TCVN T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A
TCVN 8683-5:2011
Xuất bản lần 1
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y –
PHẦN 5: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN
ĐÓNG DẤU LỢN NHƯỢC ĐỘC, CHỦNG VR2
Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 5: The procedure for
preservation of Erysipelothrix rhusiopathiae VR2 strain, attenuated
HÀ NỘI 2011
TCVN 8683-5:2011
Lời nói đầu
TCVN 8683-5:2011 được chuyển đổi từ 10 TCN 229:1995 thành tiêu
chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn
và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số
127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi
hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;
TCVN 8683-5:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng
thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
3
TCVN 8683-5:2011
T I Ể U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN 8683-5:2011
Giống vi sinh vật thú y –
Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn
đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2
Master seed of microorganisms for veterinary use –
Part 5: The procedure for preservation of Erysipelothrix
rhusiopathiae VR2 strain, attenuated
CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng
tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2 dùng để sản
xuất vắc xin đóng dấu lợn nhược độc, vắc xin Tụ - Dấu 3 - 2.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết.
3 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật
3.1 Nhận dạng
3.1.1 Chuẩn bị động vật
4
TCVN 8683-5:2011
Chuẩn bị 2 thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 1,5 kg đến 2,0 kg.
3.1.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5 % huyết thanh ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h.
Kháng nguyên, kháng huyết thanh được chuẩn bị như sau:
– Chuẩn bị kháng huyết thanh:
Canh khuẩn được cấy trên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh ngựa, ủ ở 37 0C trong 18 h đến 20
h. Rửa mặt thạch bằng nước sinh lý có bổ sung 0,3 % formalin (PBS), thu hoạch huyễn dịch. Đếm số
tế bào sao cho huyễn dịch đạt mật độ khoảng 1 x 109 CFU/ml đến 2 x 109 CFU/ml. Thỏ được tiêm vào
dưới da với liều 2 ml. Sau 2 tuần, thỏ được tiêm tiếp với các liều 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2.5 ml; 3 ml
kháng nguyên chết vào tĩnh mạch tai thỏ, mỗi lần cách nhau 3 ngày đến 4 ngày. Một tuần sau mũi tiêm
canh khuẩn chết cuối cùng, thỏ được tiêm vào tĩnh mạch tai với liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương
ứng. Thỏ được lấy máu, chắt huyết thanh và kiểm tra hiệu giá kháng thể 10 ngày sau khi tiêm mũi cuối
cùng. Hiệu giá phải lớn hơn 1/512 thì lấy toàn bộ máu. Huyết thanh được bảo quản ở – 20 0C, một
lượng nhỏ có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 0C. Huyết thanh được bổ sung 1/10000 merthiolat.
– Chuẩn bị kháng nguyên:
Canh khuẩn được cấy trên thạch BAB có bổ sung huyết thanh ngựa 5 % ủ ở 37 0C qua đêm. Thu
hoạch bằng nước muối sinh lý (PBS). Huyễn dịch được diệt bằng 0,3 % formol, sau đó ly tâm từ 1000
vòng đến 2000 vòng trong 15 min ở 4 0C rồi làm sạch, hút bỏ nước trong và bảo quản ở – 20 0C.
Kháng nguyên này được sử dụng như là kháng nguyên toàn thân. Cần đảm bảo mật độ vi khuẩn từ 1 x
107 CFU/ml đến 3 x 107 CFU/ml.
3.1.3 Cách tiến hành
Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy tròn.
Cho 50 µl nước sinh lý vào các giếng như bố trí A1 - D12. Tiếp tục cho 50 µl kháng nguyên vào A1, B1
pha loãng theo cơ số 2. 2 dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu. Ủ ở 37 0C trong 24 h rồi đọc kết
quả.
Phản ứng âm tính nếu kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước ở trên trong.
Phản ứng dương tính nếu kháng nguyên ngưng kết như hình mạng nhện ở đáy giếng, hiệu giá ngưng
kết đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng.
3.2 Đặc tính nuôi cấy
5
TCVN 8683-5:2011
Vi khuẩn đóng dấu lợn thuộc loại vi khuẩn yếm khí tùy tiện, mọc tốt trên các loại môi trường như BHI,
Martin, Hottinger, VF…, pH từ 7,4 đến 7,8 có bổ sung 5 % huyết thanh ngựa.
3.3 Hình thái vi khuẩn
Vi khuẩn nhỏ hình gậy mảnh, kích thước từ (0,3 x 0,8) µm đến (0,6 x 2,5) µm, không sinh nha bào.
Canh khuẩn non, vi khuẩn thường đứng rời hoặc chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương.
Canh khuẩn già, vi khuẩn thường tạo thành chuỗi dài có khi tạo thành sợi dài cuốn vào nhau như đám
tóc rối, không hình thành giáp mô, không sinh nha bào, không di động.
3.4 Hình thái khuẩn lạc
Trên thạch BAB bổ sung 5 % huyết thanh ngựa, ủ ở 37 oC trong 24 h, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc
tròn, mặt lồi, rìa gọn (dạng S) đường kính khoảng 0,2 mm, trong suốt như giọt sương.
Trên thạch máu, khuẩn lạc có dạng như trên, không gây dung huyết.
3.5 Kiểm tra tính độc
3.5.1 Chuẩn bị động vật
– 2 con lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 15 kg đến 20 kg.
– 2 thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 1,5 kg đến 2,0 kg.
– 5 con chuột nhắt trắng khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 18 g đến 20 g.
3.5.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5 % huyết thanh ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h.
3.5.3 Cách tiến hành
Tiêm cho lợn với liều 20 ml canh khuẩn theo đường tĩnh mạch. Lợn có thể sốt nhẹ (nhiệt độ cơ thể
không vượt quá 41 0C) và không làm lợn phát bệnh đóng dấu.
Tiêm cho thỏ với liều 1 ml/con theo đường tĩnh mạch. Thỏ khỏe mạnh bình thường.
Tiêm cho chuột nhắt trắng với liều 0,2 ml/con theo đường dưới da. Chuột có phản ứng nặng nhưng tỷ
lệ chết không vượt quá 50 %.
3.6 Kiểm tra tính gây miễn dịch
3.6.1 Chuẩn bị động vật
6
