLVLQIGNMISIWASHSIQTRNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASITLSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGMVSLVLQIGNMISIWASHSIQTRNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASITLSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-HK-2986 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-HK-2986 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-HK-2986 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-GD-07-2 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNIGNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-GD-07-2 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNIGNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-GD-07-2 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNIGNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-HK-YU56 : MNPNQKIMTIGSICMVIGMISLVLQIGNMISIWASHSIQKMNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKVVASIALSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-HK-YU56 : MNPNQKIMTIGSICMVIGMISLVLQIGNMISIWASHSIQKMNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKVVASIALSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-HK-YU56 : MNPNQKIMTIGSICMVIGMISLVLQIGNMISIWASHSIQKMNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKVVASIALSGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Fujian- : MNPNQKITTIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Fujian- : MNPNQKITTIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Dk-Fujian- : MNPNQKITTIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQTEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNGIRIGS : 110 Ck-HK-220- : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 Ck-HK-220- : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 Ck-HK-220- : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-486-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIINLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-486-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIINLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-486-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIINLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-482-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-482-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-482-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-538-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCKQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-538-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCKQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-538-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNTISVWVSHIIKTWHPNQPEPCKQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-491-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSPIIQAWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-491-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSPIIQAWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-491-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSPIIQAWHPNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-503-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQAWHSNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-503-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQAWHSNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 HK-503-97A : MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISVWVSHIIQAWHSNQPEPCNQS-------------------INFYTEQAAASVTLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGS : 91 Ck-VN-HG4- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-HG4- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-HG4- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-29-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNLLTEKAVASVKIVGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-29-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNLLTEKAVASVKIVGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-29-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNLLTEKAVASVKIVGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-207- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-207- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-207- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-178- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-178- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-HG-178- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-CT-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-CT-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-CT-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-TG-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-TG-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-TG-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVNLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-DT-1 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQLGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLTGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-DT-1 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQLGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLTGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-DT-1 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQLGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLTGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-30-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLIEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-30-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLIEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-30-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLIEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-5-03 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-5-03 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-5-03 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-11-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-11-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-11-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-CL2009- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSINTGNQHQAEP--------------------ISNANFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-CL2009- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSINTGNQHQAEP--------------------ISNANFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 VN-CL2009- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSINTGNQHQAEP--------------------ISNANFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 MDk-VN-145 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWISHSIQTGNQHQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 MDk-VN-145 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWISHSIQTGNQHQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 MDk-VN-145 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWISHSIQTGNQHQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-HaiP : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-HaiP : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-HaiP : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-50-0 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQNQVEP--------------------IINTNFLTEKAVASITLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-50-0 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQNQVEP--------------------IINTNFLTEKAVASITLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-50-0 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQNQVEP--------------------IINTNFLTEKAVASITLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-BL-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-BL-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-BL-0 : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-17A- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFPTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-17A- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFPTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Dk-VN-17A- : MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQHQAEP--------------------ISNTNFPTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICVVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTENQCQAES--------------------ISNTKFLTEKAVASVTLMGNSSLCPISGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICVVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTENQCQAES--------------------ISNTKFLTEKAVASVTLMGNSSLCPISGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-VN-NCVD : MNPNQKIITIGSICVVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTENQCQAES--------------------ISNTKFLTEKAVASVTLMGNSSLCPISGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Indo-BL : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSVMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAES--------------------ISNTNPLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Indo-BL : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSVMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAES--------------------ISNTNPLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Indo-BL : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSVMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAES--------------------ISNTNPLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Thailan : MNPNQKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSHSIHTGNQHKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-Thailan : MNPNQKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSHSIHTGNQHKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-Thailan : MNPNQKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSHSIHTGNQHKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-CK-1 : MNPNKKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSRSIHTGNQQKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-CK-1 : MNPNKKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSRSIHTGNQQKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-CK-1 : MNPNKKIITIGSICMVTGMVSLMLQIGNLISIWVSRSIHTGNQQKAEP--------------------ISNTNFLTEKAVASAKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIQTGNLNQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIQTGNLNQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Guangxi : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIQTGNLNQVEP--------------------ISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAIHSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-NP-1 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-NP-1 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-TL-NP-1 : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-TL-KU-5 : MNPNQKIITIGSICMVVGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNSLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-TL-KU-5 : MNPNQKIITIGSICMVVGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNSLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-TL-KU-5 : MNPNQKIITIGSICMVVGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNSLTENAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Hunan-8 : MNPNQKIITIGSVCVIIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTESAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Hunan-8 : MNPNQKIITIGSVCVIIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTESAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Ck-Hunan-8 : MNPNQKIITIGSVCVIIGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIQTGNQHQAEP--------------------IRNTNFLTESAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSKDNSIRIGS : 90 Dk-Hubei-4 : MNPNRKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTENQHQAEP--------------------ISNTNFLTEEAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 90 Dk-Hubei-4 : MNPNRKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTENQHQAEP--------------------ISNTNFLTEEAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 90 Dk-Hubei-4 : MNPNRKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNIISIWVSHSIQTENQHQAEP--------------------ISNTNFLTEEAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGS : 90 Ck-India-N : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNVISIWVSHSVQTMNQRQAEP--------------------ISSSKFHAEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-India-N : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNVISIWVSHSVQTMNQRQAEP--------------------ISSSKFHAEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNSIRIGS : 90 Ck-India-N : MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNVISIWVSHSVQTMNQRQAEP--------------------ISSSKFHAEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVYSKDNSIRIGS : 90

(Dấu (.) biểu thị giống với nucleotide/amino acid của chủng CkHG4; sai khác của các chủng so với chủng CkHG4 biểu thị bằng chính ký hiệu nuleotide/chữ cái (1 chữ cái) của chúng)

Phụ lục 7: SO SÁNH TRÌNH TỰ THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN POLYMERASE GIỮA CHỦNG CKHG4 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

A. GEN PB2

a. Nucleotide (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80

* 100 *

Ck-VN-HG4- : ATGGAGAGAATAAAAGAATTACGAGATCTAATGTCACAGTCCCGCACTCGCGAGATACTAACAAAAACCACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATACACATCAGGAAGACAAG : 118 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1231 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NB-2 : .....................A.......................................................T...................................G.... : 118 Ck-VN-LS-2 : .....................A.......................................................T...................................G.... : 118 VN-CL2009- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : .....................A.......................................................T...................................G.... : 118 MDk-VN-145 : ..................C..A.........................C...........G..................................................G....... : 118 Dk-VN-BL-0 : ..................C...................A............................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ......................................A............................................................................... : 118 Dk-VN-50-0 : ------.......T.......A................................................................................................ : 112 Dk-Guangxi : .....................A.....T.......G.............................G..............C..A..T.......................T....... : 118 Ck-GD-178- : .....................A................................................................................................ : 118 Ck-Guangxi : .....................A................................................................................................ : 118 Ck-TL-NP-1 : .....................A................................................................................................ : 118 Ck-EastJav : .....................A................A..T............................................................................ : 118 Dk-TL-KU-5 : .....................A.........................A......................................A............................... : 118 Ck-Hunan-8 : .....A...............A................................................................................................ : 118 Ck-Laos-1- : .....................A.G..........................................................................G................... : 118 Dk-Hubei-4 : .....................A.....T.......G.............................G..............C.....T.......................T....... : 118

* 200 * 220 *

20 * 140 * 160 * 180 Ck-VN-HG4- : AGAAGAACCCTGCTCTCAGAATGAAATGGATGATGGCAATGAAATATCCAATCACAGCGGACAAGAGAATAATAGAGATGATTCCTGAAAGGAATGAACAAGGGCAGACGCTCTGGAG : 236 Ck-VN-29-0 : ..................................................................................A................................... : 236 Dk-HG-07-1 : ..................................................................................A................................... : 236 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 236 Dk-VN-1231 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 236 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 236 Ck-VN-NB-2 : ....A..T.........................................G.................................................................... : 236 Ck-VN-LS-2 : .......T.........................................G.................................................................... : 236 VN-CL2009- : ..............................................C....................................................................... : 236 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 236 Dk-VN-HaiP : .......T.........................................G.................................................................... : 236 MDk-VN-145 : .A...........C............................................A..............G........C......C..........G..A..A.....T..... : 236 Dk-VN-BL-0 : ..........................................................A.......................C................................... : 236 Ck-VN-NCVD : ..........................................................A.......................C................................... : 236 Dk-VN-50-0 : .......T......................................C..G..........................A.....C................................... : 230 Dk-Guangxi : ..............................................C.....A.....A..............G................................A.....T..... : 236 Ck-GD-178- : .............................................................T........................................................ : 236 Ck-Guangxi : .................................................G.................................................................... : 236 Ck-TL-NP-1 : .......T.........................................G.................................................................... : 236 Ck-EastJav : .............................................................T........................................................ : 236 Dk-TL-KU-5 : .......T........A................................G.................................................................... : 236 Ck-Hunan-8 : .......T...................................G.....G.................................................................... : 236 Ck-Laos-1- : ........................................................................C............................................. : 236 Dk-Hubei-4 : ..............................................C.....A.....A..............G................................A.....T..... : 236

* 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 Ck-VN-HG4- : GGGTCTGAGGATCAGTTCTTCCTTTAGCTTTGGAGGCTTCACTTTCAAAAGAACAAGTGGATCATCCGTCAAGAAGGAAGAGGAAGTGCTTACAGGCAACCTCCAAACATTGAAAATA : 1062 Ck-VN-29-0 : ...................................................................A......................C........................... : 1062 Dk-HG-07-1 : ....A..............................................................A......................C........................... : 1062 Dk-VN-1771 : ...................................................................A.................................................. : 1062 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 1062 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 1062 Dk-VN-1231 : ...................................................................A.................................................. : 1062 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 1062 VN-1203-04 : ......T............................................................................................................... : 1062 Ck-VN-NB-2 : ..................A.................T..................................C.....................G........................ : 1062 Ck-VN-LS-2 : ..................A.................T..................................C.....................G........................ : 1062 VN-CL2009- : .......................................................................................A.............................. : 1062 Ck-VN-NCVD : ....A..............................................G...............A.................................................. : 1062 Dk-VN-HaiP : ..................A.................T..................................C.....................G........................ : 1062 MDk-VN-145 : ...CT.............A..T.............................G........G........A.....A.....A...A................................ : 1062 Dk-VN-BL-0 : ...................................................................A.................................................. : 1062 Ck-VN-NCVD : ...................................................................A.................................................. : 1062 Dk-VN-50-0 : ..................A.................T.................................GC.....................G.....T.................. : 1056 Dk-Guangxi : ....T.............A.........................................G.........................................A........A...... : 1062 Ck-GD-178- : .........A........A..A...G....A........................................C.............................................. : 1062 Ck-Guangxi : ........A.........A..........................T.........................C.....................G........................ : 1062 Ck-TL-NP-1 : ..................A.................T..................................CA....................G........................ : 1062 Ck-EastJav : .........A........A....................................................C......G....................................... : 1062 Dk-TL-KU-5 : ..................A.................T..................................C.....................G........................ : 1062 Ck-Hunan-8 : ..................A........T........T.....C.................G..........C..................C..G.....T.................. : 1062 Ck-Laos-1- : ..................A....................................................C.............................................. : 1062 Dk-Hubei-4 : ....T.............A.........................................G.........................................A........A...... : 1062

* 2120

* 2020 * 2040 * 2060 * 2080 * 2100 Ck-VN-HG4- : AAAGGACGCAGGTGCATTAACAGAGGATCCAGATGAGGGGACAGCCGGAGTGGAATCTGCAGTACTGAGGGGACTCTTAATTCTAGGCAAGGAGGACAAAAGGTATGGACCAGCATTG : 2124 Ck-VN-29-0 : .........................................................................T..................................G......... : 2124 Dk-HG-07-1 : .........................................................................T..................................G......... : 2124 Dk-VN-1771 : .........................................................................T............................................ : 2124 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 2124 Ck-VN-TG-0 : .........................................................................T............................................ : 2124 Dk-VN-1231 : .........................................................................T............................................ : 2124 Ck-VN-36-0 : .........................................................................T............................................ : 2124 VN-1203-04 : ..............................G.....A.................G..................T........T................................... : 2124 Ck-VN-NB-2 : .................................C.......................................T..C.........................A............... : 2124 Ck-VN-LS-2 : .................................C.......................................T..C.........................A............... : 2124 VN-CL2009- : .........................................................................T............................................ : 2124 Ck-VN-NCVD : .........................................................................T.....G...................................... : 2124 Dk-VN-HaiP : .................................C.......................................T..C.........................A............... : 2124 MDk-VN-145 : ........................A........C.....A........G..T........G............T..C................A........A............... : 2124 Dk-VN-BL-0 : .........................................................................T............................................ : 2124 Ck-VN-NCVD : .........................................................................T.......C.................................... : 2124 Dk-VN-50-0 : .................................C.......................................T..C..........A..............A............... : 2118 Dk-Guangxi : G.....T.................A........C.....A.................................T..C....C.....T...........G..A............... : 2124 Ck-GD-178- : ...........................C.............................................T..C.........................A............... : 2124 Ck-Guangxi : .........................................................................T..C.........................A............... : 2124 Ck-TL-NP-1 : .................................C.......................................T..C.........................A............... : 2124 Ck-EastJav : ...........................C....................................T........T..C...................T...........G......... : 2124 Dk-TL-KU-5 : .................................C.......................................T..C.G.......................A............... : 2124 Ck-Hunan-8 : .................................C....................G..................T..C.........................A............... : 2124 Ck-Laos-1- : ...........................................A..........G..................T..C.........................A............... : 2124 Dk-Hubei-4 : G.....T.................A........C.....A.................................T..C....C.....T...........G..A............... : 2124

* 2160 * 2180 * 2200 * 2220 * 2240

* 2140 Ck-VN-HG4- : AGCATCAATGAACTGAGCAATCTTGCGAAGGGGGAGAAAGCTAATGTGCTGATAGGGCAAGGAGACGTGGTGTTGGTAATGAAACGAAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGCC : 2242 Ck-VN-29-0 : ..............A....................................................................................................... : 2242 Dk-HG-07-1 : ..............A....................................................................................................... : 2242 Dk-VN-1771 : ............................................................................................A................--------- : 2233 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 2242 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 2242 Dk-VN-1231 : .............................................................................................................--------- : 2233 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 2242 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 2242 Ck-VN-NB-2 : ..........................A..A..........................A.............................G............................... : 2242 Ck-VN-LS-2 : ..........................A..A..........................A.............................G............................... : 2242 VN-CL2009- : ...................................................................................................................... : 2242 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 2242 Dk-VN-HaiP : ..........................A..A..........................A.............................G............................... : 2242 MDk-VN-145 : ..........................A..A........G...........A...........G.......................G......................--------- : 2233 Dk-VN-BL-0 : ............................................................................................A......................... : 2242 Ck-VN-NCVD : ............................................................................................AA........................ : 2242 Dk-VN-50-0 : ............T.............A..A..........................A.............................G............................... : 2236 Dk-Guangxi : .............................A........G.....C...T............................G........G............................... : 2242 Ck-GD-178- : ..........................A..A.................AT.....................................G............................... : 2242 Ck-Guangxi : ..........................A..A........................................................G............................... : 2242 Ck-TL-NP-1 : ..........................A..A..........................A.............................G............................... : 2242 Ck-EastJav : .............................A...........A.....A.................T....................G............................... : 2242 Dk-TL-KU-5 : ..........................A..A..........................A.............................G............................... : 2242 Ck-Hunan-8 : ..........................A..A..........................A...........A.................G............................... : 2242 Ck-Laos-1- : ..T.................C........A..........................A.............................G............................... : 2242 Dk-Hubei-4 : .............................A........G.....C...T............................G........G............................... : 2242

b. Amino acid (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80

* 100 *

Ck-VN-HG4- : MERIKELRDLMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIIEMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPATSAVHYPKVYKTY : 118 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1231 : ...............................................................................................I...................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NB-2 : ........................................................................................................T..T.......... : 118 Ck-VN-LS-2 : ........................................................................................................T..T.......... : 118 VN-CL2009- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : ........................................................................................................T..T.......... : 118 MDk-VN-145 : ...............................................................M................A.......................T..T.......... : 118 Dk-VN-BL-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-50-0 : --..I...................................................................................................TA.T.......... : 116 Dk-Guangxi : ...........................I...................................M............................S...........T..T.......... : 118 Ck-GD-178- : ........................................................................................................T............. : 118 Ck-Guangxi : .......................................................................................................LT..T.......... : 118 Ck-TL-NP-1 : ........................................................................................................T..T.......... : 118 Ck-EastJav : ........................................................................................................T............. : 118 Dk-TL-KU-5 : ........................................................................................................T..T.......... : 118 Ck-Hunan-8 : ........................................................................................................T..T.......... : 118 Ck-Laos-1- : ...............................................................T........................L...............T............. : 118 Dk-Hubei-4 : ...............................................................M............................S...........T..T.......... : 118

* 140 * 160 * 180 * 200 * 220 *

Ck-VN-HG4- : FEKAERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELKDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQ : 236 Ck-VN-29-0 : ...V........................V..............................................Q.......................................... : 236 Dk-HG-07-1 : ...V........................V..............................................Q.......................................... : 236 Dk-VN-1771 : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Ck-VN-CT-0 : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Dk-VN-1231 : ...V.......................................................................Q..........................T............... : 236 Ck-VN-36-0 : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 VN-1203-04 : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Ck-VN-NB-2 : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 Ck-VN-LS-2 : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 VN-CL2009- : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Ck-VN-NCVD : ...V.......................................................................Q..............................G........... : 236 Dk-VN-HaiP : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 MDk-VN-145 : ...V.................................................................K.....Q.........................I................ : 236 Dk-VN-BL-0 : ...V.......................................................................Q..........................T............... : 236 Ck-VN-NCVD : ...V.......................................................................Q.........................IT............... : 236 Dk-VN-50-0 : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 234 Dk-Guangxi : ...V........................V..............................................Q.......................................... : 236 Ck-GD-178- : ...V.......................................................................Q.......................................... : 236 Ck-Guangxi : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 Ck-TL-NP-1 : ...V........................T..............................................Q.............D............................ : 236 Ck-EastJav : ...V.............................................................A.........Q.......................................... : 236 Dk-TL-KU-5 : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 Ck-Hunan-8 : ...V........................T..............................................Q.......................................... : 236 Ck-Laos-1- : ...V................I............................................A.........Q.......................................... : 236 Dk-Hubei-4 : ...V........................V..................................R...........Q.......................................... : 236

600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 Ck-VN-HG4- : QYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGLLILGKEDKRYGPAL : 708 Ck-VN-29-0 : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-HG-07-1 : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-VN-1771 : .......................................................................................................F.............. : 708 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 708 Ck-VN-TG-0 : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-VN-1231 : .......................................................................................................F.............. : 708 Ck-VN-36-0 : .......................................................................................................F.............. : 708 VN-1203-04 : ....................................K..................................................................F.............. : 708 Ck-VN-NB-2 : .......................................................................................................F.............. : 708 Ck-VN-LS-2 : .......................................................................................................F.............. : 708 VN-CL2009- : ....................................K..................................................................F.............. : 708 Ck-VN-NCVD : .......................................................................................................F.V............ : 708 Dk-VN-HaiP : .......................................................................................................F.............. : 708 MDk-VN-145 : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-VN-BL-0 : .......................................................................................................F.............. : 708 Ck-VN-NCVD : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-VN-50-0 : ...........................M...........................................................................F.............. : 706 Dk-Guangxi : .....................A.........T.......................................................................F.............. : 708 Ck-GD-178- : .......................................................................................................F.............. : 708 Ck-Guangxi : ..........................................................I............................................F.............. : 708 Ck-TL-NP-1 : .........................V..................................................I..........................F.............. : 708 Ck-EastJav : .......................................................................................................F.............. : 708 Dk-TL-KU-5 : ............................................................................I..........................F.............. : 708 Ck-Hunan-8 : ............................................................................I..........................F.............. : 708 Ck-Laos-1- : .....................................................................R.......................T.........F.............. : 708 Dk-Hubei-4 : ...............................T.......................................................................F.............. : 708

B. GEN PB1

a. Nucleotide (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80

100 *

Ck-VN-HG4- : ATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTACCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACATTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGGACAGGATACACCA : 118 Ck-VN-29-0 : ................................G..................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ................................G..................................................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ................................G..................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ..............................................................C....................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-LS-2 : .....................................................................................................G................ : 118 Ck-VN-10-0 : .....................................................................................................G................ : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : .....................................................................................................G................ : 118 MDk-VN-145 : ..........................................................................C..........................G..A............. : 118 Dk-VN-50-0 : ...........C.......................G..C............................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ................................G..................................................................................... : 118 Ck-Shantou : ................................................................................T..................................... : 118 Ck-GD-174- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : .................C................................................................................G................... : 118 Ck-TL-NP-1 : ...................................G.................................................................................. : 118 Ck-Guangxi : ...........C.......................G.................................................................................. : 118 Dk-TL-KU-5 : ...................................G....................................................................A............. : 118 Ck-Hubei-2 : ..............................................................................................................G....... : 118 Ck-Laos-16 : ...........C.......................G.................................................................................. : 118 Ck-TL-NS-3 : ................................................................................G..................................... : 118 Dk-Hubei-4 : .............................A.....G....C..........T.......T.....T..............T.......................A............. : 118

* 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 Ck-VN-HG4- : TAGGATGTTTCTGGCAATGATAATGTACATCACAAGGAACCAGCCAGAATGGTTTAGGAATGTCTTAAGCATTGCTCCTATAATGTTCTCAAACAAAATGGCGAGACTAGGAAAAGGA : 1062 Ck-VN-29-0 : .......................C..............................CC..................................................T........... : 1062 Dk-HG-07-1 : .......................C..............................CC..................................................T........... : 1062 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 1062 VN-HG-178- : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Dk-VN-1771 : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Ck-VN-DT-1 : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 VN-1203-04 : .......................C...............................C................A............................................. : 1062 Ck-VN-36-0 : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Ck-VN-TG-0 : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Ck-VN-LS-2 : ............A..........C...............................C...................C..............................T....G.....G : 1062 Ck-VN-10-0 : ............A..........C...............................C...................C..............................T........... : 1062 Ck-VN-NCVD : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Dk-VN-HaiP : .......................C...............................C.A.................C..............................T....G...... : 1062 MDk-VN-145 : ............A..........C...............................C.......T...........C..............................T........... : 1062 Dk-VN-50-0 : .......................C...............................C.A.................C....................G.........T....G...... : 1062 Ck-VN-NCVD : .......................C...............................C.............................................................. : 1062 Ck-Shantou : .......................C...............................C...................C..............................T....G...... : 1062 Ck-GD-174- : .......................C..................A..T...........A........G........C..............................T........... : 1062 Ck-Guangxi : .......................C...............................C.......T...........C..............................T........... : 1062 Ck-TL-NP-1 : .......................C...............................C.A.................C....................G.........T....G...... : 1062 Ck-Guangxi : .......................C...............................C.A.................C....................G.........T....G...... : 1062 Dk-TL-KU-5 : .......................C...............................C.A.................C.........................T....T....G...... : 1062 Ck-Hubei-2 : .......................C......................A........C.A...........T.....C..............................T....G...... : 1062 Ck-Laos-16 : ...A......T............C...............A...............C.A..C..............C....................G.........T....G...... : 1062 Ck-TL-NS-3 : ....G..................C...............................C.............................................................. : 1062 Dk-Hubei-4 : .C.....................CA...........A.....A..T..C........A........G........C..........................A...T....G...... : 1062

* 2200 * 2220 * 2240

* 2140 * 2160 * 2180 Ck-VN-HG4- : GTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGACGCACGAATTGACTTCGAGTCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTTGCTGAGATCATGAAGATCTGTT : 2242 Ck-VN-29-0 : .....G........................................................T....................................................... : 2242 Dk-HG-07-1 : ..............................................................T.................C..................................... : 2242 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 2242 VN-HG-178- : ..............................................................T....................................................... : 2242 Dk-VN-1771 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-VN-DT-1 : ..............................................................T....................................................... : 2242 VN-1203-04 : ...........................................................C..T...................................C................... : 2242 Ck-VN-36-0 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-VN-TG-0 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-VN-LS-2 : ...........T..................................................T....................................................... : 2242 Ck-VN-10-0 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-VN-NCVD : ..............................................................T....................................................... : 2242 Dk-VN-HaiP : ...........T..................................................T....................................................... : 2242 MDk-VN-145 : ..............................................................T............C......................C................... : 2242 Dk-VN-50-0 : ..............................................................T..............................................G........ : 2242 Ck-VN-NCVD : ..............................................................T.................C..................................... : 2242 Ck-Shantou : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-GD-174- : ................................A....................G........T....................................................... : 2242 Ck-Guangxi : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-TL-NP-1 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-Guangxi : .........................................A....................T....................................------------------- : 2223 Dk-TL-KU-5 : ..............................................................T..T................................G................... : 2242 Ck-Hubei-2 : ..............................................................T....................................................... : 2242 Ck-Laos-16 : .....G........................................................T....................................................... : 2242 Ck-TL-NS-3 : ....................................C.........................T.................C..................................... : 2242 Dk-Hubei-4 : ..............T...................................T................................................................... : 2242

b. Amino acid (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 1 Ck-VN-HG4- : MDVNPTLLFLKVPVQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSEKGKWTTNTETGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVLEAMAFLEESHPGIFENSCLETMEIVQQTR : 118 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-LS-2 : ................................................................................................N..................... : 118 Ck-VN-10-0 : ................................................................................................N................I.... : 118 Ck-VN-NCVD : .....................................................................................................V................ : 118 Dk-VN-HaiP : ................................................................................................N..................... : 118 MDk-VN-145 : ..........................................I.....................................................N..................... : 118 Dk-VN-50-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Shantou : ...................................................................................................................... : 118 Ck-GD-174- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 118 Ck-TL-NP-1 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 118 Dk-TL-KU-5 : .......................................I.............................................................................. : 118 Ck-Hubei-2 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Laos-16 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-TL-NS-3 : ..........................E........................................................................................... : 118 Dk-Hubei-4 : .............A...L.........................................................NH...................................V..... : 118

360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * Ck-VN-HG4- : YMFESKSMKLRTQIPAEMLANIDLKYFNELTKKKIEKIRPLLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKRYTKTTYWWDGLQSSDDFALIVNAPNHEGIQAGVDRFYRTCKL : 472 Ck-VN-29-0 : ..........................................M........................................................................... : 472 Dk-HG-07-1 : ..........................................M........................................................................... : 472 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 472 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 472 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 472 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-TG-0 : .......................................................................................................V.............. : 472 Ck-VN-LS-2 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-10-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : ................................................................................A..................................... : 472 Dk-VN-HaiP : ...................................................................................................................... : 472 MDk-VN-145 : ...................T.................................................................................................. : 472 Dk-VN-50-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 472 Ck-Shantou : ...................................................................................................................... : 472 Ck-GD-174- : .........V............................................................................................................ : 472 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 472 Ck-TL-NP-1 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 472 Dk-TL-KU-5 : ..........................................V..A........................................................................ : 472 Ck-Hubei-2 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-Laos-16 : .............................S........................................................................................ : 472 Ck-TL-NS-3 : .............................I........................................................................................ : 472 Dk-Hubei-4 : .........P...................S.R....................................................................S................. : 472

600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700

Ck-VN-HG4- : VSDGGPNLYNIRNLHIPEVCLKWELMDEDYQGRLCNPLNPLVSHKEIESVNNAVVMPAHGPAKSMEYDAVATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCNLFEKFFPSSSYRRP : 708 Ck-VN-29-0 : ........................................F...........................................................R................. : 708 Dk-HG-07-1 : ........................................F...........................................................R................. : 708 VN-HG-207- : ........................................F............................................................................. : 708 VN-HG-178- : ........................................F............................................................................. : 708 Dk-VN-1771 : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-VN-DT-1 : ........................................F............................................................................. : 708 VN-1203-04 : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-VN-36-0 : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-VN-TG-0 : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-VN-LS-2 : ........................................F...................................T......................................... : 708 Ck-VN-10-0 : ........................................F................................................K............................ : 708 Ck-VN-NCVD : ........................................F............................................................................. : 708 Dk-VN-HaiP : ..............................R.........FI...........I................................................................ : 708 MDk-VN-145 : ........................................F............................................................................. : 708 Dk-VN-50-0 : ........................................F............I................................................................ : 708 Ck-VN-NCVD : ...........................V............F............................................................................. : 708 Ck-Shantou : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-GD-174- : ........................................F..................................................V.......................... : 708 Ck-Guangxi : ........................................F............................................................................. : 708 Ck-TL-NP-1 : ........................................F............I........R....................................................... : 708 Ck-Guangxi : ........................................F............I................................................................ : 708 Dk-TL-KU-5 : ........................................F............I................................................................ : 708 Ck-Hubei-2 : ........................................F............I...S............................................................ : 708 Ck-Laos-16 : ........................................F............I................................................................ : 708 Ck-TL-NS-3 : ........................................F............................................................................. : 708 Dk-Hubei-4 : ........................................F............................................................................. : 708

C. GEN PB1-F2 a. Nucleotide

60 * 80 * 100 * 1

* 20 * 40 * Ck-VN-HG4- : ATGGAACAGGGACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACACCAATATTCAGAAAAGGGGAAGTGGACAACAAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAACCCGATTGATGG : 118 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................A.................................................. : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-LS-2 : .......G.............................................................................................................. : 118 Ck-VN-10-0 : .......G.............................................................................................................. : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : .......G.............................................................................................................. : 118 MDk-VN-145 : .......G..A.....................A..................................................................................... : 118 Dk-VN-50-0 : .............................................................................................................T........ : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Shantou : ...................................................................................................................... : 118 Ck-GD-174- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ....G................................................................................................................. : 118 Ck-TL-NP-1 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 118 Dk-TL-KU-5 : ..........A..............A...................................A........................................................ : 118 Ck-Hubei-2 : ................G..................................................................................................... : 118 Ck-Laos-16 : ...............................G...................................................................................... : 118 Ck-TL-NS-3 : .................................................G...........A..A..................................................... : 118 Dk-Hubei-4 : ..........A....................G.....T........T.....C.....G........A..............C..A....................T..A........ : 118

20 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 * Ck-VN-HG4- : ACCACTACCTGAAGATAATGAGCCCAGTGGGTATGCACAAACAGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCCCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTTGAAACG : 236 Ck-VN-29-0 : ............G......................................................................................................... : 236 Dk-HG-07-1 : ............G......................................................................................................... : 236 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 236 VN-HG-178- : ............G......................................................................................................... : 236 Dk-VN-1771 : ............G......................................................................................................... : 236 Ck-VN-DT-1 : ............G......................................................................................................... : 236 VN-1203-04 : ............G....................C.................................................................................... : 236 Ck-VN-36-0 : ............G......................................................................................................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ............G......................................................................................................... : 236 Ck-VN-LS-2 : ...G........G...............................................................A.T.............................C......... : 236 Ck-VN-10-0 : ...G........G...............................................................A.T....................................... : 236 Ck-VN-NCVD : ............G..............................................................................G.......................... : 236 Dk-VN-HaiP : ...G........G...............................................................A.T.............................C......... : 236 MDk-VN-145 : ...G........G...............................................................A.T....................................... : 236 Dk-VN-50-0 : ............G.........................................................................................T............... : 236 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 236 Ck-Shantou : ............G.............................................................................A........................... : 236 Ck-GD-174- : ............G............................................G................................A........................... : 236 Ck-Guangxi : ............G.................T......................................................................................A : 236 Ck-TL-NP-1 : ............G.........................................................................................T............... : 236 Ck-Guangxi : ............G.........................................................................................T............... : 236 Dk-TL-KU-5 : ............G.........................................................................................T............... : 236 Ck-Hubei-2 : ............G......................................................................................................... : 236 Ck-Laos-16 : G...........G.........................................................................................T............... : 236 Ck-TL-NS-3 : ......G.....G.........................................A..................................................A...........A : 236 Dk-Hubei-4 : .........C..GA..C.C.....G..C..A....................G....................C................................A............ : 236

240 * 260 * Ck-VN-HG4- : ATGGAAATTGTTCAACAAACAAGAGTGGATAAACTGA : 273 Ck-VN-29-0 : .............................C....... : 273 Dk-HG-07-1 : .............................C....... : 273 VN-HG-207- : ..................................... : 273 VN-HG-178- : ..................................... : 273 Dk-VN-1771 : .............................C....... : 273 Ck-VN-DT-1 : ..................................... : 273 VN-1203-04 : ..................................... : 273 Ck-VN-36-0 : ..................................... : 273 Ck-VN-TG-0 : ..................................... : 273 Ck-VN-LS-2 : ....................C............T... : 273 Ck-VN-10-0 : .........A..........C................ : 273 Ck-VN-NCVD : .............................C....... : 273 Dk-VN-HaiP : ....................C............T... : 273 MDk-VN-145 : ....................C................ : 273 Dk-VN-50-0 : ...........C......................... : 273 Ck-VN-NCVD : .............................C....... : 273 Ck-Shantou : ..................................... : 273 Ck-GD-174- : ..................................... : 273 Ck-Guangxi : ..................................... : 273 Ck-TL-NP-1 : ..................................... : 273 Ck-Guangxi : .....G............................... : 273 Dk-TL-KU-5 : ...................................A. : 273 Ck-Hubei-2 : ...........C......................... : 273 Ck-Laos-16 : .............................C....... : 273 Ck-TL-NS-3 : ..................................... : 273 Dk-Hubei-4 : ......G.......G..............C....... : 273

b. Amino acid

* 80 *

* 20 * 40 * 60 Ck-VN-HG4- : MEQGQDTPWTQSTEHTNIQKRGSGQQTQRLEHPNSTRLMDHYLKIMSPVGMHKQIVYWKQWLSLKNPTQGSLKTRVLKRWKLFNKQEWIN : 90 Ck-VN-29-0 : ...........................................R............................................T. : 90 Dk-HG-07-1 : ...........................................R............................................T. : 90 VN-HG-207- : .......................................................................................... : 90 VN-HG-178- : ...........................................R.............................................. : 90 Dk-VN-1771 : ...........................................R............................................T. : 90 Ck-VN-DT-1 : ...........................................R.............................................. : 90 VN-1203-04 : ...........................................R......T....................................... : 90 Ck-VN-36-0 : ......................N....................R.............................................. : 90 Ck-VN-TG-0 : ...........................................R.............................................. : 90 Ck-VN-LS-2 : ..R.....................................R..R.....................I.........A.........P.... : 90 Ck-VN-10-0 : ..R.....................................R..R.....................I...................P.... : 90 Ck-VN-NCVD : ...........................................R............................................T. : 90 Dk-VN-HaiP : ..R.....................................R..R.....................I.........A.........P.... : 90 MDk-VN-145 : ..RE....................................R..R.....................I...................P.... : 90 Dk-VN-50-0 : ....................................L......R.............................I........S....... : 90 Ck-VN-NCVD : ........................................................................................T. : 90 Ck-Shantou : ...........................................R.........................E.................... : 90 Ck-GD-174- : ...........................................R..............R..........E.................... : 90 Ck-Guangxi : .G.........................................R.....V............................Q........... : 90 Ck-TL-NP-1 : ...........................................R.............................I................ : 90 Ck-Guangxi : ...........................................R.............................I......R......... : 90 Dk-TL-KU-5 : ...E....-...........K......................R.............................I................ : 89 Ck-Hubei-2 : .....G.....................................R......................................S....... : 90 Ck-Laos-16 : ..........R............................G...R.............................I..............T. : 90 Ck-TL-NS-3 : ................S...KE...................C.R.............-................H...Q........... : 89 Dk-Hubei-4 : ...E......R.I..I.T.R..N....PK......IQ.....PR.T.RAD......C......S..........H........S....T. : 90

D. GEN PA a. Nucleotide (rút gọn)

* 20 * 40 * 60

* 80 * 100 * 1

Ck-VN-HG4- : ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATTGTCGAGCTTGCAGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACGAACAAGTTTGCTGCAATATGCA : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-207- : .................................................................G.................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ..................................................G................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ..................A.............G.....C............................................................................... : 118 Dk-VN-BL-0 : .........................................................................................T............................ : 118 Ck-VN-10-0 : ..................................................G..................................................AC............... : 118 Dk-VN-LS-2 : ..................................................G......................................T...........A................ : 118 Ck-VN-NB-2 : ......................................C...........G...........................A......................A..C..C.......... : 118 Dk-VN-HaiP : ................................T.................G......................................T...........A................ : 118 MDk-VN-145 : ..................................................G..................................................A................ : 118 Dk-PhuTho- : ...........C..........................C...........G...........................A................A.....A..C..C.......... : 118 Dk-Guangxi : .............................C........C...........G..............G...................................A..C..A.......... : 118 Ck-GD-191- : ..................................................G..................................................A................ : 118 Ck-Guangxi : ..................................................G..................................................A................ : 118 Ck-Indo-CD : ..................................................G..................................................A................ : 118 Ck-TL-NP-1 : ..................................................G...........................A............................C.......... : 118 Ck-EastJav : ..................................................G..................................................A................ : 118 Ck-Hubei-2 : ......................................C...........G..................................................A..C..C.......... : 118 Ck-Hunan-8 : ..................................................G............................................A.....A.....C.......... : 118 Dk-Hubei-4 : ......................................C...........G..............G...................................A..C..A.......... : 118

180 * 200 * 220 *

20 * 140 * 160 * Ck-VN-HG4- : CACACTTGGAGGTCTGTTTCATGTATTCGGATTTTCACTTTATTGATGAACGGAGTGAATCAATAATTGTAGAATCTGGAGATCTGTATGCATTATTGAAACACCGATTTGAAATAAT : 236 Dk-HG-07-1 : ....................................................................................C.A............................... : 236 VN-HG-207- : ......................................................................................A............................... : 236 VN-HG-178- : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-CT-0 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-TG-0 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-DT-1 : ....................................................................................C.A............................... : 236 VN-1203-04 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-NCVD : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-NCVD : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-NCVD : ....................................................................................C.A............................... : 236 Dk-VN-BL-0 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-10-0 : ..................................C.................................................C.A............................... : 236 Dk-VN-LS-2 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-VN-NB-2 : .......A..A.....C.................C.................AG.C.......................C....C.A.........................G..... : 236 Dk-VN-HaiP : ....................................................................................C.A............................... : 236 MDk-VN-145 : ....................................................................................C.A............................... : 236 Dk-PhuTho- : .......A..A.....C.................C.................AG.C.......................T....C.A.........................G..... : 236 Dk-Guangxi : .......A..A.G...C.................C.....C...........AG.C.......................C....CAA....G.......................... : 236 Ck-GD-191- : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-Guangxi : .............T.....................................A................................C.A.C............................. : 236 Ck-Indo-CD : ....................................................................................C.A.........................G..... : 236 Ck-TL-NP-1 : .......A..A.........................................AG.C.......................C....C.A.........................G..... : 236 Ck-EastJav : ....................................................................................C.A............................... : 236 Ck-Hubei-2 : .......A..A.......................C.................AG.C.......................C....C.A.........................G..... : 236 Ck-Hunan-8 : .......A..A.................A.....C...........C.....AG.C.......................C....C.A.........................G..... : 236 Dk-Hubei-4 : .......A..A.....C.................C.....C...........AG.C.......................C....CAA............................... : 236

* 1080 * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180

Ck-VN-HG4- : CCAAAAACAAAGAACATGAAAAAAACAAGCCAGTTGAAGTGGACACTCGGTGAGAACATGGCACCAGAGAAAGTAGACTTTGAGGACTGCAAAGATGTTAGCGATCTAAGACAGTATG : 1180 Dk-HG-07-1 : ..G........A..............................G..........A..........................................A..................... : 1180 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 1180 VN-HG-178- : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-CT-0 : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-TG-0 : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-DT-1 : ..........................................G........................................................................... : 1180 VN-1203-04 : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-NCVD : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-NCVD : ..G........A..............................G..........A..........................................A..................... : 1180 Ck-VN-NCVD : ..G....A..................................G..........A..........................................A..................... : 1180 Dk-VN-BL-0 : ..G.......................................G..........A..........................................A..................... : 1180 Ck-VN-10-0 : ..........................................G........................................................................... : 1180 Dk-VN-LS-2 : ..........................................G........................................................................... : 1180 Ck-VN-NB-2 : ....................G...........A..A......G....T....................A........................................A........ : 1180 Dk-VN-HaiP : ....................G...........A.........G....T....................A........................................A........ : 1180 MDk-VN-145 : ...................................A......G........................................................................... : 1180 Dk-PhuTho- : ....................G...........A..A......G....T....................A.......................G................A........ : 1180 Dk-Guangxi : .....G..............G...........A.........G......................G..A.....G...........T...........C........G.A........ : 1180 Ck-GD-191- : ..........................................G..........................................................................A : 1180 Ck-Guangxi : ..........................................G.......A..................................................................A : 1180 Ck-Indo-CD : ......................................A...G..................................................................C........ : 1180 Ck-TL-NP-1 : ....................G...........A..A......G....T.....A..............A..............................G.........A........ : 1180 Ck-EastJav : ......................................A...G..................................................................C........ : 1180 Ck-Hubei-2 : ....................G...........A..A......G....T....................A................................................. : 1180 Ck-Hunan-8 : ....................G...........A.........G....T....................A................................T................ : 1180 Dk-Hubei-4 : .....G..............G...........A.........G......................G..A.....G...........T...........C........G.A........ : 1180

* 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980 * 2000 Ck-VN-HG4- : AAGGCTCCATCGGAAAGGTGTGCAGAACCTTGCTGGCGAAGTCTGTGTTCAACAGTTTATATGCATCTCCACAACTCGAGGGGTTTTCAGCTGAATCAAGAAAATTGCTTCTCATTGC : 2006 Dk-HG-07-1 : ...................A.................................................................................................. : 2006 VN-HG-207- : .............G........................................................................................................ : 2006 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 2006 Ck-VN-CT-0 : ....................................................T................................................................. : 2006 Ck-VN-TG-0 : ....................................................T................................................................. : 2006 Ck-VN-DT-1 : .............................C........................................................................................ : 2006 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 2006 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 2006 Ck-VN-NCVD : ...................A.................................................................................................. : 2006 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 2006 Dk-VN-BL-0 : ...................................................................................................................... : 2006 Ck-VN-10-0 : ........................................A.............A.............T...............................................A. : 2006 Dk-VN-LS-2 : ........................................A.............A.............G.............................C.................A. : 2006 Ck-VN-NB-2 : ..A.......T..G..............A..A..A..A..A.....A........CC...................T........................................T : 2006 Dk-VN-HaiP : ..A.......T..G..............A..A..A..A..A.....A........CC...................T........................................T : 2006 MDk-VN-145 : ................A.......................A...........................T...............................................A. : 2006 Dk-PhuTho- : ..A.......T..G..............A..A..A..A..A.....A........CC...............................................C............T : 2006 Dk-Guangxi : .............G..A..............A..A..A..A.....A.........C............................C...........G....G.C....A.......T : 2006 Ck-GD-191- : ....................................................................T................................................. : 2006 Ck-Guangxi : ....................................................................T................................................. : 2006 Ck-Indo-CD : .G........................................................G.........T................................................. : 2006 Ck-TL-NP-1 : ..A.......T..G..............A..A..A..A..A.....A........CC...................T........................................T : 2006 Ck-EastJav : .G........................................................G.........T................................................. : 2006 Ck-Hubei-2 : ..A.......T..G..............A..A..A..A..A.....A........CC...................T........................................T : 2006 Ck-Hunan-8 : ..........T..G.......A......A..A..A..A..A..............CC............................................................T : 2006 Dk-Hubei-4 : .............G..A..............A..A..A..A.....A.........C............................C...........G....G.C....A.......T : 2006

* 2020 * 2040 * 2060 * 2080 * 2100 * 2120 Ck-VN-HG4- : TCAGGCACTTAGGGACAACCTGGAACCTGGGACCTTCGATCTTGGAAGGCTATTTGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAACGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCGTCTTGGTTCAAC : 2124 Dk-HG-07-1 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 VN-HG-207- : ..............................................G......A................................................................ : 2124 VN-HG-178- : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-CT-0 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-TG-0 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-DT-1 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 VN-1203-04 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-NCVD : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-NCVD : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-NCVD : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Dk-VN-BL-0 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-10-0 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Dk-VN-LS-2 : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-VN-NB-2 : ..............................A..............GG......A...........................T.......................A............ : 2124 Dk-VN-HaiP : ..............................A..............GG......A...........................T.......................A............ : 2124 MDk-VN-145 : ..............................................G......A......................G......................................... : 2124 Dk-PhuTho- : ..............................A..............GG......A...........................T.................C.....A............ : 2124 Dk-Guangxi : ......G........T..T...........A..T............G......A.........C.................T.................................... : 2124 Ck-GD-191- : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-Guangxi : ..............................................G......A................................................................ : 2124 Ck-Indo-CD : ..............................................G......A......................................................C......... : 2124 Ck-TL-NP-1 : ..............................A..............GG......A...........................T.......................A............ : 2124 Ck-EastJav : ..............................................G......A......................................................C......... : 2124 Ck-Hubei-2 : .............................................GG......A...........................T.................................... : 2124 Ck-Hunan-8 : ..............................A..............GG......A................................................................ : 2124 Dk-Hubei-4 : ......G...G....T..............A..T............G......A.........C.................T.................................... : 2124

b. Amino acid (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 1 Ck-VN-HG4- : MEDFVRQCFNPMIVELAEKAMKEYGEDPKIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHFIDERSESIIVESGDLYALLKHRFEIIEGRDRTMAWTVVNSICNTTGVEKPKFLPDLYDYKENRFI : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................PN................................................. : 118 VN-HG-207- : ....................................................................N................................................. : 118 VN-HG-178- : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-DT-1 : ...................................................................PN................................................. : 118 VN-1203-04 : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-NCVD : ......K............................................................PN................................................. : 118 Dk-VN-BL-0 : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-10-0 : ..................................L................................PN.............................................D... : 118 Dk-VN-LS-2 : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-VN-NB-2 : ..........................N..............................G.........PN...............................D................. : 118 Dk-VN-HaiP : ...................................................................PN................................................. : 118 MDk-VN-145 : ...................................................................PN.............................................D... : 118 Dk-PhuTho- : ..........................N..............................G.........PN...............................D...S............. : 118 Dk-Guangxi : ...........................................G.............G.........PN..............................A.................. : 118 Ck-GD-191- : ...................................................................PN................................................. : 118 Ck-Guangxi : ........................................................Q..........PN................................................. : 118 Ck-Indo-CD : ...................................................................PN........................L....R................... : 118 Ck-TL-NP-1 : ..........................N..............................G.........PN...............................D................. : 118 Ck-EastJav : ...................................................................PN...............A........L........................ : 118 Ck-Hubei-2 : .........................................................G.........PN...............................D................. : 118 Ck-Hunan-8 : .........................................................G.........PN...............................D................. : 118 Dk-Hubei-4 : .........................................................G.........PN................................................. : 118

360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * Ck-VN-HG4- : PKTKNMKKTSQLKWTLGENMAPEKVDFEDCKDVSDLRQYDSDEPESRSLASWIQSEFNKACELTDSSWIELDEIGEDVAPIEHIASMRRNYFTAEVSHCRATEYIMKGVYINTALLNA : 472 Dk-HG-07-1 : ..............A.................I..................................................................................... : 472 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 472 VN-HG-178- : ..............A....................................................................................................... : 472 Ck-VN-CT-0 : ..............A....................................................................................................... : 472 Ck-VN-TG-0 : ..............A....................................................................................................... : 472 Ck-VN-DT-1 : ..............A....................................................................................................... : 472 VN-1203-04 : ..............A...................................................I................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : ..............A................................................................................A...................... : 472 Ck-VN-NCVD : ..............A.................I..................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : ..K...........A.................I..................................................................................... : 472 Dk-VN-BL-0 : ..............A.................I..................................................................................... : 472 Ck-VN-10-0 : ..............A.....................................V................................................................. : 472 Dk-VN-LS-2 : ..............A.....................................V................................................................. : 472 Ck-VN-NB-2 : ..............A.....................K........P...S.................................................................... : 472 Dk-VN-HaiP : ..............A.....................K............S.................................................................... : 472 MDk-VN-145 : ..............A.....................................V..........................................I...................... : 472 Dk-PhuTho- : ..............A.....................K........P...S.................................................................... : 472 Dk-Guangxi : ..............A.....................K........P........................................................................ : 472 Ck-GD-191- : ..............A........................N.............................................................................. : 472 Ck-Guangxi : ..............A........................N............................V.F............................................... : 472 Ck-Indo-CD : ..............A.....................T................................................................................. : 472 Ck-TL-NP-1 : ..............A..................G..K........P...S.................................................................... : 472 Ck-EastJav : ..............A.....................T................................................................................. : 472 Ck-Hubei-2 : ..............A..............................PK..S....................................T............................... : 472 Ck-Hunan-8 : ..............A....................................................................................................... : 472 Dk-Hubei-4 : ..............A.....................K........P........................................................................ : 472

600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 Ck-VN-HG4- : QIESMIEAESSVKEKDMTKEFFENKSETWPIGESPKGVEEGSIGKVCRTLLAKSVFNSLYASPQLEGFSAESRKLLLIAQALRDNLEPGTFDLGRLFEAIEECLINDPWVLLNASWFN : 708 Dk-HG-07-1 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 VN-HG-207- : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 VN-HG-178- : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-CT-0 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-TG-0 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-DT-1 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 VN-1203-04 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-NCVD : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-NCVD : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-NCVD : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Dk-VN-BL-0 : ..............................................................................................G.Y..................... : 708 Ck-VN-10-0 : .........................................................N....S...............T...............G.Y..................... : 708 Dk-VN-LS-2 : .........................................................N....A...............T...............G.Y..................... : 708 Ck-VN-NB-2 : .......................T................S.....................................V...............G.Y..................... : 708 Dk-VN-HaiP : .......................T................S.....................................V...............G.Y..................... : 708 MDk-VN-145 : ..............................................................S...............T...............G.Y.......V............. : 708 Dk-PhuTho- : ......................VT...A............S.....................................V...............G.Y..................... : 708 Dk-Guangxi : .........................................................................R....V...............G.Y..................... : 708 Ck-GD-191- : ..............................................................S...............................G.Y..................... : 708 Ck-Guangxi : ........................R.....................................S...............................G.Y..................... : 708 Ck-Indo-CD : ..............................................................S...............................G.Y..................... : 708 Ck-TL-NP-1 : .......................T................S.....................................V...............G.Y..................... : 708 Ck-EastJav : ..............................................................S...............................G.Y..................... : 708 Ck-Hubei-2 : ....TV..................................S.....................................V...............G.Y..................... : 708 Ck-Hunan-8 : ..............................................Y...............................V...............G.Y..................... : 708 Dk-Hubei-4 : .........................................................................R....V...G...........G.Y..................... : 708

Phụ lục 8: SO SÁNH TRÌNH TỰ THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID GEN NP, M VÀ NS GIỮA CHỦNG CKHG4 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

A. GEN NP a. Nucleotide (rút gọn)

100 *

* 20 * 40 * 60 * Ck-VN-HG4- : ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCTTATGAACAAATGGAAACTGGTGGGGAACGCCAGAATGCTACTGAGATCAGGGCATCTGTTGGAAGAATGGTTAGTGGAATTGGGAGGTTCT : 118 Ck-VN-29-0 : ---................................G.................................................................................. : 115 Dk-HG-07-1 : ...................................G.................................................................................. : 118 VN-HG-207- : ........................................................................................................C............. : 118 VN-HG-178- : ...................................G....................................................................C............. : 118 Dk-VN-1771 : ...................................G....................................................................C............. : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................G....................................................................C............. : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................G....................................................................C............. : 118 VN-1203-04 : ...................................G....................................................................C............. : 118 Ck-VN-LS-2 : ..........................C........G..............A.....................................................C............. : 118 Ck-VN-NB-2 : ...................................G..............A..G.........T........................................C............. : 118 Ck-VN-10-0 : ...................................G..............A.........................................G...........C............. : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................G....................................................................C............. : 118 Dk-VN-HaiP : ...................................G..............A..G.........T........................................C............. : 118 MDk-VN-145 : ...................................G..............A................................................G....C............. : 118 Dk-VN-50-0 : ...................................G..............A..G..................................................C............. : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................G....................................................................C............. : 118 Dk-VN-17A- : ...................................G.....G...A..........................................................C............. : 118 Dk-VN-36ST : ...................................G.....G...A..........................................................C............. : 118 Ck-Hubei-w : .......................G..C........G..............A..........................A.....................G..........A.....T. : 118 Ck-GD-174- : ...................................G..............A.....................................................C............. : 118 Ck-Guangxi : ...................................G..............A..................................................C..C............. : 118 Ck-TL-NP-1 : ...........G.......................G..............A..G..................................................C............. : 118 Ck-Guangxi : ...................................G..............A..G..................................................C............. : 118 Ck-Hubei-2 : ...........G.......................G..............A...................................C...........C.....C............. : 118 Ck-Hunan-8 : ........C..........................G..............A..G.............................C....................C........A.... : 118 Dk-Hubei-4 : .............................C.....G..............A.......................T.............................C............. : 118

* 1320 *

1340 * 1360 * 1380 * 1400 *

* 1440 * 1460 * 1480 *

Ck-VN-HG4- : TGAGGGCAGAACGTCTGACATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACG : 1416 Ck-VN-29-0 : ......T............................................................................................................... : 1413 Dk-HG-07-1 : ......T............................................................................................................... : 1416 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 1416 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 1416 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 1416 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-LS-2 : ...A.................................................................................................................. : 1416 Ck-VN-NB-2 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-10-0 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 1416 Dk-VN-HaiP : ...................................................................................................................... : 1416 MDk-VN-145 : ...................................................................................................................... : 1416 Dk-VN-50-0 : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-VN-NCVD : ......T............................................................................................................... : 1416 Dk-VN-17A- : ......T............................................................................................................... : 1416 Dk-VN-36ST : ......T............................................................................................................... : 1416 Ck-Hubei-w : G...........A.....................................................C.....T............................................. : 1416 Ck-GD-174- : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-Guangxi : .......................................G.............................................................................. : 1416 Ck-TL-NP-1 : ..............................G....................................................................................... : 1416 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 1416 Ck-Hubei-2 : ......................................A...............T........................A...................................... : 1416 Ck-Hunan-8 : ...................................................................................................................... : 1416 Dk-Hubei-4 : ...................................................................................................................... : 1416 1420 Ck-VN-HG4- : AACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACATGAATAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAATTAA : 1497 Ck-VN-29-0 : ..............................................----------------------------------- : 1459 Dk-HG-07-1 : ................................................................................. : 1497 VN-HG-207- : ................................................................................. : 1497 VN-HG-178- : ................................................................................. : 1497 Dk-VN-1771 : ......................................................................----------- : 1486 Ck-VN-TG-0 : ................................................................................. : 1497 Ck-VN-36-0 : ..............................................................------------------- : 1478 VN-1203-04 : ................................................................................. : 1497 Ck-VN-LS-2 : ................................................................................. : 1497 Ck-VN-NB-2 : ................................................................................. : 1497 Ck-VN-10-0 : ................................................................................. : 1497 Ck-VN-NCVD : ................................................................................. : 1497 Dk-VN-HaiP : ................................................................................. : 1497 MDk-VN-145 : ......................................................................----------- : 1486 Dk-VN-50-0 : ................................C.................................AGA------------ : 1485 Ck-VN-NCVD : .......................................................................C......... : 1497 Dk-VN-17A- : .......................................................................C......... : 1497 Dk-VN-36ST : .......................................................................C......... : 1497 Ck-Hubei-w : ............................G.............................................A...... : 1497 Ck-GD-174- : ................................................................................. : 1497 Ck-Guangxi : ......................................................................----------- : 1486 Ck-TL-NP-1 : ..............................................................................--- : 1494 Ck-Guangxi : ...............................................................------------------ : 1479 Ck-Hubei-2 : ................................................................................. : 1497 Ck-Hunan-8 : ......G.......................................................................... : 1497 Dk-Hubei-4 : ................................................................................. : 1497

b. Amino acid (rút gọn)

100 *

* 20 * 40 * 60 * 80 Ck-VN-HG4- : MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVSGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKWVRELILYDKEEIRR : 118 Ck-VN-29-0 : -..................................................................................................................... : 117 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-LS-2 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NB-2 : .....................S................................................................................................ : 118 Ck-VN-10-0 : ............................................................................................................T......... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : .....................S................................................................................................ : 118 MDk-VN-145 : .................................G.................................................................................... : 118 Dk-VN-50-0 : ..............................................................T....................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-17A- : ...............S...................................................................................................... : 118 Dk-VN-36ST : ...............S...................................................................................................... : 118 Ck-Hubei-w : .................................G......................................................................I............. : 118 Ck-GD-174- : .........................................................-............................................................ : 117 Ck-Guangxi : ...................................................H.................................................................. : 118 Ck-TL-NP-1 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Hubei-2 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Hunan-8 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-Hubei-4 : ....................................................................P................................................. : 118

240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * Ck-VN-HG4- : AMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALMLRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVP : 354 Ck-VN-29-0 : ............................I......................................................................................... : 353 Dk-HG-07-1 : ............................I......................................................................................... : 354 VN-HG-207- : ............................I......................................................................................... : 354 VN-HG-178- : ............................I......................................................................................... : 354 Dk-VN-1771 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-TG-0 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-36-0 : ............................I......................................................................................... : 354 VN-1203-04 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-LS-2 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-NB-2 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-10-0 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-NCVD : ............................I......................................................................................... : 354 Dk-VN-HaiP : ............................I......................................................................................... : 354 MDk-VN-145 : ............................I.....................................................................A...........V....... : 354 Dk-VN-50-0 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-VN-NCVD : ............................I......................................................................................... : 354 Dk-VN-17A- : ............................I......................................................................................... : 354 Dk-VN-36ST : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-Hubei-w : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-GD-174- : ............................I......................................................................................... : 353 Ck-Guangxi : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-TL-NP-1 : ............................I........................N...............................................L................ : 354 Ck-Guangxi : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-Hubei-2 : ............................I......................................................................................... : 354 Ck-Hunan-8 : ............................I......................................................................................... : 354 Dk-Hubei-4 : ............................I......................................................................................... : 354

360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * Ck-VN-HG4- : RGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAT : 472 Ck-VN-29-0 : .............................................K........................................................................ : 471 Dk-HG-07-1 : .............................................K........................................................................ : 472 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 472 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 472 Dk-VN-1771 : .............................................K........................................................................ : 472 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 472 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-LS-2 : .............................................K........................................................................ : 472 Ck-VN-NB-2 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-10-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : .............................................K........................................................................ : 472 Dk-VN-HaiP : ...................................................................................................................... : 472 MDk-VN-145 : ...................................................................................................................... : 472 Dk-VN-50-0 : ...................................................................................................................... : 472 Ck-VN-NCVD : .............................................K........................................................................ : 472 Dk-VN-17A- : ...........................................H.K........................................................................ : 472 Dk-VN-36ST : ...........................................H.K........................................................................ : 472 Ck-Hubei-w : ..................T...S............................................................................................... : 472 Ck-GD-174- : ...................................................................................................................... : 471 Ck-Guangxi : .....................................................I................................................................ : 472 Ck-TL-NP-1 : ........I............................................................................................................. : 472 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 472 Ck-Hubei-2 : ..................T........................................................S...............K.............R............ : 472 Ck-Hunan-8 : ...................................................................................................................... : 472 Dk-Hubei-4 : ...................................................................................................................... : 472

B. GEN M1

a. Nucleotide (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80 *

100 *

Ck-VN-HG4- : ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCG : 118 Dk-HG-07-1 : ......................................................................................G.......................A....... : 118 VN-HG-207- : ................................A..................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ......................................................................................G.......................A....... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-5-03 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-30-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-11-0 : ...............................................A...................................................................... : 118 Ck-VN-1-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ......................................................................................G............................... : 118 Ck-VN-LS-2 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NB-2 : ......................................................................................G............................... : 118 MDk-VN-145 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-50-0 : ...............................................A......................................G............................... : 118 Ck-VN-NCVD : ......................................................................................G.......................A.....T. : 118 Dk-VN-17A- : ......................................................................................G.......................G.....T. : 118 Dk-VN-36ST : ......................................................................................G.......................A.....T. : 118 Ck-VN-NCVD : ....................T..................................................A.....A..............T..C..............T....... : 118 Dk-Hubei-w : ...............................................................................................C...................... : 118 Ck-Guangxi : .......................................................................T.............................................. : 118 Thailand-N : ...................................................................................................................... : 118 Dk-Guangxi : ......................................................................................G............................... : 118 Ck-Hubei-2 : ....................T................................................................................G................ : 118 Ck-Hunan-8 : ......................................................................................G............................... : 118 Dk-Hubei-4 : ..........................................G.............................A......G....................................A. : 118

480 * 500 * 520 * 540 * 560 * 580 * Ck-VN-HG4- : AGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCAACTGTCACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTGCTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGA : 590 Dk-HG-07-1 : .............................A........................................................................................ : 590 VN-HG-207- : .............................A........................................................................................ : 590 VN-HG-178- : .............................A...............................................................................G........ : 590 Dk-VN-1771 : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-CT-0 : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-TG-0 : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-5-03 : .............................A...T.................................................................................... : 590 Ck-VN-30-0 : .............................A........................................................................................ : 590 Dk-VN-11-0 : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-1-04 : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-NCVD : .............................A........................................................................................ : 590 Ck-VN-LS-2 : ..........C.................CA...................G.................................................................... : 590 Ck-VN-NB-2 : ............................CA....A..............G.................................................................C.. : 590 MDk-VN-145 : .............................A...................G.................................................................... : 590 Dk-VN-50-0 : ............................CA...................G.................................................................C.. : 590 Ck-VN-NCVD : .............................A.........................A.............................................................. : 590 Dk-VN-17A- : .............................A.........................A.............................................................. : 590 Dk-VN-36ST : .............................A.........................A.............................................................. : 590 Ck-VN-NCVD : .............................A...................G....................A............................................... : 590 Dk-Hubei-w : .............................A...................G.................................................................... : 590 Ck-Guangxi : .............................A...................G.................................................................... : 590 Thailand-N : .............................AC...........................................................................A........... : 590 Dk-Guangxi : ............................CA...................G.................................................................C.. : 590 Ck-Hubei-2 : ............................CA...................G.................................................................C.. : 590 Ck-Hunan-8 : ............................CA...................G.................................................................C.. : 590 Dk-Hubei-4 : ...................A.........A...................G........................................................T.....G..... : 590

600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 Ck-VN-HG4- : GCAGGCAGCGGAAGCCATGGAGATTGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAAT : 708 Dk-HG-07-1 : ........................C............................................................................................. : 708 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 708 VN-HG-178- : ........................C............................................................................................. : 708 Dk-VN-1771 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-CT-0 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-TG-0 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-5-03 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-30-0 : ........................C......................................................................................C...... : 708 Dk-VN-11-0 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-1-04 : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-NCVD : ........................C............................................................................................. : 708 Ck-VN-LS-2 : .....................AG............................................................................................... : 708 Ck-VN-NB-2 : ......................G.C............................................................................................. : 708 MDk-VN-145 : ......................G....................................................C.......................................... : 708 Dk-VN-50-0 : ......................G.C.......................................................................A..................... : 708 Ck-VN-NCVD : ........................C............................................................................................. : 708 Dk-VN-17A- : ........................C........................................................T......A............................. : 708 Dk-VN-36ST : ........................C.......................................................................A...........C......... : 708 Ck-VN-NCVD : ...............A..T.....C..........................................................................G..C............... : 708 Dk-Hubei-w : ......................G.C............................................................................................. : 708 Ck-Guangxi : ......................G.C...................................A......................................................... : 708 Thailand-N : ........................C............................................................................................. : 708 Dk-Guangxi : ......................G.C............................................................................................. : 708 Ck-Hubei-2 : .....................AG.C............................................................................................. : 708 Ck-Hunan-8 : ......................G.C............................................................................................. : 708 Dk-Hubei-4 : A.....................G.C....G..............................A...........................A.C........................... : 708

b. Amino acid

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 * Ck-VN-HG4- : MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQKLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYKKLKREITFHGAKEVALSYSTGALASCMGL : 130 Dk-HG-07-1 : .................................................................................................................................. : 130 VN-HG-207- : .................................................................................................................................. : 130 VN-HG-178- : .................................................................................................................................. : 130 Dk-VN-1771 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-CT-0 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-TG-0 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-5-03 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-30-0 : .....................................................................................................................R............ : 130 Dk-VN-11-0 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-1-04 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-NCVD : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-LS-2 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-NB-2 : .................................................................................................................................. : 130 MDk-VN-145 : .................................................................................................................................. : 130 Dk-VN-50-0 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-NCVD : .................................................................................................................................. : 130 Dk-VN-17A- : .................................................................................................................................. : 130 Dk-VN-36ST : .................................................................................................................................. : 130 Ck-VN-NCVD : ....................................................................................S............................................. : 130 Dk-Hubei-w : .................................................................................................................................. : 130 Ck-Guangxi : ..........................................................M....................................................................... : 130 Thailand-N : .................................................................................................................................. : 130 Dk-Guangxi : .................................................................................................................................. : 130 Ck-Hubei-2 : .................................................................................................................................. : 130 Ck-Hunan-8 : .................................................................................................................................. : 130 Dk-Hubei-4 : ..............V.........T.R....................................................................................................... : 130

140 * 160 * 180 * 200 * 220 * 240 * Ck-VN-HG4- : IYNRMGTVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMATVTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEIANQARQMVQAMRTIGTHPNSSAGLRDNLLENLQAYQKRMGVQMQRFK- : 252 Dk-HG-07-1 : .....................................I....................................................................................- : 252 VN-HG-207- : .....................................I....................................................................................- : 252 VN-HG-178- : .....................................I....................................................................................- : 252 Dk-VN-1771 : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-CT-0 : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-TG-0 : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-5-03 : .....................................II...................................................................................- : 252 Ck-VN-30-0 : .....................................I....................................................................................- : 252 Dk-VN-11-0 : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-1-04 : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-NCVD : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-LS-2 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Ck-VN-NB-2 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 MDk-VN-145 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Dk-VN-50-0 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Ck-VN-NCVD : .....................................I....................................................................................- : 252 Dk-VN-17A- : .....................................I..........................................................T.........................- : 252 Dk-VN-36ST : .....................................I....................................................................................- : 252 Ck-VN-NCVD : .....................................I..................................I.................................................- : 252 Dk-Hubei-w : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Ck-Guangxi : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Thailand-N : .....................................T....................................................................................- : 252 Dk-Guangxi : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Ck-Hubei-2 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Ck-Hunan-8 : .....................................I....................................V...............................................- : 252 Dk-Hubei-4 : .....................................I....................................V.S...................T..............N..........- : 252

C. GEN M2

a. Nucleotide

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 1

Ck-VN-HG4- : ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGATCCTATTGTTGTTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGATAT : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-207- : ...................................................................................................................... : 118 VN-HG-178- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-5-03 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-30-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-11-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-1-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-LS-2 : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 Ck-VN-NB-2 : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 MDk-VN-145 : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 Dk-VN-50-0 : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-17A- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-36ST : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ....................T......................................................C.......................................... : 118 Dk-Hubei-w : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 Ck-Guangxi : ...........................................................................C..A............G.......................... : 118 Thailand-N : ...................................................................................................................... : 118 Dk-Guangxi : ...........................................................................C...............G.......................... : 118 Ck-Hubei-2 : ....................T......................................................C...............G.......................... : 118 Ck-Hunan-8 : ............................A..............................................C...............G.......................... : 118 Dk-Hubei-4 : .....................................C..G...........A......................C................C......................... : 118

20 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 * Ck-VN-HG4- : TGTGGATTTTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCATTTATCGTCGCCTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTGCTACGGCAGGGGTACCTGAGTCTATGAGGGAAGAGTACCGGCAGGA : 236 Dk-HG-07-1 : ........C..........................................................C.................................................. : 236 VN-HG-207- : ........C...................................A......................................................................... : 236 VN-HG-178- : ........C............................................................................................................. : 236 Dk-VN-1771 : ........C..........................................................C.................................................. : 236 Ck-VN-CT-0 : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-TG-0 : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-5-03 : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-30-0 : ........C............................................................................................................. : 236 Dk-VN-11-0 : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-1-04 : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-NCVD : ........C............................................................................................................. : 236 Ck-VN-LS-2 : ........C..........................................................C...T.............................................. : 236 Ck-VN-NB-2 : ........C..............................................................T......A....................................... : 236 MDk-VN-145 : ........C..............................................................T......A....................................... : 236 Dk-VN-50-0 : ........C..............................................................T......A......G................................ : 236 Ck-VN-NCVD : ........C..........................................................C...............A.................................. : 236 Dk-VN-17A- : ........C.............................................A............C...............A.................................. : 236 Dk-VN-36ST : ........C.............................................A............C...............A.................................. : 236 Ck-VN-NCVD : ........C......A.......................................................T..................................A........... : 236 Dk-Hubei-w : ........C..............................................................T.............................................. : 236 Ck-Guangxi : ........C..............................................................T......A...A..........................T........ : 236 Thailand-N : ........C............................................................................................................. : 236 Dk-Guangxi : ........C..............................................................T......A....................................... : 236 Ck-Hubei-2 : ........C..............................................................T....A.A....................................... : 236 Ck-Hunan-8 : ........C..............................................................T......A....................................... : 236 Dk-Hubei-4 : ........C.............................................A................T......G...A.......................A..T........ : 236

240 * 260 * 280 * Ck-VN-HG4- : ACAGCAGAGTGCTGTGGATGTTGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGAATTGGAGTAA : 294 Dk-HG-07-1 : .......................................................... : 294 VN-HG-207- : .......................................................... : 294 VN-HG-178- : .......................................................... : 294 Dk-VN-1771 : .......................................................... : 294 Ck-VN-CT-0 : .......................................................... : 294 Ck-VN-TG-0 : .......................................................... : 294 Ck-VN-5-03 : .........................................................- : 293 Ck-VN-30-0 : .......................................................... : 294 Dk-VN-11-0 : .......................................................... : 294 Ck-VN-1-04 : .......................................................... : 294 Ck-VN-NCVD : .......................................................... : 294 Ck-VN-LS-2 : .......................................................... : 294 Ck-VN-NB-2 : .......................................................... : 294 MDk-VN-145 : .......................................................... : 294 Dk-VN-50-0 : ...............A.......................................... : 294 Ck-VN-NCVD : ...............A.....................................----- : 289 Dk-VN-17A- : ...............A...................----------------------- : 271 Dk-VN-36ST : ...............A.......................................... : 294 Ck-VN-NCVD : ...........................C....................G......... : 294 Dk-Hubei-w : .......................................................... : 294 Ck-Guangxi : ........A.............................................TA.. : 294 Thailand-N : ............................A...................G......--- : 291 Dk-Guangxi : .......................................................... : 294 Ck-Hubei-2 : ........A................................................. : 294 Ck-Hunan-8 : .......................................................... : 294 Dk-Hubei-4 : ......................................C.........GC........ : 294

b. Amino acid

* 20 * 40 * 60 * 80 * Ck-VN-HG4- : MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPIVVAANIIGILHLILWIFDRLFFKCIYRRLKYGLKRGPATAGVPESMREEYRQEQQSAVDVDDGHFVNIELE* : 97 Dk-HG-07-1 : ..........................................L......................................................- : 97 VN-HG-207- : ..........................................L...........I..........................................- : 97 VN-HG-178- : ..........................................L......................................................- : 97 Dk-VN-1771 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-CT-0 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-TG-0 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-5-03 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-30-0 : ..........................................L......................................................- : 97 Dk-VN-11-0 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-1-04 : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-NCVD : ..........................................L......................................................- : 97 Ck-VN-LS-2 : .........................L....S...........L....................S.................................- : 97 Ck-VN-NB-2 : .........................L....S...........L....................S.E...............................- : 97 MDk-VN-145 : .........................L....S...........L....................S.E...............................- : 97 Dk-VN-50-0 : .........................L....S...........L....................S.E...............................- : 97 Ck-VN-NCVD : ..........................................L........................I............................-- : 96 Dk-VN-17A- : ..........................................L..............D.........I......................-------- : 90 Dk-VN-36ST : ..........................................L..............D.........I.............................- : 97 Ck-VN-NCVD : .........................L................L.H..................S.................................- : 97 Dk-Hubei-w : .........................L....S...........L....................S.................................- : 97 Ck-Guangxi : .........................LI...S...........L....................S.E...............N..............DK : 98 Thailand-N : ..........................................L.............................................S........- : 97 Dk-Guangxi : .........................L....S...........L....................S.E...............................- : 97 Ck-Hubei-2 : .........................L....S...........L....................S.E...............N...............- : 97 Ck-Hunan-8 : .........H...............L....S...........L....................S.E...............................- : 97 Dk-Hubei-4 : ............TG...K.......L................L..............D.....S.G.........................A.....- : 97

D. GEN NS1 a. Nucleotide (rút gọn)

* 20 * 40 * 60 * 80

100 *

Ck-VN-HG4- : ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGATTTGCAGACCAAGAACTGGGTGATGCCCCATTCCTTGACCGGCTTCGCCGAGATC : 118 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-1771 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-34-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-5-03 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-30-0 : ...................................................................................................................... : 118 VN-1203-04 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-11-0 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 118 VN-CL2009- : ...................................................................................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...A.................................................................................................................. : 118 Dk-VN-LS-2 : ........T.....................................................................A....................................... : 118 Ck-VN-NB-2 : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-HaiP : ...................................................................................................................... : 118 MDk-VN-145 : .........................................C............................................................................ : 118 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-17A- : ...................................................................................................................... : 118 Dk-VN-36ST : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Shantou : ...................................................................................................................... : 118 Ck-HK-409. : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Guangxi : ...................................................................................................................... : 118 Ck-Hubei-2 : ...........................................................G.......................................................... : 118 Ck-TL-CU-3 : ...................................................................................................................... : 118 Ck-India-0 : ..............A....................................................................................................... : 118

* 420 * 440 * 460 *

360 * 380 * 400 Ck-VN-HG4- : ATGGATAAAACCATCATATTGAAAGCAAACTTCAGTGTGGCTTTTGACCGGTTGGAAACCCTAATACTACTTAGAGCTTTCACAGAAGGAGGAGCAATCGTGGGAGAAATCTCACCAT : 472 Ck-VN-29-0 : ...........T...........................A..................A..............................G............................ : 472 Dk-HG-07-1 : ...........T...........................A..................A..............................G............................ : 472 Dk-VN-1771 : .......................................A..................A..............................G............................ : 472 Ck-VN-CT-0 : .......................................A.............................................................................. : 472 Dk-VN-34-0 : .......................................A..................A..............................G............................ : 472 Ck-VN-5-03 : .......................................AT...............................................A............................. : 472 Ck-VN-30-0 : .......................................AT...............................................A............................. : 472 VN-1203-04 : .......................................AT...............................................A............................. : 472 Ck-VN-36-0 : .......................................A.............................................................................. : 472 Dk-VN-11-0 : .......................................AT...A...........................................A............................. : 472 Ck-VN-TG-0 : .......................................A............................................A................................. : 472 VN-CL2009- : .......................................A.............................................................................. : 472 Ck-VN-NCVD : .......................................A..................A..............................G............................ : 472 Dk-VN-LS-2 : .....C....A.....C......................AT............A.................C................AG..........................G. : 472 Ck-VN-NB-2 : .......................................AT............A..............G...................A............................. : 472 Dk-VN-HaiP : .......................................AT............A..............G...................A............................. : 472 MDk-VN-145 : .....C....A.....C....................................A.................C................A...........................G. : 472 Ck-VN-NCVD : .......................................A..................A..............................G............................ : 472 Dk-VN-17A- : .......................................A..................A..............................G............................ : 472 Dk-VN-36ST : .......................................A..................A..............................G....Y.G..................... : 472 Ck-Shantou : ..........A............................AT...............................................A...........................G. : 472 Ck-HK-409. : .......................................AT............A..................................A............................. : 472 Ck-Guangxi : .......................................AT..A.........A..G...............................A............................. : 472 Ck-Hubei-2 : .......................................AT............A..............G...............A...A............................. : 472 Ck-TL-CU-3 : .........GT............................AT...............................................A............................. : 472 Ck-India-0 : .......................................AT..A.........A..G...............................A..................G.......... : 472

600 * 620 * 640 * 660 * Ck-VN-HG4- : TTGGAGAAGCAGTGATGAGGATGGGAGACTTCCACTCCCTCCAAATCAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTGAGTCAGAAGTTTGA : 678 Ck-VN-29-0 : ....G........................................C.....C.................................... : 678 Dk-HG-07-1 : ....G........................................C.....C.................................... : 678 Dk-VN-1771 : ....G........................................C.....C.................................... : 678 Ck-VN-CT-0 : ........................................................................................ : 678 Dk-VN-34-0 : ....G...............T..............................C.................................... : 678 Ck-VN-5-03 : .......................................................................................G : 678 Ck-VN-30-0 : ........................................................................................ : 678 VN-1203-04 : ........A..............................................T................................ : 678 Ck-VN-36-0 : ........................................................................................ : 678 Dk-VN-11-0 : ........................................................................................ : 678 Ck-VN-TG-0 : ........................................................................................ : 678 VN-CL2009- : ........................................................................................ : 678 Ck-VN-NCVD : ...................................................C.................................... : 678 Dk-VN-LS-2 : ................A...........TC..........T....C.................................T........ : 678 Ck-VN-NB-2 : ........................................................................................ : 678 Dk-VN-HaiP : ........................................................................................ : 678 MDk-VN-145 : ...................A.........C..........T....C.................................T........ : 678 Ck-VN-NCVD : ....G..............................................C.................................... : 678 Dk-VN-17A- : ....G...............T..............................C.................................... : 678 Dk-VN-36ST : ....G...............T..............................C.................................... : 678 Ck-Shantou : .............................C.......................................................... : 678 Ck-HK-409. : ...............................................................................A........ : 678 Ck-Guangxi : ...........................................G...................................A........ : 678 Ck-Hubei-2 : ......................................T................................................. : 678 Ck-TL-CU-3 : ................................................A....................................... : 678 Ck-India-0 : ..........GT...............................G.C.................................A........ : 678

b. Amino acid (rút gọn)

100 * 1

* 20 * 40 * 60 * 80 * Ck-VN-HG4- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIEAATRAGKQIVERILEEESDKALKMPVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIKMDQAI : 118 Ck-VN-29-0 : .......................................................T.............................................................V : 118 Dk-HG-07-1 : .......................................................T.............................................................V : 118 Dk-VN-1771 : .......................................................T.............K................................................ : 118 Ck-VN-CT-0 : .......................................................T........................A..................................... : 118 Dk-VN-34-0 : .......................................................T.............................................................. : 118 Ck-VN-5-03 : .......................................................T........................A..................................... : 118 Ck-VN-30-0 : .......................................................T........................A..................................... : 118 VN-1203-04 : .......................................................T..............G.........A..................................... : 118 Ck-VN-36-0 : .......................................................T........................A..................................... : 118 Dk-VN-11-0 : .......................................................T...............K........A..................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : .......................................................T........................A..................................... : 118 VN-CL2009- : .......................................................T........................A.C................................... : 118 Ck-VN-NCVD : .N.....................................................T.............................................................. : 118 Dk-VN-LS-2 : ..........................M...........................KT..................E.....A.............................S....... : 118 Ck-VN-NB-2 : .......................................................T..................E.....T..................................... : 118 Dk-VN-HaiP : .......................................................T..................E.....T........................A............ : 118 MDk-VN-145 : .......................................................T..................E.....A.............................S....... : 118 Ck-VN-NCVD : .......................................................T.............................................................. : 118 Dk-VN-17A- : .......................................................T.............................................................. : 118 Dk-VN-36ST : .......................................................T.............................................................. : 118 Ck-Shantou : .......................................................T..................E.....A.............................Y....... : 118 Ck-HK-409. : .......................................................T..................E.....A..................................... : 118 Ck-Guangxi : .......................................................T..................E.....A..................................... : 118 Ck-Hubei-2 : .......................................................T..................E.....A..................................... : 118 Ck-TL-CU-3 : .......................................................T........................A..................................... : 118 Ck-India-0 : ...............................................S.......T..................E.....A.........................T........... : 118

20 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 Ck-VN-HG4- : MDKTIILKANFSVAFDRLETLILLRAFTEGGAIVGEISPLPSLPGHTGEDVKIAIGVLIGGLEWNDNTVRVTETIQRFAWRSSDEDGRLPLPPNQKRKMARTIESEV* : 225 Ck-VN-29-0 : .............T.....N................................N..DI............Q..........G..............N...........- : 225 Dk-HG-07-1 : .............T.....N................................N..DI............Q..........G..............N...........- : 225 Dk-VN-1771 : .............T.....N................................N...I............Q..........G..............N...........- : 225 Ck-VN-CT-0 : .............T......................................N......................................................- : 225 Dk-VN-34-0 : .............T.....N................................N...I............Q..........G....V.........N...........- : 225 Ck-VN-5-03 : .............I...............E......................N......................................................W : 226 Ck-VN-30-0 : .............I...............E......................N......................................................- : 225 VN-1203-04 : .............I...............E......................N............................N...............-.........- : 224 Ck-VN-36-0 : .............T......................................N......................................................- : 225 Dk-VN-11-0 : .............IL..............E......................N......................................................- : 225 Ck-VN-TG-0 : .............T..............K.......................N......................................................- : 225 VN-CL2009- : .............T......................................N......................................................- : 225 Ck-VN-NCVD : .............T.....N....................................I......................................N...........- : 225 Dk-VN-LS-2 : ...N.T.......I...............E.................D....N..................S..L.........K...S...S............-.- : 224 Ck-VN-NB-2 : .............I...............E......................N..................S...................................- : 225 Dk-VN-HaiP : .............I...............E......................N..................S...................................- : 225 MDk-VN-145 : ...N.T.......................E.................D....N..................S.AL..........N..P...S............-.- : 224 Ck-VN-NCVD : .............T.....N................................N...I............Q..........G..............N...........- : 225 Dk-VN-17A- : .............T.....N................................N...I............Q..........G....V.........N...........- : 225 Dk-VN-36ST : .............T.....N...........-V...................N...I............Q..........G....V.........N...........- : 224 Ck-Shantou : ...N.........I...............E.................D....N..................S................P..................- : 225 Ck-HK-409. : .............I...............E.................D....N..................S.................................K.- : 225 Ck-Guangxi : .............IY..............E.................D....N..................S.I...................D...........K.- : 225 Ck-Hubei-2 : .............I..............KE......................N........F.........S.....Y.............L...............- : 225 Ck-TL-CU-3 : ...V.........I...............E......................N......................................................- : 225 Ck-India-0 : .............IY..............E.................N....N..................S.I........V..........D...........K.- : 225

E. GEN NS2 a. Nucleotide (rút gọn)

* 100 *

* 20 * 40 * 60 * 80 Ck-VN-HG4- : ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGACATACTGGTGAGGATGTCAAAATTGCAATTGGCGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCACTGAAAC : 118 Ck-VN-29-0 : ......................................................A........A.A.......................................A............ : 118 Dk-HG-07-1 : ......................................................A........A.A.......................................A............ : 118 Dk-VN-1771 : ......................................................A..........A.......................................A............ : 118 Ck-VN-CT-0 : ......................................................A............................................................... : 118 Dk-VN-34-0 : ......................................................A..........A.......................................A............ : 118 Ck-VN-5-03 : ......................................................A............................................................... : 118 Ck-VN-30-0 : ......................................................A............................................................... : 118 VN-1203-04 : ......................................................A............................................................... : 118 Ck-VN-36-0 : ......................................................A............................................................... : 118 Dk-VN-11-0 : ......................................................A............................................................... : 118 Ck-VN-TG-0 : ......................................................A............................................................... : 118 VN-CL2009- : ......................................................A............................................................... : 118 Ck-VN-NCVD : ...A.............................................................A.................................................... : 118 Dk-VN-LS-2 : ........T..............................A..............A.........G..A................................G.........T....... : 118 Ck-VN-NB-2 : ......................................................A...................................................G...T....... : 118 Dk-VN-HaiP : ......................................................A...................................................G...T....... : 118 MDk-VN-145 : .......................................A..............A.........G..A................................G.........T.....G. : 118 Ck-VN-NCVD : ......................................................A..........A.......................................A............ : 118 Dk-VN-17A- : ......................................................A..........A.......................................A............ : 118 Dk-VN-36ST : ......................................................A.........AA.......................................A............ : 118 Ck-Shantou : .......................................A..............A.........G.............................................T....... : 118 Ck-HK-409. : .......................................A..............A.......................................................T....... : 118 Ck-Guangxi : .......................................A..............A.......................................................T......T : 118 Ck-Hubei-2 : ......................................................A.........................T.........................G...T....... : 118 Ck-TL-CU-3 : ......................................................A............................................................G.. : 118 Ck-India-0 : ..............A.......................AA..............A.....................G.................................T......T : 118

240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 Ck-VN-HG4- : GATTGAAGAAGTAAGACATAGATTGAAAATTACAGAAAACAGCTTCGAACAGATAACGTTTATGCAAGCCTTACAACTACTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACCTTCTCGTTT : 354 Ck-VN-29-0 : ...................................................................................................................... : 354 Dk-HG-07-1 : ...................................................................................................................... : 354 Dk-VN-1771 : A..................................................................................................................... : 354 Ck-VN-CT-0 : ...................................................................................................................... : 354 Dk-VN-34-0 : ...................................................................................................................... : 354 Ck-VN-5-03 : ..........................................................................................................G..--------- : 345 Ck-VN-30-0 : ......................................................................................G......................--------- : 345 VN-1203-04 : ..........................................................................................................G........... : 354 Ck-VN-36-0 : ...................................................................................................................... : 354 Dk-VN-11-0 : ..........................................................................................................G........... : 354 Ck-VN-TG-0 : ...................................................................................................................... : 354 VN-CL2009- : ..........T........................................A.................................................................. : 354 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 354 Dk-VN-LS-2 : .............C.......................................................T..G.............................G............... : 354 Ck-VN-NB-2 : .............C............................................................................................G........... : 354 Dk-VN-HaiP : .............C............................................................................................G........... : 354 MDk-VN-145 : .............C.......................................................T..G.............................G............... : 354 Ck-VN-NCVD : ...................................................................................................................... : 354 Dk-VN-17A- : ...............................................................................................................------- : 347 Dk-VN-36ST : ...................................................................................................................... : 354 Ck-Shantou : .............C..........................................................G............................................. : 354 Ck-HK-409. : .............C............................................................................................G........... : 354 Ck-Guangxi : ..........A..C........................................................................................................ : 354 Ck-Hubei-2 : .............C............................................................................................G........... : 354 Ck-TL-CU-3 : ..........................................................................................................G........... : 354 Ck-India-0 : ..........A..C........................................................................................................ : 354

b. Amino acid

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120

Ck-VN-HG4- : MDSNTVSSFQDILVRMSKLQLASSSEDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDFHSLQIRNGKWREQLSQKFEEIRWLIEEVRHRLKITENSFEQITFMQALQLLLEVEQEIRTFSFQLI : 121 Ck-VN-29-0 : ..................M..T.............K.......................T.T........................................................... : 121 Dk-HG-07-1 : ..................M..T.............K.......................T.T........................................................... : 121 Dk-VN-1771 : ..................M................K.......................T.T........................................................... : 121 Ck-VN-CT-0 : ..................M...................................................................................................... : 121 Dk-VN-34-0 : ..................M................K...............L.........T........................................................... : 121 Ck-VN-5-03 : ..................M......................................................G........................................A------ : 115 Ck-VN-30-0 : ..................M........................................................................................G.......------ : 115 VN-1203-04 : ..................M............................T..................................................................A...... : 121 Ck-VN-36-0 : ..................M...................................................................................................... : 121 Dk-VN-11-0 : ..................M...............................................................................................A...... : 121 Ck-VN-TG-0 : ..................M...................................................................................................... : 121 VN-CL2009- : ..................M...............................................................L...................................... : 121 Ck-VN-NCVD : .N...........................................................T........................................................... : 121 Dk-VN-LS-2 : .............M....M..GY..........R...............I....L....T..........H.........................................M........ : 121 Ck-VN-NB-2 : ..................M................G..............................................................................A...... : 121 Dk-VN-HaiP : ..................M................G..............................................................................A...... : 121 MDk-VN-145 : .............M....M..GY..........R....................L....T..........H.........................................M........ : 121 Ck-VN-NCVD : ..................M................K.........................T........................................................... : 121 Dk-VN-17A- : ..................M................K...............L.........T.....................................................------ : 115 Dk-VN-36ST : ..................M..E.............K...............L.........T........................................................... : 121 Ck-Shantou : .............M....M..G................................L.................................................................. : 121 Ck-HK-409. : .............M....M...............................................................................................A...... : 121 Ck-Guangxi : .............M....M...............................................................I...................................... : 121 Ck-Hubei-2 : ..................M................G.......T.............F........................................................A...... : 121 Ck-TL-CU-3 : ..................M...................R.....................K.....................................................A...... : 121 Ck-India-0 : .............M....M......G......................L..........T..................M...I...................................... : 121

Phụ lục 9: TỶ LỆ (%) ĐỒNG NHẤT VỀ THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ TƯỜNG ĐỒNG VỀ AMINO ACID GIỮA CHỦNG CKHG4 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI (Trên đường chéo là tỷ lệ đồng nhất về nucleotide, dưới đường chéo là tỷ lệ đồng nhất về amino acid)

A. GEN PB2

1 2 97

3 98 99

4 97 98 97

5 99 98 98 97

6 99 98 98 97 99

7 97 97 96 99 97 97

8 99 98 98 97 99 99 97

9 98 97 98 96 99 99 96 99

10 97 96 96 95 97 97 95 97 97

11 96 95 96 94 96 96 94 96 96 98

12 99 97 98 97 99 99 96 99 98 97 96

13 99 98 99 97 99 99 97 99 98 97 96 99

14 97 96 96 95 97 97 95 97 97 99 98 97 97

15 90 90 89 91 90 90 91 90 90 89 90 90 90 89

16 98 97 98 96 98 98 96 98 97 96 95 98 98 96 89

17 98 98 98 96 98 98 96 98 98 96 95 98 98 96 89 99

18 95 96 95 95 96 96 95 95 95 97 96 95 95 97 89 95 95

19 93 92 93 91 94 94 91 94 93 93 93 93 93 93 90 93 93 91

20 97 95 96 95 97 97 95 97 97 97 96 97 97 97 89 96 96 95 93

21 97 96 96 95 97 97 95 97 97 98 97 97 97 98 89 96 96 97 93 97

22 97 95 96 94 97 97 95 97 96 99 97 96 96 99 89 96 96 97 93 96 98

23 97 95 96 94 97 97 94 97 96 96 95 97 96 96 89 96 96 94 93 97 96 95

24 97 95 96 94 97 97 94 97 96 99 97 96 96 99 89 96 96 97 92 96 98 98 95

25 96 94 95 93 96 96 93 96 96 98 96 95 95 98 89 95 95 96 92 95 96 97 94 97

26 97 95 96 94 97 97 94 97 97 96 95 96 96 96 89 96 96 94 92 96 96 96 96 96 95

27 93 92 93 91 93 94 91 94 93 93 93 93 93 93 90 93 93 91 99 93 93 92 92 92 92 92

98 98 97 99 99 96 99 99 98 98 99 98 98 96 98 98 97 97 97 98 98 98 98 98 97 98

99 98 98 98 98 98 98 97 97 98 98 97 96 98 98 97 97 96 97 97 97 97 97 96 97

97 99 99 97 99 98 98 98 98 99 98 95 99 99 96 97 97 97 97 98 98 97 97 97

97 97 99 97 97 96 96 97 97 96 98 97 97 96 95 95 96 96 96 96 96 95 96

99 97 99 99 98 98 99 99 98 96 99 98 97 98 97 98 98 98 98 98 97 98

97 100 99 99 99 99 99 99 96 99 99 97 98 98 98 98 98 98 98 97 98

97 96 96 96 97 97 96 97 97 97 96 95 95 95 95 96 96 95 95 95

99 99 99 99 99 99 96 99 99 97 98 98 98 98 98 98 98 97 98

98 98 99 98 98 96 98 98 97 98 97 98 98 98 98 98 97 98

100 98 98 100 96 98 98 98 98 97 99 99 98 99 99 98 98

98 98 100 96 98 98 98 98 97 99 99 98 99 99 98 98

98 98 96 99 98 97 97 97 98 98 98 98 97 97 97

98 95 99 99 96 97 97 97 97 98 98 97 97 97

96 98 98 98 98 97 99 99 98 99 99 98 98

96 96 96 96 95 96 96 96 96 95 95 96

99 96 97 97 97 97 98 98 97 97 97

96 97 97 97 97 98 97 97 96 97

96 96 97 97 97 98 97 96 96

96 97 97 98 98 97 96 98

97 97 98 97 97 96 97

98 98 99 98 97 97

98 99 99 97 97

98 98 97 97

99 97 98

97 97

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.9, 1-5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới.

B. GEN PB1

2 97

3 98 99

4 99 97 98

5 99 98 98 99

6 98 98 98 99 99

7 99 98 98 99 99 99

8 99 98 98 99 99 99 99

9 99 98 98 99 99 99 99 99

10 99 98 98 99 99 99 99 99 99

11 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97

12 97 97 97 97 98 97 98 98 98 98 99

13 98 98 98 98 99 99 99 99 99 99 97 97

14 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97 98 98 97

15 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97 98 98 97 97

16 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97 96 97 96 97 96

17 98 98 99 98 98 99 98 98 98 98 96 97 98 96 96 96

18 98 97 97 98 98 98 98 98 98 98 97 98 98 97 97 97 97

19 98 97 97 98 98 98 98 98 98 98 97 98 97 97 97 97 97 98

20 97 97 97 97 98 97 98 98 98 98 98 98 97 97 97 97 97 98 98

21 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97 96 97 97 98 96 98 96 97 97 97

22 94 94 94 95 95 94 95 95 95 95 94 94 94 95 94 96 94 95 95 95 96

23 96 95 96 96 97 96 97 97 97 97 96 96 96 97 96 98 96 97 97 96 98 96

24 97 96 96 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 96 98 96 97 97 97 98 96 98

25 96 96 96 96 97 96 97 97 97 97 96 96 96 97 96 98 96 97 97 96 98 96 98 98

26 97 96 96 97 97 97 98 97 97 97 96 96 97 96 96 95 97 96 96 96 96 93 95 96 95

27 91 90 90 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 90 90 91 92 91 91 88 90 91 91 90

98 98 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 98 98 98 99 99 99 99 99 97 98 98 98 98 97

99 99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 98 98 98 99 99 98 99 99 97 98 98 98 98 97

99 99 99 99 99 99 99 98 99 99 98 98 99 99 99 99 99 99 97 98 98 98 98 97

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 97 98 99 99 99 98

99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 97 98 99 99 99 98

99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 97 98 99 99 99 98

100 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 100 99 97 99 99 99 99 98

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 100 99 97 99 99 99 99 98

99 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 97 98 99 99 99 98

99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 97 98 99 99 99 98

99 98 99 98 98 99 99 99 99 99 97 98 98 98 98 97

98 99 98 98 99 99 99 99 99 97 98 98 98 98 97

98 98 98 99 99 99 99 98 96 98 98 98 98 97

98 98 98 98 98 99 99 97 98 98 98 98 97

98 98 98 98 99 98 96 98 98 98 98 97

99 99 99 99 99 97 98 99 99 98 97

99 99 99 99 97 98 98 98 98 98

99 99 99 97 98 98 98 98 98

99 99 97 98 98 98 98 98

99 97 99 99 99 99 98

97 99 99 99 98 97

97 97 97 96 95

98 98 98 97

98 98 97

98 97

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.12; 1-17 là các chủng phân lập tại Việt Nam; 18-27 là các chủng của thế giới; 1-6 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 11, 14, 15, 16 là các chủng miền Bắc.

C. GEN PB1-F2

2 99

3 99 100

4 100 99 99

5 99 99 99 99

6 99 100 100 99 99

7 99 99 99 99 100 99

8 99 99 99 99 99 99 99

9 99 99 99 99 99 99 99 99

10 99 99 99 99 100 99 100 99 99

11 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97

12 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98

13 98 99 99 98 99 99 99 98 98 99 96 97

14 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 100 98 96

15 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98 98 96 98

16 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 96 96 98 96 96

17 99 99 99 99 99 99 99 98 98 99 96 97 99 96 96 98

18 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 97 97 98 97 97 98 98

19 98 98 98 98 99 98 99 98 98 99 96 97 98 96 96 98 98 99

20 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 96 96 98 96 96 97 98 98 98

21 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 97 97 98 97 97 99 98 99 98 98

22 98 98 98 98 99 98 99 98 98 99 96 97 98 96 96 98 98 98 98 98 99

23 97 97 97 97 98 97 98 97 97 98 95 95 97 95 96 97 97 97 97 97 98 98

24 98 98 98 98 99 98 99 98 98 99 96 97 98 96 96 98 98 98 98 98 98 98 97

25 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 95 96 98 95 95 98 98 98 97 97 98 98 97 97

26 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 94 95 96 94 94 96 96 97 96 97 97 96 96 96 95

27 90 91 91 90 91 91 91 90 91 91 88 89 91 88 89 90 91 90 90 90 90 90 90 90 91 89

97 97 100 98 97 98 97 97 98 93 94 97 93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 94 91 75

100 97 98 100 98 97 97 98 93 94 100 93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 96 91 77

97 98 100 98 97 97 98 93 94 100 93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 96 91 77

98 97 98 97 97 98 93 94 97 93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 94 91 75

98 100 98 98 100 94 95 98 94 94 96 97 98 97 96 98 97 95 97 95 92 76

98 97 97 98 93 94 100 93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 96 91 77

98 98 100 94 95 98 94 94 96 97 98 97 96 98 97 95 97 95 92 76

97 98 93 94 97 93 93 95 96 97 96 95 97 96 94 96 94 91 75

98 93 94 97 93 93 95 96 97 96 95 97 96 94 96 94 91 77

94 95 98 94 94 96 97 98 97 96 98 97 95 97 95 92 76

98 93 100 97 91 92 93 92 91 93 92 90 92 90 86 71

94 98 98 92 93 94 93 92 94 93 91 93 91 87 72

93 93 95 98 97 96 95 97 96 94 96 96 91 77

97 91 92 93 92 91 93 92 90 92 90 86 71

91 92 93 93 91 93 92 92 92 90 86 73

94 95 94 93 97 96 94 96 94 88 74

96 95 94 96 95 93 95 95 90 76

98 95 97 96 94 96 94 91 75

94 96 95 93 95 93 90 74

95 94 92 94 92 91 74

98 96 96 96 91 75

95 95 95 90 74

93 93 90 74

93 90 74

87 76

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

D. GEN PA

2 98

3 99 98

4 99 99 99

5 99 99 99 99

6 99 99 99 99 100

7 99 98 99 99 99 99

8 99 98 99 99 99 99 99

9 99 99 99 99 99 99 99 99

10 98 99 98 99 99 99 99 98 99

11 98 99 98 99 98 98 98 98 99 99

12 98 99 98 99 99 99 99 98 99 99 99

13 97 97 97 98 98 98 98 98 98 97 97 97

14 97 97 97 98 97 97 97 97 97 97 97 97 99

15 93 92 93 93 93 93 93 93 93 92 92 92 93 93

16 95 94 95 95 95 95 95 95 95 94 94 95 95 96 96

17 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98 98 92 95

18 92 92 92 93 93 93 92 93 92 92 92 92 92 92 99 95 92

19 90 90 91 91 91 91 91 91 90 90 90 90 90 90 92 91 90 91

20 97 97 98 98 98 98 98 98 98 97 97 97 98 98 93 95 97 92 90

21 97 97 97 98 98 98 97 98 97 97 97 97 98 97 92 94 97 92 90 98

22 97 96 97 97 97 97 97 97 97 97 96 97 97 97 92 94 97 92 90 97 97

23 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 98 95 92 98 91 92 92 91

24 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 96 97 97 97 92 94 97 92 90 98 97 99 91

25 92 91 92 92 92 92 92 92 92 92 91 92 92 92 98 95 92 97 91 92 91 91 97 91

26 93 92 93 93 93 93 93 93 93 92 92 92 93 93 95 94 93 95 91 93 92 92 95 93 95

27 90 90 91 91 91 91 91 91 91 90 90 90 90 90 92 91 90 91 99 90 90 90 91 90 91 92

99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 98 97 98 98 96 97 98 97 98 96 98 96 97 97

99 99 99 99 99 99 99 100 99 99 98 98 97 98 98 97 97 99 98 98 97 98 97 98 97

99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 98 97 98 98 97 97 98 98 98 96 98 97 98 97

100 100 100 99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 97 98 99 98 98 97 99 97 98 97

100 100 99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 97 98 99 98 98 97 99 97 98 97

100 99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 97 98 99 98 98 97 99 97 98 97

99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 97 98 99 98 98 97 99 97 98 97

99 99 99 99 98 98 97 98 98 97 97 99 98 98 97 98 97 98 97

99 99 99 98 98 97 98 98 97 98 99 98 98 97 98 97 98 97

99 99 98 98 97 98 98 97 97 99 98 98 97 98 97 98 97

99 98 98 97 98 98 97 97 98 98 98 96 98 97 98 97

98 98 97 98 98 97 98 99 98 98 97 98 97 98 97

99 97 98 99 96 97 98 97 98 96 98 96 97 96

97 98 98 96 97 98 97 98 96 98 96 97 97

98 97 99 98 97 96 97 99 97 98 98 98

97 98 98 98 97 97 98 98 97 98 97

96 97 98 97 98 96 98 96 97 96

97 96 96 96 98 96 98 98 97

97 96 97 97 97 97 98 99

98 98 96 98 96 97 97

97 95 97 96 97 96

96 99 96 97 96

96 97 97 97

96 97 96

98 97

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.16; 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam; 19-27 là các chủng của thế giới; 1-5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 14-18 là các chủng miền Bắc.

E. GEN NP

2 96

3 98 97

4 99 96 99

5 99 96 99 99

6 98 97 98 98 98

7 99 96 99 99 99 98

8 98 97 98 98 98 98 98

9 99 96 99 99 99 98 99 98

10 98 95 97 97 98 97 98 96 98

11 98 95 98 98 98 97 98 97 98 98

12 98 95 97 98 98 97 98 97 98 98 99

13 99 96 99 99 99 98 99 98 99 98 98 98

14 98 95 97 98 98 97 98 97 98 98 99 99 98

15 96 95 96 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97

16 96 95 96 97 97 97 97 97 97 97 98 97 96 98 98

17 98 96 99 98 99 98 99 98 99 97 97 97 99 97 96 96

18 98 96 99 98 98 98 98 97 98 97 97 97 98 97 96 96 99

19 98 96 99 98 98 98 98 97 98 97 97 97 98 97 96 96 99 99

20 92 90 92 92 92 92 93 91 93 93 92 92 92 92 92 91 92 92 92

21 97 94 97 97 98 96 98 96 98 97 98 98 97 98 96 96 97 97 97 92

22 96 95 96 97 97 97 97 97 97 96 97 97 97 97 97 97 96 96 96 91 96

23 97 95 97 97 97 97 97 97 97 98 98 98 97 99 97 98 97 96 96 92 97 97

24 96 96 96 96 97 97 97 98 97 97 98 97 96 98 98 99 96 96 96 91 96 97 98

25 96 94 96 97 96 95 97 95 97 96 97 97 96 97 96 96 96 96 96 92 97 96 96 96

26 96 94 96 96 97 95 97 95 97 97 97 97 97 98 96 96 96 96 96 91 96 95 97 96 96

27 97 95 97 98 98 96 98 97 98 97 98 98 97 98 96 96 97 97 97 93 97 96 97 96 96 96

96 99 99 99 98 99 98 99 99 99 99 99 99 98 98 99 98 98 98 99 98 99 98 98 99 99

97 97 96 98 97 98 97 97 96 96 97 96 97 97 97 97 96 95 96 97 96 98 96 96 96

99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 98 98 100 99 99 98 99 98 98 98 98 99 99

99 98 100 98 100 99 99 99 99 99 98 98 99 99 98 98 99 98 99 98 98 99 99

98 99 98 99 99 99 99 99 99 98 98 99 98 98 98 99 98 99 98 98 99 99

98 98 98 99 98 98 99 98 98 99 99 98 98 97 98 99 98 99 97 98 98

98 100 99 99 99 99 99 98 98 99 99 98 98 99 98 99 98 98 99 99

98 98 98 98 98 98 98 99 98 97 97 97 98 98 98 99 97 98 98

99 99 99 99 99 98 98 99 99 98 98 99 98 99 98 98 99 99

99 99 100 99 98 98 99 99 99 98 99 98 99 98 98 99 99

99 99 100 98 98 99 98 98 98 99 98 99 98 98 99 99

99 99 98 98 99 98 98 98 99 98 99 98 98 99 99

99 98 98 99 99 99 98 99 98 99 98 98 99 99

98 98 99 98 98 98 99 98 99 98 98 99 99

98 98 97 97 97 98 98 98 98 97 98 98

98 98 97 97 98 99 98 99 97 98 98

99 99 98 99 98 98 98 98 99 99

99 97 98 98 98 98 98 98 98

97 98 97 98 97 97 98 98

98 97 97 97 97 98 98

98 99 98 98 99 99

98 99 97 98 98

98 98 98 99

97 98 98

98 98

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.19; 1-19 là các chủng phân lập tại Việt Nam; 20-27 là các chủng của thế giới; 1-6 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 10, 11, 14, 15, 16 là các chủng miền Bắc.

F. GEN M1

2 98

3 99 98

4 99 99 99

5 99 99 99 99

6 99 99 99 99 99

7 99 99 99 99 99 100

8 99 99 99 99 99 99 99

9 99 98 99 99 99 99 99 99

10 99 99 99 99 99 99 99 99 99

11 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

12 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

13 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98

14 98 98 98 98 98 99 99 99 98 99 99 99 98

15 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 98

16 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 98

17 98 99 98 98 99 99 99 98 98 98 98 99 97 98 97 98

18 98 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98 97 98 97 97 99

19 98 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98 97 98 97 98 99 99

20 96 96 96 97 96 97 97 97 97 97 97 97 96 96 96 96 96 96 96

21 98 98 98 99 98 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 98 98 98 98 97

22 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 97 98 97 97 97 97 97 96 98

23 98 98 98 99 98 99 99 99 99 99 99 99 98 98 98 98 98 98 98 96 98 97

24 98 98 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 99 98 98 98 96 99 98 98

25 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 98 98 97 97 97 96 98 98 98 99

26 97 97 97 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 97 98 97 97 97 96 98 97 97 98 98

27 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 95 95 95 94 96 96 96 96 96 95

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 99 99 99 99 96

100 100 100 100 100 99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 100 100 100 99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 100 100 99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 100 99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

99 99 100 100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 99 99 99 99 96

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 98 99 99 99 99 96

100 100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

99 99 99 99 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

100 100 100 99 99 99 98 100 99 99 100 100 100 97

100 100 99 99 99 98 100 99 99 100 100 100 97

100 99 99 99 98 100 99 99 100 100 100 97

99 99 99 98 100 99 99 100 100 100 97

99 100 99 99 99 99 99 99 99 97

99 98 99 98 99 99 99 99 97

99 99 99 99 99 99 99 97

98 98 98 98 98 98 96

99 99 100 100 100 97

98 99 99 99 97

99 99 99 96

100 100 97

100 97

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.21; 1-20 là các chủng phân lập tại Việt Nam; 21-27 là các chủng của thế giới; 1-6 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 13-16 và 20 là các chủng miền Bắc.

G. GEN M2

2 99

3 99 99

4 99 99 99

5 99 100 99 99

6 99 99 99 100 99

7 99 99 99 100 99 100

8 99 99 99 99 99 99 99

9 99 99 99 100 99 100 100 99

10 99 99 99 100 99 100 100 99 100

11 99 99 99 100 99 100 100 99 100 100

12 99 99 99 100 99 100 100 99 100 100 100

13 98 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98

14 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99

15 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 100

16 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98 99 99

17 96 97 96 97 97 97 97 97 97 97 97 97 96 95 95 95

18 90 91 90 90 91 90 90 91 90 90 90 90 90 89 89 89 93

19 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 97 97 97 97 97 92

20 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 96 94 88 96

21 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 99 99 98 96 89 97 97

22 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 97 97 97 97 94 88 95 95 97

23 97 97 97 98 97 98 98 98 98 98 98 98 96 96 96 96 97 91 96 96 97 95

24 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 100 100 99 95 89 97 97 99 97 96

25 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98 98 98 98 94 88 96 97 98 97 95 98

26 97 97 97 98 97 98 98 97 98 98 98 98 98 99 99 98 95 89 96 97 99 97 96 99 98

27 94 94 94 95 94 95 95 94 95 95 95 95 95 95 95 94 92 87 94 95 95 94 94 95 94 95

98 97 98 98 98 98 98 98 98 98 98 95 94 94 94 96 89 96 95 95 90 97 94 93 93 90

98 100 100 100 100 100 100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

98 98 98 98 98 98 98 98 98 95 94 94 94 96 89 96 95 95 90 97 94 93 93 90

100 100 100 100 100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 100 100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

100 96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

96 95 95 95 97 90 97 96 96 91 98 95 94 94 91

98 98 98 94 87 94 97 100 94 95 98 97 97 92

100 100 93 86 93 96 98 95 94 100 98 98 92

100 93 86 93 96 98 95 94 100 98 98 92

93 86 93 96 98 95 94 100 98 98 92

92 97 94 94 90 96 93 92 92 89

92 87 87 83 89 86 85 85 85

94 94 89 96 93 92 92 91

97 92 95 96 95 95 92

94 95 98 97 97 92

90 95 96 94 88

94 93 93 90

98 98 92

97 91

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

H. GEN NS1

2 97

3 97 100

4 98 99 99

5 99 98 98 98

6 98 98 98 99 98

7 98 97 97 97 99 97

8 98 97 97 98 99 98 99

9 98 97 97 97 99 97 99 99

10 99 97 97 98 99 98 99 99 99

11 98 97 97 97 99 97 99 99 99 99

12 99 97 97 98 99 98 99 99 99 99 99

13 98 98 98 98 99 98 99 99 98 99 98 99

14 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98

15 94 93 93 94 95 94 95 95 95 95 95 95 94 94

16 97 96 96 96 98 96 98 98 97 97 97 97 97 97 95

17 97 95 95 96 97 96 97 98 97 97 97 97 97 96 95 99

18 95 93 93 94 95 94 95 95 95 95 95 95 95 94 97 95 95

19 98 99 99 99 98 99 98 98 98 98 98 98 98 99 94 96 96 94

20 98 99 99 99 98 99 98 98 97 98 97 98 98 99 94 96 96 94 99

21 97 98 98 99 98 99 97 97 97 98 97 98 97 98 93 96 96 93 99 99

22 97 95 95 96 97 96 97 98 97 97 97 97 97 96 96 97 97 96 96 96 96

23 97 96 96 97 98 97 98 98 98 98 98 98 98 97 96 98 98 96 97 97 96 98

24 96 95 95 96 97 96 97 97 97 97 97 97 96 96 95 97 97 94 96 96 95 97 98

25 96 95 95 96 97 96 97 97 97 97 97 97 97 96 94 98 98 94 96 96 95 97 98 96

26 98 96 96 97 98 97 98 99 98 98 98 98 98 97 94 97 97 95 97 97 97 97 97 96 96

27 94 94 94 94 95 94 95 96 95 95 95 95 95 94 94 95 95 93 94 94 94 95 96 97 95 95

95 95 96 98 96 97 97 96 98 96 97 97 97 92 96 96 92 96 96 95 95 96 94 95 97 93

100 98 96 98 95 95 94 96 94 96 96 97 89 94 94 90 99 98 97 92 93 92 92 95 91

98 96 98 95 95 94 96 94 96 96 97 89 94 94 90 99 98 97 92 93 92 92 95 91

96 99 95 96 94 96 95 96 96 97 90 95 94 90 99 99 98 93 94 92 93 95 91

96 98 99 97 100 98 99 99 97 93 97 97 93 97 96 96 96 97 96 96 98 94

95 96 94 96 95 96 96 97 90 95 94 91 99 100 99 93 94 92 93 95 91

99 98 98 98 98 98 96 93 98 97 93 96 95 94 96 97 96 96 99 95

98 99 99 98 98 96 94 98 98 94 96 96 95 97 98 96 97 99 95

97 97 97 97 95 92 97 96 92 95 94 93 96 96 95 96 98 94

98 99 99 97 93 97 97 93 97 96 96 96 97 96 96 98 94

97 97 95 93 97 97 93 95 95 94 96 97 96 96 98 95

99 96 92 97 96 93 96 96 95 96 96 95 96 98 94

96 92 97 96 93 96 96 95 96 96 95 96 98 94

90 95 95 91 98 97 96 93 94 93 93 96 92

94 94 96 90 90 89 96 95 94 93 94 92

99 94 95 95 94 97 98 97 97 98 96

94 95 94 93 97 98 96 97 97 95

91 91 90 96 95 94 93 94 92

99 98 93 94 93 93 96 92

99 93 94 92 93 95 91

92 93 92 92 94 90

98 96 96 97 95

98 97 97 96

96 96 98

96 94

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Ghi chú: Các chủng được đánh số thứ tự từ 1 đến 27 tương ứng với ký hiệu chủng tại Bảng 3.23; 1-21 là các chủng Việt Nam; 22-27 là các chủng của thế giới; 1-6 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 15-18 là các chủng miền Bắc.

I. GEN NS2

2 98

3 98 100

4 98 99 99

5 99 98 98 98

6 98 99 99 99 98

7 93 92 92 92 93 92

8 93 92 92 92 93 92 99

9 98 97 97 97 99 97 93 93

10 99 98 98 98 100 98 93 93 99

11 99 98 98 98 99 98 93 93 99 99

12 99 98 98 98 100 98 93 93 99 100 99

13 99 97 97 97 99 98 93 93 98 99 99 99

14 99 98 98 98 98 98 92 92 98 98 98 98 98

15 94 93 93 93 95 93 88 89 94 95 94 95 94 93

16 98 97 97 97 98 97 93 92 98 98 99 98 98 97 95

17 98 97 97 97 98 97 93 92 98 98 99 98 98 97 95 100

18 95 94 94 94 95 93 89 89 94 95 95 95 94 94 98 95 95

19 98 99 99 99 98 99 92 92 98 98 98 98 98 98 93 97 97 94

20 93 93 93 93 93 94 97 97 92 93 93 93 92 93 88 92 92 88 94

21 98 98 98 98 98 99 92 92 97 98 98 98 97 98 93 97 97 93 99 94

22 98 96 96 96 98 96 92 92 97 98 98 98 97 97 96 98 98 96 97 91 96

23 98 96 96 96 98 97 92 92 98 98 98 98 98 97 95 99 99 95 97 92 96 98

24 97 96 96 96 98 96 91 92 97 98 97 98 97 96 95 98 98 95 96 91 96 98 98

25 97 96 96 96 98 96 92 92 97 98 98 98 97 96 94 99 99 94 96 91 96 97 98 97

26 98 96 96 96 98 97 93 93 98 98 98 98 98 97 93 98 98 93 97 93 96 96 97 96 97

27 95 94 94 94 95 94 89 90 95 95 95 95 95 94 93 95 95 93 94 89 94 95 96 97 95 94

95 95 96 99 96 92 93 97 99 98 99 98 98 91 97 97 92 97 91 95 96 97 97 95 96 94

100 99 96 97 90 90 95 96 95 96 95 95 91 95 95 92 98 92 97 95 95 95 94 94 93

99 96 97 90 90 95 96 95 96 95 95 91 95 95 92 98 92 97 95 95 95 94 94 93

97 98 90 91 95 97 96 97 96 96 91 96 96 92 99 93 97 95 95 95 95 95 94

97 93 94 98 100 99 100 99 97 92 98 98 93 98 92 96 97 98 98 96 97 95

90 91 95 97 96 97 96 96 90 96 96 90 99 95 99 95 95 95 95 95 92

97 93 93 94 93 92 90 85 93 93 86 91 95 90 90 93 91 91 92 88

92 94 93 94 93 91 86 92 92 87 92 96 90 91 92 92 90 91 89

98 99 98 97 95 90 98 98 91 96 90 95 95 98 96 96 97 93

99 100 99 97 92 98 98 93 98 92 96 97 98 98 96 97 95

99 98 96 91 99 99 92 97 91 95 96 99 97 97 98 94

99 97 92 98 98 93 98 92 96 97 98 98 96 97 95

96 91 97 97 92 97 91 95 96 97 98 95 96 95

90 95 95 90 97 91 95 95 95 95 94 95 92

90 90 99 90 85 90 95 92 92 89 90 90

100 91 97 91 95 95 98 96 98 97 93

91 97 91 95 95 98 96 98 97 93

91 85 90 95 93 93 90 90 91

94 98 95 96 96 95 95 93

94 90 90 90 90 90 87

95 95 95 94 94 91

97 97 94 95 94

98 96 97 95

95 95 96

95 91

TT 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Phụ lục 10: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới bằng chương trình MEGA4.0

100 100

A. GEN PB2

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

74 74

64 64 66 66

Dk-VN-1231-05 Dk-VN-1231-05 Dk-VN-BL-07-09-07 Dk-VN-BL-07-09-07

34 34

PB2 Amino acid PB2 Amino acid

96 96

PB2 Nucleotide PB2 Nucleotide

Ck-VN-NCVD-3-07 Ck-VN-NCVD-3-07

Dk-VN-BL-07-09-07 Dk-VN-BL-07-09-07 Ck-VN-NCVD-3-07 Ck-VN-NCVD-3-07

62 62

92 92

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

92 92

100 100 Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1231-05 Dk-VN-1231-05

44 44

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07

51 51

59 59

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

98 98

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05 VN-CL2009-05 VN-CL2009-05

44 44

60 60 VN-CL2009-05 VN-CL2009-05

Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

99 99

Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

84 84

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

70 70 33 33

82 82 66 66 66 66

65 65

17 17

75 75

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 VN-1203-04 VN-1203-04

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 VN-1203-04 VN-1203-04

Ck-Laos-1-08 Ck-Laos-1-08

Ck-GD-178-04 Ck-GD-178-04

33 33

Ck-GD-178-04 Ck-GD-178-04

100 68 100 68

Ck-EastJava-UT6017-06 Ck-EastJava-UT6017-06

55 55

Ck-EastJava-UT6017-06 Ck-EastJava-UT6017-06

84 84

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

Dk-Guangxi-12-03 Dk-Guangxi-12-03

64 64

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

99 99

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

87 87

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

94 94 29 29

87 87

Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

93 93

Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

75 75

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06

60 60

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

59 59

Dk-TL-KU-56-07 Dk-TL-KU-56-07

87 87

10 10

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05 Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

Dk-Guangxi-12-03 Dk-Guangxi-12-03

63 63

Dk-TL-KU-56-07 Dk-TL-KU-56-07

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

100 100

Ck-Laos-1-08 Ck-Laos-1-08

0.01 0.01

0.002 0.002

B. GEN PB1

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

98 98

100 100

Ck-Guangxi-463-06 Ck-Guangxi-463-06

94 94

PB1 Nucleotide PB1 Nucleotide

PB1 Amino acid PB1 Amino acid

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07 Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

99 99

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

Dk-TL-KU-56-07 Dk-TL-KU-56-07

13 13 16 16 23 23 34 34 51 51

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

37 37

36 36

Ck-Laos-16-08 Ck-Laos-16-08

22 22

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

94 94

39 39 84 84 28 28

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04 VN-1203-04 VN-1203-04

Ck-Shantou-3744-03 Ck-Shantou-3744-03 Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

98 98

21 21

11 11

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

52 52

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

100 100

56 56 30 30

18 18

Ck-TL-NS-341-08 Ck-TL-NS-341-08

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

81 81

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06

Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05

43 43

37 37

46 46

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

59 59 50 50

36 36

Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05

53 53

44 44

VN-1203-04 VN-1203-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

61 61

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06 Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07 Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

38 38

70 70

9 9

99 99

Dk-TL-KU-56-07 Dk-TL-KU-56-07

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

88 88

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07 Ck-Guangxi-463-06 Ck-Guangxi-463-06

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

Ck-Laos-16-08 Ck-Laos-16-08

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

61 61 46 46

68 68

Ck-Shantou-3744-03 Ck-Shantou-3744-03

Ck-GD-174-04 Ck-GD-174-04

Ck-TL-NS-341-08 Ck-TL-NS-341-08

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

0.01 0.01

0.002 0.002

62 62

65 65

C. GEN PA

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07 Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

PA Amino acid PA Amino acid

55 55

PA Nucleotide PA Nucleotide

67 67

Ck-VN-NCVD-3-07 Ck-VN-NCVD-3-07

46 46

80 80

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-DT-171-04 VN-HG-178-04 VN-HG-178-04

Dk-VN-BL-07-09-07 Dk-VN-BL-07-09-07

52 52

VN-1203-04 VN-1203-04

76 76

99 99

47 47

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05 VN-HG-207-05 VN-HG-207-05 Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

98 98

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

100 100

85 85

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07 Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

89 89

61 61

Ck-VN-NCVD-3-07 Ck-VN-NCVD-3-07

100 100

Dk-VN-BL-07-09-07 Dk-VN-BL-07-09-07

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-DT-171-04

54 54

79 79

35 35

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

VN-1203-04 VN-1203-04 Ck-GD-191-04 Ck-GD-191-04

Ck-GD-191-04 Ck-GD-191-04

93 93

84 84

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

100 100

97 97

Ck-Indo-CDC25-05 Ck-Indo-CDC25-05

61 61

78 78

Ck-EastJava-UT6017-06 Ck-EastJava-UT6017-06

100 100

95 95

100 100 Dk-VN-LS-201-05 Dk-VN-LS-201-05

Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05

Dk-VN-LS-201-05 Dk-VN-LS-201-05 Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05

83 83

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

61 61

90 90 59 59

Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

Dk-Guangxi-12-03 Dk-Guangxi-12-03

99 99

97 97

68 68

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

100 100

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06 Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

44 44

54 54

Dk-PhuTho-07-92-07 Dk-PhuTho-07-92-07

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

85 85

88 88

Dk-Guangxi-12-03 Dk-Guangxi-12-03

Dk-PhuTho-07-92-07 Dk-PhuTho-07-92-07

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

100 100

96 96 70 70

0.002 0.002

0.01 0.01

D. GEN NP

Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08

100 100

87 87

91 91

Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08

Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08

19 19 12 12

89 89

Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

NP Nucleotide NP Nucleotide

NP Amino acid NP Amino acid

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

66 66

82 82

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

53 53

90 90

65 65

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

26 26

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04

Ck-Guangxi-463-06 Ck-Guangxi-463-06

55 55 60 60

Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

Ck-GD-174-04 Ck-GD-174-04

99 99

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04

80 80

30 30

VN-1203-04 VN-1203-04

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

4 4

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

VN-1203-04 VN-1203-04

27 27

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

27 27

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

44 44

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05

71 71

42 42

Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

Ck-VN-10-05 Ck-VN-10-05 Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

28 28

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

54 54

48 48

Ck-Guangxi-463-06 Ck-Guangxi-463-06

64 64

Ck-TL-NP-172-06 Ck-TL-NP-172-06

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

68 68

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

25 25 73 73

Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-GD-174-04 Ck-GD-174-04

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Ck-Hubei-wn-03 Ck-Hubei-wn-03

46 46

0.01 0.01

0.001 0.001

E. GEN M

Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08

63 63

67 67

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

M Nucleotide M Nucleotide

M Amino acid M Amino acid

99 99

Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08

Thailand-NBL1-06 Thailand-NBL1-06

95 95

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04

Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07

Ck-VN-30-03 Ck-VN-30-03

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

58 58

Ck-VN-1-04 Ck-VN-1-04

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

67 67

60 60

Ck-VN-5-03 Ck-VN-5-03

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

55 55

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

88 88

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05 VN-HG-207-05 VN-HG-207-05

58 58

95 95

45 45

Dk-VN-11-04 Dk-VN-11-04

VN-HG-178-04 VN-HG-178-04

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 Dk-VN-11-04 Dk-VN-11-04

56 56

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

38 38

Ck-VN-1-04 Ck-VN-1-04

67 67

54 54

Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08

Thailand-NBL1-06 Thailand-NBL1-06

53 53

Ck-VN-5-03 Ck-VN-5-03

34 34

28 28

Ck-VN-NCVD-24-07 Ck-VN-NCVD-24-07 Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08

Ck-VN-30-03 Ck-VN-30-03

85 85 66 66

69 69

Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-093-08

75 75

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

Dk-Hubei-wp-03 Dk-Hubei-wp-03

53 53

Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

Ck-VN-LS-200-05 Ck-VN-LS-200-05

75 75

Dk-Hubei-wp-03 Dk-Hubei-wp-03

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Dk-Guangxi-288-06 Dk-Guangxi-288-06

18 18

56 56

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07 Dk-VN-50-07 Dk-VN-50-07

54 54

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06 Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

19 19

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

Ck-Hunan-8-08 Ck-Hunan-8-08

Dk-Guangxi-288-06 Dk-Guangxi-288-06

58 58 43 43 76 76

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

Dk-Hubei-46-09 Dk-Hubei-46-09

0.005 0.005

F. GEN NS

Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07

88 88

66 66

Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07

43 43

Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05

NS Amino acid NS Amino acid

NS Nucleotide NS Nucleotide

97 97

Dk-VN-34-07 Dk-VN-34-07

Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08

88 88

94 94 64 64

Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08

87 87

66 66

Ck-VN-NCVD-10-07 Ck-VN-NCVD-10-07

86 86

99 99

80 80

Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05

53 53

79 79

Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04

87 87

Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04

57 57

55 55

64 64

Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04

43 43

VN-CL2009-05 VN-CL2009-05

69 69

98 98

Ck-VN-30-03 Ck-VN-30-03

Dk-VN-34-07 Dk-VN-34-07 Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-36ST-08 Dk-VN-17A-TV-08 Dk-VN-17A-TV-08 Ck-VN-NCVD-10-07 Ck-VN-NCVD-10-07 Dk-VN-1771-05 Dk-VN-1771-05 Ck-VN-29-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-HG-07-12-07 Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-NCVD09-05 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-HG4-05 VN-CL2009-05 VN-CL2009-05 Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-CT-018-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-30-03 Ck-VN-30-03

Ck-TL-CU-354-08 Ck-TL-CU-354-08

Dk-VN-11-04 Dk-VN-11-04

52 52

47 47

58 58

Ck-VN-5-03 Ck-VN-5-03

38 38

60 60 48 48

VN-1203-04 VN-1203-04

87 87

Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

Ck-TL-CU-354-08 Ck-TL-CU-354-08 VN-1203-04 VN-1203-04 Ck-VN-5-03 Ck-VN-5-03 Dk-VN-11-04 Dk-VN-11-04 Ck-Hubei-2856-07 Ck-Hubei-2856-07

80 80

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05

98 98

Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06

Ck-VN-NB-209-05 Ck-VN-NB-209-05 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Dk-VN-HaiPhong-208-06

34 34 85 75 85 75

97 97

62 62

Ck-HK-4091-02 Ck-HK-4091-02

53 53

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05

39 39

90 90

Ck-India-09 Ck-India-09

Ck-Guangxi604-05 Ck-Guangxi604-05 Ck-India-09 Ck-India-09

78 78

93 93 Ck-Shantou-2535-01 Ck-Shantou-2535-01

96 96 Ck-Shantou-2535-01 Ck-Shantou-2535-01

51 51

Dk-VN-LS-201-05 Dk-VN-LS-201-05

MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

Dk-VN-LS-201-05 Dk-VN-LS-201-05 MDk-VN-1455-06 MDk-VN-1455-06

97 97

100 100

Dk-HK-140-98 Dk-HK-140-98

Ck-Hubei-97 Ck-Hubei-97

HK-97-98 HK-97-98

Dk-HK-140-98 Dk-HK-140-98 Ck-Hubei-97 Ck-Hubei-97 HK-97-98 HK-97-98

56 56 38 38

62 62

Ck-HK-786-2-97 Ck-HK-786-2-97

100 100

99 99

Ck-China-27402-97 Ck-China-27402-97

Ck-HK-258-97 Ck-HK-258-97

98 98 71 71

Gs-GD-1-96 Gs-GD-1-96

98 98 98 98 54 54

43 43

Ck-HK-786-2-97 Ck-HK-786-2-97 Ck-China-27402-97 Ck-China-27402-97 Ck-HK-258-97 Ck-HK-258-97 Gs-GD-1-96 Gs-GD-1-96

Gs-HK-99 Gs-HK-99

Gs-HK-4853-2000 Gs-HK-4853-2000

100 100

Gs-HK-10326-2000 Gs-HK-10326-2000

Gs-HK-99 Gs-HK-99 Gs-HK-4853-2000 Gs-HK-4853-2000 Gs-HK-10326-2000 Gs-HK-10326-2000

100 100 6 6

66 66

0.02 0.02

0.05 0.05

Phụ lục 11: So sánh thành phần nucleotide và amino acid (rút gọn) gen NS chủng CkHG4 với các chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới qua các năm 1996-2009

A. NUCLEOTIDE

240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * Gs-GD-1-96 : ATAGCCATTGCTTCCAGTCCTGCTCCTCGGTATATCACCGATATGAGCATAGAGGAGATGAGCCGAGAATGGTACATGCTGATGCCTAGGCAGAAAATAACTGGAGGCCTTATGGTGA : 352 Ck-China-2 : ATGACTATCGCTTCAGTGCCTGCTCCACGCTACCTAGCTGAAATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTAATGCTCATTCCCAAGCAGAAAGTAACAGGGTCCCTTTGCATTA : 352 Ck-HK-258- : ATGACTATCGCTTCAGTGCCTGCTCCACGCTACCTAGCTGAAATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTAATGCTCATTCCCAAGCAGAAAGTAACAGGGTCCCTTTGCATTA : 352 Ck-HK-786- : ATGACTATCGCTTCAGTGCCTGCTCCACGCTACCTAGCTGAAATGACTCTTGAGGAGATGTCAAGGGACTGGTTAATGCTCATTCCCAAGCAGAAAGTAACAGGGTCCCTTTGCATTA : 352 Ck-Hubei-9 : ATGACTATTGCTTCTGTACCTGCTCCACGCTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAGATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAACAGAAAGTGGCGGGTTCCCTCTGCATTA : 352 HK-97-98AF : ATGACTATCGCTTCAGTGCCTGCTCCACGCTACCTAACTGAAATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTAATGCTCATTCCCAAGCAGAAAGTGACAGGGTCCCTTTGCATTA : 352 Dk-HK-140- : ATGACTATTGCTTCTGTGCCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTTGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAGGTGGCAGGTCCCCTTTGCATCA : 352 Gs-HK-99GU : ATAGCCATTGCTTCCAGTCCTGCTCCTCGGTATATCACCGATATGAGCATAGAGGAGATGAGCCGAGAATGGTACATGCTGATGCCTAGGCAGAAAATAACTGGAGGCCTTATGGTGA : 352 Gs-HK-485. : ATAGCCATTGCTTCCAGTCCTGCTCCTCGGTATATCACCGATATGAGCATAGAGGAGATGAGCCGAGAATGGTACATGCTGATGCCTAGGCAGAAAATAACTGGAGGCCTTATGGTGA : 352 Gs-HK-1032 : ATAGCCATTGCTTCCAGTCCTGCTCCTCGGTATATCACCGATATGAGCATAGAGGAGATGAGCCGAGAATGGTACATGCTGATGCCTAGGCAGAAAATAACTGGAGGCCTTATGGTGA : 352 Ck-VN-HG4- : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-29-0 : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-HG-07-1 : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-1771 : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-CT-0 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-34-0 : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACCCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-5-03 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-30-0 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 VN-1203-04 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-36-0 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTAGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-11-0 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-TG-0 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 VN-CL2009- : ATG---------------CCGGCTTCATGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-VN-NCVD : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-LS-2 : ATG---------------CCAGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAGATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCTCCCTTAGCATCA : 337 Ck-VN-NB-2 : ATG---------------CCGACTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCGGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-HaiP : ATG---------------CCGACCTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGCGGCGGGTTCCCTTTGCATCA : 337 MDk-VN-145 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAGATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCTCCCTTAGCATCA : 337 Ck-VN-NCVD : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-17A- : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Dk-VN-36ST : ATG---------------CCGGTTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-Shantou : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAACAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTACATCA : 337 Ck-HK-409. : ATG---------------CCGGCTTCACGCTATCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-Guangxi : ATG---------------CCAGCTTCACGCTACCTAACTGATATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAACAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-Hubei-2 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACTTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-TL-CU-3 : ATG---------------CCGGCTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCA : 337 Ck-India-0 : ATG---------------CCAGCTTCACGCTACTTAACTGATATGACTCTCGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCTAAGCAGAAAGTGACAGGTTCCCTTTGCATCA : 337

* 100 * 1

B. AMINO ACID * 20 * 40 * 60 * 80 Gs-GD-1-96 : MDSNTITSFQVDCYLWHIRKLLSMRDMCDAPFDDRLRRDQKALKGRGSTLGLDLRVATMEGKKIVEDILKSETNENLKIAIASSPAPRYITDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVK : 118 Ck-China-2 : MNSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIRTATREGKHIVERILEEESDEALKMTIASVPAPRYLAEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGSLCIR : 118 Ck-HK-258- : MNSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRFRRDQKSLRGRGSTLGLDIRTATREGKHIVERILEEESDEALKMTIASVPAPRYLAEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGSLCIR : 118 Ck-HK-786- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIRAATREGKHIVERILEEESDEALKMTIASVPAPRYLAEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGSLCIR : 118 Ck-Hubei-9 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKMTIASVPAPRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIR : 118 HK-97-98AF : MDSNTVSSFQVDCFLWRVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIRTATREGKHIVERILEEESDEALKMTIASVPAPRYLTEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGSLCIR : 118 Dk-HK-140- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATCAGKLIVERILEEESDEALKMTIASVPASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCIR : 118 Gs-HK-99GU : MDSNTITSFQVDCYLWHIRKLLSMRDMCDAPFDDRLRRDQKALKGRGSTLGLDLRVATMEGKKIVEDILKSETNENLKIAIASSPAPRYITDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVK : 118 Gs-HK-485. : MDSNTITSFQVDCYLWHIRKLLSMRDMCDAPFDDRLRRDQKALKGRGNTLGLDLRVATMEGKKIVEDILKSETNENLKIAIASSPAPRYITDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVK : 118 Gs-HK-1032 : MDSNTITSFQVDCYLWHIRKLLSMRDMCDAPFDDRLRRDQKALKGRGNTLGLDLRVATMEGKKIVEDILKSETNENLKIAIASSPAPRYITDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVK : 118 Ck-VN-HG4- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIEAATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-29-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-HG-07-1 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-1771 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-CT-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-34-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-5-03 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-30-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 VN-1203-04 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEGESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-36-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-11-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEKSDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-TG-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 VN-CL2009- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASCYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-VN-NCVD : MNSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-LS-2 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQEMGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIKTATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLSIK : 113 Ck-VN-NB-2 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PTSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-HaiP : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PTSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKAAGSLCIK : 113 MDk-VN-145 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLSIK : 113 Ck-VN-NCVD : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-17A- : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Dk-VN-36ST : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PVSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-Shantou : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLYIK : 113 Ck-HK-409. : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-Guangxi : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-Hubei-2 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-TL-CU-3 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGNTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDKALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIK : 113 Ck-India-0 : MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILEEESDEALKM-----PASRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVTGSLCIK : 113

Phụ lục 12: Các loại amino acid của virus cúm A/H5N1 đặc trưng cho loài vật chủ

Protein Vị trí amino acid Loại amino acid đặc trưng Chủng nghiên cứu

M1 M2

PB2

137 16 20 28 55 78 33 61 100 136 214 283 293 313 375 28 55 65 100 382 400 409 552 44 81 199 271 588 613 661 674 702 Gia cầm T E S/N I L Q V I R L R L R F D P D S V E Q/T/S S T A T A T A V A A/S K Người A G N I/V F K I L V M K P K I G/E L N L A D L N S S M S A I T T T R CkHG4 T E S V L Q V I R L R L R F D P D S V E S S T A T A T A V A A K

Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN QUANG VUI

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Ng­ êi

Hà Nội - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN QUANG VUI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 62 50 10

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ 2. TS. NGUYỄN BÁ HIÊN

Hà Nội - 2012

I

LỜI CAM ĐOAN

II

LỜI CẢM ƠN

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

XI

XII

1

2

3

4

5

6

Bảng 1.1: Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 6/7/2012

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

Tổng

Quốc gia

Tổng số

7

8

9

10

A

A/Ck/VN/HG4/05(H5N1)

Tên Serotype

Phân type HA và NA

Loài nhiễm

Vùng địa lí phân lập

Số hiệu chủng

Năm phân lập

Hình 1.1: Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm (WHO, 2008) [159]

11

neuraminidase neuraminidase

(B) (B)

heagglutinin heagglutinin

(C) (C)

(C) (C)

(B) (B)

(A) (A)

12

13

14

15

Hình 1.4: Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cúm gia cầm. Ghi chú: A: Xuất huyết da chân; B: Mào, tích sưng, xuất huyết. Nguồn: Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương

16

17

18

19

20

Ng êi