Quá trình phát triển chi của động vật bốn chân

Chia sẻ: Nguyễn Tấn Đạt | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu "Quá trình phát triển chi của động vật bốn chân" cung cấp cho người đọc các nội dung kiến thức như: Các vị trí mà các chi nhô ra khỏi trục cơ thể phụ thuộc vào sự biểu hiện của gene Hox; trục gần-xa của chi đang phát triển được bắt đầu bởi sự cảm ứng của ngoại bì ở ranh giới lưng-bụng; các mô hình kiểu Turing gợi ý rằng cơ chế phản ứng - khuếch tán có thể giải thích mẫu hình không đổi của stylopod-zeugopod-autopod được thấy ở các chi của động vật bốn chân;...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Quá trình phát triển chi của động vật bốn chân

SỰ PHÁT TRIỂN CHI CỦA ĐỘNG VẬT BỐN CHÂN HÃY XEM XÉT CHÂN TAY CỦA BẠN. Nó có các ngón tay hoặc ngón chân ở một đầu, xương cánh tay hoặc xương đùi ở đầu kia. Bạn sẽ không tìm thấy bất kỳ ai có ngón tay ở giữa cánh tay của họ. Cũng nên xem xét sự khác biệt tinh tế nhưng rõ ràng giữa bàn tay và bàn chân của bạn. Nếu ngón tay của bạn được thay thế bằng ngón chân, bạn chắc chắn sẽ biết điều đó. Bất chấp những khác biệt này, xương bàn chân của bạn tương tự như xương bàn tay của bạn. Dễ dàng nhận thấy rằng chúng có chung một khuôn mẫu. Và cuối cùng, hãy nhận thấy rằng cả hai bàn tay của bạn có kích thước tương tự nhau, cũng như cả hai bàn chân của bạn. Những hiện tượng phổ biến này đặt ra những câu hỏi hấp dẫn đối với nhà sinh học phát triển. Làm thế nào mà động vật có xương sống có bốn chi mà không phải sáu hoặc tám ? Làm thế nào mà ngón út phát triển ở một cạnh của chi và ngón cái ở bên kia ? Làm thế nào để chi trước phát triển khác với chi sau ? Làm thế nào kích thước chi có thể được điều chỉnh chính xác như vậy ? Có một bộ cơ chế phát triển được bảo tồn nào có thể giải thích tại sao bàn tay của chúng ta có năm ngón, cánh gà có ba ngón và móng ngựa một ngón không ? Tổng quan Được thiết kế để vận động trên cạn, tứ chi có khớp nối giữa các xương và một bộ ngón ở đầu xa của chúng. Chi bắt đầu như là một “nụ” mô ở các mặt của phôi khi các tế bào từ trung bì khúc cơ và trung bì tấm bên đang phát triển di chuyển đến và tăng sinh trong trường chi giả định, trung mô chi. “Vùng tiến triển” có tính tăng sinh này được bao phủ bởi ngoại bì, với sự dày lên ở đầu xa được gọi là gờ ngoại bì đỉnh. Tín hiệu Fgf8 từ gờ ngoại bì này đối kháng với axit retinoic có nguồn gốc từ cạnh sườn, bắt đầu một vòng phản hồi dương tính với tín hiệu trung mô (Fgf10 và Wnt) để thúc đẩy nụ chi phát triển. Fgf8 chỉ định trung mô phía sau thành “vùng hoạt động phân cực”, vùng này tiết ra Shh để thiết lập trục trước-sau (ngón cái- út) của chi. Tín hiệu Wnt xác định trục lưng-bụng (mu bàn tay-lòng bàn tay). Quá trình tạo xương được kiểm soát bởi một mô hình tự tổ chức “kiểu Turing” thông qua các tương tác của các chất tạo hình thái. Ở một số loài động vật, mô màng sơ khai giữa các ngón vẫn còn được giữ lại; ở những loài khác, nó chết thông qua quá trình apoptosis qua trung gian BMP. Mỗi hệ thống tín hiệu chi ảnh hưởng
đến sự biểu hiện khác biệt của các gene Hox dọc theo mỗi trục, việc sửa đổi chúng hỗ trợ sự phát triển của vây thành các ngón tay. Giải phẫu chi Như tên gọi, động vật có xương sống bốn chi (lưỡng cư, bò sát, chim và động vật có vú). Xương của bất kỳ chi của động vật bốn chân nào — có thể là cánh tay hoặc chân, cánh hoặc chân chèo — xét đến một styopod ở gần (xương cánh tay / xương đùi) liền kề với thành cơ thể, một zeugopod (trụ-quay / chày-mác) ở vùng giữa và một autopod ở xa (cổ tay-ngón tay / cổ chân-ngón chân) 1 (HÌNH 1). Ngón tay và ngón chân có thể được gọi là các đốt ngón (phalange) hoặc nói chung hơn là ngón (digit). Thông tin vị trí cần thiết để tạo ra một chi phải hoạt động trong một hệ tọa độ ba chiều 2: 1 Những thuật ngữ này có thể khó nhớ, nhưng biết nguồn gốc từ của chúng có thể hữu ích. Stylo = như một cây cột; zeugo = khớp nối; auto = bản thân; pod = chân 2 Thực tế, nó là một hệ bốn chiều, trong đó thời gian là trục thứ tư. Các nhà sinh học phát triển đã quen với việc nhìn thiên nhiên trong bốn chiều.
• Chiều đầu tiên là trục gần-xa (“gần-xa”; nghĩa là từ vai tới ngón tay hoặc từ hông tới ngón chân). Các xương của chi được hình thành bởi quá trình hóa hạch nội sụn. Ban đầu chúng là sụn, nhưng cuối cùng hầu hết sụn được thay thế bằng xương. Bằng cách nào đó, các tế bào chi phát triển khác nhau ở giai đoạn đầu của quá trình phát sinh hình thái chi (khi chúng tạo ra stylopod) so với ở các giai đoạn sau (khi chúng tạo ra autopod). • Chiều thứ hai là trục trước - sau (ngón cái đến ngón út). Ngón tay út hoặc ngón chân út của chúng ta đánh dấu đầu phía sau và ngón cái hoặc ngón chân cái của chúng ta ở đầu phía trước. Ở con người, rõ ràng là mỗi bàn tay phát triển như một hình ảnh phản chiếu của tay kia. Người ta có thể tưởng tượng những cách sắp xếp khác — chẳng hạn như ngón cái phát triển ở bên trái của cả hai tay — nhưng những kiểu này không xảy ra. • Cuối cùng, các chi có trục lưng-bụng: lòng bàn tay (bụng) của chúng ta dễ dàng phân biệt với mu bàn tay (lưng). Nụ chi Dấu hiệu đầu tiên có thể nhìn thấy được của sự phát triển chi là sự hình thành các khối phồng ở hai bên gọi là các nụ chi ở các vị trí giả định của chi trước và chi sau (Hình 2A). Nghiên cứu lập bản đồ số phận trên sa giông, do phòng thí nghiệm của Ross Granville Harrison tiên phong (xem Harrison 1918, 1969), cho thấy trung tâm của đĩa tế bào này trong vùng thân thể của trung bì tấm bên thường tự phát sinh chi. Liền kề với nó là các tế bào sẽ hình thành mô cạnh sườn quanh phế quản (xung quanh chi) và xương đòn vai. Tuy nhiên, nếu tất cả các tế bào này được tách ra khỏi phôi, thì một chi vẫn sẽ hình thành (mặc dù hơi muộn hơn) từ một vòng tế bào bổ sung bao quanh khu vực này nhưng thông thường sẽ không hình thành chi. Nếu vòng tế bào xung quanh này được bao gồm trong mô bị cắt bỏ, thì sẽ không có chi nào phát triển. Vùng lớn hơn này, đại diện cho tất cả các tế bào trong vùng có khả năng tự hình thành một chi, là trường chi. Các tế bào tạo nên nụ chi có nguồn gốc từ trung bì tấm bên ở phía sau, kế cận các đốt và ngoại bì bên trên của nụ chi. Các tế bào trung mô tấm bên di chuyển bên trong các trường chi để hình thành các tế bào tiền thân của bộ xương chi, trong khi các tế bào trung mô từ các đốt ở cùng mức di chuyển đến để thành lập
các tế bào tiền thân của cơ chi (Hình 2B, C). Quần thể không đồng nhất đang tích lũy này của các tế bào trung mô tăng sinh bên dưới mô ngoại bì, tạo ra nụ chi. Ngay cả nụ chi sớm cũng sở hữu cách thức tổ chức riêng của nó sao cho hướng phát triển chính xảy ra dọc theo trục từ gần đến xa (từ các đốt somite đến ngoại bì), với sự phát triển ít hơn xảy ra dọc theo trục
từ lưng tới bụng và từ trước ra sau (xem Hình 1B). Nụ chi được phân khu thành ba miền khác biệt về mặt chức năng: 1. Trung mô có tính tăng sinh cao độ thúc đẩy sự phát triển của nụ chi được gọi là trung mô vùng tiến triển (PZ) (còn gọi là vùng chưa biệt hóa). 2. Các tế bào được tìm thấy bên trong vùng phía sau nhất của vùng tiến triển tạo thành vùng hoạt động phân cực (ZPA), vì nó mẫu hình số phận tế bào dọc theo trục trước-sau. 3. Gờ ngoại bì đỉnh (AER) là vùng dày lên của lớp ngoại bì ở đỉnh của nụ chi đang phát triển (Hình19.2D). Sự chỉ định gene Hox của việc nhận dạng bộ xương chi Các yếu tố phiên mã Homeobox, hoặc các gene Hox, đóng một vai trò thiết yếu trong việc xác định liệu một tế bào trung mô cụ thể sẽ trở thành stylopod, zeugopod hay autopod. Hiểu được vai trò của chúng đã mang lại cho các nhà nghiên cứu cái nhìn sâu sắc mới về sự phát triển và tiến hóa của chi động vật có xương sống. Từ gần đến xa: Các gene Hox ở chi Các phần 5′ (giống AbdB) (đoạn từ 9–13) của phức hợp gene Hoxa và Hoxd dường như hoạt động trong các nụ chi của chuột. Dựa trên các mẫu hình biểu hiện của các gene này và các đột biến gene xảy ra tự nhiên và đột biến knockout gene, phòng thí nghiệm của Mario Capecchi (Davis và cộng sự 1995) đã đề xuất một mô hình trong đó các gene Hox này chỉ định danh tính của một vùng chi (Hình 3A, B). Ở đây, các dạng tương đồng của gene Hox9 và Hox10 chỉ định stylopod, các dạng tương đồng của gene Hox11 chỉ định zeugopod và các dạng tương đồng Hox12 và Hox13 chỉ định autopod. Kịch bản này đã được xác nhận bởi nhiều thí nghiệm. Ví dụ, khi Wellik và Capecchi (2003) loại bỏ tất cả sáu alen của ba dạng tương đồng Hox10 (Hox10aaccdd) trong phôi chuột, kết quả là những con chuột không chỉ bị khuyết tật xương trục nghiêm trọng mà chúng còn không có xương đùi hoặc xương bánh chè (tuy nhiên, chúng còn có xương cánh tay, bởi vì các dạng tương đồng của Hox9 được biểu hiện ở stylopod chi trước chứ không phải ở stylopod chi sau). Khi tất cả sáu alen của ba dạng tương đồng Hox11 bị loại bỏ, các chi sau kết quả có xương đùi nhưng không có xương chày hay xương mác (và chi trước không có xượng trụ và xương quay). Do đó, việc loại trực tiếp của Hox11 đã loại bỏ zeugopod (Hình 3C). Tương tự, việc loại bỏ tất cả
các locus Hoxa13 và Hoxd13 tương tự dẫn đến mất autopod (Fromental-Ramain và cộng sự, 1996). Những người đồng hợp tử về đột biến HOXD13 cho thấy những bất thường của bàn tay và bàn chân, trong đó các ngón sẽ hợp nhất (Hình 3D), và những người có các alen đột biến đồng hợp tử HOXA13 cũng có các dị tật của autopod (Muragaki và cộng sự, 1996; Mortlock và Innis 1997). Ở cả chuột và người, autopod (phần xa nhất của chi) bị ảnh hưởng bởi sự mất chức năng của hầu hết các gene Hox 5′. Từ vây cá đến ngón tay: các gene Hox và sự tiến hóa chi Làm thế nào mà một phần phụ của động vật có xương sống lại phát triển thành các chi rất hữu ích mà chúng ta thấy ngày nay ? Hồ sơ hóa thạch chỉ ra một sự chuyển đổi quan trọng về hình thái chi trước từ
vây ngực của cá vây tia sang các chi có ngón của động vật bốn chân, một sự chuyển đổi tạo cơ hội cho các loài thủy sinh khám phá môi trường sống trên cạn. Hiểu được lịch sử tiến hóa của chi ở động vật bốn chân có thể giúp chúng ta phân tích các cơ chế phát triển cần thiết cho hình thái học chi ngày nay. Việc phát hiện ra hóa thạch kỷ Devon của loài Tiktaalik roseae, một "loài cá có ngón tay", nhấn mạnh tầm quan trọng của sự phát triển khớp trong quá trình tiến hóa chi. Vây cá, bao gồm cả vây của một số loài nguyên thủy nhất, phát triển bằng cách sử dụng ba giai đoạn biểu hiện gene Hox giống như các loài động vật bốn chân sử dụng để hình thành các chi của chúng (Davis và cộng sự, 2007; Ahn và Ho 2008). Sự biến đổi độc lập của xương vây thành xương chi có thể được thực hiện nhờ các khớp. Các khớp của vây ngực của các vây tay Tiktaalik rất giống với các khớp của động vật lưỡng cư và chỉ ra rằng loài Tiktaalik này có cổ tay có thể di động, và tư thế được hỗ trợ bởi chất nền trong đó khuỷu tay và vai có thể uốn cong (Hình 4A – C; Shubin và cộng sự. 2006; Shubin 2008) . Ngoài ra, sự hiện diện của các cấu trúc giống như cổ tay và sự mất đi lớp vảy da ở những vùng này cho thấy loài cá ở kỷ Devon này có thể tự đẩy mình trên nền ẩm. Do đó, cá vây tay Tiktaalik được cho là sự chuyển đổi giữa cá và động vật lưỡng cư — một “chân cá” (như một trong những người phát hiện ra nó, Neil Shubin, đã gọi nó) “có khả năng chống đẩy”. Những loại biến đổi hình thái và phân tử nào đã xảy ra dọc theo các nhánh khác nhau dẫn đến một mặt là cá vây tia và mặt khác là các loài bốn chân sống trên cạn ? Ở những loài cá có quan hệ họ hàng gần nhất với động vật bốn chân (cá có vây thùy như cá vây tay và cá phổi), có nhiều xương gần của vây ngực tương đồng với đoạn stylopod của chi trước ở động vật bốn chân, và chịu trách nhiệm tương tự đối với sự khớp nối về vây ngực hoặc vai. Tuy nhiên, vây của cá vây tia lại khác nhau về hình dạng, và điều này thể hiện rõ nhất ở các phần tử xa hơn và đặc biệt là phần autopod (các ngón). Cá vây tia không có bộ xương trong liên kết với autopod, trong khi cá tổ tiên trong bộ Sarcopterygian (cá vây thùy) có bộ xương nội sụn mở rộng bên trong các vây của chúng (như ở loài Tiktaalik). Do đó, sự thích nghi nhắm vào các cơ chế phát triển chi phối bộ xương chi ở xa hơn là cơ sở chính cho sự tiến hóa chi. Nụ vây cá tương đồng với nụ chi và tương tự có trung mô vùng tiến triển và gờ ngoại bì đỉnh phía trên (AER). Tuy nhiên, sau khi tạo hình gần giống stylopod, AER của nụ vây chuyển thành nếp gấp ngoại bì đỉnh (AEF) thúc đẩy sự phát triển tia vây thay vì các ngón (Hình 4D). Một giả thuyết cho rằng sự trì hoãn
quá trình phát triển tiềm năng trong quá trình chuyển đổi từ AER sang AEF này sẽ cho phép tiếp xúc lâu hơn với các tín hiệu ở xa từ AER, cho phép trung mô vùng tiến triển ngày càng dễ dàng chấp nhận các số phận autopod (các ngón).
Hơn nữa, những thay đổi trong mẫu hình không gian và thời gian của các gene Hox ở xa có thể là nguyên nhân dẫn đến sự tiến hóa của tay của động vật bốn chân từ vùng vây ở xa của cá vây thùy cổ (Schneider và Shubin 2013; Freitas và Gómez-Skarmeta 2014; Zuniga 2015) . Số lượng vùng tăng cường điều hòa cis liên kết với các cụm Hoxa/d có thể cung cấp một cơ chế để thích ứng về mặt di truyền của autopod (xem Hình 4D). Để hỗ trợ thêm cho mô hình này, các nhà nghiên cứu đã xác định được cả các vùng tăng cường được bảo tồn (“vùng kiểm soát tổng quát”, GCR và CsB) và các vùng tăng cường dành riêng cho động vật bốn chân (CsS) có liên quan đến sự biểu hiện các gene Hox sớm (ở gần) và muộn hơn (ở xa). Trên thực tế, các vùng tăng cường CsS của chuột có thể điều khiển chức năng biểu hiện chất báo cáo trong phôi cá ngựa vằn chuyển gene tương tự như vậy bên trong trung mô ở xa nhất (Hình 5; Freitas và cộng sự, 2012). Kết luận, cuộc khảo sát ngắn gọn này về sự tiến hóa của chi ở động vật bốn chân, từ vây cá đến tay người, hy vọng đã làm sáng tỏ tầm quan trọng của việc điều hòa gene Hox trong quá trình phát triển chi. Các gene Hox rất quan trọng để xác định số phận dọc theo mỗi trục của chi và sự biểu hiện của chúng chịu ảnh hưởng của các tín hiệu phát ra từ bên sườn (gần) và AER (xa), trong số những tín hiệu khác. Những
tín hiệu này là gì và chúng hoạt động như thế nào để (1) xác định vị trí các chi hình thành, (2) thúc đẩy sự phát triển và hình thành nụ chi, và (3) xác định số phận dọc theo trục trước-sau và trục lưng-bụng ? Hox ở chi của động vật có xương sống Các gene trong vùng 5' của cụm Hoxa và Hoxd được biểu hiện rõ ràng nhất trong các chi đang phát triển của động vật có xương sống, mặc dù một số gene trong cụm Hoxb và Hoxc cũng được biểu hiện. Thật vậy, XlHboxU hiện được gọi là Hoxc-6, là một trong những gene Hox đầu tiên được nhân bản, và là gene đầu tiên được chứng minh là biểu hiện trong quá trình phát triển chi. Nhuộm bằng kháng thể đặc hiệu cho thấy Hoxc-6 được biểu hiện ở vùng trước-gần của nụ chi trước ở một số động vật có xương sống khác nhau, bao gồm ếch Xenopus, cá ngựa vằn, chuột và gà. Ngay sau đó, Duboule và các đồng nghiệp đã chỉ ra rằng các gene Hoxd phía 5' (Hoxd9-13), khi đó được gọi là các gene Hox4, được biểu hiện ở các miền chồng chéo tập trung ở rìa xa-sau ở cả nụ chi rước và nụ chi sau trong phôi chuột. Đó là sự biểu hiện cộng tuyến cả về thời gian và không gian của các gene này ở nụ chi ban đầu, với các gene đầu 3' được biểu hiện trước các gene đầu 5' , và các gene đầu 3' được biểu hiện ở gần hơn các gene đầu 5' (Hình 6). Mẫu hình biểu hiện của mỗi gene đầu 5' nữa trong cụm Hox được bao gồm bên trong mẫu hình biểu hiện của gene đầu 3' liền kề và điều này được ví như một bộ búp bê Nga. Các mẫu hình biểu hiện gene Hoxd tương tự cũng được thấy ở các nụ chi sớm trong phôi gà và sự biểu hiện thứ tự dần dần của các gene trong cụm theo hướng từ 3' đến 5' đã được chứng minh là xảy ra rất nhanh trong vòng vài giờ. Các gene Hoxa
đầu 5' được tìm thấy biểu hiện ở các miền chồng chéo tương tự ở nụ cánh gà dọc theo trục gần - xa nhưng không có khuynh hướng rõ ràng về phía sau (Hình 6). Nelson và các đồng nghiệp đã tiến hành phân tích toàn diện và chi tiết về sự biểu hiện của tất cả các gene Hox trong quá trình phát triển các chi của gà, bao gồm các gene từ cả bốn cụm Hox. Các gene Hoxc thường được biểu hiện ở các vùng trước/gần của nụ cánh hoặc chân hoặc cả hai. Một phát hiện cảnh báo là các bản phiên mã (mRNA) của Hoxc6 đã được phát hiện ở cả chi trước và chi sau, trong khi đó, như đã báo cáo trước đây, protein Hoxc6 chỉ được phát hiện ở chi trước. Hoxb9 được biểu hiện ở phía trước của nụ chân và sự biểu hiện Hoxb8 ở phía sau của nụ cánh sớm sau đó đã được mô tả bởi những người khác. Đối với gene Hoxa và Hoxd, Nelson và cộng sự cho rằng có ít nhất 3 giai đoạn biểu hiện khác nhau. Trong giai đoạn biểu hiện đầu tiên, các gene Hoxd9 và Hoxd 10 được biểu hiện khắp lớp trung bì tấm bên khi nó bắt đầu dày lên để hình thành nụ chi. Trước đó, một số gene Hox khác nhau được biểu hiện theo các mẫu hình động ở trung bì tấm bên ở các vùng chi giả định, bao gồm cả các parolog Hox9 khác như Hoxb9. Người ta gợi ý rằng mẫu hình biểu hiện của các gene này ở các giai đoạn sơ khai này có thể dùng để định vị các chi giả định dọc theo trục chính từ đầu đến đuôi của phôi. Giai đoạn thứ hai là các mẫu hình biểu hiện gene lồng nhau được mô tả rõ ràng đã được nêu ở trên với Hoxa13 được biểu hiện muộn hơn Hoxd13. Giai đoạn biểu hiện thứ ba được nhìn thấy ở vùng xa của nụ chi tiến triển hơn ở những vùng mà các ngón sẽ hình thành (Hình 6). Ở giai đoạn này, Hoxd13 được biểu hiện ở khắp phần xa của chi và Hoxdl0-Hoxdl2 đồng biểu hiện với Hoxdl3 ngoại trừ ở phần trước. Hoxa13 cũng được biểu hiện ở hầu hết các vùng xa của nụ chi trong khi biểu hiện của Hoxa11 hiện bị hạn chế hơn ở phần gần. Trong giai đoạn thứ ba này, ngoài hầu hết các gene Hoxd đầu 5' được biểu hiện ở các miền rộng hơn các gene đầu 3', chúng còn được biểu hiện theo thời gian theo hướng từ 5' đến 3', trong đó Hoxd13 được biểu hiện đầu tiên. Tổng hợp những dữ liệu này không chỉ tiết lộ các mẫu hình biểu hiện gene Hoxa và Hoxd phụ thuộc vào vị trí cụ thể ở chi đối với cả trục trước-sau và trục gần-xa mà còn làm nổi bật bản chất động của các mẫu hình này. Thực tế là một số giai đoạn biểu hiện khác nhau có thể được nhận thấy gần đây đã có ý nghĩa lớn hơn khi các vùng kiểm soát (control region) điều khiển sự biểu hiện các gene Hox ở chi đã được phát hiện (xem phần sau). Các tín hiệu kiểm soát biểu hiện gene Hox ở chi
Vậy đâu là những tín hiệu dẫn đến mẫu hình biểu hiện gene Hox phụ thuộc vào vị trí trong quá trình phát triển các chi, và những cơ chế này có phù hợp với vai trò của các gene Hox trong việc tạo mẫu hình chi không? Những câu hỏi này lần đầu tiên được giải quyết đối với Hoxc6 trong phôi gà, bằng cách thực hiện các thí nghiệm ghép và áp dụng axit retinoic, loại hóa chất duy nhất được biết đến vào thời điểm đó là có thể bắt chước tín hiệu ở vùng hoạt động phân cực và tạo ra các bản sao ngón. Do sự biểu hiện Hoxc6 bị giới hạn ở phần trước của nụ chi sơ khai, nên có một khả năng là Hoxc6 có liên quan đến việc mã hóa các giá trị vị trí theo trục trước-sau. Trong trường hợp này, việc ghép vùng hoạt động phân cực hoặc bôi axit retinoic vào rìa trước của nụ cánh, giúp tái chỉ định các tế bào phía trước hình thành các cấu trúc phía sau sẽ tắt biểu hiện Hoxc-6 ở các tế bào phía trước. Tuy nhiên, thay vào đó, những thao tác này lại kéo dài biểu hiện và điều này có liên quan đến những bất thường ở đai vai. Thật vậy, những bất thường ở vùng này của bộ xương chi phù hợp với bản đồ số phận trước đó cho thấy các tế bào ở vùng trước-gần (anterior-proximal region) của nụ chi tạo ra đai vai. Mẫu hình biểu hiện chồng chéo của các gene Hoxd đầu 5' ở nụ chi sơ khai tập trung ở rìa sau-xa (posterior-distal margin) cho thấy rằng các gene này cũng có thể liên quan đến việc tạo mẫu hình chi theo trục trước -sau. Ví dụ: Hoxd13 chỉ được biểu hiện ở phần sau của nụ chi, trong khi Hoxd9 được biểu hiện xuyên suốt, bao gồm cả rìa trước (Hình 6). Thật vậy, năm miền biểu hiện khác nhau có thể được phân biệt dọc theo trục trước -sau của nụ chi sơ khai dẫn đến gợi ý rằng đây có thể là lý do tại sao chúng ta có năm ngón tay. Khi các mảnh ghép vùng hoạt động phân cực (ZPA) hoặc các hạt ngâm axit retinoic được đặt ở rìa phía trước của nụ cánh gà, tạo ra các mẫu hình ảnh phản chiếu của sự biểu hiện các gene Hoxd và những mẫu hình này tương quan với các mẫu hình ảnh phản chiếu của các ngón sau đó sẽ phát triển. Hơn nữa, các miền biểu hiện lạc chỗ của các gene Hox xuất hiện theo thứ tự giống như trong sự phát triển chi bình thường cho thấy rằng quá trình tạo hình phía sau (posteriorization) trong thực nghiệm của các tế bào phía trước đã tóm tắt lại các sự kiện thường xảy ra ở phía sau. Người ta đã chứng minh rằng tín hiệu của gờ ngoại bì đỉnh (AER) cũng cần thiết để tạo ra các miền biểu hiện gene Hoxd lạc chỗ để đáp ứng với axit retinoic. Khi gờ ngoại bì đỉnh bị loại bỏ, các miền ngoại bì mới của sự biểu hiện gene Hox ở rìa trước của nụ cánh không được tạo ra. Vai trò của gờ ngoại bì đỉnh trong việc điều chỉnh biểu hiện gene Hox ở chi và sự tương tác giữa tín hiệu vùng hoạt động phân cực và gờ ngoại bì đỉnh sẽ được thảo luận sau.
Hiện nay người ta biết rằng axit retinoic cảm ứng tạo ra sự biểu hiện của gene Sonic hedgehog, Shh . Shh được biểu hiện ở vùng hoạt động phân cực, và hơn nữa, việc ghép các tế bào biểu hiện Shh vào rìa trước của nụ cánh gà có thể tạo ra các mẫu hình ảnh phản chiếu của sự biểu hiện Hox. Ở chuột đột biến đa ngón tiền trục (các ngón bổ sung ở rìa trước của các chi), sự biểu hiện Shh lạc chỗ đã được phát hiện ở phía trước của nụ chi và có liên quan tương tự với việc biểu hiện lạc chỗ của các gene Hoxd. Ở cánh gà sơ khai, Shh và các gene Hox được biểu hiện vào khoảng 24 giờ sau khi sử dụng axit retinoic ở rìa trước, trong khi các gene Hox cũng được biểu hiện 24 giờ sau khi sử dụng Shh. Những khoảng thời gian này khó có thể điều chỉnh được bằng một tầng tuyến tính đơn giản (xem phần sau). Hơn nữa, người ta cũng chứng minh rằng Shh có thể tạo ra các mẫu hình ảnh phản chiếu ở nụ chân gà muộn, nhưng trong trường hợp này, biểu hiện Hoxd 13 lạc chỗ được nhìn thấy đầu tiên và trong một miền rộng hơn nhiều gene đầu 3'. Cơ chế giới hạn sự biểu hiện gene Hoxd đầu 5' ở trung mô sau-xa (posterior-distal mesenchyme) của nụ chi sơ khai hiện được biết là dựa trên sự ức chế phiên mã của Gli3, một trong những tác nhân hiệu ứng của tín hiệu Shh. Protein Gli3 có chiều dài đầy đủ được xử lý thành một dạng chất ức chế ngắn trong trường hợp không có phối tử Shh và có một gradient chất ức chế Gli3 ở nụ chi của gà và chuột, với mức chất ức chế cao nhất ở phần trước. Ở nụ chi của phôi chuột Shh -I- trong đó yếu tố ức chế Gli3 sẽ chiếm ưu thế trên toàn bộ nụ chi, sự biểu hiện gene Hoxd đầu 5' ở phần sau của chồi được bắt đầu nhưng không được duy trì, và các chi bị cắt cụt nghiêm trọng. Ngược lại, ở các chi của phôi chuột Gli3-I-, trong đó không có yếu tố ức chế, các gene Hoxd đầu 5' được biểu hiện đồng đều trên trục trước-sau, tức là ở cả trung mô trước và sau. Một số thể đột biến ở chuột và gà hiện đã được phát hiện có khiếm khuyết trong quá trình xử lý Gli3, và ở chi của các thể đột biến này, các gene Hoxd đầu 5' cũng được biểu hiện đồng đều trên trục trước-sau của nụ chi.Trong tất cả các thể đột biến này, các chi có nhiều ngón không theo khuôn mẫu, nhưng không rõ liệu điều này có liên quan trực tiếp đến tính đồng nhất của sự biểu hiện gene Hoxd hay không. BMP2 là một gene khác được biểu hiện ở phía sau ở nụ chân gà sơ khai, và có thể bị Gli3 ức chế ở vùng phía trước của nụ chân. Tín hiệu BMP đã được đề xuất để làm trung gian cho các tác động của Shh báo hiệu về sự chỉ định ngón và tạo mẫu hình trước-sau, cả ở giai đoạn nụ chi sớm và ở giai đoạn đĩa ngón. Việc áp dụng BMP vào rìa trước của nụ chi gà không tạo ra sự trùng lặp hình ảnh phản chiếu mà thay vào
đó chỉ là một ngón 2 bổ sung, hoặc ngón 3 chẻ đôi. Tuy nhiên, những thay đổi trong sự biểu hiện các gene Hoxd đầu 5' đã được nhìn thấy 48 giờ sau khi áp dụng BMP cho thấy rằng BMP có thể là gene ngược dòng (upstream) của sự biểu hiện gene Hox trong tấm ngón. Tuy nhiên, khi chất đối kháng BMP, Noggin, được sử dụng để điều chỉnh quá trình tạo hình thái ngón ở giai đoạn phát triển muộn của chân gà, không có thay đổi nào có thể phát hiện được trong việc biểu hiện gene Hoxd được tạo ra. Tín hiệu từ gờ ngoại bì đỉnh cũng đóng vai trò duy trì sư biểu hiện gene Hox ở nụ chi. Việc loại bỏ gờ ngoại bì đỉnh khỏi các nụ chi sơ khai, dẫn đến việc các chi bị cắt cụt và thiếu các cấu trúc ở xa, dẫn đến mất cả biểu hiện gene Hoxa13 và Hoxd13. Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) làm trung gian cho việc truyền tín hiệu gờ ngoại bì đỉnh, và việc áp dụng FGF vào nụ cánh gà sau khi loại bỏ gờ ngoại bì đỉnh có thể cứu được cả Hoxd13 và Hoxa13. Những dữ liệu này và các dữ liệu khác gợi ý rằng các gene Hoxd13 và Hoxa13 có thể liên quan đến việc tạo mẫu hình gần-xa của các chi, và đặc biệt là trong việc hình thành các ngón. Đã có cuộc thảo luận đáng kể về cách mà gờ ngoại bì đỉnh và tín hiệu FGF được liên kết với việc tạo mẫu hình gần-xa của chi, và đặt ra mẫu hình cấu trúc dọc theo trục dài của chi và điều này có liên quan đến việc xem xét những vai trò có thể có của các gene Hox. Một mô hình lâu đời gợi ý rằng việc tạo mẫu hình gần - xa được xác định bởi một cơ chế định thời gian hoạt động ở đầu nụ chi trong một vùng của các tế bào chưa biệt hóa đang tăng sinh được gọi là vùng tiến triển (progress zone). Ngược lại, một mô hình gần đây hơn cho thấy rằng tất cả các bộ phận của chi đã được xác định ở nụ chi sơ khai, và tín hiệu của gờ ngoại bì đỉnh sau đó sẽ mở rộng các bộ phận này một cách tuần tự. Vậy thì hành vi biểu hiện gene Hox liên quan như thế nào đến các mô hình khác nhau này ? Việc loại bỏ sự biểu hiện của Hoxd13 và Hoxa13 sau khi loại bỏ gờ ngoại bì đỉnh khỏi nụ chi sơ khai phù hợp với vai trò của các gene này trong việc hình thành ngón, và có thể được giải thích bằng cả hai mô hình. Ngược lại, việc thiết lập một tập hợp hoàn chỉnh gồm các miền biểu hiện của Hoxa và Hoxd đầu 5' lồng nhau trong nụ chi sơ khai có thể phù hợp với ý tưởng về sự chỉ định trước. Thật vậy, người ta đã đề xuất rằng việc kích hoạt lũy tiến biểu hiện gene Hox ở nụ chi sơ khai để thiết lập các miền biểu hiện lồng nhau này có thể được kiểm soát bởi một gradient của FGF, từ xa đến thấp gần phát ra từ gờ ngoại bì đỉnh. Tuy nhiên, việc áp dụng FGF vào nụ cánh gà không dẫn đến biểu hiện sớm của các gene Hoxa cho thấy có các yếu tố khác có liên quan. Mặt
khác, hành vi của các tế bào biểu hiện Hoxd13 rất khó để tương thích với ý tưởng chỉ định trước. Các thí nghiệm đánh dấu tế bào đã chỉ ra rằng, khi nụ chi lớn lên, một số tế bào biểu hiện Hoxd13 ở nụ chi sơ khai bị dịch chuyển khỏi đầu nụ chi và không còn biểu hiện Hoxd13. Một cách giải thích về những dữ liệu này là các tế bào ở xa dần dần được gần hóa (progressively proximalised) trong quá trình phát triển nụ chi. Kết luận chung từ những dữ liệu trên là các thao tác ở nụ chi tạo ra những thay đổi trong việc hình thành mẫu hình đi kèm với những thay đổi trong sự biểu hiện gene Hox, và các phân tử truyền tín hiệu tế bào-tế bào liên quan đến việc tạo mẫu hình, chẳng hạn như Shh và FGF, đều tham gia vào việc duy trì mạng lưới biểu hiện gene Hox. Tuy nhiên, điều đáng chú ý là các tín hiệu làm trung gian cho sự hình thành và sự phát triển của nụ chi đều có sự phối hợp. Do đó, có một vòng phản hồi dương tính trong đó Shh duy trì sự biểu hiện của các gene FGF khác nhau ở gờ ngoại bì đỉnh, từ đó duy trì biểu hiện Shh ở vùng hoạt động phân cực. Do đó, việc thay đổi một tín hiệu có thể gây ra hiệu ứng knock-on (tức là các tác động thứ cấp, gián tiếp hoặc có tính tích lũy). Điều này gây khó khăn cho việc giải thích các thí nghiệm như vậy và phân tách vai trò của gen Hox trong việc tạo khuôn trước và sau gần . Kiểm tra chức năng gene Hox Hai phương pháp chính đã được sử dụng để kiểm tra trực tiếp chức năng của gene Hox trong quá trình phát triển chi của động vật có xương sống— biểu hiện sai (lạc chỗ) hoặc biểu hiện quá mức và bất hoạt chức năng. Chức năng của các gene Hoxd đầu 5' đã được kiểm tra bằng cả hai phương pháp. Trong phương pháp tiếp cận đầu tiên trên phôi gà, Hoxd11 (trước đây gọi là Hox4.6) đã được biểu hiện quá mức trong quá trình phát triển các chi bằng cách sử dụng hệ thống RCAS (virus sarcoma ở gia cầm có khả năng sao chép). Trong các thí nghiệm này, một ngón 2 bổ sung được tạo ra ở cánh, trong khi ở chân, ngón 1 dường như được chuyển thành ngón 2, tức là bị sau hóa (posteriorised). Hoxd12 của gà đã được biểu hiện lạc chỗ trong phôi chuột bằng cách sử dụng vùng khởi động của Hoxb6, chất này thúc đẩy sự biểu hiện ở trung mô tấm bên và khắp trung mô của nụ chi sau. Sự biểu hiện sai lệch này của Hoxd12 cũng dẫn đến hiện tượng các chi bị biến dạng hóa phía sau (posteriorization) , bao gồm cả việc chuyển đổi ngón 1 thành hình thái điển hình của ngón 2, và/hoặc sự nhân đôi của các ngón phía trước. Mặc dù các thí nghiệm ban đầu trên phôi gà được hiểu là do tác động trực tiếp của Hoxd11, nhưng nó đã được chứng
minh ở các chi của chuột, trong đó Hoxd12 bị biểu hiện sai lệch, rằng có Shh biểu hiện lạc chỗ ở rìa trước. Điều này dẫn đến gợi ý rằng Hoxd12, và có thể cả các gene Hox đầu 5' khác, có thể đóng vai trò trong việc củng cố biểu hiện Shh ở rìa sau của chi đang phát triển (xem phần sau). Trong phương pháp thứ hai, chuột biến đổi gene đã được tạo ra trong đó các gene Hox đã bị bất hoạt về mặt chức năng. Trong thí nghiệm đầu tiên, các gene Hoxd đơn lẻ, chẳng hạn như Hoxd13 đã bị loại bỏ. Các chi của chuột Hoxd13-/- cho thấy những thay đổi phức tạp về giải phẫu các ngón, bao gồm cả việc giảm kích thước các ngón, thiếu các đốt ngón và các ngón hợp nhất, cũng như có các ngón bổ sung ở chi trước. Không dễ để giải thích những thay đổi này trong giải phẫu một cách đơn giản dựa trên giả thuyết rằng các gene Hoxd mã hóa cho sự nhận dạng ngón trên trục trước - sau của chi. Tuy nhiên, chúng nhất quán về vai trò của Hoxd13 trong việc hình thành các cấu trúc ở xa. Hơn nữa, những con chuột có đột biến ở Hoxa11 cho thấy những khiếm khuyết ở vùng xương trụ/xương quay và xương chày/xương mác, một lần nữa chỉ ra vai trò trong việc tạo mẫu hình gần -xa, nhưng, ở những đột biến đơn lẻ khác, chẳng hạn như những đột biến mà Hoxd11 bị bất hoạt về mặt chức năng, thì chi sau xuất hiện tương đối bình thường. Hiện tại rõ ràng là có các tương tác bù trừ và hiệp đồng giữa các gene Hox tương tự (paralog) trong các cụm khác nhau và giữa các gene Hox trong cùng một cụm, và những tương tác này ảnh hưởng đến kiểu hình. Do đó, khi cả Hoxa13 và Hoxd13 đều bị bất hoạt chức năng, chuột hoàn toàn thiếu các ngón Trong các thí nghiệm khác, các cuộc thử nghiệm loại trực tiếp đã được thực hiện trong đó nhiều hơn một gene Hoxd đầu 5' đã bị bất hoạt về mặt chức năng, và các thí nghiệm này cho thấy rằng một vài parolog khác góp phần vào việc tạo mẫu mẫu hình ngón. Do đó, ví dụ, trong các dị hợp tử chuyển gene của Hoxd13 và Hoxd12, đã thu được các bất thường mới của ngón, và các khiếm khuyết nhìn thấy ở các dị hợp tử riêng lẻ đã trở nên trầm trọng hơn, trong khi việc xóa đồng thời Hoxd13, Hoxd12 và Hoxd11 dẫn đến số lượng và kích thước của các ngón giảm so với chỉ xóa một mình Hoxd13. Một loạt các thể đột biến phức hợp với mức độ mất chức năng khác nhau của Hoxd13, Hoxa13 và Hoxd11/12 cũng đã được biến đổi gene. Phân tích kiểu hình ngón của những thể đột biến này cho thấy rằng liều lượng gene Hox quan trọng đối với sự phát triển ngón hơn là sự khác biệt về chất giữa các gene. Điều thú vị là, việc xóa dần dần chức năng gene Hox, trước hết, tạo ra các chi có thêm ngón, và sau đó là các chi có số ngón giảm đi.
Kiểu hình chi của những con chuột đột biến gene Hox phức hợp này và phức hợp khác gần đây đã được xem xét, và mã 'Hox' cho chi đã được suy ra (Hình 7). Mã này hoạt động chủ yếu liên quan đến mẫu hình chi gần - xa. Theo mã này, các parolog Hox13 hoạt động chủ yếu ở các ngón, Hox11 ở xương quay/xương trụ và xương chày/xương mác, và Hox9 ở xương cánh tay (chi trước) và Hox 10 ở xương đùi (chi sau). Tuy nhiên, một vài gene này cũng đóng vai trò ở các phần khác của chi. Ví dụ: các parolog Hox11 cũng góp phần tạo mẫu hình ngón, và Hoxd12 có thể thay thế cho các parolog Hox13. Một trong những thách thức nổi bật nhất là xác định các gene mục tiêu xuôi dòng dịch mã Hox thành kiểu hình giải phẫu. Một báo cáo gần đây cung cấp bằng chứng cho thấy thụ thể ephrin, EphA7, là mục tiêu của Hoxd13 và Hoxa13. Gần đây, người ta đã đạt được sự loại bỏ thậm chí còn quyết liệt hơn biểu hiện gene Hox ở nụ chi của chuột và xác nhận tầm quan trọng của các gene Hox trong quá trình phát triển nhô ra ngoài và tạo mẫu hình gần - xa. Các gene trong cả hai cụm Hoxd và Hoxa đã bị loại bỏ một cách có điều kiện trong trung mô của nụ chi khi sử dụng chuột Prxl-Cre. Prxl-Cre hoạt động hiệu quả hơn ở chi trước, và do đó kiểu hình của chi trước đã được báo cáo. Các chi trước của các thể đột biến kép có điều kiện bị cắt cụt cực kỳ và các cấu trúc ở xa bị mất hoàn toàn. Điều thú vị là sự mất đi các cấu trúc ở xa này có liên quan đến việc
thiếu biểu hiện Shh ở nụ chi. Tuy nhiên, kiểu hình nghiêm trọng hơn đối với các chi của phôi chuột Shh-/- trong đó có tàn dư biểu hiện gene Hox . Các gene Hox khác cũng có thể tham gia vào việc thiết lập sự biểu hiện Shh ở nụ chi. Hoxb8 được biểu hiện ở phần sau của nụ chi chuột sơ khai. Một vai trò bất ngờ của Hoxb8 đã được phát hiện khi Hoxb8 được biểu hiện ở phía trước nhiều hơn bằng cách sử dụng vùng khởi động của RAR beta2. Điều này dẫn đến các chi trước nhiều ngón với sự biểu hiện Shh lạc chỗ ở rìa trước của chi trước. Các thí nghiệm trên phôi gà cũng ủng hộ vai trò của gene Hoxb8 trong việc thiết lập sự biểu hiện Shh ở vùng hoạt động phân cực của chi trước, và cho thấy sự biểu hiện Hoxb8 có thể được điều chỉnh bởi axit retinoic. Gần đây người ta đã báo cáo rằng một microRNA, miR-196, có thể cung cấp một cơ chế ức chế giúp ngăn chặn Hoxb8 được biểu hiện ở chân sau. Các vùng điều hòa thúc đẩy biểu hiện gene Hox ở chi Tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong việc xác định các vùng kiểm soát trong DNA điều khiển sự biểu hiện các gene Hoxd ở chi thông qua các thí nghiệm phức tạp trên chuột (Hình 8). Một vùng kiểm soát toàn cục (GCR) nằm từ đầu 5' tới cụm này, và điều khiển sự biểu hiện các gene Hoxd ở vùng ngón của chi, tương đương với giai đoạn biểu hiện thứ ba được mô tả bởi Nelson và cộng sự. Điều thú vị là, trong vùng này, có các gene khác, Lunapark và Evx2, được biểu hiện ở vùng ngón giống như các gene Hoxd nhưng có thể có rất ít chức năng, nếu có, trong quá trình phát triển ngón. Một đoạn DNA đã được xác định ở chuột có thể điều khiển biểu hiện của chất báo cáo LacZ ở vùng ngón của chi và trong ống thần kinh. Sự tồn tại của một vùng kiểm soát khác (ECLR), thúc đẩy biểu hiện gene cụm Hoxd ở các chi sơ khai, đã được xác định thông qua các thí nghiệm trong đó sự đảo ngược và thiếu hụt lớn trong cụm này của chuột
đã được thiết kế. Những thao tác này dẫn đến các gene Hoxd đầu 5' được biểu hiện theo mẫu hình của các gene Hoxd đầu 3' trong nụ chi sơ khai, sao cho sự biểu hiện Hoxd 13 xuất hiện đầu tiên và được biểu hiện khắp nụ chi sơ khai, thay vì bị giới hạn ở phía sau. Điều này dẫn đến sự phát triển của các chi nhiều ngón phù hợp với các nghiên cứu biểu hiện quá mức trước đây ở gà và chuột. Hơn nữa, giống như các thí nghiệm trên chuột, sự biểu hiện phía trước của các gene đầu 5' có liên quan đến sự biểu hiện Shh lạc chỗ và gợi ý vai trò của các gene Hox trong việc thiết lập sự biểu hiện Shh ở vùng hoạt động phân cực. Như đã đề cập, kết luận này đã được hỗ trợ bởi phân tích về các thể đột biến kép có điều kiện đối với gene Hoxa và Hoxd. Những thí nghiệm này gợi ý thêm rằng có một vùng điều khiển nằm ở đầu 3' của cụm HoxD, điều khiển giai đoạn biểu hiện sớm ở nụ chi, tương đương với giai đoạn thứ hai được mô tả bởi Nelson và cộng sự. Nghiên cứu gần đây hơn đã xác nhận ý tưởng rằng hai vùng kiểm soát này đóng vai trò thúc đẩy các giai đoạn sớm và muộn của sự biểu hiện các gene Hoxd ở chi, và hai giai đoạn này có liên quan đến quá trình phát triển của các cấu trúc ở đầu gần và các cấu trúc ở đầu xa, tương ứng. Ý nghĩa rộng hơn của Mạng lưới gene Hox Những nỗ lực đáng kể nhằm tìm hiểu vai trò cơ bản của các gene Hox trong quá trình phát triển của chi hiện đang thu được nhiều thành quả. Việc tập trung vào các gene Hox đặc biệt liên quan đến dị tật chân tay ở người. Hai loại dị tật chi đầu tiên được phát hiện là do đột biến gene Hox là hội chứng tay-chân-bộ phận sinh dục và hội chứng đa ngón, với gene bị ảnh hưởng trong mỗi trường hợp lần lượt là Hoxa13 và Hoxd13. Các đột biến khác ở Hoxd13 có thể làm phát sinh các kiểu hình khác nhau, chẳng hạn như tật ngón tay ngắn liên kết với tật đa ngón trung tâm. Cuối cùng, người ta muốn giải thích làm thế nào những đột biến gene cụ thể như vậy lại dẫn đến những thay đổi chính xác như vậy về mặt giải phẫu. Các nghiên cứu so sánh cũng dẫn tới một số suy đoán hấp dẫn về sự tiến hóa các chi của động vật có xương sống. Trong nụ vây phôi của cả cá xương (cá ngựa vằn) và cá mái chèo, Hoxa13 và Hoxa11 cùng biểu hiện ở vùng xa ở giai đoạn muộn. Hơn nữa, giai đoạn thứ ba của biểu hiện gene Hoxd dường như không có ở cả nụ vây ngực và vây bụng của cá ngựa vằn. Gần đây hơn, các vùng điều hòa thúc đẩy biểu hiện gene Hoxd ở vùng ngón đã được so sánh giữa các loài bằng dấu vân tay phát sinh loài. Đoạn DNA được tìm thấy trong bộ gene chuột điều khiển sự biểu hiện LacZ ở các ngón và ống thần kinh được phát hiện là có tính bảo tồn cao trong cả bộ gene của người và cá nóc. Điều thú vị là, khi trình tự DNA tương