Phân lập chủng vi khuẩn phân hủy nhựa tổng hợp từ mẫu đất ở Việt Nam

TNU Journal of Science and Technology

230(01): 40 - 47

http://jst.tnu.edu.vn 40 Email: jst@tnu.edu.vn

ISOLATION OF SOME PLASTIC-DEGRADING BACTERIAL STRAINS

FROM SOIL SAMPLES IN VIETNAM

Nguyen Thi Tam Thu1*, To Lan Anh1, Nguyen Thi Kim Linh2, Pham Kien Cuong1

1Institute of New Technology/ Academy of Military Science and Technology

2Northern Mountainous Agriculture and Foretry Science Institute - NOMAFSI

ARTICLE INFO

ABSTRACT

Received:

23/6/2024

Plastics are materials that are widely used in various applications,

especially food packaging. However, these synthetic polymers such as

PE, PET were synthesized from fossil fuels that are very difficult to

degrade naturally and cause serious environmental pollution. One

promising and safe solution to handle this problem is using

microorganisms for plastic biodegradation. Natural microorganisms

show the potential ability to degrade many persistent and toxic

pollutants such as dioxin as well as other inert compounds. In this

study, two strains capable of degrading PE and PET plastics were

reported for their biological properties and biodegradability of these

plastics. Both strains were identified to belong to genus Bacillus and

showed the ability to grow well at 35oC, pH 7 as well as to degrade

protein, starch, cellulose. However, the decomposition of PE and PET

plastic efficiency only reached 4% respectively in 60 days based on

imaging the film surface using a scanning electron microscope, FTIR

spectrum, weight loss and changes in tensile strength and elongation.

Revised:

16/10/2024

Published:

17/10/2024

KEYWORDS

Microorganisms

PE plastic

Bacillus

Biodegradation

Persistant

PHÂN LẬP MT S CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA

TỔNG HỢP TỪ CC MU ĐT  VIT NAM

Nguyễn Thị Tâm Thư1*, Tô Lan Anh1, Nguyễn Thị Kim Linh2, Phạm Kiên Cường1

1Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học và Công nghệ quân sự

2Viện Khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc

THÔNG TIN BÀI BÁO

TÓM TẮT

Ngày nhận bài:

23/6/2024

Nhựa l nguyên liu đưc s dng ph bin hin nay trong nhiu lnh

vực khc nhau đin hnh như sn xut bao gi thực phm. Tuy nhiên,

cc loi polyme tng hp ny (như PET - Polyethylene terephthalate,

PE-polyethylene), có nguồn gốc dầu mỏ rt khó phân hủy trong điu

kin tự nhiên và gây ô nhiễm môi trường trầm trọng. Mt trong nhng

gii php an ton, tim năng đưc quan tâm nht hin nay đ ng ph

vi tnh trng ny l s dng vi sinh vt trong phân hủy nhựa. Nhiu

vi sinh vt cho thy kh năng ưu vit trong vic phân hủy các cht gây

ô nhiễm khó phân hủy v đc hi như dioxin v nhiu hp cht trơ

khác. Trong nghiên cu này, hai chủng có kh năng phân hủy nhựa PE,

PET đưc công bố v đặc tính sinh học và kh năng phân hủy sinh học

2 loi nhựa này. Kt qu cho thy c 2 chủng đu thuc chi Bacillus, có

kh năng sinh trưởng tốt ở 35oC, pH 7, có hot tính phân hủy các hp

cht như protein, tinh bt và cellulose. Tuy nhiên, hiu sut phân hủy

nhựa PE, PET chỉ đt 4% tương ng trong thời gian 60 ngày. Kh năng

phân hủy của nhựa PE, PET sau khi phân hủy đưc đnh gi thông qua

chp nh b mặt màng bằng kính hin vi đin t quét, ph FTIR, sự

gim khối lưng và sự thay đi đ bn kéo, đ dãn dài.

Ngày hoàn thiện:

16/10/2024

Ngày đăng:

17/10/2024

TỪ KHÓA

Vi khun

Nhựa PE

Bacillus

Phân hủy sinh học

Khó phân hủy

DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10653

* Corresponding author. Email: thu.3t.cnm@gmail.com

TNU Journal of Science and Technology

230(01): 40 - 47

http://jst.tnu.edu.vn 41 Email: jst@tnu.edu.vn

1. Giới thiệu

Polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ hay nhựa tng hp c ưu đim là trọng lưng nhẹ, chi phí

thp, kh năng định hình dễ nên chúng đưc ng dng trong rt nhiu lnh vực như bao b, cc vt

dng sinh hot hàng ngày. Ngày nay, nhựa tng hp ngày càng phát trin v đưc s dng nhiu

làm các vt dng dùng 1 lần (túi nilon, ống hút, cốc, chai lọ…). Do đ, lưng rác thi do nhựa sinh

ra ngày càng ln. Do nhựa tng hp là các hp cht trơ rt khó phân hủy trong tự nhiên, có nhiu

loi nhựa mt hng trăm đn hng nghn năm đ phân hủy hon ton. Lưng rác thi nhựa không

chỉ gây mt mỹ quan mà còn gây xi mòn đt, ô nhiễm bin v đi dương. Vi sinh vt thường tương

tác vi các yu tố phi sinh học, chẳng hn như nhit v nh sng, đ thay đi cu trúc polyme, giúp

tăng kh năng phân gii của các enzyme [1]. Nhựa đưc phân hủy sinh học bởi vi khun, nm và

to đưc tìm thy trong nưc rỉ bãi rác, bùn thi và phân hu cơ. Nhng vi sinh vt này sinh tng

hp các enzyme có kh năng phân hủy c polyme tự nhiên và tng hp [2]. Hầu ht các vi khun

có kh năng phân huỷ nhựa là các vi khun ưa nhit, vi nhit đ tối ưu l 30 - 60°C. Tuy nhiên,

do trong tự nhiên chúng phân bố ri rc trong đt, nưc, không khí, điu kin sống chưa tối ưu nên

chưa pht huy ht kh năng tim tàng của chúng. Đ thúc đy nhanh quá trình phân hủy các cht

hu cơ trong điu kin nht định, các vi sinh vt cần tuyn chọn, nuôi cy ở cc điu kin tối ưu

đ chúng sinh lưng ln sinh khối, sau đ đưa ra môi trường dưi dng kích thích hoặc tăng cường

sinh học đ chúng phát trin tốt nht và phân hủy các cht trơ, kh phân hủy. Trên th gii đã c

mt số công bố v kh năng phân hủy các thành phần nhựa khác nhau (PE, PP, HDPE, LDPE) bởi

mt số nhóm vi sinh vt ở các tốc đ khác nhau. Chủng Pseudomonas fluorescens phân hủy 18%

PE trong 270 ngày [3]. Chủng Bacillus vallismortis phân hủy LDPE vi tỷ l 75% trong 120 ngày

[2], [4], [5]. Các chủng Klebsiella pneumonia CH001 và Aspergillus flavus phân hủy HDPE vi tỷ

l 18,4 v 5,5% trong 60 v 100 ngy tương ng [6], [7]. Các chủng có kh năng phân hủy LDPE

vi hiu sut 5,13 - 36,4% trong 45 đn 112 ngày gồm các chi Bacillus cereus A5, Aspergillus

oryzae A5, Trichoderma viride RH3, A. nominus RH06, B. siamensis [2], [5], [8]-[10]. Chi

Pseudomonas có kh năng phân hủy nhiu loi nhựa khác nhau vi tốc đ khc nhau như

Pseudomonas sp. AKS2 phân hủy 15 mg LDPE trong 45 ngày mà không cần quá trình tin x lý,

phân hủy 1,65 mg PES/ngày [11].

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu, hóa chất

Các mẫu đt trong khu vực cha cht thi nhựa tng hp (khu bãi rc) đang bị phân hủy ti Vân

Ni, Đông Anh (H Ni).

Các hóa cht dùng cho nuôi cy vi sinh vt như cc cht khoáng, nguồn cacbon dùng đ phân

lp là bt PE (polyethylene), PEG 400 (polyethylenglycol có khối lưng phân t 400) nguồn nito

đu có nguồn gốc từ Sigma, Trung Quốc.

2.2. Phương pháp

2.2.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa

Từ các mẫu đt ti khu vực có cht thi nhựa đang phân hủy, ly 10g đt hòa trong 100 ml nưc

muối sinh lý (nồng đ NaCl 0,85%) vô trùng. Trn đu và tin hành pha loãng mẫu theo dãy thp

phân đn nồng đ 10-3, 10-4. Tin hành gt đa cc mẫu đã pha loãng trên môi trường cha bt PE

(polyethylen) và PEG 400 là nguồn cacbon, có thành phần (g/l) như sau: K2HPO4 1, MgSO4.7H2O

0,5 KCl 1, NaNO3 2, PE 10, PEG 400 10; H2O b sung đn 1000 ml, môi trường thch b sung

thêm 18g agar. Ủ đa ở 35oC trong 7-10 ngày. Chọn lọc các khun lc riêng rẽ đ đnh gi kh

năng phân hủy nhựa [2].

2.2.2. Định danh các chủng

Các chủng đã phân lp đưc chp nh khun lc trên đa thch, nh t bào trên kính hin vi đin

TNU Journal of Science and Technology

230(01): 40 - 47

http://jst.tnu.edu.vn 42 Email: jst@tnu.edu.vn

t quét (SEM) và mô t hình thái khun lc, t bo đ thy sự khác bit.

Các chủng có kh năng phân hủy nhựa đưc định danh bằng phương php gii trình tự đon

gen 16S rRNA. Các khun lc đã tinh sch đưc s dng đ tách DNA tng số bằng kit Genomic

DNA Extraction. Cht lưng ADN tng số đưc kim tra bằng đin di trên gel agarose 1% trong

đm TAE 1X. Cc đon ADN tng số đưc s dng lm khuôn đ nhân đon gen 16S rRNA.

Thành phần phn ng PCR (l): ADN tng số 1; Mastermix 2x 12,5; Primer 27f (AGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG) và 1492R (GGTTACCTTGTTACGA CTT) 1/1; dH2O 9,5. Chu trình nhit của

phn ng nhân đon gen 16S rRNA (khong 1.500 bp) như sau: 95oC - 10 phút; 35 chu kỳ (95oC -

1 phút, 55oC - 1 phút, 72oC - 2 phút), 72oC - 7 phút; gi nhit đ ở 4oC sau khi phn ng kt thúc

[12]-[14]. Các sn phm PCR đưc làm sch và gii trình tự đon gen 16S rRNA trên thit bị

iSeq100 (Illumina). Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh đưc so sánh vi ngân hàng d liu gen của

NCBI bằng cách s dng công c BLAST v đăng ký mã số trên GenBank. Trình tự đon 16S

rRNA của các chủng phân lp và chủng có quan h gần gũi đưc s dng đ xây dựng cây phát

sinh chủng loi dựa trên phần mm Clustal W.

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng

- Các yu tố như nhit đ, pH nh hưởng đn kh năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn

đưc đnh gi bằng cách nuôi cy trên môi trường cha PEG (nguồn cacbon duy nht) ở di nhit

đ 20, 25, 30, 35, 40, 45oC (pH cố định là 7) hoặc di pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 (nhit đ cố định là 35oC).

Đnh gi kh năng sinh trưởng thông qua vic đo đ đc ở bưc sóng 600 nm (OD600).

- Kh năng sinh enzyme thủy phân tinh bt, protein, xenlulo đưc đnh gi thông qua vic đo

vòng phân gii khi nuôi cy chủng trên cc môi trường cha cc cơ cht tinh bt, CMC và gelatin

tương ng. Sau 48h, nhum vi cơ cht tương ng là dung dịch lugol 1%, dung dịch đỏ Conggo

1% và dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa. Vòng phân gii đưc tính l đường kính vòng phân gii (D,

mm) trừ đi đường kính khun lc (d, mm).

2.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy nhựa

Kh năng phân hủy nhựa đưc đnh gi thông qua nuôi cy các chủng có kh năng phân hủy

nhựa trên nguồn cơ cht là nhựa PET, PE và nuôi lắc ở điu kin tốt nht. Sau 60 ngày, ly ming

nhựa ra ra sch sinh khối v lm khô. Cân lưng nhựa còn li và so sánh vi lưng nhựa ban đầu

[15]. Kh năng phân hủy còn đưc đnh gi thông qua quan st b mặt màng trên kính hin vi đin

t SEM, đo đ bn kéo, đ dãn dài và ph FTIR của màng sau quá trình phân hủy [15].

2.2.5. Phân tích phổ FTIR

Các mẫu nhựa trưc và sau phân hủy đưc phân tích cu trúc ph trên máy quang ph hồng

ngoi bin đi bằng máy FTIR Spectrum Two (Anh) của Vin Hóa học vt liu đ xc định các

nhóm chc trong phân t bị thay đi trong quá trình phân hủy. Ph IR đưc đọc từ bưc sóng 400-

4000 cm-1 vi khong cách 4 cm-1 trong áp sut chân không.

2.2.6. Quan sát bề mặt trên kính hiển vi điện tử quét

Các mẫu màng nhựa trưc và sau khi phân hủy đưc ra sch sinh khối và quan sát b mặt dưi

kính hin vi đin t quét Hitachi 4800 ti Vin Khoa học Vt liu (Vin Hàn lâm Khoa học và

Công ngh Vit Nam).

2.2.7. Đo độ bền kéo và độ dãn dài của màng

Đ bn kéo v đ dãn dài của màng nhựa PE, PET trưc và sau khi phân hủy đưc đo đ đnh

giá sự thay đi v tính cht vt lý của màng [15]. Phép đo đưc thực hin ti Vin Khoa học vt

liu (Vin Hàn lâm Khoa học và Công ngh Vit Nam). Các chỉ tiêu đưc phân tích trên Máy phân

tích cơ lý đa năng GOTECH AI-7000M, theo tiêu chun ASTM D882.

2.2.8. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của chủng

TNU Journal of Science and Technology

230(01): 40 - 47

http://jst.tnu.edu.vn 43 Email: jst@tnu.edu.vn

Kh năng phân hủy sinh học đưc đnh gi theo TCVN 9494:2012 [16] thông qua vic xc định

sự thay đi khối lưng nhựa v lưng CO2 to thành trong quá trình phân hủy bởi vi sinh vt (VSV).

3. Kết quả

3.1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa

Từ các mẫu đt thu thp đưc từ các vị trí ô nhiễm cht thi nhựa, 6 chủng VSV có kh năng

sinh trưởng trên môi trường cha PEG 400 và PE là nguồn cacbon đưc phân lp và ký hiu lần

lưt là PE13, PE20, PEX3, PETBs, PET6, PETG1. Các chủng ny đưc nuôi cy riêng rẽ và s

dng đ đnh gi kh năng phân hủy nhựa PE, PET. Kt qu trình bày trên Bng 1 cho thy chủng

PEX3 có kh năng phân hủy PE và chủng PETBs có kh năng phân hủy PET cao hơn (c sự gim

khối lưng nhựa nhiu hơn) nên đưc chọn đ phân loi bằng quan sát hình thái khun lc, t bào

v định danh bằng gii trình tự đon gen 16S rRNA.

Bảng 1. Kết quả đánh giá khả năng phân hủy nhựa PE, PET của các chủng phân lập được

Tên chủng

% giảm với nhựa PE

% giảm với nhựa PET

m1 (mg)

m2 (mg)

% phân hủy

m1 (mg)

m2 (mg)

% phân hủy

PETBs

98,3

97,8

0,51

80,8

79,3

1,86

PE13

86,3

85,9

0,46

83,2

82,8

0,48

PE20

89,2

88,9

0,34

85,4

84,9

0,59

PEX3

95,4

94,2

1,26

88,1

87,7

0,45

PET6

85,1

84,9

0,24

84,4

83,9

0,59

PETG1

89,2

88,9

0,34

96,1

95,7

0,42

Ghi chú: m1: khối lượng ban đầu; m2: khối lượng sau phân hủy.

3.2. Định danh các chủng phân hủy nhựa

Hình 1. Hình ảnh tế bào và khuẩn lạc của 2 chủng

PEX3 và PETBs

Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng

phân lập được và các chủng liên quan gần gũi

Hình thái khun lc 2 chủng lựa chọn đưc quan st trên đa thch, hình thái t bo đưc làm

tiêu bn v quan st dưi kính hin vi đin t quét (SEM) vi đ phng đi 5000 lần. Hình thái

khun lc và t bo đưc th hin trên Hình 1. Sau khi gii trình tự đon gen 16S rRNA, 2 chủng

PEX3 và PETBs đu thuc chi Bacillus, trong đ chủng PEX3 có trình tự đon gen 16S rRNA

tương đồng 99,3% vi các chủng thuc chi Bacillus như B. stercoris D7XPN1, B. subtilis BCRC

10255, B. subtilis JCM 1465 nên đưc đặt tên là Bacillus sp. PEX3. Chủng PETBs có trình tự đon

gen 16S rRNA tương đồng 99,75% vi các chủng thuc loài Bacillus subtilis như B. subtilis BCRC

10255, NBRC 13719, DSM10 nên đưc đặt tên là Bacillus subtilis PETBs. Các chủng phân hủy

TNU Journal of Science and Technology

230(01): 40 - 47

http://jst.tnu.edu.vn 44 Email: jst@tnu.edu.vn

nhựa thuc chi Bacillus cũng đã đưc công bố [2], [15]. C 2 chủng PEX3 v PETBs đã đưc đăng

ký trình tự gen 16S rRNA trên GenBank vi mã số tương ng là PP564737 và PP564738. Cây phát

sinh chủng loi của 2 chủng này và các chủng liên quan gần gũi dưc trình bày trên Hình 2.

3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn

Cc đặc đim sinh học như kh năng sinh enzyme ngoi bào thủy phân tinh bt, CMC, protein

cùng như nhit đ và pH tối ưu đưc trình bày trên Bng 2, Bng 3. Kt qu trình bày trên Bng 2

cho thy c 2 chủng đu có nhit đ sinh trưởng tốt nht là 35oC, pH 7, có th sinh trưởng ở di

nhit đ từ 25-45oC, pH từ 5-9. C 2 chủng đu có kh năng sinh enzyme thủy phân c tinh bt,

CMC, protein vi hot tính khác nhau (Bng 3). Chủng PETBs có kh năng sinh enzyme thủy phân

các cht tinh bt, protein, CMC cao hơn so vi chủng PEX3. Trong nhiu nghiên cu đã chng

minh, chủng có kh năng thủy phân cc cơ cht tinh bt, protein v CMC cũng c kh năng phân

hủy hp cht nhựa tng hp như PE, PP, PET [13], [14].

Bảng 2. Điều kiện sinh trưởng tốt nhất của 2 chủng PEX3 và PETBs

Nhiệt độ (oC)

Chủng PEX3

(OD600)

Chủng PETBs

(OD600)

Chủng PEX3

(OD600)

Chủng PETBs

(OD600)

0,873

0,892

0,884

0,762

1,231

1,328

1,368

1,435

1,642

1,763

1,893

1,963

1,102

1,218

1,268

1,321

0,535

0,542

0,878

0,842

Bảng 3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng

Đường kính vòng phân giải (D-d) (mm)

Chủng PEX3

Chủng PETBs

Hot tính phân hủy tinh bt

Hot tính phân hủy protein

17,8

Hot tính phân hủy CMC

14,5

16,4

3.4. Khả năng phân hủy nhựa PET, PE của các chủng

Kh năng phân hủy nhựa PET và PE của các chủng đưc đnh gi thông qua sự thay đi b mặt

màng, cu trúc ph FTIR và sự thay đi v khối lưng sau khi nuôi cy ở phòng thí nghim. Kt

qu phân tích ph FTIR cho thy c 2 mẫu PE, PET sau khi phân hủy có xut hin 1 số peak giống

và khác so vi ban đầu (Hình 3), chng tỏ đã c sự thay đi trong cu trúc màng. Tuy nhiên, vì tốc

đ phân hủy sinh học rt chm nên vẫn còn cc peak như ban đầu (chưa bị phân hủy). Hình nh

quan sát b mặt mng cũng cho thy có sự thay đi rõ rt gia mng trưc và sau phân hủy (Hình

4). Tuy nhiên, màng PE thy có sự thay đi rõ rng hơn v cu trúc b mặt chng tỏ có sự phân

hủy trên b mặt nhiu hơn. Tuy nhiên, cần xc định sự thay đi v khối lưng (theo % khối lưng

ban đầu). Kt qu đnh gi kh năng phân hủy v khối lưng trên Bng 4 cho thy nhựa PE bị phân

hủy 4,08% sau 60 ngày và màng PET bị phân hủy khong 3,97% sau 60 ngày x lý vi các chủng

PEX3 v PETBs tương ng. Kt qu ny l tương đương so vi mt số nghiên cu trưc đây v

kh năng phân hủy màng nhựa tng hp [2], [13], [15].

Bảng 4. Khả năng phân hủy nhựa PE, PET sau 60 ngày

Ban đầu (mg)

Sau 60 ngày (mg)

% phân hủy

Nhựa PE

98,1

94,1

4,08

Nhựa PET

85,7

82,3

3,97

Đ khẳng định v kh năng phân hủy sinh học, mng PE, PET trưc và sau x lý còn đưc đnh

giá sự thay đi v đ bn kéo, đô dãn di của màng phn ánh bn cht của sự phân hủy màng. Kt

qu trình bày trên Bng 4 cho thy màng PE gim đ bn kéo từ 17,2 xuống con 12,6 Mpa v đ

dãn dài gim từ 4,8 xuống còn 3,2%. Màng PET có sự thay đi ít hơn, đ bn kéo gim từ 6,8

xuống 6,2 Mpa v đ dãn dài gim từ 3,1 xuống còn 2,5%.

Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa tổng hợp từ các mẫu đất ở Việt Nam

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi