Thí nghiệm Sinh học phân tử -
1
BÀI 1:
M
Ở
^ ! ^
1.CÁC THIẾT BỊ CƠ B
ẢN CỦA MỘT PH
BÀO THỰC VẬT
a. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần
b. Phòng hấp – sấy
- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200oC
c. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng (laminar)
- Quạt thông gió
-
Đ
èn t
ư
ờng
Thí nghiệm Sinh học phân tử -
2
2.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO TH
ÀNH CÔNG
VẬT
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi tr
ư
- Chọn mô cấy và x
ử lý mô cấy thích hợp tr
2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy
mô và t
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào th
ực vật có chứa
thích hợp cho các loại nấm và vi khu
ẩn phát triển. Do
lớn hơn rất nhiều so với tế bào th
ực vật, nếu trong môi tr
tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn b
ộ bề mặt môi tr
nhiều loại nấm và vi khu
ẩn. Thí nghiệm phải bỏ
không phát triển và chết dần.
2.2 Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy v
à nút
trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô c
ấy tồn tại các sợi nấm, b
hoặc vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi n
ấm hoặc vi khuẩn theo bụi l
mặt môi trường
2.3 K
ỹ thuật vô tr
ùng
Thí nghiệm Sinh học phân tử -
3
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm b
ằng bông g
chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồ
ng th
dễ dàng trong quá trình nuôi c
ấy. Bông không thấm n
các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt ho
ặc dính môi tr
là với những thí nghiệm tiến hành trong m
ột thời gian d
- Thao tác làm nút bông ch
ậm, không thuận tiện khi nuôi cấy tr
mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đ
ậ
d
ụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm v
thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210
C mà không b
ống nghiệm bằng
inox ho
ặc cao su rất thuận tiện cho việc vô tr
nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử
tr
áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15
-
kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C.
Ở
môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng b
ào t
nghiệm hoặc nút bông để tránh b
ị nhiễm trở lại.
B
ảng 2
: Th
ời gian khử tr
ùng dung d
Thí nghiệm Sinh học phân tử -
4
2.3.2 Khử trùng mô thực vật
Mô cấy có thể là h
ầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật nh
hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiế
p xúc v
nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đ
òng lúa non khi còn trong b
ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặ
c bi
củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầ
u nh
khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô ch
ứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể
vô trùng dễ d
àng trong mùa khô nhưng không th
trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay l
à dùng các ch
Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này ph
ụ thuộc v
xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồ
i lõm trên b
khí bám trên bề mặt mô cấy. Để
tăng tính linh đ
khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấ
y trong v
xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời ngườ
i ta th
Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung d
ịch diệt nấm khuẩn.
gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử
lý mô c
(1974) ở bảng sau:
Tác nhân vô trùng Nồng độ %
Calci hypochlorit 9 – 10
Natri hypochlorit
2
ệm Sinh học phân tử
- 5 - Biên so
ạn : L
Các lo
ại kháng sinh
Aminoglycoside
Trimehtoprim và sulphonamide
Chloramphenicol
Khả năng hoạt độ
ng
Ức chế sự sinh tổ
ng h
tác động l
ên các ribosome 30S ho
Gây tr
ở ngại cho quá tr
b
ằng cách ức chế enzym DNA gyrase
Ức chế s
ự tổng hợp vách tế b
Ức chế sinh tổng hợ
p protein b
tác động l
ên ribosome 30S
Ức chế sự sinh tổng hợptetrahydrofolate
Ức chế sự sinh tổ
ng h
tác động lên Rbx 50S