Nuôi cấy mô và tế bào
Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn
năng của tế bào soma ở thực vật và chỉ ra khả
năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường nuôi
cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc
tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào
trần (protoplast) mới trở thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời
trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô
trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành
cây hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được các
quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho
một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan,
một số cây ăn quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng
trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy hạt thì việc
thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn
nhiều. Ở những loài cây này tần số tái sinh thấp và
kết quả tái sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo
loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một loài,
nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi
trường dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác. Nhìn
chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép
nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu
chọn giống trong một môi trường có kiểm soát. Một
số khả năng ứng dụng của nhân nhanh đối với cây
trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử,
nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục
trong chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu
sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc
tế...
Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi
cấy in vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn
giống.
(1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro
Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng
biến dị di truyền hiện có trong nguồn gene trồng trọt
bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và chọn lọc
khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh,
một ít kiểu gene chọn lọc về những tính trạng có ý
nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong
nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số
trường hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng
có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính
kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở
lúa...
Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh
hưởng đến năng suất, nhà chọn giống cần có
nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại
thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn
lớn khi sử dụng các loài hoang dại để lai với cây
trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường
hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có
quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng
sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không
đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian
ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát
triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi cấy
phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc
phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh
trưởng, nảy mần, và phát triển thành cây con.
Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã
tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng
như lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, các
loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene có
ích đã được chuyển vào cây trồng.
Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi
từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi
noãn. Noãn chứa phôi lai non được tách ngay sau
khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên
môi trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy
noãn phôi có thể nuôi cấy ở giai đoạn sớm hơn so
với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển
trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận
lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngoài noãn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập
noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh
dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ phấn cho
noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua
thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng.
Phương pháp này đã được áp dụng để tạo con lai
giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng
và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn.
(2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội:
Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc
tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần
thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong
các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra
các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt
phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng
đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội
kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời
gian cần thiết để tạo ra giống mới.
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các
bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa
thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra
cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội
được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử
hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao
phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn
bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng
thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời
gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự
phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn
nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống. Các
dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải
thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì
trong quần thể không có phương sai trội, đồng thời
gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này
đã được áp dụng thành công ở Trung Quốc trong
việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế
trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả
năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu
gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không
thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà
chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica
khó nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai
đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý của
cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy,
môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu
quả lưỡng bội hoá bằng colchicine.
(3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào:
Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật
mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý
tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất và như
bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú.
Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu
ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta
thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di
truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc
thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến
gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây
khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình
thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị
dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và
Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh
hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy,
chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính
ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy
mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan
trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã
thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây
trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được
phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh
đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía
(Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh
đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng
sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980);
chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs,
1996).
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình
nuôi cấy là khả năng chọn lọc dòng tế bào in vitro.
Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một
không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và
chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều
kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết
hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số
biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng