Nghiên cu ánh giá tim nng di
truyn kháng bc lá ca mt s
ging lúa np a phng bng ch
th phân t
1: Trung tâm Tài nguyên thực vật
2: Trường Đại học Nông nghiệp 1
Nghiên cứu đánh giá tiềm năng di truyền kháng bạc lá của
một số giống lúa nếp địa phƣơng bằng chỉ thị phân tử
Nguyễn Thị Lan Hoa1, Trần Danh Sửu1, Trần Thị Thu Hoài1,
Hà Minh Loan1, Bùi Thị Thu Giang1, Bùi Trọng Thủy2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa là cây lương thực chiếm tỉ trọng cao trong tổng sản lượng lương thực hàng năm,
cung cấp gần 80% nhu cầu tinh bột trung bình cho người dân Việt Nam. Nước ta có khí hậu
nhiệt đới là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh hại phát triển. Trong đó, bệnh bạc lá là
một bệnh nguy hiểm đối với lúa trồng do có khả năng gây giảm năng suất nghiêm trọng, có
khi thiệt hại lên đến 30-60%, có thể dẫn đến mất trắng.
Biện pháp sử dụng giống kháng bệnh được coi là xu hướng có hiệu quả về cả mặt kinh
tế và môi trường. Ngày nay, số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên
nhanh chóng và đa dạng hơn, đòi hỏi cần tạo ra những giống lúa mới mang nhiều gen kháng,
có tính kháng bền vững hơn. Định hướng trong nghiên cứu chọn tạo giống là tạo giống kháng
bền vững mang từ 1 đến nhiều gen kháng có năng suất cao, chất lượng tốt để tiến tới có thể thay
thế dần các giống nhập nội. Vì thế, nghiên cứu xác định nguồn gen kháng bệnh bạc lá sẵn có trong
các nguồn gen lúa địa phương nhằm hạn chế tác hại của bệnh.
Cho đến nay, hơn 30 gen kháng bệnh bạc lá đã được phát hiện và một số gen kháng
chính đã được xác định với các chỉ thị liên kết (J.S. Kim và cs., 2009). Ứng dụng các chỉ thị
này để xác định sự có mặt của các gen kháng đã được tiến hành ở nhiều quốc gia, giúp rút
ngắn thời gian đánh giá và có thể sử dụng trực tiếp trong chọn giống hiện đại nhờ chỉ thị phân
tử do xác định chính xác được nguồn gen kháng.
Với mong muốn nhanh chóng tiếp cận nguồn gen kháng bệnh của các tập đoàn lúa đang
được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia để theo kịp với tiến trình chọn giống lúa hiện
đại, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá tiềm nămg di truyền kháng bạc lá của
một số giống lúa nếp địa phương bằng chỉ thị phân tử”
II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu thực vật:
+ Các dòng lúa đẳng gen mang gen kháng bệnh bạc lá có nguồn gốc từ IRRI đươc thu
thập từ hai đơn vị: Bộ môn Bệnh cây Nông nghiệp, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông
nghiệp HN và Viện Di truyền Nông nghiệp
+ Các mẫu giống lúa nếp thuộc phân loài phụ Japonica trong ngân hàng gen lúa đã có
dữ liệu đánh giá tinh kháng bệnh bạc (BL) lá điểm 1 đến 3
STT
SĐK
Tên giống
I2 - KI
Điểm kháng BL
1
24
Bạch mao Bắc Cạn
N
1
2
329
Nếp mây Hải Dương
N
1
3
334
Nếp bộc dương Hòa Bình
N
1
4
384
Nếp vằn ruộng Hòa Bình
N
1
5
386
Nếp đá Hòa Bình
N
1
6
430
Nếp chuối Hòa Bình
N
1
7
431
Nếp dương Hòa Bình
N
1
8
1285
Nếp vằn
N
1
2
STT
SĐK
Tên giống
I2 - KI
Điểm kháng BL
1292
Nếp chân
N
1
10
1902
Khẩu nu khao
N
1
11
1930
Khẩu ba tràng
N
1
12
2030
Nếp mèo nương
N
1
13
2035
Tam tân màu vàng
N
1
14
2036
Nếp tan thơm
N
1
15
2369
Nếp ông lão
N
1
16
2370
Nếp hạt mây
N
1
17
2481
Khẩu tan vang
N
1
18
2499
Khẩu tan pỏm
N
1
19
2505
Khẩu tan hang
N
1
20
2507
Khẩu tan nương
N
1
21
9880
Nếp
N
1
22
9886
Khẩu tan lanh
N
1
- Nguồn vi khuẩn X. oryzae sử dụng trong nghiên cứu
19 isolate vi khuẩn X.oryzae có số seri từ 893.HAU 10132-5 đến 1083.HAU 10164-
3. Các isolate này thuộc 2 race: 5 và 12 dựa trên phản ứng gây bệnh của isolate trên các dòng
lúa (Bùi Trọng Thủy, 2008) được cung cấp từ Bộ môn Bệnh cây – Trường Đại học Nông
nghiệp HN. Các isolate này đã được thu thập, phân lập và bảo quản từ vụ mùa năm 2010,
được thu thập ở 11 tỉnh đó là: Thanh Hóa, Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Ninh Bình, Hải
Dương, Thái Bình, Nam Định, Nghệ An, Hưng Yên, Điện Biên Phủ và trên 18 giống lúa:
HYT 100, Q-ưu 1, MT6, MT1, Kháng Mằn, B6, Dòng 536, Bắc Thơm, Xi-6, Hương Thơm,
Xi, BC15, Tạp Giao, IR64, D-ưu 527, Tẻ Đỏ, Khang dân, C70.
- Các chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu
Các chỉ thị phân tử PCR based: STS và SSR liên kết với gen kháng bệnh bạc lá Xa4,
xa5, Xa7, Xa21 từ các tài liệu tham khảo được sử dụng trong nghiên cứu.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng
2.1. Lây nhiễm nhân tạo
Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh qua lây nhiễm nhân tạo được bố trí trong
nhà lưới có mái che, theo kiểu tuần tự, cấy 1 dảnh. Tiến hành lây nhiễm bằng phương pháp
cắt đầu lá sâu 3-5cm bằng kéo nhúng dung dịch vi khuẩn khi lúa bắt đầu có đòng và đánh giá
trên 3 khóm/mẫu giống/isolate vi khuẩn, mỗi giống ghi nhận kết quả ở 5 lá trên/khóm bằng
cách đo chiều dài vết bệnh sau 18 - 21 ngày lây nhiễm.
Mức độ kháng/nhiễm của các mẫu giống được đánh giá dựa trên chiều dài trung bình
của vết bệnh trên lá lúa theo phương pháp của IRRI như sau: chiều dài vết bệnh < 8 cm:
kháng bệnh (R); 8-12cm: nhiễm vừa (M); > 12 cm: nhiễm nặng (S)
2.2 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN
ADN lá lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, JJ. và ctv
(1987). Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
0.8%.
2.2.2. Kỹ thuật PCR
3
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy PCR MJ-PTC200. Tổng dung dịch phản ứng
là 15 µl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR,
2.5mM MgCl2 và 0.5 đơn vị Taq Fermentaq. Điều kiện phản ứng PCR được xác định cụ thể
với từng chỉ thị ở các bước như sau:
- Phản ứng PCR đối với các cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 lần lượt của các gen Xa4,
Xa7, Xa21 được thực hiện theo chu kì nhiệt như sau: 94ºC trong 4 phút; 30 chu kỳ: 94ºC trong
1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72ºC trong 2 phút; và 72ºC trong 8 phút, bảo quản ở 4°C.
- Phản ứng PCR đối với cặp mồi RM6320 của gen xa5 được thực hiện theo chu kì
nhiệt: 94ºC trong 4 phút; 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút
50 giây; và 72ºC trong 7 phút, bảo quản sản phẩm ở 4°C.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5-2%. Bản gel được nhuộm bằng
ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:
Số liệu được xử lý bằng phần mềm thông dụng Microsoft Office Excel 2003.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.Thu thập, phân t ch th ng tin về ngu n gen lúa địa phƣơng v các d ng lúa đ ng gen
mang gen kháng l m vật liệu đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
+ Các dòng lúa đẳng gen mang gen kháng bệnh bạc lá:
Chúng tôi đã thu thập và gieo trồng được 20 dòng lúa đẳng gen mang gen kháng có
nguồn gốc từ IRRI được thu thập từ hai đơn vị: Bộ môn Bệnh cây Nông nghiệp, Khoa Nông
học, Trường Đại học Nông nghiệp HN và Viện Di truyền Nông nghiệp. Các dòng đẳng gen
mang các nguồn gen kháng đơn như Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14, Xa21
và một số dòng mang các tổ hợp đa gen kháng như IRBB21, IRBB55, IRBB57, IRBB59,
IRBB60, IRBB62, IRBB1/4. Trong đó, chỉ có xa5 là gen lặn, các gen khác là gen trội. IR24
không chứa gen kháng nên được chọn làm giống chuẩn nhiễm và làm giống đối chứng nhiễm.
+ Các giống lúa địa phương có tiềm năng kháng bệnh:
Trong dữ liệu tập đoàn lúa đang được lưu giữ trong ngân hàng gen, chúng tôi đã chọn
lọc được 80 mẫu giống lúa có điểm kháng bệnh bạc lá từ 1 đến 3 (kết quả đánh giá từ trước
năm 2000 với chủng bạc lá phổ biến). Trong đó, 22 mẫu giống lúa nếp thuộc phân loài phụ
Japonica có số liệu đánh giá tính kháng bệnh bạc (BL) lá điểm 1 được sử dụng trong nghiên
cứu (phụ lục).
2. Đánh giá khả năng kháng của các d ng lúa đ ng gen mang các gen kháng.
2. . ánh giá tính kháng c a các d ng l a ng gen bằng lây nhiễm v i các ch ng vi
khuẩn gây bệnh bạc lá.
Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 19 isolate được thu thập từ 11
tỉnh đại diện cho các vùng sinh thái ở miền Bắc để tiến hành lây nhiễm trên 16 dòng lúa đẳng
gen mang các gen kháng bạc lá gồm 11 dòng đẳng gen mang các gen kháng đơn nhận được từ
Trường ĐHNN và 5 dòng đa gen kháng nhận được từ Viện DTNN.
Từ kết quả đo chiều dài vết bệnh trung bình của 16 dòng lúa đẳng gen sau lây bệnh 18 ngày
căn cứ vào phản ứng kháng (R), nhiễm(S) của các dòng lúa đẳng gen với 19 isolate vi khuẩn
X. oryzae (bảng 1), chúng tôi có nhận xét như sau:
- Dòng lúa IR24 ( đối chứng – chuẩn nhiễm) đều có phản ứng nhiễm (S) với 19 isolate vi
khuẩn X. oryzae.
- Trong các dòng lúa mang đơn gen kháng, các gen kháng Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa10,
Xa11, Xa14 đều cho phản ứng nhiễm với tất cả các isolate được sử dụng. Dòng lúa mang gen
kháng xa5 có hiệu lực kháng mạnh nhất (chiều dài vết bệnh trung bình <2cm), dòng mang gen
kháng Xa7 cũng có biểu hiện kháng với tất cả các isolate lây nhiễm. Gen kháng Xa21 có hiệu
lực kháng với gần ½ các isolate được lây nhiễm, đó là các isolate thuộc race 5 và không
kháng được các isolate thuộc race 12.
4
- Các dòng đẳng gen mang nhiều gen kháng có phản ứng kháng với hầu hết các isolate sử
dụng để đánh giá. Tất cả các dòng mang gen kháng xa5, Xa7 đều có đặc điểm kháng với các
chủng vi khuẩn gây bệnh. Tổ hợp giữa Xa21 và Xa13 vẫn cho phản ứng nhiễm với isolate
893. HAU 10132-5 và 976. HAU 10143-3, giống như đặc điểm kháng/nhiễm của dòng đơn
gen IRBB21.