TNU Journal of Science and Technology
230(01): 40 - 47
http://jst.tnu.edu.vn 40 Email: jst@tnu.edu.vn
ISOLATION OF SOME PLASTIC-DEGRADING BACTERIAL STRAINS
FROM SOIL SAMPLES IN VIETNAM
Nguyen Thi Tam Thu1*, To Lan Anh1, Nguyen Thi Kim Linh2, Pham Kien Cuong1
1Institute of New Technology/ Academy of Military Science and Technology
2Northern Mountainous Agriculture and Foretry Science Institute - NOMAFSI
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
23/6/2024
Plastics are materials that are widely used in various applications,
especially food packaging. However, these synthetic polymers such as
PE, PET were synthesized from fossil fuels that are very difficult to
degrade naturally and cause serious environmental pollution. One
promising and safe solution to handle this problem is using
microorganisms for plastic biodegradation. Natural microorganisms
show the potential ability to degrade many persistent and toxic
pollutants such as dioxin as well as other inert compounds. In this
study, two strains capable of degrading PE and PET plastics were
reported for their biological properties and biodegradability of these
plastics. Both strains were identified to belong to genus Bacillus and
showed the ability to grow well at 35oC, pH 7 as well as to degrade
protein, starch, cellulose. However, the decomposition of PE and PET
plastic efficiency only reached 4% respectively in 60 days based on
imaging the film surface using a scanning electron microscope, FTIR
spectrum, weight loss and changes in tensile strength and elongation.
Revised:
16/10/2024
Published:
17/10/2024
KEYWORDS
Microorganisms
PE plastic
Bacillus
Biodegradation
Persistant
PHÂN LẬP MT S CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA
TỔNG HỢP TỪ CC MU ĐT VIT NAM
Nguyễn Thị Tâm Thư1*, Tô Lan Anh1, Nguyễn Thị Kim Linh2, Phạm Kiên Cường1
1Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học và Công nghệ quân sự
2Viện Khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
23/6/2024
Nhựa l nguyên liu đưc s dng ph bin hin nay trong nhiu lnh
vực khc nhau đin hnh như sn xut bao gi thực phm. Tuy nhiên,
cc loi polyme tng hp ny (như PET - Polyethylene terephthalate,
PE-polyethylene), có nguồn gốc dầu mỏ rt khó phân hủy trong điu
kin tự nhiên và gây ô nhiễm môi trường trầm trọng. Mt trong nhng
gii php an ton, tim năng đưc quan tâm nht hin nay đ ng ph
vi tnh trng ny l s dng vi sinh vt trong phân hủy nhựa. Nhiu
vi sinh vt cho thy kh năng ưu vit trong vic phân hủy các cht gây
ô nhiễm khó phân hủy v đc hi như dioxin v nhiu hp cht trơ
khác. Trong nghiên cu này, hai chủng có kh năng phân hủy nhựa PE,
PET đưc công bố v đặc tính sinh học và kh năng phân hủy sinh học
2 loi nhựa này. Kt qu cho thy c 2 chủng đu thuc chi Bacillus, có
kh năng sinh trưởng tốt ở 35oC, pH 7, có hot tính phân hủy các hp
cht như protein, tinh bt và cellulose. Tuy nhiên, hiu sut phân hủy
nhựa PE, PET chỉ đt 4% tương ng trong thời gian 60 ngày. Kh năng
phân hủy của nhựa PE, PET sau khi phân hủy đưc đnh gi thông qua
chp nh b mặt màng bằng kính hin vi đin t quét, ph FTIR, sự
gim khối lưng và sự thay đi đ bn kéo, đ dãn dài.
Ngày hoàn thiện:
16/10/2024
Ngày đăng:
17/10/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10653
* Corresponding author. Email: thu.3t.cnm@gmail.com
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 40 - 47
http://jst.tnu.edu.vn 41 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ hay nhựa tng hp c ưu đim là trọng lưng nhẹ, chi phí
thp, kh năng định hình dễ nên chúng đưc ng dng trong rt nhiu lnh vực như bao b, cc vt
dng sinh hot hàng ngày. Ngày nay, nhựa tng hp ngày càng phát trin v đưc s dng nhiu
làm các vt dng dùng 1 lần (túi nilon, ống hút, cốc, chai lọ…). Do đ, lưng rác thi do nhựa sinh
ra ngày càng ln. Do nhựa tng hp là các hp cht trơ rt khó phân hủy trong tự nhiên, có nhiu
loi nhựa mt hng trăm đn hng nghn năm đ phân hủy hon ton. Lưng rác thi nhựa không
chỉ gây mt mỹ quan mà còn gây xi mòn đt, ô nhiễm bin v đi dương. Vi sinh vt thường tương
tác vi các yu tố phi sinh học, chẳng hn như nhit v nh sng, đ thay đi cu trúc polyme, giúp
tăng kh năng phân gii của các enzyme [1]. Nhựa đưc phân hủy sinh học bởi vi khun, nm và
to đưc tìm thy trong nưc rỉ bãi rác, bùn thi và phân hu cơ. Nhng vi sinh vt này sinh tng
hp các enzyme có kh năng phân hủy c polyme tự nhiên và tng hp [2]. Hầu ht các vi khun
có kh năng phân huỷ nhựa là các vi khun ưa nhit, vi nhit đ tối ưu l 30 - 60°C. Tuy nhiên,
do trong tự nhiên chúng phân bố ri rc trong đt, nưc, không khí, điu kin sống chưa tối ưu nên
chưa pht huy ht kh năng tim tàng của chúng. Đ thúc đy nhanh quá trình phân hủy các cht
hu cơ trong điu kin nht định, các vi sinh vt cần tuyn chọn, nuôi cy ở cc điu kin tối ưu
đ chúng sinh lưng ln sinh khối, sau đ đưa ra môi trường dưi dng kích thích hoặc tăng cường
sinh học đ chúng phát trin tốt nht và phân hủy các cht trơ, kh phân hủy. Trên th gii đã c
mt số công bố v kh năng phân hủy các thành phần nhựa khác nhau (PE, PP, HDPE, LDPE) bởi
mt số nhóm vi sinh vt ở các tốc đ khác nhau. Chủng Pseudomonas fluorescens phân hủy 18%
PE trong 270 ngày [3]. Chủng Bacillus vallismortis phân hủy LDPE vi tỷ l 75% trong 120 ngày
[2], [4], [5]. Các chủng Klebsiella pneumonia CH001 và Aspergillus flavus phân hủy HDPE vi tỷ
l 18,4 v 5,5% trong 60 v 100 ngy tương ng [6], [7]. Các chủng có kh năng phân hủy LDPE
vi hiu sut 5,13 - 36,4% trong 45 đn 112 ngày gồm các chi Bacillus cereus A5, Aspergillus
oryzae A5, Trichoderma viride RH3, A. nominus RH06, B. siamensis [2], [5], [8]-[10]. Chi
Pseudomonas có kh năng phân hủy nhiu loi nhựa khác nhau vi tốc đ khc nhau như
Pseudomonas sp. AKS2 phân hủy 15 mg LDPE trong 45 ngày mà không cần quá trình tin x lý,
phân hủy 1,65 mg PES/ngày [11].
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu, hóa chất
Các mẫu đt trong khu vực cha cht thi nhựa tng hp (khu bãi rc) đang bị phân hủy ti Vân
Ni, Đông Anh (H Ni).
Các hóa cht dùng cho nuôi cy vi sinh vt như cc cht khoáng, nguồn cacbon dùng đ phân
lp là bt PE (polyethylene), PEG 400 (polyethylenglycol có khối lưng phân t 400) nguồn nito
đu có nguồn gốc từ Sigma, Trung Quốc.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa
Từ các mẫu đt ti khu vực có cht thi nhựa đang phân hủy, ly 10g đt hòa trong 100 ml nưc
muối sinh lý (nồng đ NaCl 0,85%) vô trùng. Trn đu và tin hành pha loãng mẫu theo dãy thp
phân đn nồng đ 10-3, 10-4. Tin hành gt đa cc mẫu đã pha loãng trên môi trường cha bt PE
(polyethylen) và PEG 400 là nguồn cacbon, có thành phần (g/l) như sau: K2HPO4 1, MgSO4.7H2O
0,5 KCl 1, NaNO3 2, PE 10, PEG 400 10; H2O b sung đn 1000 ml, môi trường thch b sung
thêm 18g agar. Ủ đa ở 35oC trong 7-10 ngày. Chọn lọc các khun lc riêng rẽ đ đnh gi kh
năng phân hủy nhựa [2].
2.2.2. Định danh các chủng
Các chủng đã phân lp đưc chp nh khun lc trên đa thch, nh t bào trên kính hin vi đin
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 40 - 47
http://jst.tnu.edu.vn 42 Email: jst@tnu.edu.vn
t quét (SEM) và mô t hình thái khun lc, t bo đ thy sự khác bit.
Các chủng có kh năng phân hủy nhựa đưc định danh bằng phương php gii trình tự đon
gen 16S rRNA. Các khun lc đã tinh sch đưc s dng đ tách DNA tng số bằng kit Genomic
DNA Extraction. Cht lưng ADN tng số đưc kim tra bằng đin di trên gel agarose 1% trong
đm TAE 1X. Cc đon ADN tng số đưc s dng lm khuôn đ nhân đon gen 16S rRNA.
Thành phần phn ng PCR (l): ADN tng số 1; Mastermix 2x 12,5; Primer 27f (AGAGTTTGA
TCCTGGCTCAG) và 1492R (GGTTACCTTGTTACGA CTT) 1/1; dH2O 9,5. Chu trình nhit của
phn ng nhân đon gen 16S rRNA (khong 1.500 bp) như sau: 95oC - 10 phút; 35 chu kỳ (95oC -
1 phút, 55oC - 1 phút, 72oC - 2 phút), 72oC - 7 phút; gi nhit đ ở 4oC sau khi phn ng kt thúc
[12]-[14]. Các sn phm PCR đưc làm sch và gii trình tự đon gen 16S rRNA trên thit bị
iSeq100 (Illumina). Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh đưc so sánh vi ngân hàng d liu gen của
NCBI bằng cách s dng công c BLAST v đăng ký mã số trên GenBank. Trình tự đon 16S
rRNA của các chủng phân lp và chủng có quan h gần gũi đưc s dng đ xây dựng cây phát
sinh chủng loi dựa trên phần mm Clustal W.
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng
- Các yu tố như nhit đ, pH nh hưởng đn kh năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn
đưc đnh gi bằng cách nuôi cy trên môi trường cha PEG (nguồn cacbon duy nht) ở di nhit
đ 20, 25, 30, 35, 40, 45oC (pH cố định là 7) hoặc di pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 (nhit đ cố định là 35oC).
Đnh gi kh năng sinh trưởng thông qua vic đo đ đc ở bưc sóng 600 nm (OD600).
- Kh năng sinh enzyme thủy phân tinh bt, protein, xenlulo đưc đnh gi thông qua vic đo
vòng phân gii khi nuôi cy chủng trên cc môi trường cha cc cơ cht tinh bt, CMC và gelatin
tương ng. Sau 48h, nhum vi cơ cht tương ng là dung dịch lugol 1%, dung dịch đỏ Conggo
1% và dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa. Vòng phân gii đưc tính l đường kính vòng phân gii (D,
mm) trừ đi đường kính khun lc (d, mm).
2.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy nhựa
Kh năng phân hủy nhựa đưc đnh gi thông qua nuôi cy các chủng có kh năng phân hủy
nhựa trên nguồn cơ cht là nhựa PET, PE và nuôi lắc ở điu kin tốt nht. Sau 60 ngày, ly ming
nhựa ra ra sch sinh khối v lm khô. Cân lưng nhựa còn li và so sánh vi lưng nhựa ban đầu
[15]. Kh năng phân hủy còn đưc đnh gi thông qua quan st b mặt màng trên kính hin vi đin
t SEM, đo đ bn kéo, đ dãn dài và ph FTIR của màng sau quá trình phân hủy [15].
2.2.5. Phân tích phổ FTIR
Các mẫu nhựa trưc và sau phân hủy đưc phân tích cu trúc ph trên máy quang ph hồng
ngoi bin đi bằng máy FTIR Spectrum Two (Anh) của Vin Hóa học vt liu đ xc định các
nhóm chc trong phân t bị thay đi trong quá trình phân hủy. Ph IR đưc đọc từ bưc sóng 400-
4000 cm-1 vi khong cách 4 cm-1 trong áp sut chân không.
2.2.6. Quan sát bề mặt trên kính hiển vi điện tử quét
Các mẫu màng nhựa trưc và sau khi phân hủy đưc ra sch sinh khối và quan sát b mặt dưi
kính hin vi đin t quét Hitachi 4800 ti Vin Khoa học Vt liu (Vin Hàn lâm Khoa học và
Công ngh Vit Nam).
2.2.7. Đo độ bền kéo và độ dãn dài của màng
Đ bn kéo v đ dãn dài của màng nhựa PE, PET trưc và sau khi phân hủy đưc đo đ đnh
giá sự thay đi v tính cht vt lý của màng [15]. Phép đo đưc thực hin ti Vin Khoa học vt
liu (Vin Hàn lâm Khoa học và Công ngh Vit Nam). Các chỉ tiêu đưc phân tích trên Máy phân
tích cơ lý đa năng GOTECH AI-7000M, theo tiêu chun ASTM D882.
2.2.8. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của chủng
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 40 - 47
http://jst.tnu.edu.vn 43 Email: jst@tnu.edu.vn
Kh năng phân hủy sinh học đưc đnh gi theo TCVN 9494:2012 [16] thông qua vic xc định
sự thay đi khối lưng nhựa v lưng CO2 to thành trong quá trình phân hủy bởi vi sinh vt (VSV).
3. Kết quả
3.1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa
Từ các mẫu đt thu thp đưc từ các vị trí ô nhiễm cht thi nhựa, 6 chủng VSV có kh năng
sinh trưởng trên môi trường cha PEG 400 và PE là nguồn cacbon đưc phân lp và ký hiu lần
lưt là PE13, PE20, PEX3, PETBs, PET6, PETG1. Các chủng ny đưc nuôi cy riêng rẽ và s
dng đ đnh gi kh năng phân hủy nhựa PE, PET. Kt qu trình bày trên Bng 1 cho thy chủng
PEX3 có kh năng phân hủy PE và chủng PETBs có kh năng phân hủy PET cao hơn (c sự gim
khối lưng nhựa nhiu hơn) nên đưc chọn đ phân loi bằng quan sát hình thái khun lc, t bào
v định danh bằng gii trình tự đon gen 16S rRNA.
Bảng 1. Kết quả đánh giá khả năng phân hủy nhựa PE, PET của các chủng phân lập được
TT
Tên chủng
% giảm với nhựa PE
% giảm với nhựa PET
m1 (mg)
m2 (mg)
% phân hủy
m1 (mg)
m2 (mg)
% phân hủy
1.
PETBs
98,3
97,8
0,51
80,8
79,3
1,86
2.
PE13
86,3
85,9
0,46
83,2
82,8
0,48
3.
PE20
89,2
88,9
0,34
85,4
84,9
0,59
4.
PEX3
95,4
94,2
1,26
88,1
87,7
0,45
5.
PET6
85,1
84,9
0,24
84,4
83,9
0,59
6.
PETG1
89,2
88,9
0,34
96,1
95,7
0,42
Ghi chú: m1: khối lượng ban đầu; m2: khối lượng sau phân hủy.
3.2. Định danh các chủng phân hủy nhựa
Hình 1. Hình ảnh tế bào và khuẩn lạc của 2 chủng
PEX3 và PETBs
Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng
phân lập được và các chủng liên quan gần gũi
Hình thái khun lc 2 chủng lựa chọn đưc quan st trên đa thch, hình thái t bo đưc làm
tiêu bn v quan st dưi kính hin vi đin t quét (SEM) vi đ phng đi 5000 lần. Hình thái
khun lc và t bo đưc th hin trên Hình 1. Sau khi gii trình tự đon gen 16S rRNA, 2 chủng
PEX3 và PETBs đu thuc chi Bacillus, trong đ chủng PEX3 có trình tự đon gen 16S rRNA
tương đồng 99,3% vi các chủng thuc chi Bacillus như B. stercoris D7XPN1, B. subtilis BCRC
10255, B. subtilis JCM 1465 nên đưc đặt tên là Bacillus sp. PEX3. Chủng PETBs có trình tự đon
gen 16S rRNA tương đồng 99,75% vi các chủng thuc loài Bacillus subtilis như B. subtilis BCRC
10255, NBRC 13719, DSM10 nên đưc đặt tên là Bacillus subtilis PETBs. Các chủng phân hủy
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 40 - 47
http://jst.tnu.edu.vn 44 Email: jst@tnu.edu.vn
nhựa thuc chi Bacillus cũng đã đưc công bố [2], [15]. C 2 chủng PEX3 v PETBs đã đưc đăng
ký trình tự gen 16S rRNA trên GenBank vi mã số tương ng là PP564737 và PP564738. Cây phát
sinh chủng loi của 2 chủng này và các chủng liên quan gần gũi dưc trình bày trên Hình 2.
3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn
Cc đặc đim sinh học như kh năng sinh enzyme ngoi bào thủy phân tinh bt, CMC, protein
cùng như nhit đ và pH tối ưu đưc trình bày trên Bng 2, Bng 3. Kt qu trình bày trên Bng 2
cho thy c 2 chủng đu có nhit đ sinh trưởng tốt nht là 35oC, pH 7, có th sinh trưởng ở di
nhit đ từ 25-45oC, pH từ 5-9. C 2 chủng đu có kh năng sinh enzyme thủy phân c tinh bt,
CMC, protein vi hot tính khác nhau (Bng 3). Chủng PETBs có kh năng sinh enzyme thủy phân
các cht tinh bt, protein, CMC cao hơn so vi chủng PEX3. Trong nhiu nghiên cu đã chng
minh, chủng có kh năng thủy phân cc cơ cht tinh bt, protein v CMC cũng c kh năng phân
hủy hp cht nhựa tng hp như PE, PP, PET [13], [14].
Bảng 2. Điều kiện sinh trưởng tốt nhất của 2 chủng PEX3 và PETBs
Nhiệt độ (oC)
Chủng PEX3
(OD600)
Chủng PETBs
(OD600)
pH
Chủng PEX3
(OD600)
Chủng PETBs
(OD600)
25
0,873
0,892
5
0,884
0,762
30
1,231
1,328
6
1,368
1,435
35
1,642
1,763
7
1,893
1,963
40
1,102
1,218
8
1,268
1,321
45
0,535
0,542
9
0,878
0,842
Bảng 3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng
Đường kính vòng phân giải (D-d) (mm)
Chủng PEX3
Chủng PETBs
Hot tính phân hủy tinh bt
18
22
Hot tính phân hủy protein
16
17,8
Hot tính phân hủy CMC
14,5
16,4
3.4. Khả năng phân hủy nhựa PET, PE của các chủng
Kh năng phân hủy nhựa PET và PE của các chủng đưc đnh gi thông qua sự thay đi b mặt
màng, cu trúc ph FTIR và sự thay đi v khối lưng sau khi nuôi cy ở phòng thí nghim. Kt
qu phân tích ph FTIR cho thy c 2 mẫu PE, PET sau khi phân hủy có xut hin 1 số peak giống
và khác so vi ban đầu (Hình 3), chng tỏ đã c sự thay đi trong cu trúc màng. Tuy nhiên, vì tốc
đ phân hủy sinh học rt chm nên vẫn còn cc peak như ban đầu (chưa bị phân hủy). Hình nh
quan sát b mặt mng cũng cho thy có sự thay đi rõ rt gia mng trưc và sau phân hủy (Hình
4). Tuy nhiên, màng PE thy có sự thay đi rõ rng hơn v cu trúc b mặt chng tỏ có sự phân
hủy trên b mặt nhiu hơn. Tuy nhiên, cần xc định sự thay đi v khối lưng (theo % khối lưng
ban đầu). Kt qu đnh gikh năng phân hủy v khối lưng trên Bng 4 cho thy nhựa PE bị phân
hủy 4,08% sau 60 ngày và màng PET bị phân hủy khong 3,97% sau 60 ngày x lý vi các chủng
PEX3 v PETBs tương ng. Kt qu ny l tương đương so vi mt số nghiên cu trưc đây v
kh năng phân hủy màng nhựa tng hp [2], [13], [15].
Bảng 4. Khả năng phân hủy nhựa PE, PET sau 60 ngày
Ban đầu (mg)
Sau 60 ngày (mg)
% phân hủy
Nhựa PE
98,1
94,1
4,08
Nhựa PET
85,7
82,3
3,97
Đ khẳng định v kh năng phân hủy sinh học, mng PE, PET trưc và sau x lý còn đưc đnh
giá sự thay đi v đ bn kéo, đô dãn di của màng phn ánh bn cht của sự phân hủy màng. Kt
qu trình bày trên Bng 4 cho thy màng PE gim đ bn kéo từ 17,2 xuống con 12,6 Mpa v đ
dãn dài gim từ 4,8 xuống còn 3,2%. Màng PET có sự thay đi ít hơn, đ bn kéo gim từ 6,8
xuống 6,2 Mpa v đ dãn dài gim từ 3,1 xuống còn 2,5%.